PT1042286E - Compostos imunomoduladores contendo grupos gama-glutamilo e beta-aspartilo e métodos para os preparar - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSTOS IMUNOMODULADORES CONTENDO GRUPOS GAMA-GLUTAMILO E BETA-ASPARTILO E MÉTODOS PARA OS PREPARAR"

Domínio da Invenção A invenção diz em geral respeito a compostos imunoestimulantes, e diz respeito mais em especial e compostos imunoestimulantes que incluam quer uma espécie γ-L-glutamilo, γ-D-glutamilo, β-L-aspartilo, ou β-D-aspartilo que estimule a maturação e a diferenciação de determinadas classes de células brancas do sangue no corpo.

Esta estimulação selectiva da diferenciação e de proliferação de células brancas do sangue aumenta as defesas do corpo contra organismos que provocam doenças e também modula e melhora as condições auto-inflamatórias.

Estado da técnica anterior à invenção 0 sistema imunológico é uma rede de células adaptadas para protegerem o organismo contra patogénicos e contra células que não sejam reconhecidas como "próprias". Uma vez activado o sistema imunológico, ele conta com a participação de várias células e moléculas diferentes para montar uma função de actuação concebida para eliminar a 2 ΡΕ1042286 entidade "não própria" de dentro do corpo. Os linfócitos são células do sistema imunológico que são especificamente capazes de reconhecer e de eliminar selectivamente entidades estranhas. Em contraste com outras células do sistema imunológico, tais como os neutrófilos que se consideram não específicos nas suas reacções contra invasores, as caracte-rísticas dos linfócitos conferem especificidade, diversidade, memória e capacidade de reconhecimento de entidades próprias/não próprias à reacção imunológica.

Existem duas populações principais de linfócitos: os linfócitos B e os linfócitos T. Os linfócitos B provêm da medula óssea na qual amadurecem, e são responsáveis pela formação de moléculas de anticorpos.

Os linfócitos T também provêm da medula óssea mas amadurecem no timo. Existem duas subpopulações principais de células T: as células T ajudantes e as células T citotóxicas. Podem distinguir-se os dois tipos de células T pela presença de uma ou duas glicoproteínas membranares, quer a CD4 quer a CD8.

As células T ajudantes (que expressam CD4), quando são activadas por complexos com antigénios (moléculas não próprias acopladas a proteínas especiais) reagem segregando diversos factores de crescimento que se designam colectivamente como citoquinas. Estas citoquinas são sinais que activam outras células do sistema imunológico, incluindo as células T citotóxicas. As células T citotóxicas (que 3 ΡΕ1042286 expressam CD8), quando activadas, proliferam e diferenciam-se em linfócitos T citotóxicos (CTL), que são capazes de monitorizar e eliminar do corpo células patogénicas, células estranhas, células infectadas com virus, e células tumorais. 0 desenvolvimento normal, a maturação e a diferenciação de linfócitos T são regulados por hormonas peptidicas segregadas por células do timo. Uma dessas hormonas é o resíduo peptídico com 49 aminoácidos, a timopoietina. Os resíduos 32-36 da timopoietina, Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, retêm as actividades biológicas da timopoietina, e constituem a base de um fármaco imunomodulatório denominado timopentina. Incluem-se nas aplicações da timo-pentina a sua utilização para tratar a artrite reumatóide, estados dermatológicos, infecções por bactérias, vírus e fungos, a inversão da depressão imunológica devida à cirurgia ou à terapia do cancro, a potenciação de reacções à vacina contra o vírus da hepatite B, e o tratamento da síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA), um estado no qual células T ajudantes (CD4) são especificamente atacadas pelo vírus (Christian, J. S., "A Review of the Pharma-cology, Clinicai Applications, and Toxicology of Thymo-pentin", Transgenica: The Journal of Clinicai Biotechno-logy, 1, páginas 23-34,1994).

Um segundo composto com propriedades semelhantes às da timopoietina é o dipéptido, Glu-Trp, que se denomina timogénio. 4 ΡΕ1042286 A sequência -Glu-Trp ocorre também na molécula que é a precursora para a síntese da timopoietina; -Glu-Trp- não é parte da hormona com 49 aminoácidos e este dipéptido também não é reconhecido como sendo um contri-butor para a actividade biológica das timopoietinas. 0 timogénio foi descoberto e principalmente utilizado na Rússia, para a profilaxia e o tratamento de infecções. Utilizou-se o timogénio para incrementar a função imuno-lógica depois de lesões nos linfócitos devidas a uma exposição acidental à irradiação em resultado do incidente de Chernobyl. (Khavinson et ai., WO 92/17.191 e WO 93/08.815, "Pharmaceutical Dipeptide Compositions and Methods of Use Thereof").

Ocorrem naturalmente em todo o corpo péptidos derivados de γ-L-Glutamilo, sendo o tripéptido glutationa o exemplo mais bem conhecido. Também se têm utilizado a título de candidates a fármacos moléculas derivadas de γ-L-glutamilo. Estes candidatos são denominados "pro-fármacos" porque a espécie γ-L-glutamilo é utilizada a título de veículo para a parte activa da molécula. Por exemplo, ο γ-L-glutaminil-4-hidroxi-3-iodobenzeno apresenta actividade anti tumoral em linhas de células de melanoma humano e de ratinho. Pensa-se que as actividades anti tumorais deste composto se devem à libertação enzimática de 4-hidroxi-3-iodobenzeno na vizinhança das células de tumor (Prezioso et al., "γ-Glutamyltranspeptidase Expression Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodrug γ- 5 ΡΕ1042286 glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene", International Journal of Câncer, 56, páginas 874-879, 1994). Para além disto, a γ-L-glutamil-dopamina e o y-L-glutamil-5-hidroxi-triptofano foram descritos como pró-fármacos susceptiveis de transportar e fornecer a dopamina e o 5-hidroxi-triptofano aos neurónios do cérebro (Likamwa et al., "The Antinatriuretic Action of y-L-glutamyl-5-hydroxy-L-tryptophan is Dependent on its Decarboxylation to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain", British Journal of Clinicai Pharmacology, 387: 265-269, 1994) .

No documento de PCT WO 96/40.740, publicado a 19 de Dezembro de 1996, os inventores Deigin e Korotkov descrevem péptidos com a fórmula X-A-D-Trp-Y (I), em que: A = D-Glu ou ácido D-isoglutâmico (D-iGlu); X = H, Gly, Ala, Leu, Ile, Vai, Nva, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nva, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, ácido y-aminobutírico ou ácido ε-aminocapróico; Y = Gly, Ala, Leu, Ile, Vai, Nva, Pro, Try, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nva, D-Pro, D-Try, D-Phe, D-Trp, ácido y-aminobutirico, ácido ε-aminocapróico, OH, ou um grupo alquilamino substituído com 1-3 C. Afirma-se que os compostos (I) possuem actividade imuno-supressora (por exemplo inibindo a proliferação de células de baço) e que são úteis em medicina humana e veterinária e em bioquímica experimental.

No WO 97/19.691 descreve-se uma classe de moléculas imunomoduladoras sintéticas que possuem a estrutura: ΡΕ1042286 6 α β Υ R-—ÍIH—ÇH“—CHj“-€H} η cooa Ί' em que R é hidrogénio, acilo ou alquilo, e X é um aminoácido aromático ou heterocíclico, ou um derivado destes.

Incluem-se nos exemplos de compostos o y-L-glutamil-L-triptofano (Bestim), o N-metil-y-L-glutamil-L-triptofano, o N-acetil-y-L-glutamil-L-triptofano, o y-L-glutamil-Nin-formil-L-triptofano, e a y-L-glutamil-p-tienil-D-alanilamida.

De acordo com a invenção presente proporciona-se um composto com pelo menos dois resíduos de aminoácidos que apresenta uma estrutura com a Fórmula 1: Fórmula 1

} n-C~X

COOU O na qual n é 1 ou 2, Ré hidrogénio, um acilo com 2 a 10 átomos de carbono, ou um alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, e X é L-triptofano ou D-triptofano, e em que o átomo de carbono em α denotado por um asterisco na Fórmula 1 tem uma configuração estereoquímica, quando n é 2, 7 ΡΕ1042286 diferente da configuração estereoquímica de X. Uma concretização especialmente preferida é o γ-D-glutamil-L-triptofano. os péptidos coma Fórmula 1 podem formar sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico com qualquer ácido não tóxico, orgânico ou inorgânico. Incluem-se nos sais de grupos carboxilicos os sais com ácidos carboxilicos não tóxicos formados com bases adequadas orgânicas ou inorgânicas. 0 Bestim tem uma actividade imunoestimuladora potente quando é testado em diversos sistemas de ensaio experimental in vitro e in vivo. 0 mecanismo da sua acção biológica relaciona-se com a indução da diferenciação dos precursores de linfócitos T da medula óssea, com a estimulação da proliferação dos linfócitos, e com o aumento da produção de diversas citoquinas, incluindo a interleu-cina 2. O resultado liquido do efeito farmacológico do Bestim é um aumento selectivo do número de linfócitos T ajudantes, isto é, de células que contêm o marcador CD4.

