JPH02117698A

JPH02117698A - 血管内皮細胞成長因子

Info

Publication number: JPH02117698A
Application number: JP63271389A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Sato; 威佐藤; Isao Yamane; 山根　績; Masuo Tatewaki; 益夫帯刀
Original assignee: Ajinomoto Co Inc; Toray Industries Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc; Toray Industries Inc
Priority date: 1988-10-27
Filing date: 1988-10-27
Publication date: 1990-05-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、医薬あるいは診断薬として、ざらには血管内
皮研究上有用である純化された血管内皮細胞成長因子に
関する。

［従来の技術］近年、日本人の死亡率の上位を占める、脳卒中、心臓病
の主原因は血管の老化、損傷、機能低下と考えられてい
る。血管内皮細胞は血管の内腔を覆う単層を形成する細
胞であり、血管の老化や損傷を引き起こす動脈硬化の原
因である脂質代謝にも関与していることが推察されてい
る。また、悪性腫瘍の増殖は血管新生と密接に関連して
おり、血管内皮細胞の増殖が必須条件である。ざらには
、やけどや耐爆の治癒にも血管新生が必要であり、血管
内皮細胞成長因子の関与が明らかである。

以上のように、本来生体に存在していると思われる血管
内皮細胞成長因子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｅｒ　、以下ＥＣＧＦと略す）
を単離そしてその利用ができれば、動脈硬化に伴う血管
内皮の保護薬および治療薬、またやけどや創傷などの治
癒促進薬となり得ることが期待できる。ざらに、ＥＣＧ
Ｆの拮抗薬は血管新生を阻害すると考えられることから
、ＥＣＧＦは、抗悪性腫瘍および慢性関節リウマチや網
膜症の治療薬開発のための極めて有用な材料となり得る
ことが期待できる。

加えて、動脈硬化や悪性腫瘍増殖などに起因して血管内
皮の増殖が起こり、血中、尿、便などに通常の生理的）
農度以上のＥＣＧＦが存在しているとすれば（種々の疾
病で特異的ホルモンの上昇はしばしば観察される）、Ｅ
ＣＧＦに対する抗体を作成して、その抗体による前述の
疾病の診断薬の開発が可能となる。このように、ＥＣＧ
Ｆの医療上にあける存在価値は極めて大きく、ちなみに
、悪性腫瘍、脳卒中、心臓病が、日本人の死亡率の上位
３位までを占めていること（昭和６１年度）から考えて
も、ＥＣＧＦの医療への利用、応用の有用性は明らかで
ある。

上述のような背景と期待から、ＥＣＧＦの探索は近年、
精力的に行われてきており、たとえばヒトの脳、軟骨、
肝ガン細胞などから分子量１８゜ＯＯＯ〜１９，０００
、等電点的５あるいは約１０のタンパク質［Ｌ　ｏｂｂ
ら、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１５４、１．　（
１９８６）　］が見出されている。また最近、血小板由
来のＥＣＧＦも見出されており、分子量４５゜０ＯＯ１
等電点４．６　［Ｍｉｙａｚｏｎｏら、　Ｊ、　Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、、２６２，４０９８．（１９８７）］と
報告されている。

［発明が解決しようとする問題点］生体物質を抽出して利用する場合、その生産性や安全性
が優れている材料や手法を用いることが重要である。Ｅ
ＣＧＦの応用をこの点から考えれば、脳やガン細胞はや
や問題があり、また血小板も大量入手は定常的には難し
いと思われる。加えて、現在までにＥＣＧＦは種々の分
子種が見つかっており、実際の医療への応用にはどの分
子種が適しているのか、あるいは他の組織由来の未発見
のＥＣＧＦの応用の可能性、などが今後の検討課題とし
て残っている。

本発明は医薬への応用の可能性のあるＥＣＧＦを、生産
性や安全性が優れた方法で得ることにより、上述の問題
点を解決しようとするものである。

本発明者らは、この目的に治って鋭意研究の結果、本発
明を完成した。

［問題点を解決するための手段］本発明は、ヒト二倍体線維芽細胞の無血清培養上清液を
限外ろ過法により濃縮し濃縮液をヘパリンセファロース
アフィニティータロマドグラフィーついで逆層高速液体
クロマトグラフィーにより精製して得られる純化された
ＥＣＧＦである。

本発明のＥＣＧＦは、血管内皮細胞に増殖促進活性を示
しＢａｌ　ｂ／３Ｔ３細胞およびヒト二倍体線維芽細胞
に対しては増殖促進活性を示さず、ＨｅｐＧ２細胞表面
ＦＧＦレセプターに対する１２５■−ＦＧＦの結合を阻
害しない。そしてそのＮ末端側に下記のアミノ酸配列を
有する。

Ｓｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−丁ｈｒ−Ｘ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａ　Ｉａ−３ｅｒ−Ｘ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ
−Ａｓｐ−Ａｌａ−本発明のＥＣＧＦはヒト二倍体線維
芽細胞の培養上清液から得られる。ヒト二倍体線維芽細
胞としてはＥＣＧＦ産生能を有するものであれば特に限
定されないが、例えばヒト胎児肺由来の二倍体線維芽細
胞を用いることができる。培養は先ず牛胎児血清を５〜
１０％含む動物細胞用培地（例えば、イーグルＭＥＭ培
地）で行う。およそ１〜２Ｘ１０５個／ｍｌのヒト二倍
体線維芽細胞を植込み、５％の炭酸ガス、３６〜３８°
Ｃの条件下で２〜３日培養する。ついでリン酸平衡生理
食塩液（ＰＢＳ）で２〜３回洗浄した後、例えばＲＩＴ
Ｃ８０−７のような無血清培地によって培地を交換し、
５％の炭酸ガス、３６〜３８°Ｃの条件下で２〜３日培
養する。この培養液から得られるヒト二倍体線維芽細胞
の無血清培養上清液を限外濾過法により５０〜１００倍
に濃縮する。生じた沈澱を除去し、ヘパリンセファロー
スアフィニティーカラムにかける。カラムを食塩水で洗
浄し溶出蛋白質を集める。この溶出液に粉末硫安を４０
％飽和になるように加え、生じた沈澱を集め、これをト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／アセトニトリル液に溶解し
て放置し、生じる沈澱を除去して上清を逆層高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかける。このようにし
て本発明の純化されたＥＣＧＦを得ることができる。

本発明のＥＣＧＦは、既知の血管内皮細胞成長因子であ
る線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）とは、細胞増殖促進活
性およびＦＧＦレセプターに対する結合能の点において
次のように異なる。すなわち、ＦＧＦは血管内皮細胞、
Ｂａ　Ｉ　ｂ／３Ｔ３細胞およびヒト二倍体線維芽細胞
のいずれにも強い増殖促進活性を示すのに対して、ＥＣ
ＧＦは血管内皮細胞にのみ増殖促進作用を示すだけで、
他の細胞に対しては作用しない。またＨｅ１）Ｇ２細胞
表面ＦＧＦレセプターに対する１２５Ｉ−ＦＧＦの結合
をＥＣＧＦは阻害しない。ざらに本発明のＥＣＧＦは、
酸性および塩基性ＦＧＦやアンジオジエニン（Ａｎｇｉ
ｏｇｅｎｉｎ）とアミノ酸の組成比を異にする。

本発明のＥＣＧＦはＮ末端側に下記のアミノ酸配列を有
する。

Ｓｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｕ−ｉｉ　　　　　　　１５　　　
　　　　　　２０Ｐｒｏ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｘ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｘ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｌ
）−Ａｌａ−ここでＸは不明でおることを意味する。

本発明のＥＣＧＦの活性判定は公知の活性測定法により
行うことができる。すなわち、ニワトリ胎児のＣｈｏｒ
ｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　　（ＣＡ
Ｍ）を利用する方法［ＴａｙｌｏｒとＦｏｌｋｍａｎ、
　Ｎａｔｕｒｅ、２９７、３０７（１９８２）およびＦ
ｏｌ　ｋｍａｎら、３ｃｉｅｎｃｅ、２２１，７１９（
１９８３）コ、あるいは、ラット又はウサギのｃｏｒｎ
ｅａｔ　ｍ１ｃｒｏｐｏｋｅｔ法［（３ｉｍｂｒｏｎｅ
ら、　Ｊ、　Ｍａｔｌ、ＣａｎＣｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、５
２，４１３（１９７４）およびＦｏｕｒｎｉｅｒら、Ｉ
ｎｖｅｓｔ、Ｏｐｈｔｈａｌｍａｌ、Ｖｉｓｕａｌ　Ｓ
ｃｉ、、２１，３５１（１９８１）コ、また、５ｕｓｔ
ａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ　１ｎｐ
ｌａｎｔｓを利用する方法［ＲａｎｃＩｅｒと　Ｆｏｌ
ｋｍａｎ、　３Ｃｉｅｎｃｅ、　２６３．７９７（１９
７６）およびＭｕｒｒａｙら、１ｎＶｉｔｒｏ、１９，
７４３（１９８３）　］などが挙げられる。簡便かつ迅
速に行うには、ヒト腰帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶ−Ｅ
Ｃ）に対する増殖促進活性を、２４ウエル・プラスチッ
クデイツシュに植え込んだＨＵＶ−ＥＣの増殖量を指標
として測定する、ＫａｎとＹａｎａｎｅの方法［Ｊ、　
Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、、１１１，１５５（１９８
２）］が望ましい。

術後組織などの治癒促進剤および心血管障害の治療剤と
して有用である。また、人工血管の内皮形成剤として用
いることもできる。間接的には、この因子の共存により
血管内皮細胞の長期培養が可能となり、血管内皮細胞研
究に必須の試薬として用いることができる。また、本Ｅ
ＣＧＦの抗体および阻害剤は、悪性腫瘍、網膜症、慢性
関節リウマチの治療剤あるいは診所茶として有用である
。

本発明のＥＣＧＦは、タンパク質製剤としてそのまま粉
末として、また薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、
希釈剤とともに医薬組成物（例、注射薬、錠剤、カプセ
ル剤、液剤、軟膏）として、ヒトなどの瀉血動物に対し
て非経口的あるいは経口的に安全に投与することができ
る。

