CN111249446B - 多肽及其盐的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MEPE多肽及其盐在制备促进肝细胞增殖和/或治疗肝细胞凋亡导致的疾病的药物中的用途，所述MEPE衍生多肽为：SEQ ID NO:1所示的多肽或SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸序列中第5‑19位氨基酸组成的多肽或SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸序列中第5‑19位的氨基酸组成的多肽N末端和C末端分别添加一个Cys经环化得到的环肽。本发明提供的促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽具有分子量小、易于合成、免疫原性低等优点，对肝细胞凋亡细胞凋亡相关疾病具有良好的治疗效果，应用前景广阔。

Description

多肽及其盐的新用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及MEPE多肽及其盐在制备促进肝细胞增殖和/或治疗肝细胞凋亡导致的疾病的用途及含有其的药物。

背景技术

肝脏是人体内最大的内脏器官(约占人体总质量的2.5％)，同时也是中心代谢器官。发挥肝功能的主要是实质细胞，它们占到肝脏细胞总量的80％。肝细胞发挥了一系列作用，包括制造血浆、合成载体蛋白、对消化物的解毒、共轭及荷尔蒙的分泌、调节血脂与氨基酸的合成及代谢等。

细胞凋亡(apoptosis)是细胞在特定环境下的主动自杀过程。细胞凋亡是Kerr等人1972年在研究肝脏局部缺血时观察到细胞调亡和死亡的两个不同图型。细胞凋亡的特征是细胞皱缩，细胞膜呈胞状突起，形成凋亡小体，核碎片和核DNA降解等异常现象。细胞凋亡是临床许多疾病病理变化的主要特征，特别是在肝脏疾病中，肝细胞凋亡是引起肝脏损害的重要因素。肝细胞凋亡在肝脏病变机制中起着重要作用，死亡受体通路的紊乱被认为是激发急/慢性肝损伤发生的重要原因之一。近年来研究表明肝细胞凋亡广泛参与了多种肝病的病理过程，包括肝衰竭、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病等。

肝衰竭(liver failure，LF)是由病毒、药物、酒精等多种因素引起的重型肝脏损害，导致其解毒、排泄、合成等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、重度黄疸、腹水、肝性脑病甚至消化道出血等为主要表现的一组临床症候群，病死率极高，是肝病科临床常见的危急重症之一。《2012年版肝衰竭诊疗指南》根据其病理特征和疾病进程的不同，将肝衰竭分为急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)、亚急性肝衰竭(subacuteliver failure，SALF)、慢加急性(亚急性)肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)和慢性肝衰竭(chronic liver failure，CLF)。肝衰竭是临床急危重症，至今仍缺乏疗效确切的特效药物，因而成为世界性的难治病种之一，尽管人工肝和肝移植是行之有效的治疗方法，但是其昂贵的费用、肝源的紧缺及排斥反应等导致该治疗方法无法在我国得到广泛的推广使用。目前对于新的治疗上述肝疾病的药物和方法存在迫切需求。

TDL23为衍生自细胞外基质磷酸糖蛋白(MEPE)的含23个氨基酸的肽，有报道显示，TDL23可以促进骨、软骨、牙骨的生成，可用于治疗骨与软骨相关疾病(参见专利文献1、2；非专利文献1、2、3)，但尚未见TDL23用于促进肝细胞再生和抑制肝细胞凋亡的报道。ERG15为衍生自TDL23的多肽，由TDL23的第5-19位氨基酸组成，而cERG15是在ERG15的N末端和C末端分别添加一个Cys环化而成，同样未见ERG15和cERG15用于促进肝细胞再生和抑制肝细胞凋亡的报道。

现有技术文献

专利文献1：WO2008091632A2

专利文献2：CN1458935A

非专利文献1：Hayashibara等人，A synthetic peptide fragment of humanMEPE stimulates new bone formation in vitro and in vivo.J Bone Miner Res.2004Mar；19(3):455-62.

