KR101644440B1 - 개선된 혈관신생 억제용 펩티드와 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개선된 혈관신생 억제용 펩티드 Ac-RLYE와 R(D)LYE 및 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환 또는 암의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 Arg-Leu-Tyr-Glu의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에서 N-말단의 L-Arg이 아세틸화된 것을 특징으로 하는 혈관신생(angiogenesis) 억제용 펩티드와 Arg-Leu-Tyr-Glu의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에서 L-Arg이 D-Arg으로 치환된 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 펩티드, 이들 펩티드를 유효성분으로 함유하는 조성물을 과다한 혈관신생으로 인한 질환(암, 당뇨망막병증 또는 노인성 황반변성)의 예방 및 치료용으로 사용하는 기술에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드는 긴 반감기를 갖으며 VEGF에 의해 유도되는 혈관신생 억제 효과가 매우 우수하다. 따라서 본 발명에서 개발한 펩티드는 과다한 혈관신생으로 유발되는 질환(암, 당뇨망막병증 또는 노인성 황반변성)에 사용하면 이들 질환을 매우 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

Description

개선된 혈관신생 억제용 펩티드와 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물{Peptides having improved anti-angiogenic effect and pharmaceutical composition containing them for preventing or treating angiogenesis-related diseases including cancer, diabetic retinopathy or age-related macular degeneration}
본 발명은 개선된 혈관신생 억제용 펩티드 Ac-RLYE와 R(D)LYE 및 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 Arg-Leu-Tyr-Glu의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에서 N-말단의 Arg이 아세틸화된 것을 특징으로 하는 혈관신생(angiogenesis) 억제용 펩티드와 Arg-Leu-Tyr-Glu의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에서 L-Arg이 D-Arg으로 치환된 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 펩티드, 이들 펩티드를 유효성분으로 함유하는 조성물을 과다한 혈관신생으로 인한 질환(암, 당뇨망막병증 또는 노인성 황반변성)의 예방 및 치료용으로 사용하는 기술에 관한 것이다.
혈관신생은 정상 및 병리적 조건에서도 모두 일어나며, 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 것을 말한다. 배아 발달 및 상처 치유와 같은 생리적 조건과 암의 성장 및 망막질환 유발과 같은 병리적 조건에서 일어나는 모든 혈관신생은 혈관신생 촉진인자와 억제인자의 균형에 의해 조절된다. 그러나 병리적 조건에서 혈관신생 촉진인자의 과다한 생성 및 축적으로 인해 유발되는 비정상적인 혈관생성은 종양 성장 및 전이, 류마티스관절염, 당뇨망막병증, 노인성 황반병성을 포함한 여러 질환의 원인이 된다.
혈관신생은 다양한 혈관신생 촉진인자에 의해 유발되는 혈관내피세포의 활성화, 증식, 이동 및 관형성을 포함한 순차적 과정에 의해 유도되는 것이 일반적이다. 혈관신생 촉진인자 중 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 다양한 신호전달 연쇄반응을 활성화시켜 내피세포 증식, 이동, 분화를 유도하는 역할을 한다. 병리적 조건에서 VEGF는 비정상적인 혈관신생을 유도해 종양세포 및 망막세포의 성장과 혈관누수를 촉진시켜 종양의 성장 및 전이, 당뇨망막병증, 노인성 황반변성 등을 야기한다. 따라서 VEGF의 중화항체와 신호억제제를 이용하여, VEGF의 생물학적 활성과 신호전달 연쇄반응을 방해함으로써, 암혈관과 망막혈관의 신생을 제어할 수 있다. VEGF나 VEGF의 수용체를 표적으로 하는 혈관신생 억제 약물은 병리적(비정상적) 혈관신생과 관련된 인간 질환을 효과적으로 제어하는 좋은 치료전략이다.
최근 몇몇 혈관신생억제 항체, 단백질 및 화학물질은 종양, 당뇨망막병증, 노인성 황반변성을 포함한 과다한 혈관신생관련 질병 치료용으로 개발되어 임상에 사용되었으나, 고혈압 및 출혈과 같은 부작용 발생되거나, 낮은 특이성과 생체이용률, 항원성 및 부적합한 약물동태 등과 같은 치료적 한계점이 보고되고 있다. 일반적으로 작은 펩티드는 대량생산이 용이하고, 항원성이 없으며, 높은 용해도와 생체이용률 등의 장점이 있기 때문에 약제 개발에 좋은 재료로 제안되고 있다.
