ES2350039T3 - Compuestos inmunomoduladores que contienen gamma-glutamilo y beta-aspartilo y métodos con ellos. - Google Patents

Abstract

Un compuesto con al menos dos residuos de aminoácido y que tiene la estructura de Fórmula 1: Fórmula 1 donde n es 1 ó 2, R es hidrógeno, un acilo que tiene 2 a 10 átomos de carbono o un alquilo que tiene de 1 a 6 carbonos, y X es L-triptófano o D-triptófano, y en la que el carbono marcado con un asterisco en la Fórmula 1 tiene una estereoconfiguración, cuando n es 2, que es diferente de la estereoconfiguración de X.

Description

Campo de la Invención

La invención se refiere generalmente a compuestos inmunoestimulantes y más particularmente se refiere a compuestos inmunoestimulantes que incluyen un resto bien �-Lglutamilo, bien �-D-glutamilo, bien �-L-aspartilo o bien �-Daspartilo que estimula la maduración y la diferenciación de ciertas clases de glóbulos blancos dentro del cuerpo. Esta estimulación selectiva de la diferenciación y la proliferación de glóbulos blancos mejora las defensas del cuerpo contra organismos que provocan enfermedades y también modula y mejoras afecciones autoinflamatorias.

Antecedentes de la Invención

El sistema inmunitario es una red de células adaptadas para proteger al organismo contra patógenos y células que no son reconocidas como “propias”. Una vez que se activa el sistema inmunitario, recluta la participación de una variedad de células y moléculas para montar una función efectora diseñada para eliminar la entidad “no propia” del interior del cuerpo. Los linfocitos son células del sistema inmunitario que son capaces de reconocer específicamente y eliminar selectivamente entidades extrañas. En contraste con

otras

células del sistema inmunitario, tales como los

neutrófilos

que se consideran no específicos en sus

reacciones

con los invasores, las características de los

linfocitos confieren especificidad, diversidad, memoria y reconocimiento propio/no propio a la respuesta inmunitaria.

Existen dos poblaciones principales de linfocitos: linfocitos B y linfocitos T. Los linfocitos B se originan y maduran dentro de la médula ósea y son responsables de la formación de moléculas de anticuerpo. Los linfocitos T también surgen de la médula ósea pero maduran en el timo. Existen dos subpoblaciones principales de células T: células T auxiliares y células T citotóxicas. Los dos tipos de células T pueden distinguirse por la presencia de una o dos glicoproteínas de membrana, bien CD4 o bien CD8. Las células T auxiliares (que expresan CD4) cuando son activadas por complejos antigénicos (moléculas extrañas acopladas a

proteínas especiales) responden secretando diversos factores de crecimiento conocidos colectivamente como citoquinas. Estas citoquinas son señales que activan otras células del sistema inmunitario, incluyendo las células T citotóxicas. Las células T citotóxicas (que expresan CD8), cuando se activan, proliferan y se diferencian en linfocitos T citotóxicos (CTL) que son capaces de controlar y eliminar del

cuerpo

células patógenas, células extrañas, células

infectadas con virus y células tumorales.

El

desarrollo, la maduración y la diferenciación

normales de los linfocitos T se regulan mediante hormonas peptídicas secretadas por células tímicas. Una de tales hormonas es el péptido de 49 residuos de aminoácido timopoyetina. Los residuos 32-36 de la timopoyetina, Arg-Lys- Asp-Val-Tyr, retienen las actividades biológicas de la timopoyetina y son la base de un fármaco inmunomodulador llamado timopentina. Las aplicaciones terapéuticas de la timopentina incluyen el uso para artritis reumatoide, afecciones dermatológicas, infecciones por bacterias, virus y hongos, inversión de la depresión inmunitaria debida a cirugía o a la terapia del cáncer, potenciación de respuestas a la vacunación contra el virus de la hepatitis B y tratamiento del virus de inmunodeficiencia adquirida (sida), una afección en la que células T auxiliares (CD4) son atacadas específicamente por el virus (Christian, J.S., “A Review of the Pharmacology, Clinical Applications, and Toxicology of Thymopentin”, Transgenica: The Journal of Clinical Biotechnology, 1, pp. 23-34, 1994).

Un segundo compuesto con propiedades similares a la timopentina es el dipéptido Glu-Trp denominado timógeno. La secuencia -Glu-Trp-también está presente en la molécula que es precursora para la síntesis de timopoyetina, pero -GluTrp-no es parte de la hormona de 49 aminoácidos ni es el dipéptido reconocido como un contribuyente a la actividad biológica de las timopoyetinas. El timógeno fue descubierto y se usó principalmente en Rusia para la profilaxis y el tratamiento de infecciones. El timógeno se usó para la mejora de la función inmunitaria después del daño de los linfocitos

por exposición accidental a irradiación como resultado del incidente de Chernobyl. (Khavinson et ál., documentos WO 92/17191 y WO 93/08815, “Pharmaceutical Dipeptide Compositions and Methods of Use Thereof”).

Péptidos derivados de �-L-glutamilo se presentan naturalmente en el cuerpo, siendo el ejemplo mejor conocido el tripéptido glutationa. Moléculas de �-L-glutamilo se han usado como fármacos “candidato”. Estos candidatos se denominan “profármacos” debido a que el resto de �-Lglutamilo se usa como un vehículo para la porción activa de la molécula. Por ejemplo, el �-L-glutaminil-4-hidroxi-3yodobenceno demuestra actividad antitumoral en ser humano y en líneas celulares de melanoma de ratón. Se cree que las actividades antitumorales de este compuesto se deben a la liberación enzimática de 4-hidroxi-3-yodobenceno cerca de las células tumorales (Prezioso et ál., “�-Glutamyltranspeptidase Expression Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodrug �-glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene,” International Journal of Cancer, 56, pp. 874-879, 1994). Además, la �-L-glutamildopamina y el �-L-glutamil-5hidroxitriptófano se han descrito como profármacos que podrían transportar y suministrar dopamina y 5hidroxitriptófano a neuronas cerebrales (Likamwa et ál., “The Antinatriuretic Action of �-L-glutamyl-5-hydroxy-L-tryptophan is Dependent on its Decarboxylation to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain,” British Journal of Clinical Pharmacology, 387:265-269, 1994).

En el documento PCT WO 96/40740, publicado el 19 de diciembre de 1996, los inventores Deigin y Korotkov describen péptidos de fórmula X-A-D-Trp-Y (I), donde: A = D-Glu o ácido D-isoglutámico (D-iGlu); X = H, Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Nva, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nva, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, ácido �-aminobutírico o ácido �aminocaproico; Y = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Nva, Pro, Try, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nva, D-Pro, D-Try, D-Phe, D-Trp, ácido �-aminobutírico, ácido �-aminocaproico, OH

o amino sustituido con 1-3C. Se dice que los compuestos (I) tienen actividad inmunosupresora (por ej., inhibiendo la

proliferación de células del bazo) y son útiles en medicina humana y veterinaria y bioquímica experimental.

