DE3782006T2

DE3782006T2 - Peptide.

Info

Publication number: DE3782006T2
Application number: DE8787310284T
Authority: DE
Inventors: Laszlo Denes; Gyoergy Hajos; Lajos Kisfaludy; Karoly Lapis; Olga Nyeki; Istvan Schoen; Bela Szende; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1986-11-21
Filing date: 1987-11-20
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2007-11-21
Also published as: EP0269389A3; DK610287A; AU8144687A; US5041535A; DE3782006D1; HUT46044A; GR3006357T3; EP0269389B1; AU597749B2; EP0269389A2; JPS63198698A; CA1318456C; IL84551A; JPH0796557B2; DK610287D0; ES2055708T3; IL84551A0; ATE81134T1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf neue Peptide, welche die Vermehrung von Leukämie-Zellen hemmen und eine immunstimulierende Wirkung zeigen, ein Verfahren zu deren Herstellung und die Peptide enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen. Die Erfindung bezieht sich auch auf Peptide und pharmazeutische Zubereitungen zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Säugern - einschließlich Menschen - zum Hemmen der Vermehrung von Leukämie-Zellen und Stimulieren des Immunsystems.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neue Peptide der Formeln
(1) Glp-Lys-NH&sub2;
(2) Glp-Glu-Lys-NH&sub2;
(3) Arg-Lys-Glu-NH&sub2;
(4) Leu-Val-Ala-OH
(5) Arg-Orn-Asp-Val-NH&sub2;
(6) Arg-Orn-Asp-Val-OH
(7) Lys-Glu-Lys-Lys-OH
(8) Lys-Leu-Lys-Lys-OH
(9) Lys-Asp-Leu-Lys-OH
(10) Glu-Leu-Val-Ala-OH und
(11) Leu-Pro-Ala-Gly-OH
und deren Säureadditionssalze bereitgestellt.
Die neuen Peptide der vorliegenden Erfindung hemmen die Vermehrung von Leukämie-Zellen und zeigen immunstimulierende Wirkung.
Es ist bekannt [Recent Progress in Hormone Research, 37, 369- 412 (1981); Cancer Immunol. Immunother. 15, 78-83 (1983)], daß gewisse Thymus-Hormone in der Lage sind, die Immunfunktion von mit cytostatischen Mitteln oder Strahlung behandelten Patienten wiederherzustellen und die Vermehrung gewisser Tumorzellen zu hemmen. Diese Wirkung kann auch mit der Hilfe kleinerer Hormonfragmente hervorgerufen werden, wobei deren therapeutische Anwendung vorteilhafter ist, als jene von Hormonen oder Thymusextrakten mit größerem Molekulargewicht. Die immunstimulierende Wirkung bis jetzt synthetisierter kleinerer Peptide konnte in verschiedenen Testsystemen unzweideutig gezeigt werden (siehe US-Patente Nr. 4 190 646, 4 215 112, 4 395 404 und 4 442 031; ungarisches Patent Nr. 185 263 und DOS Nr. 29 38 420, 30 01 775 und 31 00 974). Thymopentin - das 32-36-Fragment von Thymopoietin - wurde bereits als pharmazeutisch wirksamer Bestandteil auf den Markt gebracht. Die bekannten Peptide bewirken hauptsächlich die Vermehrung der T- und/oder B-Zellen, hemmen aber die Vermehrung der Tumorzellen direkt nicht.
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Thymopoietin- Fragment-Analoga zur Verfügung zu stellen, welche zusätzlich zur immunstimulierenden Wirksamkeit bekannter Analoga auch eine starke Antitumor-Wirkung besitzen.
Es ist auf überraschende Weise gefunden worden, daß die neuen Peptide der Formeln (1)-(11) zusätzlich zur immunstimulierenden Wirksamkeit eine starke Antitumor-Wirkung zeigen. In dem von uns verwendeten Testsystem üben die Peptide der vorliegenden Erfindung eine stärkere Antitumor-Wirkung aus, als die als Kontrolle dienenden, bekannten immunstimulierenden Peptide, d. h. Thymopentin (US-Patent Nr. 4 190 646) und das Tetrapeptid der Formel H-Arg-Lys-Asp-Val-OH (ungarisches Patent Nr. 185 263). Außer dem voranstehend Erwähnten unterscheiden sich die neuen Peptide der vorliegenden Erfindung von den bekannten cytostatischen Wirkstoffen auch in der Tatsache, daß die Verbindungen der Erfindung nur die Vermehrung von Krebszellen hemmen und keine allgemeine (systemische) immunsuppressive Wirkung ausüben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung der Peptide der Formeln (1)-(11) und deren Säureadditionssalze bereitgestellt.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die neuen Peptide der Formeln (1)-(11) und deren Säureadditionssalze in Lösung durch aufeinanderfolgende schrittweise Kettenverlängerung hergestellt, wobei Kupplungsschritte über aktive Ester und/oder gemischte Anhydride und Stufen zur Freisetzung einer α-Amino-Gruppe nacheinander ausgeführt werden. Als Ausgangsmaterial wird ein C-terminales Aminosäure-Derivat verwendet, welches eine amidierte oder durch eine hydrogenolytisch oder acidolytisch entfernbare Gruppe veresterte Carboxy-Gruppe, gegebenenfalls in der Seitenkette eine geschützte Amino-Gruppe und/oder eine amidierte oder durch eine hydrogenolytisch oder acidolytisch entfernbare Gruppe veresterte Carboxy-Gruppe und eine freie α-Amino-Gruppe umfaßt. Somit werden geschützte Derivate der Peptide der Formeln (1)-(11) hergestellt, welche an der Carboxy-Gruppe verestert oder amidiert sind und an den an der Peptid-Bindung nicht beteiligten Amino-Gruppen eine Boc- oder Z-Schutzgruppe tragen, worauf die vorhandenen Schutzgruppen durch Hydrogenolyse und/oder Acidolyse entfernt werden und, falls gewünscht, die so erhaltenen freien Peptide der Formeln (1)-(11) in deren Säureadditionssalze durch Umsetzen mit einer Säure überführt werden.
Im Verlauf der Synthese wird eine Kombination von Schutzgruppen angewendet, welche die selektive Entfernung der Schutzgruppe der Amino-Gruppe und die Spaltung aller Schutzgruppen am Ende der Synthese, falls möglich, in einem Schritt gestattet. Die Peptid-Bindung wird durch Anwenden des im ungarischen Patent Nr. 168 431 offenbarten Pentafluorphenylester-Verfahrens oder dem im ungarischen Patent Nr. 183 579 beschriebenen Verfahren über das gemischte Anhydrid gebildet.
Die Amino-Gruppen werden vorzugsweise mit Hilfe einer Boc- oder Z-Gruppe geschützt, während der Schutz der Carboxy-Gruppen vorzugsweise durch Verestern mit tertiärem Butylalkohol, Benzylalkohol oder Nitrobenzylalkohol bewerkstelligt wird.
Von dem auf diese Weise synthetisierten und geschützten Peptid wird (werden) die gegebenenfalls vorhandene(n) Schutzgruppe(n) nach der Synthese entfernt, worauf das derart erhaltene freie Peptid durch Behandlung mit einer Säure in ein Säureadditionssalz überführt wird. Die Schutzgruppen werden vorzugsweise durch katalytische Hydrierung oder einer mit einer Säure durchgeführten Acidolyse entfernt.
Die derart erhaltenen freien Peptide sind gewöhnlich zur Verwendung in der Therapie genügend rein und es ist keine weitere Reinigung erforderlich. Die Peptide können jedoch, falls erforderlich, durch bekannte Verfahren, z. B. Chromatographie an einer Kieselgel-Säule, gereinigt werden. In Form einer Lösung erhaltene Peptide können im allgemeinen durch Eindampfen der Lösung oder mittels Lyophilisierung isoliert werden.
Die biologische Wirksamkeit der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung wird nach den folgenden Methoden getestet.

