JP4536918B2 - 免疫調整機能を有するγ−グルタミルとβ−アスパルチル化合物および免疫調節剤 - Google Patents
免疫調整機能を有するγ−グルタミルとβ−アスパルチル化合物および免疫調節剤 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、免疫促進化合物に関し、さらに詳しく言えば、体内のある種類の白血球の成熟および分化を促進させるγ−Ｌ−グルタミル、γ−Ｄ−グルタミル、β−Ｌ−アスパルチル、またはβ−Ｄ−アスパルチル部分のいずれかを含む免疫促進化合物に関する。このように、白血球細胞の分化および増殖を選択的に促進することによって、病気を引き起こす細菌に対する体の免疫力を高めることができ、さらに自己炎症状態を調節して改善する。
【０００２】
（関連出願）
本発明は、１９９６年４月１８日に出願された米国特許出願第０８／６３４，７１８号の一部継続出願であり、この出願は、共に１９９５年１１月２８日に出願されたロシア特許出願第９５１１９７０４号および第９５１２０２６６号の優先権を主張している。さらに、本出願は、１９９７年１２月２５日に出願されたロシア特許出願第９７１２０９４０号に関連し、その優先権を主張している。米国特許出願第０８／６３４，７１８は参照により本願明細書に引用されるものとする。
【０００３】
（背景技術）
免疫系統とは、「自己」として認識されない病原体や細胞に対して生体を保護するために適用された細胞網である。一度免疫系統が活性化されると、それは体内に「自己でない」実態を除去するようにデザインされたエフェクタ機能を高めるようにさまざまな細胞や分子の関与をうながす。リンパ球は免疫系統の細胞であり、異物の存在を明確に認識し選択的に除去することができる。インベーダとの反応で特別でないものとしてみなされる好中球などの免疫系統の他の細胞と対比すると、リンパ球の特徴は、特殊性、多様性、記憶および免疫反応に対する自己／非自己認識を与えることである。
【０００４】
リンパ球には２つの主要な群がある。すなわち、Ｂリンパ球とＴリンパ球である。Ｂリンパ球は、骨髄から発生しその中で成熟して、抗体分子の形成に寄与する。Ｔリンパ球も、骨髄から生じるが、これは胸腺内で成熟する。Ｔ細胞には２つの主要な副群がある。すなわち、Ｔヘルパー細胞とＴ細胞毒性細胞である。これら２つのタイプのＴ細胞は、２つの膜糖たんぱく質のうちのいずれか、すなわちＣＤ４またはＣＤ８が存在することによって区別できる。抗原複合体（特定のたんぱく質に連結した異物分子）によって活性化される場合、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４を表す）は、サイトカインとして総称して公知のさまざまな成長因子を分泌することによって応答する。これらのサイトカインは、Ｔ細胞毒性細胞を含む免疫系統の他の細胞を活性化させる信号である。活性化される場合、Ｔ細胞毒性細胞（ＣＤ８を表す）は、体内をモニタし、体内から病原細胞、異物細胞、ウィルスに感染した細胞、腫瘍細胞を除去する。
【０００５】
Ｔリンパ球の通常の発生、成熟および分化は、胸腺細胞により分泌されたペプチドホルモンにより調整される。このようなホルモンの１つに、４９−アミノ酸残基ペプチドのチモポイエチンがある。チモポイエチンの残基３２−３６であるＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒは、チモポイエチンの生物活性を保持し、チモペンチン(thymopentin) と呼ばれる免疫調節薬の基本となるものである。チモペンチンを治療時に投与する使用目的には、慢性関節リウマチ、皮膚病の状態、バクテリア、ウィルス、菌による感染、手術や癌治療による免疫低下の反転、Ｂ型肝炎ウィルスのワクチン接種に対する反応の強化、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が含まれており、Ｔヘルパー（ＣＤ４）細胞はウィルスにより特に攻撃される状態にある（クリスチャン, ジェイ. エス.(Christian, J.S.)の「チモペンチンの薬理学、臨床投与および毒性に関する報告書(A review of the Pharmacology, Clinical Applications, and Toxicology of Thymopentin)」、トランスジェニカ(Transgenica)、ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオテクノロジー(The Journal of Clinical Biotechnology) 、１、２３〜３４頁、１９９４年）。
【０００６】
チモペンチンと同様の特性をもつ第２の化合物は、ジペプチドの、チモゲン(thymogen)と呼ばれるＧｌｕ−Ｔｒｐである。連鎖−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−も、チモポイエチンの合成の前駆体である分子に発生するが、−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−は、４９−アミノ酸ホルモンの一部ではなく、チモポイエチンの生物活性に寄与するものとして見なされるジペプチドでもない。チモゲンは、ロシアで発見され、主に、疫病の予防や感染治療に使用された。チモゲンは、チェルノブイリ原発事故により放射能に偶発的に被爆したことが原因でリンパ球がダメージを受けた後の免疫機能を増大させるために使用された。（カビンソン等(Khavinson et al.)、国際特許公開第ＷＯ９２／１７１９１号公報および国際特許公開第ＷＯ９３／０８８１５号公報、「薬学ジペプチド組成およびその使用方法(Pharmaceutical Dipeptide Compositions and Methods of Use Thereof)」。）
【０００７】
γ−Ｌ−グルタミル誘導ペプチドは、体内に自然に発生し、最も公知の例は、トリペプチドグルタチオンである。合成γ−Ｌ−グルタミル分子も候補薬として使用されてきた。γ−Ｌ−グルタミル部分は分子の活性部分のキャリヤとして使用されるため、これらの候補薬は、「プロドラッグ」と呼ばれる。例えば、γ−Ｌ−グルタミニル−４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゼンは、人体およびマウスの黒色腫の細胞株において抗癌作用を発揮する。この化合物の抗癌作用は、癌細胞付近で４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゼンの酵素放出によるものであると考えられる（プレジオソ等(Prezioso et al.) 、「γ- グルタミルトランスペプチダーゼの発現は抗癌プロドラッグであるγ−グルタミニル−４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゼンの成長抑制作用を調整する (γ-Glutamyltranspeptidase Expression Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodrug γ-glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene)」、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(International Journal of Cancer) 、５６、８７４頁〜８７９頁、１９９４年）。また、γ−Ｌ−グルタミル−ドーパミンおよびγ−Ｌ−グルタミル−５−ヒドロキシ−トリプトファンは、ドーパミンと５−ヒドロキシ−トリプトファンを脳神経に運び供給することがあるプロドラッグとして記載されている（リカムワ等(Likamwa et al.)、「γ−Ｌ−グルタミル−５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンの抗ナトリウム排泄増加作用は正常脳の５−ヒドロキシトロタミンの脱カルボキシル化に依存する(The Antinatriuretic Action of γ-L-glutamyl-5-hydroxy-L-tryptophan is Dependent on its Decarboxylation to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain)」、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジィ(British Journal of Clinical Pharmacology)、３８７：２６５〜２６９、１９９４年）。
【０００８】
発明者デイジン(Deigin)およびコロトコフ(Korotkov)による１９９６年１２月１９日に公開された国際特許公開第ＷＯ９６／４０７４０号公報には、式Ｘ−Ａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｙ（Ｉ）のペプチドが開示されており、ここで、Ａ＝Ｄ−ＧｌｕまたはＤ−イソグルタミン酸（Ｄ−ｉＧｌｕ）であり、Ｘ＝Ｈ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｎｖａ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、γ−アミノブチル酸またはε−アミノカプロン酸であり、Ｙ＝Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｎｖａ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、γ−アミノブチル酸、ε−アミノカプロン酸、ＯＨ、または１〜３Ｃ置換アミノである。化合物（Ｉ）は、免疫抑制作用（例えば、脾細胞の増殖抑制）をもち、人体、獣医学、実験的生化学に有益であるとされている。
【０００９】
（発明の開示）
「最良の免疫調節剤(Best immunomodulator)」の新造語として頭文字をとった「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連し、免疫調節特性を有する新しい種類の化合物の実施形態に与えられた名前である。本発明の一部継続出願である米国親特許出願第０８／６３４，７１８号には、新しい種類の化合物の数種の化合物が記載され、請求され、さらにこれらの化合物を用いて免疫調節治療方法が請求されている。ベスチム化合物自体は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの化学構造を有する。
【００１０】
新しい種類の合成免疫調整分子が式１で示される。
【式１】
式１では、Ｒは水素、アシル、アルキルまたはペプチド断片であり、Ｘは芳香族または複素環式アミノ酸またはその誘導体、およびｎは１または２である。我々は、新しい種類の一部として（ベスチム、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン以外にも）、これらの化合物が含まれることを発見し、ここでＲは水素、Ｘは、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンおよびβ−Ｄ−アスルチル−Ｌ−トリプトファンなどのＬ−トリプトファンおよびＤ−トリプトファンである。式１において星印を付けたα炭素は立体配置をもつものであり、ｎが２のとき、Ｘの立体配置とは異なる。特別な好適な実施形態は、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンである。式１のペプチドは、無毒の有機または無機酸を有する製薬的に許容可能な塩を形成することがある。カルボキシル基の塩は、任意の適切な無機または有機塩基で形成される無毒カルボキシル酸塩を含む。
【００１１】
実施形態のベスチムは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのさまざまな実験的アッセイシステムで検査された結果、有益な免疫促進作用をもつ。この生物学上の作用のメカニズムは、骨髄Ｔリンパ球前駆体の分化、リンパ球増殖の促進、およびインターロイキン−２を含むさまざまなサイトカインの発生の誘導に関する。ベスチムの薬理効果の最終結果によると、Ｔヘルパーリンパ球、すなわちＣＤ４マーカを含む細胞の数が選択的に増加する。
【００１２】
ベスチムの前臨床実験では、サブナノモル濃度で免疫促進作用が現れている。生体内では、体重１ｋｇ当たり１０ｎｇ〜１μｇの投与量で作用し、免疫促進剤の投与よりも５００から１００万倍高い投与量で毒性が見られない。動物実験では、経口投与後に活性である。
【００１３】
人体での予備実験では、ベスチムは、リンパ球機能の実験変化により測定される場合、免疫機能が増加した。これらの実験変化は、臨床結果に有益な陽性の指示薬(positive indicator)により達成された。
【００１４】
新しい類似体のうちの１つであるγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンは、ベスチムのものと、さらに広範囲の投与量で観察されるＩＬ−２誘導と比較すると、生物学活性がさらに高くなることが分かる。
【００１５】
「免疫調節薬」として指定された薬は、良好に規定された一組の作用がある。ベスチムとその類似体は、伝染病の免疫治療や、放射線への被爆または癌の化学治療や手術などのその他のストレス因子により、予め低下していた免疫反応の回復の薬として効果的である。
【００１６】
したがって、免疫調整作用を有する式１の化合物は、自然または薬で誘導された状態により引き起こされた免疫不全を緩和して患者に有益に投与され、微生物からの危険な感染を改善し減少させるように患者に投与され、特に、それぞれ感染しやすい傾向にある入院中の患者や、手術を受けている患者や、癌の化学治療を受けている患者に対しては被害を受けている場所を処置するように投与される。さらに、式１の免疫調節化合物は、ウィルス除去を容易にし、病原微生物の免疫監視を高め、さらには例えば、疱疹ウィルス、水痘ウィルス、肝炎ウィルスおよびＨＩＶなどの病気を患っているかまたはその保有者である患者の病気の再発を減少させるために、症候性または無症候性ウィルスに感染している患者に投与され、例えば、癌などの状態で、自然細胞が体に「異物」として認識されるような自然細胞を変更する病気の患者に投与され、さらに免疫系統を均衡に調整するために、慢性関節リウマチ、多発硬化症、強皮症などの自己炎症（自己免疫）の病気の患者に投与される。
