KR100602529B1 - 감마-글루타밀 및 베타-아스파르틸을 함유하는 면역조절화합물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

감마-글루타밀 및 베타-아스파르틸을 함유하는 면역조절화합물 및 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

아미노 말단에 γ-L-글루타밀, γ-D-글루타밀, β-L-아스파르틸 또는 β-D-아스파르틸 잔기를 갖는 합성 면역조절 분자는 하기 화학식 1로서 제공된다. 화학식 1에서 n은 1 또는 2이고, R은 수소, 아실 또는 알킬이고, X는 방향족 또는 헤테로시클릭 아미노산 또는 그의 유도체이다. 특히 바람직한 실시형태는 면역조절 활성을 갖는 γ-D-글루타밀-L-트립토판이다.
<화학식 1>

Description

감마-글루타밀 및 베타-아스파르틸을 함유하는 면역조절 화합물 및 그의 제조 방법 {Gamma-Glutamyl and Beta-Aspartyl Containing Immunomodulator Compounds and Methods Therewith}
본 발명은 통상적으로 면역촉진 화합물에 관한 것이고, 보다 상세하게는 체내 특정 부류의 백혈구의 성숙 및 분화를 자극하는 γ-L-글루타밀, γ-D-글루타밀, β-L-아스파르틸 또는 β-D-아스파르틸 잔기를 포함하는 면역촉진 화합물에 관한 것이다. 백혈구 분화 및 증식의 선택적인 자극은 질환-발생 유기체에 대한 신체 방어를 강화시키고 또한 자가-면역 상태를 조정하고 개선시킨다.
면역계는 "자기"로 인식되지 않는 병원체 및 세포에 대해 유기체를 보호하도록 적응된 세포의 네트워크이다. 면역계가 활성화되면, 각종 세포 및 분자가 참가 편입되어, 체내 "비-자기" 실체를 제거하도록 설계된 효과기 기능이 개시되게 한다. 림프구는 외래 실체를 특이적으로 인식하고 선택적으로 제거할 수 있는 면역계의 세포이다. 침입체에 대한 반응에 있어 비-특이적인 것으로 간주되는 호중구와 같은 면역계의 다른 세포와는 달리, 림프구의 특성은 면역 응답에 특이성, 다양성, 기억 및 자기/비자기 인식을 부여한다는 것이다.
림프구에는 B 림프구 및 T 림프구의 2가지 주요 집단이 있다. B 림프구는 골수에서 생겨 성숙하고, 항체 분자를 형성한다. T 림프구도 또한 골수에서 생기나 흉선에서 성숙한다. T-세포에는 T 보조 (hepler) 세포와 T 세포독성 세포의 2가지 주요 아집단이 있다. 이 2가지 T 세포는 2가지 막 당단백질 CD4 또는 CD8 중 어느 하나의 존재로 구별할 수 있다. (CD4를 발현하는) T-보조 세포는 항원-복합체 (특정 단백질에 결합된 외래 분자)에 의해 활성될 경우 총괄적으로 시토킨으로 공지된 각종 성장 인자를 분비함으로써 응답한다. 시토킨은 T-세포독성 세포를 포함한 면역계의 다른 세포를 활성화시키는 신호이다. (CD8을 발현하는) T-세포독성 세포는 활성화될 경우 신체로부터 병원성 세포, 외래 세포, 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포를 모니터하고 제거할 수 있는 세포독성 T 림프구 (CTL)로 증식 및 분화된다.
T 림프구의 통상적인 발육, 성숙 및 분화는 흉선 세포로부터 분비되는 펩티드 호르몬으로 조절된다. 이러한 호르몬은 49-아미노산 잔기 펩티드, 티모포이틴이다. 티모포이틴의 32-36 잔기, Arg-Lys-Asp-Val-Tyr은 티모포이틴의 생물학적 활성을 유지시키고, 티모펜틴이라 불리는 면역조절 약제의 기재가 된다. 티모펜틴의 치료학적 적용에는 류머티스성 관절염, 피부 질환, 박테리아, 바이러스 및 진균에 의한 감염, 수술 또는 암 치료로 인한 면역 억제의 반전, 간염 B 바이러스 예방접종에 대한 응답 강화, 및 T-보조 (CD4) 세포가 바이러스에 의해 특이적으로 공격받는 증상인 후천성 면역 결핍증 (AIDS)의 치료에의 사용이 포함된다 [Christioan, J.S., "A Review of the Pharmacology, Clinical Applications, and Toxicology of Thymopentin," Transgenica: The Journal of Clinical Biotechnology, 1, pp. 23-24, 1994].
티모펜틴과 유사한 특성을 갖는 다른 화합물은 티모겐이라 불리는 디펩티드, Glu-Trp이다. 또한, 서열 -Glu-Trp-는 티모포이틴 합성용 전구체인 분자에 나타나나, -Glu-Trp-는 49-아미노산 호르몬의 일부도 아니고 티모포이틴의 생물학적 활성에 기여하는 것으로 인식되는 디펩티드도 아니다. 티모겐은 발견된 후 주로 러시아에서 감염의 예방 및 치료에 사용되었다. 티모겐은 체르노빌 사건의 결과 방사선에 사고로 노출된 림프구의 손상 후의 면역 기능의 강화에 사용되었다 [Khavinson et al., WO 제92/17191호 및 동 제93/08815호, "Pharmaceutical Dipeptide Compositions and Methods of Use Thereof"].
γ-L-글루타밀 유도된 펩티드는 체내 자연 발생하고, 가장 잘 알려진 예는 트리펩티드 글루타티온이다. 또한, 합성 γ-L-글루타밀-분자는 후보 약제로서 사용되어 왔다. 이 후보물들은 γ-L-글루타밀 잔기가 분자의 활성 부분에 대한 담체로서 사용되므로 "전구약제"라 불린다. 예를 들어, γ-L-글루타밀-4-히드록시-3-요오도벤젠은 인간 및 마우스 흑색종 세포 라인에서 항-종양 활성을 나타낸다. 이는 화합물의 항-종양 활성이 종양 세포 가까이의 4-히드록시-3-요오도벤젠의 효소적 방출로 인한 것으로 생각된다 [Prezioso et al., "γ-Glutamyltranspeptidase Expression Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodrug γ-glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene," International Journal of Cancer, 56, pp. 874-879, 1994]. 또한, γ-L-글루타밀-도파민 및 γ-L-글루타밀-5-히드록시-트립토판은 도파민 및 5-히드록시-트립토판을 뇌 신경단위에 이송 및 공급할 수 있는 전구약제로 기재되어 있다 [Likamwa et al., "The Antinatriuretic Action of γ-L-glutamyl-5-hydroxy-L-tryptophan is dependent on its Decarboxylation to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain," British Journal of Clinical Pharmacology, 387:265-269, 1994].
1996년 12월 19일에 출판된 PCT 공보 WO 제96/40740호에서 발명자 디긴 (Deigin) 및 코로트코프 (Korotkov)는 화학식 X-A-D-Trp-Y (I) [여기서, A는 D-Glu 또는 D-이소글루탐산 (D-iGlu)이고, X는 H, Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Nva, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nva, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ-아미노부티르산 또는 ε-아미노카프로산이고, Y는 Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Nva, Pro, Try, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nva, D-Pro, D-Try, D-Phe, D-Trp, γ-이미노부티르산, ε-아미노카프로산, OH 또는 1-3C 치환된 아미노임]의 펩티드를 기재하고 있다. 화학식 I의 화합물은 면역억제 활성 (예를 들어, 비장 세포의 증식을 억제함)이 있고, 인간 및 수의 약제 및 실험 생화학에 유용한 것으로 알려져 있다.