非专利文献2：Liu H等人，Dentonin,a fragment of MEPE,enhanced dentalpulp stem cell proliferation.J Dent Res.2004Jun；83(6):496-9.

非专利文献3：Sprowson AP等人，ASARM-truncated MEPE and TDL23 enhanceosteogenesis by promoting osteoprogenitoradhesion.J Orthop Res.2008 Sep；26(9):1256-62。

发明内容

本发明的发明人通过对现有技术存在的大量多肽进行筛选，意外的发现多肽TDL23、ERG15和cERG15不仅能够促进肝细胞增殖，而且可以抑制肝细胞凋亡。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：MEPE多肽及其盐在制备促进肝细胞增殖和/或治疗肝细胞凋亡导致的疾病的用途，所述MEPE衍生多肽为：

a)SEQ ID NO:1所示的多肽，命名为TDL23；或

b)SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸序列中第5-19位氨基酸组成的多肽，命名为ERG15；或

c)SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸序列中第5-19位的氨基酸组成的多肽N末端和C末端分别添加一个Cys经环化得到的环肽，命名为cERG15。

进一步地，所述多肽ERG15具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

进一步地，所述多肽cERG15具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

进一步地，所述盐为多肽的醋酸盐、盐酸盐或磷酸盐，优选为醋酸盐，生物相容性更好。

进一步地，所述药物为液体剂型或冻干粉剂。

进一步地，所述促进肝细胞增殖为体内促进肝再生或体外促进肝细胞生长。

进一步地，所述肝细胞凋亡导致的疾病为肝衰竭、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝或自身免疫性肝病。

进一步地，所述肝衰竭为急性肝衰竭。

本发明提供了一种促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的药物，包含有效量的上述的MEPE衍生多肽及药学上可接受的载体。本领域的技术人员可根据药物的剂型等对药学上可接受的载体进行常规选择。

本发明的发明人通过体外细胞实验证实本发明SEQ ID NO:1-3所示的多肽具有促进肝细胞增殖和抑制肝细胞凋亡的活性，因此本发明的多肽可以用于促进肝细胞增殖或治疗肝细胞凋亡导致的疾病。研究显示，肝细胞凋亡的疾病包括肝衰竭，病毒性肝炎，胆汁淤积性肝损伤，酒精性肝损伤，非酒精性脂肪性肝炎，肝硬化，和毒素或药物介导的肝损伤等，由于本发明的多肽具有抑制肝细胞凋亡的活性，因此可以用于治疗上述疾病。本发明的多肽在急性肝衰竭动物模型中显示对急性肝衰竭的良好治疗效果，进一步证实其可用于肝细胞凋亡相关疾病的治疗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了促进肝细胞增殖和/或治疗肝细胞凋亡导致的疾病的多肽TDL23、ERG15、cERG15，其具有分子量小、易于合成、免疫原性低等优点，对肝细胞凋亡细胞凋亡相关疾病具有良好的治疗效果，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明多肽的HPLC图谱，其中图1A为TDL23，图1B为ERG15，图1C为cERG15；

图2为本发明多肽促进肝细胞增殖的活性结果图；

图3为本发明多肽抑制肝细胞凋亡的活性结果图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一多肽合成

本发明促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽TDL23、ERG15和cERG15采用固相合成工艺合成，纯度＞95％，多肽TDL23、ERG15和cERG15的HPLC图谱分别如图1A、B、C所示，合成500mg。

实施例二检测体外促进肝细胞增殖的活性

本实施例中，人肝细胞系LO2购自ATCC。

本实施例检测实施例一所述多肽体外促进肝细胞增殖的活性的方法为：LO2细胞按常规方法复苏后，置37℃、5％CO₂培养箱里，用含10％FBS和1％双抗的DMEM完全培养基培养。待细胞长满至瓶底85％左右时，用胰蛋白酶-EDTA消化后，加入DMEM完全培养基轻轻吹打，制成细胞悬液，调整细胞浓度，接种到96孔板中，每孔100μL，然后放置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，待用。