【００１７】
病気の危険性が高いかまたは病気の兆候が現れている患者に用いる上記の使用法以外に、式１の免疫調節化合物は、例えば、インフルエンザのワクチン接種と組み合わせて伝染病の疑いのある健康な患者に投与したり、例えば、肝炎用のワクチン接種、この専門用語はワクチン接種の「アジュバント」として本発明で使用されるワクチン接種と組み合わせて病原体への免疫反応を高めるように投与してもよい。
【００１８】
これらの使用は、体重１ｋｇ当たり約１ｎｇ〜約１，０００μｇの範囲の服用量で投与され、１回の投与または１ヵ月以上の期間にわたって断続的に与えられ、さらに投与経路は、非経口注射、経口または鼻吸入、または経口摂取によるものが好ましい。
【００１９】
（好適な実施形態の詳細な説明）
広義には、本発明の化合物は、Ｔヘルパー細胞の数をホストの最適なレベルに調節する特有の化学物質である。例えば、Ｔヘルパー細胞数を増加させるために免疫系統を調節すると、バクテリアやウィルスからの感染を処理する生体の能力が増大する。また、Ｔヘルパー細胞の数を増大するように調節することによって、ホストに対して異物となる癌細胞に対して体が闘いやすくなる。この代わりに、これらの物質によって、内因性組織に対してホストのＴ細胞による過度の攻撃が生じる自己認識処理の混乱から生じた病気に対してホストが調節を行うこともできる。このような場合、本発明の化合物は、慢性関節リウマチおよび多発硬化症などの自発的な炎症（自己免疫）の病気の兆候や症状が改善されるように、Ｔ細胞数を調整する。
【００２０】
「最良の免疫調節剤(Best immunomodulator)」の新造語として頭文字をとった「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連するもので、免疫調節特性を有する新しい種類の化合物の実施形態に与えられた名前である。免疫促進投与量よりも５００または５００，０００倍を超える服用量で毒性は観察されない。ベスチム化合物自体は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの化学構造を有する。新しい種類の合成免疫調節分子は、式１に示すように、アミノ末端にγ−Ｌ−グルタミル部分、γ−Ｄ−グルタミル−部分、β−Ｌ−アスパルチル部分、またはβ−Ｄ−アスパルチル部分を有する。
【式１】
式１では、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシルまたはアルキルであり、Ｘは芳香族または複素環式アミノ酸またはその誘導体であり、好ましくはここではＸ＝Ｌ−トリプトファンおよびＤ−トリプトファンである。「Ｘ」の芳香族または複素環式アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−またはジ−（Ｃ1-Ｃ6）アルキル置換アミド、アリールアミドおよび（Ｃ1-Ｃ6）アルキルまたはアリールエステルである。「Ｒ」の適切なアシルまたはアルキル部分は、１〜６炭素の枝分かれしたまたは枝分かれしていないアルキル基、２〜１０の炭素原子からのアシル基、およびカルボベンジルオキシ基およびｔ−ブチルオキシカルボニル基などの保護基である。式１で星印を付したα炭素は、立体配置をもつもので、ｎが２である場合、Ｘの立体配置とは異なるものである。
【００２１】
新しい種類の一部として（ベスチム、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン以外にも）、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎin−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン、およびβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンなどの化合物が含まれる。
【００２２】
式１のペプチドは、無毒の有機または無機酸を有する製薬的に許容可能な塩を形成することがある。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、リン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの塩化水素、臭化水素、硫酸およびリン酸および酸金属塩を含む。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、モノ−、ジ−、トリカルボン酸を含む。このような酸の例は、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸(hydroxygenzoic)、酢酸フェニル、桂皮酸、サリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、およびメタンスルホン酸や２−ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸である。カルボキシル基の塩は、任意の適切な無機または有機塩基で形成された無毒のカルボン酸塩を含む。例示的に、これらの塩は、例えば、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムを含むＩＩＩＡ族の軽金属、および例えば、トリエチルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、１−エチレンアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジル−エチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン：Ｎ−（低級）アルキル−ピペリジン、他の適切なアミンを含むトリアルキルアミンなどの第１、第２、第３アミンを含む。
【００２３】
式１の本発明の化合物にγ−Ｌ−グルタミル部分またはβ−アスパルチル部分が存在すると、２つの重要な特性が与えられるとされている。この２つの特性とは、アミノペプチダーゼによる分解に対する抵抗力と、潜在能力の増大である。しかしながら、本発明の類似体の１つであるγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンは、ベスチムよりもさらに高い生物学活性と、より広範囲の服用量の範囲を有することが分かっている。本発明のこの特定の好適な実施形態は、「ＳＣＶ−０７」と称することもある。
【００２４】
毒性
良好な実験室プラクティスの条件に応じて、ベスチムを用いて急性毒性および亜急性毒性の動物実験を行った。すべての実験において、アンプルに無菌凍結乾燥粉末として調整したベスチムを、無菌０．９％ＮａＣｌ溶液で溶解し、筋肉内注射を行った。
【００２５】
急性毒性：齧歯動物（マウスおよびラット）およびイヌをオスとメスの数が同一になるグループに無作為抽出した。ベスチムを１回投与（筋肉内）させた後、１４日間毎日動物を検査した。
マウス − ５，０００．０ ｍｇ／ｋｇ
ラット − ５００．０ ｍｇ／ｋｇ
イヌ − ５００．０ ｍｇ／ｋｇ
【００２６】
体重、全体的な外観、行動を毎日評価し、２週間の最終日に、すべての動物の内蔵（心臓、肺、胸膜腔および腹膜腔、筋肉、胃、小腸および大腸、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、甲状腺、脳、皮膚および睾丸／卵巣）の肉眼検査および組織病理検査を行った。
【００２７】
検査した動物の中で死亡したものは観察されず、全体的な外観、行動、体重、血液内指標、生化学指標、生理的指標、肉眼検査および組織病理検査の記録結果はすべて正常値内のものであった。
【００２８】
亜急性毒性実験：もう１つの実験である第２の実験では、より長い間ベスチムを投与した。
ラット：３カ月および６カ月毎日、１ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与
イヌ：１カ月および３カ月毎日、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与
【００２９】
ラットにベスチムを繰り返し注射したが、死亡した動物はおらず、行動または血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。肉眼レベルと組織病理レベルでのすべての組織の形態上の外観は正常であった。ラットへの両投与ともに実験動物の体重が僅かに増えた。
【００３０】
イヌにベスチムを繰り返し注射したが、死亡した動物はおらず、行動、体重、血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。検査したすべての組織の肉眼検査および組織病理検査に著しい変化は見られなかった。注射部位での局所的炎症反応はなかった。
【００３１】
結論として、これらの毒性実験によれば、ベスチムは、齧歯動物と犬では急性または亜急性毒性を受けないことが分かった。治療トライアル用の予測投与量に対して検査で用いた投与量は、１回の投与の場合では約５，０００，０００倍であり、繰り返し投与した場合では約１００倍のものであった。
【００３２】
また、生体内での４つのペプチド（これらのうち３つは本発明のもの）の毒性をマウスの胸腺細胞を用いて検査した。胸腺細胞を２度洗浄し、２％致死子牛血清を含有するＲＰＭＩ１６４０媒体内に再懸濁させた。細胞懸濁液を９６個のウェルがある板（１ウェル当たり１×１０6個の細胞）内に配置した。次いで、ペプチド（または制御ウェルの担体）を所要の濃度でウェル内に添加した。ＣＯ2の培養器内で３７℃、４時間、ペプチドまたは担体で細胞を培養した。培養後、エオシンＢ(Eosin B) を用いて細胞の生存能力を顕微鏡で算出した。その結果を表Ａに示す。
【表Ａ】
* ｐ＜０．０５の場合制御と比較すると、相違が統計的に著しい
【００３３】
しかしながら、比較上のペプチドであるγ−Ｄ−グルタミル−Ｄ−トリプトファンは、細胞の生存能力を減少させ（表Ａ）、したがって、０．１ｍｇ／ｍｌの投与量で細胞に有毒なものとなることが分かった。
【００３４】
ゴールドスタイン(Goldstein) およびオウディヤ(Audhya)（実験および臨床医学におけるチモペンチンの「チモポイエチンからチモペンチンまで：実験的研究(Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies) 、Surv. Immunol. Res. 、４、１〜１０頁、１９８５年）は、免疫調節薬が免疫不均衡が低応答性または高応答性の状態にあろうが、免疫不均衡を回復するように作用する。これらの薬の双方向の作用は、不均衡の状態を均衡した目標値に回復する生体調整の性質により生じる。低応答性の場合、Ｔリンパ球を調整するホルモン投与は、自己防衛システムの機能を最適化しさらに調整するため、自己ではない有機体がさらに除去しやすくなるように作用する。高応答性の場合、免疫調節薬を投与すると、有益な「自己」の存在を間違って攻撃することが減少する自己免疫処理を弱めるようである。低応答性の免疫状態と高応答性の免疫状態におけるベスチムの臨床投与のカテゴリーに関して記載し、例示して述べる。
【００３５】
低応答性状態または免疫不全状態
免疫不全状態は、一般的に３つの因果関係のカテゴリーに別れる。１つ目は、病気の過程の結果として生じる免疫抑制である。２つ目は、他の病気の治療により生じた免疫不全、いわゆる医原性免疫不全である。３つ目は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）によりＴリンパ球が直接攻撃されることから生じる免疫不全である。
【００３６】
免疫不全になる病状の過程で共通するものは、栄養不良、新生物増殖、老化および感染である。細胞性および体液性免疫応答が弱まることで、さまざまな細菌による感染媒体に感染しやすくなるため、栄養不良の人、広範囲に癌が進行した患者や病気で衰弱した人は、病気になりやすく、さらに死に至る確率も高くなる。免疫応答の不全が広がった状態を免疫性欠如と呼ぶ。さまざまなタイプの感染、特にウィルス感染が免疫抑制となる。免疫系統のＴヘルパーリンパ球成分をより強力なものにできるベスチムなどの薬は、患者の感染への抵抗力を高めるための重要な治療薬となる。例えば、ベスチムまたはその類似体は、
−− 共通した深刻な臨床問題である院内感染（病院で誘発される感染）の危険性を下げるために病院への許可前または許可直後に、患者、特に年配の患者に投与され、
−− このような患者は特に感染しやすい傾向にあるため、犠牲になっている個所を処置するように投与され、
−− 例えば、インフルエンザ接種や肝炎接種と組み合わせて流行性の感染の疑いがある患者に対して、病原体への免疫応答を活性化させるように投与され、
−− 例えば、疱疹ウィルス、バクテリアウィルス、肝炎ウィルスやＨＩＶの保有者である患者に対して、病原有機体の免疫監視を高め、病気の再発の可能性を下げる目的で、無症候性のウィルスが感染した患者に投与される。
【００３７】
医原性の免疫抑制のほとんどは、リンパ球を殺すかまたは機能的に不活性にする薬治療が原因である。さまざまな化学治療薬が癌患者に投与され、これらの薬は、通常、成熟リンパ球および成長中のリンパ球の両方に対して細胞毒であり、さらには顆粒球前駆体および単球前駆体に対しても細胞毒である。したがって、癌の化学治療は、ほとんどの場合、免疫抑制期間および感染の危険性が高い期間に行われる。癌の放射線治療も同じ危険性を伴う。薬物治療（顆粒球群促進因子）は、癌の化学治療後に生じる感染と戦わせるように血液中の好中球を増やすために用いられるが、リンパ球の機能を回復させるための薬物治療は現在のところ用いられていない。動脈瘤の治療やバイパス形成手術などの大手術では、人体の免疫機能も下がる。大手術により起こる血中リンパ球の低下の理由は明らかではないが、感染の可能性を下げながら、このような患者のリンパ球機能を高める薬剤には治療薬剤として重要なものである。
【００３８】
述べておく必要がある後天性免疫抑制の最終的なタイプは、脾臓がない場合に生じるもので、これは、外傷後またはある種の血液病の治療用にこの臓器を手術で除去したり、または鎌状細胞病で梗塞が形成された結果引き起こされる。脾臓がない患者は、ある細菌、特に肺炎連鎖球菌などの被包バクテリアの感染を受けやすい。脾臓は、このような細菌に対する保護用体液性免疫応答を誘導するために必要であることは明らかである。ベスチムは、微生物による汚染に対して、脾臓がない患者または胸腺がない患者の抵抗力を高める働きをする。
