DE2602443A1

DE2602443A1 - Biologisch aktive polypeptide

Info

Publication number: DE2602443A1
Application number: DE19762602443
Authority: DE
Inventors: Robert N Hamburger
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1975-04-04
Filing date: 1976-01-23
Publication date: 1976-10-21
Also published as: US4161522A; BE840193A; JPS602318B2; JPS51118702A; DE2602443C2

Description

PATENTANWÄLTE 2^02443'

DipWng. P. WIRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK DipL-lng. G. DAN N EN BERG · Dr. P. WEIN HOLD · Dr. D. GUDEL

281134 β FRANKFURT AM MAIN

TELEFON (0611)

287014 GR. ESCHENHEIMER STBASSE 38

SK/SK

Case PA-787 UC

The Regents of the University of California

2200 University Avenue ~ .

Berkeley, California 94 720 U.S.A.

Biologisch aktive Polypeptide

Die Symptome allergischer Erkrankungen beim Menschen, insbesondere das allergische Syndrom, werden durch die Freisetzung vascäktiver Amine, insbesondere Histamin, in den Organismus hervorgerufen. Das Histamin wird normalerweise in besonderen, als hzszzellen bekannten Zellen-und Basophilleucocyten gelagert, die über den gesamten Organismus verteiltsind. Die Mastzellen sind über die gesamte Gewebestruktur beim Menschen verteilt, während die Basophilen mit dem Blut im Körper, d.h. innerhalb des vaskularen Systems, zirkulieren.

Die oben genannten Zellen produzieren und lagern Histamin innerhalb ihrer inneren Strukturen, in welchen das Histamin verblei=-., wenn nicht eine besondere Folge von Ereignissen eintritt, um die

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Freisetzung des Histamine aus innerhalb den Zellstrukturen in das umgebende Gewebe und l/askularsystem auszulösen.

Das Histamin wird insbesondere im Ansp-rechen auf die Anwesenheit spezifischer Antigene (Allergene) freigesetzt, die sich in den Organismus Eingang v/erschaffen oder durch den Organismus im Ansprechen auf ein traumatisches Geschehen freigesetzt werden können. Die übliche Histaminfreisetzung aus den Mastzellen oder Basophilen wird jedoch durch eine notwendige Folge chemischer und immunologischer Ereignisse ausgelöst, die auf und in den Mastzeil- und Basophilstrukturen stattfinden.

Die Allergen -r-Mastzellen (Basophil)-Reaktion wird insbesondere durch eine als Immunoglobulin E (IgO bekannte Gruppe von Proteinen begünstigt, die innerhalb des Körpers produziert warden. Das durch den menschlichen Organismus gebildete IgE ist ein komplexes Gebilde von Polypeptidketten, deren Moleküle jeweils bestimmte Variationen in der Folge der Aminosäuren in der Polypeptidkette aufweisen können, von denen jedoch alle im wesentlichen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine "Y" förrnige Struktur haben, u;cbei der "Fuß" (d.h. der untere Teil des "Y") in Form des (Fc) PoIy-

(Sequenz) peptidanteil oder -fragmentes eine fixierte Fulge/oder "konstante Region" von Peptiden entlang der Kette enthält. Der "Kopf" (entsprechend den nach oben weisenden Armen der "Y" Struktur) kann Regionen aufweisen, in welchen die Polypeptidkette variiert (die variable Region des Fab), und zwar von Molekül zu Molekül. So haben die IgE Moleküle gewöhnlich identische "Fuß"-Peptidfolgen, können jedoch eine große Anzahl unterschiedlicher "Kopf"Peptidfolgen haben.

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Die allergische oder immunologische Histaminfreisetzung innerhalb des Organismus aus den spezialisierten Mastzellen und Basophilen kann unter den folgenden Umstanden auftreten:

Alle Mastzellen oder Basophilen besitzen eine Anzahl von RezeptcE-stellen, die zum "Ankoppeln" der konstanten Region oder des Fc Anteil der IgE Moleküle verfügbar sind. Diese "Bindesteilen" sind spezialisierte Gebiete auf der Zell-membran, in welchen ein besondere geometrische oder räumliche Molekulararrangement erfolgt, wodurch diese "Binder- oder Rezeptorstelle" an das Fc Fragment oder eine Stelle in der konstanten Region des IgE Moleküls "ankoppeln" kann·

Sollte ein wanderndes IgE Molekül eine freie "Binderezepforetells" auf einer Mastzelle oder einem Basophilen finden, koppelt es mit seinem Fc Teil an die Binde(Rezeptor)Stelle der Zelle, um das IgE Molekül an der Mastzelle oder dem Basophil festzumachen.

Wenn der Fc Teil des IgE Moleküls an die bindende "Rezeptorstelle" festgemacht ist, sind die nach oben weisenden Arme der "Y" förmigen Moleküls (der F(ab) Anteil) frei, sich oberhalb der Zellobsrflache auszudehnen. Diese verlängerten, bzw. hinausweisenden oberen Peptidketten wirken ihrerseits als Rezeptoren für Allergene, die in der Umgebung des Organismus anwesend sein können. Wenn der Polypeptidstruktur der Fab Anteile mit einem besonderen Allergen verträglich sind, kann sich das Allergen an das sich nach außen erstreckende Fab der IgE Polypeptidkette binden. Im Fall einer Bindung wird die Mastzelle oder das Basophil automatisch stimuliert, um das Histamin aus der inneren Zellstruktur in die örtliche Umgebung der Mastzelle oder des Basophils freizusetzen. Ist

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das Histamin erst einmal freigesetzt, dann treten die bekannten "allergischen Symptome" auf.

Die derzeitige Therapie allergischer Erkrankungen umfaßt die Hyposensibilisierung (wiederholte Injektionen schädlicher Allergene zur Bildung von "Blockierungsantikörpern"), die systemische Therapie mit Antihistaminen (die mit den wählend der allergischen Reaktion freigesetzten Histaminen konkurrieren) und Dinatriumcromoglykat (das die durch allergische Reaktionen freigesetzte Histaminmenge verringern kann). Auch Corticosteroide, Isoprenalin und Theophyllin sowie andere Arzneimittel sind bei der Allergietherapie verwendet worden. Keines der oben genannten Arzneimittel oder Verfahren stört jedoch die grundsätzliche Reaktion der IgE Mastzelle (Basophil), und alle haben wesentliche Einschränxjngen bezüglich ihrer Eignung.

Ein anderer Therapiewag, der durch die obige Analyse der Allergen-IgE-Mastzell(Basophil)-Reaktion vorgeschlagen wird, wäre die Einführung eines Arzneimittels in den Organismus, das die Rezeptoroder Bindestellen von Mastzellen (Basophilen) gegen die Bindung des IgE Moleküls "blockieren" würde. Von gleicher Wichtigkeit wäre ein Arzneimittel, das nicht nur die Bindestellen "blockieren" sondern weiterhin das IgE von den Bindestellen, an welches es sich bereits angelagert hat, entfernen würde. 3ede,s Auffüllen oder Vermindern der zur IgE Anlagerung verfügbaren Bindestellen würde selbstverständlich die Anzahl der Allergen-IgE-Mastzellen-(Basophil)-Reaktionen verringern, wodurch diE Histaminfreisetzung in den Organismus vermindert und so allergische Reaktionen herabgesetzt oder verhindert würden.

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Es gibt bereits einige Versuche, diesen therapeutischen Weg zu begehen. So wurde z.B. in "Lancet" vom 6. 3uli 1968 eine Untersuchung veröffentlicht, in welcher der gesamte Fc Anteil des IgE sou/ie kleine proteolytische Verdauungsfragmente desselben auf ihre Fähigkeit zum Unterdrücken allergischer Reaktionen getestet ujurden. Diese Untersuchung legte nahe, daß nur das gesamte Fc Fragment von IgE ebenso wirksam wie das intakte IgE Molekül bei der Inhibierung allergischer Reaktionen war, während die Verdauungsfragmente ("digestion fragments") unwirksam waren. Das heißt, alle-Bruchteile der FC Peptidkette kleiner als das gesamte Polypeptid waren bei der Verhütung induzierter allergischer Reaktionen ungeeignet. Das Fc Fragment selbst kann als therapeutisches orisr Arzneimittel nicht verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf neue, niedrig molekulare Polypeptide, die als therapeutische Mittel bei der Behandlung allergischer Erkrankungen oder des allergischen Syndroms geeignet sind.

Die vorliegende Erfindung richtet sich insbesondere auf Polypeptide mit 3-10 Aminosäuraresten, die ein allergisches Ansprechen zbLü, Menschen blockieren können. Diese relativ kurzkettigen Polypep-

(Sequenzen),
tide entsprechen Folgen/ die in der zweiten (C-2), dritten (C-3) und vierten (C-4) Domäne der konstanten (Fc) Region der(£^-Peptidkette des IgE Moleküls vorkommen.

