CN102596904A - 蛋白酶抑制剂、组合物及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及草抑制素A、B和C，以及它们的分离或纯化形式。本发明的化合物可用作天冬氨酸蛋白酶、γ分泌酶、或金属蛋白酶抑制剂。还公开了使用该化合物及其组合物的方法。

Description

蛋白酶抑制剂、组合物及使用方法

相关申请

本申请要求于2009年6月26日提交的美国临时专利申请第61/221,027号的利益和优先权，其内容并入本文以作参考。 

对受联邦政府资助的研究中所作出的发明的权益声明

本工作部分得到美国国家卫生研究院/NIGMS资助金的支持，资助金号P41GM086210。政府在本发明中享有一定权力。 

背景技术

蛋白酶涉及多种过程，例如血液凝固、细胞周期、感染和神经退行性病症(Turk等人，Nat.Rev.Drug Discov.2006，5，785-799；López-Otín等人，J.Biol.Chem.2008，283，30433-30437)。因此它们是具有吸引力的药物靶标。然而，对于蛋白酶的非选择性抑制会引起严重的副作用。例如，对于金属蛋白酶的非选择性抑制被认为是在对于癌症治疗所评估的早期基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂中见到的肌骨胳副作用的原因(Coussens等人，Science 2002，295，2387-2392)。 

修饰肽具有用作蛋白酶抑制剂的潜力。已经致力于在由海洋蓝细菌产生的天然产物中寻找蛋白酶抑制剂(参见Matthew等人，J.Nat.Prod.2007，70，124-127；和Taori等人，J.Nat.Prod.2007，70，1593-1600)。已知该类生物产生大量次生代谢物，其中有具有有效细胞毒性的亲脂性修饰肽(Luesch等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，5418-5423；Taori等人，J.Am.Chem.Soc.2008，130，1806-1807)。 

近年来，随着分离科学、光谱技术、和基于微板的超灵敏体外检测领域的新发展，对于天然产品开发的兴趣已经有显著的复苏，例如，以寻找可以用作选择性蛋白酶抑制剂的新天然产物。 

发明内容

一方面，本发明提供分离的和/或纯化的选自具有以下结构的草抑制素（grassystatin）A（1）、B（2）、和C（3）或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物：

另一方面，本发明提供药物组合物，其包括选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物，以及药学上可接受的载体或稀释剂。 

另一方面，本发明提供在受试者中治疗天冬氨酸蛋白酶相关的疾病或病症的方法（例如，被鉴定为需要该治疗的受试者），其中该方法包括对受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。在某些实施方式中，天冬氨酸蛋白酶相关的疾病或病症是与组织蛋白酶D或组织蛋白酶E相关的病症。 

本发明也提供在受试者中治疗金属蛋白酶相关的疾病或病症的方法(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)，其中该方法包括对受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。在某些实施方式中，金属蛋白酶相关的疾病或病症是TACE(肿瘤坏死因子(TNF)-转化酶)相关的疾病或病症。 

另一方面，本发明提供在受试者中，或在细胞中对金属蛋白酶进行体外抑制的方法。 

另一方面，本发明提供在受试者中治疗疾病或病症的方法(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)，其中该方法包括对受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。在某些实施方式中，疾病或病症选自血液凝固病症、细胞周期病症、感染、神经退行性病症、自身免疫病症、过敏性疾病、癌症、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、AIDS、移植排斥、和细胞内病原体相关的疾病。在某些实施方式中，疾病或病症是类风湿关节炎或哮喘。 

本发明也提供在受试者中抑制T细胞增殖的方法(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)，其中对受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。 

另一方面，本发明提供在受试者中(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)或在细胞中减少IL-17产生的方法，其中该方法包括对受试者或细胞施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。 

本发明的另一方面是提供在受试者(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)或在细胞中减少IFN-γ产生的方法，其中该方法包括对受试者或细胞施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。 

本发明还提供在受试者中或在细胞中对组织蛋白酶E和/或组织蛋白酶D进行体外抑制的方法，其中该方法包括使组织蛋白酶E和/或组织蛋白酶D接触选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。 

另一方面，本发明提供在受试者中(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)或在细胞中对γ分泌酶进行体外抑制的方法，通过使γ分泌酶接触选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。 

另一方面，本发明涉及在受试者(例如，被鉴定为需要该治疗的 受试者)中治疗γ分泌酶相关的疾病或病症的方法。该方法包括对受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物的步骤。在某些实施方式中，γ分泌酶相关的疾病或病症是阿尔茨海默病(Alzheimer′sdisease)。 

在其它方面，本发明提供与IFN-γ或IL-17过量产生、或T细胞过度增殖相关的症状的治疗方法。 

本发明也提供用于草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的分离、结构测定、和生物学测定的方法。 

本发明也提供设计、评估和鉴定能够选择性地抑制蛋白酶包括天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的化合物的方法。 

本发明也提供选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物在制备用于治疗本文所确定的疾病或症状的药物中的用途。 

本发明的其它实施方式在下文中讨论。 

附图说明

下面参考下列非限制性实施例并参考下列附图对本发明进行进一步说明，其中： 

图1是示出草抑制素A(1)和B(2)在CDCl₃中于500MHz(¹H)和150MHz(¹³C)的NMR谱数据的表格； 

图2是示出草抑制素C(3)在CDCl₃中于600MHz的NMR谱数据的表格； 

图3是示出草抑制素A-C(1-3)对于在初筛中鉴定出的天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的IC₅₀值的表格； 

图4显示胃酶抑素A(包括结合位点命名)、tasiamide和tasiamideB的结构； 

图5是显示草抑制素A(1)和B(2)的ESIMS裂解形式的图； 

图6显示草抑制素C(3)的ESIMS断裂形式； 

图7是显示在用10μM草抑制素A(1)处理时的酶活性的蛋白酶筛 选图示(数值表示相对于溶剂对照的酶活性百分比，且另外由连续范围来表示)； 

图8(A-B)显示用草抑制素A(1)处理的组织蛋白酶E和TACE的进程曲线：图8A显示，对组织蛋白酶E的抑制不是时间依赖性的，且起始速率受草抑制素A(1)影响；图8B显示，对TACE的抑制是时间依赖性的，且起始速率不被草抑制素A(1)所影响； 

图9(A-B)示出用组织蛋白酶D/E底物所确定的草抑制素A(1)和胃酶抑素A对于MCF7细胞蛋白酶的活性：图9A示出用草抑制素A(1)或胃酶抑素A处理的(裂解的)MCF7细胞溶菌产物的蛋白酶活性；图9B涉及直接用草抑制素A(1)或胃酶抑素A处理的MCF7细胞溶菌产物； 

图10(A-D)显示在用草抑制素A(1)对活化的PBMC和DC处理之后T细胞和TH细胞的抗原呈递下调：图10A示出在用不同浓度的草抑制素A(1)处理后在全部PBMC上的CD3+T细胞的活化下调；图10B示出通过加入不同浓度草抑制素A(1)引起的TH活化(增殖)的下调；图10C和10D示出草抑制素A(1)对通过自体活化DC诱导的TH细胞产生胞内IFN-γ(图10C)和IL-17(图10D)的作用； 

图11(A-B)示出在MLR中草抑制素A(1)对通过同种异体活化DC诱导的TH细胞产生胞内IFN-γ(图11A)和IL-17(图11B)的作用； 

图12(A-D)显示草抑制素A(1)和C(3)与组织蛋白酶D和E的对接结构：图12A示出草抑制素A(1)与组织蛋白酶D的对接构象；图12B示出草抑制素A(1)与组织蛋白酶E的对接构象；图12C示出草抑制素C(3)与组织蛋白酶D的对接构象；图12D示出草抑制素C(3)与组织蛋白酶E的对接构象。 

具体实施方式

本发明的特征在于化合物、组合物、和使用这些化合物来治疗天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶相关的疾病或病症的方法。在某些实施方式中，化合物是从海洋蓝细菌来源发现的新的生物活性化合物。在某些实施方式中，本发明的化合物是天然产物和其类似物。在一个实施方式中，化合物用作选择性蛋白酶抑制剂。 

本发明基于，至少部分基于对草抑制素A(1)和两种天然类似物 (即，草抑制素B(2)和C(3))的发现，其通过对作为新的生物活性化合物来源的海洋蓝细菌进行探究。草抑制素A(1)、B(2)和C(3)的结构使用NMR、MS、和手性HPLC技术来确定。出人意外地发现草抑制素A(1)、B(2)和C(3)能够选择性地抑制多种蛋白酶(例如，组织蛋白酶D和E、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶)。 

I定义

在对本发明进一步说明之前，为了更好地理解本发明，为方便起见，首先定义并汇总某些术语。 

用在说明书和权利要求中的单数术语“一”(a、an)和“该/所述”(the)包括复数对象，除非上下文另外清晰地规定。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞，包括其混合物。术语“一种核酸分子”包括多个核酸分子。 

术语“给药”或“施用”包括将本发明的化合物引入受试者以实施它们的预定功能的途径。可以使用的给药途径的例子包括注射(皮下注射、静脉注射、肠胃外注射、腹膜内注射、鞘内注射)、口服、吸入、直肠和经皮。可以通过适于各种给药途径的形式来给予药物制剂。例如，这些制剂以片剂或胶囊形式给药、通过注射剂、吸入剂、洗眼剂、软膏剂、栓剂等形式通过注射、输注或吸入给药；通过洗剂或软膏剂局部给药；及通过栓剂直肠给药。优选口服给药。注射可以是推注(bolus)或连续式输注。根据给药的途径，可以将本发明的化合物用选定的材料包衣或置于选定的材料中，以保护其不受自然条件的影响，所述自然条件可以不利地影响化合物实施其预定功能的能力。本发明的化合物可以单独给药，或与上述另一种药物、或与药学上可接受的载体、或与这两者共同给药。本发明的化合物可以在其它药物给药之前、与其同时或在其之后给药。而且，本发明的化合物也可以以在体内转化成其活性代谢物或更具有活性的代谢物的前体药物的形式给药。 

术语“作用剂”(agent)是指小分子化合物、多肽、多核苷酸、或片段、或其类似物、或其它生物活性分子。 

根据本发明的术语“酰胺”或“药学上可接受的酰胺”是指通过 本发明化合物的羧酸或酯基与胺部分(例如，氨和烷基胺)反应而产生的衍生物。或者，酰胺衍生物可以通过羧酸或酯类化合物与本发明化合物的胺部分反应而产生。应该理解的是，本发明的酰胺包括在体内水解的那些和在人体内容易分解而留下母体化合物或其盐的那些。根据本发明的酰胺的例子包括，例如，伯酰胺、低级烷基酰胺、二低级烷基酰胺、和羟基酰胺。 

本文中使用的术语“天冬氨酸蛋白酶相关的疾病或病症”是指由一种或更多种天冬氨酸蛋白酶的过度活性或过度表达引起的或与其相关的疾病或病症。相似地，本文中使用的术语“γ分泌酶相关的疾病或病症”是指由γ分泌酶的过度活性或过度表达引起的或与其相关的疾病或病症，并且本文中使用的术语“金属蛋白酶相关的疾病或病症”是指由一种或更多种金属蛋白酶的过度活性或过度表达引起的或与其相关的疾病或病症。 

术语“联合(associating with)”是指化学实体或化合物或其部分与蛋白质上的结合口袋或结合位点之间接近的状态。联合可以是非共价的(其中毗邻是通过氢键或范德华力或静电相互作用在能量上有利的)、或其可以是共价的。 

本文中使用的术语“结合口袋”是指分子或分子复合物的区域，由于其形状而有利地与另一化学实体或化合物联合。 

本发明的化合物的词语“生物活性”包括由本发明的化合物在响应细胞中引起的所有活性。它包括通过这些化合物引起的基因组和非基因组活性。 

“生物组合物”或“生物样品”是指含有或源自于细胞或生物聚合物的组合物。含有细胞的组合物包括，例如：哺乳动物的血液、红细胞浓缩物、血小板浓缩物、白细胞浓缩物、血细胞蛋白质、血浆、富血小板血浆、血浆浓缩物、来自任意血浆分级的沉淀、来自于任意血浆分级的上清液、血浆蛋白部分、纯化或部分纯化的血蛋白或其它组分、血清、精液、哺乳动物初乳、乳、唾液、胎盘提取物、冷沉淀物、冷上清液、细胞溶胞产物、哺乳动物细胞培养液或培养基、发酵产物、腹水、在血细胞中诱导的蛋白质、在细胞培养物中通过正常或转化细胞(例如，通过重组DNA或单克隆抗体技术)产生的产物。生 物组合物可以不含有细胞。在一个实施方式中，合适的生物组合物或生物样品是红细胞悬浮液。在一些实施方式中，血细胞悬浮液包括哺乳动物血细胞。优选地，血细胞可以从人、非人类灵长类动物、狗、猫、马、牛、山羊、绵羊或猪获得。在某些实施方式中，血细胞悬浮液包括红细胞和/或血小板和/或白细胞和/或骨髓细胞。 

术语“手性”是指具有与其镜像伙伴不重合的性质的分子，而术语“非手性”是指与其镜像伙伴重合的分子。 

术语“包含(comprises、comprising)”、“含有”和“具有”等类似词语可具有美国专利法赋予它们的含义，并可表示“包括(includes、including)”等；“基本由……构成”或“基本上包括”同样具有美国专利法赋予它们的含义，并且该术语是开放式的，允许有列举之外的对象存在，只要所述的基本的或新的特征没有被所列举之外的对象的存在而改变，但排除现有技术的实施方式。 

