CN107827952B

CN107827952B - 一个新的具有hiv-1蛋白酶抑制活性的拟肽类化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN107827952B
Application number: CN201711225228.0A
Authority: CN
Inventors: 司书毅; 陈明华; 常珊珊; 董飚; 巫晔翔; 姜威; 余利岩; 樊秀勇
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2037-11-29
Also published as: CN107827952A

Abstract

本发明属于天然药物技术领域，具体地，本发明涉及从微生物中，特别是链霉菌发酵产物中获得新的拟肽类化合物，及其药用盐类在制备预防和治疗与HIV感染的相关的疾病，例如艾滋病。本发明所述的拟肽类化合物或其药用盐，其结构如下所示：

Description

一个新的具有HIV-1蛋白酶抑制活性的拟肽类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于天然药物技术领域，具体地，本发明涉及从微生物中，特别是链霉菌发酵产物中获得新的拟肽类化合物，及其药用盐类在制备预防和治疗与HIV感染的相关的疾病，例如艾滋病。

背景技术

艾滋病(AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的免疫和中枢神经系统的退行性疾病。自1981年在美国发现首例患者，HIV已在全球大范围传播，被称为“20世纪的瘟疫”。三十余年以来，已有200余个国家和地区，大约3400万人感染了HIV，270万成为新发感染者，其中39万儿童以及180万感染者已死亡。因此，艾滋病对人类健康生存及社会经济发展构成了严重的威胁，引起了全世界的广泛关注[1,2]。

近些年来，人们对HIV作用机制有了清楚的了解，发现HIV逆转录酶、蛋白酶和整合酶是HIV基因在复制过程中的3个关键酶，到目前为止抗HIV/AIDS药物的研究与开发主要是针对这3个关键酶进行设计[3]。有关HIV逆转录酶及蛋白酶抑制剂的研究最为广泛，FDA已批准了10个蛋白酶抑制剂和13个逆转录酶抑制剂[4]。

HIV蛋白酶是由两条相同的肽链组成的同质二聚体，具有C2对称轴，每条肽链由99个氨基酸残基构成。HIV蛋白酶的活性中心位于两条肽链之间，由两个起催化作用的天冬氨酸(Asp 25和Asp 25′)组成。在这两个天冬氨酸残基的附近有一个水分子，在催化过程中此水分子作为亲核体。两个单体相同的氨基酸残基构成与底物键合的缝隙，其一边由上述的两个天冬氨酸残基组成，另一边是由此二聚体形成的β-发卡式的结构。HIV蛋白酶可以裂解难以水解的肽键，如：Tyr-Pro和Phe-Pro[5,6]。

HIV蛋白酶在病毒复制过程中的主要作用是将gag和gag-pol基因产物裂解成病毒成熟所需要的结构蛋白(基质、壳、核壳)和酶类(蛋白酶、整合酶、逆转录酶)[7]。虽然在体内抑制这种酶的活性，其子代病毒仍会产生，但形成的病毒却是不成熟和不具传染性的。因此抑制HIV蛋白酶，可阻止病毒进一步感染[8]。

目前被批准临床使用的蛋白酶抑制剂有10种，分别是沙奎那韦(Saquinavir,SQV)、利托那韦(Ritonavir,RTV)、茚地那韦(Indinavir,IDV)、奈非那韦(Nelfinavir,NFV)、安普那韦(Amprenavir,APV)、洛匹那韦(Lopinavir,LPV)、安扎那韦(Atazanavir,ATV)、福司安普那韦(Fosamprenavir,FMP)、替派那韦(Tipranavir,TIV)和达如那韦(Darunavir,DRV)。

这些肽类化合物或作为底物类似物竞争性的抑制蛋白酶活性，或以其对称的结构抑制蛋白酶活性位点，或是基于HIV蛋白酶的结构而设计的特殊抑制剂。与核苷类药物相比，蛋白酶抑制剂的抗病毒能力高，IC50值往往在nmol/L水平，但长期使用这些蛋白酶抑制剂仍会产生明显的毒副作用和耐药性。脂代谢是多种副作用中最突出且最复杂的，临床表现为面部和外周脂肪消耗，腹、背、胸部脂肪积聚。病人出现高甘油三酯血症和高胆固醇血症、乳酸和血糖升高、对胰岛素产生耐药性等[9]。其次是耐药性，尤其是交叉耐药性是导致临床治疗失败的一个主要原因。

