KR20240026533A - 스테포게닌을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

스테포게닌을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스테포게닌을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명의 스테포게닌은 DLL4 발현을 억제함으로써 혈관내피세포의 세포 이동 또는 증식을 저해할 수 있으므로 혈관신생 억제, 및 황반변성과 같이 혈관신생이 비정상적으로 조절되는 다양한 질환의 치료제 또는 항암보조제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

스테포게닌을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis comprising steppogenin as an active ingredient}
본 발명은 스테포게닌을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)은 조직이나 장기로 신규의 혈관을 생성하는 생물학적 과정으로, 정상적인 생리조건에서 인간 또는 동물은 매우 제한적인 상황에서만 신생 혈관을 생성한다. 이러한 혈관신생은 단백질 분해효소에 의한 혈관 기저막의 분해, 혈관벽을 형성하는 혈관내피세포의 이동, 증식 및 혈관내피세포 분화에 의한 튜브(맥관)의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 단계를 포함하는 일련의 순차적인 단계를 통해 일어난다.
또한, 혈관이 신생되는 과정은 다양한 음성 및 양성 조절인자들에 의해 엄격히 조절되고 있는데 (Folkman and Cotran., Int. Rev. Exp. Patho., 16, 207~248, 1976), 이러한 혈관신생이 정상적으로 조절되지 못하면 당뇨성 망막병증, 류마티스성 관절염, 염증, 자궁내막증, 노화에 따른 시력감퇴, 건선, 혈관종 등의 병리학적 장애를 유발하게 된다.
혈관신생과 관련이 있는 질환을 크게 분류해 보면 관절염과 같은 염증성 질환, 당뇨병성 망막증과 같은 안과 질환, 건선(psoriasis)과 같은 피부과 질환 및 암으로 나눌 수 있다. 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 노인성 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게되는 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관 녹내장과 같은 질병 등이 있으며, 이러한 질병에 의하여 해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 된다. 또한, 관절염은 자가면역 이상이 원인으로 작용하나 병이 진행하는 과정에서 활액강에 생긴 만성염증이 혈관신생을 유도한다고 알려져 있으며, 새로운 모세혈관이 관절을 침습하여 연골이 파괴되어 생기는 질병이다. 아울러, 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데, 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다. 따라서, 신생혈관 형성을 억제하는 물질의 발견은 신생혈관 형성과 관련된 질병인 당뇨성 망막병증, 류마티스성 관절염, 염증, 자궁내막증, 노화에 따른 시력감퇴, 건선, 혈관종 등의 질병 치료에도 광범위하게 사용될 수 있어, 현재 학계 및 산업계는 이러한 기능을 갖는 신규 물질에 대한 연구개발을 계속적으로 진행하고 있다.
또한, 비정상적인 혈관신생은 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 역할을 하며, 종양까지 침투한 신생 모세혈관은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 제공하여 암세포가 전이될 수 있도록 한다. 따라서, 혈관신생의 기전에 대한 연구 및 이를 억제할 수 있는 물질의 개발은 암의 예방 및 치료에 있어서 관심의 초점이 되고 있으며, 최근에는 동물의 암 모델과 인간의 임상실험에서 종양의 혈관신생 저해는 종양의 성장과 발달을 효과적으로 저해할 수 있고 환자의 생명을 연장할 수 있다는 사실이 증명되면서 혈관신생 억제제 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재까지 개발된 혈관신생 억제제로는 약 200 여종이 보고되어 있는데, 이러한 혈관신생 억제제로는 특정 혈관형성 촉진인자의 활성을 감소시키는 기전, 혈관내피세포의 성장억제 또는 고사를 유도하는 기전, 혈관형성촉진 인자나 내피세포 생존인자를 조절하는 간접인자들의 작용을 억제하는 기전 및 체내에 존재하는 혈관신생 억제제들의 활성을 증가시키는 기전에 역할을 하는 4가지로 크게 분류할 수 있고, 특히 안지오스타틴 (angiostatin), 엔도스타틴 (endostatin), PK5, 프로트롬빈 크링글 2 (prothrombin kringle 2) 및 미국 FDA 승인을 받은 Avastin (VEGF antibody) 과 같은 혈관형성 억제제들이 잘 알려져 있다 (O'Relly, M.S. 등 Cell., 79, 315~328, 1994; Lee. T.H., Biol. Che., 273, 28805~28812, 1998; Shih, Mikhail V. Blagosklonny, Cancer Biology & Therapy, 4:12, 1307-1310, 2005). 다만, 기존에 이미 다양한 혈관신생 억제제가 알려져 있더라도, 상기 억제제는 우수한 활성을 오랜 시간동안 유지하기 어려우며, 약학적 특성이 낮고 쉽게 변성될 수 있는 문제점이 있어, 새로운 신생혈관 억제 물질의 개발이 요구되고 있다.