1) Hemmung des Wachstums von Tumorzellen

Für den Test wird eine humane K-562 erythroleukämische Zellinie (Karolinska Institute, Stockholm) verwendet. Die Inkubation wird in einem als RPMI-1640 bezeichneten Nährmedium (hergestellt von Flow, Großbritannien), welches 10% fetales Kälberserum umfaßt, bei einer Temperatur von 37º C in einem befeuchteten, 3% Kohlendioxid enthaltenden Inkubator in Plastikschalen durchgeführt. Jeder Meßpunkt entspricht jeweils dem Durchschnitt der in drei Schalen gemessenen Daten. Zu Beginn des Tests beträgt die Verdünnung 0,5 · 10&sup5; Zellen/ml. Die Behandlung wird 24 Stunden nach Verdünnung in einer solchen Weise durchgeführt, daß das Medium nach der Behandlung nicht verändert ist. Die Zellen werden 96 Stunden nach Verdünnung jede 24. Stunde mit Hilfe einer Buerker-Kammer gezählt.
In Fig. 1 wird die das Wachstums der Tumorzellen hemmende Wirkung des Peptids Lys-Leu-Lys-Lys veranschaulicht. Auf der linken Kurve sind die absoluten Werte der Zellenzahl dargestellt, während auf der rechten Kurve die Zellenzahl in Prozenten der Kontrolle (% c) als Funktion der Zeit dargestellt sind.
Unter der Wirkung des Peptids stagniert die Zellenzahl in der 24. Stunde nach der Behandlung und nimmt später in sehr geringem Ausmaß zu. Dies zeigt an, daß das Peptid eher eine die Zellteilung hemmende Wirksamkeit als eine zelltötende Wirkung entfaltet. Die die Tumorzellteilung hemmende Wirkung der neuen Peptide wird in Tabelle 1 (72 Stunden nach Behandlung) zusammengefaßt. Der Betrag der Hemmung wird in Prozenten der Kontrolle ausgedrückt. Aus den Daten der Tabelle geht eindeutig hervor, daß die getesteten Peptide das Wachstum von humanen K- 562 erythroleukämischen Zellen hemmen. Tabelle 1 Hemmung des Wachstums von K-562-Zellen in der 72. Stunde nach Behandlung mit dem Peptid, ausgedrückt in Prozenten der Kontrolle Hemmung Peptid-Konzentration Getestestes Peptid
Die Peptide "A" und "B" sind bekannte Referenzverbindungen
(ungarisches Patent Nr. 185 263).