目前有效治疗AIDS的方法是蛋白酶抑制剂与逆转录酶抑制剂，及其它抑制剂的联合用药，即高效抗逆转录病毒疗法(HAART),俗称“鸡尾酒疗法”[10-13]。然而，在艾滋病的治疗过程中，不管是“鸡尾酒疗法”还是单独给药，疗效都不是100％，病人得不到根治，而且，都会不同程度地出现药物依赖性、耐药性、药物间相互作用、以及药物无法进入病毒宿主等问题。目前也尚无有效的HIV疫苗问世，而新出现的HIV病毒株又表现出对临床治疗药物越来越明显的耐药性。因此，寻找新的有效、价廉、具有良好抗耐药活性的药物或治疗方法，已经成为抗HIV治疗中的重大课题。

天然药物资源丰富，从微生物、药用植物及海洋生物中寻找抗HIV活性成分的研究受到越来越多的重视[14-16]。微生物次级代谢产物相对于动植物次级代谢产物来讲，具有更易开发利用、不破坏生态环境、资源具有可持续发展性，可通过发酵大量获得和易于采用生物技术等优点。迄今为止，世界范围内曾经获得的具有可靠结构表述的天然微生物次级代谢产物只有2万多个，而直接作为药物或经改造成为临床用药或农用的微生物产物接近200个，是所有化合物种类中成药率最高的。

因此，微生物药物在临床用药中具有重要的地位。近年从微生物中发现的抗HIV活性成分对人体副作用较小，故从中筛选抗HIV药物具有良好的发展前景。

本发明从一株链霉菌4862中大米发酵产物的活性组分中分离纯化，并鉴定了一个新的拟肽类化合物Ahmpatinin ⁱBu，活性测试结果表明，该化合物对HIV-1蛋白酶有很强的抑制活性，涉及该拟肽类化合物1的化学结构、制备方法及抗HIV-1蛋白酶活性，迄今为止，尚未见有相关报道。

参考文献

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发明内容

本发明目的之一是，提供一株产生拟肽类化合物的菌株(链霉菌4862)。

本发明所述的菌株，保藏编号：CGMCC No.4766。

该菌株于2011年04月18日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.4766。

本发明目的之二是，提供一种拟肽类化合物或其药用盐。

本发明所述的拟肽类化合物及其药用盐，该化合物的结构如式I所示：

该化合物的分子式为：C₃₇H₆₁N₅O₁₀，分子量为：735。

本发明所述的拟肽类化合物的药用盐，包括与无机酸，如盐酸、硫酸形成的盐，与有机酸，如乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、草酸、琥珀酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、扁桃酸、抗坏血酸或苹果酸形成的盐，以及氨基酸，如丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸形成的盐或与磺酸，如甲磺酸、对甲苯磺酸形成的盐。

本发明目的之三是，提供所述拟肽类化合物或其药用盐的制备方法。

本发明首次从保藏编号：CGMCC No.4766的菌株(链霉菌4862)中分离提取出式Ⅰ所示的化合物。

本发明所述的拟肽类化合物或其药用盐的制备方法，包括以下步骤：

先取链霉菌4862经大米发酵得到大米发酵产物，将大米发酵产物经10-20L 70-99％乙醇超声提取2-4次、在用5-15L 30-70％乙醇提取2-4次，合并提取液，减压浓缩后得到水混悬液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位浸膏；所得浸膏利用正相硅胶色谱柱色谱分离，依次用石油醚、石油醚-丙酮、丙酮、甲醇梯度洗脱，其中石油醚-丙酮馏分为活性组分，然后该活性组分经HPLC制备和半制备纯化，得到式I所示化合物。