한편, 델타 유사(delta like) 4(Dl4) 또는 델타 유사 리간드 4(Delta Like Ligand 4, DLL4)(이하에서는 "DLL4")는 혈관 내피 세포에서 과발현되어 있는 노치(Notch)단백질을 수용체로 하는 리간드의 델타 부류의 하나로서, 혈관신생을 조절하는 주요 요소로 알려져 있다. DLL4는 특히, 혈관 내피에 과발현되는 노치 1 또는 노치 4 수용체에 결합을 한다. DLL4는 정상적인 혈관에서도 발현되나, 암 혈관에서는 매우 과발현되어 있는 것으로 알려져 있다(Reinacher-Schick A et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2008;5(5):250-67). 종양에 있어서 혈관신생은 암 조직의 저산소(hypoxia) 지역에서 산소와 영양분을 공급받기 위하여 VEGF와 같은 혈관 신생인자에 의해 혈관신생이 일어난다. 종양에 있어서 혈관신생은 종양의 성장뿐만 아니라 전이(metastasis)에 있어서도 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 종양에서 DLL4에 의한 노치 신호전달을 차단하게 되면 혈관 신생(angiogenesis)의 조절이 잘 이루어지지 않게 되므로 암의 성장을 억제할 수 있다.
대한민국 등록특허 제10-1644440호
본 발명자들은 혈관신생 억제 활성을 갖는 물질을 찾기 위해 예의 연구한 결과, 스테포게닌이 혈관신생을 조절하는 주요 요소에 해당하는 DLL4 발현을 억제하여 혈관내피세포의 세포 이동 또는 증식을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생(Angiogenesis) 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생(Angiogenesis) 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 스테포게닌은 DLL4 유전자의 발현을 억제하거나, DLL4 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 혈관내피세포의 세포 이동 또는 증식을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 만성염증 (chronic inflammation), 골관절염, 당뇨병성 망막증(diabetic retionpathy), 조숙아 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 홍색증, 증식성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 건선, 지루성 피부염, 및 여드름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 혈관신생 저해제를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암보조제로서, 혈관신생을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는, 항암보조제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 스테포게닌은 DLL4 유전자의 발현을 억제하거나, DLL4 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항암보조제는 항암제와 동시적 또는 순차적으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 항암보조제는 항암제와 병용 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제를 생산하기 위한 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 항암제와 함께 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료를 위한 병용요법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 암의 예방 또는 치료에 있어서, 항암 보조 용도를 제공한다.
본 발명의 스테포게닌은 DLL4 발현을 억제함으로써 혈관내피세포의 세포 이동 또는 증식을 저해할 수 있으므로 혈관신생 억제 및 황반변성과 같이 혈관신생이 비정상적으로 조절되는 다양한 질환의 치료제, 및 아바스틴과 같은 혈관신생 억제기능을 통한 항암보조제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 70가지의 후보 화합물의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 70가지의 후보 화합물의 HIF-1α 프로모터 리포터 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (*p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군).
도 2b는 70가지 후보 화합물 중 잠재적인 HIF-1α 억제제로 선별된 화합물에 대하여 HIF-1α 단백질 발현 억제 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (H: 저산소; *p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군; $$p < 0.01 vs. 정상 산소 대조군).
도 2c는 잠재적인 HIF-1α 억제제로 선별된 화합물 중 HIF-1α 단백질 발현을 억제하는 화합물에 대하여 DLL4 단백질 발현 억제 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (*p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs.VEGF 처리 대조군; $$p < 0.01 vs. 무처리 대조군).
도 3a는 스테포게닌에 대한 세포 생존력을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (H: 저산소; *p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군).
도 3b는 스테포게닌의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (H: 저산소).
도 3c는 스테포게닌의 HRE-루시퍼라제 리포터 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (H: 저산소; *p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군).
도 3d는 스테포게닌의 HIF-1α 활성에 대한 IC50을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (H: 저산소).
도 3e는 스테포게닌의 DLL4-루시퍼라제 리포터 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (*p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. VEGF 처리 대조군).
도 3f는 스테포게닌의 DLL4 활성에 대한 IC50을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 저산소 조건 하에 HEK293T 인간 배아 신장 상피 세포, A549 인간 폐암 세포, 및 ARPE19 인간 망막 색소 상피 세포에서, 스테포게닌의 HIF-1α 단백질 발현 억제 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (H: 저산소; *p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군; $p < 0.05, $$p < 0.01, 및 $$$p < 0.001 vs. 정상 산소 대조군).
도 4b는 저산소 조건 하에 HIF-1α의 핵 내 발현에 대한 스테포게닌의 영향을 면역형광 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (NOR: 정상 산소, HYPO 또는 H: 저산소).
도 4c는 저산소 조건 하에 HIF-1α 표적 유전자 VEGF, GLUT1, CXCR4, CA9의 mRNA 발현에 대한 스테포게닌의 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (H: 저산소; *p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군; $p < 0.05, $$p < 0.01, 및 $$$p < 0.001 vs. 정상 산소 대조군).