2. Hemmung des Wachstums von T-Lymphozyten

Die Hemmung des Wachstums von T-Lymphozyten wird in dem durch Azathioprin [6-(1-Methyl-4-nitroimidazol-5-ylthio)-purin; Thymus 1, 195 (1980)] gehemmten E-Rosetten-Test getestet.
Zu 200 ul einer gesunden Lymphozyten-Zellsuspension werden 500 ul/ml Azathioprin und 200 ul einer getrennten Verdünnung der Testverbindung in HBBS-Puffer (Hersteller: Flow, Großbritannien) zugesetzt (Konzentrationsbereich: 10&supmin;³ zu 10&supmin;¹¹ Mol/l). Das Gemisch wird bei einer Temperatur von 37ºC in 5% Kohlendioxid enthaltender Luft 60 Minuten inkubiert, worauf 200 ul einer 1%igen Schaf-Erythrozyten-Suspension zugegeben werden. Das derart erhaltene Gemisch wird 5 Minuten bei 1000 Upm zentrifugiert, der Überstand wird durch Dekantieren entfernt und die E-Rosetten bildenden Lymphozyten in der Suspension werden unter einem Mikroskop von wenigstens 400 Zellen gezählt.
Unter der Wirkung der Peptide nimmt die E-Rosetten bildende Wirksamkeit der durch Azathioprin gehemmten Lymphozyten in unterschiedlichem Ausmaß zu. In dem getesteten Dosisbereich hemmen die Peptide die E-Rosetten bildende Wirksamkeit der Lymphozyten nicht. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Daten zeigen, in welchem Ausmaß die Peptide die durch Azathioprin ausgeübte Hemmung (R %) auf die E- Rosetten bildende Wirksamkeit der Lymphozyten aufheben. Es scheint aus den Daten von Tabelle 2, daß die getesteten Peptide die Fähigkeit der inhibierten Lymphozyten, E-Rosetten zu bilden, erhöhen, d. h. die Peptide der vorliegenden Erfindung zeigen eine immunstimulierende Wirkung. Tabelle 2 Wiederherstellung der E-rosetta bildenden Wirksamkeit von durch Azathioprin inhibierten Lymphozyten Aufhebung der Hemmung Peptidkonzentration Wert für N Getestetes Peptid
Die Peptide "A" und "B" sind bekannte Referenzverbindungen.
R % = (EXP-ERFC - AZ-ERFC)/ERFC - AZ-ERFC · 100%
ERFC = Zahl der E-Rosetten bildenden Lymphozyten, ohne Zugabe von Azathioprin;
AZ-ERFC = Zahl der E-Rosetten bildenden Lymphozyten, nach Zugabe von Azathioprin;
EXP-ERFC= Zahl der E-Rosetten bildenden Lymphozyten, in Gegenwart von Azathioprin und dem getesteten Peptid.

3. Wirkung auf die Antikörperproduktion in Mäusen

Die Wirkung auf die Antikörperproduktion in vivo wird an mit einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid {2- [Bis-(2-chlorethyl)-amino]-tetrahydro-2H-1,3, 2-oxazaphosphorin-2-oxid; Methode: Z. Naturforsch. 358, 1476 (1980)} behandelten CELP-Mäusen getestet. Die Mäuse werden mit einer zuvor nach 10 Minuten Zentrifugieren bei 2500 Upm drei Mal mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung gewaschenen 1%igen Schaf- Erythrozyten-Suspension intraperitoneal immunisiert. Gleichzeitig mit der am 0. Tag durchgeführten Immunisierung wird die Wirksamkeit des Immunsystems durch eine Behandlung mit einer Dosis von 100 mg/kg Cyclophosphamid i.p. unterdrückt. Am 3. Tag des Tests werden die Peptide den Tieren in einer Dosis von 5, 50 beziehungsweise gelegentlich 100 mg/kg intraperitoneal verabreicht. Am 6. Tag des Tests wird den Mäusen retroorbital Blut entnommen und der Anti-Schaf- Erythrozyten-Titer des Serums wird bestimmt. Der eindeutig gehemmte Zustand des supprimierten Immunsystems wird als Zeitpunkt des Beginns der Peptidbehandlung gewählt. Die Wirkung der Peptide wird als Prozentwerte der Aufhebung der Hemmung (G %) ausgedrückt. Die Daten werden in Tabelle 3 dargestellt.
Aus den Daten von Tabelle 3 kann ersehen werden, daß die Peptide der vorliegenden Erfindung das in unterschiedlichem Ausmaß in CELP-Mäusen durch Cyclophosphamid gehemmte Immunsystem stimulieren. Die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen nicht die für cytostatische Mittel kennzeichnende immunsuppresive Wirkung. Tabelle 3 Aufhebung der Hemmung in Mäusen mit durch Cyclophosphamid gehemmter Antikörperproduktion (G %) Wiederherstellung der primären Immunantwort, G % Dosis der Peptide Getestete Peptide
G%= Kontrolle-Test / Kontrolle-CFY · 100
Kontrolle = Antikörper-Produktion unbehandelter Tiere, welche keine Testverbindung erhalten
Test = Antikörper-Produktion behandelter Tiere, welche Testverbindung erhalten
CFY = Antikörper-Produktion mit 100 mg/kg Cyclophosphamid behandelter Tiere.