术语“非对映异构体”是指具有两个或更多个不对称中心且其分子不互为镜像的立体异构体。 

术语“有效量”包括就剂量和必要的时间周期而言，有效达到所期望的结果(例如，足以治疗本文中描述的疾病或病症)的量。本发明化合物的有效量可以根据例如如下的因素而不同：受试者的疾病状态、年龄、和体重、及本发明的化合物在细胞中或在受试者中引起期望的响应的能力。可以调节给药方案以提供最佳的治疗反应。有效量也是本发明的化合物的治疗有益效果胜于任何毒性或不良作用(例如副作用)的量。 

化合物的治疗有效量(即，有效剂量)可以在约0.005μg/kg体重～约200mg/kg体重、约0.1μg/kg体重～约100mg/kg体重、或约1mg/kg体重～约50mg/kg体重的范围内。在其它实施方式中，治疗有效浓度可以在约1.0nM～约1μM的范围内。本领域的技术人员应该理解，某些因素可能影响用于有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于受试者的疾病或病症的严重程度、先前的治疗、总体健康和/或年龄、以及其它存在的疾病。此外，使用治疗有效量的化合物治疗受试者可以包括单一治疗，或者优选地，可以包括一系列治疗。在一个实施例中，使用在约0.005μg/kg体重～约200mg/kg体重的范围内的化合物对受 试者进行治疗，在约1～10周之间、在2～10周之间、在约1～8周之间、或在约4、5或6周之间每天一次。也应该理解，用于治疗的化合物的有效剂量可以在具体治疗的过程中增加或减少。 

术语“对映异构体”是指彼此互为不重合镜像的化合物的两个立体异构体。两个对应异构体的等摩尔混合物称为“外消旋混合物”或“外消旋体” 

本文中使用的术语“酯”或“药学上可接受的酯”是指本发明化合物的酯化衍生物(如果适用的话)。可以例如通过分别使化合物以其游离酸形式或羟基形式与合适的酯化剂反应来制备酯。可以通过游离的或活化的羧酸的处理来将羟基转化为酯。根据本发明的酯包括在体内水解的那些和在人体内容易分解而留下母体化合物或其盐的那些。合适的酯基包括，例如，源自药学上可接受的脂肪族羧酸，特别是链烷酸、链烯酸、环烷酸和链烷双酸(alkanedioic acid)的那些，其中各烷基或烯基部分都有利地具有不多于6个碳原子。 

根据本发明的酯的例子包括，例如，取代的和未被取代的、支链的或无支链的低级烷基酯(例如，丙酸酯)、低级烯基酯、二-低级烷基-氨基低级-烷基酯(例如，二甲基氨基乙基酯)、酰氨基低级烷基酯(例如，乙酰氧基甲基酯)、酰氧基低级烷基酯(例如，特戊酰氧基甲基酯)、芳基酯(苯酯)、芳基-低级烷基酯(例如，苄酯)、取代的(例如，用甲基、卤素、或甲氧基取代基取代)芳基和芳基低级烷基酯。本发明的具体酯包括，但不限于，叔丁基酯、甲酸酯、醋酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯、和琥珀酸乙酯。 

术语“水合物”是指本发明的化合物或其盐，其还包括化学计量或非化学计量的通过非共价分子间力结合的水。 

词语“改善的生物性质”是指本发明的化合物固有的任何活性，其在体内效力增强。在一个实施方式中，该术语是指本发明的化合物的任何定性或定量改善的治疗性质，例如降低的细胞毒性。 

术语“结合”(in combination with)意在指将本发明的化合物与其它药剂(例如用于临床治疗或预防破骨细胞相关疾病或病症的第二化合物)一起提供的所有给药形式，其中两者同时或按任意顺序相继给药。 

术语“分离的”、“纯化的”、“纯的”、或“生物纯的”是指大体上或基本上没有其以原来或天然状态发现时通常伴有的成分(例如，蛋白质、核酸、碳水化合物、和其它细胞物质)的物质，其中该状态为例如，其在生物体中的该化合物或物质自然出现的状态。纯度和均一性通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来确定。在某些实施方式中，本发明的化合物为至少50％纯、60％纯、75％纯、80％纯、85％纯、至少90％纯或至少95％纯(例如，重量比)。在某些例子中，化合物为至少98％纯、99％纯、99.5％纯、99.8％纯、或99.9％纯。 

术语“异构体”或“立体异构体”是指具有相同化学构成但是原子或基团的空间排布不同的化合物。 

术语“调节”是指，例如响应于与本发明的化合物接触的化合物抑制靶标活性能力的提高或降低，包括例如在受试者(例如动物、人类)中的提高或降低，从而获得期望的最终结果，例如治疗结果。 

本文中使用的术语“天然产物”是指通过有生命的生物体产生的化学化合物或物质。在某些实施方式中，该术语是指在自然中找到的通常具有用于药物开发和药物设计的药学或生物活性的化合物。天然产物可以从陆生植物、海洋生物的组织或微生物发酵液中提取。最有可能的是，当从天然来源处提取时，天然产物存在于与其它化合物的混合物中。为获得纯的形式的化合物，可以进行分离和纯化。天然产物怎样分离和纯化取决于例如化合物的结构和稳定性以及其在混合物中的量等因素。 

在能够调节(激动(agonizing)、拮抗)本文所述目标物的“化合物获得”中的术语“获得”包括购买、合成或用别的方法得到化合物。 

术语“药学上可接受的盐”是指从，例如本文公开的任一种化学式的化合物的酸性或碱性基团形成的盐。示例性的盐包括，但不限于，硫酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、苯磺酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐(glucaronate)、 糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、及扑酸盐(即，1，1′-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))等盐类。术语“药学上可接受的盐”也指从本文公开的任何一种化学式的具有酸性官能团例如羧酸官能团的化合物与药学上可接受的无机或有机碱类制备而来的盐。合适的碱包括，但不限于，碱金属例如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属例如钙和镁的氢氧化物；其它金属例如铝和锌的氢氧化物；氨、和有机胺类，例如未被取代或经羟基取代的单-、二-、或三烷基胺；二环己基胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基，N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-、或三-(2-羟基-低级烷基胺)，例如单-、双-或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁胺、或三-(羟甲基)甲胺、N，N，-二-低级烷基-N-(羟基低级烷基)胺，例如N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺、或三-(2-羟乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；和氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸等。术语“药学上可接受的盐”也指从本文公开的任何一种化学式的具有碱性官能团例如氨基官能团的化合物与药学上可接受的无机或有机酸制备而来的盐。合适的酸包括硫酸(hydrogen sulfate)、柠檬酸、乙酸、草酸、盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、氢碘酸(HI)、硝酸、二硫化二氢(hydrogen bisulfide)、磷酸、乳酸、水杨酸、酒石酸、重酒石酸(bitartratic acid)、抗坏血酸、琥珀酸、马来酸、苯磺酸、延胡索酸、葡糖酸、葡糖醛酸、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸。 

术语“多晶型物”表示本发明化合物或其复合物的固体结晶形式。相同化合物的不同多晶型物可以显示不同的物理、化学和/或光谱性质。不同的物理性质包括但不限于稳定性(例如，对热、或光的稳定性)、可压性和密度(在制剂和产品生产中很重要)、和溶解速率(其可影响生物利用度)。稳定性的差异可以由化学反应性(例如，有差别的氧化反应，使得剂型当包含一种多晶型物时比包含另一种多晶型物时褪色更快)或机械特性(例如，在储存时，当动力学有利的多晶型物转变为热动力学更稳定的多晶型物时，片剂破碎)或这两种特性(例如，在高湿度时一种多晶型物的片剂更容易断裂)的改变导致的。多晶型物的不同物理特性可以影响它们的加工。例如，一种多晶型物由于例如其颗粒形状或粒径分布可能更容易形成溶剂合物或可能更难过滤或 洗除杂质。 

术语“前药”或“前体药物”包括具有能在体内代谢的部分的化合物。通常来说，前药通过酯酶或通过其它机制在体内代谢为活性药物。前药和它们的用途的实例在领域内公知(参见，例如，Berge等人(1977)″Pharmaceutical Salts″，J.Pharm.Sci.66：1-19)。可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备前药，或通过分别使纯化的化合物以其游离酸形式或羟基与合适的酯化剂进行反应而制备前药。羟基可以通过用羧酸处理而转化为酯。前药部分的实例包括取代和未被取代的、支链或无支链的低级烷基酯部分(例如，丙酸酯)、低级烯基酯、二-低级烷基-氨基低级烷基酯(例如，二甲基氨基乙基酯)、酰氨基低级烷基酯(例如，乙酰氧基甲基酯)、酰氧基低级烷基酯(例如新戊酰氧基甲基酯)、芳基酯(苯基酯)、芳基低级烷基酯(例如苯甲基酯)、取代的(例如被甲基、卤素或甲氧基取代基取代)芳基和芳基低级烷基酯、酰胺、低级烷基酰胺、二低级烷基酰胺和羟基酰胺。优选的前药部分是丙酸酯和酰基酯。本发明也包括在体内通过其它机制转变为活性形式的前药。 

化合物的词语“预防有效量”是指本发明的或在本文另外描述的化合物的量，其在以单剂量或多剂量对受试者给药时，在预防或治疗本文病症中有效。 

术语“受试者”包括能患有本文所述的病症或可以以其它方式受益于施用本发明的化合物的生物体，比如人类和非人类的动物。优选的人包括以上讨论的患有或易患有疾病或病症的人类患者。本发明的术语“非人类的动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物，例如啮齿类动物，例如小鼠，以及非哺乳动物，比如非人类灵长类动物，例如绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。“被鉴定为需要治疗的受试者”包括，例如由医学或兽医专家诊断的、患有或对本文所述疾病、病症或症状易感的受试者。 

本文中使用的短语“系统给药”、“系统性地给药”、“外周给药”和“外周地给药”表示本发明化合物、药物、或其它物质的施用，从而使之进入患者的体系，从而进行代谢和其它类似过程，例如，皮下给药。 

至于手性中心的系统命名，术语“d”和“l”构型通过IUPAC命名法(IUPAC Recommendation)定义。对于下述术语的应用，非对映异构体、外消旋体、差向异构体和对映异构体将以其常见含义(context)用于描述制剂的立体化学。 

II本发明的化合物

一方面，本发明提供新的生物活性化合物。在一个实施方式中，本发明的化合物能够选择性地抑制蛋白酶。在另一个实施方式中，化合物能够抑制酶，包括人体酶，例如γ分泌酶、组织蛋白酶D和E、天冬氨酸蛋白酶、或金属蛋白酶。在一个实施方式中，本发明提供能够选择性地抑制天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的化合物。在某些实施方式中，该化合物能够选择性地抑制组织蛋白酶D和/或组织蛋白酶E。在某些实施方式中，本发明的化合物能够抑制γ分泌酶。 

在某些实施方式中，本发明的化合物是分离的或纯化的天然产物、和/或其天然类似物。在一个实施方式中，化合物是由海洋蓝细菌产生的分离的或纯化的天然产物。 

已知海洋蓝细菌产生很多次生代谢产物。蓝细菌通过非核糖体肽合成酶(NRPS)途径或通过NRPS和聚酮合成酶(PKS)通路的结合生产修饰肽(参见Dittman等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.2001，57，467-473)。这两条通路都高度模块化，据推测允许生物活性化合物通过组合变化而进化。 

在一个实施方式中，化合物为至少85％纯。在其它实施方式中，化合物为至少90％、95％、或99％纯。在一个实施方式中，本发明的化合物选自具有如下结构的草抑制素A(化合物1)、B(化合物2)和C(化合物3)： 

本发明也涉及本文所述化合物的药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物。 

注意到，草抑制素A-C（1-3）包含抑胃酶氨酸（statine）单元[(3S,4S)-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，Sta]，其首次在广谱天然天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃酶抑素A中得到描述（Morishima等人，J.Antibiot.1970,23,263-265；和Umezawa等人，J.Antibiot.1970,23,259-262）。据报道，抑胃酶氨酸由缩合亮氨酸和丙二酸单元的混合NRPS/PKS通路所产生（Morishima等人,J.Antibiot.1974,27,267-273）。蓝细菌天然产物中的结构相关物（relatives）是tasiamide和tasiamide B（图4）（Williams 等人,J.Nat.Prod.2002,65,1336-1339；和Williams等人，J.Nat.Prod.2003,66,1006-1009）。Tasiamide不包含抑胃酶氨酸单元，并且在一些氨基酸残基的构象上也存在一些差异（图4）。 

此外，本发明的化合物可以包含一个或多个不对称中心，因此以外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、单独非对映异构体和非对映异构混合物出现。这些化合物的所有这些异构体形式也明确地包括在本发明中。本发明的化合物还可以以多互变异构的形式表示，在这种情况下，本发明明确地包括本文所述的化合物的所有互变异构形式。这些化合物的所有这些异构形式明确地包括在本发明中。在某些情况下，本发明化合物的纯度可以是指单一异构形式的化合物的纯度。在其它情况中，化合物的纯度可以是指所有异构形式的化合物的纯度。此外，本文所述的化合物的所有晶体形式都明确地包括在本发明中。 