도 4d는 저산소 조건 하에 HIF-1α 표적 유전자 VEGF, CXCR4, CA9의 단백질 수준에 대한 스테포게닌의 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (H: 저산소; *p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군; $p < 0.05, $$p < 0.01, 및 $$$p < 0.001 vs. 정상 산소 대조군).
도 5a는 VEGF 처리 하에 DLL4, Notch1, 및 NICD 단백질 수준에 대한 스테포게닌의 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (*p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. VEGF 처리 대조군; $p < 0.05, $$p < 0.01, 및 $$$p < 0.001 vs. 무처리 대조군).
도 5b는 저산소 조건 하에 DLL4 발현에 대한 스테포게닌의 영향을 면역형광 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (NOR: 정상 산소, HYPO 또는 H: 저산소; *p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군; $p < 0.05, $$p < 0.01, 및 $$$p < 0.001 vs. 정상 산소 대조군).
도 5c는 저산소 조건 하에 세포 이동에 대한 스테포게닌의 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (NOR: 정상 산소, HYPO 또는 H: 저산소; *p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. 저산소 대조군; $p < 0.05, $$p < 0.01, 및 $$$p < 0.001 vs. 정상 산소 대조군).
도 5d는 VEGF 처리 하에 EA.hy926(HUVEC) 스페로이드 발아능에 대한 스테포게닌의 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (*p < 0.05, **p < 0.005, 및 ***p< 0.001 vs. VEGF 처리 대조군; $p < 0.05, $$p < 0.01, 및 $$$p < 0.001 vs. 무처리 대조군).
도 6a는 종양 성장에 대한 스테포게닌의 영향을 종양 동물 모델에서 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (*p < 0.05, **p < 0.005, ***p< 0.001, 및 ****p < 0.0001 vs. 대조군, 이하 동일).
도 6b는 스테포게닌 투여 후 종양 동물 모델의 몸무게 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6c는 종양 동물 모델의 종양에서 저산소 영역 및 HIF-1α 발현에 대한 스테포게닌의 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (저산소 영역: 초록색, HIF-1α: 빨간색). 스케일 바 = 100 μm.
도 6d는 종양 동물 모델에서 CD34 항체를 사용한 미세혈관 밀도 분석을 통해 혈관신생에 대한 스테포게닌의 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (CD34: 빨간색).
도 6e는 종양 동물 모델에서 CD3+, CD4+, CD8+ T 세포에 대한 스테포게닌의 영향을 면역형광 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 혈관신생 억제 활성을 갖는 물질을 찾기 위해 예의 연구한 결과, 스테포게닌이 혈관신생을 조절하는 주요 요소에 해당하는 DLL4 발현을 억제하여 혈관내피세포의 세포 이동 또는 증식을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생(Angiogenesis) 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, “스테포게닌(steppogenin)”은 하기 화학식 1로 표시될 수 있으며, (2S)-2-(2,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-one의 IUPAC 네임을 가질 수 있다. 또한, 분자량은 288.25, 화학식은 C15H12O6일 수 있다. 또한, 상기 스테포게닌은 본 발명이 속한 분야에서 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나 시판되는 물질을 사용할 수 있으며, 추출, 분리하여 획득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 1]
본 발명은 또한, 스테포게닌(steppogenin)의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 DLL4 및 HIF-1α(Hypoxia-inducible factor-1 alpha) 유전자의 발현을 억제하거나, DLL4 및 HIF-1α 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 감소시키고, Notch1, 및 NICD에 의해 발현 되는 단백질의 수준을 감소시키며, HIF-1α의 표적 유전자 VEGF, GLUT1, CXCR4, 및 CA9 발현을 억제함으로써, 혈관내피세포의 세포 이동 또는 증식을 억제하여 혈관신생 및 종양 성장을 저해할 수 있으므로 혈관신생 관련 질환에 대한 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 및 항암보조제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 "발현"은 in vitro 또는 세포 내에서 유전자가 단백질로 만들어지는 과정의 모든 단계를 포함하는 것으로, 예를 들면, 유전자에서 mRNA로의 전사, mRNA에서 단백질로의 번역을 포함하는 것이다.
본 발명의 조성물에 의한 예방, 개선, 또는 치료 대상 질병인 “혈관신생에 의해 유발되는 질환” 또는 “혈관신생 관련 질환”은 신생혈관 형성이 비정상적으로 진행되어 야기되는 질환을 의미한다. 본 명세서 내에서 “혈관신생 관련 질환”과 “혈관신생에 의해 유발되는 질환”은 상호 호환적으로 기재할 수 있다.