优选的，本发明所述的拟肽类化合物或其药用盐的制备方法，包括以下步骤：

链霉菌4862经大米发酵后，大米发酵产物经10L 95％乙醇超声提取3次、10L 50％乙醇提取3次，合并提取液，减压浓缩后得到水混悬液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位浸膏；所得浸膏利用正相硅胶色谱柱色谱分离，依次用石油醚、石油醚-丙酮(9:1)、石油醚-丙酮(5:1)、石油醚-丙酮(2:1)和石油醚-丙酮(1:1)、丙酮、甲醇梯度洗脱，其中石油醚-丙酮(1:1)馏分为活性组分，然后该活性组分经HPLC半制备纯化(Capcell-Pak C₁₈ 5μm,10×250mm,37％CH₃CN/含0.1％TFA的H₂O,1.5ml/min)得到式I所示化合物。

其中，链霉菌4862，该菌株于2011年04月18日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.4766。

该菌株已经在中国专利2012101354644中予以公开，属于现有产品。

本发明的目的之四是，提供式I所示化合物或其药用盐的药物应用。

本发明所述的化合物或其药用盐在制备抗艾滋病的药物中的应用。

本发明所述的化合物或其药用盐在制备抗HIV-1蛋白酶活性上的应用。

本发明采用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型筛选链霉菌4862的发酵物、提取馏分及所分离获得的式I所示的拟肽类化合物的抗HIV-1蛋白酶活性。实验结果表明，式I所示的化合物显示很强的抗HIV-1蛋白酶活性。表明所述拟肽类化合物可用作制备抗HIV感染的相关疾病的药物；而以所述拟肽类化合物作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗HIV感染的药物组合物。所述药物及药物组合物可用于抗HIV感染的临床治疗。所述化合物也可与已知药物组成复方制剂用于抗HIV感染疾病的治疗。

本发明中经微生物发酵制备式Ι所述拟肽类化合物1的方法，可适用于其他能产生此化合物的任何微生物。

本发明的目的之五是，提供含有式I所示化合物或其药用盐的药物组合物的应用。

含有式I所示化合物或其药用盐的药物组合物在制备抗艾滋病的药物中的应用。

含有式I所示化合物或其药用盐的药物组合物在制备抗HIV-1蛋白酶活性上的应用。

本发明的目的之六是，提供一种含有式I所示化合物或其药用盐的药物组合物。

本发明所述的药物组合物，还含有药物上可接受的载体。

本发明所述的药物组合物，以式(I)所示化合物及其药用盐作为药物活性成分。

药物组合物含有的式(I)所示化合物或其药用盐在组合物中的重量比为0.1～99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1～99.9％。

药物组合物以适合药用的制剂形式存在。

药用的制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、混悬剂、注射剂、粉针剂、栓剂、霜剂、滴剂或贴剂。其中，所述片剂为糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂或缓释片剂；所述胶囊剂为硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂；所述粉针剂为冻干粉针剂。

本发明的药物组合物，作为制剂形式，每剂中含有的发明化合物的有效量为0.1～1000mg，所述每剂指的是，每一制剂单位，如片剂的每片，胶囊的每粒，也可指每次服用剂量，如每次服用100mg。

本发明的药物组合物在制备成粉剂、片剂、可分散粉剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和软膏形式的固体或半固体药物制剂时，可使用固体载体。可使用的固体载体优选为选自稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、膨胀剂等中的一种或多种物质，或可为包封物质。在粉状制剂中，在载体中含有5～70％的微粒化活性成分。适宜的固体载体包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低沸点蜡、可可脂等。由于它们易于给药，片剂，粉剂、扁囊剂和胶囊等代表最有利的口服固体制剂。

本发明的液体制剂包括溶液、悬液和乳液。例如，非胃肠道给药的注射制剂可为水或水-丙二醇溶液形式，调节其等渗度，pH等使适于活体的生理条件。液体制剂还可制成在聚乙二醇、水溶液中的溶液形式。可通过将活性成分溶解在水中，再加入适量的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂，来制备口服水溶液。可将微粒化的活性成分分散在粘性物质如天然和合成胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它已知悬浮剂中制备适于口服的水悬液。

为了易于给药及剂量均一，将上述药物制剂配制成剂量单位形式是特别有利的。制剂的剂量单位形式指适于作为单一剂量的物理分离单位，每个单位含有产生所期望的治疗效果的计算好的预定量的活性成分。这种剂量单位形式可为包装形式，如片剂、胶囊或装在小管或小瓶中的粉剂，或装在管或瓶中的软膏、凝胶或霜剂。