El documento W097119691 describe una clase de moléculas inmunomoduladoras sintéticas que tienen la estructura:

imagen1

5 en la que R es hidrógeno, acilo o alquilo y X es un aminoácido aromático o heterocíclico o su derivado. Compuestos ejemplares incluyen �-L-glutamil-L-triptófano (Bestim), N-metil-�-L-glutamiltriptófano, N-acetil-�-L10 glutamil-L-triptófano, �-L-glutamil-Nin-formil-L-triptófano y �-L-glutamil-�-tienil-D-alanilamida. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un compuesto con al menos dos residuos de aminoácido y que tiene la estructura de Fórmula 1: 15 Fórmula 1

imagen1

donde n es 1 ó 2, R es hidrógeno, un acilo que tiene 2 a 10 átomos de carbono o un alquilo que tiene de 1 a 6 carbonos y

20 X es L-triptófano o D-triptófano, y en la que el carbono � marcado con un asterisco en la Fórmula 1 tiene una estereoconfiguración, cuando n es 2, que es diferente de la estereoconfiguración de X. Los presentes inventores han descubierto que están

25 incluidos como miembros de la nueva clase los compuestos en los que R = hidrógeno y X = L-triptófano y D-triptófano, tales como �-D-glutamil-L-triptófano, �-L-glutamil-Dtriptófano, �-L-aspartil-L-triptófano y �-D-aspartil-Ltriptófano. El carbono � marcado con un asterisco en la

30 Fórmula 1 tiene una estereoconfiguración, cuando n es 2, que es diferente de la estereoconfiguración de X. Una realización

particularmente preferida es �-D-glutamil-L-triptófano. Los péptidos de Fórmula 1 pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con cualquier ácido orgánico o inorgánico atóxico. Sales de los grupos carboxílicos incluyen las sales de ácido carboxílico atóxicas formadas con cualesquiera bases inorgánicas u orgánicas adecuadas.

Bestim tiene una potente actividad inmunoestimulante cuando se prueba en diversos sistemas de ensayo experimentales in vitro e in vivo. El mecanismo de su acción biológica está relacionado con la inducción de la diferenciación de precursores de linfocitos T de la médula ósea, la estimulación de la proliferación de linfocitos y el

incremento

en la producción de diversas citoquinas,

incluyendo

interleuquina-2. El resultado neto del efecto

farmacológico

del Bestim es un incremento selectivo en el

número de linfocitos T auxiliares, esto es células que contienen el marcador CD4.

Estudios preclínicos de Bestim demuestran actividad inmunoestimulante a concentraciones subnanomolares. In vivo, actúa en dosis de 10 ng a 1 µg por kg de peso corporal y no tiene toxicidad observable a dosis de 500 a más de un millón de veces superiores a la dosis inmunoestimulante. En estudios en animales, es activo después de la administración oral.

En estudios preliminares en seres humanos, Bestim incrementaba la función inmunitaria, según se medía mediante cambios de laboratorio de la función de los linfocitos. Estos cambios de laboratorio estaban acompañados por indicadores positivos de beneficio en el resultado clínico.

Se ha encontrado que uno de los nuevos análogos, �-Dglutamil-L-triptófano, tiene una actividad biológica incluso superior en comparación con la del Bestim y con la inducción de IL-2 observada en un intervalo de dosis más amplio.

Un fármaco señalado como un “fármaco inmunomodulador” tiene un conjunto de acciones bien definido. Bestim y sus análogos son eficaces como un fármaco para la inmunoterapia de enfermedades infecciosas y para la restitución de la reactividad inmunitaria previamente disminuida por la exposición a radiación u otros factores de estrés tales como

quimioterapia del cáncer o cirugía.

Así, los compuestos de Fórmula 1 que poseen actividad inmunomoduladora se administran útilmente a pacientes para modificar la inmunodeficiencia provocada por estados naturales o inducidos por fármacos, se administran a pacientes para mejorar y para reducir los riesgos de infecciones por microorganismos, especialmente se administran a pacientes hospitalizados, a victimas de quemaduras, a pacientes sometidos a cirugía, a pacientes sometidos a quimioterapia del cáncer, debido a que tales individuos son especialmente propensos a infecciones. Además, los compuestos inmunomoduladores de Fórmula 1 pueden administrarse a pacientes con infecciones virales sintomáticas o asintomáticas, para facilitar la eliminación viral y para mejorar la vigilancia inmunitaria de organismos patógenos y así reducir la probabilidad de recaída de la enfermedad, por ejemplo, para individuos que están enfermos de o son portadores de herpesvirus, virus de varicela, virus de hepatitis y HIV, se administran a pacientes con enfermedades que alteran células naturales de modo que son reconocidas como “extrañas” por el cuerpo, por ejemplo, en afecciones tales como el cáncer, y se administran a pacientes con enfermedades autoinflamatorias (autoinmunes) tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, escleroderma -para ajustar el sistema inmunitario hasta el equilibrio.

Además de estos usos con pacientes con riesgo de enfermedad o que expresan síntomas de enfermedad, los compuestos inmunomoduladores de Fórmula 1 pueden administrarse a poblaciones sanas en prevención de infecciones epidémicas, por ejemplo, junto con vacunaciones contra influenza, o para vigorizar la respuesta inmunitaria a patógenos junto con las vacunaciones, por ejemplo para la vacunación contra la hepatitis -el término técnico para esto es el uso de la invención como un “adyuvante” para la vacunación.

Estos usos pueden administrarse mediante dosificaciones en el intervalo de aproximadamente 1 ng a aproximadamente 1000 µg por kg de peso corporal, suministrados como una dosis

simple o intermitentemente durante un período de hasta un mes

o más, y las rutas de aporte son preferiblemente mediante inyección parenteral, mediante inhalación oral o nasal, o mediante ingestión oral.

Descripción Detallada de las Realizaciones Preferidas

En términos generales, los compuestos de esta invención son sustancias químicas únicas que modulan la población de células T auxiliares hasta niveles óptimos en el huésped. Por ejemplo, la modulación del sistema inmunitario para incrementar el número de células T auxiliares incrementa la capacidad del organismo para hacer frente a infecciones de bacterias o virus. La modulación para incrementar el número de células T auxiliares también ayuda al cuerpo a luchar contra células cancerosas que se han hecho extrañas para el huésped. Alternativamente, estas sustancias también permiten al huésped ajustarse a enfermedades que surgen del desarreglo de procesos de autorreconocimiento en los que existe un ataque excesivo por las células T del huésped contra tejidos endógenos. En tales casos, los compuestos de la invención modulan la población de células T de modo que se mejoran los signos y los síntomas de enfermedades inflamatorias autodirigidas (autoinmunes) tales como artritis reumatoide y esclerosis múltiple.

“Bestim”, un acrónimo de la frase acuñada “best immunomodulator” (“mejor inmunomodulador”) es el nombre dado a una realización de una nueva clase de compuestos de los que trata la invención y que tienen propiedades inmunomoduladoras. No tiene toxicidad observable en dosis 500 a más de 500.000 veces superiores que la dosis inmunomoduladora. El propio compuesto Bestim tiene la estructura química de �-L-glutamil-L-triptófano. La nueva clase de moléculas inmunomoduladoras sintéticas tiene un resto de �-L-glutamilo, un resto de �-D-glutamilo, un resto de �-L-aspartilo o un resto de �-D-aspartilo en el extremo amino, según se ilustra por la Fórmula 1.

FÓRMULA 1

imagen1

En la Fórmula 1, n es 1 ó 2, R es hidrógeno, acilo o alquilo, y X es L-triptófano o D-triptófano. Restos acilo o 5 alquilo apropiados para “R” son: grupos alquilo ramificados o no ramificados de 1 a 6 carbonos, grupos acilo de 2 a 10 átomos de carbono y grupos de bloqueo tales como carbobenciloxi y t-butiloxicarbonilo. El carbono � marcado con un asterisco en la Fórmula 1 tiene una

10 estereoconfiguración, cuando n es 2, que es diferente de la estereoconfiguración de X. Incluidos como miembros de la nueva clase están compuestos tales como �-L-glutamil-Nin-formil-L-triptófano, Nmetil-�-L-glutamil-L-triptófano, N-acetil-�-L-glutamil-L

15 triptófano, �-D-glutamil-L-triptófano, �-L-glutamil-Dtriptófano, �-L-aspartil-L-triptófano y �-D-aspartil-Ltriptófano.