Die Aminosäurefolge der gesamten £-Kette wurde neuerdings von Bennich et al bestimmt und in "Progress in Immunology II-Bd. 1: Immunochemical Aspects", Juli 1974, Seite 49-58, North Holland

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Publishing Company, Amsterdam, (1974) veröffentlicht. Die Folge der Fc Region, in welcher die erfindungsgemäßen Aminosäurafolgen vorkommen, ist uiie folgt, wobei die Zahlen am Rand die numerische Stellung in der Folge der Aminosäure rechts von derselben anzeigt:

265-(Met)-Asp-Val-Asp-Leu-Ser-Tiir-Ala-Ser-Thr-Glu-Ser-Glu-Gly-Glu-Leu-Ala-Ser-Thr-Glu-Ser-Glu-Leu-Thr -

289- Leu-Ser-Gln-Lys-His-Trp-Leu-Ser-Asp-Arg-Thr-Tyr-Thr-Ci's-Glu-Val-Thr-Tyr-Glx-Gly-His-Thr-Phen-Glx-

313- Asx-Ser-Thr-Lys-Lys-Cys-Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg-Gly-

Val-Ser-Ala-Tyr-Leu-Ser-Arg-Pro-Ser-Pro-Phe- 337- Asp-Leu-Phe-Ile-Arg-Lys-Ser-Pro-Thr-Ile-Thr-Cys-Leu-

Val-Val-Asx-Leu-Ala-Pro-Ser-Lys-Gly-Thr-Val - 361- Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly-Lys-Pro-Val-Asx-

His-Ser-Thr-Arg-Lys-Glu-Glu-Lys-Gln-Arg-Asn-385-Gly-Thr-Leu-Thr-Val-Thr-Ser-Thr-Leu-Pro-Val-Gly-Thr-

Arg-Asx-Trp-Ile-Glu-Gly-Glu-Thr-Tyr-Glx-Cys- 409- Arg-Val-Thr-His-Pro-His-Leu-Pro-Arg-Ala-Leu-Met-Arg-

Ser-Thr-Thr-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Arg-Ala-Ala- 433- Pro-Glu-Val-Tyr-Ala-Phe-Ala-Thr-Pro-Glu-Trp-Pro-Gly-

Ser-Arg-Asp-Lys-Arg-Thr-Leu-Ala-Cys-Leu-Ile- 457- Gln-Asn-Phe-Met-Pro-Glu-Asp-Ile-Ser-Val-Gln-Trp-Leu-His-Asn-Glu-Val-Gln-Leu-Pro-Asp-Ala-Arg-His-

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481- Ser-Thr-Thr-Glu-Pro-Arg-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Pha Phe-Val-Phe-Ser-Arg-Leu-Glu-Val-Thr-Arg-Ala-

505- Glu-Trp-Gln-Glu-Lys-Asp-Glu-Phe-Ile-Cys-Arg-Ala-Val His-Glu-Ala-Ala-Ser-Pro-Ser-Gln-Thr-Val-Gln-

529- Arg-Ala-Val-Ser-Val-Asn-Pro-Gly-Lys

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen sind Polypeptide aus 3-10 Aminosäuren in einer Folge, die aus einem Teil der obigen Aminosäurefolge ausgewählt ist, sciuie deren Salze, Ester, Amide, I\!-Acyl- und O-Acylderivate,

Wie bereits geschehen, werden zur einfacheren Beschreibung der vorliegenden Erfindung die üblichen Abkürzungen für die verschiedenen Aminosäuren verwendet, die dem Fachmann geläufig sind. Zur besseren Klarheit werden jedoch die erfindungsgemäß in Frage kommenden Verbindungen im folgenden noch aufgeführt. Alle hier erwähnten, chiralen Aminosäurereste haben, falls nicht anders angegeben, die natürliche oder L^Konfiguration. Alle hier aufgeführten Peptidfolgen sind in üblicher Weise geschrieben, wodurch die N-endständige Aminosäure links und die C-endständige Aminosäure rechts steht.

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Asp - Asparginsäure Ala - Alanin Arg - Arginin Asn - Asparagin Asx - Asparginsäure oder Asparagin

(zeigt Unsicherheit in der Zersetzungsanalyse)

Cys - Cystein GIy - Glycin GIn - Glutamin GIx - Glutaminsäure oder Glutamin

(zeigt Unsicherheit in der Zersetzungsanalyse)

His - Histidin He - Isoleucin Leu - Leucin Lys- Lysin Met - Methionin Phe - Phenylalanin Pro - Prolin Ser - Serin Thr - Threonin Trp - Tryptophan Tyr - Tyrosin VaI - Valin

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₉ _ 2BU2443

Die hier verwendete Bezeichnung "Salze" bezieht sich sowohl auf Salze einer Carboxylgruppe der Polypaptidkette als auch auf Säureadditionssalze einer Aminogruppe der Polypeptidkette. Salze einer Carboxylgruppe können mit anorganischen oder organischen Basen gebildet werden. Anorganische Salze umfassen z.B. die Alkalimetallsalze, luie das Natrium-, Kalium- und Lithiumsalz; Erdalkalisalze, uiie das Calcium-, Barium- und Magnesiumsalz j und das Ammonium-, Ferro-, Ferri-, Zink-, Mangano-, Aluminium-, Manganisalz usw. Salze mit organischen Aminen umfassen solche, die z.8. mit Triniethylamin, Triäthylamin, Tri-(n-propyl)-amin, Dicyclohexylamin, ß- (Dimethylamino)-äthanol, Tris- (hydroxymethyl)-arr.inamethan, Triäthanolamin, ß-(Diäthylamino)-äthanol, Arginin, Lysin, Histidin, N-Äthylpiperidin, Hydrabe«iT.in, Cholin, Betain, Äthylendiamin, Glucosamin, Methylglucamin, Theobromin, Purinen, Piperazinen, Piperidinen, Coffein, Procain usw. gebildet werden.

Säureadditionssalze umfassen z.B. Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure usw; und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glucpnsäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure usw.

Die hier verwendete Bezeichnung "Ester" bezieht sich auf Ester einer Carboxylgruppe des Polypeptide, gebildet mit geraden oder verzweigkettigen gesättigten aliphatischen Alkoholen mit 1-12 C-Atomen, wie der Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, tert.-Butyl-, n-Amyl-, n-Hexyl-, Octyl-, Decyl- und Dodecylester.

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26U2443 - ίο -

Die hier veru/endete Bezeichnung "Amide" bezieht sich auf Amide einer Carboxylgruppe des Polypeptids, gebildet mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen mit bis zu 12 C-Atomen _r tuie Dimethylamin, Diäthylamin, Di-(n-butyl)-amin, n-Hexylamin, Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin, Di-(n-hexyl)-amin, N-Methylpiperazin usu/.

Die "N-Acylderivate" beziehen sich auf Derivate einer Aminogruppe des Polypeptids, gebildet mit Acylteilen (z.B. einer Alkanoylodsr carbocyclischen Aroylgruppe) mit bis zu 12 C-Atomen, wie Formamide, Acetamide, Benzamide usui,

Die "Q-Acylderivate" beziehen sich auf Derivate einer Hydroxylgruppe der Polypeptidkette, gebildet mit Acylteilen (z.B. Alkanoyl- oder carboxcyclischen Aroylgruppen) mit bis zu 12 C-Atomen, wie Formiate, Acetate, Propionate, Benzoate usuj.

Erfindungsgemäß bevorzugte Polypeptide haben Aminosäurefolgen, die nicht-analog mit vergleichbaren Regionen in anderen Immunoglobulinen sind. In.dieser Hinsicht können die folgenden Peptide besonders ermähnt werden:

266 - Asp-Val-Asp-Leu-Ser

271 - Thr-Ala-Ser-Thr-Glu

266 - Asp-Val-Asp-Leu-Ser-Thr-Ala-Ser-Thr-Glu 289 - Leu-Ser-Gln-Lys-His

319 - Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg

320 - Asp-Ser-Asp-Pro-Arg

321 - Ser-Asp-Pro-Arg

322 - Asp-Pro-Arg

354 - Ala-Pro-Ser-Lys-Gly-Thr

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π - 26Ü2U3

367 - Ala-Ser-Gly-Lys-Pro

437 - Ala-Phe-Ala-Thr-Pro-Glu-Trp-Pro-Gly-Ser 437 - Ala-Phe-Ala-Thr-Pro

442 - Glu-Trp-Pro-Gly-Ser

476 - Pro-Asp-Ala-Arg-His-Ser

521 - Ala-Ser-Pro-Ser-Gln

sowie deren Salze, Ester, Amide, N-Acyl- und O-Acylderivate. Ein besonder bevorzugtes Pclypeptid ist Asp-Ser-Asp-Pro-Arg.

Die obige Liste soll nicht als vollständig gelten, und es sich weitere Peptide mit kürzerer Folge als oben oder mit Folgen, eis zusätzliche Aminosäuren aufweisen, oder Folgen aus anderen Regionen der C-2, C-3 oder C-4€--Domäne wichtig.

Weiterhin richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfanren zur Verhütung oder Erleichterung von Symptomen in Verbindung nit allergischen Manifestationen, wie sie z.B. durch Antigen-Antikörper (allergische) Reaktionen verursacht werden· Das erfindungsgemäße Verfahren blockiert (d.h. inhibiert oder verhindert) die Wirkungen der allergischen Reaktion, wenn das betreffende PoIypeptid in wirksamer Menge verabreicht wird. Das erfindungsgernä3e Verfahren zur Verhütung oder Inhibierung der Wirkungen allergischer Reaktionen ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man* vor-

(aber auch einem Säugetier)

zugsweise einem Menschen,/eine wirksame Menge eines hier beschriebenen Polypeptids oder seines Derivates verabreicht.

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Obgleich die erfindungsgemäßen Verbindungen vermutlich, wie oben beschrieben, durch "Blockieren" der IgE Bindestellen wirken, soll die vorliegende Erfindung an keinen besonderen Wirkungsmechanismus gebunden werden.

Außerdem richtet sich die vorliegende Erfindung auf pharmazeutische Präparate zum Blockieren (d.h. Verhindern oder Inhibieren) der Wirkungen allergischer Reaktionen, wobei die Präparate eine wirksame Menge eines oben beschriebenen Polypeptids oder eines Derivates desselben in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Träger umfassen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine wirksame Menge eines Polypeptids oder eines Derivates desselben oder eine diese enthaltenden pharmazeutischen Präparates in üblicher, anerkannter Weise einzeln oder in Kombination mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen oder anderen pharmazeutischen Mitteln, wie Antihistamine, Corticosteroide usw., verabreicht. Somit können die Verbindungen oder Präparat oral, sublingual, örtlich, (d.h. auf die Haut oder in die.Augen), parenteral (z.B. intramuskulär, intravenös, subkutan oder intradermal) oder durch Inhalation und in Form fester, flüssiger oder gasförmiger Dosen einschließlich Tabletten, Suspensionen und Aerosolen verabreicht werden, wie im folgenden noch näher beschrieben wird. Die Verabreichung kann in kontinuierlicher Therapie mit Einzeldosierungsformen oder ad libitum in Einzeldosistherapie erfolgen.