天然出现的或合成的异构体可以以本领域已知的数种方式分离。分离两种对映异构体的外消旋混合物的方法包括使用手性固定相的色谱法(参见，例如″Chiral Liquid Chromatography，″W.J.Lough，Ed.Chapman and Hall，New York(1989))。对映异构体也可以通过经典的拆分技术(resolution techniques)分离。例如，非对映异构盐的形成和分步结晶可以用于分离对映异构体。对于羧酸的对映异构体的分离，可以通过加成光学纯手性碱比如马钱子碱、奎宁、麻黄素、番木鳖碱等形成非对映异构盐。或者，可以用光学纯手性醇比如薄菏醇形成非对映异构酯，随后分离非对映异构酯并水解以产生游离的、光学异构体富集的(enantiomerically enriched)羧酸。对于氨基化合物的光学异构体的分离，手性羧羧或磺酸比如樟脑磺酸、酒石酸、扁桃酸(mandelic acid)或乳酸的加入可以导致非对映异构盐的形成。 

本发明化合物的分离、纯化和结构测定的方法在下文中详细说明。 

III本发明的用途和方法

一方面，本发明提供在受试者(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)中治疗天冬氨酸蛋白酶相关疾病或病症的方法。该方法包括对受试者施用有效量的本发明化合物。在某些实施方式中，疾病或病症与组织蛋白酶D相关。在其它实施方式中，疾病或病症与组织蛋白酶E相关。在一个实施方式中，疾病或病症是乳腺癌。在另一个实施方式中，疾病或病症是阿尔茨海默病。 

组织蛋白酶是在许多类型的细胞中发现的蛋白酶家族。组织蛋白酶家族包括约十二个成员，按照它们的结构、催化机理和它们切割的蛋白质的类型对其进行区分。组织蛋白酶家族的一个成员，组织蛋白酶D，是天冬氨酸蛋白酶。据信组织蛋白酶D涉及到多种疾病的发病机理，包括乳腺癌和阿尔茨海默病。 

该家族的另一成员，组织蛋白酶E，是肽酶C1家族的成员，具有 与胃蛋白酶A和组织蛋白酶D相似的特异性。其是胞内蛋白酶，似乎不参与饮食蛋白消化，并且在胃的上皮粘液产生细胞的表面以最高浓度发现。其是在多于一半的胃癌中发现的天冬氨酸蛋白酶。 

另一方面，本发明提供在受试者中治疗金属蛋白酶相关疾病或病症的方法(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)。该方法包括对受试者施用有效量的本发明化合物。在一个实施方式中，金属蛋白酶相关疾病或病症是TACE(肿瘤坏死因子(TNF)转化酶)相关的疾病或病症。 

金属蛋白酶是一组蛋白酶。它们是蛋白水解酶，其催化机制涉及金属(例如锌和钴)。TACE是将已知的生理物质和炎症细胞因子，膜结合前体-TNF-α，加工成其成熟可溶形式的ADAM蛋白酶。已经发现TACE为数种不同的加工事件所需，例如肿瘤生长因子-α(TGF-a)前体和淀粉样前体蛋白(APP)的切割(参见，例如，Drug Discovery Today，vol 6，Issue 8，1April 2001，Pages 417-426)。 

本发明也提供治疗选自血液凝固病症、细胞周期病症、感染、神经退行性病症、自身免疫病症、过敏性疾病、癌症、HIV感染、AIDS、阿尔茨海默病、移植排斥、和细胞内病原体相关疾病的疾病或病症的方法。方法包括对受试者(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)施用有效量的本发明的化合物。在某些实施方式中，所治疗的疾病或病症是类风湿关节炎或哮喘。 

本发明的另一方面提供在受试者中抑制T细胞增殖的方法。该方法包括对受试者施用有效量的本发明化合物。 

T细胞(或T淋巴细胞)属于在细胞介导的免疫中发挥核心作用的白血球组群(被称为淋巴细胞)。T细胞在其细胞表面具有特殊的受体，称为T细胞受体(TCR)。迄今已经发现数种不同的T细胞亚群(例如，T_H细胞、T_c细胞、γδT细胞、T_reg细胞、和NKT细胞)。 

此外，本发明也提供通过使用有效量的本发明化合物来减少IL-17产生的方法。该方法在受试者中或在细胞中可用。 

IL-17(或白介素-17)属于一组细胞因子(IL-17家族)。IL-17作为来自啮齿类T细胞杂交瘤的转录物而被鉴定出(参见Rouvier等人，J.Immunol.150(12)：5445-56)。IL-17表现出对于由嗜T淋巴细胞猴病 毒属(rhadinovirus)松鼠猴疱疹病毒(Herpesvirus saimiri)的开放阅读框所编码的病毒IL-17的高度同源性(见Rouvier等人)。IL-17可以在生物体例如，肾脏、胰腺、肝脏、成纤维细胞、肺、脑和肠中表达(参见，例如Kolls等人，Immunity 21(4)，2004，467-76)。 

此外，本发明也提供在受试者或在细胞中减少IFN-γ产生的方法。该方法包括对受试者或细胞施用有效量的本发明化合物。 

IFN-γ(或II型干扰素)是对于针对病毒和胞内细菌感染的先天和适应性免疫以及对于肿瘤控制很关键的细胞因子。异常的IFN-γ表达与自体炎症以及自体免疫疾病相关。IFN-γ在免疫系统中发挥重要作用。据信IFN-γ主要由自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T细胞产生作为先天免疫应答的一部分，并在一旦形成抗原特异性免疫时由CD4和CD8细胞毒T淋巴细胞效应T细胞所产生(参见，例如Schoenborn等人，Adv.Immunol.2007，96：41-101)。 

另一方面，本发明提供通过在体内或在体外使组织蛋白酶D与本发明的化合物接触来抑制组织蛋白酶D的方法。在另一方面，本发明提供通过在体内或在体外使组织蛋白酶E蛋白酶与本发明的化合物接触来抑制组织蛋白酶E的方法。 

本发明也提供通过在体内或在体外使γ分泌酶与本发明的化合物接触来抑制γ分泌酶的方法。 

γ分泌酶是在跨膜域内的残基处切割单次跨膜蛋白的多亚基蛋白酶复合物。γ分泌酶的一种底物是淀粉样前体蛋白，当其被γ和β分泌酶切割时，产生称为淀粉样蛋白β的氨基酸肽，该淀粉样蛋白β是在阿尔茨海默病患者脑内发现的淀粉样斑块的主要成分。γ分泌酶在Notch蛋白的相关加工中也很关键。 

另一方面，本发明提供在受试者中治疗γ分泌酶相关的疾病或病症的方法(例如，被鉴定为需要该治疗的受试者)。该方法包括对受试者施用有效量的本发明化合物，从而治疗γ分泌酶相关的疾病或病症。在一个实施方式中，γ分泌酶相关疾病或病症是阿尔茨海默病。 

在某些实施方式中，根据任何上文所述的方法和用途的本发明化合物以不是在受试者中表现最佳效果所需剂量的剂量进行给药。作为本领域技术人员的医生或兽医(“主治医师”)可以通过已知技术的 使用或遵从医疗操作规程而容易地确定特定化合物的有效剂量。 

本文所述的方法包括其中受试者被鉴定为需要具体描述的治疗的那些方法。鉴定受试者需要这样的治疗可以是受试者或者卫生保健专家的判断，且可以是主观的(例如，意见)或客观的(例如，通过测试或诊断方法可测量的)。在其它方法中，通过对用于该治疗的相关标志物或合适度指示物的评估来将受试者预筛选或鉴定为需要该治疗。 

在某些实施方式中，本发明的化合物可以用于与现有药物的结合治疗来治疗以上讨论的疾病、病症或症状。 

其它现有的可用来治疗本文中疾病或病症的药物可以在Harrison′s Principles of Internal Medicine，Thirteenth Edition，Eds.T.R.Harrison等人McGraw-Hill N.Y.，NY；和the Physicians Desk Reference62th Edition 2008，Oradell New Jersey，Medical Economics Co.中找到，其全部内容明确地引入本文作为参考。本发明的化合物和合适的现有药物可以以相同的药物组合物或以不同的药物组合物施用给受试者(同时或不同时)。 

对于本发明化合物的治疗有效量或预防有效量的确定可以由作为本领域技术人员的医生或兽医(“主治临床医生”)通过已知技术的使用和在相似情况下观察得到的结果而容易地做出。剂量可以在主治临床医师的判断下根据接受治疗的受试者的需要而改变；或者依据受治疗的症状的严重程度和所采用的特定化合物而改变。在确定治疗有效量或剂量和预防性有效量或剂量时，主治临床医师考虑很多因素，包括，但不限于：涉及的具体疾病；具体作用剂的药效学特征和其给药的模式和途径；期望的治疗时程；哺乳动物的种类；其大小、年龄和基本健康情况；所涉及的具体疾病；疾病的程度或牵涉状况或严重度；个体患者的反应；具体的给药的化合物；给药的模式；给药制剂的生物利用度性质；选定的剂量方式；协同治疗(即本发明的化合物与其它一起给药的治疗药物的相互作用)的种类；及其它相关情况。 

可以用较小的剂量开始治疗，该剂量小于化合物的最优剂量。之后，以小增量增加剂量直至达到在该情形下的最佳效果。出于方便起见，如果需要的话，总的日常剂量可以进行划分并在一天中以部分施用。预期本发明化合物的治疗有效量和预防有效量从每天约0.005 μg/kg变化至约200mg/kg，或从每天每千克体重0.001毫克(mg/kg/day)变化至约100mg/kg/day。 

确定为有效防止或治疗受试者例如狗、鸡和啮齿类动物的本文所述疾病或病症的化合物还可用于治疗人类的疾病或病症。基于动物研究中所获得的数据，治疗人类疾病或病症的本领域技术人员将知道对人施用该化合物的剂量和途径。 

对于需要治疗的受试者的鉴定在本领域技术人员的能力和知识范围内。鉴定受试者具有本文疾病/病症的某些方法或鉴定受试者具有形成可通过受试者方法治疗的这种疾病/病症的风险的某些方法在医学领域是被认可的，例如家族史、以及患者中是否存在与该疾病状态发展相关的风险因素。临床领域的技术人员可通过使用例如临床测试、身体检查和医学/家族史而容易地鉴别这些候选受试者。 

评估受试者中的治疗效力的方法包括通过领域内的已知方法来确定治疗前疾病/病症的程度，以及对受试者施用治疗有效量的根据本发明的化合物。在化合物施用后一段合适的时间后(例如，1天、1周、2周、1个月、6个月)，再次确定疾病/病症的程度和严重度。疾病或病症的程度或严重度的调节(例如，降低)表示治疗的效力。疾病或病症的程度或严重程度可以在治疗中定期确定。 

本发明的方法和用途可以在培养的细胞上实施，例如，在体外或先体外后体内(ex vivo)，或者在存在于动物受试者的细胞上实施，例如，在体内。本发明的化合物可以使用细胞的原代培养等等进行体外的初步检测。本发明的化合物可以使用细胞或其它哺乳动物或非哺乳动物模型在体外进行初步检测。或者，可以用动物模型在体内表征本发明的化合物的效力。 

此外，本发明还提供本发明的化合物单独或与一种或多种额外的治疗剂一起在药物制备中的用途，作为单一组合物或作为独立剂型，用于治疗受试者的本文所述的疾病、病症或症状。本发明的另一方面是本发明的化合物用于治疗或预防受试者的本文所述的疾病、病症或其症状。 

IV化合物的提取、分离和结构确定

在一个实施方式中，本发明的化合物是天然产物、和/或其天然类似物。如以上所讨论，天然产物是由生命体产生的化合物或物质。天然产物的来源包括，例如，陆生植物、海洋生物的组织和微生物发酵液。在大多数情况下，首先从这些资源中的任何一个中提取粗混合物。接着可进行一个或多个对于粗提取物的分级(fractionation)、分离和/或纯化步骤，以得到其分离的和/或纯化状态的天然产物。 

提取步骤可以依据资源和待分离的化合物的性质来进行选择。在选择方法之前，必需知道需要提取什么类型的目标物，例如，未知或已知化合物、一组结构相关的化合物、或通过天然资源等产生的次生代谢产物。此外，提取过程也可以通过例如植物材料、动物样品和微生物等资源的性质来确定。 

提取方法可以包括，但不限于，浸渍、煮沸、索氏提取(soxhlet)、超临界流体抽提、升华、和蒸汽蒸馏。此外，在提取过程中可以使用不同类型的溶剂。对于极性提取，溶剂可以是，例如水、乙醇和甲醇(MeOH)。对于中等极性提取，可以使用例如醋酸乙酯(EtOAc)和二氯甲烷(DCM)的溶剂。对于非极性提取，可以使用正己烷、石油醚和氯仿(CHCl₃)(参见Sarker等人，Natural Product Isolation：An Overview，Methods in Biotechnology，20，2005，1-25)。 

原始天然产物提取物是化合物和其它物质的混合物。通常通过分级分离使用液-液提取或色谱技术，例如，减压液相色谱(VLC)、柱层析(CC)、尺寸排阻色谱(SEC)、固相提取(SPE)、高效薄层色谱(HPTLC)、多闪色谱(multiflash chromatography)、和chromatotron等等，来将粗提取物分成多个级分。在某些实施方式中，由例如紫外(UV)、或高效液相色谱(HPLC)的检测技术来引导分级分离(参见Sarker等人，Natural Product Isolation：An Overview，Methods in Biotechnology，20，2005，1-25)。 

