CN110627866B

CN110627866B - 多肽rly4及其促进肝再生和抑制肝细胞凋亡的用途

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Publication number: CN110627866B
Application number: CN201911014727.4A
Authority: CN
Inventors: 张时群; 卢肖宇; 王�华; 李天然
Original assignee: Link Health Group
Current assignee: Link Health Group
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2039-10-23
Also published as: CN110627866A

Abstract

本发明公开了一种多肽及其促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的用途。本发明的能促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有3/4以上的序列一致性，多肽长度为4个氨基酸，具有分子量小、易于合成、免疫原性低等优点，因此本发明的多肽在肝病治疗中具有广阔的应用前景。

Description

多肽RLY4及其促进肝再生和抑制肝细胞凋亡的用途

技术领域

本发明涉及细胞增殖与凋亡技术领域，尤其是一种多肽RLY4及其促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的用途。

背景技术

肝脏是人体内最大的内脏器官(约占人体总质量的2.5％)，同时也是中心代谢器官。发挥肝功能的主要是实质细胞，它们占到肝脏细胞总量的80％。肝细胞发挥了一系列作用，包括制造血浆、合成载体蛋白、对消化物的解毒、共轭及荷尔蒙的分泌、调节血脂与氨基酸的合成及代谢等。

细胞凋亡(apoptosis)是细胞在特定环境下的主动自杀过程。细胞凋亡是Kerr等人1972年在研究肝脏局部缺血时观察到细胞调亡和死亡的两个不同图型。细胞凋亡的特征是细胞皱缩，细胞膜呈胞状突起，形成凋亡小体，核碎片和核DNA降解等异常现象。细胞凋亡是临床许多疾病病理变化的主要特征，特别是在肝脏疾病中，肝细胞凋亡是引起肝脏损害的重要因素。肝细胞凋亡在肝脏病变机制中起着重要作用，死亡受体通路的紊乱被认为是激发急/慢性肝损伤发生的重要原因之一。近年来研究表明肝细胞凋亡广泛参与了多种肝病的病理过程，包括肝衰竭、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病等。

肝衰竭(liver failure，LF)是由病毒、药物、酒精等多种因素引起的重型肝脏损害，导致其解毒、排泄、合成等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、重度黄疸、腹水、肝性脑病甚至消化道出血等为主要表现的一组临床症候群，病死率极高，是肝病科临床常见的危急重症之一。《2012年版肝衰竭诊疗指南》根据其病理特征和疾病进程的不同，将肝衰竭分为急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)、亚急性肝衰竭(subacuteliver failure，SALF)、慢加急性(亚急性)肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)和慢性肝衰竭(chronic liver failure，CLF)。肝衰竭是临床急危重症，至今仍缺乏疗效确切的特效药物，因而成为世界性的难治病种之一，尽管人工肝和肝移植是行之有效的治疗方法，但是其昂贵的费用、肝源的紧缺及排斥反应等导致该治疗方法无法在我国得到广泛的推广使用。目前对于新的治疗上述肝疾病的药物和方法存在迫切需求。

RLY4为含有4个氨基酸(RLYE)的多肽，有报道显示，RLY4可以抑制血管表皮生长因子(VEGF)诱导的血管新生，可用于肿瘤、湿性黄斑变性等疾病的治疗(参见中国专利CN108350029A，以及非专利文献1、2、3)，但尚未见RLY4用于促进肝细胞再生和抑制肝细胞凋亡的报道。

非专利文献1：Baek YY,et al.The tetrapeptide Arg-Leu-Tyr-Glu inhibitsVEGF-induced angiogenesis.Biochem Biophys Res Commun.2015Aug7；463(4):532-7；

非专利文献2：Baek YY,et al.Arg-Leu-Tyr-Glu tetrapeptide inhibits tumorprogression by suppressing angiogenesis and vascular permeability via VEGFreceptor-2antagonism.Oncotarget.2017Feb 14；8(7):11763-11777；