【００３９】
本発明のペプチドに関するデータと、さらにいくつかの合成方法を、以下の例を用いて説明するが、この例は説明を目的とするもので、本発明を限定するものではない。
【００４０】
例１
本発明の化合物の調製とそれらの製薬組成
材料と装置
試薬 Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−グルタミン酸α−ベンジルエステルとＮ−ベンジルオキシカルボン−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステルを、ムーア等(Moor et al.)のJ. Chem. Soc.、２３４９（１９６６）に記載されるように調製し、さらにＬ−トリプトファンベンジルエステルｐ−トルエンスルホン酸を、アライ等(Arai et al.)、J. Org. Chem.、４８、１２１（１９８３）に記載されるように調製した。Ｄ−トリプトファン、Ｎ−メチルモルホリン、クロロぎ酸イソブチル、パラジウム−炭素触媒（１０％）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリルをフルカ社(Fluka)から購入し、トリフルオロ酢酸をメルック社(Merck)から購入した。
【００４１】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） 以下の溶媒系（体積比）を用いて、予め被覆させた板のＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ254（メルック社）上で上昇ＴＬＣを実行した。
Ａ．クロロホルム／メタノール／酢酸 ９０：８：２
Ｂ．２−プロパノール／２５％ ＮＨ4ＯＨ／水 ５０：５：１５
Ｃ．ブタノール／酢酸／水 ３：１：１
ＵＶ光、ニンヒドリン、Ｊ2でペプチドを配置した。
【００４２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） すべてのＨＰＬＣ分離に対して、同じ溶媒系を用いた。すなわち、溶媒Ａ−０．１％トリフルオロ酢酸水と、溶媒Ｂ−アセトニトリルである。
【００４３】
２つのポンプ（モデル３０２）、自動サンプラ（モデル４０２）、分光光度計（モデル１１６）、データマスタ(Data Master)（モデル６２１）、および分析カラムゾルバックス(Zorbax)ＯＤＳ ４．６×１５０ｍｍ、５μからなるギルソン(Gilson)クロマトグラフ上で分析作業を実行した。流量は１ｍｌ／ｍｉｎであった。２３０ｎｍでペプチドを制御した。溶離液は、２０分間、１０〜４０％Ｂまたは１０〜９０％の線形の勾配であった。
【００４４】
２つのポンプ（モデル３０２）、動力計ミキサ（モデル８１１）、フラクションコレクタ（モデル２０２）、分光光度計（ホロクロム(Holochrome)）、および分取カラムゾルバックス ＯＤＳ ２１．２×２５０ｍｍ、８μからなるギルソンクロマトグラフ上で予備浄化を実行した。流量は１０ｍｌ／ｍｉｎであった。２３０ｎｍでペプチドを制御した。溶離液は、８０分間、０〜４０％Ｂの線形の勾配であった。
【００４５】
核磁気共鳴 プロトンに対して３００ＭＨｚで直角検出するフーリエ変換モードで、アスペクト(Aspect)２０００コンピュータを備えたブルッカー(Brucker)ＣＰＸ−３００を用いて、すべてのスペクトルを記録した。０．５ｍｌのＣＤ3ＯＤで５０ｍｇのペプチドを溶解し、ここで 1Ｈ残留信号を３．３５ｐｐｍで参照としてとった。特別な記載がなければ、通常の獲得パラメータは、温度は周囲温度で、スペクトル幅は４，５００Ｈｚで、パルス幅は１μｓ（６0）で、時間ドメインにおいて８１９２データ点であった。１６３８４点アドレスで処理を実行した。緩和遅延は２ｓであった。
【００４６】
例１Ａ
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンジベンジルエステル
無水テトラヒドロフランにおいてＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−グルタミン酸α−ベンジルエステル（０．７４ｇ、２ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（０．２２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）の溶液を−１５℃に冷却する。クロロぎ酸イソブチル（０．２８ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を添加して、この混合物を混合無水化合物を形成するために３分間、−１０℃に置く。無水テトラヒドロフランにおいてＬ−トリプトファンベンジアルエステルｐ−トルエンスルホン酸（０．９３ｇ、２ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（０．２２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）の溶液を−５℃に冷却し、添加して、約５℃の冷蔵庫に反応混合物を置く。次の日、溶液を塩からフィルタがけし、無水テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）で洗浄し、真空内で蒸発させる。酢酸エチル（５０ｍｌ）で残留物を溶解し、同量の水、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4溶液、水、５％ＮａＨＣＯ３溶液、さらに再度水で洗浄する。これを無水Ｎａ2ＳＯ4 上で乾燥させ、乾燥剤からフィルタがけし、約１０ｍｌまで真空内で濃縮する。ヘキサン（５０ｍｌ）を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は８２０ｍｇ（６２％）である。Ｒｆ（Ａ）は０．７５である。
【００４７】
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
メタノール（３０ｍｌ）中におけるＮ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンジベンジルエステル（０．６ｇ、０．９ｍｍｏｌ）の溶液を、５時間Ｐｄ／Ｃ（１０％、２００ｍｇ）上で水素化させる。触媒を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる。生成量は２６０ｍｇである。
【００４８】
分取ＨＰＬＣを用いて、このようにして得たペプチドを浄化し、凍結乾燥させる。生成量は１９０ｍｇである。ＲＦ（Ｂ）は０．５で、ＲＦ（Ｃ）は０．４５である。前述したように、このような特定の好適な実施形態は、「ＳＣＶ−０７」と呼ばれることがある。
【表１】
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの
プロトン化学シフト（ｐｐｍ）
【表２】
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの
13Ｃ化学シフト（ｐｐｍ）
【００４９】
例１Ｂ
γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファンα−ベンジルエステル
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９６ｍｌ）においてＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステル（０．９９ｇ、２．６ｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液を氷水浴で冷却し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）においてジシクロヘキシルカルボジイミド（０．５６ｇ、２．７ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌して添加する。０℃で１時間この混合物を攪拌して、室温で一晩置く。分離したＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、Ｄ−トリプトファン（０．６４ｇ、３．１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．４６ｍｌ、３．３ｍｍｏｌ）を濾過水に添加する。この混合物を室温で１６時間攪拌して、水（５０ｍｌ）で希釈する。分離した油を酢酸エチル（３×２０ｍｌ）で抽出して、組み合わせた有機層を２ＮＨ2ＳＯ4溶液（２×２０ｍｌ）と水（４×３０ｍｌ）で洗浄して、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて、乾燥剤からフィルタがけし、約１０ｍｌまで真空内で濃縮させる。ヘキサン（３０ｍｌ）を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は１．２ｇ（８１％）である。Ｒｆ（Ａ）は０．７である。
【００５０】
γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン
メタノール（３０ｍｌ）中においてＮ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファンαベンジルエステル（０．６ｇ、０．９ｍｍｏｌ）の溶液を、２時間Ｐｄ／Ｃ（１０％、２００ｍｇ）上で水素化させる（ＴＬＣ制御）。触媒を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる。生成量は２８５ｍｇである。
【００５１】
分取ＨＰＬＣを用いて、このようにして得たペプチドを浄化し、凍結乾燥させる。生成量は１８０ｍｇである。Ｒｆ（Ｂ）は０．５で、Ｒｆ（Ｃ）は０．４５である。
γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファンは、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンと同じ 1Ｈ ＮＭＲおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルを有する。
【００５２】
例１Ｃ
β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンの固相合成
固体担体として１％ジビニルベンゼン橋かけポリスチレンを用いて、所要の分子を合成した。０．１ｇのＮａ−ｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−ニンホルミル−Ｌ−トリプトファン−メリフィールド樹脂（Ｔｒｐ０．７ｍｍｏｌ／ｇ樹脂の含量）を反応器に配置する。自動合成プログラムは以下のとおりである。
【表３】
自動ペプチド合成用スケジュール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン、
ＤＭＡＡ：ジメチルアセトアミド
* 氷上で３０分間、ＤＭＡＡで３つの等価のＢｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ−α−ＯＢｚｌ、ＨＯＢｔおよびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＩ）から調製された１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の活性化エステルでカップリングが実行された。
** カイザー(Kaiser)のニンヒドリン検査によりカップリング完了が検証された（カイザー等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４：５９５、１９７０）。カップリングが完全に終了していない場合は、もう一度繰返した。
【００５３】
ペプチドを脱保護し、６０分間、０℃で１０％アニソールと１０％ｍ−クレゾールを含有する液体フッ化水素（ＨＦ）でポリマーから開裂した。０℃の真空内でＨＦを除去し、ペプチドを３０％水性酢酸で抽出し、エチルエーテルで洗浄し、凍結乾燥させて、０．２Ｎ水酸化ナトリウムで脱ホルミル化した後、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により純化した。
【００５４】
第５段階のみが異なる異なるＢｏｃ−誘導体を用いて、上述した表３のスケジュールのものと同じ方法により、すべてのベスチム類似体を合成させてもよい。
【００５５】
合成の検証
例えば、ベスチムは以下により特徴付けられる。
１． 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、クロマトグラフギルソン（フランス）、溶離液０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配１０〜４０％、１４分ラン、カラムデルタ−パック(Delta-Pack)Ｃ−１８、３００Å、５μｍ、３．９×１５０ＭＭを用いた。生成物の保持時間は８．１ｍｉｎであり、ＨＰＬＣピーク下での平均領域として測定された純度は９９．７％であった。
２． アミノ酸分析：ＬＫＢアミノ酸アナライザアルファプラス(Alpha Plus)４１５１を用いて、２４時間、１１５℃の真空内で０．２％トリプタミンを含有する４Ｎメタンスルホン酸に生成物を加水分解した。グルタミン酸のペプチド含有量は１．０で、トリプトファンは０．０４であり、所望の残留物の存在を確認した。
３． 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：システム１ − ｎ−ブタノール：酢酸エチル：酢酸：水＝１：１：１：１、Ｒｆ＝０．７２、システム２ − ｓｅｃ−ブタノール：酢酸：トルエン：水＝６：１：２：１、Ｒｆ＝０．４
４． 核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）：アスペクト(Aspect)２００コンピュータを備えたＮＭＲ分光計ブルーカー(Bruker) ＧＸＰ−３００。、ペプチド（０．００１Ｍ／ｌ溶液）を炭素ＮＭＲスペクトルで検出した：Ｇｌｕに対して、３０．０；３１．０；５７．２；１７６．６；１７８．３ｐｐｍ、Ｔｒｐに対して、３５．７；５８．３；１１３．１；１１６．６；１２３．４；１２４．３；１２６．６；１２９．０；１３１．０；１４０．３；１７９．４ｐｐｍであった。