Em ensaios pré clínicos de Bestim demonstrou-se a sua actividade imunoestimuladora a concentrações sub-nanomolares. Ele actua in vivo a doses de entre 10 ng e 1 μρ por kg de peso corporal e não apresenta qualquer toxicidade observável a doses entre 500 e um milhão de vezes mais elevadas do que a dose imunoestimuladora. Em estudos em animais, o Bestim é activo após administração por via oral. 8 ΡΕ1042286

Em estudos preliminares em seres humanos, o Bestim aumenta a função imunológica tal como medida através de alterações laboratoriais nas funções linfocitárias. Estas alterações laboratoriais eram acompanhadas por indicadores positivos de melhorias a titulo de consequências clinicas.

Verificou-se que um dos novos análogos, ο γ-Ό-glutamil-L-triptofano, tem uma actividade biológica ainda maior, quando comparada com a do Bestim e apresenta uma indução da IL-2 por toda uma gama de dosagens ainda maior.

Um fármaco designado como sendo um "fármaco imunomodulador" apresenta um conjunto de acções bem definido. 0 Bestim e os seus análogos são eficazes a titulo de fármacos na imunoterapia de doenças infecciosas e para a reposição da reactividade imunológica previamente comprometida por exposição à radiação ou a outros tipos de factores de stresse tais como a quimioterapia do cancro ou a cirurgia.

Assim, os compostos com a Fórmula 1 que possuem actividade imunomoduladora são administrados a pacientes de forma útil, para modificar a imunodeficiência provocada por estados naturais ou induzidos por fármacos, são administrados a pacientes para melhorar e para diminuir os riscos de infecções por micro-organismos, são administrados em especial pacientes hospitalizados, a vitimas de queimaduras, a pacientes submetidos a cirurgia, a pacientes sob 9 ΡΕ1042286 quimioterapia do cancro, uma vez que tais indivíduos têm tendência específica para sofrerem infecções. Para além disto, os compostos imunomoduladores com a Fórmula 1 podem ser administrados a pacientes com infecções virais, quer sintomáticas quer assintomáticas, para facilitar a eliminação dos vírus e para melhorar a vigilância imunológica contra organismos patogénicos, e desta forma para diminuir a probabilidade de recaída de doenças, por exemplo, nos indivíduos que sofram ou sejam transportadores de vírus herpes, de vírus de varicela, de vírus de hepatite de HIV, são administrados aos indivíduos com doenças que alterem células naturais de modo a serem reconhecidas como "estranhas" pelo corpo, por exemplo, em estados tais como o cancro, e são administrados a pacientes com doenças auto-inflamatórias (auto-imunes) tais como a artrite reumatóide, a esclerose múltipla, o escleroderma, para ajustar o sistema imunológico ao equilíbrio.

Para além destas utilizações em pacientes em elevado risco de doença ou que expressem sintomas de uma doença, os compostos imunomoduladores com a Fórmula 1 podem ser administrados a populações saudáveis quando se anticiparem infecções epidémicas, por exemplo, em conjunto com vacinas da gripe, ou para tornar mais forte a reacção imunológica a patogénicos, em conjunto com vacinas, por exemplo, para a vacina contra a hepatite, o termo técnico para este tipo de utilização é o de uma utilização da invenção a título "adjuvante" de uma vacinação. 10 ΡΕ1042286

Nestas utilizações pode administrar-se dosagens na gama de entre cerca de 1 ng e cerca de 1000 μg por kg de peso corporal, quer a titulo de doses únicas, quer intermitentemente ao longo de um período de até um mês, ou mesmo mais, e as vias de administração são preferivelmente a de injecções parenterais, a de inalações orais ou nasais, ou por ingestão oral.

Descrição Pormenorizada das Concretizações Prefe- ridas

De um modo geral, os compostos desta invenção são substâncias químicas singulares que modulam a população de células T ajudantes para atingirem teores óptimos no hospedeiro. Por exemplo, a modulação do sistema imunológico de modo a aumentar o número de células T ajudantes aumenta o número de células T ajudantes e aumenta a capacidade do organismo para aguentar infecções por bactérias ou por vírus. A modulação para aumentar o número de células T ajudantes também ajuda o organismo a lutar contra células cancerosas que se tornaram estranhas em relação ao hospedeiro. Em alternativa, estas substâncias também ajudam o hospedeiro a ajustar-se a doenças provenientes do mau funcionamento dos processos de reconhecimento próprio, nos quais existe um excessivo ataque por parte das células T do hospedeiro contra tecidos endógenos. Nestes casos, os compostos inventivos modulam a população de células T de modo a que os sinais e os sintomas de doenças inflamatórias 11 ΡΕ1042286 dirigidas contra si próprio (auto-imunes) tais como a artrite reumatóide e a esclerose múltipla sejam melhorados. "Bestim", uma sigla proveniente da expressão gerada "melhor imunomodulador", é o nome atribuído a uma concretização de uma nova classe de compostos aos quais esta invenção diz respeito, e que possuem propriedades imunomoduladoras. Ele não apresenta toxicidade observável a doses de entre 500 e mais do que 500.000 vezes maiores do que a dose que é imunoestimuladora. O composto Bestim ele próprio tem a estrutura química de γ-L-glutamil-L-triptofano. A nova classe de moléculas imunomoduladoras sintéticas possui uma espécie γ-L-glutamilo, uma espécie γ-D-glutamilo, uma espécie γ-L-aspartilo, ou uma espécie β-D-aspartilo no terminal amino, tal como se ilustra através da Fórmula 1. FÓRMULA 1

R—CHj—·) n—C—X COOH O

Na Fórmula 1, n é 1 ou 2, Ré hidrogénio, acilo ou alquilo, e X é L-triptofano ou D-triptofano. As espécies acilo ou alquilo apropriadas para "R" são: grupos alquilo lineares ou ramificados com 1 a 6 átomos de carbono, grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbono, e grupos de bloqueio tais como carbobenziloxilo e t-butiloxicarbonilo. 0 carbono 12 ΡΕ1042286 em α marcado com um asterisco na Fórmula 1 tem uma configuração estereoquimica, quando n for 2, que é diferente da configuração estereoquimica de X.

Incluem-se como membros da nova classe os compostos tais como o y-L-glutamil-Nin-formil-L-triptofano, o N-metil-y-L-glutamil-L-triptofano, o N-acetil-y-L-glutamil-L-triptofano, o γ-D-glutamil-L-triptofano, o y-L-glutamil-D-triptofano, o β-L-aspartil-L-triptofano, e ο β-D-aspartil-L-triptofano.

Os péptidos com a Fórmula 1 podem formar sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico com qualquer ácido não tóxico, orgânico ou inorgânico. Incluem-se nos ácidos inorgânicos ilustrativos que formam sais adequados, os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico, bem como sais metálicos de ácidos tais como o mono-hidrogeno-ortofosfato de sódio e o hidrogenossulfato de potássio. Incluem-se nos ácidos orgânicos que formam sais adequados, os ácidos mono-, di- e tri-carboxílicos. São ilustrativos de tais ácidos, por exemplo, os ácidos acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, benzóico, hidroxibenzóico, fenilacético, cinâmico, salicí-lico, 2-fenoxibenzóico e os ácidos sulfónicos tais como o ácido metanossulfónico e o ácido 2-hidroxietanossulfónico. Incluem-se nos sais dos grupos carboxílicos os sais não tóxicos de ácidos carboxílicos formados com qualquer base adequada, inorgânica ou orgânica. Incluem-se nestes sais, a 13 ΡΕ1042286 título ilustrativo, os sais de metais alcalinos, tais como por exemplo, sais de sódio e de potássio, os sais de metais alcalino-terrosos, tais como de cálcio e de magnésio, os sais de metais leves do Grupo IIIA incluindo alumínio e os de aminas orgânicas primárias, secundárias e terciárias, tais como, por exemplo trialquil-aminas, incluindo a trietilamina, a procaína, a dibenzilamina, a 1-etenoamina, a N,N-dibenzil-etilenodiamina, a dihidroabietilamina, a (N-alquil(inferior)-piperidina, e qualquer outra amina adequada .