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In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren, u/enn die Erleichterung von Symptomen besonders notwendig ist oder möglicherweise bevorsteht; in einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren als kontinuierliche oder prophylaktische Behandlung.

Aufgrund der obigen Angaben sowie unter Berücksichtigung von Ausmaß oder Schwere der zu behandelnden Erkrankung, dem Alter des Patienten usw. -Faktoren, die vom Fachmann durch Routineversuche

bestimmbar sind - kann die wirksame Dosis erfindungsgemäß über einen weiten Bereich variieren. Da einzelne Patienten in ihrem IgE Gehalt variieren, wird eine wirksame systemische Dosis erfindungsgemäß als zwischen dem 2x10 bis 2x10 Fachen dc3 IgE Gehaltes, auf molarer Basis, angegeben. Für einen Durchschnittschnittspatienten würde dies zwischen etwa 0,5-500 mg/kg/Tag in Abhängigkeit von der Stärke der Verbindung liegen. Selbstverständlich wird für eine lokalisierte Behandlung, z.B. des Atmungssystems, proportional weniger Material benötigt.

Geeignete pharmazeutische Träger zur Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate können Feststoffe, Flüssigkeiten oder Gase sein; so können die Präparate die Form von Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvers, enterisch überzogenen oder anders geschützten Formulierungen (z.B. durch Binden auf Ionenaustauscherharze oder andere Träger, durch Verpacken in Lipid-Protein-Vesikel oder durch Addition zusätzlicher endständiger Aminosäuren oder Ersetzen einer endständigen Aminosäure in der L-Form durch eine in der D-Form), Depotformulierungen, Lösungen (z.B. Augentropfen), Suspensionen, Elixieren, Aerosolen usw. annehmen. Der Träger kann aus ver-

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schiedenen Ölen einschließlich solchen von Erdöl, soiuie tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, wie z.B. Erdnußöl, Sdjabohnenöl, Mineralöl, Sesaraöl usw., ausgewählt u/erden. Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose und Glykole werden als flüssige Träger, insbesondere (wenn isotonisch) für injizierbare Lösungen, bevorzugt. Geeignete pharmazeutische Streckmittel umfassen Stärke, Cellulose, Talkum, Glucose, Lactose, Sucrose, Gelatiae, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselsäuregel, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Natriumchlorid, Trockenmagermilch, Glycerin, Propylenglykol, Wasser, Äthanol usw. Die Präparate können den üblichen pharmazeutischen Maßnahmen, wie Sterilisation, unterworfen werden und die üblichen pharmazeutischen Zusätze, wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Netzmittel oder Emulgatoren, Salze zur Einstellung des osmotischen Druckes, Puffermittel usw., enthalten. Geeignete pharmazeutische Träger und ihre Formulierung werden in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E.W. Martin beschrieben. Die Präparate enthalten in jedem Fall eine wirksame Menge der aktiv/en Verbindung zusammen mit einer geeigneten' Trägermenge zur Hersteilung der richtigen Dosierungsform für die entsprechende Verabreichung an den Patienten.

Um zur Verhütung oder Behandlung allergischer Reaktionen wirksam zu sein, ist es wichtig, daß die therapeutischen Mittel relativ nicht-toxisch, nicht-antigenisch und nicht-irritierend sind bei den Konzentrationen ihrer tatsächlichen Verwendung. Dies ist, wie festgestellt wurde, bei allen erfindungsgemäßen Verbindungen der Fall, deren Herstellung im folgenden beschrieben wird.

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Die erfindungsgemäßen Polypeptide können nach jedem in der Peptidtechnik bekannten !/erfahren hergestellt uierden. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen verfügbaren Verfahren findet sich bei 3. Meienhofer "Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 2, Seite 46, Academic Press, New York (1973) für die Peptidsynthese in fester Phase und bei E. Schröder und K. Lübke "The Peptides", Bd. 1, Academic Press, Nein York (1965) für die klassische Synthese in Lösung.

Gewöhnlich umfassen diese Verfahren die aufeinanderfolgende Addition einer oder mehrerer Aminosäuren oder entsprechend geschützter Aminosäuren an die wachsende Kette. Normalerweise wird entweder die Amino- oder Carboxylgruppe der ersten Aminosäure geschützt, und zwar durch eine geeignete schützende Gruppe. Die geschützte oder in ein Derivat umgewandelte Aminosäure kann dann entweder an einen inerten festen Träger gebunden oder in Lösung durch Zugabe der nächsten Aminosäure in der Reihenfolge mit einer zweckmäßig geschützten, komplementären (Amino- oder Carboxyl)-Gruppe unter geeigneten Bedingungen zur Bildung der Amidbindung verwendet werden. Dann wird die schützende Gruppe von diesem neu addierten Aminosäurerest entfernt, worauf die nächste (zweckmäßig geschützte) Aminosäure addiert wird usw. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge gebunden sind, werden irgendwelche verbliebenen schützenden Gruppen (und alle festen Träger) nacheinander oder gleichzeitig zur Bildung des endgültigen Polypeptids entfernt. Durch einfache Modifikation dieses allgemeinen Verfahrens kann man mehr als eine Aminosäure gleichzeitig an eine wachsende Kette addieren, z.B. durch

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Kuppeln (unter Bedingungen, die chirale Zentren nicht racemisieren) eines geschützten Tripeptids mit einem entsprechend geschützten Dipeptid, um nach Entfernung der schützenden Gruppen ein Pentapeptid zu erhalten.

Die schützenden Gruppen sollten gegen die Bedingungen der Bildung der Peptidbindung stabil sein und gleichzeitig ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette oder Racemisierung eines der darin enthaltenen chiralen Zentren leicht entfernbar sein.

Zu den Klassen von Schutzgruppen für Aminogruppen bei der stufenuieisen Synthese von Polypeptiden gehören (1) acylartige schützende Gruppen, tuie Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Toluolsulfonyl (Tosyl), Benzolsulfonyl, o-Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Chloracetyl, Acetyl, ^--Chlorbutyryl usuj. ; (2) aromatische urethanartige schützende Gruppen, u/ie Benzyloxycarbonyl und substituiertes Benzyloxycarbonyl, z.B. p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-l\litrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl, 2-Benzoyl-1-methyluinyl; (3) aliphatische urethanartige schützende Gruppen, wie tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Is op ropy Io xy carbonyl, Äthoxycarbonyl, Allyloxycarbonylj (4) cycloalkylurethanartige schützende Gruppen, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl; (5) thiourethanartige schützende Gruppen, wie Phenylthiocarbonyl; (6) alkylartige schützende Gruppen, wie Triphenyltnethyl (Trityl) und Benzyl; und (7) Trialkylsilylgruppen, wie Trimethylsilyl.

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Bevorzugte schützends Gruppen sind tert.-Butyloxycarbonyl (t-BDC) und tert.-Amyloxycarbonyl (AOC).

Zu den Klassen der für die stufenweise Synthese von Polypeptiden geeigneten, Carboxyschutzgruppen gehören (1) substituierte und unsubstituierte aliphatische Estergruppen, wie Methyl*, Äthyl-, tert.-Butyl-, 2,2,2-Trichloräthyl-und tert.-Butylester;

(2) Aralkylestergruppen, wie Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Methoxy-

ester benzyl-, Diphenylmethyl-oder Triphenylmethyl- (Trityl)/j (3) N-substituierte Hydrazide, iuie tert.-Butyloxycarbonylhydrazide und Carbobenzyloxycarbonylhydrazide; (4) amidschützende Gruppen, gebildet durch Kondensation eines Carboxylteils mit z.B. Ammoniak, Methylamin, Äthylamin, Diphenylrnethylamin usuj.

in

Hydroxylgruppen in Aminosäuren, wie/Serin, Threonin und Hydroxyprolin, können als Aralkyläther, z.B. Benzyläther, geschützt werden.

Geeignet als feste Träger für die obige Synthese sind Materialien, die gegenüber den Reaktionsteilnehmern und Reaktionsbedingungen der stufenteisen Kon densations-Schutzgruppenentfernungs-Reaktionen inert und in den verwendeten Medien unlöslich sind. Verwendbare Materialien umfassen z.B. vernetzte Polystyroldivinylbenzolharze, vernetzte Polyamidharze, Polyäthylenglykolharze, entsprechend funktionalisierte Glasperlen usuj.

Der erste Aminosäurerest wird durch Bildung einer kovalenten Bindung mit einer aktiven Gruppe auf dem Harz an den festen Träger gebunden. Zu diesem Zweck geeignete aktive Gruppen umfassen z.B. Chlormethyl, Benzhydrilamino, Hydroxymethyl, Phenacylhalogenid,

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Dehydraanlanin usu/., u/obei Chlormethyl als aktive Gruppe bevor-

wird

zugt wird. Die erste Aminosäure/an das bevorzugte Chlormethylharz nach einem basisch katalysierten Verfahren gebunden, in welchem das Triäthylamin-, Tetramethylammonium- oder Cäsiumsalz (oder ein ähnliches Salz) der Carbonsäure mit dem Harz in einem Lösungsmittel, wie Äthanol, Dioxan, Dimethylformamid usw., erhitzt wird.