Los péptidos de Fórmula 1 pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con cualquier ácido orgánico o 20 inorgánico atóxico. Ácidos orgánicos ilustrativos que forman sales adecuadas incluyen ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico y sales metálicas de ácido tales como monohidrogenoortofosfato sódico e hidrogenosulfato potásico. Ácidos orgánicos ilustrativos que forman sales adecuadas 25 incluyen los ácidos mono-, di-y tri-carboxílicos. Ilustrativos de tales ácidos son, por ejemplo, acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, benzoico, hidroxibenzoico, fenilacético, cinámico, salicílico, 230 fenoxibenzoico y ácidos sulfónicos como ácido metanosulfónico y ácido 2-hidroxietanosulfónico. Sales de los grupos carboxílicos incluyen las sales de ácidos carboxílicos atóxicas formadas con cualesquiera bases inorgánicas u orgánicas adecuadas. Ilustrativamente, estas sales incluyen 35 las de metales alcalinos, como, por ejemplo, sodio y potasio,

metales alcalinotérreos, tales como calcio y magnesio, metales ligeros del Grupo IIIA incluyendo aluminio, y aminas orgánicas primarias, secundarias y terciarias, como, por ejemplo trialquilaminas, incluyendo trietilamina, procaína, dibencilamina, 1-etenamina, N,N-dibenciletilendiamina, dihidroabietilamina, (N-alquil(inferior)-piperidina y cualquier otra amina adecuada.

Se ha creído que la presencia del resto �-L-glutamilo o

�-aspartilo en los compuestos de la invención de Fórmula 1 confiere dos propiedades importantes: resistencia a la degradación por aminopeptidasas y potencia incrementada. Sin embargo, se ha encontrado que uno de los análogos de la invención, el �-D-glutamil-L-triptófano, tiene una actividad biológica incluso superior que Bestim y un intervalo de dosis más amplio. Esta realización particularmente preferida de la invención se denomina a veces “SCV-07”.

Toxicidad

Se efectuaron estudios de toxicidad aguda y subaguda en animales con Bestim de acuerdo con condiciones de buenas prácticas de laboratorio. Bestim, preparado como un polvo liofilizado estéril en ampollas, se disolvió en solución estéril de NaCl al 0,9% y se inyectó intramuscularmente en todos los experimentos.

Toxicidad aguda: Roedores (ratones y ratas) y perros se aleatorizaron en grupos de números iguales de machos y hembras. Los animales se inspeccionaron diariamente durante 14 días después de una sola dosis de Bestim (intramuscular):

ratones -5000,0 mg/kg

ratas -500,0 mg/kg

perros -500,0 mg/kg

El

peso corporal, la apariencia global y el

comportamiento

se evaluaron cada día y, al final de dos

semanas,

se efectuaron exámenes macroscópicos e

histopatológicos de los órganos internos (corazón, pulmones, cavidades pleural y peritoneal, músculos, estómago, intestino delgado y grueso, hígado, bazo, páncreas, riñones, vejiga, tiroides, cerebro, piel y testículos/ovarios) de todos los

animales.

No se observaron muertes en ninguno de los animales probados y los parámetros registrados de apariencia general, comportamiento, peso corporal, índices hematológicos, bioquímicos y fisiológicos y examen macroscópico e histopatológico de los órganos internos estaban todos dentro de los límites normales.

Estudios de Toxicidad Subaguda: En un segundo grupo de experimentos, se administró Bestim a lo largo de duraciones más prolongadas, de acuerdo con esto:

ratas: 1 mg/kg y 100 mg/kg, administrados intramuscularmente diariamente durante 3 meses y durante 6 meses

perros: 1 mg/kg, 10 mg/kg y 100 mg/kg, administrados intramuscularmente diariamente durante 1 mes y durante 3 meses.

La inyección repetida de Bestim en ratas no provocaba la

muerte

en ningún animal, ni producía cambios en el

comportamiento,

ni en los parámetros hematológicos,

bioquímicos

o fisiológicos. La apariencia morfológica de

todos los órganos a niveles macroscópicos e histológicos era normal. Ambas dosis en ratas inducían un ligero incremento en el peso corporal en los animales experimentales.

La inyección repetida de Bestim en perros no provocaba la muerte en ningún animal, ni producía cambios en los parámetros de comportamiento, peso corporal, hematológicos, bioquímicos o fisiológicos. El examen macroscópico e histológico de todos los órganos examinados no mostraba cambios significativos. No existían reacciones inflamatorias locales en la zona de inyección.

En conclusión, estas pruebas de toxicidad mostraban que Bestim está libre de propiedades tóxicas agudas o subagudas en roedores y perros. Las dosis probadas relativas a las dosis esperadas para ensayos terapéuticos eran del orden de

5.000.000 de veces para la administración simple y de 100 veces para la administración repetida.

También se determinó la toxicidad de cuatro péptidos (tres de los cuales eran de la invención) in vitro usando

timocitos múridos. Los timocitos se lavaron dos veces, se

resuspendieron en medio RPMI 1640, que contenía suero de

ternero fetal al 2%. La suspensión celular se puso en una

placa de 96 pocillos (lxlO6 células por pocillo). A

5 continuación, los péptidos (o vehículo para los pocillos de

control) se añadieron a los pocillos en concentraciones

deseables. Las células se incubaron con péptidos o vehículo

durante 4 horas a 37°C en una incubadora de CO2. Después de

la incubación, la viabilidad celular se calculó 10 microscópicamente usando tinción con eosina B. Los resultados

se muestran en la Tabla A.

TABLA A

Dosis de Péptido (�/ml)

Viabilidad Celular %

Comparativo �-D-Glu-D-Trp

100

94,7 ± 0,3*

10

97,3 ± 0,33

1

96,7 ± 0,88

0,1

98,3 ± 0,3

0,01

97,5 ± 0,5

Invención �-D-Glu-L-Trp

100

95,3 ± 0,88

10

96,7 ± 1,86

1

97,3 ± 1,2

0,1

96,7 ± 0,88

0,01

96,3 ± 0,67

Invención �-L-Glu-D-Trp

100

95,0 ± 1,15

10

95,3 ± 1,45

1

95,3 ± 0,67

0,1

97,0 ± 0,58

0,01

96,0 ± 0,58

Bestim �-L-Glu-L-Trp

100

96,7 ± 2,85

10

96,0 ± 0,58

1

97,7 ± 1,2

0,1

98,0 ± 1,0

0,01

97,0 ± 0,58

Control

97,0 ± 0,58

* -la diferencia es estadísticamente significativa en comparación con el control, p < 0,05

Sin embargo, se encontró que el péptido comparativo, �

D-glutamil-D-triptófano, reducía la viabilidad celular (Tabla A) y así era citotóxico a una dosis de 0,1 mg/ml.

Goldstein y Audhya (“Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies” en Thymopentin in Experimental and Clinical Medicine, Surv. Immunol. Res., 4, pp. 1-10, 1985)

introdujeron

el concepto de que los fármacos

inmunomoduladores

actúan para restaurar desequ ilibrios

inmunitarios,

ya sean los desequilibrios en estado

hiposensible o hipersensible. La actividad bidireccional de estos fármacos se produce debido a la naturaleza de la biorregulación en la que los desequilibrios se restauran hasta un punto de referencia de equilibrio. En el caso de la hiposensibilidad, la administración de hormonas que regulan linfocitos T actúa para optimizar y regular al alza la función del sistema de autodefensa de modo que los organismos no propios se rechacen más fácilmente. En el caso de la hipersensibilidad, la administración de fármacos inmunomoduladores parece amortiguar procesos autoinmunes en los que se disminuye ahora el ataque erróneo de entidades “propias” útiles. Las categorías de las aplicaciones clínicas de Bestim en estados inmunitarios hiposensibles e hipersensibles se analizan en los ejemplos esbozados.