Tem-se pensado que a presença da espécie γ-L-glutamilo ou β-aspartilo nos compostos inventivos com a Fórmula 1 confere duas propriedades importantes: resistência à degradação por aminopeptidases e aumento de potência.

No entanto, verificou-se que um dos análogos da invenção, o γ-D-glutamil-L-triptofano, apresenta uma actividade biológica ainda maior do que a do Bestim, bem como uma gama de dosagens mais ampla.

Esta concretização especialmente preferida da invenção é por vezes designada como "SCV-07".

Toxicidade

Levaram-se a cabo estudos de toxicidade aguda e subaguda do Bestim em animais, seguindo as condições de boas práticas laboratoriais. Dissolveu-se o Bestim, prepa- 14 ΡΕ1042286 rado sob a forma de um pó liofilizado estéril em ampolas, em solução aquosa estéril a 0,9 % de NaCl, e injectou-se por via intramuscular em todas as experiências.

Toxicidade aguda: Distribuiram-se aleatoriamente os roedores (ratinhos e ratos) e os cães, por grupos contendo números iguais de machos e de fêmeas. Inspec-cionaram-se diariamente os animais ao longo de 14 dias após uma dose única de Bestim (intramuscular): ratinhos - 5.000,0 mg/kg ratos - 500,0 mg/kg cães - 500,0 mg/kg

Avaliou-se dia a dia o peso corporal, o aspecto geral e o comportamento, e, no final da segunda semana, fizeram-se exames macroscópicos e histopatológicos dos órgãos internos (coração, pulmões, e cavidades da pleura e do peritoneu, músculos, estômago, intestino delgado e grosso, figado, baço, pâncreas, rins, bexiga, tiróide, cérebro, pele e testiculos/ovários) de todos os animais. Não se observou a morte de nenhum dos animais testados, e os parâmetros registados quanto ao seu aspecto geral, comportamento, peso corporal, índices hematológicos, bioquímicos e fisiológicos, bem como o exame macroscópico e 15 ΡΕ1042286 histopatológico dos órgãos internos, estavam todos adentro dos limites normais.

Estudos de Toxicidade Subaguda: Num segundo conjunto de experiências, administrou-se o Bestim durante períodos mais longos, sendo portanto: ratos: 1 mg/kg e 100 mg/kg, administrados por via intramuscular, diariamente ao longo de 3 meses e ao longo de 6 meses cães: 1 mg/kg, 10 mg/kg e 100 mg/kg, administrados por via intramuscular, diariamente ao longo de 1 mês e ao longo de 3 meses. A injecção repetida do Bestim em ratos não provocou a morte de nenhum dos animais, nem produziu alterações do seu comportamento, nem alterações dos seus parâmetros hematológicos, bioquímicos ou fisiológicos. O aspecto morfológico de todos os órgãos, aos níveis macroscópico e histológico, eram normais. Ambas as doses induzira, em ratos um pequeno aumento do peso corporal dos animais experimentais. A injecção repetida de Bestim em cães não provocou a morte de nenhum animal, nem provocou alterações de comportamento, de peso corporal, ou dos parâmetros hematológicos, bioquímicos ou fisiológicos. Um exame macroscópico 16 ΡΕ1042286 e histológico de todos os órgãos que foram examinados não evidenciou quaisquer alterações significativas. Não havia reacções inflamatórias locais no local da injecção.

Em conclusão, estes testes de toxicidade mostraram que o Bestim está isento de propriedades tóxicas agudas ou subagudas em roedores e em cães. As doses testadas eram, em relação às doses expectáveis para os ensaios terapêuticos, da ordem de 5.000.000 de vezes superiores para uma administração única, e cerca de 100 vezes para a administração repetida.

Também se avaliou a toxicidade in vitro dos quatro péptidos (três dos quais da invenção), utilizando timócitos murinos. Lavaram-se os timócitos duas vezes, voltaram a suspender-se em meio RPMI 1640, contendo 2 % de soro fetal de vitelo.

Colocou-se uma suspensão de células numa placa de 96 poços (lxlO6 células por poço). Em seguida adicionaram-se os péptidos (ou o veiculo nos poços de controlo) aos poços, nas concentrações adequadas. Incubaram-se as células com os péptidos ou com veiculo durante 4 horas a 3 7°C num incubador sob C02. Depois da incubação calculou-se a viabilidade microscopicamente recorrendo a uma contrastação com Eosina B. Listam-se os resultados na Tabela A. 17 ΡΕ1042286

TABELA A

Doses de Péptido ^g/mL) Viabilidade das células, % De comparação γ-D-Glu-D-Trp 100 94,7 ± 0,3* 10 97,3 ± 0,33 1 96,7+0,88 0,1 98,3 ± 0,3 0,01 97,5 ± 0,5 Da invenção γ-D-Glu-L-Trp 100 95,3 ± 0,88 10 96,7 ± 1,86 1 97,3 ± 1,2 0,1 96,7 ± 0,88 0,01 96,3 ± 0,67 Da invenção γ-L-Glu-D-Trp 100 95,0 ± 1,15 10 95,3 ± 1,45 1 95,3 ± 0,67 0,1 97, 0 ± 0,58 0,01 96,0 ± 0,58 Bestim γ-L-Glu-L-Trp 100 96,7+2,85 10 96,0 ± 0,58 1 97,7 ± 1,2 0,1 98,0 ±1,0 0,01 96,0 ± 0,58 Controlo 97,0 ± 0,58 *- A diferença é estatisticamente significativa em comparação com o controlo, p < 0,05 18 ΡΕ1042286

No entanto, verificou-se que o péptido de comparação, γ-D-glutamil-D-triptofano, diminui a viabilidade das células (Tabela A) , e é portanto citotóxico a uma dose de 0,1 mg/mL.

Goldstein e Audhya ("Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies", em Thymopentin in Experimental and Clinicai Medicine, Surv. Immunol. Res., 4, páginas Ι-ΙΟ, 1985), introduziram o conceito de que os fármacos imunomoduladores actuam de modo a restaurar os desequilíbrios imunológicos, quer estes desequilíbrios sejam do tipo hipo-reactivo quer do tipo hiper-reactivo. A actividade bi-direccional destes fármacos ocorre por causa da natureza da bio-regulação na qual os desequilíbrios são restaurados para um ponto de equilíbrio bem determinado. No caso de hipo-reactividade, a administração de hormonas que regulam os linfócitos T actua de modo a optimizar e a regular em alta a função do sistema de autodefesa de modo a que os organismos estranhos são mais facilmente rejeitados. No caso de hiperreactividade, a administração de fármacos imuomoduladores parece amortecer os processos de resposta auto imunológica nos quais o ataque indevido contra entidades úteis 'próprias' aparece agora diminuído. Descrevem-se as categorias de aplicação clínica do Bestim em estados imunológicos hiporreactivos e hiperreactivos, delineando-se exemplos.

Estados de Hiperreactividade ou Imunodeficiência 19 ΡΕ1042286

Os estados de imunodeficiência podem ser classificados em três categorias etiológicas gerais. Em primeiro lugar, existe uma imunossupressão gue ocorre em consequência de processos de doença. Em segundo, existem imuno-deficiências provenientes de terapias para outras doenças, as assim denominadas imunodeficiências iatrogénicas. Em terceiro lugar, podem resultar imunodeficiências do ataque directo aos linfócitos T por parte do virus de imunode-fiência de humanos (HIV) que provoca a síndrome de imuno-deficiência adquirida (SIDA).

