JP3159705B2 - 血管形成ペプチド - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 1.序章 本発明は、血管形成作用を示す血小板第４因子に関連
するペプチド及びペプチド誘導体、このペプチドを含有
する薬剤組成物、及び本発明のペプチドを使用する血管
形成促進方法に関する。
するペプチド及びペプチド誘導体、このペプチドを含有
する薬剤組成物、及び本発明のペプチドを使用する血管
形成促進方法に関する。
2.本発明の背景 新血管形成による血管形成の生物学的プロセス、即ち
新しい血管の形成は通常の発達のために必要であり、ま
た、損傷の修復及び炎症のような病的な状態及び固体腫
瘍成長の重要な局面でもある（Leibovichら,1988,“成
長因子及び傷治癒の他の局面"Barbulら編,Alan R.Liss,
NY第132頁）。血管形成カスケードには、内皮細胞移
動、プロテアーゼ形成及び内皮細胞増殖が含まれる（Le
ibovichら,.上掲）。多数の良く知られた、かつ、種々
の同定された自己分泌及びパラ分泌成長因子が血管形成
カスケードに関与している。あまり特性決定が行われて
いない因子の一つに、血小板由来の血管形成因子がある
（PDAF:Bandaら,1982,Proc.Natl,Acad.Sci.79:7773−77
77）。
新しい血管の形成は通常の発達のために必要であり、ま
た、損傷の修復及び炎症のような病的な状態及び固体腫
瘍成長の重要な局面でもある（Leibovichら,1988,“成
長因子及び傷治癒の他の局面"Barbulら編,Alan R.Liss,
NY第132頁）。血管形成カスケードには、内皮細胞移
動、プロテアーゼ形成及び内皮細胞増殖が含まれる（Le
ibovichら,.上掲）。多数の良く知られた、かつ、種々
の同定された自己分泌及びパラ分泌成長因子が血管形成
カスケードに関与している。あまり特性決定が行われて
いない因子の一つに、血小板由来の血管形成因子がある
（PDAF:Bandaら,1982,Proc.Natl,Acad.Sci.79:7773−77
77）。
2.1. 血管形成ペプチド 血管形成を引き起こす幾つかのタンパク質成長因子が
同定されている。最もよく同定された血管形成因子の１
つは、ヘパリン結合性ポリペプチド分裂促進因子の塩基
性繊維芽細胞増殖因子である。塩基性繊維芽細胞成長因
子（bFGF）タンパク質は、より大きい分子量のものも確
認されているが、約18kDaの分子量を有しており、これ
は155個のアミノ酸から成る予想されたcDNA翻訳生成物
に合致する（Sommerら.,1989,Biochem.Biophys.Res.Com
mun.160:1267−1274;Abrahamら,1986,EMBO J.5:2523−2
528）。
同定されている。最もよく同定された血管形成因子の１
つは、ヘパリン結合性ポリペプチド分裂促進因子の塩基
性繊維芽細胞増殖因子である。塩基性繊維芽細胞成長因
子（bFGF）タンパク質は、より大きい分子量のものも確
認されているが、約18kDaの分子量を有しており、これ
は155個のアミノ酸から成る予想されたcDNA翻訳生成物
に合致する（Sommerら.,1989,Biochem.Biophys.Res.Com
mun.160:1267−1274;Abrahamら,1986,EMBO J.5:2523−2
528）。
他の多くの因子が血管形成活性を示すことが報告され
ており、これには、セルロプラスミン（Chu及びOlden,1
985,Biochem.Biophys.Res.Commun.126:15−24）；単球
由来のモノサイトアンジオトロピン（Wisslerら.,1983,
Fed.Proc.42,アブストラクト684）；胎盤血管形成因子
（Burgas,1986,Eur.J.Clim.In−vest.16:486−493）；
グリオーム由来内皮細胞成長因子（Libermannら,1987,E
MBO J.6:1627−1632）；及びbFGFに免疫的に関連する腎
臓の線癌からのヘパリン−結合性成長因子が含まれる。
炎症及び血管形成の簡単な総説はフォークマン（Folkma
n）らの“免疫学の進歩（Progress in Immunology）"19
89、第VII巻、メルチァー（Melcher）編、スプリンガー