본 발명에서 상기 혈관신생 관련 질환은 예를 들어, 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 관절염, 류마티스 관절염, 만성염증 (chronic inflammation), 골관절염, 당뇨병성 망막증 (diabetic retionpathy), 조숙아 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반/황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 홍색증, 증식성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 건선, 홍색증, 지루성 피부염 또는 여드름 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 비정상적인 신생혈관 형성에 의해 야기되는 모든 질환이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 이외에 공지된 항암제 또는 혈관신생 저해제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다. 다른 치료에는 화학요법, 방사선 치료, 호르몬 치료, 골수 이식, 줄기-세포 대체 치료, 다른 생물학적 치료, 면역치료 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물에 추가로 포함될 수 있는 항암제는 예를 들어, 17-AAG(tanespimycin), DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신(mitomycin) 및 C 브레오마이신(C Bleomycin); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 및 이리도테칸(iridotecan) 등이 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 추가로 포함될 수 있는 혈관신생 저해제는 예를 들어, 안지오스타틴(angiostatin)(플라스미노겐 절편); 항-안지오제닉 항트롬빈 Ⅲ안지오자임(angiozyme); ABT-627; Bay 12-9566; 베네핀(benefin); 베바시주마브(bevacizumab); BMS-275291; 연골-유래 억제제(cartilage-derived inhibitor, CDI); CAI; CD59 보체 절편; CEP-7055; Col 3; 콤브레타스타틴(combretastatin) A-4; 엔도스타틴(endostatin)(콜라겐 ⅩⅧ절편); 피브로넥틴 절편; 그로-베타(Gro-beta); 할로퓨리논(halofuginone); 헤파리나제; 헤파린 헥사사카라이드 절편; HMV833; 인간 융모막 고나도트로핀(hCG); IM-862; 인터페론 알파/베타/감마; 인터페론 유도 단백질 (IP-10); 인터루킨-12; 크링글(Kringle) 5(플라즈미노겐 절편); 마리마스타트(marimastat); 덱사메타손; 금속단백분해효소(metalloproteinase) 억제제(TIMP); 2-메톡시에스트라디올; MMI 270(CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; 네오바스타트(neovastat); NM-3; 판젬(Panzem); PI-88; 태반 리보뉴클레아제 억제제; 플라즈미노겐 활성화제 억제제; 혈소판 인자-4 (PF4); 프리노마스타트(prinomastat); 프로락틴 16 kD 절편; 프로리페린(proliferin)-관련 단백질(PRP); PTK 787/ZK 222594; 레티노이드 소리마스타트; 스쿠알라민; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; 테트라하이드로코티솔-S; 테트라티오몰리브데이트(tetrathiomolybdate); 탈리도마이드; 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1(TSP-1); TNP-470; 형질전환(transforming) 성장인자-베타(TGF-b); 바스큘로스타틴(vasculostatin); 바소스타틴(칼레티큘린(calreticulin) 절편); ZD6126; ZD6474; 파네실(farnesyl) 트랜스페라제 억제제(FTI); 및 비스포스포네이트(예를 들어, 알렌드로네이트, 에티드로네이트(etidronate), 파미드로네이트, 리세드로네이트, 이반드로네이트, 졸레드로네이트(zoledronate), 올파드로네이트(olpadronate), 이칸드로네이트 또는 네리드로네이트(neridronate)) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 “유효성분”은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산 나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한, 본 발명은 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제를 생산하기 위한 스테포게닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 투여란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이 때 상기 건강기능식품 조성물은 혈관신생 관련 질환 또는 암의 예방 또는 개선을 위하여 혈관신생 관련 질환 또는 암의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 혈관신생 관련 질환 또는 암의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
또한, 혈관신생은 종양의 성장 및 전이에 중요하게 작용하므로, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암보조제로서, 혈관신생을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는, 항암보조제를 제공한다. 상기 스테포게닌에 대한 구체적인 설명은 전술한 설명과 동일하다.
상기 항암보조제는 혈관신생을 억제함으로써 항암제의 효능을 증진시킬 수 있다. 또한, 상기 항암보조제는 항암제와 동시적 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 순차적으로 투여할 시에는 항암보조제 투입 후 항암제를 투입할 수 있고, 항암제 투입 후 항암보조제를 투입할 수도 있으며, 단독 또는 항암제와 병용 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항암효능을 증진시킬 수 있도록 투여방식은 변경될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 고형암일 수 있으며, 상기 고형암은 예를 들어, 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 폐암, 교세포종, 두경부암, 전이암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
실험예 1. 재료
사용한 70개의 화합물(다양한 천연 약초에서 분리됨.)은 Kyung Hee University's nature compound library(College of Life Science, Kyung Hee University, Korea)의 백남인 교수님으로부터 제공받았다. 실험 전 무작위로 70개의 화합물에 번호를 매겼으며, 각각의 화합물을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 10 mM 스톡 농도(stock concentration)로 제조하였다. 사용한 70개의 화합물에 대한 정보는 스테포게닌(steppogenin, 화합물 #57)을 제외하고 공개되지 않았으며, Tanespimycin(17-AAG)은 Selleckchem(Pittsburgh, PA, US)에서 구입하였다.
