JPS63198698A - 新規ペプチド、その製法およびそれを含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、白血病性細胞の増殖を阻害すると共に免疫刺
激作用を示す新規ペプチド、その製法およびそのペプチ
ドを含む医薬組成物に関する。本発明は、白血病性細胞
の増殖を阻害し、そして免疫系を刺激する哺乳類（人間
を含む）の治療方法にも係る。

本発明の１つの観点によれば１式 ％式％ で表される新規ペプチド並びにそれらの酸付加塩が提供
される。

本発明の新規ペプチドは白血病性細胞の増殖を阻害し、
そして免疫刺激作用を示す。

成る種の胸腺ホルモンは、細胞増殖抑制剤で処理された
患者の免疫機能を復活させることができるとともに成る
種の腫瘍細胞の増殖を阻害することができることは知ら
れている（　ＲｅｃｅｎｔＰｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈ
ｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　＋　３７　＋３６９
−４１２（１９８１）；Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
。

Ｉｍｙｌｕｎｏｔｈｅｒ、１５．７８−８３．１９８３
：＋にの作用は、より小さいホルモン断片の補助で誘発
させることもでき、その治療応用は、より大きな分子量
をもつホルモンまたは胸腺抽出物の応用よりも好ましい
。従来合成された小さいペプチドの免疫刺激効果は各種
の試験系で明確に示すことができた（米国特許第４，１
９０，６４６号、第４，２１５，１１２号、第４，３９
５，４０４号および第４．４４２，０３１号；ハンガリ
ー国特許第１８５，２６３号、並びに酉独国特許公開第
２，９３８，４２０号、第３，００１，７７５号および
第３，１００，９７４号各明細書参照）。サイモペンチ
ン（サイモポイエチンの３２〜３６断片）は、医薬活性
成分として既に市場に出ていた。この公知のペプチドは
Ｔ細胞および／またはＢ細胞の増殖を主に誘発するが、
腫瘍細胞の増殖は直接的には阻害しない。

本発明の目的は、公知のサイモポイエチン断片類似体の
免疫刺激活性に加えて、強い抗腫瘍作用ももつ新規のサ
イモポイエチン断片類似体を提供することにある。

驚ろくべきことに、前記の式（１）〜（１４の新規ペプ
チドは免疫刺激活性の他に強い抗腫瘍作用を示すことが
分かった。本発明者が使用した試験系において、本発明
のペプチドは、対照として使用した公知の免疫刺激ペプ
チドすなわちサイモベンチン（米国特許第４．１９０．
６４６号）および式Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ
ｌ−ＯＨのテトラペプチド（ハンガリー国特許第１８５
，２６３号）と比較して、より強い抗腫瘍作用を及ぼす
。前記の他に、本発明の化合物は癌性細胞だけの増殖を
阻害し、一般的（系統的）な免疫抑制作用を及ぼさない
点で、本発明の新規ペプチドは公知の細胞増殖抑制剤と
異なる。

本発明の他の観点によれば、式（１）〜α→のペプチド
およびそれらの酸付加塩の製造方法が提供される。

本発明方法によれば、活性エステルおよび／または混合
無水物のカッブリング工程とα−アミノ基の遊離化工程
とを屓次に実施すること、出発材料として、水添分解的
またはアシドリシス的に除去可能な基によってアミド化
またはエステル化されるカルボキシル基と、場合により
、側鎖中の、保護されたアミノ基および／または水添分
解的またはアシドリシス的に除去可能な基によってエス
テル化されたカルがキシル基と、遊離α−アミノ基とを
含むＣ末端アミノ酸誘導体を使用すること、こうして、
カルボキシル基上がエステル化またはアミド化されそし
てペプチド結合に参加しないアミノ基上にＢｏｃまたは
２保護基を担持した式（１）〜α◆のペプチドの保護さ
れた誘導体を調製すること、そして存在する保護基を水
添分解および／またはアシドリシスによって除去するこ
と、そして所望により、こうして得られた式（１）〜式
α→の遊離ペプチドを酸との反応によってその酸付加塩
に変えることからなる、段階的な屓次の鎖延長により、
式（１）〜ａ４の新規ペプチドおよびその酸付加塩が溶
液中に調製される。

合成の過程においては、アミノ基の保護基の選択的除去
を可能にする保護基の組合せを、そして合成の終点にお
いては、すべての保護基の脱離を（可能なら単独の工程
で）可能にする保護基の組合せを使用する。ペプチド結
合は、ハンガリー国％許第１６８，４３１号に記載のペ
ンタフルオロフェニルエステル法またはハンがリー国特
許第１８３．５７９号に記載の混合無水物法を使用して
形成される。