ベルラーク（Springer−Verlag）社、N.Y.,第761−764
頁に見い出される。
ており、これには、セルロプラスミン（Chu及びOlden,1
985,Biochem.Biophys.Res.Commun.126:15−24）；単球
由来のモノサイトアンジオトロピン（Wisslerら.,1983,
Fed.Proc.42,アブストラクト684）；胎盤血管形成因子
（Burgas,1986,Eur.J.Clim.In−vest.16:486−493）；
グリオーム由来内皮細胞成長因子（Libermannら,1987,E
MBO J.6:1627−1632）；及びbFGFに免疫的に関連する腎
臓の線癌からのヘパリン−結合性成長因子が含まれる。
炎症及び血管形成の簡単な総説はフォークマン（Folkma
n）らの“免疫学の進歩（Progress in Immunology）"19
89、第VII巻、メルチァー（Melcher）編、スプリンガー
ベルラーク（Springer−Verlag）社、N.Y.,第761−764
頁に見い出される。
2.2. 血小板第４因子 70個のアミノ酸をもつヘパリン結合性タンパク質であ
る、血小板第４因子（PF4）は、活性化された血小板の
アルファ顆粒から放出される。PF4は化学走性、凝結、
炎症及び細胞成長に関連する多重遺伝子ファミリーの一
員であるが、PF4の正確な生物学的機能は知られていな
い（Eismanら,1990,Blood 76:336−344）。PF4遺伝子の
ゲノム配列及び高度に相同の遺伝子のPF4altが最近報告
された（Eismanら，上掲）。PF4の報告されている生物
学的活性には、マウスにおけるコンカナバリンＡにより
誘導される免疫抑制の軽減（Zuckerら,1989,Proc.Natl.
Acad.Sci.86:7571−7574）；内皮細胞への結合及び侵入
能力（Rybakら,1989,Blood 73:1534−1539）；好中球化
学走性の誘導、リソソーム酵素の放出及び増大した接着
性（Bebawyら,1986,J.Leukocyte Biol.39:423−424）；
血管周囲細胞の移動の刺激及び平滑筋細胞及び内皮細胞
の非刺激（Bernsteinら,1982,J.Cell.Sci.（56）;71−8
2）；及び潜在的な抗血栓作用（Weerasingheら,1984,Th
ormb,Res,33:625−632）、が含まれる。PF4の増大した
レベルは糖尿病患者（Guastamacchiaら,1985,Boll.Soc.
Ital.Biol.Sper.61:499−502:Cortellatoら,1990,Throm
b.Res.58:751−576;Cellaら,1986,Folia Haematol.113:
646−654）及びベーチェット病疾患（Schmitz−Huebner
及びKnap,1984,Thromb.Res.34:277−286）において確認
されている。
る、血小板第４因子（PF4）は、活性化された血小板の
アルファ顆粒から放出される。PF4は化学走性、凝結、
炎症及び細胞成長に関連する多重遺伝子ファミリーの一
員であるが、PF4の正確な生物学的機能は知られていな
い（Eismanら,1990,Blood 76:336−344）。PF4遺伝子の
ゲノム配列及び高度に相同の遺伝子のPF4altが最近報告
された（Eismanら，上掲）。PF4の報告されている生物
学的活性には、マウスにおけるコンカナバリンＡにより
誘導される免疫抑制の軽減（Zuckerら,1989,Proc.Natl.
Acad.Sci.86:7571−7574）；内皮細胞への結合及び侵入
能力（Rybakら,1989,Blood 73:1534−1539）；好中球化
学走性の誘導、リソソーム酵素の放出及び増大した接着
性（Bebawyら,1986,J.Leukocyte Biol.39:423−424）；
血管周囲細胞の移動の刺激及び平滑筋細胞及び内皮細胞
の非刺激（Bernsteinら,1982,J.Cell.Sci.（56）;71−8
2）；及び潜在的な抗血栓作用（Weerasingheら,1984,Th
ormb,Res,33:625−632）、が含まれる。PF4の増大した
レベルは糖尿病患者（Guastamacchiaら,1985,Boll.Soc.