将对数期LO2细胞按前期摸索的密度较好的5000个/孔接种至96孔板培养24h。分为正常对照组、模型对照组、TDL23低剂量(0.1μg/mL)、中剂量(1μg/mL)、高剂量(10μg/mL)处理组、ERG15低剂量(0.1μg/mL)、中剂量(1μg/mL)、高剂量(10μg/mL)处理组、cERG15低剂量(0.1μg/mL)、中剂量(1μg/mL)、高剂量(10μg/mL)处理组和阳性对照组，每组6个复孔。培养24h后，吸去培养基，各组加入800μM H₂O₂工作液用细胞3h，正常对照组加入相同体积的培养基作对照。用PBS洗2次，各受试组分别加入相应的含药培养基，正常对照组和模型对照组加入正常培养基作对照，阳性对照组加入1mM的乙酰半胱氨酸(NAC)，继续培养24h。取出96孔板，吸去含药培养基，用PBS洗2次，每孔加入100μL含10％CCK-8溶液的DMEM培养基。继续培养2h后于微孔板分光光度计中测定450nm下OD值。计算细胞活力(Cell Viability)＝OD实验组/OD对照组平均值。

结果见图2，可看出，多肽TDL23、ERG15和cERG15均具有明显促进肝细胞增殖的作用，且量效关系明显。与模型对照组相比，TDL23高剂量组、ERG15和cERG15中、高剂量组对肝细胞增殖的促进作用具有统计学显著差异(**代表P＜0.01)。

实施例三检测体外抑制肝细胞凋亡的活性

本实施例检测实施例1所述多肽体外抑制肝细胞凋亡的活性的方法为：

人肝细胞HL-7702铺96孔板，细胞浓度为1×10⁵个/ml，每孔100μl，即每孔细胞为1×10⁴个，每孔加入20ng/mL放线菌素D2(Act D2)处理30min、80ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理48h，建立细胞凋亡模型。加入相应的多肽处理，加药体积为10μl，终浓度分别为0.1、1、10μg/ml，并以同体积的PBS作为阴性对照，0.2μg/ml的表皮生长因子(EGF)为阳性对照。

药物处理24h后，每孔加入100μl Caspase-

试剂(caspase-/>

3/7 Assaypromega公司提供，货号：G8090)，在摇板机上以300-500rpm的转速轻柔混匀每孔的内容物约30秒。在室温(18-22℃)孵育30分钟到3小时。在荧光发光仪(Luminometer)(Promega，GloMax生物发光检测仪)上测量每个样品的荧光值。

结果见图3，多肽TDL23、ERG15和cERG15均具有显著抑制肝细胞凋亡的作用，且量效关系明显。与模型对照组相比，TDL23和ERG15的低、中、高剂量组以及cERG15的中、高剂量组对肝细胞凋亡的抑制作用具有统计学显著差异(*代表P＜0.05，**代表P＜0.01)。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所述技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州领晟医疗科技有限公司

<120> 多肽及其盐的新用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly

1 5 10 15

Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln

1 5 10 15

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Cys Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln

1 5 10 15

Cys

Claims (4)

1.MEPE衍生多肽及其盐在制备治疗肝细胞凋亡导致的疾病的药物中的用途，其特征在于，所述MEPE衍生多肽为：

a）氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；或

b）SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸序列中第5-19位氨基酸组成的多肽；或

c）SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸序列中第5-19位的氨基酸组成的多肽N末端和C末端分别添加一个Cys经环化得到的环肽；

所述疾病为急性肝衰竭；

所述盐为多肽的醋酸盐、盐酸盐或磷酸盐。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述MEPE衍生多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述MEPE衍生多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；所述MEPE衍生多肽为N末端和C末端经环化得到的环肽。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为液体剂型或冻干粉剂。

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