アミノ基はＢｏｃ基または２基を使って保護するのが好
ましく、一方、カルボキシル基の保護は、ｔ−ブチルア
ルコール、ベンノルアルコールマタはニトロベンジルア
ルコールによるエステル化によって実施するのが好まし
い。

こうして得られる合成された保護ペプチドから、合成の
後で、場合により存在する保護基を除去し、こうして得
られた遊離ペプチドを酸処理によって酸付加塩に変える
。保護基の除去は、酸によって行うアシドリシス１＋は
接触水素化によって行うのが好ましい。

こうして得られる遊離ペプチドは治療用として一般に充
分に純粋であるので、更に精製する必要はない。しかし
ながら、必要な場合には、公知の方法例えばシリカカラ
ム上のクロマトグラフィーによって４プチドを精製する
ことができる。溶液の形で得られるペプチドは、溶液の
蒸発により、または凍結乾燥によって一般に単離するこ
とができる。

本発明によるペプチドの生物学的活性は以下の方法によ
って試験する。

（１）腫瘍細胞増殖の阻害 この試験には、ヒトに−５６２赤白血病細胞系列を使用
する（ストックホルム、ＫａｒｏｌｉｎａｋａＩｎｓｔ
ｌｔｕｔｅ）。グラスチ、り型皿中で、二酸化炭素３％
含有の給温化インキュベータ内で、温度３７℃において
、子ウシ胎児血清１０％を含むＲＰＭＩ−１６４０と称
する栄養培地（英国のＦｌｏｗ製）中でインキュベート
を実施する。すべての測定値は、各々３つの皿で測定し
たデータの平均値である。試験の開始時に０．５Ｘ１０
　　細胞／づに希釈する。希釈してから２４時間後に処
理を実施し、処理後には培地を加えない。細胞の計数は
、Ｂｕｅｒｋｅｒ　　チャンバーを使用して、希釈の９
６時間後まで、２４時間毎に行う。

添付図面はＲプチドＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓの
腫瘍細胞増殖阻害効果を示すものである。左側のグラフ
は細胞の絶対数の値を時間との関係でプロットしたもの
である。右側のグラフは細胞数を対照に対する百分率（
ＣＳ）で時間との関係でプロットしたものである。処理
から２４時間後のペプチドの作用の下で、細胞数は停滞
し、そしてその後の細胞数の増加程度は非常に小さい。

これは、そのペプチドが細胞死減作用よりもむしろ細胞
分裂阻害活性を示すものであることを意味する。本発明
の新規ペプチドの腫瘍細胞分裂阻害活性を表１に示す（
処理から７２時間後）。阻害率は対照に対する百分率で
示す。ヒ）Ｋ−５６２赤白血病細抱の増殖を、供試ペプ
チドが示すことが表のデータから明白である。

以下糸白 ペプチド″Ａ″および′Ｂ”は公知の参考用化合物であ
る（ハンガリー国特許第１８５，２６３号）。

（２）Ｔ−リンパ球の増殖阻害 Ａｚａｔｈｉｏｐｉｎｅ　Ｃ６−（１−メチル−４−二
トロイミダゾール−５−イル−チオ）−プリン；Ｔｈｙ
ｍｕｓ　１　、１９５（１９８０年）〕によって阻害さ
れるＥ−ロゼツタ試験によって、Ｔ−リンパ球の増殖阻
害を試験する。

健康なリン・９球細胞懸濁液２００μｌ中に、ＨＢＢＳ
緩衝液（英国のＦｌｏｗ　展）中の供試化合物の各々の
希釈液２００μ！およびＡｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ５０
０μ７３／ｆｎｌを加える（濃度範囲：１０〜１０モル
／ｌ）。二酸化炭素５チを含有する空気中で６０分間、
３７℃の温度で前記の混合物をインキ−ベートする。こ
うして得られた混合物を１１０００ｒｐで５分間遠心し
、上清をデカンテーションによって除き、邂濁液中で、
少なくとも４００個の細胞から顕微鏡下でリンパ球形成
性Ｅ−ロゼツタを計数する。