Ital.Biol.Sper.61:499−502:Cortellatoら,1990,Throm
b.Res.58:751−576;Cellaら,1986,Folia Haematol.113:
646−654）及びベーチェット病疾患（Schmitz−Huebner
及びKnap,1984,Thromb.Res.34:277−286）において確認
されている。
3.本発明の概要 本発明は、血管形成活性を示す血小板第４因子に関連
するペプチド及びペプチド誘導体、このペプチドを含有
する薬剤組成物、及びこのペプチドを使用する血管形成
促進のための方法に関する。これは、一部、ウサギ角膜
移植試験における新血管新生の測定により、及び毛細管
内皮細胞の化学誘引（chemoattraction）の測定によ
り、血小板第４因子に由来するオクタペプチド及びそれ
に構造的に関連する７種のペプチド（第１図に示す）が
インビボにおいて血管形成応答を引き起こすことができ
たという知見に基く。これらの８種のペプチドは本発明
の非限定的な特定の態様を表わす。本発明の血管形成ペ
プチドは、特に、切開口の治療、骨修復、やけど治療及
び心筋又は中枢神経系の損傷における梗塞形成後の修復
を含む傷の治療の促進；及び移植組織の同化、特に、糖
尿病患者のように血管不全を被っている患者において特
に有用である。
するペプチド及びペプチド誘導体、このペプチドを含有
する薬剤組成物、及びこのペプチドを使用する血管形成
促進のための方法に関する。これは、一部、ウサギ角膜
移植試験における新血管新生の測定により、及び毛細管
内皮細胞の化学誘引（chemoattraction）の測定によ
り、血小板第４因子に由来するオクタペプチド及びそれ
に構造的に関連する７種のペプチド（第１図に示す）が
インビボにおいて血管形成応答を引き起こすことができ
たという知見に基く。これらの８種のペプチドは本発明
の非限定的な特定の態様を表わす。本発明の血管形成ペ
プチドは、特に、切開口の治療、骨修復、やけど治療及
び心筋又は中枢神経系の損傷における梗塞形成後の修復
を含む傷の治療の促進；及び移植組織の同化、特に、糖
尿病患者のように血管不全を被っている患者において特
に有用である。
4.図面の説明 第１図。血管形成ペプチドWohl−１からWohl−８のア
ミノ酸配列。
ミノ酸配列。
第２図。PF4のアミノ酸配列。
第３図。ネガティブ及びポジティブ（血小板由来の血
管形成因子）のコントロールに比較したときのWohl 1−
８ペプチド（P1〜P8に相応）の血管形成活性を示す棒グ
ラフ。
管形成因子）のコントロールに比較したときのWohl 1−
８ペプチド（P1〜P8に相応）の血管形成活性を示す棒グ
ラフ。
第４図。ペレット移植に向かう手細管の成長を示すダ
イアグラム。
イアグラム。
第５（Ａ−Ｂ）図。７日目（5A）及び14日目（5B）に
おけるＰ−１（０μg/ml,10μg/ml及び30μg/ml）の損
傷治療作用を示す棒グラフ。
おけるＰ−１（０μg/ml,10μg/ml及び30μg/ml）の損
傷治療作用を示す棒グラフ。
第６図。14日目におけるＰ−１（０μg/ml,10μg/ml,
30μg/ml及び100μg/ml）の損傷治療活性を示す棒グラ
フ。
30μg/ml及び100μg/ml）の損傷治療活性を示す棒グラ
フ。
5.発明の詳細な説明 限定するのではなく、発明の明確化のために、以下の
サブセクションにおいて発明の詳細な説明がなされる： （ｉ）血小板第４因子の製造； （ii）本発明のペプチド及びその製造； （iii）血管形成ペプチドの同定；及び （iv）本発明の有用性 5.1. 血小板第４因子の製造 血小板第４因子（PF4）は、当該分野で既知のいずれ
かの方法を使用して、精製しうる。本発明の好適な態様
において、PF4はメヂィチィ（Medici）らにより記載さ
れた方法を改善したものにより、トロンビン活性化血小
板抽出物より精製しうる（1989,Thrombos.Res.54:277−
287）。PF4は、1.7M NaClで因子を溶出するヘパリンセ
ファロースアフィニティークロマトグラフィーにより、
次いで約15％のアセトニトリルの存在下におけるNaClで
溶出されたポリスルホエチル−アスパルタミドカラム上
での強陰イオン交換クロマトグラフィーにより、及び最
後に約0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）水溶液中のアセ
トニトリルの線形勾配により溶出されたVydac RPC4逆相
HPLC分析カラム上における分離により単離しうる。