Os processos de doença habituais que levam à imunodeficiência são a malnutrição, as neoplasias, o envelhecimento, e as infecções. As pessoas malnutridas, os pacientes com cancros avançados e disseminados e pessoas com doenças debilitantes ficam doentes e morrem mais amiúde por causa de as respostas imunológicas mediadas por células e humorais deficientes aumentarem a susceptibilidade a infecções através de uma série de organismos. Um estado de deficiência generalizada das reacções imunológicas é denominado anergia. Diversos tipos de infecções, em especial infecções virais, levam a uma imunossupressão. Um fármaco tal como o Bestim, capaz de tornar mais robustas as componentes linfociticas ajudantes T do sistema imuno-lógico, será um agente terapêutico importante para aumentar a resistência do paciente a infecções. Por exemplo, o Bestim ou os seus análogos podem ser: em especial a administrados a pacientes ΡΕ1042286 20 pacientes mais idosos, antes ou logo a seguir às suas admissões a hospitais para diminuir os riscos de infecções nosocomiais (adquiridas nos hospitais), um problema medicinal habitual e severo — administradas a vitimas de queimaduras, uma vez que esses indivíduos são especialmente susceptíveis a infecções — administradas a pacientes em antecipação de epidemias infecciosas, por exemplo, em conjunto com vacinas contra a gripe ou a hepatite, para tornar mais vigorosa a resposta imunológica contra os patogénicos administradas a pacientes com infecções virais sem sintomas, para aumentar a vigilância imunológica de organismos patogénicos e para diminuir a probabilidade de recaída de uma doença, por exemplo, em indivíduos que sejam transportadores de vírus herpes, de vírus da varicela, de vírus da hepatite e de HIV. A imunossupressão iatrogénica é na maior parte das vezes devida a terapias com fármacos que ou matam ou tornam inactiva a funcionalidade dos linfócitos. Adminis-tram-se diversos fármacos quimioterapêuticos a pacientes 21 ΡΕ1042286 com cancro, e estes fármacos são habitualmente citotóxicos para linfócitos maduros e também para linfócitos em desenvolvimento, bem como para precursores de granulócitos e de monócitos. Deste modo, a quimioterapia do cancro é quase sempre acompanhada por um período de imunossupressão e de um aumento de risco de infecções. O tratamento do cancro com radiação apresenta os mesmos riscos. Existem medicamentos (factor estimulante de colónias de granulócitos) para aumentar os neutrófilos no sangue, para combater infecções que ocorrem depois da quimioterapia do cancro, mas não são hoje em dia utilizados medicamentos para restaurar as funções dos linfócitos. A grande cirurgia, por exemplo correcção de aneurismas ou operações de by-pass, também diminui a função imunológica os seres humanos. As razões do declínio dos linfócitos do sangue, que ocorre por causa da grande cirurgia, não são claras, mas agentes que aumentem as funções dos linfócitos nesses pacientes têm valor terapêutico diminuindo a probabilidade de ocorrência de infecções.

Uma forma final de imunossupressão adquirida que deveria ser mencionada resulta da ausência do baço, provocada pela remoção cirúrgica do órgão após um trauma ou pelo tratamento de determinadas doenças hematológicas, ou ainda em resultado de enfarto na doença de células falciformes. Os pacientes sem baço são mais susceptíveis a infecções por alguns organismos, em especial por bactérias encapsuladas tais como o Streptococcus pneumoniae. 22 ΡΕ1042286 O baço é aparentemente necessário para a indução de reacções humorais protectoras contra tais organismos. O Bestim ajudaria indivíduos sem baço ou sem timo na sua resistência contra a infecção por micro-organismos.

Os dados relativos aos péptidos da invenção, bem como diversos métodos sintéticos, serão agora ilustrados pelos exemplos que se seguem, que se destinam a ilustrar, mas não limitam, a invenção. EXEMPLO 1

Preparaçao dos Compostos Inventados e das Suas Composições

Farmacêuticas

Materiais e Equipamento

Reagentes. Prepararam-se o éster α-benzílico do ácido N-benziloxicarbonil-D-glutâmico e o éster a-benzílico do ácido N-benziloxicarbonil-L-glutâmico tal como foi descrito por Moore et ai., J. Chem. Soc., 2349 (1966), e o ρ-toluenossulfonato do o éster benzílico do L-triptofano tal como foi descrito por Arai et al., J. Org. Chem., 48, 121 (1983). Adquiriram-se junto da Fluka o D-triptofano, a N-metilmorfolina, o cloroformato de isobu-tilo, o catalisador de paládio sobre carvão (a 10 %), a N- 23 ΡΕ1042286 hidroxissuccinimida, a diciclo-hexilcarbodi-imida, a N,N-dimetilformamida, o tetra-hidrofurano, o acetonitrilo, e adquiriu-se o ácido trifluoroacético junto da Merck.

Cromatografia em Camada Fina (CCF). Levou-se a cabo a CCF ascendente sobre placas previamente revestidas com Kieselgel 60 F254 (Merck) utilizando os seguintes sistemas de solventes (em volume): A, clorofórmio/metanol/ácido acético a 90:8:2; B, 2-propanol/NH4OH a 25 %/água a 50:5:15; C, butanol/ácido acético/agua a 3:1:1.

Localizaram-se os péptidos com luz UV, ninidrina e J2.

Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho (HPLC)

Em todas as separações por HPLC utilizou-se o mesmo sistema solvente: solvente A - 0,1 % de ácido trifluoroacético em água, e solvente B - acetonitrilo.

Levaram-se a cabo as determinações analíticas num cromatógrafo de Gilson constituído por duas bombas (Modelo 302), um auto amostrador (Modelo 402), um espectrofotómetro ΡΕ1042286 - 24 - (Modelo 116), um sistema de tratamento de dados (Data Master) (Modelo 621), e uma coluna analítica Zorbax ODS 4,6 x 150 mm, 5 μιη, Caudal 1 mL/minutos. Controlaram-se os péptidos a 230 nm. Eluente - gradiente linear de 10-40 % B ou de 10-90 %, ao longo de 20 minutos.

Levou-se a cabo uma purificação preparativa num cromatógrafo Gilson constituído por bombas (Modelo 303), um misturador dinamométrico (Modelo 811), colector de fracções (Modelo 202), espectrofotómetro (Holochrome), e coluna preparativa Zorbax ODS 21,2x250 mm, 8 μ, Caudal de 10 mL/minuto. Controlou-se o péptido a 230 nm. Eluente -gradiente linear de 0-40 % de B ao longo de 80 minutos.

Ressonância Magnética Linear. Todos os espectros foram registados com um espectrómetro Bruker CPX-300 equipado com um computador Aspect 2.000, operando no modo de transformada de Fourier com detecção da quadratura a 300 MHz para protões. Dissolveu-se 50 mg de péptido em 0,5 mL de CD3OD e tomou-se o seu sinal de protão residual como referência a 3,35 ppm. A não ser aonde se especificar algo em contrário, os parâmetros de aquisição típicos de aquisição foram: temperatura - ambiente, largura espectral - 4500 Hz, largura de pulsos 1 με (σ°) , e 8192 pontos de dados no domínio. 0 processamento foi levado a cabo com 16384 endereços de pontos. O período de relaxação era de 2 s. 25 ΡΕ1042286

Exemplo ΙΑ γ-D-glutamil-L-triptofano Éster dibenzílico de N-benziloxicarbonil-y-D-glutamil-L-triptofano

Arrefeceu-se até -15°C uma solução de éster a-benzílico do ácido N-benziloxicarbonil-D-glutâmico (0,74 g, 2 mmol) e N-metilmorfolina (0,22 mL, 2 mmol) em tetra-hidrofurano seco. Adiciona-se-lhe cloroformato de isobutilo (0,28 mL, 2 mmol) e deixa-se repousar a mistura a -10°C durante 3 minutos, para se formar o anidrido misto. Nessa altura adiciona-se uma solução de p-toluenossulfonato do éster benzilico de L-triptofano (0,93 g, 2 mmol) e N-metilmorfolina (0,22 mL, 2 mmol) em tetra-hidrofurano seco, e armazena-se a mistura reaccional num frigorífico a cerca de 5°C, de um dia para o outro. No dia seguinte filtra-se a solução para separar o sal, lava-se com tetra-hidrofurano seco (20 mL) e evapora-se em vazio. Dissolve-se o resíduo em acetato de etilo (50 mL), lava-se com iguais volumes de água, solução aquosa 2 N de H2S04, água, solução aquosa a 5 % de NaHCCh, e de novo com água. Seca-se sobre Na2S04 anidro, filtra-se para se separar o agente exsicante e concentra-se em vazio até cerca de 10 mL. Por diluição com hexano (50 mL) o produto separa-se. Rendimento 820 mg (62 %). Rf (A)-0,75. γ-D-glutamil-L-triptofano

Hidrogena-se uma solução de éster dibenzílico de 26 ΡΕ1042286 N-benziloxicarbonil-y-D-glutamil-L-triptofano (0,6 g, 0,9 iranol) em metanol (30 mL) sobre Pd/C (a 10 %, 200 mg) durante 5 horas. Remove-se o catalisador por filtração através de carvão e evapora-se o filtrado à secura. Rendimento de 260 mg.