一些分离操作规程可以依据存在于粗提取产物或级分中的目标化合物的性质来使用。需要考虑的分子性质包括，例如溶解性(疏水性或亲水性)、酸-碱性质、电荷、稳定性和分子大小。在一些例子中，对于各种类型化合物的存在的定性检测与分析薄层色谱(TLC)或HPLC图谱化(profiling)一起进行。此外，提取物的性质也可以帮助 选择合适的分离操作规程(参见Sarker等人，Natural Product Isolation：An Overview，Methods in Biotechnology，20，2005，1-25)。 

在某些例子中，可以优化分离操作规程。也讨论了用于优化分离条件的方法，如果有必要将竞争副产物降至最低，并且某些方面可以在本领域内找到。该方法也可以在本文具体描述的步骤之前或之后额外地包括步骤，以添加或移除合适的保护基团，以最终合成本文中的化合物。此外，各种合成步骤可以以交替的顺序或次序进行以得到所需的化合物。用于合成可用的化合物的合成化学转化和保护基方法学(保护和去保护)是本领域已知的，且包括，例如在R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser，Fieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后续版本中描述的那些方法。 

分离出的化合物可以通过结构解析来进行鉴定。通常用于结构解析的技术包括，但不限于紫外-可见光光谱(UV-vis)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、一维NMR(例如，¹HNMR、¹³CNMR、¹³CDEPT、 ¹³CPENDANT、¹³C J mod.、nOe-diff.)、和二维NMR(¹H-¹H COSY、 

¹H-¹H DQF-COSY、¹H-¹H COSY-1r、¹H-¹H NOESY、¹H-¹H ROESY、¹H-¹H TOCSY(或HOHAHA)、¹H-¹³C HMBC、¹H-¹³C HMQC、 ¹H-¹³C HSQC、HSQC-TOCSY)。此外，X射线晶体技术可以提供有关化合物的光学活性的信息。 

在某些例子中，化学、生物、或物理检测对于目标化合物的提取、分离、和结构解析也是有帮助的。已经对可用的检测进行了讨论，并且其可以在本领域内找到。 

V药物组合物和试剂盒

本发明还提供药物组合物，其包含有效量的本发明化合物和药学上可接受的载体。在某些实施方式中，本发明的化合物可以是本文所述的分离的或纯化的化合物、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水 合物、立体异构体、或溶剂合物。在另一个实施方式中，有效量在受试者中对于治疗或预防疾病或病症有效，正如前面所描述的。 

本发明也包括用于治疗或预防以上讨论的疾病或病症的试剂盒。试剂盒可以包括本发明的化合物，例如，本文所述的化合物、其药学上可接受的酯、盐、酰胺、水合物、溶剂合物、或立体异构体，以及使用说明书。使用说明书可包括关于剂量、递送方法、试剂盒保存等信息。该试剂盒也可以包括试剂，例如测试化合物、缓冲液、介质(例如，细胞生长培养基)、细胞等。测试化合物可以包括已知化合物或新发现的化合物，例如，化合物的组合库。一种或多种本发明的试剂盒可以包装在一起，例如，根据本发明，用于评价疾病治疗效力的试剂盒可以与用于监测被治疗受试者的进程的试剂盒包装在一起。 

在一个实施方式中，使用药学上可接受的制剂，例如，在对受试者施用药学上可接受的制剂之后对受试者持续递送本发明的化合物至少12小时、24小时、36小时、48小时、一周、两周、三周、或四周的药学上可接受制剂，将本发明的化合物施用给有需求的受试者。 

在某些实施方式中，这些药物组合物适于对受试者进行局部或口服给药。在其它实施方式中，正如以下的详细描述，本发明的药物组合物可以特别配制用于以固体或液体形式进行给药，包括适于以下的那些：(1)口服给药，例如浸液(drench，水性或非水性溶液或混悬液)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂；(2)肠胃外给药，例如以例如无菌溶液或混悬液通过皮下注射、肌内注射或静脉注射；(3)局部应用，例如，作为应用于皮肤的乳剂、软膏剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内给药，例如作为阴道栓、乳剂或泡沫剂；或(5)气溶胶，例如，作为含有该化合物的水性气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒剂。 

短语“药学上可接受的”是指本发明的这些化合物、含有这些化合物的组合物、和/或剂型，其在合理的医学判断范围之内，适合用于与人类或动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，具有合理的收益/风险比。 

短语“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的物质、组合物或媒介物，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物质，其涉及将受试化学物质从身体的一个器官或部位携带或转运至身体的 另一器官或部位。各种载体是“可接受的”是指其可以与制剂的其它组分相容且不会对患者造成伤害。一些可用作药学上可接受的载体的物质的实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，比如可可脂和栓剂蜡；(9)油，比如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，比如丙二醇；(11)多元醇，比如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸缓冲液；及(21)其它用于药物制剂中的非毒性可相容物质。 

润湿剂、乳化剂和润滑剂比如月桂硫酸钠和硬脂酸镁、以及着色剂、脱模剂、包衣料、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂以及抗氧化剂也可以存在于组合物中。 

药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，比如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸盐、叔丁对甲氧酚(BHA)、二叔丁对甲酚(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。 

含有本发明的化合物的组合物包括那些适于口服给药、经鼻给药、局部给药(包括口腔和舌下给药)、直肠给药、阴道给药、气溶胶给药和/或肠胃外给药的组合物。该组合物可以方便地以单位剂量形式存在，并且可通过在药学领域内已知的任何方法制备。取决于待治疗的主体、具体的给药模式，可与载体物质结合以产生单一剂型的活性成分的量可以不同。可与载体物质结合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗作用的化合物的量。通常，除了100％以外，该量的范围为从约1％至约99％的活性成分，从约5％至约70％，或从约10％至约30％。 

制备这些组合物的方法包括将本发明的化合物与载体以及任选的 一种或多种辅助成分联合的步骤。通常，制剂通过将本发明的化合物与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地联合而制备，然后如果需要则将产物成型。 

适于口服给药的本发明的组合物可以是以胶囊、扁胶囊、丸剂、片剂、锭剂(使用香料基体，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂的形式、或作为在水性或非水性液体中的溶液或混悬液、或作为水包油或油包水液体乳剂、或作为酏剂或糖浆、或作为软锭剂(使用惰性基质，比如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，各种均含有预定量的作为活性成分的本发明的化合物。化合物也可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂给药。 

在用于口服给药的本发明的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒剂等)中，活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合，比如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或下述中的任何一种：(1)填料或膨胀剂，比如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，比如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵盐化合物；(7)润湿剂，例如乙酰基醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，比如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，比如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂硫酸钠及其混合物；及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，药物组合物还可以含有缓冲剂。在使用了比如乳糖(lactose或milk sugars)及高分子量的聚乙二醇等作为赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中，相似类型的固体组合物也可以用作填料。 

片剂可以任选地与一种或多种辅助成分通过压制或模制而制备。压制片可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羧甲淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备。模制片可以通过在合适的机器中模压用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物而制备。 

本发明的药物组合物的片剂和其它固体剂型，比如糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，可以任选地用包衣和外壳刻痕(scored)或制备， 比如肠溶包衣和其它药剂学领域已知的包衣。也可以使用，例如提供期望的释放曲线(profile)的不同比例的羟丙甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球，来配制以便提供其中活性成分的缓释或控释。可以将它们进行灭菌，例如通过细菌截留滤器(bacteria-retaining filter)过滤，或者通过引入可以溶于无菌水的无菌固体组合物形式的灭菌剂，或者在使用前即刻引入一些其它的无菌可注射介质。这些组合物也可以任选地含有遮光剂，并任选地以延迟方式，可以是仅在或优先在胃肠道的某个部位释放活性成分的组合物。可以使用的植入式组合物的例子包括聚合物质和蜡。活性成分也可以是微囊形式，如果合适的话，是与一种或多种上述赋形剂一起的微囊形式。 

本发明的化合物的用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆和酏剂。除了活性成分外，液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，比如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇、和山梨聚糖的脂肪酸酯，及其混合物。 

除惰性稀释剂外，口服组合物可以包括佐剂，比如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。 

除了本发明的活性化合物外，混悬剂还可以含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahvdroxide)、膨润土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。 

用于直肠和阴道给药的本发明的药物组合物可以以栓剂形式存在，该栓剂可通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种包含例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯的合适的非刺激性赋形剂或载体混合而制备，该栓剂在室温是固态，但是在体温是液态，因此其会在直肠或阴道腔中熔化并释放活性药物。 

适用于阴道给药的本发明的组合物还包括阴道栓剂、止血塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，其含有在本领域内已知为合适的那些载体。 

本发明的化合物用于局部或经皮给药的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。本发明的活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体及任何需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。 

软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂除含有本发明的化合物之外，还可以含有赋形剂，比如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。 

粉剂和喷雾剂除含有本发明的化合物外，还可以含有赋形剂，比如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以额外地含有常规的推进剂，比如氯氟烃和挥发性未取代烃，比如丁烷和丙烷。 

或者，本发明的化合物可以通过气溶胶给药。这通过制备含有该化合物的水性气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒而实现。可以使用非水(例如碳氟化合物推进剂)混悬剂。因为声波喷雾器(sonic nebulizer)将药物与可以导致化合物降解的剪切力的接触降至最低，所以是优选的。 

通常，水性气溶胶通过一起配制药物的水溶液或混悬液连同常规的药学上可接受的载体和稳定剂而制备。载体和稳定剂随着具体化合物的需要可以不同，但通常包括非离子型表面活性剂(Tweens、Pluronics或聚乙二醇)、无毒蛋白质如血清白蛋白、山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸比如甘氨酸、缓冲液、盐、糖或糖醇。气溶胶通常由等渗溶液制备。 

透皮贴剂具有向机体提供本发明化合物的受控递送的额外优势。该剂型可以通过将药物溶解或分散于合适的介质中制备。吸收促进剂也可以用于增加活性成分跨过皮肤的透入(flux)。所述透入的速率可以通过提供控制速率的膜或将活性成分分散于聚合物基质或凝胶中来控制。 

眼制剂、眼软膏剂、粉剂、溶液等也在本发明的考虑范围之内。 

适于肠胃外给药的本发明的药物组合物包含一种或多种本发明的化合物结合一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、 分散剂、混悬剂或乳剂、或在使用之前可以重新组成无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉剂，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与目标接受者的血液等渗的溶质、或助悬剂或增稠剂。 

可以在本发明的药物组合物中采用的合适的水性和非水性载体的例子包括：水、乙醇、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油比如橄榄油、及可注射有机酯比如油酸乙酯。合适的流动性可以通过例如以下方式维持：使用包衣材料比如卵磷脂、通过在分散剂的情况下维持所需的粒径、和通过使用表面活性剂。 

这些组合物还可以含有佐剂，比如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过加入下述各种抗细菌剂和抗真菌剂可以确保对微生物作用的预防：例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等。也可以期望的是，本发明的组合物包括等渗剂，比如糖、氯化钠等。此外，通过引入延迟吸收的试剂比如单硬脂酸铝和明胶能引起可注射药物剂型的吸收的延长。 

在一些情况下，为延长药物的作用，期望减缓从皮下注射或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形物质的液体混悬剂而实现。此时，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于其结晶粒度和晶型。或者，肠胃外给药剂型的延迟吸收可以通过将药物溶解于或悬浮于油性媒介物中实现。 

可注射贮存剂型通过在可生物降解的聚合物比如聚交酯-聚乙交酯中形成本发明化合物的微囊基质而制备。取决于药物与聚合物的比例以及所采用的具体聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其它可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。贮存可注射剂型也可以通过将药物包封于与机体组织相容的脂质体或微乳剂中制备。 

当本发明的化合物作为药物对人和动物给药时，其可以自身给药或作为含有例如0.1％至99.5％(或0.5％至90％)的活性成分结合药学上可接受的载体的药物组合物给药。 

不管选定的给药途径，可以以合适的水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。 

VI实施例

下列实施例以示例说明的方式给出，并不意在限制本发明的范围。 

一般实验流程：

在Perkin-Elmer 341旋光仪上测量旋光度。在SpectraMax M5(Molecular Devices)上测量UV，IR数据在Bruker Vector 22仪器上得到。化合物1和化合物2在CDCl₃中的¹H和2D NMR谱记录在Bruker 500MHz光谱仪上。化合物1的¹³C和APT谱记录在Bruker 600MHz Avance光谱仪上。使用1-mm三共振高温超导低温探头，在Bruker Avance II 600MHz光谱仪上收集化合物3在CDCl₃中的¹H和2D NMR谱、以及化合物1在DMSO-d₆中的¹H和2D NMR谱(见Brey等人，construction，and validation of a 1-mm triple-resonance high-temperature superconducting probe for NMR.J.Magn.Reson.2006，179，290-293)。 

将谱与残余的溶剂信号参照[δ_H/C 7.26/77.0(CDCl₃)和δ_H/C 2.49/39.5(DMSO-d₆)]。HMQC和HSQC实验针对145Hz优化，且HMBC实验针对7Hz进行优化。HRESI/APCIMS数据记录在处于正离子模式的装备有APCI/ESI多模式离子源检测器的Agilent LC-TOF质谱仪上。使用装备有Shimadzu LC系统的API 3200(Applied Biosystems)来获得LC-MS数据。通过使用注射驱动(syringe driver)直接注射而在API 3200上得到ESIMS碎裂数据。使用CellQuest软件(BD Biosciences，Heidelberg，Germany)在FACSCalibur流式细胞仪上进行流式细胞术。使用PyMol制得对接配体的图。 