サブセクションにおいて発明の詳細な説明がなされる： （ｉ）血小板第４因子の製造； （ii）本発明のペプチド及びその製造； （iii）血管形成ペプチドの同定；及び （iv）本発明の有用性 5.1. 血小板第４因子の製造 血小板第４因子（PF4）は、当該分野で既知のいずれ
かの方法を使用して、精製しうる。本発明の好適な態様
において、PF4はメヂィチィ（Medici）らにより記載さ
れた方法を改善したものにより、トロンビン活性化血小
板抽出物より精製しうる（1989,Thrombos.Res.54:277−
287）。PF4は、1.7M NaClで因子を溶出するヘパリンセ
ファロースアフィニティークロマトグラフィーにより、
次いで約15％のアセトニトリルの存在下におけるNaClで
溶出されたポリスルホエチル−アスパルタミドカラム上
での強陰イオン交換クロマトグラフィーにより、及び最
後に約0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）水溶液中のアセ
トニトリルの線形勾配により溶出されたVydac RPC4逆相
HPLC分析カラム上における分離により単離しうる。
5.2. 本発明のペプチド及びその製造 本発明のペプチドは、（ｉ）第２図に示したアミノ酸
配列のPF4の少なくとも４アミノ酸部分、又は機能的に
同等な配列、又は（ii）第２図に示したPF4配列の一部
に少なくとも66％相同である少なくとも６アミノ酸配
列、又は機能的に同等な配列のいずれかを含むペプチド
を含有する。相同であることは、本明細書では、個々の
ペプチドにより共有されるアミノ酸残基間の同一性を表
すものとして理解されるべきである；例えば、PF4の６
アミノ酸断片に66％相同である６アミノ酸残基のペプチ
ドは、必ずしも互いに連結しない４個のアミノ酸残基を
PF4断片と共有する。
配列のPF4の少なくとも４アミノ酸部分、又は機能的に
同等な配列、又は（ii）第２図に示したPF4配列の一部
に少なくとも66％相同である少なくとも６アミノ酸配
列、又は機能的に同等な配列のいずれかを含むペプチド
を含有する。相同であることは、本明細書では、個々の
ペプチドにより共有されるアミノ酸残基間の同一性を表
すものとして理解されるべきである；例えば、PF4の６
アミノ酸断片に66％相同である６アミノ酸残基のペプチ
ドは、必ずしも互いに連結しない４個のアミノ酸残基を
PF4断片と共有する。
本発明の好適な態様において、ペプチド又はペプチド
誘導体は、Thr−Ser−Gln及び／又はVal−Arg−Pro、及
びより好適には、Thr−Thr−Ser−Gln及び又はVal−Arg
−Pro−Argの配列を含む。
誘導体は、Thr−Ser−Gln及び／又はVal−Arg−Pro、及
びより好適には、Thr−Thr−Ser−Gln及び又はVal−Arg
−Pro−Argの配列を含む。
本発明のペプチドは、PF4にほとんど又は全く相同で
はない部分を含んでいてもよい。更に、これらのペプチ
ドは、限定されるものではないが、炭化水物、脂質、リ
ン酸、澱粉、抗体、Fab、Fab2、酵素、アミノ酸、ペプ
チド又は成長因子化合物を含む、他の化合物に結合させ
ることにより、誘導体とすることができる。
はない部分を含んでいてもよい。更に、これらのペプチ
ドは、限定されるものではないが、炭化水物、脂質、リ
ン酸、澱粉、抗体、Fab、Fab2、酵素、アミノ酸、ペプ
チド又は成長因子化合物を含む、他の化合物に結合させ
ることにより、誘導体とすることができる。
第２図に示されたPF4のアミノ酸配列又は機能的に同
等な配列は、PF4配列が（ｉ）第２図に示した配列又は
（ii）第２図に示した配列であるが、或る残基がサイレ
ント変化を生ずる機能的に同等のアミノ酸により置換さ
れたもののいずれかでありうることを意味するものと解
釈されるべきである。例えば、配列内の１又は複数のア
ミノ酸残基は、機能的に同等に作用する類似の極性をも
つ他のアミノ酸により置換させ、サイレント変化を生じ
させることができる。配列内のアミノ酸の置換は、その
アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択しう
る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ
る。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオ
ニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタ
ミンを含む。正に荷電された（塩基性）アミノ酸には、
アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負に荷
電された（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグ
ルタミン酸が含まれる。
等な配列は、PF4配列が（ｉ）第２図に示した配列又は
（ii）第２図に示した配列であるが、或る残基がサイレ
ント変化を生ずる機能的に同等のアミノ酸により置換さ
れたもののいずれかでありうることを意味するものと解
釈されるべきである。例えば、配列内の１又は複数のア
ミノ酸残基は、機能的に同等に作用する類似の極性をも
つ他のアミノ酸により置換させ、サイレント変化を生じ
させることができる。配列内のアミノ酸の置換は、その
アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択しう
る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ
る。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオ
ニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタ
ミンを含む。正に荷電された（塩基性）アミノ酸には、
アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負に荷
電された（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグ
ルタミン酸が含まれる。
すべての場合において、本発明のペプチドは以下の第
5.3節で定義される血管形成作用を示す。
5.3節で定義される血管形成作用を示す。
本発明のペプチドは、当該分野で既知のいずれかの方
法により製造しうる。例えば、限定されるものではない
が、ペプチドは（ｉ）PF4（これに限定されない）のよ
うな大きなペプチドからの開裂により；（ii）組み換え
DNA発現方法により；及び（iii）バラニ（Barany）及び
メリーフィールド（Merrifield）により記載された固相
法（1980年，“ペプチド”第２巻,Gross及びMeien−hof
er編，アカデミックプレス,N.Y.）を含む化学合成によ
り合成し得る。
法により製造しうる。例えば、限定されるものではない
が、ペプチドは（ｉ）PF4（これに限定されない）のよ
うな大きなペプチドからの開裂により；（ii）組み換え
DNA発現方法により；及び（iii）バラニ（Barany）及び
メリーフィールド（Merrifield）により記載された固相
法（1980年，“ペプチド”第２巻,Gross及びMeien−hof
er編，アカデミックプレス,N.Y.）を含む化学合成によ
り合成し得る。
本発明の好適な特定の態様において、PF4ペプチド断
片を製造するために、PF4のトリプシン消化を行うこと
ができる。例えば、第5.1節で述べたようにして製造さ
れた、凍結乾燥したPF4は、微量遠心分離管内でpH＝９
にて0.4MのNa2CO3/8M尿素の50μｌ中に溶解させること
ができる。次いで、このタンパク質は、50℃にて、約15
分間、pH＝８で、緩衝液中の約45mMジチオトレイトール
を添加することにより、還元しうる。このタンパク質
は、次いで、0.5N NaOH中のヨード酢酸５μｌを添加
し、室温で暗所にて約15分間インキュベートすることに
よりカルボキシメチル化され得る。約140μｌの脱イオ
ン水及び配列決定用グレードのトリプシン（200μg/m
l）の1mM HCl溶液５μｌを添加し、試料を37℃で約24時
間インキュベートし得る。得られたトリプシン消化物
は、次いで、相応の逆相クロマトグラフィーカラム、例
えば、2.7％アセトニトリル/0.1％TFA/H2Oで平衡させた
Vydac C18カラム内に注入し、相応の流速、例えば0.5ml
/分でクロマトグラフを行い、1.0分画分を集めることが
できる。溶出プログラムは、例えば、緩衝液Ａ（0.1％T
FAの水溶液）中の2.7％緩衝液Ｂ（95％アセトニトリ
ル）を約10分間、及び約27〜95％緩衝液Ｂ勾配を123分
とすることができる。ペプチドの溶出は、210nmの波長
において分光光度計によりモニターしうる。好適には、
ベックマンシステムゴールドHPLCシステムを、タンパク
質及び消化物の両方のクロマトグラフィーのために使用
しうる。上記の例として記載したクロマトグラフィーの
プロトコールを使用すると、Wohl−１がペプチド番号４
として溶出することが期待される（下記第６節参照）。
本発明に従って、PF4のペプチド断片は適宜化学的に修
飾でき、次節に記載されるように血管形成作用について
試験される。
片を製造するために、PF4のトリプシン消化を行うこと
ができる。例えば、第5.1節で述べたようにして製造さ
れた、凍結乾燥したPF4は、微量遠心分離管内でpH＝９