이에 본 발명자들은 VEGF의해 유도되는 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있는 펩티드를 개발하기 위하여 다양한 연구를 시도하였으며, 이의 결과 VEGF 수용체-2와 VEGF 간의 결합을 효과적으로 차단하는 RLYE(Arg-Leu-Tyr-Glu) 펩티드를 개발할 수 있었다. 이 펩티드는 VEGF의해 유도되는 혈관신생을 효과적으로 억제하는 활성을 나타내며, 이러한 활성은 과다한 혈관신생으로 인해 유발되는 질병, 특히 암의 치료제로 매우 유용하게 사용할 수 있는 것으로 확인되었다.
하지만 추가 연구를 통해 RLYE 펩티드는 혈액 내에서 분해가 빠르고 반감기가 길지 않다는 것을 확인하여 이를 개선할 필요성을 느꼈다. 반감기를 늘릴 수 있다면 지속적 효과를 기대할 수 있음으로 과다한 혈관신생으로 인해 유발되는 질병(암, 당뇨망막병증, 노인성 황반변성)을 치료하는데 보다 유용할 것이라 판단하였고, 이에 따라 RLYE 펩티드의 반감기를 개선할 수 있는 방법을 연구하게 되었다.
국제공개특허 WO 97/41824
G. Neufeld, T. Cohen, S. Gengrinovitch, Z. Poltorak, Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors, FASEB J. 13 (1999) 9-22. J. Folkman, Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease, Nat. Med. 1 (1995) 27-31. R.H. Adams, K. Alitalo, Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (2007) 8464-8478. N. Ferrara, H.P. Gerber, J. LeCouter, The biology of VEGF and its receptors, Nat. Med. 9 (2003) 669-676. N. Ferrara, R.S. Kerbel, Angiogenesis as a therapeutic target, Nature 438 (2005) 967-74. H. Takahashi, M. Shibuya, The vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under physiological and pathological conditions, Clin. Sci. (Lond) 109 (2005) 227-241. M. Shibuya, VEGF-VEGFR Signals in Health and Disease, Biomol. Ther. (Seoul) 22 (2014) 1-9. F.M. Yakes, J. Chen, J. Tan, K. Yamaguchi, Y. Shi, P. Yu, F. Qian, F. Chu, F. Bentzien, B. Cancilla, J. Orf, A. You, A.D. Laird, S. Engst, L. Lee, J. Lesch, Y.C. Chou, A.H. Joly, Cabozantinib (XL184), a novel MET and VEGFR2 inhibitor, simultaneously suppresses metastasis, angiogenesis, and tumor growth, Mol. Cancer Ther. 10 (2011) 2298-2308. S.R. Wedge, D.J. Ogilvie, M. Dukes, J. Kendrew, R. Chester, J.A. Jackson, S.J. Boffey, P.J. Valentine, J.O. Curwen, H.L. Musgrove, G.A. Graham, G.D. Hughes, A.P. Thomas, E.S. Stokes, B. Curry, G.H. Richmond, P.F. Wadsworth, A.L. Bigley, L.F. Hennequin, ZD6474 inhibits vascular endothelial growth factor signaling, angiogenesis, and tumor growth following oral administration, Cancer Res. 62 (2002) 4645-4655. W.K. You, B. Sennino, C.W. Williamson, B. Falcon, H. Hashizume, L.C. Yao, D.T. Aftab, D.M. McDonald, VEGF and c-Met blockade amplify angiogenesis inhibition in pancreatic islet cancer, Cancer Res. 71 (2011) 4758-4768. D.D. Hu-Lowe, H.Y. Zou, M.L. Grazzini, M.E. Hallin, G.R. Wickman, K. Amundson, J.H. Chen, D.A. Rewolinski, S. Yamazaki, E.Y. Wu, M.A. McTigue, B.W. Murray, R.S. Kania, P. O'Connor, D.R. Shalinsky, S.L. Bender, Nonclinical antiangiogenesis and antitumor activities of axitinib (AG-013736), an oral, potent, and selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases 1, 2, 3, Clin. Cancer Res. 14 (2008) 7272-7283. F. Hilberg, G. J. Roth, M. Krssak, S. Kautschitsch, W. Sommergruber, U. Tontsch-Grunt, P. Garin-Chesa, G. Bader, A. Zoephel, J. Quant, A. Heckel, W.J. Rettig, BIBF 1120: triple angiokinase inhibitor with sustained receptor blockade and good antitumor efficacy, Cancer Res. 68 (2008) 4774-4782. J.C. Soria, A. Mauguen, M. Reck, A.B. Sandler, N. Saijo, D.H. Johnson, D. Burcoveanu, M. Fukuoka, B. Besse, J.P. Pignon, Systematic review and meta-analysis of randomised, phase II/III trials adding bevacizumab to platinum-based chemotherapy as first-line treatment in patients with advanced non-small-cell lung cancer, Ann. Oncol. 24 (2013) 20-30. S.J. Lee, S. Namkoong, Y.M. Kim, C.K. Kim, H. Lee, K.S. Ha, H.T. Chung, Y.G. Kwon, Y.M. Kim, Fractalkine stimulates angiogenesis by activating the Raf-1/MEK/ERK- and PI3K/Akt/eNOS-dependent signal pathways, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291 (2006) H2836-H2846. J.H. So, S.K. Hong, H.T. Kim, S.H. Jung, M.S. Lee, J.H. Choi, Y.K. Bae, T. Kudoh, J.H. Kim, C.H. Kim, 2010. Gicerin/Cd146 is involved in zebrafish cardiovascular development and tumor angiogenesis. Genes Cells 15 (2010) 1099-110. Y. Cao, A. Chen, S.S.A. An, R.W. Ji, D. Davidson, M. Llinas, Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth, J. Biol. Chem. 272 (1997) 22924-22928 P.C. Lee, A.N. Salyapongse, G.A. Bragdon, L.L. Shears 2nd, S.C. Watkins, H.D. Edington, T.R. Billiar, Impaired wound healing and angiogenesis in eNOS-deficient mice, Am. J. Physiol. 