4. Test auf durch Oxazolon hervorgerufene Dermatitis

In diesem Test wird ein modifiziertes pharmakologisches Modell von D. P. Evans et al. [Br. J. Pharmac. 43, 403-488 (1971)] verwendet.
Die Bauchhaut männlicher, 20-22 g wiegender CFLP-Mäuse wird nach Entfernen der Haare mit 0,1 ml einer 2%igen Lösung von Oxazolon (4-Ethoxymethyl-2-phenyloxazolin, Hersteller Sigma) in Sonnenblumenöl bestrichen. Am rechten Ohr der Versuchstiere wird 7 Tage nach der Sensibilisierung (Bestreichen) mit Hilfe von 10 ul einer 2%igen Acetonlösung von Oxazolon eine entzündliche Reaktion ausgelöst und gleichzeitig werden die Tiere mit einer Dosis von 1 beziehungsweise 2 mg/kg Testverbindung i.p. behandelt. Die Testverbindung wird in einer physiologischen Natriumchloridlösung in einer solchen Konzentration gelöst, daß der der Dosis entsprechende Gehalt des wirksamen Bestandteils in einem Volumen von 0,5 ml/10 g Körpergewicht des Tieres gelöst sein sollte.
Die entzündungshemmende Wirkung wird wie folgt bestimmt: die Tiere werden in der 24. Stunde nach der Behandlung getötet, worauf die rechten und linken Ohren abgeschnitten werden. Die prozentuale Gewichtszunahme des rechten Ohres bezogen auf das linke Ohr ist für das Ausmaß der während der Behandlung hervorgerufenen Entzündung kennzeichnend, während die prozentuale Verringerung der Gewichtszunahme der behandelten Tiere bezogen auf die unbehandelte Kontrolle der entzündungshemmenden Wirkung proportional ist. In Tabelle 4 wird die Verringerung der durch die Testverbindungen erzielten Gewichtszunahme (entzündungshemmende Wirkung) als Prozentsatz der unbehandelten Kontrolle mitgeteilt. Tabelle 4 Hemmung der durch Oxazolon hervorgerufenen Entzündung in der 24. Stunde nach Behandlung mit den Peptiden Hemmung in % der Kontrolle Peptid-Dosis Getestete Peptide

5. in vivo-Wirkung auf die Phagozytose

Männliche CFLP-Mäusen mit einem Körpergewicht von 22-23 g werden in vier Gruppen zu jeweils 8-12 Tieren aufgeteilt. Die Tiere der Testgruppen werden 2 Tage mit Glp-Lys-NH&sub2;-mandelat behandelt. Die Behandlung wird durch Verabreichen einer Dosis von 0,1, 1 beziehungsweise 10 mg/kg s.c. des wirksamen Bestandteils einmal täglich in Form einer Lösung in einer physiologischen Natriumchloridlösung durchgeführt. In der 24. Stunde nach der letzten Behandlung wird das Aufnahmevermögen der peritonealen Exsudat-Zellen (PEC) für Hefezellen bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. In der Tabelle beziehen sich die x ± S.E.M.-Daten auf die Zahl der in die 100 PEC-Zellen aufgenommenen Hefezellen. Tabelle 5 PEC-Phagocytoseaktivität von PEC in der 24. Stunde nach Behandlung Phagocytoseaktivität Dosis Students t-Test

6. Bestimmung der Wirkung auf die durch Cyclophosphamid (CY) inhibierte Phagocytose

a) Gleichzeitig verabreichtes Cyclophosphamid und Peptid

Männliche, 22-23 g wiegende CFLP-Mäusen werden in vier Gruppen zu jeweils 8-12 Tieren aufgeteilt. Die den Testgruppen (alle Gruppen außer der zur Kontrolle) angehörenden Tiere werden 2 Tage mit einer Dosis von 80 mg/kg p.o. Cyclophosphamid einmal täglich behandelt und die Tiere von drei der Gruppen werden gleichzeitig mit der Verabreichung von Cyclophosphamid mit Glp- Lys-NH&sub2;-mandelat in einer Dosis von 0,1, 1,0 beziehungsweise 10 mg/kg s.c., gelöst in einer physiologischen Natriumchloridlösung, behandelt. Am 3. Tag des Tests wird die Fähigkeit der PEC-Zellen, Hefezellen auf zunehmen, bestimmt. Die danach erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Die in der Tabelle offenbarten x ± S.E.M.-Werte stehen für die Zahl der von den 100 PEC-Zellen aufgenommenen Hefezellen. Tabelle 6 Phagozyten-Wirksamkeit von PEC in der 24. Stunde nach Behandlung Phagozyten-Wirksamkeit CY-Dosis Students t-Test

b) nicht gleichzeitig verabreichtes Cyclophosphamid und Peptid

Man verfährt wie in Test a) beschrieben, außer daß das Peptid den Tieren 6 Stunden nach der Behandlung mit Cyclophosphamid verabreicht wird. Der Test wird wie voranstehend beschrieben ausgewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 mitgeteilt. Tabelle 7 Phagozyten-Aktivität von PEC in der 24. Stunde nach Behandlung Phagozyten-Wirksamkeit CY-Dosis Students t-Test