にて0.4MのNa2CO3/8M尿素の50μｌ中に溶解させること
ができる。次いで、このタンパク質は、50℃にて、約15
分間、pH＝８で、緩衝液中の約45mMジチオトレイトール
を添加することにより、還元しうる。このタンパク質
は、次いで、0.5N NaOH中のヨード酢酸５μｌを添加
し、室温で暗所にて約15分間インキュベートすることに
よりカルボキシメチル化され得る。約140μｌの脱イオ
ン水及び配列決定用グレードのトリプシン（200μg/m
l）の1mM HCl溶液５μｌを添加し、試料を37℃で約24時
間インキュベートし得る。得られたトリプシン消化物
は、次いで、相応の逆相クロマトグラフィーカラム、例
えば、2.7％アセトニトリル/0.1％TFA/H2Oで平衡させた
Vydac C18カラム内に注入し、相応の流速、例えば0.5ml
/分でクロマトグラフを行い、1.0分画分を集めることが
できる。溶出プログラムは、例えば、緩衝液Ａ（0.1％T
FAの水溶液）中の2.7％緩衝液Ｂ（95％アセトニトリ
ル）を約10分間、及び約27〜95％緩衝液Ｂ勾配を123分
とすることができる。ペプチドの溶出は、210nmの波長
において分光光度計によりモニターしうる。好適には、
ベックマンシステムゴールドHPLCシステムを、タンパク
質及び消化物の両方のクロマトグラフィーのために使用
しうる。上記の例として記載したクロマトグラフィーの
プロトコールを使用すると、Wohl−１がペプチド番号４
として溶出することが期待される（下記第６節参照）。
本発明に従って、PF4のペプチド断片は適宜化学的に修
飾でき、次節に記載されるように血管形成作用について
試験される。
5.3. 血管形成ペプチドの同定 上記したペプチドは、血管形成活性について因子を評
価するための、当該分野で既知のインビトロ又はインビ
ボのアッセイシステムを使用することにより、血管形成
活性を有することを決定し得る。血管形成活性という語
は、（ｉ）新しい血管の形成を引き起こす及び／与は
（ii）内皮細胞を引き寄せる（attract）能力に言及す
るものと、本明細書においては解釈されるべきである。
価するための、当該分野で既知のインビトロ又はインビ
ボのアッセイシステムを使用することにより、血管形成
活性を有することを決定し得る。血管形成活性という語
は、（ｉ）新しい血管の形成を引き起こす及び／与は
（ii）内皮細胞を引き寄せる（attract）能力に言及す
るものと、本明細書においては解釈されるべきである。
特定の態様において、ペプチドは例えば下記第６節に
記載するように、内皮細胞化学走性アッセイを使用し
て、血管形成活性を試験し得る。かかる方法によれば、
特定のペプチドに応答する内皮細胞の移動は、多孔膜へ
の内皮細胞の移動を検出することにより測定しうる。
記載するように、内皮細胞化学走性アッセイを使用し
て、血管形成活性を試験し得る。かかる方法によれば、
特定のペプチドに応答する内皮細胞の移動は、多孔膜へ
の内皮細胞の移動を検出することにより測定しうる。
例えば、内皮細胞の移動は、バンダ（Banda）らに記
載されたような方法（1982,Proc.Natl,Acad.Sci.79:777
3−7777,参考までに本明細書中に取り入れる）でアッセ
イしうる。この方法によれば、試験されるペプチド溶液
はウサギ血小板の乏しい10％のプラズマ血清を補充した
ダルベッコ修飾イーグル培地中で約1:10に希釈し、ボイ
デン（Boyden）ブラインド−ウエルチャンバーの底部に
置かれる。次に、ゼラチンで被覆した10μｍの孔径を有
するポリカルボネートフィルター（ヌクレオポアー社か
ら購入可能なもの）を試験溶液の上に置き、血小板に乏
しい10％血清を加えたダルベッコ修飾イーグル培地に懸
濁させた内皮細胞を上部コンパートメントに加え、この
チャンバーを37℃で約７時間インキュベートさせる。イ
ンキュベーションの終了後に、フィルターの頂部をきれ
いにふき、フィルターを固定、染色し、そして、フィル
ターの底部側面に移動した細胞の数を計算することによ
り評価する。
載されたような方法（1982,Proc.Natl,Acad.Sci.79:777
3−7777,参考までに本明細書中に取り入れる）でアッセ
イしうる。この方法によれば、試験されるペプチド溶液
はウサギ血小板の乏しい10％のプラズマ血清を補充した
ダルベッコ修飾イーグル培地中で約1:10に希釈し、ボイ
デン（Boyden）ブラインド−ウエルチャンバーの底部に
置かれる。次に、ゼラチンで被覆した10μｍの孔径を有
するポリカルボネートフィルター（ヌクレオポアー社か
ら購入可能なもの）を試験溶液の上に置き、血小板に乏
しい10％血清を加えたダルベッコ修飾イーグル培地に懸
