NL9000551A

NL9000551A - Sdk peptiden, werkwijze voor de bereiding daarvan en therapeutische preparaten die deze bevatten.

Info

Publication number: NL9000551A
Application number: NL9000551A
Authority: NL
Original assignee: Scras
Priority date: 1989-03-11
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 1990-10-01
Also published as: OA09197A; MY106274A; IT1240933B; CH680666A5; ES2023746A6; NO901129L; IE64762B1; PT93380A; CA2011874C; SG91892G; AR245139A1; FI901196A0; DK173932B1; MA21770A1; NZ232815A; AU631197B2; KR0133850B1; FR2644065A1; AT402822B; CA2011874A1

Description

SDK PEPTIDEN, WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING DAARVAN EN THERAPEUTISCHE PREPARATEN DIE DEZE BEVATTEN

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op SDK peptiden, op een werkwijze voor de bereiding daarvan en op therapeutische preparaten die ze bevatten.

De in deze beschrijving gebruikte afkortingen volgen de aanbevelingen voor de nomenclatuur en symbolen voor aminozuren en peptiden uit 1983 van de IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (Eur. J. Biochem. 138, 9-37 (1984)). Voor een gemakkelijk begrip worden bepaalde van deze afkortingen hierna vermeld:

Asp of D asparaginezuur

Ser of S serine

Lys of K lysine

Pro of P proline

Thr of T threonine Z benzyloxycarbonyl

Boe t-butoxycarbonyl OBzl benzyloxy

Ac acetyl

Andere gebruikte afkortingen zijn: DMF dimethylformamide DCM dichloormethaan NMM N-methylmorfoline TPA trifluorazijnzuur TLC dunne laag chromatografie FAB bombardement met snelle atomen

De uitvinding heeft betrekking op peptiden met de

algemene formule I

waarin X voorstelt een Pro- of Lys-rest of een valentiebinding, en W voorstelt een Thr- of Pro-rest of een valentiebinding, met de voorwaarde dat, wanneer X een Pro-rest voorstelt W eveneens een Pro-rest voor- stelt.

De peptiden die worden omvat door de algemene formule I kunnen als volgt worden genoteerd:

Ser-Asp-Lys (i)

Ser-Asp-Lys-Lys (ii)

Pro-Ser-Asp-Lys-Lys (iii)

Thr-Ser-Asp-Lys-Lys (iv)

Pro-Ser-Asp-Lys (v)

Thr-Ser-Asp-Lys (vi)

Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (vii)

De uitvinding betreft ook farmaceutisch aanvaardbare zouten van de peptiden met de algemene formule I.

Dit tripeptide (i), waarop de andere peptiden volgens de uitvinding zijn gebaseerd, blijkt tot op de voorrangsdatum niet te zijn geïsoleerd of bereid. Deze sequenties van aminozuren zijn echter gevonden in verschillende levende proteïnen, bijvoorbeeld Ser-Asp-Lys in membraanproteïne van T-lymfocyt waar het blijkt te werken als een deel van een merkteken van lymfocyten zoals CD2-lymfocyt, en als a- of Y-subeenheid van T-receptor die de specifieke sequentie bevat welke een (bepaalde) plaats inneemt ten opzichte van bepaalde specifieke receptors van de lymfocyt; deze aminozuursequenties kunnen ook worden gevonden in verschillende proteïnen, zoals virusproteïnen en ook in bepaalde proteïnen van het complement of tumornecrosefactor α.

Het was derhalve bijzonder belangwekkend om de werking van de specifieke aminozuursequenties te onderzoeken en volgens de uitvinding werd gevonden dat ze een actieve rol spelen op het gebied van de immuno-modulatie zoals wordt aangetoond door de immunologische rapporten.

Deze uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het bereiden van deze peptiden die wordt uitgevoerd langs de gebruikelijke weg door de volgende opeenvolging van reacties:

I Boe K(Z) - X( ) - OH

II Boe D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH

III Boe S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH

IV Boe W( ) - S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH

met de afspraak dat: a) de haken die staan na W of X leeg zijn als W en X de betekenis Pro hebben, dat de haken die staan na W Bzl bevatten indien W de betekenis Thr heeft en dat de haken die staan na X Z bevatten als X de betekenis Lys heeft, en b) als W en/of X een valentiebinding voorstellen, de corresponderende stap wordt weggelaten.

Als een therapeutisch aanvaardbaar zout wordt bereid, bijvoorbeeld acetyl, moet het omzetten in de zoutvorm worden uitgevoerd voordat de laatste stap van verwijderen van een beschermende groep wordt uitgevoerd.