7. Hemmwirkung auf Tumormetastasen

20 männlichen, 20 g wiegenden, in aus jeweils 5 Tieren bestehende Gruppen aufgeteilten C&sub5;&sub7;B&sub1;-Mäusen wurde eine Lewis- Lungentumor- (LLT)Zellsuspension injiziert. Die Zellsuspension wird in einer Dosis von 10&sup5; Zellen/Maus in die Schwanzvene verabfolgt. Vierundzwanzig Stunden nach der Verabfolgung der Tumorzellen werden die Tiere mit einer Einzeldosis der Testverbindung von 10 mg/kg i.p. behandelt. Am 18., auf die Tumorinfektion folgenden Tag werden die Tiere getötet und die in den Lungen auftretenden Krebseinheiten werden unter einem Stereomikroskop gezählt. Mit dem Peptid nicht behandelte Tiere dienen als Kontrolle. In Tabelle 8 werden die mit dem Dipeptidamid Glp-Lys-NH&sub2; erhaltenen Ergebnisse mitgeteilt. Tabelle 8 Zahl der Metastasen in den Lungen Seriennummer der Tiere: In behandelten Tieren: In der unbehandelten Kontrolle:
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, welche als wirksamen Bestandteil wenigstens ein Peptid der Formel (1) - (14) der vorliegenden Erfindung oder deren Säureadditionssalz im Gemisch mit geeigneten inerten pharmazeutischen Trägern enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in der Therapie zur Behandlung von Tumorkrankheiten verwendet werden. Der Vorteil der Verwendung der neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung liegt nicht nur in der Hemmung des Wachstums von Krebszellen, sondern auch in der Tatsache, daß sie, entgegen der immunsuppresiven Wirkung bekannter und weitverbreitet verwendeter cytostatischer Mittel, eine leichte immunstimulierende Wirkung zeigen, welche die Verteidungsfähigkeit des Immunsystems des Organismus aufrecht erhält.
Die Peptide der Formeln (1)-(11) und deren Salze werden durch an sich bekannte Verfahren der pharmazeutischen Industrie in Formen formuliert, welche in der Therapie allgemein verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in festen oder flüssigen Formen formuliert werden und können einen oder mehrere, allgemein verwendete, übliche Träger, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Hilfsmittel (z. B. Stabilisatoren, Salze zum Verändern des osmotischen Druck), Mittel zur Einstellung des pH-Wertes und andere Zusatzstoffe enthalten.
Die festen pharmazeutischen Zusammensetzungen können z. B. zur Herstellung von Injektionen brauchbare Ampullen mit Pulver sein. Die flüssigen Zusammensetzungen können Injektionen und Infusionen sein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden in einer Menge verabreicht, welche genügend wirksamen Bestandteil enthält, um die erwünschte Wirkung zu zeigen. Die Dosis hängt von der Schwere der Erkrankung, dem Körpergewicht des Patienten und seiner (oder ihrer) Empfindlichkeit gegen den wirksamen Bestandteil, der Art der Anwendung, der täglichen Zahl der Behandlungen usw. ab. Die anzuwendende Dosis kann vom Arzt auf der Grundlage aller Umstände des vorgegebenen Falls sicher bestimmt werden.
Um eine einfache Verabreichung zu ermöglichen, wird der wirksame Bestandteil vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten, welche den wirksamen Bestandteil in der zu verabreichenden Menge oder einem kleinen Vielfachen oder Teil (z. B. der halbe, der dritte, der vierte Teil) desselben enthalten, fertiggestellt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können allgemein etwa 1 mg bis etwa 100 mg des wirksamen Bestandteils je Dosierungseinheit enthalten. Die voranstehenden Werte sind selbstverständlich von rein veranschaulichender Art und der tatsächliche Gehalt an wirksamem Bestandteil kann sowohl unter als auch über diesen Grenzen liegen.
Weitere Einzelheiten der vorliegenden Erfindung können in den folgenden Beispielen gefunden werden, ohne den Schutzumfang auf die Beispiele zu begrenzen.
Die in der Beschreibung auftretenden Abkürzungen entsprechen den in der Technik allgemein verwendeten und anerkannten Symbolen [Biochem. J. 219, 345 (1984)]. Alle Aminosäuren besitzen die "L"-Konfiguration.
Die Schmelzpunkte werden in einer Apparatur nach Dr. Tottoli (Büchi, Schweiz) bestimmt. Die Werte der Dünnschichtchromatographie werden auf einem vorgefertigten Kieselgel- Adsorbens (DC-Fertigplatten, Merck) in den folgenden Gemischen bestimmt:
1. Ethylacetat:Grundlösung = 19 : 1
2. Ethylacetat:Grundlösung = 9 : 1
3. Ethylacetat:Grundlösung = 4 : 1
4. Ethylacetat:Grundlösung = 7 : 3
5. n-Butanol:Grundlösung = 3 : 7
6. n-Butanol:Essigsäure:Ethylacetat = 1:1:1:1.
Die Grundlösung ist ein 20:6:11-Gemisch aus Pyridin, Essigsäure und Wasser. Die voranstehenden Verhältnisse sind Volumenverhältnisse.
Die Chromatogramme werden mit Ninhydrin und nach Chlorierung mit einem KI-Tolidin-Reagens entwickelt.
Die spezifische optische Drehung wird mit der Hilfe eines Polarimeters vom Typ Perkin-Elmer 141 bestimmt. Das Entfernen der Lösungsmittel und alle Eindampfschritte werden in einem Rotationsvakuumverdampfer vom Typ Büchi in einem Wasserbad mit 40º C durchgeführt.