Afecciones de Hiposensibilidad o Inmunodeficientes

Los estados de inmunodeficiencia están dentro de tres categorías etiológicas generales. En primer lugar, existe inmunosupresión que se produce como consecuencia de procesos de enfermedad. En segundo lugar, existen inmunodeficiencias que surgen debido a una terapia para otras enfermedades, llamadas inmunodeficiencias iatrogénicas. En tercer lugar, pueden resultar inmunodeficiencias del ataque directo de linfocitos T por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) que provoca el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida).

Procesos de enfermedad comunes que conducen a inmunodeficiencia son la malnutrición, las neoplasias, el envejecimiento y las infecciones. Las personas desnutridas, los pacientes con cánceres extendidos y las personas con

dolencias debilitantes enferman y mueren más a menudo debido a que las respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales deterioradas incrementan la susceptibilidad a infecciones por una variedad de organismos. Un estado de deficiencia generalizada en las respuestas inmunitarias se denomina anergia. Diversos tipos de infecciones, especialmente infecciones virales, conducen a inmunosupresión. Un fármaco tal como Bestim, capaz de hacer más robustos a los componentes linfocíticos auxiliares T, será un importante agente terapéutico para incrementar la resistencia del paciente a las infecciones. Por ejemplo, Bestim o sus análogos pueden:

--administrarse a pacientes, especialmente pacientes ancianos, antes o justo después de admisiones en hospitales para reducir los riesgos de infecciones nosocomiales (inducidas por hospitales), un problema clínico común y grave

--administrarse a victimas de quemaduras, debido a que tales individuos son especialmente propensos a infecciones

--administrarse a pacientes en prevención de infecciones epidémicas, por ejemplo, junto con vacunaciones contra influenza o vacunaciones contra hepatitis, para vigorizar la respuesta inmunitaria a patógenos

--administrarse a pacientes con infecciones virales asintomáticas, para mejorar la vigilancia inmunitaria de organismos patógenos y reducir la probabilidad de recaída de la enfermedad, por ejemplo, para individuos que son portadores de herpesvirus, virus de varicela, virus de hepatitis y VIH.

La inmunosupresión iatrogénica se debe lo más a menudo a terapias farmacológicas que bien destruyen o bien inactivan funcionalmente los linfocitos. Diversos fármacos quimioterapéuticos se administran a pacientes con cáncer y estos fármacos habitualmente son citotóxicos para linfocitos tanto maduros como en desarrollo así como para precursores de granulocitos y monocitos. Así, la quimioterapia del cáncer casi siempre está acompañada por un período de

inmunosupresión y riesgo de infecciones incrementado. El tratamiento del cáncer mediante radiación conlleva los mismos riesgos. Existen medicaciones (factor estimulante de colonias de granulocitos) para incrementar los neutrófilos en sangre para combatir infecciones que se producen después de la quimioterapia para el cáncer, pero actualmente no se usan medicaciones para restaurar las funciones linfocíticas. La cirugía principal, por ejemplo reparación de aneurismas u operaciones de baipás, también disminuye la función inmunitaria en seres humanos. Las razones de la caída en los linfocitos en sangre que se produce debido a cirugía principal no están claras, pero un agente que eleve las funciones de los linfocitos en tales pacientes tendrá valor terapéutico para disminuir la probabilidad de infecciones.

Una forma final de inmunosupresión adquirida que debe mencionarse resulta de la ausencia del bazo, provocada por la extirpación quirúrgica del órgano después de trauma o para el tratamiento de ciertas enfermedades hematológicas o como resultado de infarto en la enfermedad de células falciformes. Los pacientes sin bazo son más susceptibles de infecciones

por

algunos organismos, particularmente bacterias

encapsuladas

tales como Streptococcus pneumoniae.

Aparentemente,

el bazo se requiere para la inducción de

respuestas inmunitarias humorales protectoras a tales organismos. Bestim ayudará a los individuos sin bazo o sin timo en la resistencia contra una infección por microorganismos.

Datos relativos a los péptidos de la invención, así como varios métodos de síntesis, se ilustrarán ahora mediante los siguientes ejemplos, que pretenden ilustrar, pero no limitar, la invención.

EJEMPLO 1

Preparación de Compuestos de la Invención y Sus Composiciones Farmacéuticas Materiales y Equipo Reactivos. El éster �-bencílico de ácido Nbenciloxicarbonil-D-glutámico y el éster �-bencílico de ácido

N-benciloxicarbonil-L-glutámico se prepararon según se describe en Moore et ál., J. Chem. Soc., 2349 (1966), y el ptoluenosulfonato de éster bencílico de L-triptófano se preparó según se describe en Arai et ál., J. Org. Chem., 48, 121 (1983). El D-triptófano, la N-metilmorfolina, el cloroformiato de isobutilo, el catalizador de paladio-carbón vegetal (10%), la N-hidroxisuccinimida, la diciclohexilcarbodiimida, la N,N-dimetilformamida, el tetrahidrofurano y el acetonitrilo se adquirieron de Fluka, y el ácido trifluoroacético se adquirió de Merck.

Cromatografía en Capa Fina (TLC). Se realizó TLC ascendente sobre placas prerrevestidas Kieselgel 60 F254 (Merck) usando los siguientes sistemas disolventes (en vol.):

A, cloroformo/metanol/ácido acético 90:8:2;

B, 2-propanol/NH4OH al 25%/agua 50:5:15;

C, butanol/ácido acético/agua 3:1:1. Los péptidos se localizaron con luz UV, ninhidrina y J2.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Para todas las separaciones de HPLC se usó el mismo sistema disolvente: disolvente A -ácido trifluoroacético al 0,1% en agua y disolvente B -acetonitrilo.

Se llevaron a cabo comprobaciones analíticas en un cromatógrafo Gilson que consistía en dos bombas (Modelo 302), un automuestreador (Modelo 402), un espectrofotómetro (Modelo 116), Data Master (Modelo 621) y una columna analítica Zorbax ODS 4,6x150 mm, 5µ. Caudal -1 ml/min. El péptido se controló a 230 nm. Eluyente -gradiente lineal de B al 10-40% o 10-90% durante 20 min.

Se llevó a cabo purificación preparativa en un cromatógrafo Gilson que consistía en dos bombas (Modelo 303), un mezclador dinamométrico (Modelo 811), fracciones colectoras (Modelo 202), un espectrofotómetro (Holochrome) y una columna preparativa Zorbax ODS 21,2x250 mm, 8µ. Caudal 10 ml/min. El péptido se controló a 230 nm. Eluyente gradiente lineal de de B al 0-40% durante 80 min.

Resonancia Magnética Nuclear. Todos los espectros se registraron con un espectrómetro Brucker CPX-300 equipado con un ordenador Aspect 2000, que funcionaba en el modo de

transformación de Fourier con detección cuadrática a 300 MHz para protones. 50 mg de péptido se disolvieron en 0,5 ml de CD3OD en el que la señal residual de lH se tomaba como referencia a 3,35 ppm. A no ser que se especifique otra cosa, parámetros de adquisición típicos eran: temperatura ambiente, anchura espectral -4500 Hz, anchura del pulso -1 µs (6°), y 8192 puntos de datos en el dominio temporal. El procesamiento se realizó con 16384 consignaciones de puntos. Retraso de relajación -2s.

EJEMPLO lA

�-D-glutamil-L-triptófano Éster Dibencílico de N-Benciloxicarbonil-�-D-glutamil-Ltriptófano

Una solución de éter �-bencílico de ácido Nbenciloxicarbonil-D-glutámico (0,74 g, 2 mmol) y N-metilmorfolina (0,22 ml, 2 mmol) en tetrahidrofurano seco se enfría hasta -15°C. Se añade cloroformiato de isobutilo (0,28 ml, 2 mmol) y la mezcla se deja reposar a -10°C durante 3 minutos para la formación del anhídrido mixto. En ese momento, se añade una solución de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-triptófano (0,93 g, 2 mmol) y N-metilmorfolina (0,22 ml, 2 mmol) en tetrahidrofurano seco, (15 ml) enfriada hasta -5°C, y la mezcla de reacción se reservó en un refrigerador a aproximadamente 5°C. Al día siguiente, la solución se filtra de la sal, se lava mediante tetrahidrofurano seco (20 ml) y se evapora a vacío. El residuo se disuelve en acetato de etilo (50 ml), se lava con volúmenes iguales de agua, solución de H2SO4 2N, agua, solución de NaHCO3 al 5% y agua de nuevo. Se seca sobre Na2SO4 anhidro, se filtra del agente de secado y se concentra a vacío hasta aproximadamente 10 ml. Durante la dilución con

hexano

(50 ml) el producto se separa. Rendimiento 820 mg

(62%).