Purifica-se o péptido obtido por intermédio de uma HPLC preparativa e liofiliza-se. Rendimento de 190 mg. Rf(B) -0,5, Rf(C) -0,45. Tal como se afirmou acima, esta concretização especialmente preferida é por vezes referida como "SCV-07". TABELA 1

Desvios Químicos de Protões (ppm) do γ-D-glutamil-L-triptofano Resíduo H em α H em β H em γ Outros Trp 4, 75 3,2-3,4 H4 - 7,65; H7 - 7,35; H2 -7,15; H6 - 7,1 H5 - 7,05 Glu 3,65 2,4 2,1 TABELA 2

Desvios Químicos de 13H(ppm) do γ-D-glutamil-L-triptofano Resíduo co C em α C em β C em γ Outros Trp 176,19 55,17 27, 65 H4-111,08; H8-112,35; Hll-119,25; H9119,81; H10-122,38; H5-124,58; H7-128,76; H6-137,87 Glu 173,96 174,68 55,17 28,48 32, 71 ΡΕ1042286 27 EXEMPLO 1B γ-L-glutamil-D-triptofano Éster a-benzílico de N-benziloxicarbonil-y-L-glutamil-D-triptofano

Arrefece-se uma solução de éster α-benzílico de ácido N-benziloxicarbonil-L-glutâmico (0.99 g, 2,6 mmol) e N-hidroxissuccinimida (0,3 g, 2,6 mmol) em N,N-dimetil-formamida (96 mL) com um bano de gelo e água, e adiciona-se-lhe sob agitação uma solução de diciclo-hexilcarbodi-imida (0,56 g, 2,7 mmol) em N, N-dimetilf ormamida (3 mL) . Agita-se a mistura durante 1 hora a 0°C e de um dia para o outro à temperatura ambiente. Remove-se por filtração a N, N-diciclo-hexilureia e adicionam-se ao filtrado D-triptofano (0,64 g, 3,1 mmol) e trietilamina (0,46 mL, 3,3 mmol). Agita-se a mistura durante 16 horas à temperatura ambiente e dilui-se com água (50 mL). Extrai-se o óleo que se separa com acetato de etilo (3x20 mL) e combina-se a fase orgânica com uma solução aquosa 2 N de H2S04 (2x20 mL) e com água (4x30 mL), seca-se sobre Na2S04, filtra-se para separar o agente de secagem e concentra-se em vazio até cerca de 10 mL. Ao diluir com hexano (30 mL) o produto separa-se. rendimento de 1,2 g (81 %). Rf(A) - 0,7. ΡΕ1042286 28 γ-L-Glutamil-D-triptofano

Hidrogena-se uma solução de éster α-benzílico de N-benziloxicarbonil-y-L-glutamil-D-triptofano (0,6 g, 0,9 mmol) em metanol (30 mL) sobre Pd/C (a 10 %, 200 mg) durante 2 horas (controlando-se por CCF). Remove-se o catalisador por filtração através de carvão e evapora-se o filtrado à secura. Rendimento de 285 mg.

Purifica-se o péptido gue se obteve por intermédio de uma HPLC preparativa e liofiliza-se. Rendimento de 180 mg. Rf(B) - 0,5, Rf(C) - 0,45. 0 γ-L-glutamil-D-triptofano tem o mesmo espectro de RMN de ‘‘H e de RMN de 13C que o y-D-glutamil-L-tripto-f ano.

EXEMPLO 1C Síntese de β-L-aspartil-L-triptofano em fase sólida

Sintetizou-se a molécula pretendida recorrendo a um suporte sólido em poliestireno com ligações cruzadas com 1 % de divinilbenzeno. Coloca-se no balão reaccional 0,1 g de resina de Merryfield de Na terc-Boc-Nin-f ormil-L-triptofano (conteúdo em Trp 0,7 mmol/g de resina). O programa de síntese automatizada é como se segue. ΡΕ1042286 29 TABELA 3

Sequência para Síntese Automatizada de Péptidos Passo Reagente Na de Repetições Volume (mL) Tempo (minutos) 1 50 % de TFA em CH2C12 2 5 2 + 30 2 CH2C12 6 8 2 3 5 % de DIEA em CH2C12 3 5 2 4 CH2C12 6 8 120 5 acoplamento* 1 4 2 6 DMAA 2 8 2 7 2-propanol 2 8 2 8 ch2ci2 2 8 1 9 Teste da ninidrina** — — TFA - ácido trifluoroacético, DIEA - di-isopropiletilamina, DMAA - dimetilacetamida. * levou-se a cabo o acoplamento com éster activo de 1-hidro-xibenzotriazole (HOBt), que se havia preparado a partir de três equivalentes de Boc-L-Asp-a-OBzl, HOBt e diciclo-hexil-carbodi-imida (DCI) em DMAA durante 30 minutos, sobre gelo. ** verificou-se que o acoplamento se havia completado através do teste de Kaiser da ninidrina (Kaiser et al., Anal. Biochem., 34: 595,1970). Estando o acoplamento incompleto, repetiu-se mais uma vez.

Desprotegeu-se o péptido e clivou-se do polímero 30 ΡΕ1042286 a partir do polímero com fluoreto de hidrogénio líquido (HF) contendo 10 % de anisole e 10 % de m-cresol, a 0°C, durante 60 minutos. Removeu-se o HF em vazio a 0°C, extraiu-se o péptido com solução aquosa a 30 % de ácido acético, lavou-se com éter etílico, liofilizou-se e depois de se desformilar com solução aquosa 0,2 N de hidróxido de sódio purificou-se por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) preparativa.

Podem sintetizar-se todos os análogos do Bestim de acordo com este mesmo esquema figurado na sequência da Tabela 3 acima, recorrendo a diferentes derivados de Boc no passo 5 a título de única diferença.

Verificação da Síntese

Caracterizou-se por exemplo o Bestim por: 1. Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho (HPLC), recorrendo a um Cromatógrafo Gilson (França), eluente 0,1 % de TFA/acetonitrilo, gradiente de 10-40 %, durante 14 minutos, coluna Delta-Pack C-18, 300A, 5 μιη, 3,9x150 mm. O período de retenção do produto foi de 8,1 minutos e a sua pureza, medida integrando a área sob o pico de HPLC, era de 99,7 %. 2. Análise de aminoácidos: utiliza-se um analisador de aminoácidos LKB Alpha Plus 31 ΡΕ1042286 4151, o produto foi hidrolisado em ácido metanossulfónico 4 N, contendo 0,2 % de triptamina, em vazio, a 115°C, durante 24 horas. 0 conteúdo peptídico era de 1,0 em ácido glutâmico, 0,94 de triptofano, confirmando a presença dos resíduos pretendidos. 3. Cromatografia em camada fina (CCF): sistema I n-butanol:acetato de etilo: ácido acético: água = 1:1:1:1, Rf=0,72; sistema 2 sec- butanol:ácido acético:tolueno:água = 6:1: 2:1, Rf=0,4. 4. Espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN): Espectrómetro de RMN Bruker GXP-300 equipado com um computador Aspect 200. No espectro de RMN de carbono do péptido (solução 0,001 M/L) foram detectados picos: para Glu - a 30,0; 31,0; 57,2; 176,6; 178,3 ppm; para Trp - a 35,7; 58,3; 113,1; 116,6; 123,4; 124,3; 126,6; 129,0; 131,0; 140,3; 179,4 ppm. 5. Espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos (FAB-MS), ião molecular: calculado, 334,13 Da; determinado 333,73. A preparação dos compostos inventivos sob uma forma aceitável do ponto de vista farmacêutico é ilustrada 32 ΡΕ1042286 pelo Exemplo 1D adiante, seguido pela formulação de comprimidos tais como os descritos no Exemplo 1E.