Beispiel 1

Z-Lys(Z)-Glu(OBzl)-LYs(Z)-Lys(Z)-ONB

Einer Lösung von 1,13 g (2,5 Millimol) H-Lys(Z)-ONB- hydrochlorid in 10 ml Dimethylformamid werden 0,35 ml (2,5 Millimol) Triethylamin und 1,50 g (2,8 Millimol) Boc-Lys(Z)- OPfp zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, eingedampft, und das verbleibende Öl wird in Ethylacetat suspendiert. Die Suspension wird zweimal mit jeweils 15 ml 10%iger Citronensäure, einer 5%igen Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der so erhaltene geschützte Dipeptidester Boc- Lys(Z)-Lys(Z)-ONB (Rf&sup5;= 0,70) wird mit 10 ml einer 8 Mol/l Chlorwasserstoff enthaltenden Dioxanlösung 15 Minuten umgesetzt und das Reaktionsgemisch wird mit 50 ml wasserfreiem Ether verdünnt. Das ausgefällte freie Dipeptidester-hydrochlorid Lys(Z)-Lys(Z)-ONB*HCl (Rf³= 0,30) wird abfiltriert, mit Ether gewaschen und in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Der pH der Lösung wird mit Triethylamin auf 8 gestellt, worauf 1,5 g (3,0 Millimol) Boc-Glu(OBzl)-OPfp zugefügt werden. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, eingedampft, und der Rückstand wird in 50 ml Ethylacetat suspendiert. Die Suspension wird zweimal mit jeweils 15 ml wäßriger Salzsäure (1 Mol/l), einer 5%igen Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit wasserfreiem Ether verfestigt, die so erhaltene Suspension wird filtriert und der Niederschlag wird mit Ether gewaschen. Auf diese Weise wird der geschützte Tripeptidester Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)ONB erhalten (Rf&sup5;= 0,85). Der so erhaltene geschützte Tripeptidester wird mit 15 ml einer 8 Mol/l Chlorwasserstoff enthaltenden Dioxanlösung 15 Minuten umgesetzt und das Reaktionsgemisch wird mit 100 ml wasserfreiem Ether verdünnt. Das ausgefällte freie Tripeptidester-hydrochlorid Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-ONB*HCl wird abfiltriert, mit Ether gewaschen und in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Der pH der Lösung wird mit Triethylamin auf 8 eingestellt, und der Suspension werden 1,45 g (2,5 Millimol) Z- Lys(Z)-OPfp zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH der Lösung durch Zugabe von Triethylamin bei einem Wert von etwa 8 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird mit 60 ml Ethylacetat behandelt und die so erhaltene Mischung wird zwei Mal mit jeweils 15 wäßriger Salzsäure (Konzentration 1 Mol/l) und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Ethylacetat verfestigt. Der ausgefällte geschützte Tetrapeptidester (2,4 g) Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-ONB wird abfiltriert und aus 25 ml Ethylacetat umkristallisiert. Auf diese Weise werden 2,0 g der gewünschten Verbindung erhalten, Ausbeute 62% (bezogen auf das Ausgangsmaterial Lys(Z)-ONB*HCl). Schmp.: 140-142º C, Rf&sup5;= 0,70.

Beispiel 2

Boc-Arq(HCl)-LVs(Boc)-Glu(OtBu)-NH&sub2;