신조어인 최상의 면역조절제 (best Immunomodulator)의 두문자어인 "베스팀 (Berstim)"은 본 발명과 연관되고 면역조절 특성을 갖는 신규 화합물 부류의 실시형태에 주어진 이름이다. 부분 계속 출원인 모특허출원 제08/634,718호에는 신규 화합물 부류 중 몇몇 화합물이 기재 및 청구되어 있고, 이들 화합물을 사용한 면역조절 치료 방법이 청구되어 있다. 베스팀 화합물 자체는 γ-L-글루타밀-L-트립토판의 화학 구조를 갖는다.
신규 합성 면역조절 분자의 부류는 화학식 1로 나타낸다.
상기 식 중에서, R은 수소, 아실, 알킬 또는 펩티드 잔기이고, X는 방향족 또는 헤테로시클릭 아미노산 또는 그의 유도체이고, n은 1 또는 2이다. 본 발명자들은 (베스팀, γ-L-글루타밀-L-트립토판 외에) 신규 부류의 구성원으로서 R이 수소이고, X가 L-트립토판 및 D-트립토판인 화합물, 예를 들어 γ-D-글루타밀-L-트립토판, γ-L-글루타밀-D-트립토판, β-L-아스파르틸-L-트립토판 및 β-D-이스파르틸-L-트립토판인 화합물이 포함된다는 것을 알게 되었다. 화학식 1 중 별표로 표지된 α탄소는 입체배열을 가지며, n이 2일 경우는 X의 입체배열과 다르다. 특히 바람직한 실시형태는 γ-D-글루타밀-L-트립토판이다. 화학식 1의 펩티드는 임의의 비-독성, 유기 또는 무기산과 제약상 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 카르복실기의 염에는 임의의 적합한 무기 또는 유기 염기와 형성된 비-독성 카르복실산염이 포함된다.
실시형태 베스팀은 각종 실험 검정계에서 시험관내 및 생체내 시험할 경우 효능있는 면역촉진 활성을 갖는다. 그의 생물학적 작용 메카니즘은 골수 T-림프구 전구체의 분화 유도, 림프구 증식 자극과 연관되어 있고, 인터류킨-2를 포함한 각종 시토킨의 생성을 증가시킨다. 베스팀의 약물학적 효과의 전체 결과로 T-보조 림프구, 즉 CD4 표지 (marker)를 함유하는 세포의 수가 선택적으로 증가한다.
베스팀의 예비임상 연구로 나노몰 이하의 농도에서 면역촉진 활성이 증명되었다. 생체내에서는 체중 1㎏ 당 10 ng 내지 1㎍의 투여량으로 작용하고, 면역자극 투여량보다 500 내지 100만배 이상으로 더 높은 투여량에서도 독성을 나타내지 않는다. 동물 연구에서는 경구 투여후 활성을 띄었다.
인간에 대한 예비 연구에서, 베스팀은 림프구 기능의 실험실 변화로 측정한 바와 같이 면역 기능을 증가시켰다. 이들 실험실 변화는 임상적 결과에서 유리한 양성 지표를 수반한다.
신규 유사체 중 하나인 γ-D-글루타밀-L-트립토판은 베스팀과 비교하여 더 높은 생물학적 활성을 갖는 것을 알게 되었고, 더 넓은 투여 범위에서 IL-2 유도가 관찰되었다.
"면역조절 약제"로 지정된 약제는 그의 작용이 잘 알려져 있다. 베스팀 및 그의 유사체는 감염성 질환의 면역요법, 및 방사선으로의 노출 또는 암 화학요법 또는 수술과 같은 다른 스트레스 인자에 의해 미리 감소된 면역 반응성의 복귀를 위한 약제로서 효과적이다.
따라서, 면역조절 활성을 갖는 화학식 1의 화합물은 자연 또는 약물-유도된 상태에 의해 야기되는 면역결핍을 완화하고, 미생물체로부터의 감염의 위험을 개선하고 감소시키기 위해 환자에게 투여하고, 특히 입원 환자, 화상 희생자, 수술받는 환자, 암 화학요법을 받는 환자는 감염되기 쉬우므로 이들에게 투여하는 것이 유리하다. 또한, 화학식 1의 면역조절 화합물은 증후성 또는 비증후성 바이러스 감염된 환자에게 투여하여, 바이러스 제거를 촉진하고, 병원성 유기체의 면역 감시를 강화시켜, 포진 바이러스, 수두 바이러스, 간염 바이러스 및 HIV를 앓거나 이의 보유자인 개인의 질환 재발 가능성을 감소시키고, 정상 세포를 변경시키는 질환을 앓는 환자에게 투여하여 체내에서 이들이 "외래"로, 예를 들어 암과 같은 상태로 인식되도록 하고, 류마티스성 관절염, 다발성경화증, 경피증과 같은 자기-염증성 (자가면역) 질환을 앓는 환자에게 투여하여 면역계를 평형 조정할 수 있다.
질환의 위험이 높거나 질환의 증상을 나타내는 환자에서의 상기 용도 이외에도, 화학식 1의 면역조절 화합물은 예를 들어 인플루엔자 예방접종과 관련하여 유행성 감염의 예방을 위해, 또는 예를 들어 간염에 대한 예방접종과 관련하여 병원체에 대한 면역 응답을 고무하기 위해 건강한 집단에 투여할 수도 있으며, 이에 대한 본 발명에 사용되는 기술적인 용어는 접종을 위한 "보조약"이다.
이러한 사용에서는 체중 1㎏ 당 약 1 ng 내지 약 1000 ㎍ 범위 내의 투여량을 단일 투여 또는 1달 이하 또는 그 이상의 기간 동안 간헐적으로 투여할 수 있고, 전달 경로는 비경구 주입, 경구 또는 비내 흡입, 또는 경구 섭취가 바람직하다.
<바람직한 실시형태의 상세한 설명>
통상적으로, 본 발명의 화합물은 T-보조 세포 집단을 숙주 중 최적 수준으로 조절하는 독특한 화학 물질이다. 예를 들어, 면역계를 조절하여 T-보조 세포의 수를 증가시키면, 박테리아 또는 바이러스로부터의 감염에 대항하는 유기체의 성능이 증가된다. 또한, T-보조 세포 수가 증가하도록 조절하면 신체가 숙주에 대해 외래 물질이 되는 암 세포와 싸우는 것을 돕게 된다. 별도로 또한, 이들 물질은 숙주가 내생 조직에 대한 숙주 T-세포의 과잉 공격이 있는 자기-인식 과정의 혼란으로부터 발생하는 질환에 순응될 수 있도록 한다. 이러한 물질에서, 본 발명의 화합물은 T-세포 집단을 조정하여, 류마티스성 관절염 및 다발성경화증과 같은 자발 염증성 (자가면역) 질환의 신호 및 증상이 개선되도록 한다.
신조어인 "최상의 면역조절제"의 두문자어인 "베스팀"은 본 발명과 연관되고 면역조절 특성을 갖는 신규 화합물 부류의 한 실시형태에 주어진 이름이다. 이는 면역자극 투여량보다 500 내지 500,000배가 넘는 투여량에서 독성을 나타내지 않았다. 베스팀 화합물 자체는 γ-L-글루타밀-L-트립토판의 화학 구조를 갖는다. 합성 면역조절 분자의 신규 부류는 하기 화학식 1로 표시되는 바와 같이, 아미노 말단에 γ-L-글루타밀-잔기, γ-D-글루타밀-잔기, β-L-아스파르틸-잔기 또는 β-D-아스파르틸-잔기를 갖는다.
<화학식 1>
식 중, n은 1 또는 2이고, R은 수소, 아실 또는 알킬이고, X는 방향족 또는 헤테로시클릭 아미노산 또는 그의 유도체이고, 바람직하게는 X는 L-트립토판 및 D-트립토판이다. "X"에 대한 방향족 또는 헤테로시클릭 아미노산의 적합한 유도체는 아미드, 모노- 또는 디-(C1-C6) 알킬 치환된 아미드, 아릴아미드 및 (C1-C 6) 알킬 또는 아릴 에스테르이다. "R"에 대한 적합한 아실 또는 알킬 잔기는 분지 또는 비분지된 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 2 내지 10의 아실기, 및 블로킹기, 예를 들어 카르보벤질옥시 및 t-부틸옥시카르보닐이다. 화학식 1 중 별표로 표지된 α탄소는 입체배열을 가지며, n이 2인 경우는 X의 입체배열과 다르다.