실험예 2. 세포 배양 및 저산소(hypoxic) 조건
인간 배아 신장 상피 세포(HEK293T; KCLB, Seoul, Korea) 및 HUVEC 세포주(human umbilical vein EC; EA.hy926; ATCC, Manassas, VA, USA)를 Dulbecco's modified Eagle's medium(Hyclon, Logan, UT, USA)에서 배양하였으며, 인간 폐암 세포(A549; ATCC)는 RPMI-1640 (Hyclon)에서 배양하였고, 인간 망막 색소 상피 세포(ARPE-19)는 1% 항생제(100-units/mL penicillin 및 100-mg/mL streptomycin; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 10% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DME/F-12 media(Hyclon)에서 배양하였다. HUVEC(2 내지 8회 계대배양됨.)은 EGM-2 Kit, 10% FBS 및 1% 항생제의 함량이 보충된 EBM-2 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 젤라틴-코팅(0.1% gelatin; Sigma-Aldrich)된 배양접시에서 성장시켰다. 모든 세포는 정상 산소 조건(5% CO2 및 95% 공기) 하에서 배양하였으며, hypoxia chambers(ASTEC, Fukuoka, Japan)에서 세포를 저산소 조건(5% CO2, 1% O2 및 94% N2)에 노출시켰다.
실험예 3. 동물 모델
6주령의 성체 수컷 C57BL/6J 마우스(SLC, Japan)를 사용하였으며, 경북대학교에 있는 개별 환기 시스템을 갖춘 특정 병원체 없는 시설에 수용하였다. 동물 취급 및 실험 절차는 경북대학교 동물병원윤리위원회에서 고시한 실험동물 관리 및 사용 지침(프로토콜 번호: KNU 2014-0189 및 KNU 2017-0145)에 따라 수행하였다.
실험예 4. 세포 계수 키트-8 분석(Cell counting Kit-8 assay)
HEK293T 세포를 96-웰 플레이트에 5×103 cells/well의 밀도로 시딩(seeding)하고 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 천연 화합물을 해당 농도에 따라 배지에 희석하여 교체하였다. 세포 생존율은 제조사의 지침에 따라 Cell Counting Kit-8(DOJINDO, Rockville, MD, USA)을 사용하여 24시간 동안 저산소 조건에 노출시킨 후 확인하였으며, 450 nm에서 microplate reader(Infinite M200 Pro; TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 측정하였다.
실험예 5. 이중-루시퍼라제 분석(Dual-luciferase assay)
HRE-luciferase assay를 수행하기 위해 HEK293T 세포를 5×103 cells/well의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하고 37 ℃에서 배양하였다. 그런 다음, Vivamagic transfection reagent(Vivagen, Seongnam, Korea)를 사용하여 인간 VEGF 유전자의 HRE 5개 사본을 포함하는 pGL3-HRE-luciferase 플라스미드 및 pRL-SV40 Renilla 플라스미드로 세포를 공동 형질감염시켰다 (Kwon et al., 2015). 24시간 후, 세포를 다양한 농도의 천연 화합물로 1시간 동안 전처리한 다음 저산소 조건에서 24시간 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. DLL4-luciferase assay을 수행하기 위해 EA.hy926 세포를 24-웰 플레이트에 4×104 cells/well의 밀도로 시딩하고 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 pGL3-DLL4 luciferase 및 pRL-SV40 Renilla 플라스미드로 공동 형질감염시키고 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 이들을 다양한 농도의 천연 화합물과 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 VEGF(10 ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 인큐베이션 하였다. HRE- 및 DLL4-프로모터 활성의 발광성은 제조업체의 지침에 따라 microplate reader 및 Dual-Luciferase Assay Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 검출하였다. 천연 화합물의 루시퍼라제 활성은 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 활성으로 정규화하였다.
실험예 6. 면역형광 염색(Immunofluorescence staining)
세포를 4-웰 플레이트의 커버슬립에 2-3×104 cells/well의 밀도로 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. HIF-1α 염색을 위해, A549 세포를 다양한 화합물로 처리하고 4시간 동안 정상 산소 또는 저산소 조건에서 인큐베이션 하였다. Ki-67 및 DLL4 염색의 경우, EA.hy926 세포를 동일한 화합물로 처리하고 VEGF(20 ng/mL) 처리 하에 유지하였다. 이어서, 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고 1% Triton X-100으로 투과화시켰다. 고정된 세포를 3% BSA(bovine serum albumin)를 함유하는 PBS(phosphate-buffered saline)로 차단한 다음 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, 세포를 1시간 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션하고 DAPI를 사용하여 핵을 염색하였다. 염색된 세포를 공초점 현미경(Leica TCS SP5 II Dichroic/CS, Leica, Germany)을 사용하여 시각화하였다.
실험예 7. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
RIPA 용해 완충액(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 배양된 세포로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 추출물을 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 니트로셀룰로오스 막(Whatman, Maidstone, England)으로 옮겼다. 막은 실온에서 1시간 동안 0.1% Tween-20을 함유한 Tris-buffered saline에서 5% 탈지유로 차단하였다. 차단 후, 막을 특정 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 제조업체의 지침에 따라 Enhanced Chemiluminescence Kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질을 검출하였다. HIF-1α(BD Biosciences, San Diego, CA, USA), VEGF(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), CXCR4(Abcam, Cambridge, UK), CA9(Abcam), DLL4(Santa Cruz Biotechnology), NOTCH1(Thermo Scientific), 및 β-actin (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 1차 항체를 사용하였다.