1,46 g (5,0 Millimol) Glu(OtBu)-NH&sub2;-oxalat und 2,73 g (65,0 Millimol) Z-Lys(Boc)-OPfp werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, worauf 2,10 ml (15 Millimol) Triethylamin tropfenweise bei Raumtemperatur zugesetzt werden. Nach einer Stunde wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand wird in einem Gemisch aus 50 ml Ethylacetat und 50 ml Chloroform gelöst. Die organische Phase wird dreimal mit jeweils 40 ml wäßriger Salzsäure (Konzentration 1 Mol/l) und dreimal mit einer 5%igen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das dermaßen erhaltene geschützte rohe Dipeptidamid Z-Lys(Boc)- Glu(OtBu)-NH&sub2; wird in 100 ml Ethanol gelöst und in Gegenwart von 0,5 g eines 10% Pd-Aktivkohle-Katalysator und unter Rühren durch Durchblasen der Lösung mit Wasserstoff hydriert. Der Reaktionsfortschritt wird durch Dünnschichtchromatographie überwacht (der Rf-Wert des geschützten Dipeptidamids beträgt 0,85 und der des Dipeptidamids beträgt 0,10 im Lösungsmittelgemisch Nr. 3). Die Schutzgruppe wird innerhalb zwei Stunden vollständig entfernt. Die Suspension wird filtriert, das Filtrat wird eingedampft und das verbleibende frei Dipeptidamid Lys(Boc)-Glu(OtBu)-NH&sub2; wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst.
In einem anderen Kolben werden 1,80 g (5,5 Millimol) Z- Arg(HCl)-OH*H&sub2;O in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Dieser Lösung werden 0,77 ml (5,5 Millimol) Triethylamin zugesetzt und das Gemisch wird auf -10º C gekühlt. Bei dieser Temperatur werden dem Gemisch 0,71 ml (5,5 Millimol) iso-Butylchlorformat zugefügt. Die Lösung des so erhaltenen gemischten Anhydrids wird einen weiteren Zeitraum von 10 Minuten bei dieser Temperatur gerührt und die voranstehend erwähnte Dimethylformamidlösung des freien Dipeptidamids wird bei derselben Temperatur zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in einem Gemisch aus 100 ml Chloroform und 10 ml n-Butanol gelöst, die Lösung wird dreimal mit einer 5%igen Essigsäurelösung und dreimal mit einer 5%igen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in 10 ml Ethylacetat gelöst und Ether wird zugefügt, bis die Lösung trübe wird. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird im Kühlschrank stehen gelassen, filtriert und der Niederschlag wird getrocknet. Auf diese Weise werden 1,94 g der gewünschten Verbindung erhalten, Ausbeute 53,7%. Schmp.: 86-88º C; [α]²&sup0;D= -15,8º (c=1, Dimethylformamid), Rf³= 0,30.
Die folgenden Peptid-Derivate werden auf eine zu den Beispielen 1 und 2 analoge Weise erhalten. Verbindung Beispiel Ausbeute Schmp. Rf Reinigung
Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
Beispiel = Nr. des darauf bezogenen analogen Beispiels;
Ausbeute = erhaltene Ausbeute;
Rf = Rf-Wert, in Klammern die Zahl des Lösungsmittelgemisches zur Entwicklung;
Reinigung = Reinigungsverfahren, einschließlich EtOH = Ethanol;
MeOH = Methanol;
EtOAc = Ethylacetat;
Ether = Diethylether;
Hex. = n-Hexan;
Petr.eth. = Petrolether;
S.chrom. = Säulenchromatographie.

Beispiel 3

Lys-Glu-Lys-Lys-diacetat

1,7 g (1,3 Millimol) geschütztes Tetrapeptid Z-Lys(Z)- Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-ONB (Beispiel Nr. 1) werden in 30 ml einer 90%igen Essigsäurelösung gelöst. Der Lösung werden 1,0 g 5% Palladium/Aktivohle-Katalysator zugefügt und Wasserstoff durchperlt 6 Stunden die Lösung. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Dem Rückstand werden 20 ml Wasser zugesetzt und das Gemisch wird erneut eingedampft. Dem Rückstand werden 20 ml Ethanol zugefügt und das Gemisch wird erneut eingeengt. So werden zuerst die Essigsäurespuren und darauf wird das restliche Wasser entfernt. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wird mit 20 ml eines 2:3-Gemisches aus Ethanol und Ether verfestigt, die erhaltene Suspension wird filtriert, der Niederschlag wird zweimal mit dem voranstehenden Lösungsmittelgemisch gewaschen und über Phosphorpentoxid in einem Exsikkator im Vakuum getrocknet. So werden 0,75 g der gewünschten Verbindung erhalten, Ausbeute 88%. Aminosäurenanalyse: Lys = 2,95 (3,0), Glu = 1,00 (1,0). [α]²&sup0;D= -17,3º (c=1, in 10%iger Essigsäure), Rf&sup6;= 0,17.

Beispiel 4

Arg-Lys-Glu-NH&sub2;-acetat

1,47 g (2,0 Millimol) des geschützten Tripeptids Boc-Arg(HCl)- Lys(Boc)-Glu(OtBu)-NH&sub2; werden in 15 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und mit 150 ml wasserfreiem Ether verdünnt. Die derart erhaltene Suspension wird filtriert, der Niederschlag wird in 50 ml Wasser gelöst und die Lösung wird mit 50 ml DOWEX 2 · 8-Anionenaustauscher (Acetatphase) behandelt. Nach 15 Minuten wird die Suspension filtriert, das Filtrat wird mit Aktivkohle geklärt, erneut filtriert und lyophilisiert. Auf diese Weise werden 0,93 g der gewünschten amorphen Verbindung erhalten, Ausbeute 84,6%, [α]²&sup0;D = -3,9º (c=1, Wasser).
Die folgenden Peptid-Derivate werden auf zu den Beispielen 3 und 4 analoge Weise erhalten. Verbindung Beispiel Ausbeute Rf [α]D22
Die Buchstaben in Klammern nach den Daten zur spezifischen optischen Drehung besitzen die folgende Bedeutung:
(a): c=1, Wasser;
(b): c=1, in 10%iger Essigsäure;
(c): c=1, in Essigsäure.
x: der Schmelzpunkt von Glp-Lys-NH&sub2;-mandelat beträgt 159-162ºC.