(베스팀, γ-L-글루타밀-L-트립토판 외에) 신규 부류의 구성원으로서 γ-L-글루타밀-Nin-포르밀-L-트립토판, N-메틸-γ-L-글루타밀-L-트립토판, N-아세틸-γ-L-글루타밀-L-트립토판, γ-D-글루타밀-L-트립토판, γ-L-글루타밀-D-트립토판, β-L-아스파르틸-L-트립토판 및 β-D-이스파르틸-L-트립토판과 같은 화합물이 포함된다.
화학식 1의 펩티드는 임의의 비-독성, 유기 또는 무기산과 제약상 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 적합한 염을 형성하는 유기산의 예에는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산 및 산 금속염, 예를 들어 나트륨 모노히드로겐 오르토포스페이트 및 칼륨 히드로겐 술페이트가 포함된다. 적합한 염을 형성하는 무기산의 예에는 모노-, 디- 및 트리카르복실산이 포함된다. 이러한 산의 예에는 예를 들어 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 벤조산, 히드록시겐조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시벤조산 및 술폰산, 예를 들어 메탄술폰산 및 2-히드록시에탈 술폰산이 있다. 카르복실기의 염에는 임의의 적합한 무기 또는 유기 염기와 형성된 비-독성 카르복실산 염이 포함된다. 예를 들어, 이들 염에는 알칼리 금속, 예를 들어 나트륨 및 칼륨, 알칼리 토금속, 예를 들어 칼슘 및 마그네슘, 알루미늄을 포함하는 IIIA족의 경금속, 및 유기 1급, 2급 및 3급 아민, 예를 들어 트리에틸아민을 포함하는 트리알킬아민, 프로카인, 디베닐아민, 1-에텐아민, N,N-디벤질-에틸렌디아민, 디히드로아비에틸렌아민, N-(저급)알킬-피페리딘, 및 임의의 다른 적합한 아민의 염이 포함된다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 중 γ-L-글루타밀 또는 β-아스파르틸 잔기가 존재함으로써, 아미노펩티다제에 의한 분해에 대한 내성 및 효능의 증가와 같은 2가지 중요한 특성이 주어지는 것으로 생각된다. 그러나, 본 발명의 임의의 유사체 중 하나, γ-D-글루타밀-L-트립토판은 베스틴보다 더 광범위한 투여량에서 더 높은 생물학적 활성을 갖는다는 것을 알게 되었다. 본 발명의 특히 바람직한 실시형태는 종종 "SCV-07"을 말한다.
<독성>
우수한 연구실 실시의 조건에 따라 베스팀으로 동물에 대한 급성 및 아급성 독성 시험을 수행하였다. 앰풀내에 무균 동결건조된 분말로 제조된 베스팀을 무균 0.9% NaCl 용액에 용해시키고 모든 실험에서 근육내로 주사하였다.
급성 독성 시험: 설치 동물 (마우스 및 래트)과 개를 동일한 수의 숫컷과 암컷으로 무작위로 그룹화하였다. 동물들은 베스팀을 (근육내로) 1회 투여한 후 14일간 매일 관찰하였다:
마우스 - 5000.0 mg/kg
래트 - 500.0 mg/kg
개 - 500.0 mg/kg
체중, 전체적 외관 및 거동을 각각 매일 평가하고 2주 마지막에 모든 동물들의 내부 장기 (심장, 폐, 흉강 및 복강, 근육, 위, 소장 및 대장, 간, 비장, 췌장, 신장, 방광, 갑상선, 뇌, 피부 및 고환/난소)의 육안적 및 조직병리학적 검사를 수행하였다.
시험한 동물 중 죽은 것은 관찰되지 않았고 일반적 외관, 거동, 체중, 혈액학적, 생화학적 및 생리학적 지표의 기록된 파라미터 및 내부 장기의 육안적 및 조직병리학적 검사는 모두 정상 범위내에 속하였다.
아급성 독성 시험: 두 번째 시험에서는 베스팀을 하기와 같이 더 장기간 투여하였다:
래트: 1 mg/kg 및 100 mg/kg을 3개월 및 6개월 동안 매일 근육내로 투여하였다.
개: 1 mg/kg, 10 mg/kg 및 100 mg/kg을 1개월 및 3개월 동안 매일 근육내로 투여하였다.
래트에서 베스팀의 반복적 주사로 인해 동물이 죽거나 거동의 변화가 있거나 또는 혈액학적, 생화학적 또는 생리학적 파라미터가 변화되지 않았다. 육안적 및 조직학적 수준에서 모든 장기의 형태학적 외관은 정상이었다. 래트에서 두 가지 투여량은 실험 동물에서 약간의 체중 증가를 유도하였다.
개에서 베스팀의 반복적 주사로 인해 동물이 죽거나 거동, 체중, 혈액학적, 생화학적 또는 생리학적 파라미터가 변화되지 않았다. 모든 검사된 장기의 육안적 및 조직학적 검사에서 유의한 변화가 나타나지 않았다. 주사 부위에서의 국소적 염증 반응도 없었다.
결론적으로, 이러한 독성 시험은 베스팀이 설치 동물과 개에서 급성 또는 아급성 독성이 없음을 나타낸다. 치료적 시도를 위한 예상된 투여량에 대한 시험된 투여량은 대략 단일 투여에 대해 5,000,000 배 및 반복 투여에 대해 100배이다.
또한, 시험관내에서 4 개의 펩티드(이 중 3개는 본 발명의 펩티드임)의 독성을 쥐의 흉선세포를 이용하여 평가하였다. 흉선세포를 2회 세척하고, 2% 우태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 매질에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 96-웰 플레이트 (웰 당 1 x 106 세포)에 넣었다. 이어서, 펩티드(또는 대조용 웰에서는 운반체)를 목적하는 농도로 웰에 가하였다. 세포를 37 ℃의 CO2 배양기에서 4 시간 동안 펩티드 또는 운반체와 함께 배양하였다. 배양 후, 에오신(Eosin) B 염색을 이용하여 세포 생존율을 현미경적으로 계산하였다. 그 결과를 표 A에 나타내었다.
펩티드 투여량 (㎍/㎖) 세포 생존율 (%)
비교예의γ-D-Glu-D-Trp1001010.10.01 94.7 ±0.3*97.3 ±0.3396.7 ±0.8898.3 ±0.397.5 ±0.5
본 발명의γ-D-Glu-L-Trp1001010.10.01 95.3 ±0.8896.7 ±1.8697.3 ±1.296.7 ±0.8896.3 ±0.67
본 발명의γ-L-Glu-D-Trp1001010.10.01 95.0 ±1.1595.3 ±1.4595.3 ±0.6797.0 ±0.5896.0 ±0.58
본 발명의γ-L-Glu-L-Trp1001010.10.01 96.7 ±2.8596.0 ±0.5897.7 ±1.298.0 ±1.096.0 ±0.58
대조군 97.0 ±0.58
* - 차이는 대조군과 비교시 통계적으로 유의함, p < 0.05
그러나, 비교예의 펩티드인 γ-D-글루타밀-D-트립토판은 세포 생존율을 감소시키는 것으로 나타났고(표 A), 따라서 0.1 mg/ml의 투여량에서 세포독성이다.