非专利文献3：Park W,et al.Arg-Leu-Tyr-Glu Suppresses RetinalEndothelial Permeability and Choroidal Neovascularization by Inhibiting theVEGF Receptor 2Signaling Pathway.Biomol Ther(Seoul).2019。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

本发明提供一种多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有3/4以上的序列一致性。需要说明的是，本发明请求保护的多肽序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，序列一致性可以是3/4或4/4，但是不限于3/4以上，还可以是1/2的序列一致性，只要相应的多肽具有促进肝细胞增殖的功效，或者能抑制肝细胞凋亡，均应落在本发明的保护范围之内。

进一步地，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述多肽具有末端修饰，所述末端修饰为N端乙酰化修饰或/和C端酰胺化修饰。

在另一个方面，本发明提供上述多肽或其盐在制备用于促进肝细胞增殖或治疗由肝细胞凋亡导致的疾病的药物中的用途。

进一步地，所述盐为多肽的醋酸盐、盐酸盐或磷酸盐。

进一步地，所述由肝细胞凋亡导致的疾病为肝衰竭、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝或自身免疫性肝病。更优选为急性肝衰竭。

进一步地，所述促进肝细胞增殖为体内促进肝再生或体外促进肝细胞生长。

在又一个方面，本发明提供一种促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的药物，其中含有上述多肽或其盐。进一步地，所述盐为多肽的醋酸盐、盐酸盐或磷酸盐。

进一步地，所述由肝细胞凋亡导致的疾病为急性肝衰竭。

进一步地，所述药物为液体剂型或冻干粉剂。更进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。本领域的技术人员可根据药物的剂型等对药学上可接受的载体进行常规选择。当所述药物为液体剂型时，可通过静脉注射或皮下注射来进行给药。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种能促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽RLY4，其长度为4个氨基酸，具有分子量小、易于合成、免疫原性低等优点，因此本发明的多肽在肝病治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明多肽RLY4的HPLC图谱；

图2为本发明多肽RLY4促进肝细胞增殖的活性检测结果图；

图3为本发明多肽RLY4抑制肝细胞凋亡的活性检测结果图。

具体实施方式

本申请的发明人对现有技术存在的大量多肽进行实验筛选，意外的发现多肽RLY4不仅能够促进肝细胞增殖，而且可以抑制肝细胞凋亡。

在一些实施方案中，本发明提供了一种能促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽RLY4/其盐及它们的用途。进一步地，所述促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽RLY4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一些实施方案中，所述盐包括多肽的醋酸盐、盐酸盐或磷酸盐。

在一些实施方案中，所述多肽是末端修饰的。进一步地，所述末端修饰是N端乙酰化修饰或C端酰胺化修饰。

在一些实施方案中，本发明还提供上述多肽或其盐在制备用于促进肝细胞增殖或治疗由肝细胞凋亡导致的疾病的药物中的用途。进一步地，所述药物为液体剂型或冻干粉剂。更进一步地，所述由肝细胞凋亡导致的疾病为肝衰竭、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝或自身免疫性肝病。更优选的，所述肝衰竭为急性肝衰竭。

在一些实施方案中，所述促进肝细胞增殖为体内促进肝再生或体外促进肝细胞生长。

本发明还提供一种促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的药物，所述药物含有上述多肽或其盐。

优选的，所述药物为液体剂型或冻干粉剂。

优选的，所述促进肝细胞增殖为体内促进肝再生或体外促进肝细胞生长。

优选的，所述药物还包括药学上可接受的载体。本领域的技术人员可根据药物的剂型等对药学上可接受的载体进行常规选择。

当所述药物为液体剂型时，可通过静脉注射或皮下注射来进行给药。

本申请的发明人通过体外细胞实验证实本发明SEQ ID NO:1所示的多肽RLY4具有促进肝细胞增殖和抑制肝细胞凋亡的活性，因此本发明的多肽可以用于促进肝细胞增殖或治疗肝细胞凋亡导致的疾病。研究显示，肝细胞凋亡的疾病包括肝衰竭，病毒性肝炎，胆汁淤积性肝损伤，酒精性肝损伤，非酒精性脂肪性肝炎，肝硬化，和毒素或药物介导的肝损伤等，由于本发明的多肽具有抑制肝细胞凋亡的活性，因此可以用于治疗上述疾病。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂或方法均采用本领域的常规试剂或方法。