Geeignete Reaktionsteilnehmer zur Amidbildung zwischen Carboxyi- und Aminogruppen sind bekannt und umfassen z.B. (1) Carbodiimide, u/ie Dicyclohexylcarbodii-nid (DCC); (2) ein Carbadiimid plus einen Zusatz, wie 1-Hydroxybenzotriazol oder Äthyl-2-hydroximino-2-cyanacetat; (3) Alkylchlorformiate, u/ie Isobutylchlorformiat oder Äthylchlorformiat; (4) l\l-geschützte Aminosäuren, die durch Eildung eines geeigneten Esters aktiviert sind, z.B. substituierte Phenylester, Aryl- oder Alkylthioester, substituierte 8-Hydroxyisochinolinester, 2-Thiopyridylester und ähnliche bekannte Ester.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide ist das sog.--"Merrif ield"-Verfahren, das bekannt ist und im einzelnen von R.B. Merrifieldin "Synthesis of a Tetrapeptide", D.Am.Chem.Soco, Bd. 85, Seite 2149-2154 (1963), sowie durch die oben genannte Meienhofer-Ueröffentlichung beschrieben wurde.

Bei diesem bevorzugten Uerfahren wird ein Peptid jeder gewünschten Länge und Folge durch stufenweise Addition von Aminosäuren an sine wachsende Peptidkette hergestellt, die durch eine kovalente Bindung an ein festes Harzteilchen gebunden ist.

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In der bevorzugten Anwendung dieses Verfahrens wird das C-endständige Ende der wachsenden Peptidkette kovalent an ein Harzteilchen gebunden, und Aminosäuren mit geschützten Aminogruppen werden in oben dargestellter Weise stufenweise addiert. Eine bevorzugte, die Aminogruppe schützende Gruppe ist die t-BOC Gruppe, die bei den Kondensationsbedingungen shabil und dennoch leicht ohne Zerstörung der Peptidbindungen oder Racemisierung der chiralen Zentren in der Peptidkette entfernbar ist. Am Ende des l/erfahrens wird das endgültige Peptid vom Harz abgespalten, und irgendwelche verbliebenen schützenden Gruppen werden durch Behandlung unter sauren Bedingungen z.B. mit einer Mischung aus Bromwasserstcffsäure und Trifluoressigsäure oder mit Fluorwasserstoffsäure entfernt; oder die Abspaltung vom Harz kann unter basischen Bedingungen, z.B. mit Triäthylamin, erfolgen, wobei die schützenden Gruppen dann unter sauren Bedingungen entfernt werden.

Die abgespaltenen Peptide werden in bekannter Weise isoliert und gereinigt, z.B. durch Lyophilisierung und anschließende Ausschlußoder Teilungschromatographie auf Polysaccharidgelmedien, wie "Sephadex G-25", oder Gegenstromverteilung. Die Zusammensetzung des endgültigen Peptids kann durch Aminosäureanalyse nach Abbau des Peptids durch Standardmaßnahmen bestätigt werden.

Salze der Carboxylgruppen des Peptids können in üblicher Weise durch Berührung des Peptids mit einem oder mehreren Äquivalenten einer gewünschten Base, wie eine metallische Hydroxybase, z.B. Natriumhydroxid, eineMetallcarbonat- oder -bicarbonatbase, wie Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, oder eine Aminbase, wie

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Triethylamin, Triäthanolamin usw., hergestellt werden.

Säureadditionssalze der Polypeptide kann man durch Berührung des Polypeptids mit einem oder mehreren Äquivalenten der gewünschten anorganischen oder organischen Säure, z.B. Salzsäure, herstellen.

Ester von Carboxylgruppen der Polypeptide kann man in üblicher Weise zur Umwandlung einer Carbonsäure oder eines Vorläufers in einen Ester herstellen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Estern der erfindungsgemäßen Polypeptide unter Verwendung des oben beschriebenen Merrifield-Syntheseverfahrens besteht im Abspalten des vollständigen Polypeptids vom Harz in Anwesenheit des gewünschten Alkohols unter basischen oder sauren Bedingungen, was vom Harz abhängt. So wird das C-endständige Ende des Peptics nach Befreiung vom Harz direkt ohne Isolierung der freien Säure verestert.

Amide der erfindungsgemäßen Polypeptide können ebenfalls nach den zur Umwandlung einer Carbonsäuregruppe oder eines Vorläufers in ein Amid üblichen Weise hergestellt werden. Ein bevorzugten Verfahren zur Amidbildung an der C-endständigen Carboxylgruppe ist die Abspaltung des Polypeptids von einem festen Träger mit einetr, entsprechenden Amin oder die Abspaltung in Anwesenheit eines Alkohols, die zu einem Ester führt, sowie die anschließende Aminolyse mit dem gewünschten Amin.

Die N-Acylderivate einer Aminogruppe der erfindungsgemäöen Polypeptide können unter Verwendung einer N-Acyl-geschützten Aminosäure für die endgültige Kondensation oder durch Acylierung eines geschützten oder ungeschützten Peptids hergestellt werden. Die O-Acylderivate können z.B. durch Acylierung eines freien Hydroxy-

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peptids oder Peptidharzes hergestellt werden. 3ede Acylierung kann mit üblichen Acylierungsmitteln, wie Acylhalcgenide, Anhydride, Acylimidazole usw., durchgeführt werden. Gegebenenfalls können N- und O-Acylierung zusammen durchgeführt werden.

Die Kupplung, Schutzgruppenentfernungs/Spaltungs-Reaktionen und die Herstellung von Derivaten der erfindungsgemäßen Polypeptide erfolgen zweckmäßig bei Temperaturen zwischen etwa -10 C. und + 50^QC, vorzugsweise etwa 20-25 C. Selbstverständlich hängt die genaue Temperatur für jede besondere Reaktion von den Substraten, Reaktionäteilnehmern, Lösungsmitteln usw. ab, wie dies dem Fachmann geläufig ist.Beispiele für Reaktionsbedingungen zu diesen Verfahren kennen den Beispielen entnommen werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1_

Herstellung des Tripeptide Asp-Pro-Arg 1,6 g (5 Millimol) t-BOC-IMitroarginin wurde mit 10 g Chlormethylharz (Perlen aus Koprolystyrol - 2 % Divinylbenzol mit 0,5-1 meq Chtomethylgruppen pro g Harz) in einer Mischung aus 1,4 ecm (10 Millimol) Triäthylamin und 100 ecm Äthanol 24 Stunden bei 22⁰C. unter ständigem Rühren umgesetzt. Das argininierte Harz wurde anschließend nacheinander gründlich mit Essigsäure, abs. Äthanol, Wasser mit sich erhöhenden Äthanolmengen, Methanol und schließlich mit Methylenchlorid gewaschen. Dann wurde das Harz gründlich unter Vakuum getrocknet. Die Analyse ergab 0,05 Millimol Arg/g Harz. 2,5 g des so hergestellten Harzes wurden in ein Merrifield-Gefäß für die Reaktion in fester Phase gegeben, das mit Rührmitteln

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versehen iuar und dem folgenden Schutzgruppenentfernungszyklus unterworfen:

(a) unter Rühren wurde bei 22 C. die t-BOG Gruppe mit 10 ecm 4N HCl in Dioxan u/ährend 30 Minuten abgespalten

(b) es uiurde 2 Mal mit 10 ecm Dioxan gewaschen

(c) es u/urde zweimal mit 10 ecm Methylenchlorid gewaschen

(d) es wurde zweimal mit 10 ecm Chloroform gewaschen

(e) das Hydrochlorid wurde mit 10 ecm 5:95 Triäthylamin/Chloroform neutralisiert

(f) es wurde zweimal mit 10 ecm Methylenchlorid gewaschen

(g) es wurde zweimal mit 10 ecm Chloroform gewaschen.

Dann wurde das Harz dem folgenden Synthesezyklus unterworfen: ein 10-facher Überschuß aus t-BOC-Prolin (1,25 Millimol) in Methylenchloridlösung wurde zugefügt, dann wurden 258 mg (1,25 Millimol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und die Mischung 2 Stunden bei 22 C. geschüttelt. Anschließend wurde das Harz dreimal mit je 10 ecm Dioxan, Chloroform bzw. Methylenchlorid gewaschen.

Das Dipeptidharz wurde dann dem Schutzgruppenentfernungszyklus unterworfen und mit einem 4-fachen Überschuß an t-BGC-ß-Benzylaspartat (0,5 Millimol) wie im oben beschriebenen Synthesezyklus umgesetzt. Dann wurde ein 0,5 g Anteil des Harzes aus dem Reaktionsgefä3 entfernt und wie folgt einem Abspaltungsuerfahren unterworfen:

0,5 g des Tripeptidharzes wurden in 5 ecm trockener Trifluoressigsäure suspendiert, dann wurde 90 Minuten ein langsamer Strom wasserfreiem HBr durch die Lösung geleitet. Das Harz wurde ab-

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filtriert und zweimal mit 5 ecm Trifluoressigsäure geuiaschen. Die kombinierten Filtrate wurde unter Vakuum konzentriert und der überschüssige HBr vom Peptid durch wiederholtes Abdampfen v/on 1:1 Methanol/Wasser-Lösungen entfernt. Das Peptid wurde schließlich in Wasser gelöst und lieferte nach Lyophilisieren Aspartyl-Prolyl-£-Nitroarginin. Dann wurde die Nitrogruppe durch Hydrieren in einer, Parr-Niederdruck-Schüttelhydrierungsvorrichtung wie folgt entfernt: das nitrogeschützte Tripeptid wurde in einer 10:1:1 Methanol/Essigsäure/Wasser-Mischung gelöst (etwa 10-20 mg/ccm)und ein gleiches Gewicht eines 5-^igen Palladium-auf-BaSO Katalysators zugefügt und die Mischung über Nacht bei sinem Wasserstoffdruck von etwa 3,5 at geschüttelt. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Filtrate unter Vakuum konzentriert» Der Peptidrest wurde auf einer Sephadex G-25 Kolonne chromatographiert. Die durch übliche Aminosäureanalyse festgestellte Ausbeute an gereinigtem Tripeptid betrug etwa 24 %, bezogen auf das in das Harz einverleibte Arginin. Ein Teil des Produktes wurde mit 5,7N HCl in Wasser hydrolysiert und in einer Aminosäure.-analysevorrichtung untersucht; es zeigte sich ein Verhältnis von Asp 1,05, Pro 0,95, Arg 1,00.