EXEMPLO 1D

Preparaçao do Sal Sódico de Η-γ-D-Glu-L-Trp

Dissolveu-se éster α-benzílico de N-benziloxi-carbonil-y-D-Glu-L-Trp (5 g, 0,087 M) em metanol (40 mL) e adicionou-se NaHC03 (0,73 g, 0,087 M). Retirou-se o ar purgando com um caudal pequeno de azoto, e adicionou-se catalisador de paládio a 10 % sobre carvão (2,5 g em 30 mL de água) . Uma vez mais fez-se passar um caudal pequeno de azoto através do conteúdo do reactor, e depois iniciou-se a introdução de um pequeno caudal de hidrogénio. Manteve-se o catalisador em suspensão usando uma agitação vigorosa. Passadas 4 horas removeu-se o catalisador por filtração e lavou-se com metanol (10 mL) . Evaporou-se o filtrado em vazio e triturou-se o resíduo com acetonitrilo. Recolheu-se o produto sólido sobre um filtro, lavou-se com acetonitrilo e secou-se em vazio.

Rendimento: 2,14 g (70 %).

EXEMPLO 1E

Formulação de Comprimidos

Formulou-se o péptido inventivo do Exemplo ΙΑ (γ- 33 ΡΕ1042286 D-glutamil-L-triptofano) em comprimidos, quer usando 98,9 % de glicina, 1 % de estearato de magnésio, e 0,1 % do péptido inventivo, quer 94,9 % de glicina, 5 % de amido, e 0,1 % do péptido inventivo. Cada comprimido de 100 mg continha 100 μg do análogo inventivo. EXEMPLO 2

Estudos In Vivo com Bestim e Análogos de Bestim Influência sobre a Produção de Interleucina 2 (IL-2) Espécie: Ratinho (estirpe CBA).

Ensaio: Administraram-se a ratinhos os péptidos γ-L-Glu-L-Trp (Bestim) e γ-D-Glu-L-Trp (análogo de Bestim) per os e sob uma forma de uma solução aquosa às diferentes doses indicadas na tabela, uma vez ao dia e ao longo de 5 dias consecutivos. Utilizaram-se cinco animais para cada dose de péptido. Passadas 48 horas removeram-se os baços e cultivaram-se células de baço durante mais 24 horas in vitro na presença do indutor da produção de IL-2, Com A (5 μρ/ιηΙΟ em meio RPMI 1640 suplementado com 10 % de soro fetal de vitelo, em placas de cultura de 96 poços com fundo chato. Mediram-se os teores de IL-2 nos sobrenadantes no bioensaio, utilizando a linha de células murina dependente de IL-2, CTLL-2 (Gillis et al., 1978). 34 ΡΕ1042286 TABELA 4

Efeito do Bestim e dos seus Análogos sobre a Produção de IL-2 por Células de Baço de Ratinhos Dose de péptido γ-D-Glu-L-Trp γ-L-Glu-L-Trp ^g/kg) (SCV-07) (Bestim) 10, 0 132,2 ± 9,3* 56,7+4,5 0,1 129,2 ± 9,8* 47,2 ± 8,9 0,001 103, 4 + 7,5* 115,9+8,6* 0,00001 85,9 ± 5,0* 65,2 ± 5,2 Controlo 6 8,3 ± 4,9 68,3 ±4,9 * diferença significativa face ao controlo, p < 0,05

Conclusão: 0 péptido γ-D-Glu-L-Trp (Análogo ao

Bestim inventivo) apresentava uma actividade biológica maior do que a do Bestim. A indução da IL-2 foi observada numa gama de doses mais larga, e a doses elevadas este análogo não apresentava decréscimo da indução da IL-2. EXEMPLO 3

Influência de Precursores de Células T da Medula óssea de Ratinhos sobre a Expressão do Antigénio Thy-1

Protocolo: Obtiveram-se células de medula óssea a partir ossos femurais de ratinhos CBA e incubaram-se in vitro com os péptidos em placas de microtitulação (Terasakiem meio de Eagle, durante uma hora a 37°C. 35 ΡΕ1042286

Determinou-se a expressão do antigénio Thy-1 por um ensaio de citotoxicidade dependente do complemento recorrendo a anticorpos para o Thy-1.

TABELA 5A

Alterações dos Números de Células que Expressavam Antigénios para Thy-1 em Medula Óssea de Ratinho Cultivada na Presença dos Análogos Peptídicos Inventivos Concentração de Células Expressando o Antigénio Thy-1 (%) Péptido ^g/kg) γ-L-Glu-D-Trp γ-D-Glu-L-Trp γ-L-Glu-L-Trp (SCV-07) (Bestim) 10,0 39,4 ± 2,2 63,6 ± 4,2 35,0 ± 3,0 1,0 44,3 ± 5,4 47,3 ± 1,6 39,6 ± 4,6 0,1 42,2 ± 1,6 38,4 ± 4,4 39,5 ± 2,8 0, 01 35,6 ± 4,4 36,3 ± 4,9 38,0 ± 3,1 0, 001 40,0 ± 1,6 37,6 ± 1,2 32,2 ± 2,8 0,0001 33,7+2,8 37,2 ± 2,6 30,0 ± 2,4 0,00001 29, 4 + 1,7 36,2 ± 3,2 24,0 ± 2,0 Controlo 14, 7 + 2,4 Observou-se uma diferença significativa face ao controlo, p<0,05.

Conclusão: 0 péptido inventivo, γ-D-Glu-L-Trp apresentava a actividade mais elevada em comparação com a actividade do Bestim e de outro análogo inventivo, o γ-L-Glu-D-Trp. ΡΕ1042286 36

TABELA 5B

Alterações dos Números de Células que Expressam Antigénios para Thy-1 em Medula óssea de Ratinho Cultivada na Presença dos Péptidos Inventivos

Concentração de Péptido (μg/mL) Número Células Expressando o Antigénio Thy-1 (%) Péptido 1** Péptido 2 Péptido 3 10, 0 55,4 ± 2,4* 44, 8 + 4,0* 41,9 ± 3,2* O 1—1 51,4 ± 2,6* 42,5 ± 3,6* 38,0 ± 2,9* i—1 o 49,4 ± 2,3* 22,5 ± 2,8 33,9 ± 2, 1* 0,01 35, 7 ± 2,1* 18,2 ± 2,3 27,3 ± 2, 1* 0,001 14, 9 + 1,7 16,4+1,9 13,0 ± 1,3 0,0001 12,7+1,9 17, 9 + 2,1 12,9+1,4 0,00001 12,3 ± 1,6 15,6 ± 2,0 13, 4 + 1,7 Controlo 13,9 ±1,9

Concentração de Péptido (pg/mL) Número de Células Expressando o Antigénio Thy-1 (%) Péptido 4** Péptido 5 O O \—1 41,2 ± 2,4* > co 1+ o * 1,0 39,2 ± 2,6* 42,5 ± 3,6* 1-1 o 37,1 ± 2,3* 22,5 ± 2,8 0,01 36,3 ± 2,1* 18,2 ± 2,3 0,001 25,6 ± 1,7 16,4 ± 1,9 0,0001 24,2 ±1,9 17, 9 + 2,1 0,00001 23,0 ±2,7 15,6 ± 2,0 Controlo 14, 8 ±2,1 37 ΡΕ1042286 * - diferença significativa face ao controlo, p < 0,05. ** - os péptidos eram: 1. beta-L-aspartil-L-triptofano 2. acetil-gama-D-glutamil-L-triptofano 3. beta-D-aspartil-L-triptofano 4. gama-D-glutamil-L-triptofano-amida 5. gama-D-glutamil-L-triptofano (SCV-07) EXEMPLO 4

Actividade Biológica In Vitro de Análogos de Bestim Péptidos: Prepararam-se o Bestim e diversos seus análogos inventivos sob forma liofilizada. Imediatamente antes da experiência, dissolveram-se todos os péptidos em água para se prepararem soluções com diferentes concentrações nas substâncias.