277 (1999) H1600-1608. K.R. Kidd, B.M. Weinstein, Fishing for novel angiogenic therapies, Br. J. Pharmacol. 140 (2003) 585-594. S. Isogai, M. Horiguchi, B.M. Weinstein, The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230 (2001) 278-301. J.I. Greenberg, D.A. Cheresh, VEGF as an inhibitor of tumor vessel maturation: implications for cancer therapy, Expert Opin. Biol. Ther. 9 (2009) 1347-1356. A. Idbaih, F. Ducray, M. Sierra Del Rio, K. Hoang-Xuan, J.Y. Delattre, Therapeutic application of noncytotoxic molecular targeted therapy in gliomas: growth factor receptors and angiogenesis inhibitors, Oncologist 13 (2008) 978-992. K.M. Cook, W.D. Figg, Angiogenesis inhibitors: current strategies and future prospects, CA Cancer J. Clin. 60 (2010) 222-243. H.M. Verheul, H.M. Pinedo, Possible molecular mechanisms involved in the toxicity of angiogenesis inhibition, Nat. Rev. Cancer 7 (2007) 475-485. M.S. O'Reilly, L. Holmgren, Y. Shing, C. Chen, R.A. Rosenthal, M. Moses, W.S. Lane, Y. Cao, E.H. Sage, J. Folkman, Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma, Cell 79 (1994) 315-328. G.S. Sheppard, M. Kawai, R.A. Craig, D.J. Davidson, S.M. Majest, R.L. Bell, J. Henkin, Lysyl 4-aminobenzoic acid derivatives as potent small molecule mimetics of plasminogen kringle 5, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 965-966. Y. Wang, D. Fei, M. Vanderlaan, A. Song, Biological activity of bevacizumab, a humanized anti-VEGF antibody in vitro, Angiogenesis 7 (2004) 335-345.
본 발명의 주된 목적은 보다 긴 반감기를 가짐으로 지속적 혈관신생 억제 효과를 통해 과다한 혈관신생과 관련된 질병의 예방 및 치료 효과를 갖는 새로운 펩티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 함유함으로써 혈관신생 관련 질환인 암과 망막질환에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 나타내는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 Arg-Leu-Tyr-Glu(R-L-Y-E 혹은 RLYE)의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에서 N-말단의 L-Arg이 아세틸화된 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 펩티드(Ac-RLYE) 및 Arg-Leu-Tyr-Glu의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에서 N-말단의 L-Arg이 D-Arg으로 치환된 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 펩티드(R(D)LYE)를 제공한다.
상기 두 펩티드는 혈관내피성장인자(VEGF)에 의해 유도되는 혈관신생을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 펩티드들 중 적어도 하나의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 과다한 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물은 종양의 성장과 전이, 당뇨망막병증, 노인성 황반병성, 류마티스관절염 및 건선으로 이루어진 질환군에서 선택된 하나 이상 질환의 예방 및 치료에 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 펩티드들 중 적어도 하나의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩티드는 암의 예방 및 치료용 조성물은 다양한 종류의 암 중에서도 특히 고형암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 펩티드들 중 적어도 하나의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 당뇨망막병증의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 펩티드들 중 적어도 하나의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 노인성 황반변성의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩티드는 인간 또는 동물의 의약품, 식품 또는 사료 등의 용도로 사용할 수 있다.
이때 본 발명에 따른 펩티드는 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 나트륨(Na), 칼륨(K), 칼슘(Ca), 아연(Zn), 철(Fe) 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있을 것이다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 펩티드는 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 올리고펩티드를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리(pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조할 수 있을 것이다. 다만, 이때 담체가 상기와 같은 종류의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 유리체강내(intravitreal), 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.