실험예 8. 젖산 탈수소효소 세포독성 분석(Lactate dehydrogenase cytotoxicity assay)
HEK293T 세포를 96-웰 플레이트에 2×103 cells/well로 시딩하고 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 저산소 조건에서 24시간 동안 다양한 농도의 스테포게닌으로 처리하였다. LDH(Lactate dehydrogenase) 방출 값은 제조업체의 지침에 따라 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST(DOJINDO)를 사용하여 평가하였다. 세포 독성은 490 nm에서 microplate reader (Infinite M200 Pro; TECAN)를 사용하여 측정하였다.
실험예 9. RNA 분리 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RNA isolation and quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction)
총 RNA는 TRIzol Reagent(Invitrogen)를 사용하여 분리하였다. 분리된 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO, Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하는데 사용하였다. 합성된 cDNA는 유전자-특이적 프라이머와 혼합하였다. 증폭 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 열 주기는 다음과 같이 진행하였다: 50 ℃에서 2분, 95 ℃에서 10분, 95 ℃에서 15초 변성 사이클 40회, 60 ℃에서 1분 어닐링. 내부 대조군으로서 β-actin에 대한 정규화로 mRNA 발현을 계산하기 위해 평균 주기 역치 값(Mean cycle threshold values)을 사용하였다. Real-Time PCR을 위한 특정 프라이머의 서열은 표 1에 나타냈다.
실험예 10. 상처 치유 마이그레이션 분석(Wound-healing migration assay)
EA.hy926 세포를 12-웰 플레이트에 4×104 cells/well의 밀도로 시딩하고 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 밤새 무-혈청 배지에서 starvation시키고 1시간 동안 mitomycin C(0.5 μg/mL) 처리하였다. 합류(confluence) 시 피펫 팁으로 상처를 만들고 무-혈청 배지로 세척하여 세포 파편을 제거하였다. 그 다음, 플레이트를 스테포게닌으로 처리된 저산소 조건 하에 HEK293T 세포 배양물로부터 수집된 조건 배지로 처리하였다. 상처 봉합을 모니터링하고 0h 및 8h에 사진을 찍었다. 세포 이동은 0h와 8h 사이의 상처 면적을 계산하여 측정하였다.
실험예 11. 스페로이드 발아 분석(Spheroid sprouting assay)
EA.hy 926 세포 현탁액(5×103 cells)을 현적법(hanging-drop method)을 사용하여 100 mm 디쉬의 뚜껑 위에 배포하고 24시간 동안 유지하였다. 다음날, 스페로이드를 수확하고 20% FBS를 함유하는 Methocel stock 용액과 혼합하였다. 그런 다음 Methocel 용액을 함유한 스페로이드를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, VEGF 또는 스테포게닌을 중합된 Methocel 용액에 첨가하고 2일 동안 인큐베이션 하였다. 마지막으로 발아 EC(endothelial cells)를 계산하고 그래프로 표시하였다.
실험예 12. 종양 모델 및 치료 요법의 개발
LLC(Lewis lung carcinoma) 동종이식 종양 모델을 제조하기 위해, LLC 세포 현탁액(200 μL의 무-혈청 배양 배지에 5×105 cells)을 6주령 수컷 C57BL/6J 마우스의 등쪽 옆구리 부위에 피하 이식하였다. LLC-세포 접종 후 다양한 시점에 복강 내 주사를 통해 마우스에 17-AAG(25 mg/kg) 또는 스테포게닌(2 mg/kg)을 투여하였다. 그런 다음, 다음 공식에 따라 종양 부피를 측정하였다: V = 0.5 × A × B2, 여기서 A와 B는 각각 가장 긴 치수와 가장 짧은 치수를 의미함. 마지막으로, 마우스를 마취하고 추가 분석을 위해 조직을 수집하였다.
실험예 13. 면역조직화학 및 조직학적 분석(Immunohistochemical and histological analyses)
면역조직화학적 분석을 위해, 수집한 종양 또는 조직 샘플을 4% 파라포름알데히드에 고정하고 조직 동결 배지(Leica, Wetzlar, Germany)에 포매(embedding) 하였다. 동결된 블록을 10 μm 샘플 섹션으로 절단하고 PBST(PBS 중 0.3% Triton X-100)에서 3% BSA로 차단하고 적절한 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 1차 항체는 다음과 같다: 항-CD34(Boster Bio, CA, USA), 항-DLL4(R&D Systems, MN, USA), 항-pimonidazole(Hypoxyprobe-1, HPI, MA, USA), 항-CD3(Abcam), 항-CD4(Invitrogen), 및 항-CD8(Invitrogen). 몇 번 세척 후, 샘플을 권장된 형광단-태그된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 그런 다음, DAPI가 포함된 Antifade Mounting Medium(Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 사용하여 세포 핵을 염색하였다. 면역형광 이미지는 Zeiss 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 획득하였다. 그런 다음, 마우스의 꼬리 정맥을 통해 pimonidazole hydrochloride(60 mg/kg; Hypoxyprobe-1, HPI)을 정맥 주사하고 90분 후에 마취하였다. 마지막으로, 추가 분석을 위해 종양 조직을 수집하였다.