实施例1：提取和分离

根据之前描述的方法，从Grassy Key收集被鉴定为丝状鞘丝蓝细菌(Lyngbya confervoides)的蓝细菌样品，然后对其分级分离(参见Kwan等人，Total structure determination of grassypeptolide，a new marine cyanobacterial cytotoxin.Org.Lett 2008，10，789-792)。将各收集物的非极性提取物(MeOH-EtOAc 1∶1)进行硅胶色谱。用100％甲醇洗脱的硅胶级分通过制备型反相HPLC(Phenomenex Luna 10u C₁₈AXI，100×21.2mm，10.0mL/min；UV检测器，于220和254nm)使用MeOH-H₂O线性梯度(60-100％，30min，之后100％MeOH至10min)来纯化， 在t_R24.3和24.9min分别得到不纯的草抑制素A(化合物1)和B(化合物2)。之后使用不同的柱(Phenomenex Ultracarb 5u ODS(30)，250×10.0mm，2.0mL/min；UV检测器，于220和254nm)采用相同的线性梯度来纯化不纯的化合物，在t_R33.8min得到化合物1(5.7mg)，在t_R35.1min得到化合物2(1.3mg)。 

从Key Largo收集丝状鞘丝蓝细菌的样品。将凭证标本保存在Smithsonian海洋站。用EtOAc-MeOH(1∶1)提取冷冻干燥的生物，以提供非极性提取物，其直接通过硅胶柱分级并用CH₂Cl₂中的浓度增加的异丙醇洗脱。用100％异丙醇洗脱的级分(665.8mg)使用线性MeOH-H₂O梯度(60-100％MeOH，30min，之后100％MeOH，5min)来进行制备型反相HPLC[柱，Luna C18(2)100A AXI，10μm(100x21.20mm)，Phenomenex；流速10.0mL/min；通过UV于220和254nm检测]。在t_R17.2min洗脱的小峰，之后使用不同条件[柱，ODS-AQ(10x250mm)，YMC；流速2.0mL/min；通过UV于220和254nm检测]用相同的线性MeOH-H₂O梯度对其去卷积，以在t_R27.3min提供纯的草抑制素C(化合物3)(1.0mg)。 

实施例2 酸解和手性氨基酸分析

用6N HCl于110℃处理化合物1样品(100μg)24h。将水解产物浓缩至干燥，在100μL的H₂O中复原(reconstituted)，然后用手性HPLC[柱，Chirobiotic TAG(4.6x250mm)，Supelco；溶剂，MeOH-10mM NH₄OAc(40∶60，pH 5.23)：流速0.5mL/min；通过ESIMS以正离子模式检测(MRM扫描)]分析。L-Thr、L-Leu、L-Pro、N，N-Me₂-L-Val和N-Me-D-Phe分别在tR7.2、9.0、14.4、27.0和45.4min洗脱。真实(authentic)氨基酸的保留时间(t_R，min；MRM离子对，母料→产物)如下所示：L-Thr(7.2；120→74)，L-allo-Thr(7.5)，D-Thr(8.6；)，D-allo-Thr(11.9)，L-Pro(14.4；116→70)，D-Pro(39.5)，L-Leu(9.0；132→86)，D-Leu(20.6)，N-Me-L-Phe(25.0；180→134)，N-Me-D-Phe(45.4)，N，N-Me₂-L-Val(27.0；146→100)，以及N，N-Me₂-D-Val(69.8)。L-Thr的归属通过水解产物与L-allo-Thr和L-Thr的共注射来确认。使用的MS参数如下：DP 31.0，EP 8.0，CE 17.3， CXP 3.1，CUR 35，CAD中(Medium)，IS 4500，TEM 750，GS165，GS265。L-Ala也以正离子模式检测，在t_R8.0，但是MS条件稍微不同。真实标准物的保留时间(t_R，min；MRM离子对，母料→产物)如下所示：L-Ala(8.0；90→44)，D-Ala(14.6)。使用的MS参数如下：DP 21.0，EP 8.0，CE 15.0，CXP 5.0，CUR 50，CAD中，IS 4500，TEM 750，GS165，GS265。在正离子模式下仅微弱地检测到Asp，因此以相同LC条件使用负离子模式。L-Asp在t_R6.1min洗脱，表明Asn单元的构型为L。真实标准物的保留时间(t_R，min；MRM离子对，母料→产物)如下所示：L-Asp(6.1；132→88)，D-Asp(6.8)。使用的MS参数如下所示：DP-30.0，EP-5.0，CE-18.5，CXP-13.0，CUR 30，CAD高，IS-4500，TEM 750，GS165，GS265。 

用6N HCl于110℃处理化合物3的样品24h。将水解产物浓缩至干燥，并在100μL的H₂O中复原，然后用手性HPLC[柱，Chirobiotic TAG(4.6x250mm)，Supelco；溶剂，MeOH-10mM NH₄OAc(40∶60，pH 5.33)：流速0.5mL/min；通过ESIMS以正离子模式检测(MRM扫描)]分析。N-Me-L-Glu、L-Ile、L-Leu、L-Pro和N-Me-D-Phe分别在t_R6.0、8.3、8.6、13.3和41.7min洗脱。真实标准物的保留时间(t_R，min；MRM离子对，母料→产物)如下所示：N-Me-L-Glu(6.0；162→44)，N-Me-D-Glu(15.8)，L-Ile(8.3；132→86)，L-allo-Ile(8.5)，D-allo-Ile(19.6)，D-Ile(22.2)，L-Leu(8.6；132→86)，D-Leu(19.8)，L-Pro(13.3；116→70)，D-Pro(35.2)，N-Me-L-Phe(23.2；180→134)、和N-Me-D-Phe(41.7)。为进一步分离等量异位的(isobaric)Ile和Leu单元，采用不同LC条件[柱，Chirobiotic TAG(4.6x250mm)，Supelco；溶剂，MeOH-10mM NH₄OAc(90∶10，pH 5.65)：流速0.5mL/min；通过MS检测(MRM扫描)]。L-Ile和L-Leu分别在t_R12.3和13.1min洗脱。真实氨基酸的保留时间(t_R，min；MRM离子对，母料→产物)如下所示：L-Ile(12.3；132→86)，L-allo-Ile(13.4)，D-allo-Ile(57.5)，D-Ile(70.5)，L-Leu(13.1；132→86)，和D-Leu(51.7)。使用的MS参数如下所示：DP 31.0，EP 8.0，CE 17.3，CXP3.1，CUR 35，CAD中，IS 4500，TEM 750，GS165，GS265。 

在化合物3的水解产物中的六甲基磷酰胺(Hmpa)用负离子模式 检测[柱，Chirobiotic TAG(4.6x250mm)，Supelco；溶剂，MeOH-10mM NH₄OAc(40∶60，pH 5.35)；流速0.5mL/min；通过ESIMS以负离子模式检测(MRM扫描)]。使用的MS参数如下所示：DP-35.0，EP-8.0，CE-17.9，CXP-1.7，CUR 40，CAD中，IS-4500，TEM 750，GS165，GS265。来自水解产物的(2R，3S)-Hmpa在t_R6.4min洗脱。真实标准物的保留时间(t_R，min；MRM离子对，母料→产物)如下所示：(2S，3R)-Hmpa(6.0；131→85)，(2S，3S)-Hmpa(6.2；131→85)，(2R，3S)-Hmpa(6.4；131→85)，(2R，3R)-Hmpa(7.0；131→85)。为确定该归属，水解产物在不同的HPLC条件下检测[柱，Chiralpak MA(+)(4.6×50mm)，Daicel Chemical Industries，Ltd.；溶剂，2mMCuSO₄-CH₃CN(85∶15)；流速，1.0mL/min；于254nm用UV吸收来检测]。来自水解产物的(2R，3S)-Hmpa在t_R15.4min处洗脱。真实标准物的保留时间(t_R，min)如下所示：(2R，3S)-Hmpa(15.4)，(2R，3R)-Hmpa(17.9)，(2S，3R)-Hmpa(22.7)，(2S，3S)-Hmpa(27.5)。在这些条件下，所有其它单元在t_R＜6.5min洗脱。 

实施例3 碱水解以确定HIVA单元的构型

通过手性HPLC[柱，Chirobiotic TAG(4.6×250mm)，Supelco；溶剂，MeOH-10mMNH₄OAc(60∶40，pH 5.63)；流速，0.5mL/min；通过ESIMS以负离子模式检测(MRM扫描)]分析化合物1的酸解产物。L-Hiva和D-Hiva分别在t_R6.0和6.4min检测到。真实标准物的保留时间(t_R，min；MRM离子对，母料→产物)如下所示：L-Hiva(6.0；117→71)，D-Hiva(6.4)。将化合物1的样品(100μg)悬浮于80μLMeOH-0.5N NaOH(1∶1)中，并于室温放置72h。加入20μL的1N HCl来中和溶液，然后通过手性HPLC-MS对其进行分析。 

只在t_R6.0min检测到L-Hiva。真实标准物的保留时间(t_R，min；MRM离子对，母料→产物)如下：L-Hiva(6.0；117→71)，D-Hiva(6.4)。使用的MS参数如下所示：DP-30.0，EP-3.0，CE-17.3，CXP-2.0，CUR 45，CAD中，IS 4500，TEM 650，GS150，GS225。 

实施例4 抑胃酶氨酸单元构型确定的改进Marfey分析

将化合物1和3的样品(35μg)进行酸解，用L-FDLA进行衍生化(derivatized)，并使用线性梯度的于H₂O中的MeOH(均含有0.1％的HCOOH，40-100％的MeOH，在50分钟内)通过反相HPLC[柱，Alltima HP C18HL(4.6×250mm)，5μm，Alltech；流速，0.5mL/min；用ESIMS以负离子模式检测(MRM扫描，468→408)]进行分析。在两个样品中都观察到比例为1∶1的对应于(3S，4S)-Sta-L-FDLA和(3R，4S)-Sta-L-FDLA的两个峰，分别在t_R35.5和35.9min。真实标准物的保留时间(t_R，min)如下：(3S，4S)-Sta-L-FDLA(35.5)、(3R，4S)-Sta-L-FDLA(35.9)、(3S，4S)-Sta-D-FDLA[与(3R，4R)-Sta-L-FDLA一致，45.7]、(3R，4S)-Sta-D-FDLA[与(3S，4R)-Sta-L-FDLA一致，46.4]。使用的MS参数如下所示：DP-60.0，EP-7.0，CE-28.0，CXP-7.4，CUR 40，CAD高，IS-4500，TEM 750，GS 140，GS240。 

实施例5 结构分析和确定

化合物1的HRESI/APCIMS和NMR数据表明分子式为C₅₈H₉₅N₉O₁₆([M+Na]⁺的m/z为1196.6812，[M+H]⁺的为1174.6988、[M+H+Na]²⁺的为598.8455，[M+2H]²⁺的为587.8544)。对¹H和¹³CNMR谱的研究表明，该化合物为缩酚酸肽(depsipeptide)(图1)，且具有一些酰胺(δ_H～～6至～8)和α-质子(δ_H～～4至～5)的可交换质子信号特征，以及一些在¹H和¹³C NMR谱中的指示与酯键相邻的次甲基的去保护信号(δ_H/C 5.13/78.1和4.70/77.5)。看起来还有一些N-甲基信号(δ_H 3.01和2.30)和一个O-甲基(δ_H 3.72)。此外，以15∶1的比例存在两个构象异构体(conformer)。相信存在于CDCl₃NMR谱中的小信号是由于构象异构体，而不是杂质，因为在DMSO-d₆得到的谱中没有观察到这些。 

对化合物1在CDCl₃中的¹H NMR、¹³C NMR、APT、COSY、编辑的(edited)HSQC、HMBC、ROESY和TOCSY谱的分析(图1)反映出四个常规氨基酸单元(Ala、Thr、Asn和Leu)和两个羟基异戊酸(Hiva)部分的存在。此外，推断出O-Me-Pro、N-Me-Phe、N，N-Me₂-Val和抑胃酶氨酸(Sta，C-25-C-32)。鉴于有两个末端基团(O-Me-Pro和N，N-Me₂-Val)，由不饱和度明显可知该化合物为线性(说明所有16 个双键等价体)。Sta和Thr单元的羟基质子是明显的，因此排除了在这些位置通过酯键的链分支(注意：仅在收集于DMSO-d₆中的NMR谱中观察到苏氨酸羟基)。在HMBC和ROESY数据的帮助下容易地构建出片段Sta-Thr-Ala-N-Me-Phe-O-Me-Pro和N，N-Me₂-Val-Hiva-Hiva-Leu-Asn。这两个片段的连续序列通过ESIMS碎裂得到证实(图5)。然而，没有其它证据，仍然不清楚Sta和Asn单元是通过Asn的C-1还是C-4(化合物1中的C-33和C-36)连接，因为通过Sta单元中的NH₂基团或从NH或H-28没有观察到关联。对于化合物1在DMSO-d₆中的NMR数据收集反映出额外的从一个NH₂酰胺质子到Asn的β碳的HMBC关联，因此确定链通过C-1延展。 