골드스테인(Goldstein)과 오디아(Audhya)의 문헌["Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies" in Thymopentin in Experimental and Clinical Medicine, Surv. Immunol. Res., 4, pp. 1-10, 1985]은 저반응성 또는 과반응성 면역 불균형 상태를 회복시키기 위해 작용하는 면역조절 약물의 개념을 기재하고 있다. 이러한 약물의 이방향성(bi-directional) 활성은 불균형을 평형 세트-포인트로 회복시키려는 생물조절의 성질로 인해 발생한다. 저반응성의 경우, 자기방어계의 기능을 최적화하고 상승조절하기 위해 작용하는 T-림프구를 조절하는 호르몬을 투여하여 비자기 유기체를 더욱 쉽게 거부할 수 있다. 과반응성의 경우, 자가면역 진행을 저하시키는 것처럼 보이는 면역조절 약물의 투여가 유용한 "자기" 독립체의 잘못된 공격을 감소시킨다. 저반응성 및 과반응성 면역 상태에서 베스팀의 임상 적용의 카테고리가 논의되고 실시예가 설명되었다.
저반응성 또는 면역결핍 상태
면역결핍 상태는 3 개의 일반적인 병인학적 카테고리로 나누어 진다. 첫째로는 질병이 진행됨에 따라 발생하는 면역억제이다. 두번째는 다른 질환의 치료로 인해 발생하는 면역결핍, 소위 의원성(醫原性) 면역결핍이다. 세번째는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)을 일으키는 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의한 T-림프구의 직접 공격에 기인한 면역결핍이다.
면역결핍에 이르는 통상의 질환 진행은 영양부족, 신형성, 노화 및 감염이다. 손상된 세포-매개 및 체액 면역 반응이 다양한 유기체에 의한 감염에 대한 감수성을 증가시키기 때문에 영양이 부족한 사람들, 광범위하게 진행된 암 환자 및 쇠약 질환에 걸린 사람들이 더 자주 앓거나 죽게된다. 면역 반응에서 일반적인결핍 상태를 아네르기로 부른다. 다양한 형태의 감염, 특히 바이러스성 감염이 면역억제를 일으킨다. 면역계의 T-보조 림프구 성분을 더욱 튼튼하게 만들 수 있는 베스팀과 같은 약물은 감염에 대한 환자의 내성을 증가시키기 위한 중요한 치료제일 것이다. 예를 들면, 베스팀 또는 그의 유사체는
-- 환자, 특히 나이가 많은 환자에게 병원성 (병원으로 인한) 감염, 통상의 및 중증의 임상 문제의 위험을 감소시키기 위해 병원에 입원 전 또는 직후에 투여,
-- 특히 감염의 위험이 높은 화상 환자에게 투여,
-- 병원체에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 유행성 감염이 예상되는 환자에게 예를 들면 유행성 감기 백신 또는 간염 백신과 함께 투여,
-- 병원성 유기체의 면역 감시를 향상시키고 질병의 재발 가능성을 감소시키기 위해 무증후성 바이러스성 감염의 환자, 예를 들면 포진 바이러스, 수두 바이러스, 간염 바이러스 및 HIV의 운반체인 개인에게 투여한다.
병원성 면역억제는 종종 림프구를 죽이거나 기능적으로 불활성화시키는 약물 치료로 인해 발생한다. 다양한 화학치료 약물이 암 환자에게 투여되고, 이러한 약물은 보통 조숙한 림프구 및 발생중인 림프구 뿐만 아니라 과립구 및 단구 전구체에 세포독성이다. 따라서, 암 화학치료는 거의 항상 면역억제 및 감염의 위험이 증가되는 기간을 수반한다. 암의 방사선 치료도 동일한 위험을 수반한다. 약물 치료(과립구-집락 자극 인자)는 암 화학치료 후 발생하는 감염에 대항하기 위해 혈액내 호중구를 증가시키기 위해 존재하지만, 림프구 기능을 회복시키기 위해 현재 사용되고 있는 약물치료는 없다. 또한, 대수술 예를 들면, 대동맥류 수술 또는 혈관이식 수술은 사람의 면역 기능을 저하시킨다. 대수술로 인해 발생하는 혈액 림프구의 감퇴에 대한 이유는 명확하지 않지만, 대수술 환자에게 림프구 기능을 높이는 제제가 감염의 가능성을 감소시키는 치료 가치를 갖는다.
언급해야할 후천성 면역억제의 한 가지 최종 형태는 외상 후 또는 특정 혈액학적 질환의 치료를 위해 또는 겸상적혈구 질환에서의 폐색의 결과로 장기의 외과적 제거로 인한 비장의 부재로 인한 것이다. 비장이 없는 환자는 몇몇 유기체, 특히 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)와 같은 협막 박테리아로 인한 감염에 더 쉽게 걸릴 수 있다. 비장은 외관상으로는 이러한 유기체에 대한 보호성 체액 면역 반응의 유도에 필요하다. 베스팀은 비장 또는 흉선이 없는 사람에게 미생물에 의한 감염에 대한 내성에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 펩티드 뿐만 아니라 몇 개의 합성법에 관한 자료는 하기 실시예에 의해 예시되는데, 이는 단지 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
<실시예 1>
본 발명의 화합물 및 그의 제약 조성물의 제조
재료 및 장치
시약: N-벤질옥시카르보닐-D-글루탐산 α-벤질 에스테르 및 N-벤질옥시카르보닐-L-글루탐산 α-벤질 에스테르는 무어(Moore) 등의 문헌[J. Chem. Soc., 2349 (1966)]에 기재된 바와 같이 제조하고, L-트립토판 벤질 에스테르 p-톨루엔술포네이트는 아라이(Arai)등의 문헌[J. Org. Chem., 48, 121 (1983)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. D-트립토판, N-메틸모르폴린, 이소부틸 클로로포르메이트, 팔라듐-목탄 촉매 (10%), N-히드록시숙신이미드, 디시클로헥실카르보디이미드, N,N-디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴은 플루카(Fluka)로부터 구입하고 트리플루오로아세트산은 머크(Merck)로부터 구입하였다.
박막 크로마토그래피 (TLC): 하기 용매 시스템(부피비)을 사용하여 예비코팅된 플레이트 키젤겔(Kieselgel) 60 F254 (머크)에서 상승 TLC를 수행하였다:
A, 클로로포름/메탄올/아세트산 90:8:2;
B, 2-프로판올/25% NH4OH/물 50:5:15;
C, 부탄올/아세트산/물 3:1:1.
펩티드를 자외선, 닌히드린 및 J2와 함께 놓았다.
고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)
모든 HPLC 분리관은 동일한 용매계를 사용하였다: 용매 A - 물 중의 0.1% 트리플루오로아세트산 및 용매 B - 아세토니트릴.
분석은 두 개의 펌프 (모델 302), 오토샘플러 (모델 402), 흡광광도계 (모델 116), 데이타 매스터 (모델 621), 및 분석 칼럼 조르박스(Zorbax) ODS 4.6 x 150 mm, 5 μ로 이루어진 길손(Gilson) 크로마토그래피에서 수행하였다. 유속 - 1 ml/분. 펩티드를 230 nm에서 관리하였다. 용출액 - 20분간 10-40% B 또는 10-90%의 직선형 구배.
예비 정제는 두 개의 펌프 (모델 303), 동력 혼합기 (모델 811), 수집기 분획 (모델 202), 흡광광도계 (홀로크롬(Holochrome)), 및 예비 칼럼 조르박스 ODS 21.2 x 250 mm, 8μ로 이루어진 길손 크로마토그래피에서 수행하였다. 유속 - 10 ml/분. 펩티드는 230 nm에서 관리하였다. 용출액 - 80분간 0-40 % B의 직선형 구배.