被プチドの作用の下で、Ａｚｏｔｈｊｏｐｒｉｎｅによ
って阻害されるリン・４球のＥ−ロゼツタ形成性活性の
増加１度は異ったものとなる。試験した投与量範囲にお
いては、ペプチドはす７７９球のＥ−ロゼ、り形成活性
を阻害しない。結果を表２に要約する。このデータは、
す７１球のＥ−ロゼツタ形成活性に対してＡｚａｔｈｉ
ｏｐｒｉｎｅによって与えられる阻害がペプチドによっ
てどの程度までやわらげられるかを示すものである。供
試ペプチドによって、阻害リン・９球のＥ−ロゼツタ形
成能力が増加すること、すなわち本発明のペプチドには
先優刺激作用のあることが表２のデータかられかる。

以下４゛、白 ペプチド″′Ａ＃およびＢ“は公知の参考用化合物であ
る。

ＥＲＦＣ−−−Ａｚａｔｈｌｏｐｒｉｎｅを添加しない
、Ｅ−ロゼツタを形成するリン／４球の数 ＡＺ−ＥＲＦＣ−Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅを添加した
、Ｅ−ロゼツタを形成するリン／４球の数 ＥＸＰ−ＥＲＦＣ＝　Ａｚａｔｈｌｏｐｒｉｎｓ　　お
よび供給ペプチドの存在下における、Ｅ−ロゼツタ を形成するリンパ球の数 （３）マウス中での抗体生成作用 シクロホスファミド（２−（ビス−（２−／ロロエチル
）−アミノコ−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキ
サデーホスホリン−２−オキシド：　Ｚ、　Ｎａｔｕｒ
ｆｏｒｓｃｈ、３５Ｂ　＋　１４７６（１９８０））１
００ηＡ９体重の投与量で処理したＣＥＬＰマウスにつ
いて、ｉｎ　ｖｉｖｏ　抗体生成作用を試験する。

遠心処理（２５００ｒｐｍ、　１０分間）後に０．９チ
塩化ナトリウム溶液で予め３回洗浄した１％ヒツジ赤血
球懸濁液を使用して、前記のマウスは腹腔内免疫処理を
しておく。０日目に実施される免疫化と同時に、シクロ
ホスファミド１００Ｗ４腹腔内投与で処理することによ
り免疫系活性を抑制する。試験の３日目に、ペプチドを
投与量５４勺、５０”９ｉ勺および場合により１００４
勺で各々動物に腹腔内投与する。試験の６日目にマウス
の後部眼窩から試験面液を採取し、崩清の抗−ヒツジ赤
血球滴定量を測定する。ペプチド処理の開始時点として
、免疫系が明らかに阻害されている状態を選ぶ。ペプチ
ドの作用は阻害緩和の百分率（０％）で示す。データを
表３に示す。

本発明のペプチドは、シクロホスファミドによって阻害
された免疫系を、ＣＥＬＰマウスにおいて異なる程度に
刺激することが、茨３のデータから分かる。本発明の新
規化合物は、細胞増殖抑制剤の免疫抑制作用特性を示さ
ない。

以下オ、白 対照・・・供試化合物を受けていない非処理動物の抗体
生成 試験・・・供試化合物を受けた処理動物の抗体生成ＣＦ
Ｙ・・・シクロホスファミド１１００Ｔｎ９Ａで処理し
た動物の抗体生成 この試験では、Ｄ、Ｐ、　Ｅｖａｎｓ等の修正生理学的
モデルを使用する［　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃ、
　４３　＋４０３−４８８　（１９７１））。

体重２０〜２２ｐの雄ＣＦＬＰマウスの腹部皮膚に、そ
の体毛を除去した後で、ヒマワリ種子油中のオキサシロ
ン（４−エトキシメチル−２−フェニル−オキサグリン
：　Ｓ１ｇｍａ製）の２％溶９０．１ゴを塗布する。感
作（塗布）から７日後に試験動物の右耳上に、２％アセ
トン性オキサシロン溶液１０μｌを使用して炎症反応を
誘発させ、同時に、供試化合物１４勺または２叩／ゆの
腹腔内投与によって動物を処理する。投与量に相当する
活性成分含量が動物体重１０．ｇ当す０．５１１７の容
量中に溶解されるような濃度で供試化合物を生理食塩水
中に溶解する。

抗炎症性作用を以下のように測定する。すなわち、処理
から２４時間後に動物を殺し、右耳訃よび左耳を切断す
る。左耳に対する右耳の知覚し得る体重増加は試験中に
誘発された炎症速度の特性であり、そして非処理対照に
対する処理動物の体重増加の知覚し得る減少は抗炎作用
に比例する。