实施例1多肽合成

本发明促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽RLY4(氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示)采用固相合成工艺合成，纯度＞98％(图1)，合成500mg。

实施例2检测体外促进肝细胞增殖的活性

本实施例中，人肝细胞系LO2购自ATCC。

本实施例检测实施例1所述多肽RLY4体外促进肝细胞增殖的活性的方法为：

LO2细胞按常规方法复苏后，置37℃、5％CO₂培养箱里，用含10％FBS和1％双抗的DMEM完全培养基培养。待细胞长满至瓶底85％左右时，用胰蛋白酶-EDTA消化后，加入DMEM完全培养基轻轻吹打，制成细胞悬液，调整细胞浓度，接种到96孔板中，每孔100μL，然后放置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，待用。

将对数期LO2按前期摸索的密度较好的5000个/孔接种至96孔板培养24h。分为正常对照组、模型对照组、RLY4低剂量(0.1μg/mL)、中剂量(1μg/mL)、高剂量(10μg/mL)处理组和阳性对照组，每组6个复孔。培养24h后，吸去培养基，各组加入800μM H₂O₂工作液作用细胞3h，正常对照组加入相同体积的培养基作对照。用PBS洗2次，各受试组分别加入相应的含药培养基，正常对照组和模型对照组加入正常培养基作对照，阳性对照组加入1mM的乙酰半胱氨酸(NAC)，继续培养24h。取出96孔板，吸去含药培养基，用PBS洗2次，每孔加入100μL含10％CCK-8溶液的DMEM培养基。继续培养2h后于微孔板分光光度计中测定450nm下OD值。计算细胞活力(Cell Viability)＝OD实验组/OD对照组平均值。

结果见图2，多肽RLY4具有明显促进肝细胞增殖的作用，且量效关系明显。与模型对照组(相对细胞活性0.436±0.120)相比，中(相对细胞活性0.555±0.090)、高剂量组(相对细胞活性0.625±0.126)对肝细胞增殖的促进作用具有统计学显著差异(**代表P＜0.01)。

实施例3检测体外抑制肝细胞凋亡的活性

本实施例检测实施例1所述多肽RLY4体外抑制肝细胞凋亡的活性的方法为：

人肝细胞HL-7702铺96孔板，细胞浓度为1×10⁵个/ml，每孔100μl，即每孔细胞为1×10⁴个。

每孔加入20ng/mL放线菌素D2(Act D2)处理30min、80ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理48h，建立细胞凋亡模型。

加入相应的多肽RLY4处理，加药体积为10μl，终浓度分别为0.1、1、10μg/ml，并以同体积的PBS作为阴性对照，0.2μg/ml的表皮生长因子(EGF)为阳性对照。

药物处理24h后，每孔加入100μl

试剂(

3/7 Assaypromega公司提供，货号：G8090)，在摇板机上以300-500rpm的转速轻柔混匀每孔的内容物约30秒。在室温(18-22℃)孵育30分钟到3小时。

在荧光发光仪(Luminometer)(Promega，GloMax生物发光检测仪)上测量每个样品的荧光值。

结果见图3，多肽RLY4具有显著抑制肝细胞凋亡的作用，且量效关系明显。与模型对照组(荧光强度146576.2±11714)相比，中(荧光强度70624.49±3512)、高剂量组(荧光强度47641.37±5983)对肝细胞凋亡的抑制作用具有统计学显著差异(**代表P＜0.01)。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广州领晟医疗科技有限公司

<120> 多肽RLY4及其促进肝再生和抑制肝细胞凋亡的用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Arg Leu Tyr Glu

1

Claims

1.多肽在制备用于促进肝细胞增殖或抑制肝细胞凋亡的药物中的用途，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。