将化合物1的一部分水解(6N HCl，110℃，24h)并通过手性HPLC-MS分析。这反映出L-Pro、N-Me-D-Phe、L-Ala、L-Thr、L-Asp、L-Leu和N，N-Me2-L-Val的存在。水解产物中L-Asp的存在与完整分子中L-Asn的存在一致，伯酰胺经历过水解。此外，检测到对应于L-Hiva和D-Hiva的峰，表明存在两个相反构型的单元。为确定它们的顺序，将化合物1的另一部分进行碱水解(0.5NNaOH/MeOH 1∶1，常温，72h)来选择性地水解酯键以及释放两个末端单元(Hiva-2和N，N-Me₂-Val)。碱水解的手性分析表明仅有L-Hiva的存在，因此确定化合物1呈现的构型。 

为建立Sta的构型，将化合物1酸解产物的一部分用L-FDLA衍生化并进行改进的Marfey分析(参见Marfey等人.Carlsburg Res.Commun.1984，49，591-596)。检测到对应于(3S，4S)-Sta-L-FDLA和(3R，4S)-Sta-L-FDLA的峰，其可能是因为C-3位的脱水/再水化引起的差向异构化。通过J-based分析来原位确定该单元的相对构型的尝试失败(Matsumori等人.J.Org.Chem.1999，64，866-876)，可能是因为小的H-27-H-28耦合(2.7Hz)阻碍了通过HETLOC在该键的异核耦合常数测定(参见，例如，Luesch等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，5418-5423；和Uhrin等人，.J.Magn.Reson.1998，130，155-161)。近来显示出，抑胃酶氨酸和来自其它氨基酸的抑胃酶氨酸类似单元的相对构型可以容易地通过对α-亚甲基信号的耦合常数的测定而确定(Preciado，A.等人，J.Org.Chem.2008，73，9228-9234)。低场H-2a信 号(H-26a)显示出对H-27的较大耦合，高场H-26(H-26b)显示出对H-27的较小耦合(分别为8.7和5.4Hz)，由此表明构型为3S，4S。 

化合物2的HRESI/APCIMS表明分子式为C₅₉H₉₇N₉O₁₆([M+K]⁺的m/z为1226.6687，[M+Na]⁺的为1210.6936，以及[M+H+Na]²⁺的为1188.7119)，且¹H NMR谱显示出与化合物1显著的相似性，包括相同的构象比例。化合物2的¹H NMR、COSY、HMQC、HMBC、ROESY和TOCSY谱检测(图1)反映出在化合物1中发现的相同单元的存在，除了Ala为2-氨基-丁酸(Aba)所取代。化合物1和2之间质子和碳化学位移的紧密相似性表明，化合物2具有与化合物1相同的序列和相对构型。化合物1和2表现出非常相似的旋光度(分别为[α]²⁰ _D-4.4和[α]²⁰ _D-5.0)，表明它们具有相同的绝对构型。化合物2的序列通过ESIMS碎裂来证实(图5)。 

在化合物3的HRESI/APCIMS和NMR数据中，[M+Na]⁺的m/z峰在1009.5941，表明分子式为C₅₀H₈₂N₈O₁₂。¹H NMR谱的分析表明该化合物为具有至少两种构象异构体的肽(酰胺信号在δ_H 6-8、α-质子信号在δ_H～4-5.5)，最显著的构象异构体以2.45∶1的比例存在。还观察到芳香族信号(δ_H 7.2-7.3)、推定的N-甲基单峰(δ_H 3.090、3.087、3.05和2.77)和O-甲基单峰(δ_H 3.75)。对在CDCl₃中记录的化合物3的¹H NMR、COSY、编辑的HSQC、HMBC、ROESY和TOCSY谱的分析反映出四种常规α-氨基酸(Pro、Gly、Ile、Leu)、两种N-甲基化α-氨基酸(N-Me-Phe、N-Me-GIn)、一种羟基酸(2-羟基-3-甲基戊酸，Hmpa)、和Sta(C-25-C-32，图2)的存在。序列N-Me-Phe-Gly-Ile-Sta-Gln-Leu-Hmpa可以通过HMBC分析来确定。H-5a和H-8之间的ROESY关联，允许O-Me-Pro对N-Me-Phe的连接。ROESY数据也证实HMBC序列(图2)。明确确立N-Me-GIn的C-5(化合物3中的C-37)是伯酰胺碳，由于H-28对C-33的HMBC相关以及从H-34和H₃-38到C-39的相关。此外，在HRESI/APCIMS中在m/z 858.5322有[M-128]⁺的峰，其与O-Me-Pro的损失一致(C₄₄H₇₂N₇O₁₀计算为858.5341)。按照默认，提出OH基在C-46，这由该位置的质子化学位移(δ_H 4.15)所支持，表明为OH而不是酰氧基。该序列进一步通过ESIMS碎裂证实(图6)。 

对部分化合物3进行水解(6N HCl，110℃，24h)并通过手性HPLC-MS进行分析。检测到对应于L-Pro、N-Me-D-Phe、L-Ile、N-Me-L-Glu、和L-Leu的峰。水解产物中N-Me-L-Glu的存在与完整分子中N-Me-L-Gln的存在一致，伯酰胺经历过水解。Hmpa的四种立体异构体一起非常接近地洗脱出来，但是作出了(2R，3S)-Hmpa的推定的归属。这在之后通过在四种立体异构体进一步洗脱分开的条件下(参见在本文中描述的检定)，使用不同的柱，通过常规的手性HPLC，经过分析水解产物而得到证实。之后将部分水解产物与化合物1一样用L-FDLA进行衍生化，并再次检测到对应于(3R，4S)-Sta-L-FDLA和(3S，4S)-Sta-L-FDLA的两个峰。C-26处的CH₂质子的进一步低场显示出对H-27的较大耦合常数(9.3Hz)，表明该单元的构型为3S，4S(参见Preciado等人，J.Org.Chem.2008，73，9228-9234)。 

草抑制素A(化合物1)、B(化合物2)、C(化合物3)各自的数据总结如下： 

草抑制素A(1)：无色非晶形固体；[α]²⁰ _D-4.4(c 0.08，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)206(4.93)，258(4.03)，324(3.2)；IR(film)ν_max 3291(br)，3068(w)，3054(w)，3019(w)，2955，2937，2925，2914，2851，2360，2342，1733，1646，1540，1457，1374(w)，1265，1109(w)，1023(w)，896(w)，739；NMR数据，¹H NMR、¹³C NMR、APT、COSY、HMQC、HMBC、ROESY、TOCSY于CDCl₃中，参见表1，¹H NMR、COSY、编辑的HSQC、HMBC、ROESY于DMSO-d₆中；HRESI/APCIMS m/z[M+Na]⁺1196.6812(对于C₅₈H₉₅N₉O₁₆Na计算为1196.6794)，[M+H]⁺1174.6988(对于C₅₈H₉₆N₉O₁₆计算为1174.6975)，[M+H+Na]²⁺598.8455(对于C₅₈H₉₆N₉O₁₆Na计算为598.8436)，[M+2H]²⁺587.8544(对于C₅₈H₉₇N₉O₁₆计算为587.8527)。 

草抑制素B(2)：无色非晶形固体；[α]²⁰ _D-5.0(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)202(4.47)，266(2.96)，320(2.45)；IR(film)ν_max 3276(br)，3079(w)，3054(w)，3017(w)，2961，2927，2874，2360，2342，1752，1732，1690，1627，1549，1493(w)，1463(w)，1436(w)，1389(w)，1369(w)，1267(w)，1207(w)，1179(w)，1124(w)，1023(w)；NMR数据，¹H NMR、 COSY、HMQC、HMBC、ROESY、TOCSY于CDCl₃中，参见表1；HRESI/APCIMS m/z[M+K]⁺1226.6687(对于C₅₉H₉₇N₉O₁₆K计算为1226.6690)，[M+Na]⁺ 1210.6936(对于C₅₉H₉₇N₉O₁₆Na计算为1210.6951)，[M+H]²⁺1188.7119(对于C₅₉H₉₈N₉O₁₆计算为1188.7131)，[M+H+Na]²⁺605.8516(对于C₅₉H₉₈N₉O₁₆Na，计算为605.8515)。 

草抑制素C(3)：无色非晶形固体；[α]²⁰ _D-21.9(c 0.04，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.74)，260(2.89)，320(2.17)；IR(film)ν_max 3307(br)，3078(w)，3054(w)，3016(w)，2659，2927，2904，2874，2361，2340，1742，1635，1531，1462，1442，1410，1368，1285(w)，1199(w)，1047(w)；NMR数据，¹H NMR、COSY、编辑的HSQC、HMBC、ROESY、TOCSY于CDCl₃中，参见表2；HRESI/APCIMS m/z[M+Na]⁺1009.5941(对于C₅₀H₈₂N₈O₁₂Na，计算为1009.5950)，[M-128]⁺858.5322(对于C₄₄H₇₂N₇O₁₀，计算为858.5341)。 

发现草抑制素A-C(1-3)在结构上不同于蓝细菌代谢产物tasiamide B和tasiamide(参见图4)。 

实施例6 蛋白酶抑制筛选

通过声波移液技术(acoustic droplet ejection)(Echo 550，Labcyte Inc.，Sunnyvale，CA)将化合物1加入含有酶的反应缓冲液中，从而使得终浓度为10μM。于室温培育10～15min后，加入底物，之后2h内每5min测定各相关Ex/Em波长处的荧光。将仅有底物的反应缓冲液用作背景。通过获得相对于没有抑制剂对照的斜率的酶活性百分比来评估化合物1的活性。各个酶检定通过Reaction Biology Corp.(Malvern，PA)进行两遍。 

实施例7 蛋白酶抑制检测

对于化合物1和2的检定以与蛋白酶筛选同样的方式进行，使用在DMSO中的3倍连续稀释，分别从10μM和100μM开始，各有10个不同浓度。化合物3在DMSO中不溶，因此使用在EtOH中的连续稀释。对于化合物1-3，使用开始于100μM的3倍连续稀释，具有10个不同浓度。 通过Reaction Biology Corp.(Malvern，PA)进行检测。在GraphPad Prism(GraphPad软件，Inc.，La Jolla，CA)中，使用非线性回归将如上计算的酶活性(％)用来确定IC₅₀值。 

在化合物1的初筛中鉴定出ADAM家族的3个金属蛋白酶(ADAM9、ADAM10和TACE)。然而，只有其中的一个(TACE)可以在剂量反应检测中重复(图3)。化合物1-3对TACE的抑制是浓度和时间依赖性的(图8B)，IC₅₀分别为1.23、2.23和28.6μM。 

实施例8 细胞摄取和细胞组织蛋白酶的抑制

在MCF7细胞中如之前描述对草抑制素A(1)的细胞摄取进行检测(参见Zaidi，N.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2007，364，243-249)。在含有10％胎牛血清(FBS，HyClone，Logan，UT)的Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM，Invitrogen)中于37℃在含有5％CO₂的加湿气氛中培养MCF7细胞。简单来说，将MCF7细胞接种到24孔板中。当细胞达到80～100％汇合(confluency)时，加入化合物1或胃酶抑素A。培育1小时后，除去培养基，对细胞胰蛋白酶化10min，之后通过离心收集并用NP-40裂解缓冲液(1％NP-40，50mM NaOAc，pH 4.0)进行裂解。于37℃将各孔的裂解产物(50μL)与50mM NaOAc(pH4.0，总体积为100μL)中的10μMMca-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH₂(在其它检测中用于组织蛋白酶D和E的相同底物)一起培育。通过测量荧光(λ_ex＝320nm，λ_em＝405nm)的增加而监测反应。 

为测量化合物1和胃酶抑素A在体外对细胞组织蛋白酶的抑制，以相同的方式，使用由未经处理的MCF7细胞制备的溶菌产物来进行动力学检测。将测试化合物加入到反应缓冲液和底物的混合物中(50μL)。通过加入50μL细胞溶菌产物来起始反应，之后用同样的方式监测。 

图9(A-B)显示用组织蛋白酶D/E底物所测定的草抑制素A(1)和胃酶抑素A对于MCF7细胞蛋白酶的抑制活性。图9A示出用草抑制素A(1)或胃酶抑素A处理的MCF7细胞的活性。裂解细胞，并评估裂解产物的蛋白酶活性。图9B涉及直接用草抑制素A(1)或胃酶抑素A处理的MCF7细胞裂解产物(*表示使用双尾t检验的P＜0.05的显著性。数 据点以±SD示出)。明显地，通过草抑制素A(1)在组织蛋白酶D和E之间的选择性大于胃酶抑素A。 

实施例9 PBMC分离以及单核细胞和DC的培养

使用淋巴细胞分离剂(Axis-Shield，Norway)，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从自Lifesouth Community Blood Center(Gainesville，FL，USA)获得的血块黄层(leukopac，PBL)分离PBMC。简而言之，在无菌1×PBS pH 7.4(Gibco，California，USA)中将血块黄层的内含物稀释至3倍体积。将稀释液以2∶1的比例铺展到淋巴细胞分离剂上。随后，将样品于室温和250g离心25min。在分界面收集PBMC，用PBS洗两遍，于4℃和250g离心，每次10min。用台盼蓝拒染法评定细胞存活。将所有人类PBMC和获得细胞的培养物都维持在添加有2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies，Paisley，Scotland)、5000U/mL青霉素(Sigma，Missouri，USA)、5000U/mL链霉素硫酸盐(Sigma，Missouri，USA)和10％v/v胎牛血清(Gibco，California，USA)的RPMI 1640培养基中(Sigma，Missouri，USA)。PBMC用于各种浓度的化合物1的实验，或者进一步分离。 