表４に、供試化合物によって達成された体重増加の減少
（抗炎作用）を、非処理対照体に対する百分率で示す。

表　４ ０ｆチド処理から２４時間後における、オキサシロン供
試ペプチド Ｇｌｐ−Ｌｙｓ−ＮＴ（２６２６１ Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓ　ｐ−ＮＨ２２７Ｌ）ｒｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ２２７９Ｌｙ８−Ｌｓｕ−Ｌ
ｙｅ−Ｌｙｓ−ＯＨ３０４１Ｇｌｕ−Ｌ＠ｕ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−ＯＨ４０Ｌ＠ｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｈ５５体重２２〜２３ｐの雄ＣＦＬ、Ｐマウスを各々８
〜１２匹の動物の４つの群に分ける。試験群の動物を２
日間Ｇｉｐ−ＬｙＩＩ−ＮＨ２−マンプレートで処理す
る。

生理塩化ナトリウム溶液中の溶液の形で、１日に１回、
それぞれ活性成分０．１　Ｗ／に９．１　ｑ／ユまたは
１０■／ゆ皮下投与によって処理を実施する。

最後の処理から２４時間後に、腹膜滲出細胞（ＰＥＣ：
　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　　ｅｘｓｕｄａｔｕｍ　ｅｓ
ｌｌ）のイースト細胞装入能を測定する。得られる結果
を表５に示す。その表において、　：にニー１８．Ｅ、
Ｍ　　データはＰＥＣ細胞１００個中に装入されたイー
スト細胞の数に関する。

（６）シクロホスファミド（ＣＹ）によって阻害された
食菌作用に対する作用の測定 葎）同時に投与されたシクロホスファミドおよびヘフチ
ド体重２２〜２３ｇの雄ＣＦＬＰマウスを各々８〜１２
匹の５つの群に分ける。試験群（対照群１つを除くすべ
ての群）に属する動物を、シクロホスファミド８０１ｎ
９／に９の経口投与で１日１回で２日間処理し、そして
それらの群のうちの３つの群の動物は生理塩化ナトリウ
ム溶液中に溶解したＧｌｐ−Ｌｙｌ−ＮＨ２−マンプレ
ートの０．１■／ゆ、１、　Ｏ４勺および１０η殉皮下
投与によってシクロホスファミドと同時に処理する。試
験の３８目にＰＥＣ細胞のイースト菌装入能力を測定す
る。

得られる結果を表５に示す。表中のＸ−１：Ｓ、Ｅ、Ｍ
。

直はＰＥＣ細胞１００個によって装入されたイースト細
胞の数を示す。　　　　　　　　　以−１，；Ｊ２．白
（ｂ）　　同時に投与されないシクロホスファミドおヨ
ヒペプチドシクロホスファミドによる処理から６時間後
にペプチドを動物に投与すること以外は前記試験（１）
の方法を繰返す。評価も前記と同様に行う。結果を表７
に示す。

以下全白 （７）腫瘍転移阻害作用 各々動物５匹からなる群に分けた体重２０ｇの雄０５７
Ｂ、マウスにＬｓｗｉｇ肺腫瘍（ＬＬＴ）細胞懸濁液を
注入する。その細胞懸濁液を、１０細胞／マウスの投与
量で、尾部静脈中に投与する。腫瘍細胞の投与から２４
時間後に、供試化合物の１０４勺の単独膜腔内投与で動
物を処理する。腫瘍の注入から１８日８に動物を殺し、
肺中に現れる培率を立体顕微鏡下で計数する。ペプチド
処理をしてない動物は対照として使う。表８に、Ｇｌｐ
−Ｌｙ　ａ−Ｎｌ（２ソペプチドアミドで得られた結果
を示す。

表　　８ 肺中の転移数 動物の連続番号　　　１２３４５ 処理動物中　　　　　０２１２５ 非処理動物中　　　１５　２０　１６　１２　１１本発
明の更に別の観点によれば、式（１）〜ａ→のペプチド
またはその酸付加塩少なくとも１種を活性成分として、
適当な不活性医薬担体との混合物として含む医薬組成物
が提供される。本発明による医薬組成物は、腫瘍疾患の
処理に治療用として使用することができる。本発明の新
規化合物を使用する利点は、癌性細胞の増殖阻害だけで
なく、公知の広範に使用されていた細胞増殖抑制剤の免
疫抑制作用とは異なり、本発明の医薬組成物は器官の免
疫系の防御能力を維持する単独の免疫刺激作用を示す点
にもある。

式（１）〜ａ４のペプチドおよびそれらの塩は、医薬業
界にそれ自体公知の方法によって治療上一般に使用され
ている形に調製される。本発明の医薬組成物は、固体ま
たは液体の形で調製することができ、一般に使用されて
いる通常の担体、希釈剤、安定剤、浸透圧調整剤、−調
整剤および／または他の添加剤および／″′！たけ助剤
を含有することができる。