상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 유도할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 본 발명의 펩티드를 체중 1㎏ 당 약 0.5 ~ 1.0㎎ 정도를 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
본 발명의 펩티드는 긴 반감기를 갖으며 VEGF에 의해 유도되는 혈관신생 억제 효과가 매우 우수하다. 따라서 본 발명에서 개발한 펩티드는 과다한 혈관신생과 관련된 질환, 암, 당뇨망막병증 또는 노인성 황반변성에 사용하면, 이들 질환을 매우 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
도 1은 인간혈청에서 RLYE 펩티드의 안정성을 실험한 결과이다. A: 인간혈청(serum)과 생리식염수(no serum)에서 RLYE의 안정성을 실험한 결과, B: 인간혈청에서 RLYE 안정성에 미치는 단백질 분해효소 저해제의 효과를 확인한 결과, C: 인간혈청에서 RLYE의 안정성에 미치는 aminopeptidase B의 저해제인 bestatin의 효과를 실험한 결과. NC, 음성대조군(negative control); CTRL, 생리식염수 대조군(control)
도 2는 RLYE와 변형된 RLYE의 인간혈청 내 안정성 및 혈관내피세포 이동에 미치는 효과를 실험한 결과이다. A: 인간혈청에서 RLYE와 변형된 RLYE(Ac-RLYE, RLYE-NH2, Ac-RLYE-NH2, R(D)LYE)의 안정성을 실험한 결과, B: RLYE와 변형된 RLYE가 인간혈청에서 반감기(t1/2) 및 혈관내피세포 이동 억제 효과(IC50)를 실험한 결과.
도 3은 인간혈청으로 전 처리 유무에 따라 RLYE, Ac-RLYE와 R(D)LYE가 혈관내피세포 관형성에 미치는 영향을 실험한 결과이다. A: 인산완충 식염수에 3시간 전 처리한 펩티드가 VEGF(V)에 의해 유도되는 혈관내피세포 관형성을 억제하는 효과를 실험한 결과, B: 인간혈청과 3시간 전 처리한 펩티드가 VEGF(V)에 의해 유도되는 혈관내피세포 관형성을 억제하는 효과를 실험한 결과.
도 4는 인간대장암 세포를 이식한 마우스 모델에서 RLYE, Ac-RLYE와 R(D)LYE가 종양성장 억제에 미치는 효과를 나타낸 것이다. A: 펩티드 또는 bevacizumab(BVZ) 투여가 종양 크기에 미치는 효과를 실험한 결과 (종양 유도 30일), B: 펩티드 또는 bevacizumab 투여가 종양성장 억제에 미치는 효능을 실험한 결과(종양 유도 30일 간), C: 펩티드 또는 bevacizumab 투여가 암혈관 생성을 억제하는 효과를 실험한 결과.
도 5는 레이저-유도 맥락막 신생혈관 마우스 모델에서 RLYE와 Ac-RLYE에 의한 맥락막 혈관신생 억제 효능 실험 결과이다. A: 헤마톡실린-에오신 염색을 통해 펩티드가 맥락막 신생혈관을 억제하는 효과를 실험한 결과(점선으로 표시된 부분은 맥락막 신생혈관막의 경계를 표시), B: 맥락막 신생혈관의 면적에 대한 정량적인 분석 결과, C: 플루오레신이소티오시아네이트(FITC)-결합 덱스트란을 정맥 주사 후 적출한 안구의 망막색소상피/맥락막/공막 복합체 조직에서 펩티드가 맥락막 신생혈관를 억제하는 효과를 실험한 결과.
도 6은 당뇨 마우스 모델에서 RLYE와 Ac-RLYE에 의한 망막혈관 누수 억제 효능을 실험한 결과이다. A: 텝티드가 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유도된 당뇨에 의한 망막혈관 누수를 억제하는 효과를 실험한 결과. B: 펩티드에 의한 당뇨에 의한 망막혈관 누수 억제 효과를 정량화한 결과.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
< Ac-RLYE 펩티드 및 R (D) LYE의 항혈관신생 효과, 암과 망막질환 치료효과 확인 >
1. 실험방법
1-1. 실험재료 및 동물 윤리
실험에 사용된 모든 펩티드[RLYE, EYLR, Ac-RLYE(RLYE의 N-말단을 아세틸화한 펩티드), RLYE-NH2(RLYE의 C-말단을 아미드화한 펩티드), R(D)LYE(RLYE의 L-형 아르기닌을 D-형 아르기닌으로 치환한 펩티드)]는 (주)펩트론(대전)에 의뢰하여 합성하였다. 모든 동물실험은 강원대학교 실험동물보호와 사용에 대한 윤리위원회의 가이드라인에 따라 수행하였다.