Die Reinheit wurde in üblicher Weise durch Papierelektrophorese bei einer Anzahl von pH-Werten bestimmt.

Beispiel 2

Herstellung des Tetrapeptide Ser-Asp-Pro-Arg Das nicht zur Synthese des Tripeptids verwendete Tripeptidharz von Beispiel 1 wurde dem Schutzgruppenentfernungszyklus (vgl. Beispiel 1) unterworfen und dann mit 0,111 g t-BOC-0-Benzylserin und 0,13 g Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ecm Methylenchlorid wie

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im Synthesezyklus von Beispiel 1 reagieren gelassen.

Dann u/urde ein Teil des Harzes den in Beispiel 1 beschriebenen Abspaltungs- und Hydrierungsverfahren unterworfen und wie in Beispiel 1 gewonnen, wodurch man Ser-Asp-Pro-Arg in 20-^iger Ausbeute, bezogen auf das an das Harz veresterte Arginin, gewonnen. Wach hydrolyse mit HCl wurde eine Probe des gewonnenen Tetrapeptids in einer Aminosäureanalysevorrichtung untersucht und zeigte ein Verhältnis von Ser 0,79, Asp 1,18, Pro 1,02 und Arg 1,01 (Serin wurde teilweise während der Säurehydrolyse zerstört) .

Die Reinheit wurde in üblicher Weise bei einer Anzahl von pH-Werten durch Papierelektrophorese bestimmt.

Beispiel 3

Herstellung des Pentapeptids Asp-Ser-Asp-Prc^—Arg

A.) Das nicht abgespaltene Tetrapeptidharz von Beispiel 2 wurde dem Schutzgruppenentfernungszyklus von Beispiel 1 unterworfen und unter Verwendung von 0,152 g t-BOC-ß-Benzylaspartat im Synthesezyklus behandelt.

Das Pentapeptid wurde vom Harzteil mit HBr in Trifluoressigsäure uiie oben abgespalten. Das gewonnene Polypeptid wurde unter Vakuum getrocknet, gründlich mit Wasser gewaschen und dann lyophilisiert< Die Analyse zeigte eine Ausbeute von 16 %, bezogen auf das Arginin.

Das Pentapeptidprodukt wurde mit HCl hydrolysiert und in der Aminosäureanalysevorrichtung untersucht; es zeigte sich ein Verhältnis von Asp 2,12, Ser 0,74, Pro 1,12 und Arg 1,01.

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B.) Das Pentapeptid kann auch durch Modifikation der Verfahren von Beispiel 1-3A hergestellt werden:

Zu einer Lösung aus 3,02 g (6,82 Millimol) oi -t-Amyloxycarbonyl-IM -tosyl-L-arginin (t-Aoc-Tosyl-Arg) in 15 ecm Äthanol und 6 ecm Wasser ujurde eine Lösung aus Cäsiumbicarbonat (1,4 g in 3 ecm HO) eingetropft, bis der pH-Wert der Lösung 7,0 betrug. Die Lösung wurde unter Vakuum zu einem Schaum konzentriert, der unter Hocnvakuum über P₉O gründlich getrocknet wurde. Zu diesem Rückstand wurden 25 ecm trockenes Dimethylformamid (DMF) und 4,5 g chlormethyliertes Harz (Perlen aus Kopolystyrol-1 % Divinylbenzol mit 1,10 meq Chlormethylgruppen/g Harz) zugefügt und die Mischung 3 Tage bei 5O⁰C. geschüttelt. Das HarT wurde filtriert und 5 Mal mit j£ 20 ecm Dimethylformamid, 3 Mal mit je 20 ecm 90-/oigem Dimethylformarnid/Wasser, 2 Mal mit je 20 ecm Dimethylformamid und 2 Mal mit je 20 ecm Äthanol gewaschen und dann unter Vakuum über PO getrocknet; so erhielt man 5,54 g argininiertes Harz (Einverleibung von etwa 50 %).

Dann wurde das Harz 4 Schutzgruppenentfernungs- und Synthesezyklen unter Verwendung von 4 Äquivalenten der entsprechenden t-B3C-Aminosäure in jeder Kettenverlängerungsstufe unterworfen, wodurch man ein geschütztes Pentapeptidharzmaterial erhielt.

Dieses Harzmaterial wurde dann in ein HF beständiges Reaktionsgefäß gegeben, es wurden 8 ecm Anisol zugefügt und das Gefäß an eine HF Leitung angeschlossen. Es wurden etwa 70 ecm HF bei O⁰C. in das ReaktionsgefäQ hineindestilliert, und die Mischung ujurce weitere 30 Minuten bei O⁰C. gerührt. Das HF wurde abgepumpt und

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das Harz 5 Mal mit je 30 ecm Äther geumschen und dann 5 Mal mit je 30 ecm Wasser extrahiert. Die wässrige Schicht ujurde zu einem gelben glasigen Pulver lyophilisiert, das nach Reinigung gemäß Beispiel 1 das Pentapeptid Asp-Ser-Asp-Pro-Arg lieferte«

Das oben hergestellte Pentapeptid zeigt ein LpHv\ - -78»6 (c=1, H₉O). Die Reinheit wurde in üblicher Weise bei einer Anzahl von pH-Werten durch Papierelektrophorese bestimmt.

Beispiel 4

Herstellung des Hexapeptids Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Ein weiterer Ansatz des arginierten Harzes (0,20 Millimol) wurde den Uerfahren von Beispiel 1-3A unterworfen, wobei jedoch,nach Bindung de? zweiten Aspartinsäurerestes und Schutzgruppenentfernung eine äquivalente Menge t-BOC-A.lanin in üblicher Weise mit Dicyclohexylcarbodiimid gekoppelt wurde.

Dann wurde das Harz wie in Beispiel 1 den Abspaitungs- und Hydrierungsverfahren unterworfen und wie dort gewonnen. So erhielt man 0,026 Millimol Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg in 13-^iger Ausbeute.

Das gewonnene Polypeptid wurde in einer Aminosäureanalysevorrichtung untersucht und zeigte ein Aminosäureverhältnis von AIa 0,95, Asp 2,05, Ser 0,80, Pro 0,98 und Arg 1,00.

Beispiel 5

Nach den Syntheseverfahren von Beispiel 1-4 können die folgenden Polypeptide hergestellt werden:

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Asp-Val-Asp-Leu-Ser

Thr-Ala-Ser-Thr-Glu Asp-Val-Asp-Leu-Ser-Thr-Ala-Ser-Thr-Glu Leu-Ser-Glu-Lys-His Ala-Pro-Ser-Lys-Gly-Thr Ala-Ser-Gly - Lys-Pro Ala-Phe-Ala-Thr-Pro-Glu-Trp-Pro-Gly-Ser

Ala-Phe-Ala-Thr-Pro Glu-Trp-Pro-Gly-Ser - -- - -

Pro-Asp-Ala-Arg-His-Ser Ala-Ser-Pro-Ser-Glu Asp-Thr-Glu-Ala-Arg

Beispiel

Herstellung von Metall- und Aminsalzen A.) Das Pentapeptid Asp-Ser~Asp-Pro-Arg wurde wie folgt in sein Natriumsalz umgewandelt:

Eine Lösung aus 0,05 Millimol des Pentapeptids in Wasser wurde vorsichtig mit genau 1 Äquivalent 0,1N NaOH behandelt und das Monanatriumsalz des Peptids durch Lyophilisierung isoliert. Durch Verwendung von genau 2 oder 3 Äquivalenten 0,1N NaOH wurden die entsprechenden Di- bzw. Trinatriumsalze erhalten.

In ähnlicher Weise konnte dieses Peptid durch Verwendung der entsprechenden Base in andere Metallsalze, z.B. das Kalium-, Lithium-, Calcium-, Barium-, Magnesium-, Ammonium-, Ferro-, Ferri-, Zink-, Hangano-, Mangani- und Aluminiumsalz, umgewandelt werden. '

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B.) Das Pentapeptid Asp-Ser-Asp-Pro-Arg wurde wie folgt in sein Triäthylaminsalz umgewandelt:

Die vorsichtige Zugabe von 1, 2 oder 3-Äquivalenten Triäthylamin zur Lösung des Peptids in Methanol und anschließende vorsichtige Abdampfung des Lösungsmittels lieferte das Mono-, Bis- bzw. Tristriäthylammoniui.isalz. In ähnlicher Weise kann dieses Pentapeptid durch Verwendung des entsprechenden Amins in andere Aminsalze umgewandelt werden, z.B. dasjenige von Trimethylamin, Tri-(npropyl)-amin, Dicyclohexylamin, ß-(Dimethylamino)-äthanol, B-(Diäthylamino)-äthanol, Triethanolamin, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Arginin, Lysin, Histidin, N-Äthy!piperidin, Hydrabamin, Cholin, Betain, Äthylendiamin, Glucosamin, Methylglucamin, Theobromin, Purin, Piperazin, Piperidin, Coffein und Procein.

C.) In ähnlicher Weise können die anderen Peptide von Beispiel 1, 2, 4 und 5 in ihre entsprechenden Metall- und Aminsalze umgewandelt werden.

Beispiel 7

Das Pentapeptid Asp-Ser-Asp-Pro-Arg kann wie folgt in sein Salzsäure-Additionssalz umgewandelt werden:

Die vorsichtige Neutralisation einer Lösung des Peptids in Wasser oder Methanol mit genau 1 oder 2 Äquivalenten Salzsäure lieferte das Mono- bzw. Dihydrochloridsalz. Die.Salze wurden durch Lyophilisierung einer wässrigen Lösung oder durch Ausfällung mit Äther aus einer methanolischen Lösung isoliert.