固体の医薬組成物は、例えば注射製剤に使用する粉末ア
ンプルであることができる。液体組成物は注射および浸
剤であることができる。

本発明の医薬組成物は、望ましい作用を示すのに充分な
活性成分を含有する量で投与する。その投与量は、疾患
の重さ、患者の体重、活性成分に対する患者の感受性、
適用の態様、および１日の処理回数等によって異なる。

適用すべき投与量は、具体的な場合のすべての状況に基
づいて医師が安全に決定することができる。

簡単な投与を可能にするには、活性成分を投与すべき量
でもしくは小さい複数のｔたは部分的（例えば半分、１
／３．１／４部分）の量で含有する投与単位の形で活性
成分を仕上げるのが好ましい。

本発明の医薬組成物は、投与単位当り活性成分約１１ｎ
９〜約１００〜を一般に含有することができる。この値
は単なる例示であり、実際の活性成分含量はその限界の
下または上であることができる。

本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明するが、
これは本発明の範囲を限定するものではない。

本明細書で使用する略語は当業界で一般に使用されそし
て受は入れられているものである［Ｂｉｏｃｈａｍ、　
Ｊ、　２１９　、３４５　（１９８碑））。アミノ酸は
すべてＬ配置である。

融点はＴｏｔｔｏｌｉ形装置（スイス、Ｂ１１ｃｈｉ’
）で決定する。薄層クロマトグラフィーの直は、予備調
製シリカダル吸着剤（Ｍ＠ｒｃｋ：ＤＣ−Ｆｅｒｔｌｇ
ｐｌａｔｔｅｎ）上で、以下の溶媒混合物中で測定する
。

（１）酢酸エチル：原液＝ｉ９：１ （２）酢酸エチル二原液＝９：１ （３）酢酸エチル二原液＝４＝１ （４）酢酸エチル二原液＝７：３ （５）ｎ−ブタノール：原液＝３ニア （６）ｎ−ブタノール：酢酸：酢酸エチル：水＝１：１
：１：１ 原液はピリジンと酢酸と水との２０：６：１１混合物で
ある。上記の比は容量比である。

クロマトグラムはニンヒドリンで、そして塩素化後にＫ
Ｉ−トリノン試薬で現像する。

比光学回転はＰｅｒｋｉｎ−ｇｌｍｓｒｌ　４１形偏光
計を使用して測定する。溶媒の除去およびすべての蒸発
工程は、４０℃の水浴中でＢ１１ｃｈｉ形の回転真空蒸
発器中で実施する。

以下で：白 例Ｉ Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）
−Ｌｙｅ（Ｚ）−ＯＮＢツメチルホルムアミド１０ゴ中
のＨ−Ｌ１２（Ｚ）−〇ＮＢ−塩酸塩１．１３．９　（
２，５ミリモル）の溶液に、トリエチルアミノ０．３５
ｍ／（２，５ミリモル）とＢｏａ−Ｌｙｓ（Ｚ）−０Ｐ
ｆｐ　１．５０　、ｌｉ’　（２，８ミリモル）とを加
える。反応混合物を室温で３０分間攪拌し、蒸発させ、
そして残留油状体を酢酸エチル中に懸濁する。懸濁液を
、１０％クエン酸、５チ炭酸水素す）　ＩＪウム溶液お
よび水の各１５ｍ１で２回洗浄する。有機相を硫酸ナト
リウム上で乾かし、そして蒸発させる。こうして得られ
る保護されたジペプチドエステルＨｏｅ−Ｌｙｓ（Ｚ）
−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＮＢ　（Ｒ５ｆ＝０．７０）と、塩
化水素８モル／ｌ’ｃ含有するジオキサン溶液１０−と
を１５分間反応させ、反応混合物を無水エーテル５０−
で希釈する。沈殿する遊離のジペプチドエステル塩酸塩
Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＮＢ、ＨＣ２（Ｒ３ｆ
＝　０．３０　）　’ｋＷ別Ｌ、エーテルで洗い、ジメ
チルホルムアミド１５−中に溶解する。溶液のｐＨｔＪ
リエチルアミノで８に調整し、Ｂｏａ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ
ｌ）−０Ｐｆｐ　　１．５　ｊ９　（３，０ミリモル）
を加える。反応混合物を３０分間室温で攪拌し、蒸発さ
せ、そして残留物を酢酸エテル５０ゴ中に懸濁する。懸
濁液全水性塩酸（１モル／ｌ）、５チ炭酸水素ナトリウ
ム溶液および水の各１５１！Ｌｌで２回洗浄する。有機
相を無水硫酸ナトＩＪウム上で乾かし、蒸発させる。油
状残留物を無水エーテルで固化し、こうして得られた懸
濁液を濾過し、沈殿をエーテルで洗う。こうして保護さ
れているトリペプチドエステ／ｌ／　Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（
ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＮＢ　（
Ｒ”ｆ＝　０．８５　）が得られる。こうして得られる
保護されたトリペプチドと、塩化水素８モル／！ヲ含有
するジオキサン１５−と全１５分間反応させ、反応混合
物を無水エーテル１００ｒｎｌで希釈する。沈殿する遊
離のトリペプチドエステル塩酸塩Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−
Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）　−０ＮＢ、ＨＣｚ　２（
濾過し、エーテルで洗い、ジメチルホルムアミド２０づ
中に溶解する。溶液のＰ［′ｉミラトリエチルアミノ８
に調整し、懸濁液にＺ−Ｌｙｓ（７：Ｊ−ＯＰｆｐ　１
．４５　ｆｉ＋　（２，５ミリモル）を加える。反応混
合物を１５分間室温で攪拌し、トリエチルアミノの添加
によって溶液の−を約８の値に維持する。