핵 자기 공명: 모든 스펙트럼은 아스펙트(Aspect) 2000 컴퓨터가 장착된 브루커(Brucker) CPX-300 분광계로 기록하고 양성자용 300 MHz에서 구적 검출로 푸리에르(Fourier) 변환 모드에서 작동시켰다. 펩티드 50 mg을 CD3OD 0.5 ml에 용해시키고 1H 잔류 신호를 3.35 ppm에서 표준 신호로 삼았다. 달리 특정하지 않는 한, 대표적 획득 파라미터는 다음과 같다: 온도 - 상온, 스펙트럼 너비 - 4500 Hz, 펄스 너비 - 1 ㎲ (6o), 및 시간 범위내의 8192 데이타 점. 프로세싱은 16384 포인트 어드레스로 수행하였다. 이완 지연 시간 - 2초.
<실시예 1A>
γ-D-글루타밀-L-트립토판
N-벤질옥시카르보닐-γ-D-글루타밀-L-트립토판 디벤질 에스테르
무수 테트라히드로푸란 중의 N-벤질옥시카르보닐-D-글루탐산 α-벤질 에스테르 (0.74 g, 2 밀리몰) 및 N-메틸-모르폴린 (0.22 ml, 2 밀리몰)의 용액을 -15 ℃로 냉각하였다. 이소부틸 클로로포르메이트 (0.28 ml, 2 밀리몰)를 가하고 혼합된 무수물의 형성을 위해 혼합물을 -10 ℃에 3분간 두었다. 이 때, -5 ℃로 냉각시킨 무수 테트라히드로푸란 (15 ml) 중의 L-트립토판 벤질 에스테르 p-톨루엔술포네이트 (0.93 g, 2 밀리몰) 및 N-메틸-모르폴린 (0.22 ml, 2 밀리몰)의 용액을 가하고, 반응 혼합물을 약 5 ℃에서 냉장고에 두었다. 다음날 용액을 염으로부터 여과하고 무수 테트라히드로푸란 (20 ml)으로 세척하고 진공하에 증발시켰다. 잔사를 에틸아세테이트 (50 ml)에 용해시키고 동일한 부피의 물, 2N H2SO4 용액, 물, 5% NaHCO3 용액, 및 물로 세척하였다. 이를 무수 Na2SO4로 건조시키고 건조제로부터 여과하고 진공하에 약 10 ml로 농축시켰다. 헥산 (50 ml)으로 희석시 생성물을 분리하였다. 수율 820 mg (62%). Rf(A) - 0.75.
γ-D-글루타밀-L-트립토판
메탄올 (30 ml) 중의 N-벤질옥시카르보닐-γ-D-글루타밀-L-트립토판 디벤질 에스테르 (0.6 g, 0.9 밀리몰)의 용액을 5 시간 동안 Pd/C (10%, 200 mg)으로 수소첨가반응하였다. 촉매를 목탄을 통해 여과하여 제거하고 여액을 증발 건조시켰다. 수율 260 mg.
수득한 펩티드를 제조용 HPLC로 정제하고 동결건조하였다. 수율 190 mg. RF(B) - 0.5, RF(C) - 0.45. 앞서 언급한 바와 같이, 이러한 특히 바람직한 실시태양은 종종 "SCV-07"로 불리기도 한다.
γ-D-글루타밀-L-트립토판의 양성자 화학적 이동 (ppm)
잔기 Hα Hβ Hγ 기타
Trp 4.75 3.2-3.4 H4-7.65; H7-7.35; H2-7.15;H6-7.1; H5-7.05
Glu 3.65 2.4 2.1
γ-D-글루타밀-L-트립토판의13C 화학적 이동 (ppm)
잔기 CO Cα Cβ Cγ 기타
Trp 176.19 55.17 27.65 H4-111.08; H8-112.35; H11-119.25;H9-119.81; H10-122.38; H5-124.58;H7-128.76; H6-137.87
Glu 173.96174.68 55.17 28.48 32.71
<실시예 1B>
γ-L-글루타밀-D-트립토판
N-벤질옥시카르보닐-γ-L-글루타밀-D-트립토판 α-벤질 에스테르
N,N-디메틸포름아미드 (96 ml) 중의 N-벤질옥시카르보닐-L-글루탐산 α-벤질 에스테르 (0.99 g, 2.6 밀리몰) 및 N-히드록시숙신이미드 (0.3 g, 2.6 밀리몰)의 용액을 빙수조에서 냉각시키고 N,N-디메틸포름아미드 (3 ml) 중의 디시클로헥실카르보디이미드 (0.56 g, 2.7 밀리몰)의 용액을 교반하면서 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 1 시간 및 실온에서 밤새 교반하였다. 분리된 N,N-디시클로헥실우레아를 여과로 제거하고 D-트립토판 (0.64 g, 3.1 밀리몰) 및 트리에틸아민 (0.46 ml, 3.3 밀리몰)을 여액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반시키고 물 (50 ml)로 희석시켰다. 분리된 오일을 에틸아세테이트로 추출하고 (3 x 20 ml) 합한 유기층을 2N H2SO4 용액 (2 x 20 ml) 및 물 (4 x 30 ml)로 세척하고, Na2SO 4로 건조시키고 건조제로부터 여과하고 진공하에 약 10 ml로 농축하였다. 헥산 (30 ml)으로 희석시 생성물을 분리하였다. 수율 1.2 g (81%). Rf(A) - 0.7.
γ-L-글루타밀-D-트립토판
메탄올 (30 ml) 중의 N-벤질옥시카르보닐-γ-L-글루타밀-D-트립토판 α-벤질 에스테르 (0.6 g, 0.9 밀리몰)의 용액을 2 시간 동안 Pd/C (10%, 200 mg)으로 수소첨가반응하였다(TLC 제어). 촉매를 목탄을 통해 여과하여 제거하고 여액을 증발 건조하였다. 수율 285 mg.
수득한 펩티드를 제조용 HPLC로 정제하고 동결건조하였다. 수율 180 mg. Rf(B) - 0.5, Rf(C) - 0.45.
γ-L-글루타밀-D-트립토판은 γ-D-글루타밀-L-트립토판과 동일한 1H NMR 및 13C NMR을 가졌다.
<실시예 1C>
β-L-아스파르틸-L-트립토판의 고체상 합성
1% 디비닐벤젠 가교결합된 폴리스티렌을 고체 지지체로 사용하여 원하는 분자를 합성하였다. Na-tert-Boc-닌포르밀-L 트립토판-메리필드 수지 0.1 g (함량: Trp 0.7 밀리몰/g 수지)을 반응 용기에 넣었다. 자동화된 합성 프로그램은 다음과 같다:
자동화된 펩티드 합성을 위한 표
단계 시약 반복 횟수 용량 (ml) 시간 (분)
1 CH2Cl2 중의 50% TFA 2 5 2 + 30
2 CH2Cl2 6 8 2
3 CH2Cl2중의 5% DIEA 3 5 2
4 CH2Cl2 6 8 2
5 커플링* 1 4 120
6 DMAA 2 8 2
7 2-프로판올 2 8 2
8 CH2Cl2 2 8 1
9 닌히드린 시험** - - -
TFA-트리플루오로아세트산, DIEA-디이소프로필에틸아민, DMAA-디메틸아세트아미드.* 커플링은 얼음상에서 30분간 DMAA 중의 3당량의 Boc-L-Asp-α-OBzl, HOBt 및 디시클로헥실카르보디이미드 (DCI)로부터 제조한 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)의 활성 에스테르에 의해 수행하였다.** 커플링의 완결은 카이저(Kaiser) 닌히드린 시험 (카이저 등의 문헌[Anal. Biochem., 34:595, 1970])으로 증명하였다. 불완전한 커플링은 한번 더 반복하였다.
펩티드를 0 ℃에서 60분간 10% 아니졸 및 10% m-크레졸을 함유한 액체 불화수소 (HF)로 중합체로부터 탈보호하고 절단하였다. HF를 0 ℃에서 진공하에 제거하고, 펩티드를 30% 수성 아세트산으로 추출하고 에틸 에테르로 세척하고 동결건조시키고 0.2N 수산화나트륨으로 탈포르밀화 후 제조용 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 정제하였다.