Influência sobre a Produção da IL-2 em Cultura

Protocolo. Removeram-se baços dos ratinhos CBA, isolaram-se as células do baço e cultivaram-se em meio RPMI 1640 suplementado com 10 % de soro fetal de vitelo em placas de cultura de 96 poços com fundo chato. Induziu-se a produção de IL-2 com 5 μρ/ιηί de Con A numa cultura de 2 4 horas. Adicionaram-se os péptidos, nas concentrações pretendidas, às culturas celulares, no instante "0". Deter-minaram-se os teores em IL-2 nos sobrenadantes das culturas utilizando uma linha de células dependente de IL-2, CTLL-2, (Gillis et al., 1978). ΡΕ1042286 38 TABELA 6

Alterações da Produção de IL-2 Induzida por Con-A em Células de Baço de Ratinhos em Cultura em Presença de Análogos de Bestim Concentração de Teor em IL- 2 nos Sobrenadantes (UI/mL) Péptido (μρ/kg) γ-L-Glu-D-Trp γ-D-Glu-L-Trp γ-L-Glu-L-Trp (SCV-07) (Bestim) O O \—I 62,8 ± 3,2 65,5 ± 3,7* 59,9 ± 3,0* 0 1 1 57,4 ± 4,8 80,9 ± 6,7* 61,4 ± 3,3* 1-1 o 57,9 ± 3,2 87,2 ± 7, 1* 57,3 ± 4,0 0, 01 59,9 ± 4,5 73,8 ± 6,3* 56,6 ± 3,7 0,001 60,4 ± 5,9 65,9 ± 4,0* 54,7 ± 3,2 0,0001 52,6 ± 5,0 47,9 ± 3,4 53,2 ± 3,3 Controlo 50,1 ±3,7 50,1 ± 3,7 50,1 ± 3,7 * diferença significativa face ao controlo, p < LD O O EXEMPLO 5

Alterações do sistema Imunológico dos Pacientes após Aplicação por Via Oral

Administrou-se qualquer uma das duas formulações de comprimido descritas no Exemplo 1E a dois pacientes com cancro, um mês depois de uma intervenção cirúrgica. ΡΕ1042286 39

Estudo do Primeiro Caso

Paciente: "Eg"

Diagnóstico: Cancro do cólon

Terapia anterior: Cirurgia

Terapia com SCV-07: administração de 5 comprimidos ao dia, por via oral (0,1 mg por dia). TABELA 7

Dados Acerca das Alterações dos Parâmetros Imunológicos no Paciente "Eg" que Recebeu Terapia por Via Oral com Comprimidos de SCV-07 Parâmetros Antes do tratamento 2 Semanas depois do Imunológicos final dos 5 dias de tratamento Contagens de linfócitos do sangue (%) : CD3 51,2 ± 1,1 55,4 ± 1,3 CD 4 26,2 ± 1,0 29,7 ±1,5 CD 8 23,1 ± 1,3 24,1 ± 1,6 razão CD4/CD8 1,13 1, 23 CD20 20,8 ± 1,4 20,4 ±1,1 40 ΡΕ1042286 (continuação)

Dados Acerca das Alterações dos Parâmetros Imunológicos no Paciente "Eg" que Recebeu Terapia por Via Oral com Comprimidos de SCV-07 Parâmetros Antes do tratamento 2 Semanas depois do Imunológicos final dos 5 dias de tratamento índice de migração 2,35 2, 46 de neutrófilos Redução de tetrazolium nitroblue por Neutrófilos (U): espontânea 675 ± 123 1031 ± 49 induzida por PMA 6459 ± 132 6950 ± 175

Segundo Caso Estudado

Paciente: "Ar"

Diagnóstico: Cancro do cólon

Terapia prévia: Cirurgia

Terapia com SCV-07: aplicaçao de 5 comprimidos ao dia, por via oral, (0,1 mg por dia) 41 ΡΕ1042286 TABELA 8

Dados Acerca das Alterações dos Parâmetros Imunológicos no Paciente "Eg" que Recebeu Terapia por Via Oral com Comprimidos de SCV-07 Parâmetros Antes do tratamento 2 Semanas depois do Imunológicos final dos 5 dias de tratamento Contagens de linfócitos do sangue (%) : CD3 46,3 ± 1,4 59,2 ± 1,3 CD 4 23,4 ± 1,2 31,0 ±1,7 CD 8 23,5 ± 1,1 27,1 ± 1,9 razão CD4/CD8 1,0 1,14 CD20 11,4 ± 1,0 14,3 ± 0,9 índice de migração 1,25 3, 07 de neutrófilos Redução de tetrazolium nitroblue por Neutrófilos (U): espontânea 401 ± 38 1646 ± 97 induzida por PMA 5007 ± 245 5111 ± 304

Determinou-se a influência do péptido inventivo γ-D-glutamil-L-triptofano, na actividade funcional dos leucócitos neutrofilicos humanos, de acordo com as alterações de teores de produção de radicais livres de oxigénio, utilizando o ensaio de quimioluminescência espontânea 42 ΡΕ1042286 dependente do luminol (Muto et al., 1986). Inseriram-se amostras de sangue inteiro dos doadores no recipiente de trabalho do Luminómetro 1251 (LKB), em conjunto com pépti-dos diluídos em soro salino, nas concentrações indicadas na tabela. Adicionou-se luminol a cada recipiente de trabalho e incubaram-se estes recipientes durante 10 minutos. Em seguida incubaram-se os recipientes nos poços do luminómetro durante 40 minutos a 37°C sob agitação constante. Calculou-se a quantidade de radicais superóxido que se havia desenvolvido utilizando o programa de computador "Lumina", e exprimiram-se sob a forma de uma soma da luz durante 40 minutos (mV/minuto) . Estudou-se cada amostra em triplicado. TABELA 9

Influência de Péptido Sobre o Aumento da Quimioluminescência de Neutrófilos Potenciada por Luminol em Cultura de Células Completas de Sangue Humano Péptido Quimioluminescência de Quimioluminescência de Inventivo células não estimuladas células activadas por ^g/mL) PMA Valor do pico Somatório de Valor do Somatório de (mV) Luz - 40 pico (mV) Luz - 40 minutos minutos (mV/minuto) (mV/minuto) 1,0 0,71+0,02 25,7+0,13 3,40+0,06* 75,9+1,5* 0,1 0,72+0,02 27,2+0,93 2,57+0,40 60,3+0,8 0, 01 0,73+0,04 27,9+0,85 3,03+0,99 63,0+0,7 Controlo 0,66+0,07 25,2+0,09 2,90+0,12 64,9+4,0 *- diferença significativa face ao controlo, P < 0,05 43 ΡΕ1042286

Estudos da Influência dos Péptidos Inventivos Sobre a Quimiotaxia de Leucócitos Humanos

Levou-se a cabo o ensaio quimiotático utilizando a técnica de migração sobre agarose descrita por Nelson et al. (1972). Dissolveu-se agarose, a uma concentração final de 1 %, em meio de cultura 199 suplementado com 10 % de soro fetal de vitelo. Transferiu-se esta mistura para uma placa de cultura de tecidos e deixou-se formar o gel. Cortou-se no gel uma série de poços com diâmetros de 2 mm e espaçados de 3 mm. Adicionou-se ao gel poço central 10 μΡ de neutrófilos (2,5 x 106 células por mL) . Num dos lados encheram-se outros poços com meio, para se medir a migração aleatória, enquanto se encheram os do outro lado com o factor quimiotático FMLP, a 10“7 M, para se medir a migração estimulada. Incubaram-se as placas num incubador sob CO2 durante 120 minutos. Adicionaram-se as concentrações pretendidas de péptidos às células no instante "0". Leu-se a migração de células ao microscópio recorrendo a uma micro escala, e exprimiu-se sob a forma do índice quimiotático: migração estimulada/migração aleatória. TABELA 10 Péptidos** Concentração de péptido, \iq/mL 100 10 1 1 1,47 ± 0,04 1, 75 ± 0,25 1,71 ± 0,20 2 1, 73 ± 0,07 1,79 ± 0,01 2,33 ± 0,17* 3 2, 17 ± 0,17* 1, 78 ± 0,20 1,75 ± 0,10 4 2,13 ± 0,34 1,71 ± 0,15 1,75 ± 0,13 5 2,50 ± 0,30* 1,77 ± 0,17 1,81 ± 0,11 6 2,19 ± 0,30 1,93 ± 0,29 1,61 ± 0,15 44 ΡΕ1042286 *- diferença significativa face ao controlo, δ < 0,05. **- os péptidos utilizados foram: 1. beta-L-aspartil-L-triptofano 2. acetil-gama-D-glutamil-L-triptofano 3. beta-D-aspartil-L-triptofano 4. gama-D-glutamil-L-triptofano-amida 5. gama-D-glutamil-L-triptofano (SCV-07) 6 . gama-D-glutamil-L-triptamina (continuação) Péptidos** Concentração de péptido, μρ/πΛ 100 10 1 Controlo 1,77 ± 0,05

Estudos da Influência dos Péptidos Inventivos Sobre a Fagocitose de Leucócitos Humanos