1-2. 펩티드 안정성 분석
정상인으로부터 채취한 혈액을 원심분리(테이블탑 원심분리기, 3000rpm, 20분)하여 혈청을 분리하였다. 혈청을 기공의 크기가 0.22μM인 필터(Millipore)로 거른 후, 인간혈청 50㎕에 100㎍의 RLYE, R(D)LYE, RLYE-NH2 및 Ac-RLYE(100㎍/50㎕, 인산완충 식염수, pH 7.4)와 혼합하고 시간별로 37℃에서 항온 시켰다. 시료를 C18 reverse phase 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분리(Vydac protein and peptide C18 column, 0.1% trifluoroacetate in H2O for equilibration, and 0.1% trifluoroacetate in acetonitrile for elution)한 후 펩티드 농도를 피크의 면적으로 계산하였다.
1-3. 혈관내피세포 이동 분석
인간혈관내피세포(HUVECs)의 이동 분석은 6.5㎜ 직경의 폴리카보네이트 필터(기공 크기, 8㎛)가 부착된 트랜스웰 세포배양 용기(Trans-well culture plate)를 사용하여 수행하였다. 필터의 표면은 10㎍의 젤라틴으로 코팅하였다. 혈관내피증식인자(VEGF, 10ng/㎖)가 함유된 신선한 M199 배지(1% 우태혈청)를 트랜스웰의 아래쪽 배양용기에 넣고, 0.15nM과 1.5nM의 펩티드로 상온에서 30분 반응시킨 인간혈관내피세포(1×106 cells/100㎕)를 위쪽 배양용기로 조심스럽게 옮겼다. 이산화탄소-항습항온기에서 4시간 배양하고, 트랜스웰 필터 아래로 이동한 세포를 헤마톡실린-에오신 염색으로 염색하고, 광학현미경으로 정량하였다.
1-4. 혈관내피세포 관형성 분석
인간혈관내피세포의 관형성 정도는 마트리겔(growth factor-reduced Matrigel)을 이용하여 확인하였다. 마트리겔(10㎎ protein/㎖) 250㎕를 24웰 플레이트에 넣고 30분간 37℃에서 중합되게 하였다. M199(1% 우태혈청) 배지에 6시간 배양한 인간혈관내피세포를 2×105 cells/well의 밀도로 배양용기의 마트리겔 위로 조심스럽게 옮긴 후, VEGF(10ng/㎖)를 단독 혹은 펩티드(0.15nM)와 함께 37℃에서 20시간 배양하였다. 한편 펩티드는 인산완충 식염수 혹은 신선한 인간혈청에서 3시간 반응시킨 것을 사용하기도 하였다. 인간혈관내피세포의 관형성 정도는 역위상차현미경으로 촬영하고, 관형성 길이는 Image-Pro Plus version 4.5(Media Cybernetics, San Diego, CA)로 측정하고 정량하였다.
1-5. 인간 결장암(HCT116) 이종이식 마우스 모델
누드마우스(BALB/c nu/nu, 6 주령, 수컷)의 좌측 옆구리에 인간 결장암 세포(HCT116, 1×107 세포/100㎕)를 피하 주사하고, 종양의 체적이 적어도 50 ~ 70㎣가 되었을 때(약 7일 소요) 생리식염수(음성대조군), RLYE(1.0㎎/㎏), R(D)LYE(1.0㎎/㎏) 또는 Ac-RLYE(1.0㎎/㎏)(이상, 실험군)를 매일 1회 복막내로 주사하였다. VEGF 중화 항체인 bevacizumab은 2㎎/㎏으로 일주일에 두 번 복막내로 주사하였다(양성대조군). 종양의 크기는 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 2차원적으로 측정하였다. 종양의 체적(㎣)은 넓이2×길이×0.52의 공식을 사용하여 계산하였다.
1-6. 종양혈관 형성 측정
종양조직을 10% 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 삽입하였다. 종양조직 절편으로 슬라이드를 만든 후 자일렌(xylene)에 침지하여 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올을 단계적으로 처리하여 재 수화하였다. 이후 슬라이드를 탈이온수로 상온에서 수차례 세척하였다. 세포내 퍼록시다제의 활성을 억제하기 위해 조직절편을 0.3% 과산화수소가 포함된 메탄올에서 15분간 반응시키고, 인산완충 식염수로 3회 세척하였다. 조직절편을 3% 염소혈청이 포함된 인산완충 식염수에서 2시간 동안 상온에서 반응시킨 후, FITC-isolectin B4(5㎎/㎖; Vector Laboratories)로 1시간 반응시켰다. 조직절편을 인산완충 식염수로 3회 세척한 다음 permount 용액으로 영구용 슬라이드를 만들고, 종양혈관을 형광현미경으로 촬영하였다.