濁させた内皮細胞を上部コンパートメントに加え、この
チャンバーを37℃で約７時間インキュベートさせる。イ
ンキュベーションの終了後に、フィルターの頂部をきれ
いにふき、フィルターを固定、染色し、そして、フィル
ターの底部側面に移動した細胞の数を計算することによ
り評価する。
他の態様において、ペプチドはインプラント中に含ま
れる本発明のペプチドに応答するインビボの血管形成を
試験するインビボアッセイを使用して、血管形成活性を
試験しうる。特定の態様によれば、ウサギの角膜インプ
ラントアッセイ（RCIA）方法が使用できる（Gimbrone
ら,1974,J.Natl.Cancer,Instit.52:413,これは参考とし
て全部分が本明細書にとり入れられる）。RCIAにおい
て、試験すべきペプチドは、ヒドロン、メタクリレート
ポリマーのような不活性の媒体と混合し、次いで乾燥さ
せる。得られたペレットは、次に、上縁部から２〜３ミ
リのウサギの角膜中に移植させる。もし試験したペプチ
ド血管形成性であれば、毛管の成長は上縁部から開始さ
れ、移植体に向けて成長することが期待し得る。RCIA法
の記載は、下記第７節でなされる。
れる本発明のペプチドに応答するインビボの血管形成を
試験するインビボアッセイを使用して、血管形成活性を
試験しうる。特定の態様によれば、ウサギの角膜インプ
ラントアッセイ（RCIA）方法が使用できる（Gimbrone
ら,1974,J.Natl.Cancer,Instit.52:413,これは参考とし
て全部分が本明細書にとり入れられる）。RCIAにおい
て、試験すべきペプチドは、ヒドロン、メタクリレート
ポリマーのような不活性の媒体と混合し、次いで乾燥さ
せる。得られたペレットは、次に、上縁部から２〜３ミ
リのウサギの角膜中に移植させる。もし試験したペプチ
ド血管形成性であれば、毛管の成長は上縁部から開始さ
れ、移植体に向けて成長することが期待し得る。RCIA法
の記載は、下記第７節でなされる。
5.4. 本発明の有用性 本発明は、血管形成を促進させるために使用し得るPF
4に関係するペプチド及びペプチド誘導体、及び、増大
した血管形成より利益が得られる患者を治療するための
方法を提供する。本発明は、血管形成活性を示すPF4に
関連するペプチド又はペプチド誘導体の有効量を組織に
さらすことから成る、組織の血管形成を引き起こす方法
を提供する。治療方法は、かかる治療が必要な患者に本
発明のペプチドの有効量を投与することを含む。ペプチ
ドの投与量は、全身又は局所的になし得る。投与方法
は、限定されるものではないが、静注、筋肉内、皮下、
鼻内、口腔内又は他の適当な態様を含む。本発明のペプ
チドは、いずれかの適当な薬剤担体とともに投与しう
る。或る状態においては、ペプチドの持続的な放出が達
成されるように移植体に含まれた本発明のペプチドを投
与することが望ましいかもしれない。
4に関係するペプチド及びペプチド誘導体、及び、増大
した血管形成より利益が得られる患者を治療するための
方法を提供する。本発明は、血管形成活性を示すPF4に
関連するペプチド又はペプチド誘導体の有効量を組織に
さらすことから成る、組織の血管形成を引き起こす方法
を提供する。治療方法は、かかる治療が必要な患者に本
発明のペプチドの有効量を投与することを含む。ペプチ
ドの投与量は、全身又は局所的になし得る。投与方法
は、限定されるものではないが、静注、筋肉内、皮下、
鼻内、口腔内又は他の適当な態様を含む。本発明のペプ
チドは、いずれかの適当な薬剤担体とともに投与しう
る。或る状態においては、ペプチドの持続的な放出が達
成されるように移植体に含まれた本発明のペプチドを投
与することが望ましいかもしれない。
増大した血管形成から恩恵を受ける患者は、全身的又
は局所的部位のいずれかの動脈並びに静脈の血管不全を
被っている患者を含む。具体的には、糖尿病又はアテロ
ーム性動脈硬化症又は微少循環系の異常を被っている患
者が含まれる。血管形成ペプチドによる治療で恩恵を受
ける顕著な部位は、限定するものではないが、四肢、心
臓及び脳血管系である。本発明の血管形成ペプチドは、
殊に、糖尿病における傷部の治療の促進のために有効で
あろう。
は局所的部位のいずれかの動脈並びに静脈の血管不全を
被っている患者を含む。具体的には、糖尿病又はアテロ
ーム性動脈硬化症又は微少循環系の異常を被っている患
者が含まれる。血管形成ペプチドによる治療で恩恵を受
ける顕著な部位は、限定するものではないが、四肢、心
臓及び脳血管系である。本発明の血管形成ペプチドは、
殊に、糖尿病における傷部の治療の促進のために有効で
あろう。
本発明の血管形成ペプチドは、また、血管の弱体化を
被っている又は被っていない患者において傷の治療を促