虽然剂量单位形式中所含活性成分的量可以变化，但一般根据所选择活性成分的效力，调节在1～800mg范围内。

本领域技术人员可按常规方法确定适于某种情况的优选剂量。一般，开始治疗的量低于活性成分的最佳剂量，然后逐渐增加给药剂量，直到达到最佳治疗效果。为治疗需要，总的日剂量可一次给药或分数次给药。

本发明从一株链霉菌4862的发酵产物中分离制备获得如式Ι所示新型拟肽类化合物，对HIV-1蛋白酶具有很强的抑制活性，有望开发成为临床上抗HIV感染的新型药物。

本发明式(I)所示化合物，与现有的同类抗HIV药物相比，具有更加优越的治疗效果。而且，本发明的药物安全性更高，有效的降低药物的毒副作用。同时，本发明的制备方法工艺简单，用时短，大大降低药品的成本，适合大规模生产。

附图说明

图1：(3S,4S)和(3R,4S)-Statine以及(3R,4R)和(3S,4R)-Statine 2对混合物的合成路线图

图2：(3S,4S)、(3R,4S)、(3R,4R)和(3S,4R)-Ahmppa的合成路线图

图3：化合物1的高分辨电喷雾质谱

图4：化合物1的红外光谱

图5：化合物1的¹H NMR谱

图6：化合物1的¹³C NMR谱

图7：化合物1的¹H-¹H COSY谱

图8：化合物1的HSQC谱

图9：化合物1的HMBC谱

实施方案：

本发明实施方案适用于从任何微生物，而不限于从链霉菌发酵物制备拟肽类化合物。以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>用于链霉菌4862的发酵：

取活化的链霉菌4862菌种接种于接种到YM斜面，28℃恒温箱培养一周，传代后同法复壮一次。将种子斜面挖块，碾碎接种于3个装有100mL发酵培养基(葡萄糖0.5％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，玉米浆0.4％，黄豆饼粉1％，淀粉2％，碳酸钙0.4％，二氯化钴0.0004mg/L，调节pH为7.2，121℃，30min灭菌。)的500mL锥形瓶中，28℃振摇培养48h后，作为种子液。用无菌水将种子液稀释成1×10⁶/mL的菌悬液。每个500ml的三角瓶中放入80g大米及120ml蒸馏水，封口、浸泡过夜后在121℃，灭菌30min，冷却后向每瓶加入10ml上述菌悬液(共30瓶)，并在28℃培养30天，得到链霉菌4862大米发酵物。

<实施例2>链霉菌4862发酵物的提取与浸膏的获得：

取实施例1中大米发酵物经10L 95％乙醇/水超声提取3次、10L 50％乙醇/水提取3次，合并提取液，减压浓缩后得到水混悬液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位浸膏。

<实施例3>化合物1的分离、制备及结构鉴定：

取实施例2所得浸膏利用正相硅胶色谱柱色谱分离，依次用石油醚、石油醚-丙酮(9:1)、石油醚-丙酮(5:1)、石油醚-丙酮(2:1)和石油醚-丙酮(1:1)、丙酮、甲醇梯度洗脱，其中石油醚-丙酮(1:1)馏分为活性组分，然后该活性组分经HPLC半制备纯化(Capcell-PakC185μm,10×250mm,37％CH₃CN/含0.1％TFA的H2O,1.5ml/min)得到式I所示化合物。