1-7. 레이저-유도 맥락막 신생혈관(laser-induced choroidal neovascularization) 측정
레이저-유도 맥락막 신생혈관 동물모델을 만들기 위해 마우스의 망막에 400mW의 세기로 50ms 지속시간의 다이오드 레이저를 조사하면 망막층과 맥락막층 사이의 Bruch 막의 파괴가 일어나고, 이후 14일에 걸쳐 맥락막 신생혈관이 유발된다. 상기 조건으로 6주령의 수컷 C57BL/6 생쥐의 망막에 레이저를 조사한 후 10일째 되는 날에 안전 검진을 통해 병변의 생성 유무를 확인하고, 1.5mM의 EYLR, RLYE 및 Ac-RLYE 용액 1㎕를 유리체강 내로 주사하였다. 이때, 대조군에는 동량의 식염수를 주사하였다. 4일 후(레이저 조사 14일 후), 생쥐의 안구를 적출하여 치료효과 분석을 위한 실험을 진행하였다. 적출된 안구를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 12시간 동안 고정하고, 안구를 파라핀에 포매하였다. 파라핀 조직으로부터 4㎛ 두께의 절편을 준비하고, 헤마톡실린-에오신 염색을 시행하였다. 이후, 각 개체에서 맥락막 신생혈관막(choroidal neovascular membrane)의 면적이 가장 넓은 절편의 사진을 촬영하고, 맥락막 신생혈관막의 면적을 ImageJ 프로그램(NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 정량적으로 분석하였다. 식염수를 주사하였던 대조군에서 맥락막 신생혈관 면적의 평균을 100%로 하여 각 치료군의 치료효과를 분석하였다. 한편 마우스의 안구를 적출하기 1시간 전에 1㎖(1.25㎎)의 FITC-덱스트란(250kDa)을 좌심실에 주사하여 전신적으로 관류되게 하였다. 안구를 적출한 후 4% 파라포름알데히드에 1시간 동안 고정하였다. 이후 각막 및 수정체를 가위로 잘라 제거하고, 망막을 집게로 조심스럽게 제거하여 망막색소상피/맥락막/공막 복합조직을 준비하였다. 망막평면 표본고정(retinal flat mount)한 복합조직을 형광현미경을 통해 관찰하고, 사진을 촬영하였다.
1-8. 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)에 의해 유도된 당뇨망막병증 마우스 모델
구연산 완충액(100mM, pH4.5)으로 신선하게 만든 STZ 용액(100mM)을 마우스의 복강에 150㎎/㎏을 주사하고, 저혈당 쇼크를 방지하기 위해 10% 자당(sucrose)을 충분히 공급하였다. 2일 후 부터 Accu-chek performa 혈당측정기(Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 사용하여 혈당을 측정하였고, 1~2주 내에 비 공복 혈당이 300㎎/㎗ 이상을 유지할 때 당뇨 동물모델로 사용하였다. 당뇨가 유발된 마우스를 2%의 avertin으로 마취하고, 1.5mM의 EYLR, RLYE 및 Ac-RLYE 용액 1㎕를 유리체강 내로 주사(intravitreal injection)하였다. 이때, 대조군에는 동량의 인산완충 식염수를 주사하였다. 펩티드를 주사하고 24시간 후 마우스의 좌심실에 1㎖(1.25㎎)의 FITC-덱스트란(250kDa)을 주사하여 5분 정도 순환시켰다. 경추탈골로 마우스를 안락사 시킨 후 안구를 적출하여 상온에서 4%의 파라포름알데히드에 1시간 고정하였다. 고정된 안구에서 망막을 분리하여 망막평면 표본고정(retinal flat mount)을 제작하고, 공초점 현미경으로 혈관누수 현상을 관찰하였다. 한편, 망막 혈관으로부터 누수된 FITC-덱스트란 형광도를 Fluoview software로 측정하였다.
2. 실험결과
2-1. 인간혈청에서 RLYE 펩티드의 안정성 실험 및 짧은 반감기의 원인 분석
RLYE의 안정성을 평가하기 위하여 RLYE 펩티드를 각각 인산완충 식염수와 인간혈청에 넣고 시간별로 37℃에서 항온하였다. RLYE를 인산완충 식염수에 넣어 항온시킨 경우 RLYE 펩티드의 분해가 일어나지 않았고, 인간혈청에서 항온 한 경우 RLYE의 반감기가 1.2시간으로 나타났다(도 1 A 참조).