실험예 14. 통계 분석
모든 데이터는 적어도 3개 샘플의 평균±표준 편차(SD)로 표시하였으며, P 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 데이터는 Student's t test와 ANOVA를 사용하여 분석하였다.
[실시예]
실시예 1. 70가지 천연 화합물 중 잠재적인 HIF-1α 및 DLL4 억제제 스크리닝
HIF-1 및 DLL4 활성에 대한 70가지 천연 화합물의 억제 활성을 테스트하기 위해, 먼저 저산소 조건 하에 불멸화된 정상 세포에 대한 세포 독성 효과를 테스트하였다. 특히, 이러한 조건에서, HEK293T 세포에 화합물을 다양한 농도(0.1 내지 10 μM)로 처리하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 저산소 상태에서 세포 생존율이 낮은 두 가지 천연 화합물(#31 및 #61)은 추가 분석에서 제외하였다.
잠재적인 HIF-1α 억제제를 선택하기 위해, 70가지 천연 화합물의 효과를 이중-루시퍼라제 분석을 사용하여 HIF-1α 프로모터 리포터 활성에 대해 시험하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 12가지 천연 화합물(#17, #18, #34, #42, #47, #49, #50, #51, #52, #56, #57, 및 #70)이 저산소 비히클(vehicle, DMSO) 대조군과 비교하여 < 70%의 HRE-루시퍼라제 활성을 나타냈으며, 이를 잠재적인 HIF-1α 억제제로 선택하였다.
선택된 천연 화합물이 HIF-1α 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, HEK293T 세포에 대해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 5가지 천연 화합물(#51, #52, #56, #57, 및 #70)이 HIF-1α 단백질 발현을 억제하였다. Tip EC(Endothelial Cells)에서 DLL4 발현은 VEGF에 의해 유도되기 때문에(Blanco and Gerhardt, 2013), 저산소성 종양 세포의 HIF-1α와 혈관 EC의 DLL4가 동시에 표적화되면 종양 성장 및 발아 혈관신생(angiogenesis)이 효과적으로 억제되었다. 따라서, EC에서 DLL4 리포터 활성에 대한 HIF-1α 억제 활성을 갖는 5가지 화합물의 효과도 조사하였다. 그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, VEGF에 의해 유도된 DLL4 단백질 수준 및 DLL4 루시퍼라제 활성이 화합물 #57의 처리로 유의하게 억제되었다. 따라서 화합물 #57을 HIF-1α와 DLL4의 잠재적 억제제로 선택하였다.
실시예 2. 스테포게닌의 HIF-1α 및 DLL4 억제 활성
천연 화합물 #57은 Morus alba L.의 뿌리 껍질에서 추출한 스테포게닌으로 확인되었다. 추가 테스트 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건에서 용량-의존적 세포 생존력과 세포 독성은 비히클 처리와 비교하여 스테포게닌 처리로 변경되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 도 3c에 나타낸 바와 같이, HRE-루시퍼라제 리포터 활성은 용량-의존적으로 0.1 내지 10 μM의 스테포게닌에 의해 유의하게 억제되었다. 또한, 도 3d에 나타낸 바와 같이, HIF-1α 활성에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50)는 0.56 ± 0.043 μM이었다. DLL4-루시퍼라제 리포터 활성 또한 도 3e에 나타낸 바와 같이, 0.3 - 10.0 μM 스테포게닌에 의해 유의하게 감소되었다. 도 3f에 나타낸 바와 같이, DLL4 활성에 대한 IC50은 EA.hy926 세포에서 8.46 ± 1.08 μM 이었다.
실시예 3. 저산소(hypoxic) 조건 하에서 암세포의 HIF-1α의 발현을 억제하는 스테포게닌
도 4a에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건 하에 HEK293T 인간 배아 신장 상피 세포, A549 인간 폐암 세포, 및 ARPE19 인간 망막 색소 상피 세포에서, 스테포게닌은 HIF-1α 단백질 수준을 용량-의존적으로 유의하게 억제하였다 (최대 용량: 3 μM). 면역형광 분석 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, HIF-1α의 핵 내 발현은 정상산소 대조군에 비해 저산소에서 증가하였다. 그러나, 17-AAG 처리와 유사하게 스테포게닌(# 57) 처리는 저산소 조건 하에 HIF-1α의 핵 내 발현을 감소시켰다.