式I所示化合物1的结构鉴定

(1)化合物1为白色粉末，易溶于丙酮-水混合溶液，不溶于石油醚、乙酸乙酯等。[α]_D ²⁰-75(c 1.5，CH₃CN:H₂O 1:1)。低分辨喷雾质谱(ESI-MS)给出准分子离子峰m/z 736[M+H]⁺，高分辨电喷雾质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 736.4474[M+H]⁺，提示其分子组成为C₃₇H₆₁N₅O₁₀(calcd for C₃₇H₆₂N₅O₁₀,736.4491)，不饱和度为10。化合物1的氢谱和碳谱数据与Ahpatinin ⁱBu[Sun Y.et al.Lower homologues of ahpatinin,aspartic proteaseinhibitors,from a marine Streptomyces sp.J Nat.Prod.,2014,77,1749-1752]的文献报道数据非常相似，但是氢谱显示，Ahpatinin ⁱBu的单取代苯环信号被化合物1中的4-甲氧基-1-取代的苯环信号[δ_H 6.80(2H,d,J＝8.4Hz),7.12(2H,d,J＝8.4Hz)]所代替，这也得到了二维核磁共振波谱(¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC和NOESY谱)的确证。HMBC谱中显示，4-OMe与C-4相关，Ahmppa中的δ-H与C-1、C-2、C-6、C-γ-Ahmpp和C-β-Ahmpp相关信号，Ahmppa中的α-H与C-CO-Ahmppa、C-β-Ahmpp和C-γ-Ahmpp相关信号，Ahmppa中的β-H与C-CO-Ahmppa相关信号，Ahmppa中的NH与C-γ-Ahmpp相关信号，这充分说明该结构中含有一个4-amino-3-hydroxy-5-(4-methoxyphenyl)pentanoic acid[Ahmppa]单元。HMBC谱中，也能观察到Val¹的α-H以及NH与异丁酰基(ⁱBu)的羰基相关表明Val¹与异丁酰基形成酰胺键相连，Val²的α-H与Val¹的羰基相关表明Val²与Val¹相连，statine单元中的γ-H与Val²的羰基相关表明statine与Val²相连，Ala中的α-H与statine的羰基相连。NOESY谱中显示，Val¹中的NH与异丁酰基的α-H相关，Val²中的NH与Val¹中的α-H相关，statine单元中的NH与Val²中的α-H相关，Ala中的NH与statine的α-H相关，这些也验证了上述之间的连接关系。另外，在NOESY谱中还能观察到Ahmppa单元中的NH与Ala中的α-H相关，说明Ahmppa单元与Ala相连。由上得出了各个片段之间的连接顺序：ⁱBu-Val¹-Val²-Statine-Ala-Ahmppa。由此我们确定了化合物1的平面结构。

表1化合物1的NMR数据(600MHz,DMSO-d₆)

(2)化合物1中Val和Ala氨基酸残基α-C的构型确定：应用Marfey反应[MarfeyP.Determination of D-amino acids.Ⅱ.Use of a bifunctional reagent,1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Carlsberg Res Commun,1984,49(6):591-596]，确定了化合物1中的Val¹、Val²和Ala的绝对构型。

简而言之，取1mg化合物1，加入2ml 6N HCl，并在110℃温育16h。温育结束后，用隔膜泵抽干溶液，并将干燥的水解产物置于两个1.5ml EP管中。用丙酮将FDAA(1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺)配置成浓度为1％(w/v)的溶液，将100μL该FDAA溶液加入含有化合物1的水解产物的EP管中，并加入1.0N NaHCO₃溶液40μL，然后将该反应混合物置于室温反应过夜。向反应混合物中加入2N HCl溶液20μL进行酸化中和，获得化合物1水解产物的FDAA衍生物。用相同的方法处理标准的D-型和L-型的氨基酸，作为对照。然后使用高效液相色谱HPLC(Angilent C₁₈SB-Aq column：5μm,4.6×150mm；所用流动相为A：H₂O(0.1％CF₃COOH)，B：乙腈；洗脱条件为20-50％乙腈/水梯度，洗脱时间为60min，流速为1.0ml/min；检测波长为340nm，柱温为30℃)，分析化合物1的水解产物和标准D-型和L-型氨基酸的FDAA衍生物，并比较它们的保留时间(t_R)，以确定化合物1的水解产物的氨基酸构型。结果示于表2。

表2化合物1的水解产物与标准氨基酸的FDAA衍生物的HPLC分析

氨基酸的FDAA衍生物	t<sub>R</sub>
		D-Val	49.43
L-Val	44.10
		D-Ala	39.93
L-Ala	36.26
		水解产物	36.30
	44.16