모든 베스팀 유사체는 단계 5에서 상이한 Boc-유도체를 이용하는 것만 제외하고는 상기 표 3에서와 동일한 반응에 따라 합성할 수 있다.
합성의 확인
예를 들면, 베스팀은 다음과 같은 특징을 갖는다:
1. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC): 크로마토그래프 길손(Gilson)(프랑스), 용출액 0.1% TFA/아세토니트릴, 구배 10-40%, 14 분 수행, 칼럼 델타-팩(Delta-Pack) C-18, 300 Å, 5 ㎛, 3.9 x 150 mm를 이용. 생성물의 체류 시간은 8.1분이고 HPLC 피크하에 적분한 면적으로 측정한 순도는 99.7%였다.
2. 아미노산 분석: LKB 아미노산 분석기 알파 플러스 4151을 이용하여 생성물을 115 ℃에서 24 시간 동안 진공하에 0.2% 트립타민을 함유한 4N 메탄술폰산에서 가수분해하였다. 글루탐산 1.0, 트립토판 0.94의 펩티드 함량으로 원하는 잔기의 존재를 확인하였다.
3. 박막 크로마토그래피 (TLC): 시스템 1 - n-부탄올:에틸아세테이트:아세트산:물 = 1:1:1:1, Rf=0.72; 시스템 2 - sec-부탄올:아세트산:톨루엔:물 = 6:1:2:1, Rf=0.4.
4. 핵 자기 공명 분광법 (NMR): 아스펙트 200 컴퓨터가 장착된 NMR 분광기 브루커 GXP-300. 펩티드 (0.001 M/l 용액)의 탄소 NMR 스펙트럼을 Glu는 30.0; 31.0; 57.2; 176.6; 178.3 ppm에서; Trp는 35.7, 58.3; 113.1; 116.6; 123.4; 124.3; 126.6; 129.0; 131.0; 140.3; 179.4 ppm에서 측정하였다.
5. 고속 원자 충격 질량 분광기 (FAB-MS), 분자 이온: 계산치 334.13 Da; 실측치 333.73.
제약상 허용가능한 염 형태의 본 발명의 화합물의 제조를 하기 실시예 1D에 예시하였고, 그후 실시예 1E에 기술되어 있는 바와 같이 정제로 제형하였다.
<실시예 1D>
H-γ-D-Gru-L-Trp 나트륨염의 제조
N-벤질옥시카르보닐-γ-D-Glu-L-Trp-α-벤질 에스테르 (5g, 0.087 M)를 메탄올 (40 ml)에 용해시키고 NaHCO3 (0.73g, 0.087 M)를 첨가하였다. 질소를 서서히 흘러보내 공기를 대체하고 목탄 상 10% 팔라듐 촉매 (물 30 ml 중의 2.5g)를 첨가하였다. 질소를 다시 플라스크에 서서히 통과시킨 후, 수소를 서서히 도입하기 시작하였다. 촉매를 격렬히 교반시켜 현탁시켰다. 4 시간 후 촉매를 여과하여 제거하고 메탄올 (10 ml)로 세척하였다. 여과물을 진공으로 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴과 함께 분쇄하였다. 고상 생성물을 필터 상에 수집하고, 아세토니트릴로 세척한 후 진공 하에 건조하였다.
수율: 2.14g (70%).
<실시예 1E>
정제로의 제형
실시예 1A의 본 발명의 펩티드 (γ-D-글루타밀-L-트립토판)를 글리신 98.9%, 마그네슘 스테아레이트 1% 및 본 발명의 펩티드 0.1%, 또는 글리신 94.9%, 전분 5% 및 본 발명의 펩티드 0.1%로 정제로 제형하였다. 각 정제 100 mg은 본 발명의 유사체를 100 ㎍ 함유하였다.
<실시예 2>
인터류킨 2(IL-2) 생성에 대한 생체 내에서의 베스팀 및 베스템 유사체의 영향에 대한 연구
종: 마우스 (CBA 변종)
감정: 펩티드 γ-L-Gru-L-Trp (베스팀) 및 γ-D-Gru-L-Trp (베스팀 유사체)를 5일 동안 매일 하루에 한번 정제에 지시된 상이한 투여량으로 수용액의 형태로 로 입으로 투여하였다. 5마리의 동물을 각 펩티드 투여량에 대해 실험하였다. 48시간 후 비장을 제거하고 비장 세포를 96 웰 평면 바닥 배양 판에서 10% 우태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 매질에서 IL-2 생성 유도체 Con A (5 ㎍/ml)의 존재 하에 시험관내에서 추가의 24 시간 동안 배양하였다. 상청액 중의 IL-2 정도를 쥐과 IL-2-의존 세포 라인 CTLL-2 (길리스 (Gillis) 등, 1978)를 사용하여 생물학적 검정으로 측정하였다.
쥐과 비장 세포에 의한 IL-2 생성에 대한 베스팀 및 그의 유사체의 영향
펩티드 투여량 (㎍/kg) γ-D-Glu-L-Trp (SCV-07) γ-L-Glu-L-Trp (베스팀)
10.0 132.2 ± 9.3* 56.7 ± 4.5
0.1 129.2 ± 9.8* 47.2 ± 8.9
0.001 103.4 ± 7.5* 115.9 ± 8.6*
0.00001 85.9 ± 5.0* 65.2 ± 6.2
대조용 68.3 ± 4.9 68.3 ± 4.9
* 대조용과의 상당한 차이, P < 0.05.
결론: 펩티드 γ-D-Glu-L-Trp (본 발명의 베스팀 유사체)는 베스팀의 생물학적 활성과 비교하여 보다 보다 높은 생물학적 활성을 가졌다. IL-2 유도는 보다 광범위한 투여량 범위에서 관찰되었으며, 높은 투여량에서 이러한 유사체는 IL-2 유도를 감소시키지 않았다.
<실시예 3>
쥐과 골수 T-세포 전구체에 의한 Thy-1 항원 발현에 대한 영향
프로토콜: 골수 세포를 CBA 마우스 대퇴골로부터 수득하고 37℃에서 1시간 동안 이글 매질(Eagle's medium) 중의 마이크로적정(테라사키(Terasaki)) 플레이트에서 시험관내 펩티드와 인큐베이션하였다. Thy-1 항원 발현을 항-Thy-1 항체를 사용하여 보체 의존성 세포독성 검정으로 측정하였다.
본 발명의 펩티드 유사체의 존재 하에 배양된 쥐과 골수에서의 Thy-1 항원 발현 세포 수의 변화
펩티드 농도 (㎍/kg) Thy-1 항원 발현 세포 (%)
γ-L-Glu-D-Trp γ-D-Glu-L-Trp(SCV-07) γ-L-Glu-L-Trp(베스팀)
10.0 39.4 ± 2.2 63.6 ± 4.2 35.0 ± 3.0
1.0 44.3 ± 5.4 47.3 ± 1.6 39.6 ± 4.6
0.1 42.2 ± 4.4 38.4 ± 4.4 38.5 ± 2.8
0.01 35.6 ± 4.1 36.3 ± 4.9 38.0 ± 3.1
0.001 40.0 ± 1.6 37.6 ± 1.2 32.2 ± 2.8
0.0001 33.7 ± 2.8 37.2 ± 2.6 30.0 ± 2.4
0.00001 29.4 ± 1.7 36.2 ± 3.2 24.0 ± 2.0
대조용 14.7 ± 2.4
대조용과의 상당한 차이(p < 0.05)가 관찰되었다.
결론: 본 발명의 펩티드 γ-D-Glu-L-Trp는 베스팀 및 또다른 본 발명의 유사체, γ-L-Glu-D-Trp의 활성과 비교하여 보다 높은 활성을 가졌다.