In ähnlicher Weise kann das Peptid durch Verwendung der entsprechenden Säure anstelle von Salzsäure in andere Säure-Additions-

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salze umgewandelt u/erden, z.B. in das Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Acetat, Oxalat, Tartrat, Succinat, Maleat, Fumarat, Gluconat, Citrat, Malat, Ascorbat und Benzoat.

In ähnlicher Weise können die anderen Peptide von Beispiel 1, 2, 4 und 5 in ihre entsprechenden Säure-Additionssalze umgewandelt werden.

Beispiel 8

Herstellung von Estern

A..) 1,0 g des entsprechenden Peptidharzes von Beispiel 5 wurde in 40 ecm wasserfreiem Methanol pro g Harz suspendiert, es wurden Millimol Triethylamin zugefügt und die Mischung 20 Stunden bei 22⁰C. gerührt. Das Harz wurde abfiltriert und die vereinigten Filtrate unter Vakuum konzentriere. Der Rückstand wurde in Äthyiacetat gelöst, mit 5 ecm Chlorwasserstoff gesättigt und die Lösung 30 Minuten bei 22⁰C. gerührt. Das Produkt wurde durch Zugabe von Äther ausgefällt und lieferte ein Hydrochloridsalz des Peptids. Die schützenden O-Benzyläthergruppen von Ser oder Thr wurden durch Hydrogenolyse unter Verwendung von Pd/BaSO in der in Beispiel 1 zur Entfernung der Nitrogruppe in Nitroargininderivaten beschriebenen Weise entfernt; so erhielt man Ala-Pro-Ser-Lys-Gly-Thr-OMe
Ala-Ser-Gly-Lys-Pro-OMe bzui.
Ala-Phe-Ala-Thro-Pro-OHe.

Durch Verwendung anderer Alkohole anstelle von Methanol und Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 45-8O⁰C. sowie der Reaktionszeit auf 45-90 Stunden erhielt man die entsprechenden Äthyl·, Propyl-, Butyl-, Hexyl-, Octyl-, Decyl- oder Dodecylester.

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Β·) Bei diesem l/erfahren wurde eine andere Art von verankernder Bindung zum Binden des Argininrestes verwendet, nämlich die von S. Wang und R.B. Merrifield in ZJ.Am.Chem. Soc., 9±, 6488 (1969) beschriebene Harz-0-CH -CH -C(CH ) -OCONHNH Bindung. Weiter wurden bei dem Verfahren N -2-(p-Biphenylylj-isopropyloxycarbonyl-Schutzgruppen (Bpoc) anstelle von t-BOC für den Schutz deröC-Aninogruppe verwendet, da die Bpoc Gruppe bei jedem Zyklus der Synthese mit einer sehr milden Säure unter Bedingungen entfernt werden kann, bei welchen die verankernde Bindung stabil ist. Dss Bpoc-N -Nitro-Arg wird an das Harz nach dem DCC l/erfahren gebunden, und die Synthese erfolgt im wesentlichen gemäß Beispiel 1-3, wobei jedoch 1 % Trifluoressigsäure(TFA)/CH₂Cl₀ für den Schutzgruppenentfernungszyklus zwecks Abspaltung der Bpoc Gruppe verwendet wird. Die endgültige einverleibte Aminosäure wird als N -Benzyloxycarbonylderivat (Z) geschützt, so daß die M-endständige Gruppe während der Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz geschützt bleibt. Die Abspaltung erfolgt wie folgt: 500 rrg des Peptidharzes wurden in 12 ecm 50-^iger Trifluoressigsäure in CH Cl. suspendiert und die Mischung 50 Minuten bei Zimmerterpsratur geschüttelt. Das Harz wurde abfiltriert, 2 Mal mit je 1G ecm CH-Cl₂ gewaschen und die kombinierten Filtrate unter Uakuur. konzentriert; so erhielt man Z-ß-Benzyl-Asp-Q-Benzyl-Ser-ß-Benzyi-Asp-Pro-N -Nitra-Arg-NHNH₂ als weißes Pulver.

Eine Lösung aus G,2 Minimal des geschützten Peptidhydrazids in 1 ecm Dimethylformamid wurde auf -2O⁰C. abgekühlt, dann wurde 3,35N HCl in Dioxan (0,5 Millimol) zugefügt. Das Bad wurde auf

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-15 C. erwärmt, es wurden 0,03 ecm tert.-Butylnitrit zugefügt und die Mischung 10 Minuten bei -1O⁰C. stehen gelassen, wodurch man das Peptidazidderivat erhielt. Dann wurde überschüssiges Methanol bei -15⁰C. sowie 0,5 Millimol Äthyldiisopropylamin zugefügt und die Mischung 24 Stunden bei O⁰C. gehalten. Während der ersten 6 Stunden wurden jede Stunde 5 ,ul der Base zugefügt. Dann wurde aac geschützte Peptid durch Eingießen der Mischung in 15 ecm kalte,

Essigsäure ausgefällt und der gesammelte Niederschlag durch gewonnen und
Filtrieren/gewaschen. Dann wurden die Schutzgruppen auf Benzylbasis durch Hydrogenolyse gemäß Beispiel 1 entfernt und das Produkt durch Teilungschromatographie auf "Sephadex G-25" oder durch Gegenstromverteilung gereinigt, wodurch man Asp-Ser-Asp-Pro-Arg-OHe erhielt.

Wurde das Methanol in diesem Verfahren durch andere Alkohole ersetzt, dann erhielt man die entsprechenden Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Hexyl-, Octyl-, Decyl- und Dodecylester.

C.) Durch Anwendung der in A.) und B.) beschriebenen Verfahren können die entsprechenden Ester der Polypeptide von Beispiel 1, 2, 4 und 5 hergestellt werden.

Beispiel 9

Herstellung von Amiden

A.) Die Produkte von Beispiel 8A und 8B wurden mit einer gesättigten Lösung aus Ammoniak in Methanol 2 Tage bei Zimmertemperatur behandelt? nach Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum erhielt man:

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Ala-Pro-Ser-Lys-Gly-Thr-NH₂
Ala-Ser-Gly-Lys-Pro-NH
Ala-Phe-Ala-Thr-Pro-I\!H₂ und
Asp-Ser-Asp-Pro-Arg-(\IH₂

B.) Das Peptidazid von Beispiel 8B uiurde mit Ammoniak in Dimethylformamidlösung unter den in Beispiel BB zur Reaktion mit Methanol beschriebenen Bedingungen umgesetzt. Das geschützte Peptidamid wurde isoliert und die Schutzgruppen in beschriebener Weise entfernt', wodurch man Asp-Ser—Asp-Pro—Arg-NH erhielt.

C.) Das geschützte Peptidharzprodukt von Beispiel 3A wurde in einer gesättigten Lösung aus Ammoniak in Methanol suspendiert und die mischung 2 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Das Harz wurde abfiltriert, mit Methanol gewaschen und die vereinigten Filtrate unter Vakuum konzentriert; so erhielt man t-BOC-Asn-D-Banzyl-Ser-Asn-Pro-N -Nitro-Arg-NhL·- Die t-BOC Gruppe und die N^-Nitrogruppe wurden anschließend durch saure Hydrolyse- bzw. Hydrogenolyse wie oben entfernt und lieferten

Durch Verwendung anderer Amine anstelle von Ammoniak sowie Dimethylformamid als Lösungsmittel (wenn angebracht) sowie durch Erhöhung von Reaktionstemperatur und -zeit (falls notwendig), erhielt man z.B. das entsprechende Dimethyl-, Diäthyl-, Di-(nbutyl)-, n-Hexyl-, Piperidyl-, Pyrrolidinyl-, Morpholinyl-, Di-(n-hexyl)- und N-Methylpiperazinylamid.

D.) Nach Verfahren gemäß A.) B.) und G.) können die entsprechenden Amide der anderen Polypeptide von Beispiel 1, 2, 4 und 5 hergestellt werden.

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Beispiel I^

Herstellung von N-Acylderivaten

ti. '

N -Acylderivate von Asp-Ser-Asp-Pro-Arg wurden hergestellt, indem man die endständige t-BOC-Aminosäure (t-BOC-ß-Benzylaspartat) durch die entsprechende N -Acylaminosäure (z.B. N -Acetyl-ßbenzylaspartat) ersetzte, wobei alle anderen Stufen von Schutzgruppenentfernungs-, Synthese- und Abspaltungszyklen gleich blieben.

So. können hergestellt werden:

N^-Acetyl-Asp-Ser-tAsp-Pro-Arg N*-Butyryl-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg I\I*-H exanoyl- Asp-Ser-Asp-Pro-Arg N^-Octanoyl-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg I\l ¹³^-D ecanoyl-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg IM^-Dodecanoyl-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg.

In ähnlicher Weise können die entsprechenden N -Acylderivate der anderen, in Beispiel 1, 2, 4 und 5 genannten Peptide hergestellt «/erden.

Beispiel 11 Herstellung von O-Acylderivaten Zur Herstellung des geschützten Pentapeptidharzmaterials, in welchem die Hydroxylgruppe von Serin ungeschützt ist, wurde die folgende Modifikation des Syntheseverfahrens in fester Phase angewendet:

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Das Tripeptidharztnaterial von Beispiel 1 wurde dem Schutzgruppen-Bntfernungszyklus unterworfen und dann mit dem t-BOC-Serin-!\l-Hydrosuccinimidester reagieren gelassen, wodurch man ein t-30C-Ser-ß-Benzyl-Asp-Pro~N -Nitro-Arg-Harz erhielt, das nach Schutzgruppenentfernung unter üblichen Bedingungen mit p-Nitrophenylt-BGC-ß-benzyl&f.partat gekoppelt ujurde, wodurch man ein t-BQC-ß-Benzyl-Asp-5er-ß-Benzyl-Asp-Pro-N -Nitro-Arg-Harz erhielt,

0,5 Millimol dieses geschützten Peptidharzmaterials wurden gründlich mit CHCl und CH Cl gewaschen, dann wurden 1,5 Millimol Hexansäure, in 1:1 Dimethylformamid/CHCl, gelöst, sowie 1,5 Millimol Carbonyldiimidazol, in denselben Lösungsmitteln gelöst, zugefügt. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 2 Stunden in einem Merrifield Reaktionsgefäß geschüttelt und das Peptid dann in oben beschriebener Weise uom Harz abgespalten. Die N -Nitro-Gruppe wurde hydrogenolytisch entfernt und das Peptid wie oben gereinigt, wodurch man Asp-O-Hexanoyl-Ser-Asp-Pro-Arg erhielt.