表2的分析结果表明，化合物1的Val和Ala均为L型。

(3)化合物1中Statine残基C-3和C-4构型的确定。

(3-1)(3S,4S)和(3R,4S)-Statine以及(3R,4R)和(3S,4R)-Statine 2对混合物的合成[Sun Y.et al.Lower homologues of ahpatinin,aspartic protease inhibitors,from a marine Streptomyces sp.J Nat.Prod.,2014,77,1749-1752]：

取500mg Boc-L-亮氨酸溶于5ml二氯甲烷，加入806mg米氏酸、381mg DMAP、512mgEDC-HCl室温搅拌1h。反应后的混合物用6ml的5％KHSO₄洗涤2次，饱和NaCl水溶液洗涤一次，蒸干有机相。将蒸干得到的固体溶解于4ml乙酸乙酯中，加热回流1h。乙酸乙酯溶液蒸干，所得固体溶于6ml甲醇，上硅胶柱，流动相用不同比例的CH₂Cl₂:MeOH洗脱(CH₂Cl₂、30:1、20:1、10:1、5:1和1:1)，回收二氯甲烷-甲醇10:1和5:1洗脱流份，得386mg白色固体。取100mg白色固体化合物溶于2.5mL二氯甲烷和TFA混合溶液(3:2)，室温搅拌10min，浓缩蒸干，再溶于2mL的二氯甲烷-冰醋酸(9:1)，0℃冰浴，30mg NaBH₄分成两部分先后加入到溶液中，室温搅拌45min，反应后浓缩干燥。将干燥后的固体化合物上硅胶柱纯化，用不同浓度CH₂Cl₂:MeOH梯度洗脱(CH₂Cl₂、30:1、20:1、10:1和5:1)，合并二氯甲烷-甲醇5:1洗脱流份，蒸干得固体。将固体分别溶解于2ml 6N HCl水溶液，加热110℃回流1.5h，冷却，回收溶剂蒸干，用高效液相色谱HPLC半制备，制备条件为(日本资生堂CAPCELL PAK C₁₈-AQ column：5μm,10.0×250mm；所用流动相为A：H₂O(0.1％CF₃COOH)，B：乙腈；洗脱条件为14％乙腈/0.1％CF₃COOH水溶液，流速为1.5ml/min；检测波长为220nm，柱温为30℃)，回收溶剂，制得(3S,4S)(主要产物)和(3R,4S)-Statine的混合物58mg。

方法同上用500mg Boc-D-亮氨酸最终制得(3R,4R)和(3S,4R)-Statine的混合物73mg。

(3-2)取5mg化合物1，加入2ml 6N HCl，并在110℃温育16h。温育结束后，用隔膜泵抽干溶液，溶于适量水溶液中，并将其混合物进行高效液相色谱半制备，制备条件为(资生堂CAPCELL PAK C₁₈-AQ column：5μm,10.0×250mm；所用流动相为A：H₂O(0.1％CF₃COOH)，B：乙腈；洗脱条件为14％乙腈/水洗脱，流速为1.5ml/min；检测波长为220nm，柱温为30℃)，收集25.23min的化合物，并进行NMR测试，其核磁图谱与(3S,4S)和(3R,4R)两种构型一致，然后对其进行旋光测试，测得旋光值为[α]_D ²⁰＝-18.5(c 0.05,H₂O)与参考文献[TakemotoY.et al.An expeditious synthesis of(3S,4S)-statine and(3S,4S)-cyclohexylstatine,Tetrahedron Lett,1990,31(2):217-218]中的(3S,4S)-statine{[α]_D ²⁰＝-20.4(c 0.502,H₂O)}比较，确定化合物1中Statine单元的C-3和C-4的构型为(3S,4S)。

(4)化合物1中Ahmppa残基C-3和C-4构型的确定。

(4-1)N-Boc-4-甲氧基-L-酪氨酸的制备：取500mg 4-甲氧基-L-酪氨酸溶于15ml2N的碳酸钠水溶液，冰浴搅拌，逐滴滴加839mg(Boc)₂O，升温至室温，用饱和碳酸钠水溶液调节pH 10-11，反应过夜。用乙酸乙酯萃取两次，取水相用4N的HCl水溶液调节pH至2。用乙酸乙酯快速萃取3次，合并有机相，回收溶剂，干燥制得635mg N-Boc-4-甲氧基-L-酪氨酸。