反応混合物を酢酸エチル６０ｍ１で処理し、こうして得
られる混合物を水性塩酸（ｆＩｋ度１モル／りおよび水
の各々１５−で洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウム
上で乾かし、真空中で蒸発させる。

油状残留物を酢酸エチルで固化する。沈殿する保護され
次テトラペプチドエステルＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｇｌ
ｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＮＢ
　（２，４１！　）　ｋ戸別し、酢酸エチル２５ｍから
再結晶する。こうして、所望の化合物２．Ｏｌが得られ
る。収量６２％　（Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＮＢ、ＨＣＡ出発
材料に対シテ〕。融点：１４０〜１４２℃。Ｊ＝Ｏ９７
０゜ 例２ Ｂｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＮＨ２−オキサレート１．４６　
Ｆ　（５，０ミリモル）とＺ−Ｌｙｓ（Ｂｏａ）−０Ｐ
ｆｐ　２．７３１　（６５，０ミリモル）とをジメチル
ホルムアミド１０１ｎｌ中に溶解し、トリエチルアミノ
２．１０ｍ１（１５ミリモル）を室温で滴加する。１時
間後、反応混合物を真空中で蒸発させ、残留物を酢酸エ
チル５０プとクロロホルム５０ｍＪとの混合物中に溶解
する。有機相全水性塩酸（濃度１モル／ｌ＞４０ｍ１で
３回および５％炭酸水素ナトリウム溶液で３回洗い、無
水硫酸ナトリウム上で乾かし、そして蒸発させる。こう
して得られた保護された粗製のジペプチドアミ　ドＺ−
Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）−ＮＨ２ｅエタノ
ール１００ｒｎｌ中に溶解し１．１０％パラジウム木炭
触媒ｏ、ｓ、ｐの存在下で、溶液中に水素をバグリング
することによって攪拌しながら水素化する。反応の進行
は薄層クロマトグラフィーで監視スる（溶液混合物Ａ３
中で、保護されたジペプチドアミドのＲｆ値は０．８５
であシ、そしてジペプチドアミドのＲｆ値は０．１０で
ある）。保護基は２時間以内に完全に除去される。懸濁
液を濾過し、Ｆ液を蒸発させ、残留物であるＬｙｉ（Ｂ
ｏｅ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＮＨ２遊離ジペプチドア
ミドをジメチルホルムアミド１５ｄ中に溶解する。

別のフラスコ中において、Ｚ−Ａｒｇ（ＨＣｔ）−０Ｈ
。

１（２０１，８０Ｊ　（５，５ミリモル）をジメチルホ
ルムアミド１５ｍＪ中に溶解する。この溶液に、トリエ
チルアミノ０．７７１７１ｊ（５，５ミリモル）を加え
、混合物’！１ｅ−−１０℃に冷却する。この温度で、
混合物中に、クロロギ酸イソブチル０．７１ｍ（５，５
ミリモル）を加える。こうして得られる混合アルデヒド
の溶液をこの温度で更に１０分間攪拌し、前記の遊離ジ
ペプチドアミドのジメチルホルムアミド溶液を同じ温度
で加える。反応混合物を一晩室温で攪拌し、真空中で蒸
発する。残留油状物をクロロホルム１００ＴＲ１とｎ−
ブタノール１０−との混合物中に溶解し、この溶液を５
％酢酸溶液で３回および５％炭酸水素ナトリウム溶液で
３回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾かし、真空中で
蒸発させる。残留油状物を酢酸エチル１０ｎ６中に溶解
し、溶液が曇るまでエーテルを加える。こうして得られ
る懸濁液を冷却器中に放置し、濾過し、沈殿を乾かす。