Claims

1. Peptide der Formel

(1) Glp-Lys-NH&sub2;

(2) Glp-Glu-Lys-NH&sub2;

(3) Arg-Lys-Glu-NH&sub2;

(4) Leu-Val-Ala-OH

(5) Arg-Orn-Asp-Val-NH&sub2;

(6) Arg-Orn-Asp-Val-OH

(7) Lys-Glu-Lys-Lys-OH

(8) Lys-Leu-Lys-Lys-OH

(9) Lys-Asp-Leu-Lys-OH

(10) Glu-Leu-Val-Ala-OH und

(11) Leu-Pro-Ala-Gly-OH

und deren Säureadditionssalze, wobei die Verbindungen die Vermehrung von Leukämie-Zellen hemmen und eine immunstimulierende Wirkung besitzen.

2. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Hemmung der Vermehrung von Leukämie-Zellen mit einer immunstimulierenden Wirkung, umfassend als wirksamen Bestandteil ein oder mehrere Peptid- Derivate der in Anspruch 1 angegebenen Formeln (1)-(11) oder ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz derselben im Gemisch mit herkömmlichen Trägern, Verdünnungsmitteln, Füllstoffen und weiteren Zusatz- und/oder Hilfsstoffen und/oder Mitteln zur Einstellung des pH-Wertes.

3. Peptide mit den wie in Anspruch 1 definierten Formeln (1) bis (11) oder deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze zur Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die Vermehrung von Leukämie-Zellen hemmen und eine immunstimulierende Wirkung besitzen.

4. Peptide mit den wie in Anspruch 1 definierten Formeln (1) bis (11) oder deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung der Vermehrung von Leukämie-Zellen in Säugern und zur Stimulierung des Immunsystems der Säuger, welches das Verbreichen einer wirksamen Dosis wenigstens eines der Peptide an die zu behandelnden Säuger umfaßt.

5. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Derivate eines oder mehrerer Peptide mit den wie in Anspruch 1 definierten Formeln (1) bis (11) oder pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Peptide enthalten, zur Verwendung in einem Behandlungserfahren zur Hemmung der Vermehrung von Leukämie- Zellen in Säugern und zur Stimulierung des Immunsystems der Säuger, welches das Verbreichen einer wirksamen Dosis wenigstens eines der Peptide an die zu behandelnden Säuger umfaßt.

6. Peptide mit den wie in Anspruch 1 definierten Formeln (1) bis (11) oder deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze zur Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen.

7. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der wie in Anspruch 1 angegebenen Formeln (1) bis (11) und deren Säureadditionssalze, umfassend die Schritte des Amidierens oder des Veresterns der Carboxyl-Gruppe einer C-terminalen Aminosäure mit einer hydrogenolytisch oder acidolytisch entfernbaren Gruppe und Schützen irgendeiner Amino- oder Carboxy-Gruppen in der Seitenkette der Säure auf eine Weise, daß eine freie α- Amino-Gruppe übrigbleibt; des nacheinander Ausführens von Verfahren über einen aktiven Ester und/oder ein gemischtes Anhydrid und anschließend von Verfahren zum Freisetzen der α-Amino- Gruppe, um eine aufeinanderfolgende Kettenverlängerung zu erzielen, bis das Peptid in einem geschützten Zustand erhalten wird; des Entfernens der Schutzgruppe oder -gruppen, um das Peptid zu erhalten; und gegebenenfalls seines Umsetzens mit Säure, um ein Säureadditionssalz desselben zu erhalten.

8. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die Vermehrung von Leukämie-Zellen hemmen und eine immunstimulierende Wirkung besitzen, umfassend das Vermischen von Derivaten eines oder mehrerer Peptide der wie in Anspruch 1 definierten Formeln (1) bis (11) oder deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze mit herkömmlichen Trägern, Verdünnungsmitteln, Füllstoffen und weiteren Zusatzund/oder Hilfsstoffen und/oder Mitteln zur Einstellung des pH- Wertes.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, welches das Verwenden von Pentafluorphenylestern im Schritt der Kupplung eines aktiven Esters umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 9, welches das Verwenden eines mit iso-Butylchlorformat gebildeten gemischten Anhydrids im Schritt der Kupplung eines gemischten Anhydrids umfaßt.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7, 9 oder 10, welches das Herstellen eines geschützten, eine Z-Schutzgruppe an den nicht in einer Peptid-Bindung befindlichen Amino-Gruppen und eine entweder mit einer Benzyl- oder Nitrobenzyl-Gruppe veresterten Carboxy-Gruppe oder in amidierter Form enthaltenden Derivates und das Entfernen der Schutzgruppen von den geschützten Derivaten durch katalytische Hydrierung umfaßt.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7, 9 oder 10, welches das Herstellen geschützter, eine Boc-Schutzgruppe an den nicht in einer Peptid-Bindung befindlichen Amino-Gruppen und eine entweder mit einer tertiären Butyl-Gruppe veresterten Carboxy- Gruppe oder in amidierter Form enthaltender geschützter Derivate und das Entfernen der Schutzgruppen von den geschützten Derivaten durch Acidolyse umfaßt.