取635mg N-Boc-4-甲氧基-L-酪氨酸溶于5ml二氯甲烷，加入350mg米氏酸、300mgDMAP、460mg EDC-HCl室温搅拌1h。反应后的混合物用6ml的5％KHSO₄洗涤2次，饱和NaCl水溶液洗涤一次，蒸干有机相。将蒸干得到的固体溶解于4ml乙酸乙酯中，加热回流1h。静止放置2h，溶液析出白色结晶，用乙酸乙酯洗涤再过滤，得370mg白色固体。取200mg白色固体化合物溶于2.5ml二氯甲烷和TFA混合溶液(3:2)，室温搅拌10min，浓缩蒸干，再溶于2ml的二氯甲烷-冰醋酸(9:1)，0℃冰浴，50mg NaBH₄分成两部分先后加入到溶液中，室温搅拌45min，反应后浓缩干燥。将干燥后的固体化合物上硅胶柱纯化，用不同浓度的CH₂Cl₂:MeOH梯度洗脱(CH₂Cl₂、50:1、40:1、30:1、20:1和10:1)，并用薄层色谱TLC检测，可在二氯甲烷-甲醇10:1洗脱部分看到两个斑点，分别合并蒸干得固体。将固体分别溶解于2ml 6N HCl水溶液，加热110℃回流1.5h，冷却，回收溶剂蒸干，分别用HPLC半制备(资生堂CAPCELL PAKMGII C₁₈column：5μm,10.0×250mm；所用流动相为A：H₂O(0.1％CF₃COOH)，B：乙腈；洗脱条件为20％乙腈/0.1％CF₃COOH水洗脱，流速为1.5ml/min；检测波长为220nm，柱温为30℃)，分别制得(3S,4S)-4-amino-3-hydroxy-5-(4-methoxyphenyl)pentanoic acid[(3S,4S)-Ahmppa,39mg]，(3R,4S)-4-amino-3-hydroxy-5-(4-methoxyphenyl)pentanoic acid[(3R,4S)-Ahmppa,23mg]。合成路线见图2。

方法同上用取502mg N-Boc-4-甲氧基-D-酪氨酸最终分别制得[(3R,4R)-Ahmppa,31mg]和[(3S,4R)-Ahmppa,17mg]。

(4-2)采用配位交换色谱柱MCI GEL CRS10W型号的柱子测定Ahmppa中OH-3和NH-4构型：使用高效液相色谱HPLC[MCI GEL CRS10W column：(3μm,4.6×50mm)；所用流动相为2mM CuSO4水溶液，流速为0.8ml/min；检测波长为254nm，柱温为30℃]，分析化合物1的水解产物和标准的(3S,4S)、(3R,4S)、(3R,4R)和(3S,4R)-Ahmppa，并比较它们的保留时间(t_R)，以确定化合物1的水解产物中Ahmppa构型。结果示于表3中。

表3化合物1的水解产物与标准Ahmppa的HPLC分析

氨基酸的FDAA衍生物	t<sub>R</sub>
		(3S,4S)-Ahmppa	11.96
(3R,4S)-Ahmppa	10.63
		(3R,4R)-Ahmppa	10.06
(3S,4R)-Ahmppa	10.36
		水解产物	12.07

表3的分析结果表明，化合物1中Ahmppa C-3和C-4的绝对构型为(3S,4S)。

本发明化合物的结构式为：

<实施例4>式Ⅰ化合物的抗HIV-1蛋白酶活性测试

取待测化合物1mg，配成1mg/mL的DMSO溶液。取2μL，加入到200μL反应缓冲液(0.1mol/L NaAc,0.9mol/L NaCl,1.0mmol/L DTT,1.0mmol/L EDTA)中，则初始浓度为10μg/mL。逐级用反应缓冲液稀释，分别得到待测化合物浓度为1μg/mL、0.1μg/mL，加入底物，使其浓度为10μL/mL。向无底物反应缓冲液中加入HIV-1蛋白酶(应用HIV-1蛋白酶的融合蛋白表达载体p100w表达)，使其浓度为50μL/mL(蛋白酶原液/无底物缓冲液)，冰浴。取蛋白酶的反应缓冲液加入到前述已加入样品和底物的反应缓冲液中，留两个孔加无底物、无蛋白酶的反应缓冲液做为空白对照，另留两个孔加阳性药茚地那韦，37℃反应3min，在荧光检测仪中以355nm激发光和490nm发射光连续进行测定读数。按照以下公式计算待测化合物的HIV-1蛋白酶抑制率：