Transferiram-se leucócitos neutrofilicos humanos obtidos do sangue de doadores por separação sobre Ficoll-Pack para tubos tratados com silicone, a uma concentração de 2 x 106 células por mL em meio de cultura de Eagle suplementado com 10 % de soro fetal de vitelo. Utilizaram-se células de levedura opsonizadas com soro humano como objecto da fagocitose. Adicionaram-se células de levedura a tubos (10 células de levedura para 1 neutrófilo) e incubou-se a suspensão de células num incubador sob C02 durante 40 minutos. Em seguida lavaram-se as células por centrifugação, prepararam-se lâminas de vidro com esfregaços de células e contrastaram-se com contraste de Giemsa. Calculou-se o número de células fagociticas ao microscópio. 45 ΡΕ1042286 *- diferença significativa face ao controlo, P < 0,05. **- os péptidos utilizados eram: 1. beta-L-aspartil-L-triptofano 2 . acetil-gama-D-glutamil-L-triptofano 3. beta-D-aspartil-L-triptofano 4. gama-D-glutamil-L-triptofano-amida 5. gama-D-glutamil-L-triptofano (SCV-07) 6 . gama-D-glutamil-L-triptamina_ TABELA 11 Péptidos** Concentração de péptido, μρ/ιτΛ 100 10 1 1 33,3 ± 1,2* 36,0 ± 7,5* 32,3 ± 1,8* 2 34,3 ± 1,2* 29,5 ± 0,5* 0,03 ± 1,1* 3 22,3 ±1,9 21,0 ± 5,0 23,0 ±5,6 4 20,7 ± 5,2 18,0 ±2,7 16,7 ± 2,7 5 25,0 ± 1,4* 25,7 ± 2,7* 17,0 ± 1,0 6 19,0 ±2,3 22,0 ± 4,0 22,0 ±3,0 Controlo 16,7 ± 1,5

Influência dos Péptidos Inventivos Sobre a Proliferação In Vitro dos Timócitos de Rato

Incubaram-se culturas em triplicado de timócitos de linha pura de rato branco a 5 x 106 por mL, durante 72 horas com péptidos, num incubador sob CO2, em placas de 96 poços com fundo chato, em meio RPMI 1640 suplementado com 1 % de soro fetal bovino termicamente desactivado, 2 mM de L-glutamina, 80 μg/mL de gentamicina, 5 μg/mL de Polimixina B e 0,5 μg/mL de Concanavalina A. Dezasseis horas antes do 46 ΡΕ1042286 final do período de cultura marcaram-se as células de forma pulsada com 3H-timidina. Recolheram-se as células em filtros em fibra de vidro com um sistema de colheita de células Titertek, e contaram-se num contador beta de cintilação líquida. Exprimiu-se a taxa de proliferação em contagens por minuto. TABELA 12

Concentração de Péptido ^g/mL) Taxa de Proliferação (contagens por minuto) Péptido 1* Péptido 2 Péptido 3 10,0 58720 ± 2340* 52300 ± 2490 49700 ± 790 O !-1 53110 ± 485 53340 ± 1590 50190 ± 1780 1-1 o 46590 ± 1190 51950 ± 5910 56510 ± 3970 0,01 55010 ± 5350 56790 ± 1980* 55530 ± 2750 0,001 51230 ± 2030 52080 ± 1880 51430 ± 2050 0,0001 Controlo 49000 ± 1420

Concentração de Péptido ^g/mL) Taxa de Proliferação (contagens por minuto) Péptido 4 Péptido 5 0 1 1 53330 ± 1370 49420 ± 1210 0,1 48690 ± 1790 53180 ± 1910 0,01 48100 ± 1950 59480 ± 2250* 0,001 50740 ± 2150 61340 ± 2340* 0,0001 50960 ± 1050 57880 ± 1560* Controlo 49000 ± 1420 - 47 - ΡΕ1042286 *- diferença significativa face ao controlo, p < 0,05. **- os péptidos utilizados eram: 1. beta-L-aspartil-L-triptofano 2. acetil-gama-D-glutamil-L-triptofano 3. beta-D-aspartil-L-triptofano 4. gama-D-glutamil-L-triptofano-amida 5. gama-D-glutamil-L-triptofano (SCV-07)

Em conclusão, os péptidos inventivos apresentam propriedades estimuladoras do sistema imunológico e conseguem estimular a produção de IL-2 pelos linfócitos do baço, induzir a maturação dos precursores dos linfócitos T, e estimular a proliferação das células T. Em especial, verifica-se que o péptido inventivo preferido, γ-D-Glu-L-Trp (SCV-07) aumenta a função imunológica através da estimulação da actividade funcional dos leucócitos neutro-fílicos, em especial a fagocitose e a produção de radicais de oxigénio. Verifica-se que os péptidos inventivos, em especial o SCV-07, aumentam os números totais de linfócitos T e de linfócitos T ajudantes bem como a razão CD4/CD8 no sangue periférico. Por último, verificou-se também que os péptidos inventivos, em especial o SCV-07, estimulam a migração e a actividade bactericida de leucócitos neutro-fílicos humanos.

Deve entender-se que embora se tenha descrito a invenção acima em conjunto com concretizações especificas 48 ΡΕ1042286 exemplos definido preferidas, se pretende que a descrição e os ilustrem e não limitem o âmbito da invenção, que é pelo âmbito das reivindicações apensas.

Lisboa, 1 de Outubro de 2010

Claims (16)

1. ΡΕ1042286 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto com pelo menos dois resíduos de aminoácido e que apresente a estrutura correspondente à Fórmula 1: Fórmula 1 (-CH2~) n-C-X COOH O em que n seja 1 ou 2, R seja hidrogénio, um acilo contendo 2 a 10 átomos de carbono, ou um alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, e X seja L-triptofano ou D- triptofano, e em que o carbono em α marcado com um asterisco na Fórmula 1 tenha uma configuração estereoquímica, quando n for 2, que seja diferente da configuração estereoquímica de X.
2. 2. Um composto tal como na reivindicação 1, no qual X seja L-triptofano.
3. 3. Um composto tal como na reivindicação 1, no qual X seja D-triptofano.
4. 4. Um composto tal como na reivindicação 1, sob a forma de um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico . - 2 - ΡΕ1042286
5. 5. Um composto tal como se reivindicou na reivindicação 1, que seja γ-D-glutamil-L-triptofano.
6. 6. Um composto tal como se reivindicou na reivindicação 1, que seja β-L-aspartil-L-triptofano.
7. 7. Um composto tal como se reivindicou na reivindicação 1, que seja β-D-aspartil-L-triptofano.
8. 8. Um composto tal como se reivindicou na reivindicação 1, que seja acetil-gama-D-glutamil-L-tript-f ano.
9. 9. Um composto tal como se reivindicou na reivindicação 1, que seja gama-D-glutamil-L-triptofano-amida.
10. 10. Uma composição farmacêutica que inclua o composto de qualquer das reivindicações anteriores, misturado com um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico .
11. 11. A utilização de um compostos com a Fórmula 1 )n-C~X COOH 3 ΡΕ1042286 sob uma forma aceitável do ponto de vista farmacêutico, em que n seja 1 ou 2, R seja hidrogénio, um acilo contendo 2 a 10 átomos de carbono, ou um alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, e X seja L-triptofano ou D-triptofano, e em que o carbono em α marcado com um asterisco na Fórmula 1 tenha uma configuração estereoquimica, quando n for 2, que seja diferente da configuração estereoquimica de X, para o fabrico de um medicamento para o tratamento terapêutico imunomodulador, para se adminitrar a um paciente numa dose na gama de entre cerca de 1 ng e cerca de 1.000 μg/'kq de peso corporal, do composto referido com a Fórmula 1.
12. 12. reivindicação administração administradas A utilização tal como reivindicada na 11, em que o medicamento assuma uma forma de de uma dose única ou a de uma série de doses intermitentemente.
13. 13. A utilização tal como na reivindicação 11 ou na reivindicação 12, na qual o medicamento assuma uma forma para administração por injecção parenteral, inalação oral ou nasal, ou ingestão oral.
14. 14. A utilização tal como se reivindicou em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, na qual o composto com a Fórmula 1 seja tal como se definiu na reivindicação 3 .
15. 15. A utilização tal como se reivindicou em 4 ΡΕ1042286 qualquer uma das reivindicações 11 a 13, na qual o composto com a Fórmula 1 seja γ-D-glutamil-L-triptofano.
16. 16. A utilização tal como se reivindicou em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, na qual a administração seja eficaz para modular o sistema imunológico de um paciente. Lisboa, 1 de Outubro de 2010