한편, RLYE가 인간혈청 내에서 어떤 성분에 의하여 안정성이 감소되는지 확인하기 위하여 혈청의 주된 성분인 알부민 및 각종 단백질 분해효소의 저해제를 첨가하여 37℃에서 항온하였다. 그 결과 알부민은 RLYE의 분해를 유도하지 않았으며, 단백질 분해효소 저해제로 알려진 aprotinin, EDTA, leupeptin, 그리고 phenylmethyl sulfonyl pluoride(PMSF)를 처리하여도 인간혈청에 의한 RLYE의 분해를 저해하지 확인하였다(도 1 B 참조). 그러나 aminopeptidase B의 제해제인 bestatin을 첨가하였을 때 인간혈청에 의한 RLYE의 분해를 효과적으로 억제함을 확인하였다(도 1 C 참조). 이러한 결과는 RLYE가 혈청에 존재하는 aminopeptidase B에 의해 분해됨을 제시하고 있다.
2-2. RLYE와 RLYE의 N/C-말단을 변형시킨 펩티드의 인간혈청 내 안정성 및 약리 활성 연구
RLYE와 변형된 RLYE(Ac-RLYE, RLYE-NH2, Ac-RLYE-NH2, R(D)LYE)의 안정성을 평가하기 위하여 인간혈청에서 12시간동안 37℃에서 항온하였다. 그 결과 RLYE와 RLYE-NH2의 반감기가 각각 1.2시간과 1.3시간으로 낮게 나타났고, Ac-RLYE와 R(D)LYE 펩티드의 반감기가 각각 8.8시간과 7.0시간으로 나타났다(도 2 A 참조).
RLYE와 변형된 RLYE의 약리효능을 확인하기 위하여 혈관신생의 전형적인 현상 중의 하나인 혈관내피세포 이동에 미치는 효과를 연구하였다. 인간혈관내피세포에 VEGF를 처리하여 혈관내피세포의 이동을 유도하는 조건에서 각각의 펩티드를 첨가하고 세포의 이동 억제에 대한 IC50 값을 측정하였다. 그 결과 RLYE, Ac-RLYE, RLYE-NH2, Ac-RLYE-NH2 및 R(D)LYE IC50 값은 각각 0.08, 0.05, 0.11, 80.2, 0.06nM이었고, 초기에 혈관신생 억제효능이 있는 것으로 확인된 RLYE와 비교하였을 때 Ac-RLYE와 R(D)LYE의 혈관신생 억제효능이 유사하거나 약간 우수한 것으로 확인되었다(도 2 B 참조). 이러한 결과는 RLYE를 Ac-RLYE와 R(D)LYE로 변형했을 때 펩티드의 안정성이 높아졌고, 또한 내피세포의 이동을 효과적으로 저해시킬 수 있음을 의미한다.
2-3. 혈청의 존재 유무에 따른 RLYE, Ac-RLYE와 R (D) LYE의 약리활성 연구
새로운 혈관생성은 혈관내피세포 증식 및 이동뿐만 아니라, 내피세포의 관형성과 관련된 형태적 분화가 매우 중요하다. 따라서 RLYE, Ac-RLYE와 R(D)LYE를 각각 인산완충 식염수와 인간혈청에 3시간 항온 시킨 후 혈관내피세포의 관형성에 미치는 효과를 2차원 마트리겔을 이용하여 조사하였다. 이들 펩티드를 인산완충 식염수에 전 처리한 경우 VEGF에 의해 유도되는 관형성을 효과적으로 억제하였으며, 억제효능은 3종의 펩티드 모두 유사하였다(도 3 A 참조). 한편, 이들 펩티드를 인간혈청에 3시간 전 처리한 경우, Ac-RLYE와 R(D)LYE는 내피세포의 관형성을 효과적으로 억제하였으나, RLYE에 의한 관형성 억제효과는 미약하였다(도 3 B 참도). 이러한 결과는 혈액 내에서 RLYE의 안정성은 낮아서 약리효능이 감소되었을 것이고, Ac-RLYE와 R(D)LYE의 안정성이 높아서 약리효능은 지속됨을 제시하고 있다. 따라서 혈액이 존재하는 생체 내에서는 변형된 RLYE의 효능은 매우 높을 것으로 사료된다.
2-4. 마우스 종양모델에서 RLYE, Ac-RLYE와 R (D) LYE의 항암 효능 연구
인간결장암 세포(HCT116)를 이종 이식한 누드마우스 모델에서 RLYE, Ac-RLYE 및 R(D)LYE의 항암효과를 조사하고자, 각각의 펩티드를 1.0㎎/㎏/day의 용량으로 매일 1회 복강에 주사하였으며, 양성대조군으로 사용하기 위해 임상에서 사용되는 VEGF 중화항체 항암제인 bevacizumab(Avastin)을 2.0㎎/㎏으로 일주일에 두 번 복강에 주사하였다. 그 결과 이들 펩티드는 종양의 크기와 성장을 억제하였으며, RLYE 보다 Ac-RLYE와 R(D)LYE의 항암효과가 우수한 것으로 나타났다(도 4 A와 B 참조). Ac-RLYE와 R(D)LYE의 항암효과는 양성대조군인 bevacizumab 보다는 다소 낮았다. 종양조직 내에 생성된 혈관을 FITC-isolectin B4로 염색한 결과 Ac-RLYE, R(D)LYE에 의한 암혈관 생성 억제효과는 RLYE 보다 우수하였다(도 4 C 참조). 이러한 결과는 RLYE의 N-말단 아미노산인 L-arginine(R)을 변형시킨 Ac-RLYE와 R(D)LYE는 생체 내에서 안정성이 증가되고 이로 인해 암혈관 생성을 효과적으로 억제하여 항암효능을 증가시킴을 제시한다.