Wurde die Hexansäure durch Essigsäure, Buttersäure, Getansäure, Decansäure und Doecansäure ersetzt, dann konnten die entsprechenden O-Acetyl-, Butyryl-, Octanoyl-, Decanoyl- und Dodecanoyluerbindungen hergestellt werden.

In ähnlicher Weise können die entsprechenden O-Acylderivate der anderen Peptide mit Seitenkettenhydroxylgruppen von Beispiel 2, 4 und 5 hergestellt werden.

Beispiel 1_2

Die folgenden pharmazeutischen Präparate mit Asp-Ser-Asp-Pro-Arg als Beispiel sind typisch für die erfindungsgemäßen Produkte:

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Aerosolformulierunq (pro Dosis)

Asp-Ser-Asp-Pro-Arg 10 mg

Natriumchlorid · 8 mg

Wasser auf 1,0 ecm

Injizierbare Formulierung (pro Dosis)

Asp-Ser-Asp-Pro-Arg 10 mg

Natriumchlorid 8 mg

Methylparaben 0,25 mg

Propylparaben 0,14 mg

Wasser auf 1,0 ecm

Xrockene Pulverformulierung zur Inhalation

mit Vorrichtung wie z.B. SPINHALER (pro Dosis)

Asp-Ser-Asp-Pro-Arg 10 mg

Lactose 30 mg

Beispiel Y5_

Die "Blockidrungs"-aktivität der erfindungsgemäßen Polyoeptide kann an der klassischen Prausnitz-Kustner (P-K) Reaktion untersucht werden. Dabei wird einem Menschen ein bekanntes allergisches Serum, d.h. ein solches, das ein für ein bekanntes Antigen oder Allergen spezifisches IgE enthält, intradermal injiziert. Nach einer gewissen Zeit, z.B. 20 Stunden oder mehr, werden die ■Injektionsstellen durch einen Stich oder die Injektion einer Lösung des für das IgE im injizierten Serum spezifischen Antigens gereizt. Innerhalb der nächsten 10-30 Minuten zeigt sich eine positive Reaktion durch Bildung einer Schwellung (und Rötung) an der Injektionsstelle. 3e größer der Schwellungsdurchmesser, umso intensiver ist die allergische Reaktion. Das heißt, eine stärkere Schwellung bedeutet eine größere Histaminfreisetzung in das Gewebe an der Injektionssteiler Umgekehrt zeigt die Bildung einer Schwellung mit geringerem Durchmesser oder das Fehlen jeglicher Schwellung eine verminderte und/oder überhaupt keine allergische Reaktion. Diese dargestellte P-K Reaktion ist ein klassi-

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scher, allgemein bekannter und von Allergieforschern angewendeter Test.

Wie ermähnt, uiird die klassische P-K Reaktion zur Untersuchung der "Blockierungs"-Fähigkeiten der erfindungsgemäßen Polypeptide verwnedet.

Die folgenden Untersuchungen verschiedener erfindungsgemäß geeigneter Polypeptide, deren Synthese beschrieben morden ist, erfolgten unter Verwendung eines einzigen, als sicher erkannten P-K Spenderserums, das ein für Meerschweinchenallergene spezifisches IgE enthielt.

Die Peptidlösungen wurden entweder intradermal 1-24 Stunden ./or dem P-K Serum injiziert oder zur gleichzeitigen Injektion mit Verdünnungen des P-K Serums gemischt. Die anfänglichen Tests erfolgten mit einem P-K Serum bei Verdünnungen von 1:4 bis 1:200. Weitere Versuche erfolgte bei einer fixierten P-K Verdünnung von 1:32, wobei die erfindungsgemäßen Peptidlösungen variiert wurden, so daß sie etwa 1 Millimol bis 2 Mol des zu testenden Peptids enthielten. Die Injektionsstellen der Versuchspersonen wurden durch Stichpunktur von Meerschweinchen BCA 1:40 Gew./Vol. (eingekauft von der Fir.ma Berkeley Biologicals, Inc.) gereizt.

Es wurden Versuchspersonen mit Serum Ige Werten unter 100 U/ccm 242 ng/ccm) hatten; von diesen Werten ist bekannt, daß sie eine erfolgreiche P-K Reaktionsfähigkeit sicherstellen. Weiter wurden für diese Tests Personen mit einem negativen direkten Hauttest auf Meerschweinchenantigen ausgewählt. Die P-K und Hauttests erfolgten am Rücken und/oder am Unterarm. Mehrfachteststellen von

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ötu/a 25 mm Durchmesser wurden durch eine Markierung bezeichnet, und alle Injektionen erfolgten innerhalb der umrahmten Hautflächen.

Eine typische Folge bestand in der intradermalen Injektion von 0,1 ecm der Peptidlösung oder einer gepufferten Kontrollösung mit Kochsalzlösungverdunnung; in 1-24 Stunden schloß sich daran die intradermale Injektion von 0,05 ecm P-K .Serum in jede vorherige Injektionsstelle an. Nach Verstreichen von 20-24 Stunden wurde jede Stelle mit dem Antigenlösung stichpunktiert, in 5 Minuten trocken getupft, und dann erfolgten, gewöhnlich 15,

dreimaligen

und 25 Minuten nach der Stichpunktur, die/Messungen auf Schwellung und Rötung in ihrem engsten und weitesten Durchmesser.

Die Untersuchungen auf Blockierungs-Akrivität erfolgten mit folgenden Polypeptiden: Asp-Pro-Arg; Ser-Asp-Pro-Argj Asp-Ser-Asp-Pro-Arg; und Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg. Zum Vergleichstesten u/urcsn auch Asp-Thr-Glu-Ala-Arg und Tosyl-L-Argininsarcosinmethylester (TASME) synthetisiert und untersucht.

Die genannten Polypeptide, wurden wie oben an seahs verschiedenen Personen mit den folgenden Ergebnissen untersucht:

Für Asp-Pro-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 15 % mit einam individuellen Bereich von nur Q % bis zu 38 %.

Für Ser-Asp-Pro-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei

% bis 50 %,

18 % mit einem individuellen Bereich von nur 0 % bis 50 %.

Für Asp-Ser-Asp-Pro-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 72 % mit einem individuellen Beieich von 60 bis 89 %,

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Für Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 46 % mit einem individuellen Bereich zwischen 10 bis 61 %.

Für Asp-Thr-Glu-Ala-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 58 % mit einem individuellen Bereich zwischen 30 bis 80 %,

Für TASME lag die durchschnittliche Inhibierung bei 24 % mit einem individuellen Bereich zu/ischen 0 bis 40 %.

Die obigen Ergebnisse sind der Durchschnitt doppelter Messungen bei drei Zeitabständen für jede Reaktion jeder Person, subtrahiert von den durchschnittlichen Kontrollschwellungsmessungen und dividiert durch die durchschnittliche Messung der Kantrollschwellung bei jeder Uersuchsperson. Die Kontrollschwellungeir. bei

den verschiedenen Versuchspersonen variierten von 8-40 mm" mit

ο
einem Durchschnittswert von 17 mm . Jedes Peptid wurde in etwa

6 /ug/ccm Verdünnung verwendet, und an jede Stelle wurde 0,1 ecm und anschließend 0,05 ecm verdünntes P-K Serum mit einem IgE

_g Gehalt von 0,2 ng injiziert. Somit konkurrierten 10 M des Pep-

— 15
tids mit 10" M IgE bzgl. der Bindestellen der Mastzellen; oder das Verhältnis betrug 1 Ige Molekül pro 10 Peptidmoleküle. Aus den obigen Untersuchungen geht hervor, daß das Pentapeptid, d.h. Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, die stärke "Blockierungs"-aktivität zeigt, ujobei das Hexapeptid, d.h. Ala-Asp-Ser-Asp-Prop-Arg, eine etwas geringere Aktivität zeigt. Das Tetrapeptid Ser-Asp-Pro-Arg und das Tripeptid Asp-Pro-Arg zeigten die geringste Wirksamkeit.

Es wird darauf hingewiesen, daß das Pentapeptid Asp-Thr-Glu-Alazusammen mit den anderen obigen Peptiden hergestellt und

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untersucht wurde. Dieses Polypeptid hat nicht die analoge Folge der in den C 2, C 3 oder C 4 Domänen des Ige Molekül erscheinenden Aminosäuren, zeigt jedoch im obigen Test eine hohe Wirksamkeit

Beispiel 1_4

Weiterhin wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen aktiven Polypeptide offenbar die Fähigkeit zum "Entfernen" des IgE aus den Mastzellenstellen sowie zum Verhindern, einer Bindung des IgE f.n diese Stellen haben. Bei einem Einzeltest an einer Versuchsperson mit bekannter, extremer Sensibilität auf Meerschweinchenantigene, d.h. eine Person mit hoher natürlicher Konzentration an gegen Meerschweinchenantigen sensitivem IgE, wurden die erfindungsgemäßen Polypeptide injiziert, und es wurde die Reaktion der Versuchsperson auf Meerschroänchenantigen festgestellt.