５． 高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）、分子イオン：計算、３３４．１３ Ｄａ；３３３．７３獲得。
【００５６】
製薬上認可される塩形式の本発明の化合物の調製を、以下の例１Ｄと、さらに例１Ｅに記載するような錠剤の製剤により説明する。
【００５７】
例１Ｄ
Ｈ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐナトリウム塩の調製
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ−α−ベンジルエステル（５ｇ、０．０８７Ｍ）をメタノール（４０ｍｌ）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（０．７３ｇ、０．０８７Ｍ）を添加した。空気を低速の流れの窒素と取り替え、１０％パラジウム炭触媒（３０ｍｌ水に２．５ｇ）を添加した。さらにもう一度、低速の流れの窒素をフラスコを通して流し、低速の流れの水素の導入を開始した。強力な攪拌により触媒の懸濁を保持した。４時間、濾過により触媒を除去して、メタノール（１０ｍｌ）により洗浄した。濾過水を真空内で蒸発させ、残留物をアセトニトリルで粉末にした。固体の生成物をフィルタ上で収集し、アセトニトリルで洗浄して、真空内で乾燥させた。
生成量：２．１４ｇ（７０％）
【００５８】
例１Ｅ
錠剤の製剤
例１Ａの本発明のペプチド（γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン）を、９８．９％グリシン、１％ステアリン酸マグネシウムおよび０．１％の本発明のペプチドか、または９４．９％グリシン、５％デンプンおよび０．１％の本発明のペプチドのいずれかを用いて錠剤に製剤した。各１００ｍＧの錠剤は、本発明の類似体の１００μｇを含有した。
【００５９】
例２
生体内でのベスチムおよびベスチム類似体の検証
インターロイキン２（ＩＬ−２）生成物への影響
標本： マウス（ＣＢＡストレイン）
分析評価： ペプチドγ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（ベスチム）およびγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（ベスチム類似体）を、５連続日、１日につき表に示す異なる服用量で水溶液の形でマウスに経口的に投与した。５匹の動物を用いて各ペプチドを服用させた。４８時間後、脾臓を除去し、９６ウェルの底が平坦な培養板に１０％致死子牛血清で満たしたＲＰＭＩ−１６４０培地において、ＩＬ−２生成物誘導酵素ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）がある生体外で、さらに２４時間脾臓細胞を培養した。マウスのＩＬ−２−依存細胞株ＣＴＬＬ−２（ギリス等(Gillis et al.)、１９７８）において、上澄みにあるＩＬ−２レベルを測定した。
【表４】
マウスの脾臓細胞によるＩＬ−２生成物への
ベスチムおよびその類似体の効果
*ｐ＜０．０５で、制御に著しい相違
【００６０】
結論： ペプチドγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（本発明のベスチム類似体）は、ベスチムよりも高い生物学的活性を呈した。ＩＬ−２の導入をより広範囲の服用量で観察し、服用量が大きい場合、この類似体はＩＬ−２導入を低下させなかった。
【００６１】
例３
マウスの骨髄Ｔ細胞前駆体によるＴｈｙ−１抗原発現への影響
実験記録： 骨髄細胞をＣＢＡマウスの大腿骨から獲得し、３７℃で１時間、イーグル培地でマイクロタイトレーション（テラサキ）板において生体内でペプチドで培養した。反Ｔｈｙ−１抗体を用いて補体依存性の細胞毒分析評価により、 Ｔｈｙ−１抗原発現を決定した。
【表５Ａ】
本発明のペプチド類似体を含むものに培養させた
マウスの骨髄における
Ｔｈｙ−１抗原発現細胞数の変化
*ｐ＜０．０５で、制御に著しい相違が見られた。
【００６２】
結論： 本発明のペプチドγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐは、ベスチムおよび別の本発明の類似体であるγ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｔｒｐの作用と比較すると高い作用を呈した。
【表５Ｂ】
本発明のペプチドを含むものに培養させた
マウスの骨髄における
Ｔｈｙ−１抗原発現細胞数の変化
* ｐ＜０．０５で、制御に著しい相違
** 使用したペプチドは、
１．β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
２．アセチル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
３．β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
４．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン−アミド
５．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）
【００６３】
例４
生体内ベスチム類似体の生物学的作用
ペプチド： 凍結乾燥形でベスチムおよび本発明のいくつかの類似体を調製した。実験の直前に異なる物質濃度を有する溶液を調製するためにすべてのペプチドを水に可溶性にした。
【００６４】
培養でのＩＬ−２生成物への影響
実験記録 ＣＢＡマウスから脾臓を除去し、脾臓細胞を分離し、９６ウェルの底が平坦な培養板に１０％致死子牛血清で満たしたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＩＬ−２生成物を５μｇ／ｍｌＣｏｎ Ａで２４時間の培養で生成した。所要の濃度でペプチドを「０」時間で細胞培養に添加する。ＩＬ−２−依存ＣＴＬＬ−２細胞株（ギリス等、１９７８）において、培養上澄みにあるＩＬ−２レベルを求めた。
【表６】
ベスチム類似体を含む培養での
マウスの脾臓細胞による
Ｃｏｎ−Ａ誘導ＩＬ−２の変化
*ｐ＜０．０５で、制御に著しい相違
【００６５】
例５
経口投与後の患者の免疫系統の変化
例１Ｅに記載した２つの錠剤の製剤のうちいずれかの製剤を、手術後１ヶ月経過した２人の癌患者に投与した。
【００６６】
第１の事例研究
患者：「Ｅｇ」
診断：大腸癌
前治療：手術
ＳＣＶ−０７治療：５日経口錠剤投与（１日当たり０．１ｍｇ）
【表７】
【００６７】
第２の事例研究
患者：「Ａｒ」
診断：大腸癌
前治療：手術
ＳＣＶ−０７治療：５日経口錠剤投与（１日当たり０．１ｍｇ）
【表８】
【００６８】
自発ルミノール依存化学発光分析結果（ムトー等(Muto et al.)、１９８６）を用いて遊離酸素ラジカル生成レベルの変化により、ヒト好中球白血球への本発明のペプチドγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの影響を決定した。表に示した濃度で塩水に希釈したペプチドとともに１２５１照度計（ＬＫＢ）の作業キュベットにドナーの全血液の標本を挿入した。各キュベットにルミノールを添加し、１０分間キュベットを培養した。この後、３７℃で４０分間、照度計のウェルで培養し、続けて攪拌した。「ルミナ(Lumina)」コンピュータプログラムを用いて発生したスーパーオキシドラジカル量を計算し、４０分間光の総量として表した（ｍＶ／ｍｉｎ）。各試料を３通りに検証した。
【表９】
ヒト全血液細胞培養のルミノールを高めた
好中球化学発光へのペプチドの影響
* ｐ＜０．０５で、制御に著しい相違
【００６９】
ヒト白血球走化性への本発明のペプチドの影響に関する検証
ネルソン等(Nelson et al.)（１９７２）により記載されたアガロース移動技術を用いて、走化性分析評価を行った。１０％致死子牛血清で満たした１９９培養培地でアガロースを溶解して最終的な濃度を１％にした。この混合物を組織培養皿に移して、ゲル状にした。このゲルに、直径２ｍｍの一連のウェルを３ｍｍ間隔で切り分けた。１０μｌの好中球（１ｍｌ当たり２．５×１０６細胞）を中央のウェルに添加した。ランダム移動を測定するために他のウェルを培地の片側に満たし、促進された移動を測定するために１０−７Ｍで走化性ＦＭＬＰでこれらのウェルをもう一方の片側に満たした。ＣＯ2培養器で１２０分間皿を培養した。「０」時間に所望の濃度のペプチドを細胞に添加した。マイクロスケールを用いて顕微鏡で細胞移動を読出し、走化性指標である促進移動／ランダム移動として表した。
【表１０】
*δ＜０．０５で、制御に著しい相違
** 使用したペプチドは、
１．β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
２．アセチル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
３．β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
４．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン−アミド
５．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）
６．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトアミン
【００７０】
ヒト白血球食細胞活動への本発明のペプチドの影響に関する検証
１０％致死子牛血清で満たしたイーグル培養地に１ｍｌ当たり２×１０６細胞の濃度でシリコン処理した管に、フィコル−パック(Ficoll-Pack)分離によりドナーの血液から得たヒト好中球白血球を移した。ヒト(huan)の血清を用いてオプソニンを作用させた酵母セルを食細胞活動の対象物として使用した。管内に酵母細胞を添加し（１好中球当たり１０酵母細胞）、４０分間ＣＯ2培養器で細胞懸濁を培養した。この細胞を遠心分離法を用いて洗浄した後、ガラススライドに細胞塗抹を調製して、ギムザ染色により染色した。食細胞を顕微鏡下で算出した。
【表１１】
* Ｐ＜０．０５で、制御に著しい相違
** 使用したペプチドは、
１．β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
２．アセチル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
３．β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
４．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン−アミド
５．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）
６．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトアミン
【００７１】
生体内でのラットの胸腺細胞増殖への本発明のペプチドの影響
１％熱不活性致死牛血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、８０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５μｇ／ｍｌポリミキシンＢおよび０．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡで満たしたＲＰＭＩ−１６４０培地において底が平坦の９６ウェル培養板のＣＯ2培養器で、７２時間、１ｍｌ当たり５×１０6の近交ホワイトラットの３つの培養組織を培養した。培養期間の終了前の１６時間、３Ｈ−チミジンで細胞をパルスラベルした。チテルテック(Titertek)細胞ハーベスタを用いてガラスファイバフィルタ上で細胞を採取し、β液体シンチレーションカウンタで算出した。増殖率を１分当たりの数として表す。
【表１２】
* Ｐ＜０．０５で、制御に著しい相違
** 使用したペプチドは、
１．β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
２．アセチル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
３．β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
４．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン−アミド
５．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）
【００７２】
結論として、本発明のペプチドは、免疫促進特性を有するもので、脾リンパ球によるＩＬ−２生成を促進し、前駆体Ｔリンパ球の成熟を誘導し、Ｔ細胞の増殖を促進することが可能なものである。特に、好適な本発明のペプチドであるγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（ＳＣＶ−０７）は、ヒト好中球白血球機能活動、特に食細胞活動および酸素ラジカル生成を促進させることで、免疫機能を高めることが示されている。本発明のペプチド、特にＳＣＶ−０７は、Ｔリンパ球とＴヘルパーリンパ球数の総数と周辺の血液のＣＤ４／ＣＤ８の比率を増大させることが示されている。最後に、本発明のペプチド、特にＳＣＶ−０７はまた、ヒト好中球白血球移動と殺菌活動を促進させることが分かっている。
【００７３】
本発明を好適な特定の実施形態とともに上述したが、上記記載および例は説明を目的としたものであって、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲により規定されるものであることを理解されたい。
（技術分野）