このように、本ＥＣＧＦは、これまで有効な薬剤が少な
かった当該分野に、新規で有用な薬剤として提供するこ
とができる。

［実施例］Ａ、ヒトニ倍体線維芽細胞培養上清液の製造ヒト二倍体
線維芽細胞（１０〜４ＱＰＤＬ）を１０％の牛胎児血清
を添加したＭＥＭ培地に細胞数１×１０５個／ｍｌで植
込み、ローラーボトルを用い３７°Ｃ，５％ＣＯ２の条
件下で２日間培養した。

ついで培地を捨て、ＰＢＳで１回洗浄後ＲＩＴＣ８０−
７培地に交換し、３７℃、５％Ｃ０２（７）条件下で２
日間培養した。

上記により得られた培養上清液を、アミコン社製ＹＭ−
１０を用い限外濾過法により１００倍に濃縮した。生じ
た沈澱を除去し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で平衡化したヘパリンセフ
ァロースアフィニティーカラムにかけた。塩化ナトリウ
ム濃度を０．５Ｍに上げカラムを洗浄した後、ざらに塩
化ナトリウム濃度を１．５Ｍに上げ溶出タンパクカラム
からの溶出液に粉末硫酸安全を４０％飽和になるように
加え、生じた沈澱を集め、０．１％ＴＦＡを含む］Ｏ％
アセトニトリル液５ｍに溶解した。水中に２時間放置し
て生じた沈澱を除去し、上清をＣ−１８セミプレパラテ
イブ逆相ＨＰＬＣカラム（バイオラド社ＲＰ−３１８セ
ミプレパラティブカラム）にかけた。０．１％ＴＦＡの
存在下で、２５−４０％アセトニトリル濃度勾配、６０
分、１ｄ／分の流量でＥＣＧＦ活性成分を溶出した。

得られた活性分画を■ｙｄａＣのＣ−４逆相ＨＰＬＣカ
ラムにかけた。０．１％ＴＦＡの存在下で、２５−３５
％アセトニトリル濃度勾配、３０分、１ｍ１Ｚ分の流量
で最も活性の高い分画を取り、Ｃ−４で再クロマトをし
て精製した。

Ｃ，ＥＣＧＦの分析（１）アミノ酸配列分析上記で得られた精製ＥＣＧＦサンプルについて、気相式
シーケンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　８ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　４７０Ａ型）でＥｄｍａｎ分解を行い、得られたＰＴ
Ｈ−アミノ酸をＰＴＨ−アミノ酸同定用ＨＰＬＣ（Ａｐ
ｐＩｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　１２０Ａ型）で同
定分析した。その結果、Ｎ末端のアミノ酸配列は下記の
とおりであることがわかった。

Ｓｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｘ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ−
Ａｓｐ−Ａｌａ−６ケ所のＸは配列が決定できなかった
ものである。

（２）ＦＧＦとの比較ＦＧＦは血管内皮細胞、Ｂａ１ｂ／３Ｔ３細胞およびヒ
ト二倍体線維芽細胞のいずれにも強い増殖促進活性を示
すのに対して、ＥＣＱＦは血管内皮細胞にのみ増殖促進
作用を示すだけで、他の細胞に対しては作用しない。ま
たＨｅｐＧ２ｍ胞表面ＦＧＦレセプターに対する１２５
１−ＦＧＦの結合をＥＣＧＦは阻害しない。ざらに本発
明のＥＣＧＦは、酸性および塩基性ＦＧＦやアンジオジ
エニン（Ａｎｇ＋ｏｇｅｎｉｎ）とアミノ酸の組成比を
異にする。

［発明の効果］本発明のＥＣＧＦは、火傷や創傷などの治癒促進剤およ
び心血管障害の治療剤として有用でおる。

また、悪性腫瘍、網膜症、慢性リウマチ等の治療薬およ
び診断薬として、極めて有用な材料となり得る。ざらに
本発明のＥＣＧＦは、従来のものに比べ生産性や安全性
が非常に優れている方法で得ることができ、得られるＥ
ＣＧＦの純度も高い。

代理人弁理士　船　　山　　　武

Claims

【特許請求の範囲】

（１）、ヒト二倍体線維芽細胞の無血清培養上清液を限
外ろ過法により濃縮し濃縮液をヘパリンセフアロースア
フィニティークロマトグラフィーついで逆層高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製して得られる純化された血
管内皮細胞成長因子。
（２）、血管内皮細胞に増殖促進活性を示しＢａｌｂ／
３Ｔ３細胞およびヒト二倍体線維芽細胞に対しては増殖
促進活性を示さない請求項（１）記載の血管内皮細胞成
長因子。
（３）、ＨｅｐＧ２細胞表面ＦＧＦレセプターに対する
１２５＿ I ＿−＿Ｆ＿Ｇ＿Ｆの結合を阻害しない請求
項（１）記載の血管内皮細胞成長因子。
（４）、Ｎ末端側のアミノ酸配列が下記のものである請
求項（１）記載の血管内皮細胞成長因子。【遺伝子配列があります。】