Im einzelnen wurden jeweils etwa 2 nM Asp-Ser-Asp-Pro-Arg und Ala-Asp-Ser-Asp-Pro^Arg intrariermal in 3 markierte Stellung injiziert. Vergleichsweise wurde TASME sowie eine Kontrolle des Pufferverdünnungsmittels allein ebenfalls in 3 markierte Stellen injiziert. 1, 5 und 24 Stunden nach der Polypeptid- und Kontrollinjektion wurde jeweils eine Peptid- und Verdünnungsmittelstelle durch Stichpunktur mit Meerschweinchenantigen gereizt. Zu den Zeitabständen von 1 und 5 Stunden wurde keine Inhibierung der Schmellungs- und Rötungsreaktion an irgendeiner der Stellen festgestellt. Bei der Reizung nach 24 Stunden war jedoch die Schwellung an der Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Stelle etwa 45 % kleiner, während an der Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Stelle die Schwellung etwa 23 % kleiner war. An der TASME Stelle wurde keine Verringerung der SchwellungsgröQe im Vergleich zur Stelle der Injektion mit

lösungs
gepuffertem Kochsalz/Verdünnungsmittel festgestellt.

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Somit "entfernen" mindestens die aktivsten erfindungsgemäßen Peptide offenbar ein bereits an Mastzellenstellen gebundenes IgE und inhibieren somit eine natürliche allergische Reaktion. Wie in Beispiel 13 bereits gezeigt, ist dasselbe Pentapeptid bei der Inhibierung einer passiv übertragenen (P-K) allergischen Reaktion äußerst luirksam.

Beispiel 1_5

Die akute Toxizität wurde mie folgt bestimmt:

Weiße BBA Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 15 g wurden jeweils mit 1,4 ecm einer Lösung des Peptids in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 7,4 wie folgt injiziert:

0,1 ecm x 3 intradermal

0,1 ecm χ J subkutan

0,2 ecm intravenös

0,6 ecm intraperitoneal

24-72 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse, die alle noch lebten, getötet und untersucht.

Die verwendeten Peptide und ihre Konzentrationen u/aren tuie folgt:

Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg (Beisp.4) 5 ,ug/ccm (375 mg/kg)-6 Mäuse Asp-Ser-Asp-Pro-Arg (Beisp.3) 10. ,ug/ccm (1 mg/kg) -8 Mäuse Asp-Ser-Asp-Pro-Arg (Beisp.3) 13 ,u/ccm (1,3 mg/kg)-8 Mäuse

Die visuelle und mikroskopische Untersuchung von Gewebe und Organen zeigte keine örtlichen oder systemischen toxico-logikalen Abnormalitäten.

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Claims

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Patentansprüche

' 1,- Biologisch aktive Polypeptide zum Blockieren, Inhibieren und Verhüten allergischer Reaktionen, bestehend aus 3 bis 1U Aminosäuren in einer Sequenz, die aus einem Teil der Aminosäuresequenz 265-537 der FC Region von Immunoglobulin E ausgewählt ist, und die pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Salze, Ester, Amide und I\l-Acyl- und G-Acylderivate derselben.

2.- Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Pehtapeptid ist.

3.- Pentapeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Asp-Ser-Asp-Pro-Arg hat.

4,- Pentapeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Ala-Phe-Ala-Thr-Pro hat.

5.- Pentapeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daS ss die Aminosäuresequenz Ala-Ser-Gly-Lys-Pro hat.

6,- Pentapeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz. Leu-Ser-Gln-Lys-His hat.

7.- Pentapeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es

die Aminosäuresequenz Thr-Ala-Ser-Thr-Glu hat.

8,- Pentapeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Asp-Val-Asp-Leu-Ser hat.

9.- Pentapeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Glu-Trp-Pro-Gly-Ser hat.

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10,- Pentapeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Ala-Ser-Pro-Ser-Gln hat.

11.- Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Hexapeptid ist.

12.- Hexapeptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg hat.

13.- Hexapeptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Ala-Pro-Ser-Lys-Gly-Thr hat.

14,- Hexapeptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Pro-Asp-Ala-Arg-His-Ser hat.

15.- Polypeptid nach Anspruch 1, dad'irch gekennzeichnet, daß es ein Deoapeptid ist.

16.- Decapeptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Asp-Ual-Asp-Leu-Ser-Thr-Ala-Ser-Thr-Glu h=ü

17.- Decapeptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Ala-Phe-Ala-Thr-Pro-Glu-Trp-Pro-Gly-Ser hac.

18.- Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Tetrapeptid ist.

19.- Tetrapeptid nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Ser-Asp-Pro-Arg hat.

20.- Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Tripeptid ist.

21.- Tripeptid nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Asp-Pro-Arg hat.

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22.- Pentapeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz Asp-Thr-Glu-Ala-Arg hat.

23.- Pharmazeutisches Präparat zum Blockieren allergischer Reaktionen bei Mensch und Tier, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge eines Polypeptids aus 3 bis 10 Aminosäuren in einer Sequenz,. die aus einem Teil der Aminosäuresequenz 265-537 der Fc Region von Immunoglobulin E ausgezahlt ist, oder das Polypeptid Asp-Thr-Glu-Ale-Arg oder ein pharmazeutisch annehmbares, nicht-toxisches Salz-, Ester- Amid-,' N-Acyl- oder O-Acylderivat desselben in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Träger umfaßt.

24.- Präparat nssh Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Asp-Ser-rAsp-Pro-Arg ist.

2 5.·- l/erfahren zur Herstellung eines Polypeptid aus 3 bis 10 Aminosäuren in einer Sequenz, die aus einem Teil der Aminosäuresequenz 265-537 des Fc Region von Immunoglobulin E ausgewählt ist, oder des Polypepticfe Asp-Thr-Glu-Ala-Arg^oder ein pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxisches Salz-, Ester-, Amid-, N-Acyl- oder O-Acylderivat derselben, ' dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine erste Aminosäure oder ein Peptid, das wahlweise kovalent

kann an einen festen Träger gebunden sein/und/oder eine geschützte Carboxyl- oder Aminogruppe -hat, mit einer zweiten Aminosäure oder einem Peptid mit wahlweise einer geschützten Carboxyl- oder Aminogruppe kondensiert, wobei die Gesamtzahl der Aminosäurcreste in der ersten und zweiten Aminosäure und/oder Peptiden gleich derjenigen des endgültigen Polypeptids istj

(b) nacheinander oder gleichzeitig die schützenden Gruppen und/

oder den festen Träger vom Produkt aus Stufe (a) abspaltet;

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NACHQEREfCHTi

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(c) das Produkt aus Stufe (a) oder (b) wahlweise in ein Salz umwandelt;

(d) das Produkt aus Stufe (a) oder (b) wahlweise in einen Ester umwandelt;

(e) das Produkt aus Stufe (a) oder (b) wahlweise in ein Amid umwandelt;

(d) das Produkt aus Stufe (a) oder (b) wahlweise in ein N-Acylderivat umwandelt; oder

(g) das Produkt aus Stufe (a) oder (b) wahlweise in ein O-Acylder.ivat umwandelt.

\?6. - Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das 3 bis 10

einer
Aminosäuren in/bequenz, die aus einem Teil der Aminosäuresequenz 265-537 des Fc Bereiches von Immunoglobulin E ausgewählt ist, oder des Polypeptids Asp-Thr-Glu-Ala-Arg, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz-, Ester-, Amid-, N-Acyl- oder O-Acylderivat derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man nacheinander oder gleichzeitig eine Carboxy- und/oder Aminoschutzgruppe und/ oder einen kovalent gebundenen festen Träger vom geschützten Polypeptid entfernt und wahlweise das Produkt in ein Salz-, Ester-, Amid-, N-Acyl- oder O-Acylderivat umwandelt.

und 26,
27·- Verfahren nach Anspruch 25/dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Asp-Ser-Asp-Pro-Arg oder ein pharmazeutisch annehmbares, nicht-toxisches Salz, Ester, Amid, N-Acyl- oder O-Acylderivat desselben ist.

bis 27,
28.- Verfahren nach Anspruch 2 5/ dadurch gekennzeichnet, daß die schützende Gruppe eine Aminoschutzgruppe aus Acyl-, aromatischen Urethan-, aliphatischen Urethan-, Cycloalkylurethan-, Thio— urethan-, Aralkyl- oder Trialkylsilylgruppen oder eine Carboxyl-

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- A5 -I

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schutzgruppe aus substituierten oder unsubstituierten aliphatischen Estern, Aralkylesterr., N-substituierten Hydroaziden und Amiden ist.

bis 28i
29·.- Verfahren nach Anspruch 25/ dadurch gekennzeichnet, daß der kovalent gebunocne feste Träger ein jprnetztes Polystyrol-Divinyl-Harz, vernetztes Polyamidharz, Polyäthylenglykolharz oder funktionalisier!;e blasperlen ist.

30,- Verfahren zur Herstellung eines Salz-, Enter-, Amid-, N-AcyloderÜ-Acylderivates eines Polypeptids aus 3 bis 10 Aminosäuren in einer Sequenz, die aus einem Teil der Aminosäuresequenz 265-537 der Fc Region von Immunoglobulin E ausgewählt ist, oder des Polypeptide Asp-Thr-Glü-Ala-Arg, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polypeptid oder ein Salz-, Ester-, Amid-, N-Acyl- oder O-Acylderivat desselben in das Salz-, Ester-, Amid-, N-Acyl- oder Ö-Acylderivat umwandelt.

31.- Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids aus 3 bis 10 Aminosäuren in einer Sequenz, die aus einem Teil der Aminosäuresequenz 265-537 der Fc Region von Immunoglobulin E ausgewählt ist, oder des Polypeptids Asp-Thr-Glu-Ala-Arg, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Salz-, Ester-, Amid-, N-Acyl- oder O-Acylderivat des Polypeptids in das freie Polypeptid umwandelt.

Der Patentanwalt:

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ORIGINAL INSPECTED