De oplosmiddelen die hierbij worden gebruikt zijn van Purex kwaliteit. DMF wordt bewaard op een moleculaire zeef van 3 en 4 A.

TLCs worden gemaakt op in de handel verkrijgbare analytische platen. De platen worden waargenomen bij 254 nm en het chromatogram wordt zichtbaar gemaakt met een ninhydrine oplossing en volgens Pataki. Er worden de volgende oplosmiddelen gebruikt: A: DCM/methanol (vol.verh. 8/2) B: n-butanol/AcOH/water (vol.verh. 4/1/1) en C: n-butanol/AcOH/water/pyridine (vol.verh. l/l/l/l).

Tussenprodukten worden zonodig gezuiverd op een kolom van siliciumdioxyde (silica 60 A (40-60 μ) SDS) en ze worden gekarakteriseerd door hun massaspectrum (moleculaire piek of MH+), door een bombardement met snelle atomen (FAB).

Eindprodukten worden gezuiverd door HPLC met een semi-preparatieve kolom (7,2 mm x 250 mm) van C ODS Hypersil 10 μ SFCC, 18 waarbij op isocratische wijze of met een gradiënt wordt gewerkt.

Analyse van aminozuren wordt uitgevoerd na zure hydrolyse van het peptide met 6N HC1, bij 110°C gedurende 12 uur in een HPLC apparaat.

Deze uitvinding heeft tenslotte (ook) betrekking op therapeutische preparaten waarvan het actieve bestanddeel bestaat uit een voldoende hoeveelheid van de genoemde peptiden, in combinatie met dragers die geschikt zijn voor de gekozen wijze van toediening.

De uitvinding zal beter worden begrepen uit de be- schrijving van de bereiding van Ser-Asp-Lys (i).

SYNTHESE VAN PEPTIDEN

Syntheses zijn stap voor stap uitgevoerd met de gemengde anhydridemethode, onder toepassing van isobutylchloorformiaat of volgens de actieve estermethode, onder toepassing van esters van N-hydroxysuccinimide. De beschermde aminozuren zijn in ue nandel ver krijgbare produkten.

VERWIJDEREN VAN EEN BESCHERMENDE GROEP

De Boe groep wordt afgesplitst door acidolyse met TFA: het peptide wordt gedurende 1 tot 2 uur bij kamertemperatuur be handeld met een mengsel (vol.verh. 1/1) van DCM/TFA (10 tot 30 equivalenten) .

De ZBzl of QBzl groepen worden gehydrogenolyseerd. Het peptide, opgelost in een mengsel van methanol/water (vol.verh.

9/1) wordt gehydrogenolyseerd bij aanwezigheid van 10% Pd op kool.

ACETYLERBN

Acetyleren vindt plaats door acetylimidazool in DMF te laten reageren met het trifluoracetaat van het amine dat is geneutraliseerd met triethylamine.

BEREIDING VAN Boe P(OBzl) K(z) 1

De ester van het N-hydroxysuccinimide van Boe D(OBzl) (1 mol) wordt opgelost in 2,5 ml DMF. Een suspensie van K(Z) (1,1 eq.) wordt aan deze oplossing toegevoegd; het mengsel wordt in een ijsbad geplaatst en onder roeren worden 1,1 eq. triethylamine toegevoegd. Het roeren wordt 24 uur voortgezet. Het reactiemengsel wordt onder verlaagde druk ingedampt. Het residu wordt daarna behandeld met ethylacetaat en een oplossing van 0,5 N HC1. De organische fase wordt uitgewassen met water, daarna met een verzadigde oplossing van natriumchloride en gedroogd boven natriumsulfaat en wordt tenslotte onder verlaagde druk drooggedampt. Het residu wordt gechromatografeerd over een kolom van silicagel: en geelueerd met een mengsel van DCM/methanol (vol.verh. 95/5). De homogene fracties van TLC worden verzameld. Opbrengst 0,540 g.

BEREIDING VAN Boe S(Bzl) D(OBzl) K(Z) 2 0,5 mM van component 1_ worden behandeld met 1,4 cm.3 van een mengsel van TFA/DCM (vol.verh. 1/1) (20 equivalenten). Na 60 minuten behandeling bij kamertemperatuur, worden de oplosmiddelen onder verlaagde druk afgedampt. Het residu wordt tweemaal behandeld met DCM en onder verlaagde druk gedroogd bij aanwezigheid van KOH.