HIV-1蛋白酶抑制％＝(未加待测样品的荧光吸收值-加入待测样品后的荧光吸收值)/未加待测样品的荧光吸收值*100％

以1μg/mL为初始浓度，二倍逐级稀释，测定每个浓度下的抑制率，从而得到待测样品的IC₅₀值。

实验结果：式Ⅰ化合物对HIV-1蛋白酶抑制作用IC₅₀值为1.79nM[阳性药茚地那韦(IC₅₀：1.82nM)]。

<实施例5>MTT法测定化合物式Ⅰ的细胞毒性

实验方法：将对数生长期的Hela(宫颈癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、U2OS(人骨肉瘤细胞)用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/mL。铺板，将调整浓度后的细胞培养液加入96孔板板的孔中，每孔100μl，周边以无血清的培养基封闭，将细胞置于培养箱中培养至对数期。将阳性化合物及待测化合物以无血清的培养基梯度稀释，每孔加入100μl，使药物终浓度分别为100μM,10μM,1μM,100nM,50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.13nM。每个浓度设立3个复孔，设立空白(血清)对照组和2％DMSO对照组。

呈色:随时观察细胞的病变情况，在50％的细胞发生病变时直接倒掉培养基，加入0.5g/LMTT 22μl，继续培养4小时。取出96孔板，弃上清液，每孔加入150μl DMSO，平板摇床震荡10分钟，使紫色小颗粒溶解。酶标仪测定各孔的光吸收，波长为570nm。通过与空白对照组相比，得到细胞的增殖抑制率。

化合物式Ⅰ细胞毒性结果：化合物式Ⅰ对三种人癌细胞Hela(宫颈癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、U2OS(人骨肉瘤细胞)均无明显的细胞毒性(IC₅₀>100μM)。

Claims

1.一种拟肽类化合物或其药用盐，其特征在于，该化合物的结构如式I所示：

2.根据权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐，其特征在于，该化合物的药用盐，包括与无机酸，或与有机酸形成的盐。

3.根据权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐，其特征在于，式Ⅰ所示的化合物是从链霉菌4862大米发酵产物中分离提取出的，其中链霉菌(Streptomyces sp.)4862，该菌株于2011年04月18日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.4766。

4.权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

先取链霉菌4862经大米发酵得到大米发酵产物，将大米发酵产物经10-20L 70-99％乙醇超声提取2-4次、再用5-15L 30-70％乙醇提取2-4次，合并提取液，减压浓缩后得到水混悬液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位浸膏；所得浸膏利用正相硅胶色谱柱色谱分离，依次用石油醚、石油醚-丙酮、丙酮、甲醇梯度洗脱，其中石油醚-丙酮馏分为活性组分，然后该活性组分经HPLC半制备纯化，得到式I所示化合物。

5.权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：链霉菌4862经大米发酵后得到大米发酵产物，将大米发酵产物经10L 95％乙醇超声提取3次、10L 50％乙醇提取3次，合并提取液，减压浓缩后得到水混悬液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位浸膏；所得浸膏利用正相硅胶色谱柱色谱分离，依次用石油醚、石油醚-丙酮9:1、石油醚-丙酮5:1、石油醚-丙酮2:1和石油醚-丙酮1:1、丙酮、甲醇梯度洗脱，其中石油醚-丙酮1:1馏分为活性组分，然后该活性组分经HPLC半制备纯化得到式I所示化合物。

6.权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐在制备抗艾滋病的药物中的应用。

7.权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐在制备抗HIV-1蛋白酶活性的药物中的应用。

8.含有权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐的药物组合物在制备抗艾滋病的药物中的应用。

9.含有权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐的药物组合物在制备抗HIV-1蛋白酶活性的药物中的应用。

10.含有权利要求1所述的拟肽类化合物或其药用盐的药物组合物。