在37℃将5×106PBMC/mL附着在烧瓶上至2h，从而得到单核细胞。在除去含有非粘附细胞的上清液后，用1×PBS(pH 7.4)清洗粘附的单核细胞。将完全培养基加到剩余的细胞中。为诱导分化成DC，在培养基中加入50ng/mL的GM-CSF(Leukine，Berlex，Washington，USA)和20ng/mL的IL-4(BD Biosciences)至7天。 

实施例10 从PBMC中分离CD4+T辅助细胞

按照制造商的操作规程使用“人类CD4⁺T细胞富集”试剂盒(EasySep，StemCell Technologies，Vancouver，BC，Canada)通过阴性选择来从PBMC中纯化CD4⁺T细胞。简而易之，在12×75mm聚苯乙烯管中将细胞以5×10⁷细胞/mL再悬浮于具有2％胎牛血清的无镁1×PBS中。加入50μL/mL的富集混合物，于室温培育10min，然后加入100μL/mL纳米颗粒混合物，并进行额外的培育。之后使总体积为2.5mL，并将管放入EasySep磁体中。在5min培育以使磁珠附在管侧之后， 将内容物轻轻倒入一干净管中。再清洗一遍珠子以增加细胞纯度。细胞随后被用于混合淋巴细胞反应(MLR)中。 

实施例11 混合淋巴细胞反应(MLR)

根据制造商的操作规程，使用200nM的羧基荧光素二醋酸(carboxyfluorescein diacetate)、琥珀酰亚胺酯(CFSE，分子探针，Eugene OR)标记自体或同种异体的富集CD4⁺T细胞15min，并以1×10⁶细胞/mL进行培养。将经由5μg/mL破伤风毒素C片段(TTc，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)和佛波醇12-豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA，Promega，Madison，WI)脉冲的源自单核细胞的DC(MoDC)，结合增加浓度的化合物1以1∶2的比例加到相同的培养基中。使细胞混合物于37℃在水套培养箱中培育5天。之后，收集培养细胞以进行流式细胞分析。 

发现化合物1能够减少PBMC中抗原刺激的T细胞增殖(图10A)和DC至TH细胞的抗原呈递(图10B)。之前报道过使用胃酶抑素A的实验(参见Zaidi等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2007，364，243-249；Burster等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2008，377，1299-1303；Chain等人，J.Immunol.2005，174，1791-1800；和Zhang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，276，693-701)。图10A显示，在用不同浓度的化合物1处理后，所有PBMC上CD3⁺T细胞的活化下调。图10B示出通过加入不同浓度的化合物1使T_H活化(增殖)下调(“Ctrl”是指不具有向其加入的DC的T细胞。*表示使用双尾t检验的P＜0.05的显著性。数据点显示为±SEM)。 

实施例12 流式细胞术

IFN-γ是促炎症分子，是由活化巨噬细胞(其作用之一)的T_H1细胞产生的特征性细胞因子(Janeway等人，T cell-mediated immunity.In Immunobiology，The Immune System in Health and Disease，5^th ed.；Garland Publishing：New York，2001；295-340)。这些细胞强烈地涉及对抗癌症和例如病毒的细胞内病原体的细胞免疫，但也涉及移植排异的病因(Dunn等人，Immunol.Res.2005，32，231-245)。IL-17是另一种 促炎症细胞因子，由最近阐述的T细胞亚型，T_H17细胞所产生(参见Tesmer等人，Immunol.Rev.2008，223，87-113)。 

T_H17细胞和IL-17已经涉及很多自体免疫和过敏性疾病例如类风湿性关节炎和哮喘(参见Tesmer等人，Immunol.Rev.2008，223，87-113)。因为它们在促炎症病症中的参与以及这些病理与抗原呈递引起的T细胞活化的相关性，针对化合物1对于促炎症细胞因子的调节或下调的作用进行研究。 

将实验中粒状的(pelleted)细胞与抗体一起于4℃培育30min，并用染色缓冲液(PBS+2％BSA+0.1％叠氮化钠)清洗。接着进行细胞内染色，首先加入Cytofix/Cytoperm以增加细胞的渗透性，之后，在用2％多聚甲醛固定之前进行另一轮染色。使用FSC Express(版本3，De Novo Software，Los Angeles，CA)，基于前向和侧向散射特性，通过对淋巴细胞设门(gating)，之后分析阳性染色象限的百分比来进行定量。对每个样品分析50,000个细胞，每种荧光染料都进行同种型特异性的免疫球蛋白对照。在PBMC实验中使用的染料是CD3-APC、CFSE和7-AAD(eBioscience)；用于MLR中的CD4⁺T细胞的是CFSE、7-AAD、结合有AlexaFluo 647的抗IL-17和结合有PE的抗IFN-γ(BD Biosciences)。 

发现化合物1降低T细胞的白介素-17(IL-17)产生(图10C)和干扰素-γ(IFN-γ)产生(图10D)。图10C和D显示化合物1对由自体活化DC诱导的T_H细胞产生细胞内IFNγ(图10C)和IL-17(图10D)的作用(“Ctrl”是指没有向其加入DC的T细胞，*表示使用双尾t检验的P＜0.05的显著性。数据点以±SEM示出)。 

实施例13 蛋白酶图谱和细胞活性

缓慢的抑制起始表明抑制剂的缓慢结合，且可以根据在未受抑制的反应仍是线性的时程内反应的进程曲线中的显著曲线看到(Copeland等人，Wiley & Sons：Hoboken，2005，141-177)。对天冬氨酸蛋白酶的抑胃酶氨酸类缓慢结合抑制剂已被描述过(Marcinkeviciene等人，J.Biol.Chem.2001，276，23790-23794)。对于锌金属蛋白酶的缓慢结合抑制剂和MMP的缓慢结合抑制剂有一些实例(参见Bull等人，J.Biol.Chem. 1985，260，2952-2962；和Bernardo等人，J.Biol.Chem.2002，277，11201-11207)。缓慢结合的原因可能是从活性位点驱出紧密结合的有催化活性的水分子(Copeland等人，In Evaluation of Enzyme Inhibitors In Drug Discovery：A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists，Wiley & Sons：Hoboken，2005；pp 141-177)。使用缓慢结合抑制剂，抑制的起始依赖于测试化合物和酶的预培育时间。 

为了对某些天冬氨酸蛋白酶和其它蛋白酶测试活性和探查选择性，针对一组(panel)蛋白酶对化合物1进行检测，以确定在10μM时的抑制活性。发现化合物1对于部分天冬氨酸蛋白酶——组织蛋白酶D和组织蛋白酶E——有活性。其它具有折中活性的蛋白酶是金属蛋白酶ADAM9、ADAM10和TACE。这些蛋白酶的后继验证显示，化合物1的最大活性是针对组织蛋白酶E。 

图7示出用草抑制素A(1)(10μM)处理的蛋白酶筛选结果。所示数值表示与溶剂对照相较的酶活性百分比，并另外以连续色标示出。 

此外，测试结果显示，相比于胃酶抑素A，化合物1-3均显示出对于组织蛋白酶E超过组织蛋白酶D的选择性。具体来说，化合物1选择性地抑制组织蛋白酶D和组织蛋白酶E，IC₅₀分别为26.5nM和886pm。化合物2选择性地抑制组织蛋白酶D和组织蛋白酶E，IC₅₀分别为7.27nM和354pm，而胃酶抑素A抑制组织蛋白酶D和组织蛋白酶E的IC₅₀分别为173pM和181pm。结果显示化合物1-3抑制组织蛋白酶D和E，且它们对组织蛋白酶E是选择性的(～20至～30倍)，而胃酶抑素A对于这些蛋白酶没有区别。 

明显地，化合物1-3在这两种酶之间有区别，而胃酶抑素A没有区别。这证实了对细胞体系中组织蛋白酶的抑制，以及对树突细胞(DC)抗原呈递的阻碍，其是一个组织蛋白酶E参与的过程(Zaidi等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2008，377，327-330；和Zaidi等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2008，367，517-522)。化合物1可以用作用于研究组织蛋白酶E功能的有价值的探针，因为它选择性地针对组织蛋白酶E。 

在金属蛋白酶中，只有TACE抑制在第二轮检验中得到验证(图3)。针对ADAM9和ADAM10的IC₅₀在高的微摩尔范围内或在100μM以上。 TACE抑制的IC₅₀在低微摩尔范围内，并且与剂量依赖性和时间无关性的组织蛋白酶抑制相反(图8A)，进程曲线分析反映出浓度和时间依赖性的抑制(图8B)。在大范围筛选中，时间可能比所预期的要长，引起化合物1对ADAM 9和ADAM10的IC₅₀看起来较低。 

为评估草抑制素A(化合物1)是否能够进入细胞并在细胞环境中抑制目标酶，用各种浓度的化合物1处理MCF7细胞1h。此时之后，清洗、裂解细胞，然后用荧光的组织蛋白酶D/E底物来测定裂解产物的蛋白酶活性(参见图9A)。为做对比，细胞也用相同浓度的胃酶抑素A处理(图9A)，并通过直接对细胞溶菌产物添加化合物来测定细胞酶的体外抑制(图9B)。化合物1和胃酶抑素A在细胞体系中的表观IC₅₀颇为相似(图9A)。然而，化合物1针对MCF7裂解产物的表观体外IC₅₀是约0.5μM，而胃酶抑素A的为约5nM。该不一致可能反映出这些化合物对组织蛋白酶D和E的不同特异性——与胃酶抑素A相比，化合物1能够抑制较小部分的切割底物的酶(主要是组织蛋白酶E)。归结在一起，结果表明，化合物1能够比已知细胞渗透性差的胃酶抑素A更有效地进入细胞(参见Zaidi等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2007，364，243-249)。 

实施例14 化合物对抗原呈递的作用的研究

组织蛋白酶E被认为在抗原肽的蛋白水解起功能性作用，抗原肽之后在主要组织相容性复合体(MHC)II型通路中作为抗原在抗原呈递细胞(APC)的表面被呈递(参见，例如Zaidi等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2007，364，243-249；Burster等人，.Biochem.Biophys.Res.Commun.2008，377，1299-1303；Nishioku，T.等人，J.Biol.Chem.2002，277，4816-4822；和Chain等人，J.Immunol.2005，174，1791-1800；和Zhang，T.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，276，693-701)。 

在呈递于细胞表面上结合至MHC II型蛋白之前，外源抗原被APC内化，并在内体中蛋白水解切割(Janeway等人，T cell-mediated immunity.In Immunobiology.The Immune System in Health and Disease.5^th ed.；Garland Publishing：New York，2001；295-340)。恒定链(Ii)是在内源肽从内质网输送到内体时防止内源肽结合MHC II型蛋白的分 子伴侣(Janeway等人，In Immunobiology，The Immune System in Health and Disease，5^th ed.；Garland Publishing：New York，2001，155-184)。Ii在进入内体之前和之后都经历一些切割步骤。其移除使得抗原能够结合MHC II以进行接下来的呈递。已经报道过半胱氨酸蛋白酶在Ii切割中的作用(Riese等人，J.Clin.Invest.1998，101，2351-2363；Marié等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91，2171-2175；Zhang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，276，693-701；Nishioku等人，J.Biol.Chem.2002，277，4816-4822；和Chain等人，J.Immunol.2005，174，1791-1800)。此外，Costantino等人(J.Immunol.2008，180，2876-2885)示出结果表明不同酶在Ii切割中的作用是高度变化的并且存在高度的冗余。 

抗原呈递至T细胞，刺激它们的增殖和某些炎症细胞因子的释放(参见下文)(参见Janeway等人，In Immunobiology，The Immune System in Health and Disease，5^th ed.；Garland Publishing：New York，2001，pp295-340)。对化合物1对于人类外周血单核细胞(PBMC)的作用进行研究。PBMC是含有多种APC(树突细胞、B细胞和巨噬细胞)和T细胞的混合物。使用流式细胞术来检验化合物1对T细胞的作用以对CD3⁺淋巴细胞(T细胞)设门。 

发现10μM的化合物1能够显著减少响应于外源抗原(破伤风毒素C片段，TTc，图10A)的T细胞增殖。在相同的实验中，T细胞的存活力未受影响(数据未示出)。 

然后在混合淋巴细胞反应(MLR)中，研究化合物1对来源于单核细胞的树突细胞(DC)和CD4⁺T细胞(T辅助细胞，T_H)间相互作用的影响。第一个实验是自体MLR，其中DC和T细胞来自相同的人类供体。在这个研究中选择DC是因为它们是最有效力的抗原呈递细胞并且比其它APC具有更高的组织蛋白酶E表达(参见Zaidi，N.等人，FEBS J.2007，274，3138-3149)。抗原呈递的主要靶标是T_H细胞，其继续组织(orchestrate)接着发生的免疫反应。之后将这些细胞的富集群作为反应者用于检测中。在抗原(TTc)、佛波醇12-豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)和T_H细胞的存在下，将分化的DC培养5天。 

化合物1能够以剂量依赖性的方式降低T细胞增殖(图10B)。仅TTc和PMA(即，在没有DC的情况下)不能增加T细胞增殖，因此化合 物1的这种作用是依赖于DC的。在该实验中，发现化合物1能够抑制白介素-17(IL-17)(图10C)和干扰素γ(IFN-γ)(图10D)响应于抗原呈递的上调。 

为确定化合物1是否对T细胞识别外来MHC II蛋白有任何作用，对来自不同供体的DC和T_H细胞进行了相同的实验。发现化合物1在同种异体MLR中对DC刺激的增殖没有作用。这可能是因为T细胞正在识别DC表面上的非自体MHC II蛋白(参见Janeway等人，In Immunobiology，The Immune System in Health and Disease，Garland Publishing：New York，2001)。 