De ester van het N-hydroxysuccinimide van Boe S(Bzl) (1,2 eq.) en het eerder verkregen trifluoracetaat worden opgelost in 1,3 ml DMF. Onder roeren met een magnetische roerder wordt 1 equivalent triethylamine toegevoegd. Het roeren wordt 24 uur voortgezet. Het reac-tiemengsel wordt op dezelfde wijze behandeld als beschreven voor bereiding 1_. Het residu wordt gechromatografeerd over silicagel en het verkregen produkt wordt geelueerd met een mengsel van diethylether/metha-nol (vol.verh. 8/2). De homogene fracties van het TLC worden verzameld (opbrengst:0,318 g, 83%). Bij wrijven met pentaan wordt een vaste stof verkregen (0,27 g). Massaspectrometrie (MS) (FAB) MH+; berekend werd 763 en gevonden werd 763 en 763,100 (MH+ - Boe).

BEREIDING VAN NAc S(Bzl) D(OBzl) K(Z) 3

Van het derivaat 2 wordt de beschermende groep verwijderd met een oplossing van 3,IN HC1 (20 equivalenten) in tetrahydro-furan. De oplossing wordt 6½ uur bij kamertemperatuur geroerd. Het re-actiemengsel wordt ingedampt en onder verlaagde druk gedurende 1 nacht bij aanwezigheid van KOH gedroogd.

Het verkregen hydrochloride en 1,1 equivalent ace-tylimidazool worden opgelost in 1 ml DMF. De pH van deze oplossing wordt met triethylamine op 7,5 gebracht. Het mengsel wordt 22 uur geroerd. Het reactiemengsel wordt daarna ingedampt en het residu wordt behandeld met ethylacetaat en een 0,5N oplossing van HC1. De organische fase wordt uitgewassen met water en met een verzadigde natriumchloride-oplossing en wordt daarna gedroogd boven natriumsulfaat.

MS FAB MH+, hiervoor werd berekend 705 en werd gevonden 705.

BEREIDING VAN NAc SDK 4 0,140 g van het derivaat 3_ (0,2 mM) opgelost in 3 ml methanol en 1 ml water wordt 22 uur gehydrogenolyseerd bij aanwezigheid van 10% Pd/C. De katalysator wordt afgefiltreerd over een filterlaag van celite en het oplosmiddel wordt onder verlaagde druk afgedampt. Opbrengst:0,079 g. Bij TLC ontstaan 2 vlekken die gevoelig zijn voor ninhydrine.

Het produkt wordt gezuiverd door HPLC, volgens de isocratischemethode; elueermiddel:water:TFA 0,1%; debiet 4 ml/min.· t - 8 min.

Analyse van aminozuren: S: 0,9 (1); D: 1,3 (1); K: 1,3 (1) MS: FAB MH+ hiervoor werd berekend 391 en werd waargenomen 391.

BEREIDING VAN SDK 5

Het tripeptide 2 wordt eerst 1½ uur lang behandeld met een mengsel van TFA/DCM (vol.verh. 1:1); daarna worden de oplosmiddelen onder verlaagde druk afgedampt en wordt het residu behandeld met tolueen; het oplosmiddel wordt afgedampt en het residu wordt 20 uur lang bij kamertemperatuur gehydrogenolyseerd in een oplossing van 3 ml methanol en 0,3 ml water, bij aanwezigheid van 0,030 g Pd/C. De katalysator wordt afgefiltreerd op een filterlaag van celite en het oplosmiddel wordt onder verlaagde druk afgedampt. Opbrengst:0,090 g.

MS MH+, hiervoor wordt gevonden 349 en werd berekend 349.

Produkt _5_ wordt gezuiverd dóór middel van HPLC volgens de isocratische methode;elueermiddel:weter, TFA 0,10«, debiet 2 ml/min; t = 6 min.

Analyse van aminozuren: S: 1(1); D: 0,8 (1); K: 1,3 (1).

De andere peptiden volgens de uitvinding worden bereid met dezelfde techniek als toegepast voor SDK.

Het belang van de onderhavige uitvinding zal worden toegelicht door de volgende immunologische rapporten.

PROTOCOL VOOR ROSETTES

I - Prepareren van rode bloedcellen van schapen.

Was de rode bloedcellen (RBC) driemaal uit in RPMI 1640 of RBS of Hanks (oplossing) + antibiotica. Centrifugeer gedurende 7 min met 3000 omw/min..