本発明は、一般に、免疫促進化合物に関し、さらに詳しく言えば、体内のある種類の白血球の成熟および分化を促進させるγ−Ｌ−グルタミル、γ−Ｄ−グルタミル、β−Ｌ−アスパルチル、またはβ−Ｄ−アスパルチル部分のいずれかを含む免疫促進化合物に関する。このように、白血球細胞の分化および増殖を選択的に促進することによって、病気を引き起こす細菌に対する体の免疫力を高めることができ、さらに自己炎症状態を調節して改善する。
【０００２】
（関連出願）
本発明は、１９９６年４月１８日に出願された米国特許出願第０８／６３４，７１８号の一部継続出願であり、この出願は、共に１９９５年１１月２８日に出願されたロシア特許出願第９５１１９７０４号および第９５１２０２６６号の優先権を主張している。さらに、本出願は、１９９７年１２月２５日に出願されたロシア特許出願第９７１２０９４０号に関連し、その優先権を主張している。米国特許出願第０８／６３４，７１８は参照により本願明細書に引用されるものとする。
【０００３】
（背景技術）
免疫系統とは、「自己」として認識されない病原体や細胞に対して生体を保護するために適用された細胞網である。一度免疫系統が活性化されると、それは体内に「自己でない」実態を除去するようにデザインされたエフェクタ機能を高めるようにさまざまな細胞や分子の関与をうながす。リンパ球は免疫系統の細胞であり、異物の存在を明確に認識し選択的に除去することができる。インベーダとの反応で特別でないものとしてみなされる好中球などの免疫系統の他の細胞と対比すると、リンパ球の特徴は、特殊性、多様性、記憶および免疫反応に対する自己／非自己認識を与えることである。
【０００４】
リンパ球には２つの主要な群がある。すなわち、Ｂリンパ球とＴリンパ球である。Ｂリンパ球は、骨髄から発生しその中で成熟して、抗体分子の形成に寄与する。Ｔリンパ球も、骨髄から生じるが、これは胸腺内で成熟する。Ｔ細胞には２つの主要な副群がある。すなわち、Ｔヘルパー細胞とＴ細胞毒性細胞である。これら２つのタイプのＴ細胞は、２つの膜糖たんぱく質のうちのいずれか、すなわちＣＤ４またはＣＤ８が存在することによって区別できる。抗原複合体（特定のたんぱく質に連結した異物分子）によって活性化される場合、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４を表す）は、サイトカインとして総称して公知のさまざまな成長因子を分泌することによって応答する。これらのサイトカインは、Ｔ細胞毒性細胞を含む免疫系統の他の細胞を活性化させる信号である。活性化される場合、Ｔ細胞毒性細胞（ＣＤ８を表す）は、体内をモニタし、体内から病原細胞、異物細胞、ウィルスに感染した細胞、腫瘍細胞を除去する。
【０００５】
Ｔリンパ球の通常の発生、成熟および分化は、胸腺細胞により分泌されたペプチドホルモンにより調整される。このようなホルモンの１つに、４９−アミノ酸残基ペプチドのチモポイエチンがある。チモポイエチンの残基３２−３６であるＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒは、チモポイエチンの生物活性を保持し、チモペンチン(thymopentin) と呼ばれる免疫調節薬の基本となるものである。チモペンチンを治療時に投与する使用目的には、慢性関節リウマチ、皮膚病の状態、バクテリア、ウィルス、菌による感染、手術や癌治療による免疫低下の反転、Ｂ型肝炎ウィルスのワクチン接種に対する反応の強化、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が含まれており、Ｔヘルパー（ＣＤ４）細胞はウィルスにより特に攻撃される状態にある（クリスチャン, ジェイ. エス.(Christian, J.S.)の「チモペンチンの薬理学、臨床投与および毒性に関する報告書(A review of the Pharmacology, Clinical Applications, and Toxicology of Thymopentin)」、トランスジェニカ(Transgenica)、ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオテクノロジー(The Journal of Clinical Biotechnology) 、１、２３〜３４頁、１９９４年）。
【０００６】
チモペンチンと同様の特性をもつ第２の化合物は、ジペプチドの、チモゲン(thymogen)と呼ばれるＧｌｕ−Ｔｒｐである。連鎖−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−も、チモポイエチンの合成の前駆体である分子に発生するが、−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−は、４９−アミノ酸ホルモンの一部ではなく、チモポイエチンの生物活性に寄与するものとして見なされるジペプチドでもない。チモゲンは、ロシアで発見され、主に、疫病の予防や感染治療に使用された。チモゲンは、チェルノブイリ原発事故により放射能に偶発的に被爆したことが原因でリンパ球がダメージを受けた後の免疫機能を増大させるために使用された。（カビンソン等(Khavinson et al.)、国際特許公開第ＷＯ９２／１７１９１号公報および国際特許公開第ＷＯ９３／０８８１５号公報、「薬学ジペプチド組成およびその使用方法(Pharmaceutical Dipeptide Compositions and Methods of Use Thereof)」。）
【０００７】
γ−Ｌ−グルタミル誘導ペプチドは、体内に自然に発生し、最も公知の例は、トリペプチドグルタチオンである。合成γ−Ｌ−グルタミル分子も候補薬として使用されてきた。γ−Ｌ−グルタミル部分は分子の活性部分のキャリヤとして使用されるため、これらの候補薬は、「プロドラッグ」と呼ばれる。例えば、γ−Ｌ−グルタミニル−４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゼンは、人体およびマウスの黒色腫の細胞株において抗癌作用を発揮する。この化合物の抗癌作用は、癌細胞付近で４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゼンの酵素放出によるものであると考えられる（プレジオソ等(Prezioso et al.) 、「γ- グルタミルトランスペプチダーゼの発現は抗癌プロドラッグであるγ−グルタミニル−４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゼンの成長抑制作用を調整する (γ-Glutamyltranspeptidase Expression Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodrug γ-glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene)」、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(International Journal of Cancer) 、５６、８７４頁〜８７９頁、１９９４年）。また、γ−Ｌ−グルタミル−ドーパミンおよびγ−Ｌ−グルタミル−５−ヒドロキシ−トリプトファンは、ドーパミンと５−ヒドロキシ−トリプトファンを脳神経に運び供給することがあるプロドラッグとして記載されている（リカムワ等(Likamwa et al.)、「γ−Ｌ−グルタミル−５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンの抗ナトリウム排泄増加作用は正常脳の５−ヒドロキシトロタミンの脱カルボキシル化に依存する(The Antinatriuretic Action of γ-L-glutamyl-5-hydroxy-L-tryptophan is Dependent on its Decarboxylation to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain)」、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジィ(British Journal of Clinical Pharmacology)、３８７：２６５〜２６９、１９９４年）。
【０００８】
発明者デイジン(Deigin)およびコロトコフ(Korotkov)による１９９６年１２月１９日に公開された国際特許公開第ＷＯ９６／４０７４０号公報には、式Ｘ−Ａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｙ（Ｉ）のペプチドが開示されており、ここで、Ａ＝Ｄ−ＧｌｕまたはＤ−イソグルタミン酸（Ｄ−ｉＧｌｕ）であり、Ｘ＝Ｈ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｎｖａ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、γ−アミノブチル酸またはε−アミノカプロン酸であり、Ｙ＝Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｎｖａ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、γ−アミノブチル酸、ε−アミノカプロン酸、ＯＨ、または１〜３Ｃ置換アミノである。化合物（Ｉ）は、免疫抑制作用（例えば、脾細胞の増殖抑制）をもち、人体、獣医学、実験的生化学に有益であるとされている。
【０００９】
（発明の開示）
「最良の免疫調節剤(Best immunomodulator)」の新造語として頭文字をとった「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連し、免疫調節特性を有する新しい種類の化合物の実施形態に与えられた名前である。本発明の一部継続出願である米国親特許出願第０８／６３４，７１８号には、新しい種類の化合物の数種の化合物が記載され、請求され、さらにこれらの化合物を用いて免疫調節治療方法が請求されている。ベスチム化合物自体は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの化学構造を有する。
【００１０】
新しい種類の合成免疫調整分子が式１で示される。
【式１】
【００１１】
実施形態のベスチムは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのさまざまな実験的アッセイシステムで検査された結果、有益な免疫促進作用をもつ。この生物学上の作用のメカニズムは、骨髄Ｔリンパ球前駆体の分化、リンパ球増殖の促進、およびインターロイキン−２を含むさまざまなサイトカインの発生の誘導に関する。ベスチムの薬理効果の最終結果によると、Ｔヘルパーリンパ球、すなわちＣＤ４マーカを含む細胞の数が選択的に増加する。
【００１２】
ベスチムの前臨床実験では、サブナノモル濃度で免疫促進作用が現れている。生体内では、体重１ｋｇ当たり１０ｎｇ〜１μｇの投与量で作用し、免疫促進剤の投与よりも５００から１００万倍高い投与量で毒性が見られない。動物実験では、経口投与後に活性である。
【００１３】
人体での予備実験では、ベスチムは、リンパ球機能の実験変化により測定される場合、免疫機能が増加した。これらの実験変化は、臨床結果に有益な陽性の指示薬(positive indicator)により達成された。
【００１４】
新しい類似体のうちの１つであるγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンは、ベスチムのものと、さらに広範囲の投与量で観察されるＩＬ−２誘導と比較すると、生物学活性がさらに高くなることが分かる。
【００１５】
「免疫調節薬」として指定された薬は、良好に規定された一組の作用がある。ベスチムとその類似体は、伝染病の免疫治療や、放射線への被爆または癌の化学治療や手術などのその他のストレス因子により、予め低下していた免疫反応の回復の薬として効果的である。
【００１６】
したがって、免疫調整作用を有する式１の化合物は、自然または薬で誘導された状態により引き起こされた免疫不全を緩和して患者に有益に投与され、微生物からの危険な感染を改善し減少させるように患者に投与され、特に、それぞれ感染しやすい傾向にある入院中の患者や、手術を受けている患者や、癌の化学治療を受けている患者に対しては被害を受けている場所を処置するように投与される。さらに、式１の免疫調節化合物は、ウィルス除去を容易にし、病原微生物の免疫監視を高め、さらには例えば、疱疹ウィルス、水痘ウィルス、肝炎ウィルスおよびＨＩＶなどの病気を患っているかまたはその保有者である患者の病気の再発を減少させるために、症候性または無症候性ウィルスに感染している患者に投与され、例えば、癌などの状態で、自然細胞が体に「異物」として認識されるような自然細胞を変更する病気の患者に投与され、さらに免疫系統を均衡に調整するために、慢性関節リウマチ、多発硬化症、強皮症などの自己炎症（自己免疫）の病気の患者に投与される。
【００１７】
病気の危険性が高いかまたは病気の兆候が現れている患者に用いる上記の使用法以外に、式１の免疫調節化合物は、例えば、インフルエンザのワクチン接種と組み合わせて伝染病の疑いのある健康な患者に投与したり、例えば、肝炎用のワクチン接種、この専門用語はワクチン接種の「アジュバント」として本発明で使用されるワクチン接種と組み合わせて病原体への免疫反応を高めるように投与してもよい。
【００１８】
これらの使用は、体重１ｋｇ当たり約１ｎｇ〜約１，０００μｇの範囲の服用量で投与され、１回の投与または１ヵ月以上の期間にわたって断続的に与えられ、さらに投与経路は、非経口注射、経口または鼻吸入、または経口摂取によるものが好ましい。
【００１９】
（好適な実施形態の詳細な説明）
広義には、本発明の化合物は、Ｔヘルパー細胞の数をホストの最適なレベルに調節する特有の化学物質である。例えば、Ｔヘルパー細胞数を増加させるために免疫系統を調節すると、バクテリアやウィルスからの感染を処理する生体の能力が増大する。また、Ｔヘルパー細胞の数を増大するように調節することによって、ホストに対して異物となる癌細胞に対して体が闘いやすくなる。この代わりに、これらの物質によって、内因性組織に対してホストのＴ細胞による過度の攻撃が生じる自己認識処理の混乱から生じた病気に対してホストが調節を行うこともできる。このような場合、本発明の化合物は、慢性関節リウマチおよび多発硬化症などの自発的な炎症（自己免疫）の病気の兆候や症状が改善されるように、Ｔ細胞数を調整する。