Rf (A) -0,75.

�-D-glutamil-L-triptófano

Una

solución de éster dibencílico de N

benciloxicarbonil-�-D-glutamil-L-triptófano (0,6 g, 0,9 mmol) en metanol (30 ml) se hidrogena sobre Pd/C (10%, 200 mg)

durante 5 horas. El catalizador se retira mediante filtración a través de carbón vegetal y el filtrado se evapora hasta sequedad. Rendimiento 260 mg.

El péptido obtenido se purifica por medio de HPLC

5 preparativa y se liofiliza. Rendimiento 190 mg. RF(B) -0,5, RF(C) -0,45. Según se apunta previamente, esta realización particularmente preferida se denomina a veces “SCV-07.”

TABLA 1

10 Desplazamientos Químicos de Protones (ppm) de �-D-glutamil-L-triptófano

Residuo

H� H� H� Otro

Trp

4,75 3,2-3,4 H4-7,65; H7-7,35; H2-7,15; H6-7,1; H5-7,05

Glu

3,65 2,4 2,1

TABLA 2

Desplazamientos Químicos de 13C (ppm) de �-D-glutamil-L-triptófano

Residuo

CO C� C� C� Otro

Trp

176,19 55,17 27,65 H4-111,08; H8-112,35; H11-119,25; H9-119,81; H10-122,38; H5-124,58; H7-128,76; H6-137,87

Glu

173,96 174,68 55,17 28,48 32,71

EJEMPLO 1B

�-L-glutamil-D-triptófano 20 Éster �-bencílico de N-Benciloxicarbonil-�-L-qlutamil-Dtriptófano

Una solución de éster �-bencílico de ácido N

benciloxicarbonil-L-glutámico (0,99 g, 2,6 mmol) y N

hidroxisuccinimida (0,3 g, 2,6 mmol) en N,N-dimetilformamida

25 (96 ml) se enfría en un baño de agua de hielo y se añade con remoción una solución de diciclohexilcarbodiimida (0,56 g,

2,7 mmol) en N,N-dimetilformamida (3 ml). La mezcla se remueve 1 hora a 0°C y durante la noche a temperatura ambiente. La N,N-diciclohexilurea separada se retira mediante filtración y se añaden al filtrado D-triptófano (0,64 g, 3,1 mmol) y trietilamina (0,46 ml, 3,3 mmol). La mezcla se remueve durante 16 horas a temperatura ambiente y se diluye mediante agua (50 ml). El aceite separado se extrae mediante acetato de etilo (3x20 ml) y la capa orgánica combinada se lava con solución de H2SO4 2N (2x20 ml) y agua (4x30 ml), se seca sobre Na2SO4, se filtra del agente de secado y se concentra a vacío hasta aproximadamente 10 ml. Durante la dilución con hexano (30 ml) el producto se separa. Rendimiento 1,2 g (81%). Rf(A) -0,7.

�-L-Glutamil-D-triptófano

Una solución de éster �-bencílico de Nbenciloxicarbonil-�-L-glutamil-D-triptófano (0,6 g, 0,9 mmol) en metanol (30 ml) se hidrogena sobre Pd/C (10%, 200 mg) durante 2 horas (control por TLC). El catalizador se retira mediante filtración a través de carbón vegetal y el filtrado se evapora hasta sequedad. Rendimiento 285 mg.

El péptido obtenido se purifica por medio de HPLC preparativa y se liofiliza. Rendimiento 180 mg. Rf(B) -0,5, Rf(c) -0,45.

El �-L-glutamil-D-triptófano tiene los mismos espectros de 1HNMRy 13CNMRqueel �-n-glutamil-L-triptófano.

EJEMPLO 1C

Síntesis en Fase Sólida de �-L-aspartil-L-triptófano

La molécula deseada se sintetizó usando poliestireno reticulado con divinilbenceno al 1% como soporte sólido. 0.1 g of de Na-terc-Boc-Ninformil-L-triptófano-resina de Merrifield (contenido de Trp 0,7 mmol/g de resina) se ponen en un recipiente de reacción. El programa de síntesis automatizada es como sigue.

TABLA 3

Esquema para la Síntesis de Péptidos Automatizada

Etapa

Reactivo Nº de Repeticiones Vol (ml) Tiempo (min)

1

TFA al 50% en CH2Cl2 2 5 2+30

2

CH2Cl2 6 8

2

3

DIEA al 5% en CH2Cl2 3 5 2

4

CH2Cl2 6 8 2

5

acoplamiento* 1 4 120

6

DMAA 2 8 2

7

2-propanol 2 8 2

8

CH2Cl2 2 8 1

9

Prueba de la ninhidrina** - - -

TFA -ácido trifluoroacético, DIEA -diisopropiletilamina, 5 DMAA -dimetilacetamida.

* el acoplamiento se llevó a cabo mediante el éster activo de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) que se preparó a partir de tres equivalentes de Boc-L-Asp-�-OBzl, HOBt y diciclohexilcarbodiimida (DCI) en DMAA durante 30

10 minutos sobre hielo. ** la terminación del acoplamiento se verificó mediante la prueba de la ninhidrina de Kaiser (Kaiser et ál., Anal. Biochem., 34:595, 1970). El acoplamiento incompleto se repitió una vez más.

15 El péptido se desprotegió y se separó del polímero con fluoruro de hidrógeno (HF) líquido que contenía anisol al 10% y m-cresol al 10% a 0°C durante 60 minutos. El HF se retiró a vacío a 0°C, el péptido se extrajo con ácido acético acuoso

20 al 30%, se lavó con éter etílico, se liofilizó y después de la desformilación con hidróxido sódico acuoso 0,2 N se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) preparativa.

Todos los análogos de Bestim pueden sintetizarse de 25 acuerdo con el mismo esquema que en el esquema de la Tabla 3 anterior, siendo la única diferencia el uso de diferentes

derivados de Boc en la fase 5. Verificación de la Síntesis

Por ejemplo, Bestim se caracterizaba por:

1.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), usando un cromatógrafo Gilson (Francia), eluyente TFA al 0,1%/acetonitrilo, gradiente 10-40%, paso 14 min, columna Delta-Pack C-18, 300�, 5 µm, 3,9x150 mm. El tiempo de retención del producto era 8,1 min y su pureza, medida como el área integrada bajo el pico de HPLC, era 99,7%.

2.

Análisis de aminoácidos: usando un analizador de aminoácidos de LKB Alpha Plus 4151, el producto se hidrolizó en ácido metanosulfónico 4N, que contenía 0,2% de triptamina, a vacío, a 115°C, 24 horas. El contenido en el péptido de ácido glutámico 1,0, triptófano 0,94, confirmando la presencia de los residuos deseados.

3.

Cromatografía en capa fina (TLC): sistema I -nbutanol:acetato de etilo:ácido acético:agua = 1:1:1:1, Rf = 0,72; sistema 2-sec-butanol:ácido acético:tolueno:agua = 6:1:2:1, Rf=0,4.

4.