Breng het celsap in suspensie. Tel. Breng de concentratie op 2.108 RBC/ml in een oplossing van RPMI met 20% serum van foetale kalveren (FCS) (4 ml eerder geadsorbeerd aan 1 ml RBC sap, 30 min. houden op een ijsbad en daarna 7 min. centrifugeren met 3000 omw/min. en winnen van het materiaal onder steriele omstandigheden).

II - Prepareren van Jurkat T-cellen.

Neem een afgemeten hoeveelheid van een culture van Jurkat T-cellen.Bepaal de levensvatbaarheid met Trypan blauw.

Neem vervolgens een volume hoeveelheid van de cellen die nodig is voor praktisch werken. Was de cellen driemaal uit in RPMI 1640 of PBS of Hanks (oplossing) + antibiotica. Centrifugeer gedurende 7 min. met 900 omw/min..

Breng het celsap in suspensie. Tel. Breng de concentratie op 2.106 Jurkat T-cellen/ml oplossing van RPMI met 20% geadsorbeerde FCS.

III - Prepareren van het peptide.

-7

Remmende oplossing = SDK (2.10 mol).

Te evalueren peptiden worden opgelost in RPMI 1640 in een geschikte concentratie.

IV - Test

Breng in de proefbuis 200 yl van de remmende oplossing + 100 yl Jurkat T-cellen (met een concentratie van 2.10^ M in RPMI + FCS 20%),laat de buis met inhoud 10 min. in een ijsbad staan.

g

Voeg 100 μΐ RBC 2.10 M in RMPI + FCS 20%, toe.

Centrifugeer 5 min. met 500 omw/min.. Laat een o nacht bij 4 C staan.

V - Tellen van rosettes.

Rust de microscoop uit met: oculair 6x opjectief 7x.

Breng de cellen zorgvuldig weer in suspensie door zachtjes te kloppen. Laat de buis met inhoud korte tijd rustig staan.

Voeg aan de buis 30 μΐ van een 1% oplossing van Toluidine blauw toe (om de lymfocyten te kleuren). Klop zachtjes.

Voer per experimenteelpunt 3 aflezingen met de Ma-lassex hemocytometer uit.

De resultaten zijn vermeld in de volgende tabel.

% ROSETTES (percentage remming)

( ) percentage remming * : α < 0/001 : a < 0,01 *** : α < 0,05 ISOLATIE VAN MENSELIJKE PERIFERALE EENKERNIGE CELLEN.

I - Isolatie van (nPMN)

Verdun bloed tot de ½ concentratie met PBS.

Breng 35 ml verdund bloed op 15 ml Ficoll-Hypaque, Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. met 1800 omw/min.. Neem de ring die correspondeert met mononucleaire cellèn (MNC) weg met een Pasteur-pipet.

Was tweemaal uit in PBS (10 min. centrifugeren met 1800 omw/min.).

6

Breng de concentratie op 2.10 cellen/ml met RPMI 1640 "volledig" medium + 10% SVF.

II - Reactieve produkten PHA-M : reconstitueer een flesje van 5 ml gevriesdroogd materiaal met 5 ml "volledig" medium. Oplossing van 100%. Verdun zo dat een 0,4% oplossing wordt verkregen.

Peptiden: . SDK : Buis met 10^ mol + 4,35 ml "volledig" medium.

-4

Oplossing 2,3x10 M.

Verdun daarna achtereenvolgens 450" μΐ "medium" + 50 μΐ verdunde oplossing.

III - Protocol

Breng in gesteriliseerde NUNC platen met 96 holten: 100 μΐ MNC met 2.10^ cellen/ml (2,10^ cellen) 50 μΐ PHA 0,4% (0,1% uiteindelijke concentratie) 50 μΐ medium 30 μΐ peptide (3.10 ^ M).

Incubeer 3 dagen lang bij 37°C in een atmosfeer van lucht/C02 (vol.verh. 95/5). Maak gedurende de laatste 24 uur een puls van PË/ thymidine: 1 μοί/ΐιοΐΐβ. Breng de inhoud van de holten op filters en tel met een teller.

De resultaten zijn vermeld in de volgende tabel.

Stimulatie van de proliferatie van T lymfocyten door Ser-Asp-Lys (SDK) en Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (PSDKP)

* : α < 0,001 ** : α < 0,02 **** ; ot < 0,01 MNC : Mononuculeaire cel

RESPONSIE VAN LICHAAMSVLOEISTOF

6 tot 8 weken oude muizen van de stam B6D2F1 worden, op dag 0, gesensibiliseerd met 0,2 ml van een suspensie van rode bloed- — o — cellen van schapen /10 cellen/ in een zoutoplossing volgens Hanks.