전사 인자 HIF-1α는 낮은 산소 수준을 극복할 수 있거나 혈관신생, 세포 생존, 전이 및, 포도당 대사에 관여하는 다양한 표적 유전자의 발현을 조절한다(Semenza, 2007). HIF-1α 활성에 대한 스테포게닌의 억제 효과를 확인하기 위해, 실시간 qRT-PCR을 사용하여 HIF-1α 표적 유전자의 mRNA 수준을 조사하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 스테포게닌은 저산소 조건 하에 VEGF, GLUT1, CXCR4, 및 CA9의 mRNA 발현을 억제하였다. 유사하게, 도 4d에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건 하에, 스테포게닌은 비히클 대조군에서 검출된 수준과 비교하여 VEGF, CXCR4, 및 CA9의 단백질 수준을 억제하였다. 따라서, 스테포게닌이 HIF-1α 활성과 그것의 표적 유전자 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. EC에서 DLL4 활성 및 발아 혈관신생을 억제하는 스테포게닌
스테포게닌은 도 5a에 나타낸 바와 같이, HUVEC에서 VEGF로 유도된 DLL4, Notch1, 및 NICD 단백질 수준을 용량-의존적으로 감소시켰다. EC의 DLL4-NOTCH 신호 전달 경로는 발아 혈관신생 동안 팁(tip) 및 줄기(stalk) 세포 운명에 중요하기 때문에 시험관 내에서 스테포게닌의 혈관 신생 효능을 평가하였다. 흥미롭게도, 면역형광 분석 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, EC에서 DLL4 발현은 저산소 조건 하에 유의하게 증가하였다. 그러나, 스테포게닌 처리는 이러한 조건에서 DLL4 발현을 극적으로 억제하였다. 세포 증식 마커인 Ki-67의 수준은 저산소 조건에서 증가하였으나, 스테포게닌 처리에 의해 감소하였다. HUVEC에 대한 추가 분석 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 이동하는 세포의 수와 상처 봉합은 저산소 조건에서 스테포게닌의 존재 하에 유의하게 감소하였다. 또한, 도 5d에 나타낸 바와 같이, 3차원 EC 스페로이드 배양에서, 발아 능력(발아의 수를 계산하여 결정됨)은 VEGF에 의해 증가하였으나, 스테포게닌 처리에 의해 유의하게 억제되었다. 따라서, 스테포게닌은 HIF-1α 및 DLL4의 억제제로 작용하여 시험관 내에서 혈관신생을 억제하는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 종양 성장과 혈관신생을 억제하는 스테포게닌
실험예 12의 LLC 세포 현탁액을 접종한 후 7, 9, 11, 13, 및 15일에 17-AAG(25 mg/kg), 스테포게닌(2 mg/kg), 또는 비히클(대조군)을 LLC 동종이식 종양 모델에 처리하여 스테포게닌의 생채 내 효과를 시험하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 17-AAG와 스테포게닌 모두 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 그러나, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 투여 기간 동안 그룹 간의 평균 체중에는 유의한 차이가 없었다. 면역조직화학적 염색 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 종양에서 저산소 영역과 HIF-1α 발현 수준은 대조군에서 효과에 비해 스테포게닌 또는 17-AAG 처리에 의해 유의하게 감소하였다. 또한, 도 6d에 나타낸 바와 같이, CD34 항체(종양 조직의 팁-세포 마커)를 사용하여 분석한 미세혈관 밀도는 대조군 조직에서 관찰된 것과 비교하여 스테포게닌에 의해 유의하게 감소하였다. 비정상적인 혈관 구조는 염증 세포를 면역 억제 쪽으로 분극화하는 저산소 미세 환경을 생성한다(Palazon et al., 2012). 스테포게닌이 혈관 정상화를 유도하는지 알아보기 위해, 종양 조직에서 T-세포 침윤을 조사하였다. 그 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이, 스테포게닌은 CD3+ T 세포의 침윤을 유의하게 증가시켰으며, 세포독성(CD8+) vs. 조절 T(CD4+) 세포의 비율을 감소시켰다. 이러한 결과는 스테포게닌이 종양 조직에서 HIF-1α 및 EC에서 활성 발아를 억제하여 종양 혈관을 정상화함으로써 종양 성장을 억제함을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생(Angiogenesis) 억제용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 스테포게닌은 DLL4 유전자의 발현을 억제하거나, DLL4 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈관내피세포의 세포 이동 또는 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 만성염증 (chronic inflammation), 골관절염, 당뇨병성 망막증(diabetic retionpathy), 조숙아 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 황반변성 (macular degeneration), 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 홍색증, 증식성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 건선, 지루성 피부염, 및 여드름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈관신생 저해제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암보조제로서, 혈관신생을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는, 항암보조제.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 스테포게닌은 DLL4 유전자의 발현을 억제하거나, DLL4 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 항암보조제.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 항암보조제는 항암제와 동시적 또는 순차적으로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는, 항암보조제.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 항암보조제는 항암제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 항암보조제.
  11. 스테포게닌(steppogenin) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
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