Espectrometría de resonancia magnética nuclear (NMR): espectrómetro de NMR Bruker GXP-300 equipado con un ordenador Aspect 200. En el espectro de NMR de carbono del péptido (0,001 M/l de solución) se detectaron: para Glu -a 30,0; 31,0; 57,2; 176,6; 178,3 ppm; para Trp -a 35,7; 58,3; 113,1; 116,6; 123,4; 124,3; 126,6; 129,0; 131,0; 140,3; 179,4 ppm.

5.

Espectrometría con bombardeo rápido de átomos (FAB-MS), ion molecular: calculado, 334,13 Da; encontrado 333,73.

La preparación de los compuestos de la invención en una forma de sal farmacéuticamente aceptable se ilustra mediante el Ejemplo 1D posterior, seguido por la formulación de comprimidos que se describe en el Ejemplo 1E.

EJEMPLO 1D

Preparación de Sal Sódica de H-�-D-Glu-L-Trp

Éster �-bencílico de N-benciloxicarbonil-�-D-Glu-L-Trp (5 g, 0,087 M) se disolvió en metanol (40 ml) y se añadió NaHCO3 (0,73 g, 0,087 M). El aire se desplazó mediante una

corriente lenta de nitrógeno y se añadió catalizador de paladio sobre carbón vegetal al 10% (2,5 g en 30 ml de agua). Una vez más, una corriente lenta de nitrógeno se condujo a través del matraz y a continuación se inició la introducción de una corriente lenta de hidrógeno. El catalizador se mantuvo en suspensión mediante remoción vigorosa. En 4 horas, el catalizador se retiró mediante filtración y se lavó mediante metanol (10 ml). El filtrado se evaporó a vacío y el residuo se trituró con acetonitrilo. El producto sólido se recogió sobre un filtro, se lavó con acetonitrilo y se secó a vacío.

Rendimiento: 2,14 g (70%).

EJEMPLO 1E

Formulación de Comprimidos

El péptido de la invención del Ejemplo 1A (�-D-glutamilL-triptófano) se formuló en comprimidos bien con 98,9% de glicina, 1% de estearato magnésico y 0,1% de péptido de la invención, o bien con 94,9% de glicina, 5% de almidón y 0,1% de péptido de la invención. Cada comprimido de 100 mg contenía 100 µg del análogo de la invención.

EJEMPLO 2

Estudios de Bestim y Análogos de Bestim In Vivo

Influencia sobre la Producción de Interleuquina 2 (IL-2)

Especie: Ratón (cepa CBA).

Ensayo: Los péptidos �-L-Glu-L-Trp (Bestim) y �-D-Glu-L-Trp (análogo de Bestim) se administraron a ratones por vía oral en una forma de solución acuosa a diferentes dosis indicadas en la tabla una vez al día durante 5 días consecutivos. Se usaron cinco animales para cada dosis de péptido. 48 más tarde, los bazos se extirparon y células del bazo se cultivaron durante 24 horas adicionales in vitro en presencia del inductor de la producción de IL-2 ConA (5 µg/ml) en medio RPMI-1640 suplementado con suero de ternero fetal al 10% en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos. Los niveles de IL-2 en los sobrenadantes se midieron en el bioensayo usando la línea celular dependiente

de IL-2 múrida CTLL-2 (Gillis et ál., 1978).

TABLA 4

Efecto de Bestim y sus Análogos sobre la Producción de IL-2 por Células de Bazo Múridas

Dosis de péptido (�g/kg)

�-D-Glu-L-Trp (SCV-07) �-L-Glu-L-Trp (Bestim)

10,0

132,2±9,3* 56,7±4,5

0,1

129,2±9,8* 47,2±8,9

0,001

103,4±7,5* 115,9±8,6*

0,00001

85,9±5,0* 65,2±6,2

Control

68,3±4,9 68,3±4,9

* diferencia significativa con el control, p<0,05

Conclusión: El péptido �-D-Glu-L-Trp (Análogo de Bestim

10 de la invención) tenía una actividad biológica superior en comparación con la de Bestim. Se observó inducción de IL-2 en un intervalo de dosis más amplio, y en dosis altas este análogo no daba disminución en la inducción de IL-2.

15 EJEMPLO 3 Influencia sobre la Expresión de Antígeno Thy-1 por Precursores de Células T de la Médula Ósea de Múridos Protocolo: Se obtuvieron células de médula ósea de fémures de ratones CBA incubados con péptidos in vitro en

20 placas de microvaloración (Terasaki) en medio de Eagle durante una hora a 37°C. La expresión del antígeno Thy-1 se determinó mediante un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento usando anticuerpos anti-Thy-1.

25

30

TABLA 5A

Cambios en los Números de Células que Expresan Antígeno Thy-1 en Médula Ósea de Múrido Cultivada en Presencia de Análogos Peptídicos de la Invención

Concentración de

Células que Expresan Antígeno Thy-1 (%)

Péptido (�g/kg)

�-L-Glu-D-Trp �-D-Glu-L-Trp (SCV-07) �-L-Glu-L-Trp (Bestim)

10,0

39,4±2,2 63,6±4,2 35,0±3,0

1,0

44,3±5,4 47,3±1,6 39,6±4,6

0,1

42,2±4,4 38,4±4,4 38,5±2,8

0,01

35,6±4,1 36,3±4,9 38,0±3,1

0,001

40,0±1,6 37,6±1,2 32,2±2,8

0,0001

33,7±2,8 37,2±2,6 30,0±2,4

0,00001

29,4±1,7 36,2±3,2 24,0±2,0

Control

14,7±2,4

5 Se observó una diferencia significativa con el control, p<0,05.

Conclusión: El péptido de la invención �-D-Glu-L-Trp tenía la actividad más alta en comparación con la actividad 10 de Bestim y otro análogo de la invención, �-L-Glu-D-Trp.

TABLA 5B

Cambios en los Números de Células que Expresan Antígeno Thy-1 en Médula Ósea de Múrido Cultivada en Presencia de 15 Péptidos de la Invención

Concentración de Péptido (�g/kg)

Números de células que expresan antígeno Thy-1 (%)

Péptido 1**

Péptido 2 Péptido 3

10,0 1,0 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001

55,4±2,4* 51,4±2,6* 49,4±2,3* 35,7±2,1* 14,9±1,7 12,7±1,9 12,3±1,6 44,8±4,0* 42,5±3,6* 22,5±2,8 18,2±2,3 16,4±1,9 17,9±2,1 15,6±2,0 41,9±3,2* 38,0±2,9* 33,9±2,1* 27,3±2,1* 13,0±1,3 12,9±1,4 13,4±1,7

Control

13,9±1,9

Concentración de Péptido (�g/kg)

Números de células que expresan antígeno Thy-1 (%)

Péptido 4**

Péptido 5

10,0 1,0 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001

41,2±4,0* 39,2±4,1* 37,1±3,6* 36,3±2,9* 25,6±2,8 24,2±2,9 23,0±2,7 66,3±4,5* 64,3±4,4* 57,0±4,0* 54,0±3,9* 40,0±4,1* 29,0±2,8* 14,0±1,8

Control

14,8±2,1

* -diferencia significativa con el control, � < 0,05.

** -los péptidos usados eran:

5 1. beta-L-aspartil-L-triptófano

2.

acetil-gamma-D-glutamil-L-triptófano

3.

beta-D-aspartil-L-triptófano

4.

gamma-D-glutamil-L-triptofanoamida

5. gamma-D-glutamil-L-triptófano (SCV-07) 10

EJEMPLO 4

Actividad Biológica de Análogos de Bestim In Vitro Péptidos: Bestim y varios análogos de la invención se prepararon en forma liofilizada. Justo antes del experimento,

15 todos los péptidos se solubilizaron en agua para preparar soluciones con diferentes concentraciones de sustancia. Influencia sobre la Producción de IL-2 en Cultivo

Protocolo. Los bazos de ratones CBA se extirparon, los esplenocitos se aislaron y se cultivaron en medio RPMI-1640 20 suplementado con suero de ternero fetal al 10% en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos. La producción de IL-2 se indujo con 5 µg/ml de Con A en un cultivo de 24 horas. Se añadieron péptidos en las concentraciones deseadas a los cultivos celulares en un tiempo “0”. Los niveles de IL-2 en 25 los sobrenadantes de cultivo se determinaron usando la línea

celular CTLL-2 dependiente de IL-2 (Gillis et ál., 1978).