【００２０】
「最良の免疫調節剤(Best immunomodulator)」の新造語として頭文字をとった「ベスチム(Bestim)」は、本発明が関連するもので、免疫調節特性を有する新しい種類の化合物の実施形態に与えられた名前である。免疫促進投与量よりも５００または５００，０００倍を超える服用量で毒性は観察されない。ベスチム化合物自体は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの化学構造を有する。新しい種類の合成免疫調節分子は、式１に示すように、アミノ末端にγ−Ｌ−グルタミル部分、γ−Ｄ−グルタミル−部分、β−Ｌ−アスパルチル部分、またはβ−Ｄ−アスパルチル部分を有する。
【式１】
【００２１】
新しい種類の一部として（ベスチム、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン以外にも）、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎin−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン、およびβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンなどの化合物が含まれる。
【００２２】
式１のペプチドは、無毒の有機または無機酸を有する製薬的に許容可能な塩を形成することがある。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、リン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの塩化水素、臭化水素、硫酸およびリン酸および酸金属塩を含む。適切な塩を形成する例示的な有機酸は、モノ−、ジ−、トリカルボン酸を含む。このような酸の例は、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸(hydroxygenzoic)、酢酸フェニル、桂皮酸、サリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、およびメタンスルホン酸や２−ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸である。カルボキシル基の塩は、任意の適切な無機または有機塩基で形成された無毒のカルボン酸塩を含む。例示的に、これらの塩は、例えば、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムを含むＩＩＩＡ族の軽金属、および例えば、トリエチルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、１−エチレンアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジル−エチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン：Ｎ−（低級）アルキル−ピペリジン、他の適切なアミンを含むトリアルキルアミンなどの第１、第２、第３アミンを含む。
【００２３】
式１の本発明の化合物にγ−Ｌ−グルタミル部分またはβ−アスパルチル部分が存在すると、２つの重要な特性が与えられるとされている。この２つの特性とは、アミノペプチダーゼによる分解に対する抵抗力と、潜在能力の増大である。しかしながら、本発明の類似体の１つであるγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンは、ベスチムよりもさらに高い生物学活性と、より広範囲の服用量の範囲を有することが分かっている。本発明のこの特定の好適な実施形態は、「ＳＣＶ−０７」と称することもある。
【００２４】
毒性
良好な実験室プラクティスの条件に応じて、ベスチムを用いて急性毒性および亜急性毒性の動物実験を行った。すべての実験において、アンプルに無菌凍結乾燥粉末として調整したベスチムを、無菌０．９％ＮａＣｌ溶液で溶解し、筋肉内注射を行った。
【００２５】
急性毒性：齧歯動物（マウスおよびラット）およびイヌをオスとメスの数が同一になるグループに無作為抽出した。ベスチムを１回投与（筋肉内）させた後、１４日間毎日動物を検査した。
マウス − ５，０００．０ ｍｇ／ｋｇ
ラット − ５００．０ ｍｇ／ｋｇ
イヌ − ５００．０ ｍｇ／ｋｇ
【００２６】
体重、全体的な外観、行動を毎日評価し、２週間の最終日に、すべての動物の内蔵（心臓、肺、胸膜腔および腹膜腔、筋肉、胃、小腸および大腸、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、甲状腺、脳、皮膚および睾丸／卵巣）の肉眼検査および組織病理検査を行った。
【００２７】
検査した動物の中で死亡したものは観察されず、全体的な外観、行動、体重、血液内指標、生化学指標、生理的指標、肉眼検査および組織病理検査の記録結果はすべて正常値内のものであった。
【００２８】
亜急性毒性実験：もう１つの実験である第２の実験では、より長い間ベスチムを投与した。
ラット：３カ月および６カ月毎日、１ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与
イヌ：１カ月および３カ月毎日、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与
【００２９】
ラットにベスチムを繰り返し注射したが、死亡した動物はおらず、行動または血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。肉眼レベルと組織病理レベルでのすべての組織の形態上の外観は正常であった。ラットへの両投与ともに実験動物の体重が僅かに増えた。
【００３０】
イヌにベスチムを繰り返し注射したが、死亡した動物はおらず、行動、体重、血液内、生化学、生理的パラメータに変化は見られなかった。検査したすべての組織の肉眼検査および組織病理検査に著しい変化は見られなかった。注射部位での局所的炎症反応はなかった。
【００３１】
結論として、これらの毒性実験によれば、ベスチムは、齧歯動物と犬では急性または亜急性毒性を受けないことが分かった。治療トライアル用の予測投与量に対して検査で用いた投与量は、１回の投与の場合では約５，０００，０００倍であり、繰り返し投与した場合では約１００倍のものであった。
【００３２】
また、生体内での４つのペプチド（これらのうち３つは本発明のもの）の毒性をマウスの胸腺細胞を用いて検査した。胸腺細胞を２度洗浄し、２％致死子牛血清を含有するＲＰＭＩ１６４０媒体内に再懸濁させた。細胞懸濁液を９６個のウェルがある板（１ウェル当たり１×１０6個の細胞）内に配置した。次いで、ペプチド（または制御ウェルの担体）を所要の濃度でウェル内に添加した。ＣＯ2の培養器内で３７℃、４時間、ペプチドまたは担体で細胞を培養した。培養後、エオシンＢ(Eosin B) を用いて細胞の生存能力を顕微鏡で算出した。その結果を表Ａに示す。
【表Ａ】
【００３３】
しかしながら、比較上のペプチドであるγ−Ｄ−グルタミル−Ｄ−トリプトファンは、細胞の生存能力を減少させ（表Ａ）、したがって、０．１ｍｇ／ｍｌの投与量で細胞に有毒なものとなることが分かった。
【００３４】
ゴールドスタイン(Goldstein) およびオウディヤ(Audhya)（実験および臨床医学におけるチモペンチンの「チモポイエチンからチモペンチンまで：実験的研究(Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies) 、Surv. Immunol. Res. 、４、１〜１０頁、１９８５年）は、免疫調節薬が免疫不均衡が低応答性または高応答性の状態にあろうが、免疫不均衡を回復するように作用する。これらの薬の双方向の作用は、不均衡の状態を均衡した目標値に回復する生体調整の性質により生じる。低応答性の場合、Ｔリンパ球を調整するホルモン投与は、自己防衛システムの機能を最適化しさらに調整するため、自己ではない有機体がさらに除去しやすくなるように作用する。高応答性の場合、免疫調節薬を投与すると、有益な「自己」の存在を間違って攻撃することが減少する自己免疫処理を弱めるようである。低応答性の免疫状態と高応答性の免疫状態におけるベスチムの臨床投与のカテゴリーに関して記載し、例示して述べる。
【００３５】
低応答性状態または免疫不全状態
免疫不全状態は、一般的に３つの因果関係のカテゴリーに別れる。１つ目は、病気の過程の結果として生じる免疫抑制である。２つ目は、他の病気の治療により生じた免疫不全、いわゆる医原性免疫不全である。３つ目は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）によりＴリンパ球が直接攻撃されることから生じる免疫不全である。
【００３６】
免疫不全になる病状の過程で共通するものは、栄養不良、新生物増殖、老化および感染である。細胞性および体液性免疫応答が弱まることで、さまざまな細菌による感染媒体に感染しやすくなるため、栄養不良の人、広範囲に癌が進行した患者や病気で衰弱した人は、病気になりやすく、さらに死に至る確率も高くなる。免疫応答の不全が広がった状態を免疫性欠如と呼ぶ。さまざまなタイプの感染、特にウィルス感染が免疫抑制となる。免疫系統のＴヘルパーリンパ球成分をより強力なものにできるベスチムなどの薬は、患者の感染への抵抗力を高めるための重要な治療薬となる。例えば、ベスチムまたはその類似体は、
−− 共通した深刻な臨床問題である院内感染（病院で誘発される感染）の危険性を下げるために病院への許可前または許可直後に、患者、特に年配の患者に投与され、
−− このような患者は特に感染しやすい傾向にあるため、犠牲になっている個所を処置するように投与され、
−− 例えば、インフルエンザ接種や肝炎接種と組み合わせて流行性の感染の疑いがある患者に対して、病原体への免疫応答を活性化させるように投与され、
−− 例えば、疱疹ウィルス、バクテリアウィルス、肝炎ウィルスやＨＩＶの保有者である患者に対して、病原有機体の免疫監視を高め、病気の再発の可能性を下げる目的で、無症候性のウィルスが感染した患者に投与される。
【００３７】
医原性の免疫抑制のほとんどは、リンパ球を殺すかまたは機能的に不活性にする薬治療が原因である。さまざまな化学治療薬が癌患者に投与され、これらの薬は、通常、成熟リンパ球および成長中のリンパ球の両方に対して細胞毒であり、さらには顆粒球前駆体および単球前駆体に対しても細胞毒である。したがって、癌の化学治療は、ほとんどの場合、免疫抑制期間および感染の危険性が高い期間に行われる。癌の放射線治療も同じ危険性を伴う。薬物治療（顆粒球群促進因子）は、癌の化学治療後に生じる感染と戦わせるように血液中の好中球を増やすために用いられるが、リンパ球の機能を回復させるための薬物治療は現在のところ用いられていない。動脈瘤の治療やバイパス形成手術などの大手術では、人体の免疫機能も下がる。大手術により起こる血中リンパ球の低下の理由は明らかではないが、感染の可能性を下げながら、このような患者のリンパ球機能を高める薬剤には治療薬剤として重要なものである。
【００３８】
述べておく必要がある後天性免疫抑制の最終的なタイプは、脾臓がない場合に生じるもので、これは、外傷後またはある種の血液病の治療用にこの臓器を手術で除去したり、または鎌状細胞病で梗塞が形成された結果引き起こされる。脾臓がない患者は、ある細菌、特に肺炎連鎖球菌などの被包バクテリアの感染を受けやすい。脾臓は、このような細菌に対する保護用体液性免疫応答を誘導するために必要であることは明らかである。ベスチムは、微生物による汚染に対して、脾臓がない患者または胸腺がない患者の抵抗力を高める働きをする。
【００３９】
本発明のペプチドに関するデータと、さらにいくつかの合成方法を、以下の例を用いて説明するが、この例は説明を目的とするもので、本発明を限定するものではない。
【００４０】
例１
本発明の化合物の調製とそれらの製薬組成
材料と装置
試薬 Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−グルタミン酸α−ベンジルエステルとＮ−ベンジルオキシカルボン−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステルを、ムーア等(Moor et al.)のJ. Chem. Soc.、２３４９（１９６６）に記載されるように調製し、さらにＬ−トリプトファンベンジルエステルｐ−トルエンスルホン酸を、アライ等(Arai et al.)、J. Org. Chem.、４８、１２１（１９８３）に記載されるように調製した。Ｄ−トリプトファン、Ｎ−メチルモルホリン、クロロぎ酸イソブチル、パラジウム−炭素触媒（１０％）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリルをフルカ社(Fluka)から購入し、トリフルオロ酢酸をメルック社(Merck)から購入した。
【００４１】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） 以下の溶媒系（体積比）を用いて、予め被覆させた板のＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ254（メルック社）上で上昇ＴＬＣを実行した。
Ａ．クロロホルム／メタノール／酢酸 ９０：８：２
Ｂ．２−プロパノール／２５％ ＮＨ4ＯＨ／水 ５０：５：１５
Ｃ．ブタノール／酢酸／水 ３：１：１
ＵＶ光、ニンヒドリン、Ｊ2でペプチドを配置した。
【００４２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） すべてのＨＰＬＣ分離に対して、同じ溶媒系を用いた。すなわち、溶媒Ａ−０．１％トリフルオロ酢酸水と、溶媒Ｂ−アセトニトリルである。
【００４３】
２つのポンプ（モデル３０２）、自動サンプラ（モデル４０２）、分光光度計（モデル１１６）、データマスタ(Data Master)（モデル６２１）、および分析カラムゾルバックス(Zorbax)ＯＤＳ ４．６×１５０ｍｍ、５μからなるギルソン(Gilson)クロマトグラフ上で分析作業を実行した。流量は１ｍｌ／ｍｉｎであった。２３０ｎｍでペプチドを制御した。溶離液は、２０分間、１０〜４０％Ｂまたは１０〜９０％の線形の勾配であった。
【００４４】