こうして所望の化合物１．９４ｇが得られる。収率：５
３．７ｔｓ、融点：８６〜８８℃。

〔α発’＝−１５，８°（ｃ＝１、ツメチルホルムアミ
ド）。Ｊ＝０．３０゜ 前記の例１および例２と同様の方法によシ、以下のペプ
チド誘導体は調製される。

以下石臼 Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｚ）−−Ｌｙｓ（
Ｚ）−ＯＮＢ　　　　　　　　　　　　　　　１　　　
　　７２Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＮＢ　　　　　　　　　　　　
　１　　　　　５８Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅ
ｕ−−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＮＢ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１　　　　　　　７９Ｚ−Ｌｓｕ−Ｐｒ
ｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＮＢ　　　　　　　　　１　　
　　　　６２１３７−１３９　　　　　　０．７０（１
）　　　　　　ＥｔＯＡｃ１７８−１８０　　　　　　
０．８０（１）　　　　　　ＥｔＯＡｃ非晶質　　　　
　０．８５　（２）　　　　　ｐｅｔｒ、ｅｔｈ油状体
　　　　　　０．９０　（２）　　　　　　−用語の意
味は以下のとおシである。

例　　　・・・参考にされる同様の例の番号収率　　・
・・得られた収率 Ｒ４・・・Ｒ４値およびカッコ内は展開溶媒混合物の数 精製　　・・・精製方法 ＥｔＯＨ・・・エタノール ＭｅＯＨ・・・メタノール ＥｔＯＡｃ　　・・・酢酸エチル エーテル・・・ジエチルエーテル ｈｅｘ　　　・・・ｎ−ヘキサン ｐｅｔｒ、ｅｔｈ・・・石油エーテル ｃｏ１．ｃｈｒ・・・カラムクロマトグラフィー例３ Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ジアセテートＺ−Ｌ
ｙｓ　（Ｚ）−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ　）−Ｌｙｓ（Ｚ）−
Ｌｙｓ　（Ｚ）−ＯＮＢ保護テトラペプチド（例１　）
　１．７．Ｆ（１，３ミＩＪモル）ｔ−９０％酢酸溶液
３０ＴＬｌ中に溶解する。この溶液ニ、５％パラジウム
／木炭触媒１．０．９　を加ｔ、水素全混合物中に６時
間バブリングする。触媒を戸別し、Ｆ液を真空中で蒸発
させる。残留物に水２ｏａｗ加え、混合物を再び蒸発さ
せる。残留物にエタノール２０ｉ１７を加え、混合物を
再び蒸発させる。次に酢酸の痕跡量全最初にそして残留
水を次に除去する。こうして得られる残留物をエタノー
ルとエーテルの２：３混合物２０１１Ｊで固体化し、得
られる懸濁液を戸別し、沈殿を上記の溶媒混合物で２回
洗い、真空のデシケータ中の五酸化リン上で乾かす。こ
うして所望の化合物０．７５１１が得られる。収率８８
チ。アミノ酸分析：　Ｌｙｓ＝２．９５（３，０）　、
　Ｇ１ｕ＝　１．００　（１，０）。〔α〕ｏ−−１７
．３°（ｃ＝１．１０％酢酸内）ｏＲｆ＝０．１７゜ 例４ Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ２−アセテート保護され
たトリペプチドＢｏＣ−Ａｒｇ（ＨＣｔ）−Ｌｙｓ（Ｂ
ｏａ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＮＩ（ｚ　　１．４７１
　（２，０ミリモル）ヲトリフルオロ酢酸１５−中に溶
解する。この溶液全室温で１時間半放置し、無水エーテ
ル１５０ｍ１で希釈する。こうして得られる懸濁液を濾
過し、沈殿金水５０ｍＪ中に溶解し、この溶液をＤＯ■
Ｘ２４８アニオン交換樹脂（アセテート相）５０−で処
理する。１５分後、懸濁液を濾過し、戸数を活性炭で清
浄化し、再び濾過してから凍結乾燥する。こうして所望
の非晶質化合物０１９３．Ｆを得る。収率８４，６％。