TABLA 6

Cambios en la Producción de IL-2 Inducida por Con-A por Células de Bazo de Múrido en Presencia de Análogos de Bestim

Concentración de

Nivel de IL-2 en los Sobrenadantes (UI/ml)

Péptido (�g/kg)

�-L-Glu-D-Trp �-D-Glu-L-Trp (SCV-07) �-L-Glu-L-Trp (Bestim)

10,0

62,8±3,2* 65,5±3,7* 59,9±3,0*

1,0

57,4±4,8 80,9±6,7* 61,4±3,3*

0,1

57,9±3,2 87,2±7,1* 57,3±4,0

0,01

59,9±4,5 73,8±6,3* 56,6±3,7

0,001

60,4±5,9 65,9±4,0* 54,7±3,2

0,0001

52,6±5,0 47,9±3,4 53,2±3,3

Control

50,1±3,7 50,1±3,7 50,1±3,7

5

* diferencia significativa con el control, p<0,05.

EJEMPLO 5

Cambios en el Sistema Inmunitario de los Pacientes 10 después de la Aplicación por Vía Oral

Cualquiera de las dos formulaciones de comprimidos

descritas en el Ejemplo lE se suministró a dos pacientes con

cáncer un mes después de la operación quirúrgica.

Primer Caso de Estudio 15 Paciente: “Eg”

Diagnóstico: Cáncer de colon

Terapia previa: Cirugía

Terapia con SCV-07: aplicación de un comprimido por vía

oral en 5 días (0,1 mg al día). 20

25

TABLA 7

Datos sobre los Cambios de Parámetros Inmunitarios en el Paciente “Eg” que Recibe Terapia por Vía Oral con Comprimidos de SCV-07

Parámetros Inmunitarios

Antes del Tratamiento 2 semanas después del final del tratamiento de 5 días

Conteos de linfocitos en sangre (%):

CD3

51,2 ± 1,1 55,4 ± 1,3

CD4

26,2 ± 1,0 29,7 ± 1,5

CD8

23,1 ± 1,3 24,1 ± 1,6

relación CD4/CD8

1,13 1,23

CD20

20,8 ± 1,4 20,4 ± 1,1

Índice de migración de neutrófilos

2,35 2,46

Reducción de neutrófilos con nitroazul tetrazolio (U):

espontánea

675 ± 23 1031 ± 49

inducida por PMA

6459 ± 132 6950 ± 175

Segundo Caso de Estudio Paciente: “Ar”

5 Diagnosis: Cáncer de colon Terapia previa: Cirugía Terapia con SCV-07: aplicación de un comprimido por vía

oral en 5 días (0,1 mg al día).

10

TABLA 8

Datos sobre los Cambios de Parámetros Inmunitarios en el Paciente “Ar” que Recibe Terapia por Vía Oral con Comprimidos de SCV-07

Parámetros Inmunitarios

Antes del Tratamiento 2 semanas después del final del tratamiento de 5 días

Conteos de linfocitos en sangre (%):

CD3

46,3 ± 1,4 59,2 ± 1,3

CD4

23,4 ± 1,2 31,0 ± 1,7

CD8

23,5 ± 1,1 27,1 ± 1,9

relación CD4/CD8

1,0 1,14

CD20

11,4 ± 1,0 14,3 ± 0,9

Índice de migración de neutrófilos

1,25 3,07

Reducción de neutrófilos con nitroazul tetrazolio (U):

espontánea

401 ± 38 1646 ± 97

inducida por PMA

5007 ± 245 5111 ± 304

La influencia del péptido de la invención �-D-glutamilL-triptófano sobre la actividad funcional de leucocitos 5 neutrofílicos humanos se determinó de acuerdo con los cambios en el nivel de producción de radicales libres oxígeno usando el ensayo de quimioluminiscencia espontánea dependiente de luminol (Muto et ál., 1986). Muestras de la sangre entera del donante se insertaron en cubetas de trabajo del 1251 10 Luminometer (LKB) junto con péptidos diluidos en solución salina en una concentración indicada en la tabla. Se añadió luminol a cada cubeta y las cubetas se incubaron durante 10 min. Después de esto, las cubetas se incubaran en los pocillos del luminómetro durante 40 min a 37°C y con 15 agitación constante. La cantidad de radicales superóxido desarrollados se calculó usando el programa informático

“Lumina” y se expresó como suma de luz durante 40 min (mV/min). Cada muestra se estudió por triplicado.

TABLA 9

Influencia del Péptido sobre la Quimioluminiscencia de Neutrófilos Potenciada por Luminol en Cultivo de Células de Sangre Entera Humana

Péptido de la

Quimioluminiscencia en células no estimuladas Quimioluminiscencia en células activadas con PMA

Invención (�g/ml)

Valor máximo (mV) Suma de luz40 min (mV/min) Valor máximo (mV) Suma de luz40 min (mV/min)

1,0 0,1 0,01 Control

0,71 ± 0,02 0,72 ± 0,02 0,73 ± 0,04 0,66 ± 0,07 25,7 ± 0,13 27,2 ± 0,93 27,9 ± 0,85 25,2 ± 0,09 3,40 ± 0,06* 2,57 ± 0,40 3,03 ± 0,99 2,90 ± 0,12 75,9 ± 1,5* 60,3 ± 0,8 63,0 ± 0,7 64,9 ± 4,0

* -diferencia significativa con el control, P < 0,05

10 Estudios de la Influencia de los Péptidos de la Invención sobre la Quimiotaxis de Leucocitos Humanos

El ensayo quimiotáctico se llevó a cabo usando la técnica de migración en agarosa descrita por Nelson et ál. 15 (1972). Se disolvió agarosa en medio de cultivo 199 suplementado con suero de ternero fetal al 10% hasta una concentración final 1%. Esta mezcla se transfirió a un plato de cultivo tisular y se dejó gelificar. Se cortó en el gel una serie de pocillos de 2 mm de diámetro y separados 3 mm. 20 Se añadieron 10 µl de neutrófilos (2,5 x 106 células por ml) al pocillo central. Otros pocillos se rellenaron en una cara con medio para medir la migración aleatoria, mientras que los de la otra cara se rellenaron con factor quimiotáctico FMLP a

10-7

M, para medir la migración estimulada. Los platos se

25 incubaron en una incubadora de CO2 durante 120 min. Péptidos a las concentraciones deseadas se añadieron a los pocillos en un tiempo “0”. La migración celular se leyó bajo el microscopio con una microbalanza y se expreso como índice quimiotáctico: migración estimulada/migración

30 aleatoria.

TABLA 10

Péptidos**

Concentración de péptido, �g/ml

100

10 1

1 2 3 4 5 6

1,47 ± 0,04 1,73 ± 0,07 2,17 ± 0,17* 2,13 ± 0,34 2,50 ± 0,30 2,19 ± 0,30 1,75 ± 0,25 1,79 ± 0,01 1,78 ± 0,20 1,71 ± 0,15 1,77 ± 0,17 1,93 ± 0,29 1,71 ± 0,20 2,33 ± 0,17* 1,73 ± 0,10 1,75 ± 0,13 1,81 ± 0,11 1,61 ± 0,15

Control

1,77 ± 0,05

* -diferencia significativa con el control, � < 0,05.