2-5. RLYE와 Ac-RLYE에 의한 레이저-유도 맥락막 신생혈관 억제 효능 연구
난치성 안구질환인 노인성 황반변성 치료제 개발은 레이저-유도 맥락막 신생혈관 억제 효능을 마우스 모델에서 연구하는 것이 일반적이다. 레이저-유도 맥락막 신생혈관 마우스에 펩티드를 투여하고 맹락막 신생혈관 억제효과를 확인한 결과, EYLR(RLYE 펩티드의 역 서열)는 맥락막 신생혈관의 발생 정도에 변화가 없는 반면, RLYE와 Ac-RLYE를 투여한 경우 효과적으로 감소시켰고, Ac-RLYE의 효과가 RLYE 보다 월등하였다(그림 6 A와 B 참조). 망막평면표본고정(retinal flat mount) 기법을 이용한 연구에서도 Ac-RLYE가 RLYE보다 맥락막 신생혈관 억제효과가 우수함을 확인하였다(도 6C 참조). 이러한 결과는 RLYE의 N-말단을 변형시킨 Ac-RLYE는 혈관신생과 관련된 노인성 황반변성 치료제로 활용할 수 있다는 것을 제시하고 있다.
2-6. RLYE와 Ac-RLYE에 의한 당뇨망막병증 치료 효능 연구
스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 투여하여 당뇨망막병증을 유도한 마우스모델에서 망막혈관의 누수현상이 현저하게 증가함을 확인하였고, RLYE와 Ac-RLYE의 투여는 망막혈관 누수를 효과적으로 억제하였다(도 6A와 B 참조). 한편, 이들 두 펩티드의 망막혈관 누수 억제 효과를 비교한 결과 Ac-RLYE가 RLYE 보다 혈관누수 억제효과가 우수한 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 Ac-RLYE가 당뇨질환에서 유발되는 망막혈관 누수현상을 효과적으로 억제하는 당뇨망막병증 치료제로 활용할 수 있음을 제시하고 있다.
<110> AVIXGEN Inc. <120> Peptides having improved anti-angiogenic effect and pharmaceutical composition containing them for preventing or treating angiogenesis-related diseases including cancer, diabetic retinopathy or age-related macular degeneration <130> PA-D15253 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial tetra-peptide <400> 1 Arg Leu Tyr Glu 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial tetra-peptide <400> 2 Glu Tyr Leu Arg 1

Claims (18)

  1. Arg-Leu-Tyr-Glu의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에서,
    N-말단의 L-Arg이 아세틸화된 것을 특징으로 하는 혈관신생(angiogenesis) 억제용 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 의해 유도되는 혈관신생을 억제하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 펩티드.
  3. 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 조성물은 종양의 성장과 전이, 당뇨망막병증, 노인성 황반변성, 류마티스성 관절염 및 건선으로 이루어진 질환군에서 선택된 하나 이상 질환의 예방 및 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물.
  5. 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 고형암은 대장암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료용 조성물.
  8. 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 당뇨망막병증의 예방 및 치료용 조성물.
  9. 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 노인성 황반변성의 예방 및 치료용 조성물.
  10. Arg-Leu-Tyr-Glu의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에서,
    L-Arg이 D-Arg으로 치환된 것을 특징으로 하는 혈관신생(angiogenesis) 억제용 펩티드.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 펩티드는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 의해 유도되는 혈관신생을 억제하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 펩티드.
  12. 제 10항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 조성물은 종양의 성장과 전이, 당뇨망막병증, 노인성 황반변성, 류마티스성 관절염 및 건선으로 이루어진 질환군에서 선택된 하나 이상 질환의 예방 및 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물.
  14. 제 10항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료용 조성물.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 고형암은 대장암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료용 조성물.
  17. 제 10항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 당뇨망막병증의 예방 및 치료용 조성물.
  18. 제 10항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 노인성 황반변성의 예방 및 치료용 조성물.
KR1020150175853A 2015-12-10 2015-12-10 개선된 혈관신생 억제용 펩티드와 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물 KR101644440B1 (ko)

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