此外，即使增殖没有降低，也观察到显著的IL-17和IFN-γ产生的下调(分别为图11A和11B)。图11A-B示出在MLR中化合物1对经同种异体活化DC诱导的T_H细胞产生A)胞内IFNγ和B)IL-17的作用(“Ctrl”是指未向其加入DC的T细胞。*表示使用双尾t检验的P＜0.05的显著性。数据点以±SEM示出)。 

结果表明，化合物1不能抑制MHC II-Li切割，因为在同种异体(而不是自体)MLR中，用10μM化合物1处理的DC仍然能够刺激T细胞增殖。而且，化合物1在两种检测中都能够下调促炎症细胞因子。这表明，要么TTc呈递在两种情况下被抑制，其结果为细胞因子产生被抑制，要么化合物1对细胞因子表达具有直接作用。 

实施例15 分子对接

使用胃酶抑素A在组织蛋白酶D中的晶体结构作为起始点(PDB编码1LYB)，将化合物1和3对接到组织蛋白酶D中(参见Baldwin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90，6796-6800)。将AutoDock Vina 1.0用于所有的对接运行(Trott，O.等人，J.Comput.Chem.2009，DOI：10.1002/jcc.21334)。该程序比AutoDock 4快两个数量级，因此使得具有约25～50个可旋转键的柔性肽在合理时间范围内在正常工作站中的对接成为可能。 

该程序能够再生胃酶抑素A在组织蛋白酶D中的对接构象，其中RMSD为 

穷举性(exhaustiveness)的缺省值(8)足以再生胃酶抑素的结合构象，但是由于化合物1或3具有更多的可旋转键，更高 的值(25)被用于所有的对接研究，另外指出的除外。在草抑制素A(1)和C(3)的结构中，所有的键都作为可旋转的来处理，环和酰胺键除外，且蛋白质作为刚性的来处理。 

对于化合物1，将末端胺质子化来反映其在生理pH的可能状态。除Pro酰胺键外，配体中的所有酰胺都设为反式构型。对于每一个化合物，都制出分别的结构，其中Pro酰胺键为顺式或反式。以穷举值为25以及最大输出为100个结构来进行对接。观察到AutoDock总是能够提出具有相似的计算亲和性(约-9～-7kcal/mol)的对接结构，因此从质量上检验输出结构。用于选择最佳对接结构的主要标准是抑胃酶氨酸单元相对于活性位点天冬氨酸(Asp-33和Asp-231)的位置，并参考胃酶抑素A的结合构象。这样的原理在结合到很多不同天冬氨酸蛋白酶的胃酶抑素A和类似物的许多晶体结构中找到(参见，例如Bernstein等人，J.Mol.Biol.2003，329，505-524；Borelli等人，Proteins Struc.Func.Genet.2007，68，738-748；Fitzgerald等人，J.Biol.Chem.1990，265，14209-14219；Fujimoto等人，J.Mol.Biol.2004，341，1227-1235；Fujinaga等人，Protein Sci.1995，4，960-972；Kamitori等人，J.Mol.Biol.2003，326，1501-1511；Yang等人，Acta Cryst.D 1999，D55，625-630；Asojo等人J.Mol.Biol.2003，327，173-181；Bone等人，J.Am.Chem.Soc.1991，113，9382-9384；Coates等人，Biochem.2001，40，13149-13157；Fraser等人，Biochem.1992，31，5201-5214；和James等人，Biochem.1992，31，3872-3886)。 

以相同的方式进行对组织蛋白酶E的对接，但有一些不同。仅有一种可得的组织蛋白酶E的晶体结构(PDB编码1TZS)(Ostermann等人，J.Mol.Biol.2004，342，889-899)，其中抑制性前结构域(prodomain)仍然存在于活性位点中。该结构可能对应于酶成熟中的早期中间体。除了活性位点中的前结构域外，N端区域(Lys-14～Asp-22)阻碍活性位点通道，从而使得酶处于关闭的构象。需要生成与成熟酶更加一致的结构来执行有效的对接。出于该目的，使用SWISS-MODEL网络服务器进行同源建模(参见Arnold等人，Bioinformatics 2006，22，195-201)。在PDB的蛋白结构中，人类组织蛋白酶E具有与猪胃蛋白酶原(PDB编码2PSG)及其成熟形式胃蛋白酶(PDB编码4PEP)的最高序列同源性(参见Sielecki等人，J.Mol.Biol.1991，219，671-692；和Sielecki等人，J. Mol.Biol.1990，214，143-170)。 

组织蛋白酶E(1TZS)的活化中间体结构与胃蛋白酶原的吻合良好(2PSG，RMSD 

)，因此相应成熟酶(4PEP)的结构很可能是用于同源建模的好模板。得到的结构与1LYB非常吻合(RMSD 

)。胃酶抑素A对同源模型的对接是成功的。得到的构象与结合组织蛋白酶D的胃酶抑素A的构象接近(RMSD )。使用同上的操作规程来对接草抑制素A(1)。对于草抑制素C(3)，使用更大的穷尽值(50)。 

为了了解草抑制素对组织蛋白酶E高于D的选择性的结构基础，将化合物1和3对接到这两种酶中(图12)。对于两种蛋白质，使用AutoDock Vina 1.0成功地对接化合物1和3，其中配体作为完全柔性来处理(Trott等人，J.Comput.Chem.2009，DOI：10.1002/jcc.21334)。为了与胃酶抑素A的组织蛋白酶抑制模型一致，配体的输入结构的所有酰胺键为反式，产生了分别的顺式和反式结构的脯氨酸酰胺除外。对于组织蛋白酶D，结合到此酶的胃酶抑素A的晶体结构被用于对接(PDB编码1LYB)(Baldwin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90，6796-6800)。胃酶抑素A能够在对接配体前，成功再对接到该结构中。对于组织蛋白酶E，使用同源建模来获得合适的起始结构，因为仅有的已公开晶体结构是早期活化中间体的(PDB编码1TZS)(J.Mol.Biol.2004，342，889-899)。 

对于同源建模，将成熟猪胃蛋白酶(一种具有高度同源一级结构的蛋白)的结构(PDB编码4PEP)用作组织蛋白酶E的一级结构的模板，取代1TZS(Sielecki等人，J.Mol.Biol.1990，214，143-170)。在尝试化合物1和3的对接前，胃酶抑素A成功对接到得到的结构中。 

很多由胃酶抑素A结合至组织蛋白酶D的晶体结构(PDB编码1LYB)表明的推定氢键相互作用也存在于化合物1结合到此酶的模型中(图12A)。化合物1相对于胃酶抑素A的降低的亲和性可能是由于P2处(在胃酶抑素A中为Val，在化合物1中为Asn)极性残基的存在。组织蛋白酶D在这个位置具有确立的对于疏水残基的优先级，尽管其在一定程度上容忍此处的极性残基(Rao-Naik等人，Proteins Struc.Func.Genet.1995，22，168-181)。 

图12A-D示出草抑制素A(1)和C(3)与组织蛋白酶D和E的对接结构。对于显示的各蛋白质，可能的氢键以点线显示。图12A示出草抑制素A(1)与组织蛋白酶D的对接构象。图12B示出草抑制素A(1)与组织蛋白酶E的对接构象。图12C示出草抑制素C(3)与组织蛋白酶D的对接构象。图12D示出草抑制素C(3)与组织蛋白酶E的对接构象。 

在化合物1的对接构象中，Asn侧链向下卷曲从而在口盖(flap)中与Ser-80相互作用，以及避开疏水残基Met-307和Met-309。草抑制素A(1)在组织蛋白酶E中的对接结构(图12B)示出此单元与代替组织蛋白酶D中Met-307的极性残基Gln-303相互作用。这可能是对于组织蛋白酶E相比于组织蛋白酶D有增加的亲和性的一个原因。另一个因素可能是在化合物1的O-Me-Pro单元和组织蛋白酶E中的Gln-85之间可能的多个氢键相互作用(图12B)。在组织蛋白酶D中的对等残基——His-77的情况下，可能不能形成这么多氢键。 

发现草抑制素C(3)针对组织蛋白酶D和E不如草抑制素A和B(分别为1和2)有效。怀疑可能是因为末端N，N-Me₂-Val的缺失，其可以作为氢键供体(如果质子化)或受体(如果未质子化)而起作用(Ghoneim等人，Bioorg.Med.Chem.2006，14，6640-6658)。在组织蛋白酶D中，在该单元的范围内有一些极性残基(Tyr-10、Gln-14、Thr-125、Lys-130、Gln-258和Gln-260)。该情况与组织蛋白酶E相似，其中在相同口袋中有多个极性残基(Tyr-20、Glu-24、Glu-27、Glu-121、Asp-125、Glu-256和Tyr-257)。在图12B所示的化合物1的对接结构中，N，N-Me2-Val的碱性氮接近于Gln-121。在同一次运行中，生成了另一个相似的结构，其中碱性氮与Tyr-20接近(未示出)。因此，该单元可以用来将抑制剂锚定在结合间隙(cleft)的正确位置中。 

观察到当对接到相同的蛋白结构中时，相比于草抑制素A(1)，对于草抑制素C(3)生成更多的伪(spurious)结构(例如，N-C方向反转、配体自身折叠、或者不是抑胃酶氨酸的单元位于催化中心的构象)。在这些情况下，因为化合物3比化合物1具有更少的可旋转键，不太可能是搜寻参数对于化合物3而非化合物1不足。 

发现胃酶抑素A中的中心抑胃酶氨酸单元是在P1-P1’位置结合到组织蛋白酶D的抑制药效团(对于该位置参见图4)(Baldwin等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 1993，90，6796-6800)。如果化合物1-3的结合模型相同，那么在抑胃酶氨酸单元侧翼的单元对组织蛋白酶D和E赋予差异化的活性。怀疑相对于组织蛋白酶E更耐受的极性单元，例如化合物1和2中的Asn、或化合物3中的N-Me-Gln，组织蛋白酶D在P2位置强烈偏好疏水氨基酸(参见Scarborough等人，Protein Eng.1994，7，495-502；和Rao-Naik等人，Proteins Struc.Func.Genet.1995，22，168-181)。这可以解释为什么这些化合物与在P2具有缬氨酸的胃酶抑素A相比是针对组织蛋白酶D的更小效力的抑制剂(参见图4)。 

组织蛋白酶D和E在P2’位置都允许极性(但不带电)的单元，也允许例如亮氨酸的疏水单元(参见Rao-Naik等人，Proteins Struc.Func.Genet.1995，22，168-181；和Arnold等人，Eur.J.Biochem.1997，249，171-179)。据推测，从化合物1和2的Thr变为化合物3的Ile可能不是其更低活性的原因。推定的Asn-NH和Ser-80-OH之间的氢键可能对结合尤其重要，并且该相互作用在3中是不可能的因为Gln的α-氮被甲基化。化合物3不具有末端单元N，N-Me₂-L-Val-L-Hiva。N，N-Me₂-Val的碱性氮可能能够与组织蛋白酶D和E中的酸性残基作用。如之前已经示出的，Lys占据组织蛋白酶E的S5亚位增加底物转化(turnover)(Rao-Naik等人，Proteins Struc.Func.Genet.1995，22，168-181)，正电残基占据该位点可能因此是抑制剂结合的关键。 

尽管已经参考具体实施例对本发明进行了具体地示例说明和描述，但本领域技术人员应该理解到，可以做出各种形式和具体细节上的变化而不偏离由所附权利要求涵括的本发明的范围和精神。 

参考并入

本文列出的和/或本申请通篇引用的所有参考资料(包括文献参考、授权专利、公开的专利申请、和共同未决的专利申请)的内容明确地整体引入本文以供参考。 

Claims (15)

1.一种分离的化合物，选自如下的草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物。

2.一种药物组合物，包括选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物，以及药学上可接受的载体或稀释剂。

3.一种在受试者中治疗天冬氨酸蛋白酶相关的疾病或病症的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述天冬氨酸蛋白酶相关的疾病或病症与组织蛋白酶D或组织蛋白酶E相关。 

5.一种在受试者中治疗金属蛋白酶相关的疾病或病症的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述金属蛋白酶相关的疾病或病症是TACE相关的疾病或病症。

7.一种在受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物，其中所述疾病或病症选自血液凝固病症、细胞周期病症、感染、神经退行性病症、自身免疫病症、过敏性疾病、癌症、HIV感染、AIDS、阿尔茨海默移植排斥、和细胞内病原体相关的疾病。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述疾病或病症是类风湿性关节炎或哮喘。

9.一种在受试者中抑制T细胞增殖的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。

10.一种降低受试者中或细胞中IL-17产生的方法，所述方法包括对所述受试者或所述细胞施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。

11.一种减少受试者中或细胞中IFN-γ产生的方法，所述方法包括对所述受试者或所述细胞施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。 

12.一种抑制组织蛋白酶E和/或组织蛋白酶D的方法，所述方法包括使组织蛋白酶E和/或组织蛋白酶D与选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物接触。

13.一种在受试者或细胞中抑制γ分泌酶的方法，所述方法包括使所述细胞与选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物接触。

14.一种在受试者中治疗γ分泌酶相关疾病或病症的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的选自草抑制素A、B和C、或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、水合物、立体异构体、或溶剂合物的化合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述γ分泌酶相关的疾病或病症是阿尔茨海默病。 

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