본 발명의 펩티드의 존재 하에 배양된 쥐과 골수에서의 Thy-1 항원 발현 세포 수의 변화
펩티드 농도(㎍/ml) Thy-1 항원 발현 세포 수 (%)
펩티드 1** 펩티드 2 펩티드 3 펩티드 4** 펩티드 5
10.01.00.10.010.0010.00010.00001 55.4 ± 2.4*51.4 ± 2.6*49.4 ± 2.3*35.7 ± 2.1*14.9 ± 1.712.7 ± 1.912.3 ± 1.6 44.8 ± 4.0*42.5 ± 3.6*22.5 ± 2.818.2 ± 2.316.4 ± 1.917.9 ± 2.115.6 ± 2.0 41.9 ± 3.2*38.0 ± 2.9*33.9 ± 2.1*27.3 ± 2.1*13.0 ± 1.312.9 ± 1.413.4 ± 1.7 41.2 ± 4.0*39.2 ± 4.1*37.1 ± 3.6*36.3 ± 2.9*25.6 ± 2.824.2 ± 2.923.0 ± 2.7 66.3 ± 4.5*64.3 ± 4.4*57.0 ± 4.0*54.0 ± 3.9*40.0 ± 4.1*29.0 ± 2.8*14.0 ± 1.8
대조용 13.9 ± 1.9 14.8 ± 2.1
* -대조용과의 상당한 차이, δ < 0.05.** - 사용된 펩티드 1. β-L-아스파르틸-L-트립토판 2. 아세틸-γ-D-글루타밀-L-트립토판 3. β-D-아스파르틸-L-트립토판 4. γ-D-글루타밀-L-트립토판-아미드 5. γ-D-글루타밀-L-트립토판 (SCV-07)
<실시예 4>
시험관내에서의 베스팀 유사체의 생물학적 활성
펩티드: 베스팀 및 본 발명의 여러 유사체를 동결 건조 형태로 제조하였다. 실험 후 바로, 모든 펩티드를 물 중에 용해시켜 상이한 기질 농도의 용액을 제조하였다.
배양시 IL-2 생성에 대한 영향
프로토콜. CBA 마우스로부터의 비장을 제거하고, 비세포를 단리하고 96 웰 평면 바닥 배양 판에서 10% 우태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 매질에서 배양하였다. IL-2 생성은 24 시간 배양에서 5 ㎍/ml Con A로 유도하였다. 목적하는 농도에서 펩티드를 세포 배양에 첨가하고 이 때를 "0" 시간으로 하였다. 배양 상청액에서의 IL-2 농도를 IL-2 의존 CTLL-2 세포 라인(길리스 등, 1978)을 사용하여 측정하였다.
베스팀 유사체의 존재 하에 배양에서 쥐과 비장 세포에 의한 Con-A 유도 IL-2 생성의 변화
펩티드 농도 (㎍/kg) 상청액에서의 IL-2 정도 (IU/ml)
γ-L-Glu-D-Trp γ-D-Glu-L-Trp(SCV-07) γ-L-Glu-L-Trp(베스팀)
10.0 62.8 ± 3.2* 65.5 ± 3.7* 59.9 ± 3.0*
1.0 57.4 ± 4.8 80.9 ± 6.7* 61.4 ± 3.3*
0.1 57.9 ± 3.2 87.2 ± 7.1* 57.3 ± 4.0
0.01 59.9 ± 4.5 73.8 ± 6.3* 56.6 ± 3.7
0.001 60.4 ± 5.9 65.9 ± 4.0* 54.7 ± 3.2
0.0001 52.6 ± 5.0 47.9 ± 3.4 53.2 ± 3.3
대조용 50.1 ± 3.7 50.1 ± 3.7 50.1 ± 3.7
* 대조용과의 상당한 차이, p < 0.05.
<실시예 5>
경구 투여 후 환자의 면역 체계의 변화
실시예 1E에 기재된 2개의 정제 제제 각각을 수술 한 달 후 두 암환자에게 투여하였다.
제1 경우 연구
환자: "Eg"
진단: 결장 암
전 처리: 수술
SCV-07 치료: 5일간 경구 정제 투여 (1일 당 0.1 mg).
SCV-07 정제 경구 치료를 받는 환자 "Eg"의 면역 매개변수의 변화에 대한 데이타
면역 매개변수 치료 전 5일 치료를 마친 2주 후
혈액 림프구 수(%)CD3CD4CD8CD4/CD8 비CD20 51.2 ± 1.126.2 ± 1.023.1 ± 1.31.1320.8 ± 1.4 55.4 ± 1.329.7 ± 1.524.1 ± 1.61.2320.4 ± 1.1
호중구 이동지수 2.35 2.46
호중구 나이트로블루 테트라졸륨 감소 (U):자발적PMA-유도 675 ± 236459 ± 132 1031 ± 496950 ± 175
제2 경우 연구
환자: "Ar"
진단: 결장 암
전 처리: 수술
SCV-07 치료: 5일간 경구 정제 투여 (1일 당 0.1 mg).
SCV-07 정제 경구 치료를 받는 환자 "Ar"의 면역 매개변수의 변화에 대한 데이타
면역 매개변수 치료 전 5일 치료를 마친 2주 후
혈액 림프구 수(%)CD3CD4CD8CD4/CD8 비CD20 46.3 ± 1.423.4 ± 1.223.5 ± 1.11.011.4 ± 1.0 59.2 ± 1.331.0 ± 1.727.1 ± 1.91.1414.3 ± 0.9
호중구 이동지수 1.25 3.07
호중구 나이트로블루 테트라졸륨 감소 (U):자발적PMA-유도 401 ± 385007 ± 245 1646 ± 975111 ± 304
인간 호중구성의 백혈구 기능 활성에 대한 본 발명의 펩티드 γ-D-글루타밀-L-트립토판의 영향을 자발적 루미놀-의존 화학발광 감정(무토(Muto) 등, 1986)을 사용하여 유리 산소 라디칼 생성 정도의 변화에 따라 측정하였다. 공여체의 전체 혈액의 시료를 표에 나타낸 농도에서 식염수로 희석시킨 펩티드와 함께 1251 발광기 (LKB)의 작동 쿠벳(working cuvet)에 삽입하였다. 루미놀을 각 쿠벳에 첨가하고 쿠벳을 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 후, 쿠벳을 일정한 교반과 함께 37℃에서 40분 동안 발광기 웰에 인큐베이션하였다. 발생한 과산소 라디칼의 양을 "루미나(Lumina)" 컴퓨터 프로그램을 이용하여 계산하였으며 40 분 동안 광의 합계(mv/분)로 나타내었다. 각 시료에 대해 3번 실시하였다.
인간 전체 혈액 세포 배양에서 루미놀 강화 호중구 화학발광에 대한 펩티드의 영향
본 발명의 펩티드 (㎍/ml) 비자극 세포의 화학발광 PMA 활성화 세포의 화학발광
최대 수치(mv) 40분에서의 광 합계 (mv/분) 최대 수치(mv) 40분에서의 광 합계 (mv/분)
1.00.10.01대조용 0.71 ± 0.020.72 ± 0.020.73 ± 0.040.66 ± 0.07 25.7 ± 0.1327.2 ± 0.9327.9 ± 0.8525.2 ± 0.09 3.40 ± 0.06*2.57 ± 0.403.03 ± 0.992.90 ± 0.12 75.9 ± 1.5*60.3 ± 0.863.0 ± 0.764.9 ± 4.0
* - 대조용과의 상당한 차이, P < 0.05.