２つのポンプ（モデル３０２）、動力計ミキサ（モデル８１１）、フラクションコレクタ（モデル２０２）、分光光度計（ホロクロム(Holochrome)）、および分取カラムゾルバックス ＯＤＳ ２１．２×２５０ｍｍ、８μからなるギルソンクロマトグラフ上で予備浄化を実行した。流量は１０ｍｌ／ｍｉｎであった。２３０ｎｍでペプチドを制御した。溶離液は、８０分間、０〜４０％Ｂの線形の勾配であった。
【００４５】
核磁気共鳴 プロトンに対して３００ＭＨｚで直角検出するフーリエ変換モードで、アスペクト(Aspect)２０００コンピュータを備えたブルッカー(Brucker)ＣＰＸ−３００を用いて、すべてのスペクトルを記録した。０．５ｍｌのＣＤ3ＯＤで５０ｍｇのペプチドを溶解し、ここで 1Ｈ残留信号を３．３５ｐｐｍで参照としてとった。特別な記載がなければ、通常の獲得パラメータは、温度は周囲温度で、スペクトル幅は４，５００Ｈｚで、パルス幅は１μｓ（６0）で、時間ドメインにおいて８１９２データ点であった。１６３８４点アドレスで処理を実行した。緩和遅延は２ｓであった。
【００４６】
例１Ａ
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンジベンジルエステル
無水テトラヒドロフランにおいてＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−グルタミン酸α−ベンジルエステル（０．７４ｇ、２ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（０．２２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）の溶液を−１５℃に冷却する。クロロぎ酸イソブチル（０．２８ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を添加して、この混合物を混合無水化合物を形成するために３分間、−１０℃に置く。無水テトラヒドロフランにおいてＬ−トリプトファンベンジアルエステルｐ−トルエンスルホン酸（０．９３ｇ、２ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（０．２２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）の溶液を−５℃に冷却し、添加して、約５℃の冷蔵庫に反応混合物を置く。次の日、溶液を塩からフィルタがけし、無水テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）で洗浄し、真空内で蒸発させる。酢酸エチル（５０ｍｌ）で残留物を溶解し、同量の水、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4溶液、水、５％ＮａＨＣＯ３溶液、さらに再度水で洗浄する。これを無水Ｎａ2ＳＯ4 上で乾燥させ、乾燥剤からフィルタがけし、約１０ｍｌまで真空内で濃縮する。ヘキサン（５０ｍｌ）を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は８２０ｍｇ（６２％）である。Ｒｆ（Ａ）は０．７５である。
【００４７】
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
メタノール（３０ｍｌ）中におけるＮ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンジベンジルエステル（０．６ｇ、０．９ｍｍｏｌ）の溶液を、５時間Ｐｄ／Ｃ（１０％、２００ｍｇ）上で水素化させる。触媒を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる。生成量は２６０ｍｇである。
【００４８】
分取ＨＰＬＣを用いて、このようにして得たペプチドを浄化し、凍結乾燥させる。生成量は１９０ｍｇである。ＲＦ（Ｂ）は０．５で、ＲＦ（Ｃ）は０．４５である。前述したように、このような特定の好適な実施形態は、「ＳＣＶ−０７」と呼ばれることがある。
【表１】
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの
プロトン化学シフト（ｐｐｍ）
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの
13Ｃ化学シフト（ｐｐｍ）
例１Ｂ
γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファンα−ベンジルエステル
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９６ｍｌ）においてＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステル（０．９９ｇ、２．６ｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液を氷水浴で冷却し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）においてジシクロヘキシルカルボジイミド（０．５６ｇ、２．７ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌して添加する。０℃で１時間この混合物を攪拌して、室温で一晩置く。分離したＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、Ｄ−トリプトファン（０．６４ｇ、３．１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．４６ｍｌ、３．３ｍｍｏｌ）を濾過水に添加する。この混合物を室温で１６時間攪拌して、水（５０ｍｌ）で希釈する。分離した油を酢酸エチル（３×２０ｍｌ）で抽出して、組み合わせた有機層を２ＮＨ2ＳＯ4溶液（２×２０ｍｌ）と水（４×３０ｍｌ）で洗浄して、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて、乾燥剤からフィルタがけし、約１０ｍｌまで真空内で濃縮させる。ヘキサン（３０ｍｌ）を用いた希釈で生成物を分離する。生成量は１．２ｇ（８１％）である。Ｒｆ（Ａ）は０．７である。
【００５０】
γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン
メタノール（３０ｍｌ）中においてＮ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファンαベンジルエステル（０．６ｇ、０．９ｍｍｏｌ）の溶液を、２時間Ｐｄ／Ｃ（１０％、２００ｍｇ）上で水素化させる（ＴＬＣ制御）。触媒を炭を通して濾過して除去し、濾過水を乾燥するまで蒸発させる。生成量は２８５ｍｇである。
【００５１】
分取ＨＰＬＣを用いて、このようにして得たペプチドを浄化し、凍結乾燥させる。生成量は１８０ｍｇである。Ｒｆ（Ｂ）は０．５で、Ｒｆ（Ｃ）は０．４５である。
γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファンは、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンと同じ 1Ｈ ＮＭＲおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルを有する。
【００５２】
例１Ｃ
β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンの固相合成
固体担体として１％ジビニルベンゼン橋かけポリスチレンを用いて、所要の分子を合成した。０．１ｇのＮａ−ｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−ニンホルミル−Ｌ−トリプトファン−メリフィールド樹脂（Ｔｒｐ０．７ｍｍｏｌ／ｇ樹脂の含量）を反応器に配置する。自動合成プログラムは以下のとおりである。
【表３】
自動ペプチド合成用スケジュール
ＤＭＡＡ：ジメチルアセトアミド
* 氷上で３０分間、ＤＭＡＡで３つの等価のＢｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ−α−ＯＢｚｌ、ＨＯＢｔおよびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＩ）から調製された１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の活性化エステルでカップリングが実行された。
** カイザー(Kaiser)のニンヒドリン検査によりカップリング完了が検証された（カイザー等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４：５９５、１９７０）。カップリングが完全に終了していない場合は、もう一度繰返した。
【００５３】
ペプチドを脱保護し、６０分間、０℃で１０％アニソールと１０％ｍ−クレゾールを含有する液体フッ化水素（ＨＦ）でポリマーから開裂した。０℃の真空内でＨＦを除去し、ペプチドを３０％水性酢酸で抽出し、エチルエーテルで洗浄し、凍結乾燥させて、０．２Ｎ水酸化ナトリウムで脱ホルミル化した後、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により純化した。
【００５４】
第５段階のみが異なる異なるＢｏｃ−誘導体を用いて、上述した表３のスケジュールのものと同じ方法により、すべてのベスチム類似体を合成させてもよい。
【００５５】
合成の検証
例えば、ベスチムは以下により特徴付けられる。
１． 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、クロマトグラフギルソン（フランス）、溶離液０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配１０〜４０％、１４分ラン、カラムデルタ−パック(Delta-Pack)Ｃ−１８、３００Å、５μｍ、３．９×１５０ＭＭを用いた。生成物の保持時間は８．１ｍｉｎであり、ＨＰＬＣピーク下での平均領域として測定された純度は９９．７％であった。
２． アミノ酸分析：ＬＫＢアミノ酸アナライザアルファプラス(Alpha Plus)４１５１を用いて、２４時間、１１５℃の真空内で０．２％トリプタミンを含有する４Ｎメタンスルホン酸に生成物を加水分解した。グルタミン酸のペプチド含有量は１．０で、トリプトファンは０．０４であり、所望の残留物の存在を確認した。
３． 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：システム１ − ｎ−ブタノール：酢酸エチル：酢酸：水＝１：１：１：１、Ｒｆ＝０．７２、システム２ − ｓｅｃ−ブタノール：酢酸：トルエン：水＝６：１：２：１、Ｒｆ＝０．４
４． 核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）：アスペクト(Aspect)２００コンピュータを備えたＮＭＲ分光計ブルーカー(Bruker) ＧＸＰ−３００。、ペプチド（０．００１Ｍ／ｌ溶液）を炭素ＮＭＲスペクトルで検出した：Ｇｌｕに対して、３０．０；３１．０；５７．２；１７６．６；１７８．３ｐｐｍ、Ｔｒｐに対して、３５．７；５８．３；１１３．１；１１６．６；１２３．４；１２４．３；１２６．６；１２９．０；１３１．０；１４０．３；１７９．４ｐｐｍであった。
５． 高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）、分子イオン：計算、３３４．１３ Ｄａ；３３３．７３獲得。
【００５６】
製薬上認可される塩形式の本発明の化合物の調製を、以下の例１Ｄと、さらに例１Ｅに記載するような錠剤の製剤により説明する。
【００５７】
例１Ｄ
Ｈ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐナトリウム塩の調製
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ−α−ベンジルエステル（５ｇ、０．０８７Ｍ）をメタノール（４０ｍｌ）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（０．７３ｇ、０．０８７Ｍ）を添加した。空気を低速の流れの窒素と取り替え、１０％パラジウム炭触媒（３０ｍｌ水に２．５ｇ）を添加した。さらにもう一度、低速の流れの窒素をフラスコを通して流し、低速の流れの水素の導入を開始した。強力な攪拌により触媒の懸濁を保持した。４時間、濾過により触媒を除去して、メタノール（１０ｍｌ）により洗浄した。濾過水を真空内で蒸発させ、残留物をアセトニトリルで粉末にした。固体の生成物をフィルタ上で収集し、アセトニトリルで洗浄して、真空内で乾燥させた。
生成量：２．１４ｇ（７０％）
【００５８】
例１Ｅ
錠剤の製剤
例１Ａの本発明のペプチド（γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン）を、９８．９％グリシン、１％ステアリン酸マグネシウムおよび０．１％の本発明のペプチドか、または９４．９％グリシン、５％デンプンおよび０．１％の本発明のペプチドのいずれかを用いて錠剤に製剤した。各１００ｍＧの錠剤は、本発明の類似体の１００μｇを含有した。
【００５９】
例２
生体内でのベスチムおよびベスチム類似体の検証
インターロイキン２（ＩＬ−２）生成物への影響
標本： マウス（ＣＢＡストレイン）
分析評価： ペプチドγ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（ベスチム）およびγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（ベスチム類似体）を、５連続日、１日につき表に示す異なる服用量で水溶液の形でマウスに経口的に投与した。５匹の動物を用いて各ペプチドを服用させた。４８時間後、脾臓を除去し、９６ウェルの底が平坦な培養板に１０％致死子牛血清で満たしたＲＰＭＩ−１６４０培地において、ＩＬ−２生成物誘導酵素ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）がある生体外で、さらに２４時間脾臓細胞を培養した。マウスのＩＬ−２−依存細胞株ＣＴＬＬ−２（ギリス等(Gillis et al.)、１９７８）において、上澄みにあるＩＬ−２レベルを測定した。