〔α）、　−−３，９（（！＝１１水）。

例３および例４と同様の方法で以下のペプチド誘導体を
調製する。

以下石、白 比光学施光データの後のカッコ内の記号は以下の意味で
ある。

（ａ）：ｃ＝１．水中 （ｂ）　：　ｃ＝１　、１０チ酢酸中 （ｃ）：ｃ＝１．酢酸中 ｘ　：　Ｇｌｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ２−マフブレートの融点
は１５９〜１６２℃

【図面の簡単な説明】

添付図面は、ペゾチドＬｙｓ−Ｌａｕ−Ｌｙ８−Ｌｙｓ
の腫瘍細胞増殖阻害効果金示すグラフである。 特許出顯人 リヒター　ダブオン　ペジェセティ ジャール　アール、　チー。 特許出願代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 （１）Ｇｌｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２ （２）Ｇｌｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２ （３）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ＿２ （４）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＮＨ＿２ （５）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＯＨ （６）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＨ （７）Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨ （８）Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＮＨ＿２（９
   ）Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＯＨ（１０）Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１１）Ｌｙｓ−Ｌ
   ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１２）Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
   Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１３）Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
   −Ａｌａ−ＯＨおよび（１４）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
   −Ｇｌｙ−ＯＨで表されるペプチド、並びにそれらの酸
   付加塩。 ２、式 （１）Ｇｌｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２ （２）Ｇｌｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２ （３）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ＿２ （４）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＮＨ＿２ （５）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＯＨ （６）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＨ （７）Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨ （８）Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＮＨ＿２（９
   ）Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＯＨ（１０）Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１１）Ｌｙｓ−Ｌ
   ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１２）Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
   Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１３）Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
   −Ａｌａ−ＯＨおよび（１４）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
   −Ｇｌｙ−ＯＨで表されるペプチド、並びにそれらの酸
   付加塩の製造方法であって、 活性エステルおよび／または混合無水物のカップリング
   工程とα−アミノ基の遊離化工程とを順次に実施するこ
   と、出発材料として、水添分解的またはアシドリシス的
   に除去可能な基によってアミド化またはエステル化され
   るカルボキシル基と、場合により、側鎖中の、保護され
   たアミノ基および／または水添分解的またはアシドリシ
   ス的に除去可能な基によってエステル化されたカルボキ
   シル基と、遊離α−アミノ基とを含むＣ末端アミノ酸誘
   導体を使用すること、こうして、カルボキシル基上がエ
   ステル化またはアミド化されそしてペプチド結合に参加
   しないアミノ基上にＢｏｃまたはＺ保護基を担持した式
   （１）〜（１４）のペプチドの保護された誘導体を調製
   すること、そして存在する保護基を水添分解および／ま
   たはアシドリシスによって除去すること、そして所望に
   より、こうして得られた式（１）〜式（１４）の遊離ペ
   プチドを酸との反応によってその酸付加塩に変えること
   を特徴とする、前記の製造方法。 ３、活性エステルカップリング工程においてペンタフル
   オロフェニルエステルを使用する特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 ４、混合無水物カップリング工程においてクロロギ酸イ
   ソブチルで形成された混合無水物を使用する特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ５、ペプチド結合中にないアミノ基上のＺ保護基と、ベ
   ンジルもしくはニトロベンジル基でエステル化されてい
   るかまたはアミド化形のカルボキシル基とを含有する保
   護された誘導体を調製し、そして接触水素化によって前
   記の保護された誘導体から保護基を除去する特許請求の
   範囲第２項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６、ペプチド結合中にないアミノ基上のＢｏｃ保護基と
   、ｔ−ブチル基でエステル化されているかまたはアミド
   化形のカルボキシル基とを含有する保護された誘導体を
   調製し、そしてアシドリシスによって前記の保護された
   誘導体から保護基を除去する特許請求の範囲第２項〜第
   ４項のいずれかに記載の方法。 ７、式 （１）Ｇ１ｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２ （２）Ｇｌｐ−Ｇ１ｕ−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２ （３）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ＿２ （４）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＮＨ＿２ （５）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＯＨ （６）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＨ （７）Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨ （８）Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＮＨ＿２（９
   ）Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＯＨ（１０）Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１１）Ｌｙｓ−Ｌ
   ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１２）Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
   Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１３）Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
   −Ａｌａ−ＯＨおよび（１４）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
   −Ｇｌｙ−ＯＨで表されるペプチド、並びに医薬的に許
   容できるそれらの酸付加塩１種以上を活性成分として含
   む、白血病性細胞の増殖を阻害しそして免疫刺激作用を
   もつ医薬組成物。