인간 백혈구 화학주성에 대한 본 발명의 펩티드의 영향에 대한 연구
화학주성 감정은 넬슨(Nelson) 등에 의해 기술된 아가로우스 이동 기법을 사용하여 실시하였다. 아가로우스를 최종 농도 1%까지 10% 우태아 혈청이 보충된 199 배양 매질 중에 용해시켰다. 상기 혼합물을 티슈 배양 접시에 옮겨 담고 겔화시켰다. 겔이 담긴 직경 2 mm 및 간격 3 mm의 일련의 웰을 잘랐다. 호중구 10 ㎕(ml 당 2.5 x 106 세포)를 중심 웰에 첨가하였다. 한쪽 편의 다른 웰에는 매질을 채우고 램덤 이동을 측정하였고, 다른 편의 웰에는 화학주성 인자 FMLP를 10-7M에서 채워 자극 이동을 측정하였다. 접시를 120분 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 목적하는 농도의 펩티드를 세포에 첨가하고 이 때를 "0" 시간으로 하였다. 세포 이동은 마이크로스케일로 현미경으로 판독하고 화학주성 지수(자극 이동/램덤 이동)로 나타내었다.
펩티드** 펩티드 농도, ㎕/ml
100 10 1
123456 1.47 ± 0.041.73 ± 0.072.17 ± 0.17*2.13 ± 0.342.50 ± 0.30*2.19 ± 0.30 1.75 ± 0.251.79 ± 0.011.78 ± 0.201.71 ± 0.151.77 ± 0.171.93 ± 0.29 1.71 ± 0.202.33 ± 0.17*1.73 ± 0.101.75 ± 0.131.81 ± 0.111.61 ± 0.15
대조용 1.77 ± 0.05
* -대조용과의 상당한 차이, δ < 0.05.** - 사용된 펩티드 1. β-L-아스파르틸-L-트립토판 2. 아세틸-γ-D-글루타밀-L-트립토판 3. β-D-아스파르틸-L-트립토판 4. γ-D-글루타밀-L-트립토판-아미드 5. γ-D-글루타밀-L-트립토판 (SCV-07) 6. γ-D-글루타밀-L-트립타민
인간 백혈구 식작용에 대한 본 발명의 펩티드의 영향에 대한 연구
피콜-팩 분리(Ficoll-Pack separation)로 공여체 혈액으로부터 수득한 인간 호중구성의 백혈구를 10% 우태아 혈청으로 보충된 이글 배양 매질 중에 ml 당 2 x 106 세포의 농도에서 실리콘 처리 관으로 이송하였다. 인간 혈청으로 옵소닌 처리된 효모 세포를 식작용의 대상으로 사용하였다. 효모 세포를 관 중에 첨가하고(1 호중구 당 10개의 효모 세포) 세포 현탁액을 40분 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 이 후 세포를 원심분리기로 세척하고, 유리 슬라이드 상의 세포 도말을 제조하고 김사 염색(Giemsa stain)으로 염색하였다. 식세포를 현미경으로 계산하였다.
펩티드** 펩티드 농도, ㎕/ml
100 10 1
123456 33.3 ± 1.2*34.3 ± 1.2*22.3 ± 1.920.7 ± 5.225.0 ± 1.4*19.0 ± 2.3 36.0 ± 7.5*29.5 ± 0.5*21.0 ± 5.018.0 ± 2.725.7 ± 2.7*22.0 ± 4.0 32.3 ± 1.8*30.0 ± 1.1*23.0 ± 5.616.7 ± 2.717.0 ± 1.022.0 ± 3.0
대조용 16.7 ± 1.5
* -대조용과의 상당한 차이, p < 0.05.** - 사용된 펩티드 1. β-L-아스파르틸-L-트립토판 2. 아세틸-γ-D-글루타밀-L-트립토판 3. β-D-아스파르틸-L-트립토판 4. γ-D-글루타밀-L-트립토판-아미드 5. γ-D-글루타밀-L-트립토판 (SCV-07) 6. γ-D-글루타밀-L-트립타민
시험관내에서의 래트 흉선세포 증식에 대한 본 발명의 영향
ml 당 5 x 106에서 선천적 백색 래트 흉선세포를 1% 열-비활성 우태아 혈청, L-글루타민 2 mM, 젠타마이신 80 ㎍/ml, 폴리믹신 B 5 ㎍/ml, 콘카나발린 (Concanavalin) A 0.5 ㎍/ml로 보충된 RPMI-1640 매질 중의 평면 바닥 96-웰 배양 판에서 CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 펩티드와 3회 배양하였다. 배양 기간 마지막 16 시간 전, 세포를 3H-티미딘으로 펄스 라벨링하였다. 세포를 티테르텍 세포 수집기로 유리 섬유 필터 상에서 수집하고 베타 액체 섬광 계산기로 계수하였다. 증식 속도를 분 당 수로 나타내었다.
펩티드 농도(㎍/ml) 증식 속도 (분 당 수)
펩티드 1 펩티드 2 펩티드 3 펩티드 4 펩티드 5
1.00.10.010.0010.0001 58720 ± 2340*53110 ± 48546590 ± 119055010 ± 535051230 ± 2030 52300 ± 249053340 ± 159051950 ± 591056790 ± 1880*52080 ± 1880 49700 ± 79050190 ± 178056510 ± 397055530 ± 275051430 ± 2050 53330 ± 137048690 ± 179048100 ± 195050740 ± 219050960 ± 1050 49420 ± 121053180 ± 191059480 ± 2250*61340 ± 2340*57880 ± 1560*
대조용 49000 ± 1420
* -대조용과의 상당한 차이, p < 0.05.** - 사용된 펩티드는 1. β-L-아스파르틸-L-트립토판 2. 아세틸-γ-D-글루타밀-L-트립토판 3. β-D-아스파르틸-L-트립토판 4. γ-D-글루타밀-L-트립토판-아미드 5. γ-D-글루타밀-L-트립토판 (SCV-07)
결론적으로, 본 발명의 펩티드는 면역자극 특성이 있으며 비장 림프구에 의해 IL-2 생성을 자극할 수 있고 전구체 T-림프구 숙성 분열을 유도할 수 있으며 T-세포 증식을 자극할 수 있다. 특히, 바람직한 본 발명의 펩티드 γ-D-Glu-L-Trp (SCV-07)는 인간 호중구성의 백혈구 기능 활성, 특히 식작용 및 산소 라디칼 생성의 자극을 통해 면역 기능을 증가시키는 것으로 나타났다. 본 발명의 펩티드, 특히 SCV-07은 T-림프구 및 T-보조자 림프구 전체 수 및 주변 혈액에서의 CD4/CD8 비를 증가시키는 것으로 나타났다. 마지막으로 본 발명의 펩티드, 특히 SCV-07은 또한 호중구성의 백혈구 이동 및 살균 활성을 자극하는 것으로 나타났다.
본 발명을 바람직한 특정 실시양태에 관련하여 상기에서 기술하였지만, 설명 및 실시예는 예시하려는 의도이지 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라는 것을 이해하여야 하며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해 한정된다.
<관련 출원>
본 발명은 1995년 11월 28일에 출원된 러시아 출원 제95119704호 및 동 제 95120266호를 우선권 주장하여 1996년 4월 18일에 출원된 제08/634,718호의 부분 계속 출원이다. 또한, 본 출원은 1997년 12월 25일에 출원된 러시아 출원 제97120940호와 연관되며 이를 우선권으로 한다. 출원 제08/634,718호는 본원에 참고로 인용되어 있다.

Claims (14)

  1. γ-D-글루타밀-L-트립토판인 화합물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 제약상 허용가능한 염 형태의 화합물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 또는 제4항의 화합물을 제약상 허용가능한 담체와 함께 포함하는 면역조절 치료를 위한 제약 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 체중 1㎏ 당 1 ng 내지 1000 ㎍ 범위의 치료학적 투여량으로 화합물을 포함하는 제약 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 단일 투여 또는 간헐적인 다중 투여로 투여되는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 비경구 주입, 경구 또는 비내 흡입, 또는 경구 섭취로 투여되는 조성물.
  12. 삭제
  13. 제8항에 있어서, 환자의 면역계를 조절하기 위해 투여하는 조성물.
  14. 삭제
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