【表４】
マウスの脾臓細胞によるＩＬ−２生成物への
ベスチムおよびその類似体の効果
【００６０】
結論： ペプチドγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（本発明のベスチム類似体）は、ベスチムよりも高い生物学的活性を呈した。ＩＬ−２の導入をより広範囲の服用量で観察し、服用量が大きい場合、この類似体はＩＬ−２導入を低下させなかった。
【００６１】
例３
マウスの骨髄Ｔ細胞前駆体によるＴｈｙ−１抗原発現への影響
実験記録： 骨髄細胞をＣＢＡマウスの大腿骨から獲得し、３７℃で１時間、イーグル培地でマイクロタイトレーション（テラサキ）板において生体内でペプチドで培養した。反Ｔｈｙ−１抗体を用いて補体依存性の細胞毒分析評価により、 Ｔｈｙ−１抗原発現を決定した。
【表５Ａ】
本発明のペプチド類似体を含むものに培養させた
マウスの骨髄における
Ｔｈｙ−１抗原発現細胞数の変化
【００６２】
結論： 本発明のペプチドγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐは、ベスチムおよび別の本発明の類似体であるγ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｔｒｐの作用と比較すると高い作用を呈した。
【表５Ｂ】
本発明のペプチドを含むものに培養させた
マウスの骨髄における
Ｔｈｙ−１抗原発現細胞数の変化
** 使用したペプチドは、
１．β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
２．アセチル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
３．β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
４．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン−アミド
５．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）
【００６３】
例４
生体内ベスチム類似体の生物学的作用
ペプチド： 凍結乾燥形でベスチムおよび本発明のいくつかの類似体を調製した。実験の直前に異なる物質濃度を有する溶液を調製するためにすべてのペプチドを水に可溶性にした。
【００６４】
培養でのＩＬ−２生成物への影響
実験記録 ＣＢＡマウスから脾臓を除去し、脾臓細胞を分離し、９６ウェルの底が平坦な培養板に１０％致死子牛血清で満たしたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＩＬ−２生成物を５μｇ／ｍｌＣｏｎ Ａで２４時間の培養で生成した。所要の濃度でペプチドを「０」時間で細胞培養に添加する。ＩＬ−２−依存ＣＴＬＬ−２細胞株（ギリス等、１９７８）において、培養上澄みにあるＩＬ−２レベルを求めた。
【表６】
ベスチム類似体を含む培養での
マウスの脾臓細胞による
Ｃｏｎ−Ａ誘導ＩＬ−２の変化
【００６５】
例５
経口投与後の患者の免疫系統の変化
例１Ｅに記載した２つの錠剤の製剤のうちいずれかの製剤を、手術後１ヶ月経過した２人の癌患者に投与した。
【００６６】
第１の事例研究
患者：「Ｅｇ」
診断：大腸癌
前治療：手術
ＳＣＶ−０７治療：５日経口錠剤投与（１日当たり０．１ｍｇ）
【表７】
第２の事例研究
患者：「Ａｒ」
診断：大腸癌
前治療：手術
ＳＣＶ−０７治療：５日経口錠剤投与（１日当たり０．１ｍｇ）
【表８】
自発ルミノール依存化学発光分析結果（ムトー等(Muto et al.)、１９８６）を用いて遊離酸素ラジカル生成レベルの変化により、ヒト好中球白血球への本発明のペプチドγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの影響を決定した。表に示した濃度で塩水に希釈したペプチドとともに１２５１照度計（ＬＫＢ）の作業キュベットにドナーの全血液の標本を挿入した。各キュベットにルミノールを添加し、１０分間キュベットを培養した。この後、３７℃で４０分間、照度計のウェルで培養し、続けて攪拌した。「ルミナ(Lumina)」コンピュータプログラムを用いて発生したスーパーオキシドラジカル量を計算し、４０分間光の総量として表した（ｍＶ／ｍｉｎ）。各試料を３通りに検証した。
【表９】
ヒト全血液細胞培養のルミノールを高めた
好中球化学発光へのペプチドの影響
【００６９】
ヒト白血球走化性への本発明のペプチドの影響に関する検証
ネルソン等(Nelson et al.)（１９７２）により記載されたアガロース移動技術を用いて、走化性分析評価を行った。１０％致死子牛血清で満たした１９９培養培地でアガロースを溶解して最終的な濃度を１％にした。この混合物を組織培養皿に移して、ゲル状にした。このゲルに、直径２ｍｍの一連のウェルを３ｍｍ間隔で切り分けた。１０μｌの好中球（１ｍｌ当たり２．５×１０６細胞）を中央のウェルに添加した。ランダム移動を測定するために他のウェルを培地の片側に満たし、促進された移動を測定するために１０−７Ｍで走化性ＦＭＬＰでこれらのウェルをもう一方の片側に満たした。ＣＯ2培養器で１２０分間皿を培養した。「０」時間に所望の濃度のペプチドを細胞に添加した。マイクロスケールを用いて顕微鏡で細胞移動を読出し、走化性指標である促進移動／ランダム移動として表した。
【表１０】
** 使用したペプチドは、
１．β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
２．アセチル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
３．β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
４．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン−アミド
５．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）
６．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトアミン
【００７０】
ヒト白血球食細胞活動への本発明のペプチドの影響に関する検証
１０％致死子牛血清で満たしたイーグル培養地に１ｍｌ当たり２×１０６細胞の濃度でシリコン処理した管に、フィコル−パック(Ficoll-Pack)分離によりドナーの血液から得たヒト好中球白血球を移した。ヒト(huan)の血清を用いてオプソニンを作用させた酵母セルを食細胞活動の対象物として使用した。管内に酵母細胞を添加し（１好中球当たり１０酵母細胞）、４０分間ＣＯ2培養器で細胞懸濁を培養した。この細胞を遠心分離法を用いて洗浄した後、ガラススライドに細胞塗抹を調製して、ギムザ染色により染色した。食細胞を顕微鏡下で算出した。
【表１１】
** 使用したペプチドは、
１．β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
２．アセチル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
３．β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
４．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン−アミド
５．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）
６．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトアミン
【００７１】
生体内でのラットの胸腺細胞増殖への本発明のペプチドの影響
１％熱不活性致死牛血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、８０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５μｇ／ｍｌポリミキシンＢおよび０．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡで満たしたＲＰＭＩ−１６４０培地において底が平坦の９６ウェル培養板のＣＯ2培養器で、７２時間、１ｍｌ当たり５×１０6の近交ホワイトラットの３つの培養組織を培養した。培養期間の終了前の１６時間、３Ｈ−チミジンで細胞をパルスラベルした。チテルテック(Titertek)細胞ハーベスタを用いてガラスファイバフィルタ上で細胞を採取し、β液体シンチレーションカウンタで算出した。増殖率を１分当たりの数として表す。
【表１２】
** 使用したペプチドは、
１．β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
２．アセチル−γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン
３．β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン
４．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン−アミド
５．γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）
【００７２】
結論として、本発明のペプチドは、免疫促進特性を有するもので、脾リンパ球によるＩＬ−２生成を促進し、前駆体Ｔリンパ球の成熟を誘導し、Ｔ細胞の増殖を促進することが可能なものである。特に、好適な本発明のペプチドであるγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（ＳＣＶ−０７）は、ヒト好中球白血球機能活動、特に食細胞活動および酸素ラジカル生成を促進させることで、免疫機能を高めることが示されている。本発明のペプチド、特にＳＣＶ−０７は、Ｔリンパ球とＴヘルパーリンパ球数の総数と周辺の血液のＣＤ４／ＣＤ８の比率を増大させることが示されている。最後に、本発明のペプチド、特にＳＣＶ−０７はまた、ヒト好中球白血球移動と殺菌活動を促進させることが分かっている。
【００７３】
本発明を好適な特定の実施形態とともに上述したが、上記記載および例は説明を目的としたものであって、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲により規定されるものであることを理解されたい。
Claims (19)
- 少なくとも２つのアミノ酸残基と式１
の構造を有する化合物であって、前記式中、
ｎは１または２であり、Ｒは水素、２〜１０炭素原子を有するアシル、または１〜６炭素を有するアルキルであり、ＸはＬ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンであり、式１中で星印をつけたα炭素は立体配置を有し、ｎが２のとき、Ｘの立体配置とは異なる構造を有する化合物。 - 請求項１記載の化合物において、
Ｘは、Ｌ−トリプトファンである化合物。 - 請求項１記載の化合物において、
Ｘは、Ｄ−トリプトファンである化合物。 - 請求項１〜３のいずれか記載の化合物において、
製薬上認可される塩形の化合物。 - 請求項１記載の化合物において、
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンである化合物。 - 請求項１記載の化合物において、
β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンである化合物。 - 請求項１記載の化合物において、
β−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンである化合物。 - 請求項１〜７のいずれか記載の化合物を含み、製薬上認可される担体を有した混合物からなる免疫調節剤。
- 製薬上認可される形で式１
の構造を有する化合物を、体重１ｋｇ当たり１ｎｇ〜１，０００μｇの範囲の服用量で患者に投与する免疫調節剤であって、前記式中、
ｎは１または２であり、Ｒは水素、２〜１０炭素原子を有するアシル、または１〜６炭素を有するアルキルであり、ＸはＬ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンであり、式１中で星印をつけたα炭素は立体配置を有し、ｎが２のとき、Ｘの立体配置とは異なる構造を有する免疫調節剤。 - 請求項９記載の免疫調節剤において、
前記投与は、１回の服用または周期的な複数回の服用である免疫調節剤。 - 請求項９または１０記載の免疫調節剤において、
前記投与は、非経口的注射、経口もしくは鼻吸引、または経口摂取である免疫調節剤。 - 請求項９記載の免疫調節剤において、
Ｘは、Ｄ−トリプトファンである免疫調節剤。 - 請求項９記載の免疫調節剤において、
前記投与は、患者の免疫系統の調節に効果的である免疫調節剤。 - 請求項９記載の免疫調節剤において、
前記投与化合物は、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンを含む免疫調節剤。 - 式１
の構造を有する化合物の使用法であって、前記式中、
ｎは１または２であり、Ｒは水素、２〜１０炭素原子を有するアシル、または１〜６炭素を有するアルキルであり、ＸはＤ−トリプトファンであり、患者の免疫調節用に製薬上認可される形で薬剤を製造する上で式１中で星印をつけたα炭素はＸの立体配置を有し、前記薬剤は患者の体重１ｋｇ当たり１ｎｇ〜１，０００μｇで投与されるように製造される使用法。 - 請求項１５記載の使用法において、
前記薬剤は、１回の服用または周期的な複数回の服用として製剤される使用法。 - 請求項１６記載の使用法において、
前記薬剤は、非経口的注射、経口もしくは鼻吸引、または経口摂取用に製剤される使用法。 - 請求項１５記載の使用法において、
前記薬剤は、患者の免疫系統の調節に効果的である使用法。 - 請求項１５記載の使用法において、
前記薬剤は、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンを含む使用法。
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