** -los péptidos usados eran:

5 1. beta-L-aspartil-L-triptófano

2.

acetil-gamma-D-glutamil-L-triptófano

3.

beta-D-aspartil-L-triptófano

4.

gamma-D-glutamil-L-triptofanoamida

5.

gamma-D-glutamil-L-triptófano (SCV-07)

10 6. gamma-D-glutamil-L-triptamina

Estudios de la Influencia de los Péptidos de la Invención sobre la Fagocitosis de Leucocitos Humanos Leucocitos neutrofílicos humanos obtenidos de sangre de

15 donante mediante separación de Ficoll-Pack se transfirieron a tubos tratados con silicona a una concentración 2 x 106 células por ml en medio de cultivo de Eagle suplementado con suero de ternero fetal al 10%. Células de levadura opsonizadas con sueros humanos se usaron como un objetivo de

20 la fagocitosis. Las células de levadura se añadieron a los tubos (10 células de levadura por 1 neutrófilo) y la suspensión celular se incubó en una incubadora de CO2 durante 40 min. Después de esto, las células se lavaron mediante centrifugación, se prepararon frotis celulares sobre

25 portaobjetos de vidrio y se tiñeron mediante colorante de Giemsa. Las células fagocíticas se calcularon bajo el microscopio.

TABLA 11

Péptidos**

Concentración de péptido, �g/ml

100

10 1

1 2 3 4 5 6

33,3 ± 1,2* 34,3 ± 1,2* 22,3 ± 1,9 20,7 ± 5,2 25,0 ± 1,4* 19,0 ± 2,3 36,0 ± 7,5* 29,5 ± 0,5* 21,0 ± 5,0 18,0 ± 2,7 25,7 ± 2,7* 22,0 ± 4,0 32,3 ± 1,8* 30,0 ± 1,1* 23,0 ± 5,6 16,7 ± 2,7 17,0 ± 1,0 22,0 ± 3,0

Control

16,7 ± 1,5

* -diferencia significativa con el control, � < 0,05. ** -los péptidos usados eran:

5 1. beta-L-aspartil-L-triptófano

2.

acetil-gamma-D-glutamil-L-triptófano

3.

beta-D-aspartil-L-triptófano

4.

gamma-D-glutamil-L-triptofanoamida

5.

gamma-D-glutamil-L-triptófano (SCV-07)

10 6. gamma-D-glutamil-L-triptamina

Influencia de los Péptidos de la Invención sobre la

Proliferación de Timocitos de Rata In Vitro

Cultivos por triplicado de timocitos de ratas blancas

15 endógamas en 5 x 106 por ml se cultivaron durante 72 horas en una incubadora de CO2 en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo plano en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal desactivado térmicamente al 1%, L-glutamina 2 mM, 80 µg/ml de gentamicina, 5 µg/ml de polimixina B y 0,5 µg/ml de

20 concanavalina A. Dieciséis horas antes del final del período de cultivo se marcaron pulsátilmente con 3H-timidina. Las células se recogieron sobre filtro de fibra de vidrio con un recogedor de células Titertek y se contaron en un contador de centelleo de líquidos beta. La velocidad de proliferación se

25 expresó como conteos por minuto.

TABLA 12

Concentración de Péptido (�g/kg)

Velocidad de proliferación (conteos por min)

Péptido 1

Péptido 2 Péptido 3

1,0 0,1 0,01 0,001 0,0001

58720 ± 2340* 53110 ± 485 46590 ± 1190 55010 ± 5350 51230 ± 2030 52300 ± 2490 53340 ± 1590 51950 ± 5910 56790 ± 1880* 52080 ± 1880 49700 ± 790 50190 ± 1780 56510 ± 3970 55530 ± 2750 51430 ± 2050

Control

49000 ± 1420

Concentración de Péptido (�g/kg)

Velocidad de proliferación (conteos por min)

Péptido 4

Péptido 5

1,0 0,1 0,01 0,001 0,0001

53330 ± 1370 48690 ± 1790 48100 ± 1950 50740 ± 2190 50960 ± 1050 49420 ± 1210 53180 ± 1910 59480 ± 2250* 61340 ± 2340* 57880 ± 1560*

Control

49000 ± 1420

* -diferencia significativa con el control, � < 0,05. 5 ** -los péptidos usados eran:

1.

beta-L-aspartil-L-triptófano

2.

acetil-gamma-D-glutamil-L-triptófano

3.

beta-D-aspartil-L-triptófano

4.

gamma-D-glutamil-L-triptofanoamida

10 5. gamma-D-glutamil-L-triptófano (SCV-07)

En conclusión, los péptidos de la invención tienen propiedades inmunoestimulantes y pueden estimular la producción de IL-2 por linfocítos esplénicos, inducir la

15 maduración de linfocitos T precursores y estimular la proliferación de células T. En particular, se muestra que el péptido preferido de la invención �-D-Glu-L-Trp (SCV-07) incrementa la función inmunitaria a través de la estimulación de la actividad funcional de leucocitos neutrofílicos,

especialmente la fagocitosis y la producción de radicales oxígeno. Se muestra que los péptidos de la invención, particularmente SCV-07, incrementan los números de linfocitos T totales y linfocitos T auxiliares y la relación CD4/CD8 en

5 sangre periférica. Finalmente, se ha mostrado que los péptidos de la invención, particularmente SCV-07, estimulan la migración de leucocitos neutrofílicos humanos y la actividad bactericida.

Se entiende que aunque la invención se ha descrito

10 anteriormente junto con realizaciones específicas preferidas, la descripción y los ejemplos están destinados a ilustrar y no a limitar el alcance de la invención, que está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto con al menos dos residuos de aminoácido y que tiene la estructura de Fórmula 1:

   Fórmula 1

   imagen1

   donde n es 1 ó 2, R es hidrógeno, un acilo que tiene 2 a 10 átomos de carbono o un alquilo que tiene de 1 a 6 carbonos, y X es L-triptófano o D-triptófano, y en la que el carbono �

   10 marcado con un asterisco en la Fórmula 1 tiene una estereoconfiguración, cuando n es 2, que es diferente de la estereoconfiguración de X.
2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X es L-triptófano.

   15 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X es D-triptófano.

3. 4. Un compuesto de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

   20 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es �-D-glutamil-L-triptófano.

4. 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es �-L-aspartil-L-triptófano.
5. 7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 25 que es �-D-aspartil-L-triptófano.

6. 8.

   Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es acetil-gamma-D-glutamil-L-triptófano.

7. 9.

   Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es gamma-D-glutamil-L-triptofanoamida.

   30 10. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con cualquier reivindicación precedente mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. 11. El uso de un compuesto en una forma

   farmacéuticamente aceptable que tiene la estructura de 35 Fórmula 1:

   Fórmula 1

   imagen1

   donde n es 1 ó 2, R es hidrógeno, un acilo que tiene 2 a 10 átomos de carbono o un alquilo que tiene de 1 a 6 carbonos y 5 X es L-triptófano o D-triptófano, y en la que el carbono � marcado con un asterisco en la Fórmula 1 tiene una estereoconfiguración, cuando n es 2, que es diferente de la estereoconfiguración de X, para la fabricación de un medicamento para tratamiento terapéutico inmunomodulador para

   10 administrar a un paciente una dosis en el intervalo de aproximadamente 1 ng a aproximadamente 1000 �g por kg de peso corporal de dicho compuesto Fórmula 1.
9. 12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el medicamento está en una forma para la administración

   15 como una sola dosis o una pluralidad de dosis suministradas intermitentemente.
10. 13. El uso de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el medicamento está en una forma para la administración mediante inyección parenteral,

    20 inhalación oral o nasal o ingestión oral.
11. 14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el compuesto de Fórmula 1 es como se define en la reivindicación 3.
12. 15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las

    25 reivindicaciones 11 a 13, en el que el compuesto de Fórmula 1 es �-D-glutamil-L-triptófano.
13. 16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la administración es eficaz para modular el sistema inmunitario de un paciente.