De peptiden Ser-Asp-Lys en Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (3 pg/kg) werden, opgelost in fysiologisch serum, langs IP weg, in 0,2 ml, op de bestemde tijd geinjecteerd.

Op dag + 4, worden de dieren gedood en wordt het aantal B-lymfocyten dat IgM immunoglobulinen afscheidt geteld met behulp van de hemolyseplaattechniek (methode van Jerne).

8 muizen/partij. 4 bepalingen/dier herhaalde proef: 2 experimenten/punt.

De resultaten zijn vermeld in de volgende tabel.

Stimulatie van de lichaamsvloeistofresponsie bij muizen op een T-afhankelijk antigeen in de rode bloedcellen van schapen, door de peptiden Ser-Asp-Lys en Pro-Ser-Asp-Lys-Pro 6 (aantal P.F.C./1Q cellen)

* : α < 0,001 ** : a < 0,01 ( ) percentage stimulatie peptide-concentratie : 3 yg/kg

TOXICITEIT

Bij toediening per os in de maximaal toedienbare doses, aan ratten en muizen, werd van geen van de peptiden volgens de uitvinding enige toxiciteit vastgesteld. Langs de IP weg werden geen dode dieren gevonden bij een toediening van 1 g/kg voor dezelfde dieren.

WIJZE VAN TOEDIENEN EN POSOLOGIE

, Alleen Ser-Asp-Lys peptiden kunnen oraal worden toe gediend en bereiken hun doel zonder in belangrijke mate te worden afgebroken; tabletten en gelatinecapsules zijn geschikt voor doseereenheden die 10 mg Ser-Asp-Lys bevatten. Bij toedienen langs deze weg vereisen hogere peptiden beschermde preparaatvormen en een hogere dosering per eenheid (20 mg). De dagelijkse doses kunnen lopen van 10 tot 100 mg (SDK) of van 20 tot 200 mg voor hogere peptiden. Bij toedienen langs IP weg zijn de dagelijkse doses 1 tot 10 mg voor onmiddellijke werking, maar preparaat vormen voor geleidelijke afgifte over langere tijd (micro-capsules, micro-bolletjes of dergelijke) kunnen tot 300 mg (actieve stof) bevatten voor een geleidelijke afgifte over een langere periode.

Claims

1. Peptiden met de algemene formule H^NW - Ser - Asp - Lys - X - OH waarin X voorstelt een Pro- of Lys-rest of een valentiebinding en W voorstelt een Thr- of Pro-rest of een valentiebinding; met de voorwaarde dat als X een Pro-rest voorstelt W eveneens een Pro-rest voorstelt, en therapeutisch aanvaardbare zouten daarvan.

2. Ser-Asp-Lys

3. Ser-Asp-Lys-Lys

4. Pro-Ser-Asp-Lys-Lys

5. Thr-Ser-Asp-Lys-Lys

6. Pro-Ser-Asp-Lys

7. Thr-Ser-Asp-Lys

8. Pro-Ser-Asp-Lys-Pro

9. Werkwijze voor de bereiding van de peptiden volgens conclusie 1 met het kenmerk dat men volgens een gebruikelijke weg de volgende opeenvolging van reacties uitvoert: I Boe K(Z) - X( ) - OH II Boe D(OBz^) - K(Z) - X( ) - OH III Boe S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH IV Boe W( ) - S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) -OH, met de bepaling dat: a) de haken die staan na W of X leeg zijn als W en X de betekenis Pro hebben, dat de haken die staan na W Bzl bevatten als W de betekenis Thr heeft en dat de haken die staan na X Z bevatten als X de betekenis Lys heeft, en b) als W en/of X een valentiebinding voorstellen, de corresponderende stap wordt weggelaten.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk dat deze wordt uitgevoerd volgens de gemengde anhydridemethode onder toepassing van isobutylchloorformiaat.

11. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk dat deze wordt uitgevoerd volgens de actieve estermethode onder toepassing van de esters van N-hydroxysuccinimide.

12. Therapeutisch preparaat met immunologische werking, dat 1 tot 300 mg van een peptide volgens één der conclusies 1 tot 8 als werkzaam bestanddeel bevat, in combinatie met geschikte dragers voor de gekozen wijze van toediening.

13. Preparaat volgens conclusie 12 voor orale toediening, met het kenmerk dat dit 10 tot 200 mg werkzaam bestanddeel bevat.

14. Preparaat volgens conclusie 12 voor IP-toe-diening met het kenmerk dat dit 1 tot 300 mg werkzaam bestanddeel bevat.