進するために使用しうる。例えば、傷の治療は一般に、
外科手術患者、外傷の患者、やけどの患者又は、心筋梗
塞を含む心血管系への損傷、又は外傷又は梗塞のような
中枢神経系の傷害又は末梢神経系の損傷を含む神経系に
対する傷を有している患者において促進させることがで
きる。本発明のペプチドは、例えば、脊髄の傷害の治療
において使用しうる。ペプチドは、又、例えば瘢痕の再
生におけるように、傷の治療から生ずる化粧的外観を改
善するために使用しうる。本発明のペプチドは、急性並
びに慢性的な治療において使用しうる。
被っている又は被っていない患者において傷の治療を促
進するために使用しうる。例えば、傷の治療は一般に、
外科手術患者、外傷の患者、やけどの患者又は、心筋梗
塞を含む心血管系への損傷、又は外傷又は梗塞のような
中枢神経系の傷害又は末梢神経系の損傷を含む神経系に
対する傷を有している患者において促進させることがで
きる。本発明のペプチドは、例えば、脊髄の傷害の治療
において使用しうる。ペプチドは、又、例えば瘢痕の再
生におけるように、傷の治療から生ずる化粧的外観を改
善するために使用しうる。本発明のペプチドは、急性並
びに慢性的な治療において使用しうる。
かかる血管形成ペプチドは、改善された血管の灌流を
組織に与えることにより、移植された組織片のとり込み
を促進する際にも使用しうる。それゆえ、本発明は移植
組織を有効量の血管形成ペプチドにさらすことによる、
移植組織の同化を促進するための方法も提供する。
組織に与えることにより、移植された組織片のとり込み
を促進する際にも使用しうる。それゆえ、本発明は移植
組織を有効量の血管形成ペプチドにさらすことによる、
移植組織の同化を促進するための方法も提供する。
本発明の血管形成ペプチドは、ヒト並びに動物の治療
のために使用しうる。
のために使用しうる。
本発明は、また、血管形成を阻止する。本発明の血管
形成ペプチドに構造的に関連するペプチドの開発を企図
するものである。かかる抗血管形成ペプチドは、増大し
た血管形成の異常を治療する際に、又は、悪性腫瘍、血
管腫及び内皮血管腫、リウマチ性関節炎及び乾癬のよう
に、血液供給又は血管形成を限定することが望ましい治
療において有用であろう。
形成ペプチドに構造的に関連するペプチドの開発を企図
するものである。かかる抗血管形成ペプチドは、増大し
た血管形成の異常を治療する際に、又は、悪性腫瘍、血
管腫及び内皮血管腫、リウマチ性関節炎及び乾癬のよう
に、血液供給又は血管形成を限定することが望ましい治
療において有用であろう。
6.実施例：血管形成ペプチドの製造 6.1. 材料及び方法 6.1.1. PF4の製造 PF4は、メディチらにより記載された方法の改良法に
より、トロンビン−活性化血小板抽出物から精製された
（1989,Thrombos,Res,54:277−287）。PF4は、ヘパリン
セファロースアフィニティクロマトグラフィーにより、
1.7MのNaClでその因子を溶出し、次いで強カチオン性交
換クロマトグラフィーにより、ポリスルホエチル−アス
パルタミドカラム上で15％のアセトニトリルの存在下に
てNaClで溶出し、最後にVydac PRC4逆相HPLC分析用カラ
ム上、0.1％TFA水溶液中の線形アセトニトリル勾配で溶
出して単離された。
より、トロンビン−活性化血小板抽出物から精製された
（1989,Thrombos,Res,54:277−287）。PF4は、ヘパリン
セファロースアフィニティクロマトグラフィーにより、
1.7MのNaClでその因子を溶出し、次いで強カチオン性交
換クロマトグラフィーにより、ポリスルホエチル−アス
パルタミドカラム上で15％のアセトニトリルの存在下に
てNaClで溶出し、最後にVydac PRC4逆相HPLC分析用カラ
ム上、0.1％TFA水溶液中の線形アセトニトリル勾配で溶
出して単離された。
6.1.2. PF4のトリプシン消化 トリプシン消化は、微量遠心分離管において凍結乾燥
されたPF4を50μｌの0.4M Na2CO3/8M尿素（pH9.0）に溶
解させて実施した。次に、タンパク質は、50℃で15分か
けてpH9.0の緩衝液中の５μｌの45mM DTTを添加するこ
とにより還元した。タンパク質は、0.5N NaOH中の５μ
ｌヨード酢酸を添加してカルボキシメチル化し、室温で
暗所にて15分間インキュベートした。最後に、脱イオン
140μｌ及び配列決定用の等級のトリプシンの1mM HCl溶
液（200μg/ml）５μｌを添加し、試料を37℃で24時間
インキュベートした。
されたPF4を50μｌの0.4M Na2CO3/8M尿素（pH9.0）に溶
解させて実施した。次に、タンパク質は、50℃で15分か
けてpH9.0の緩衝液中の５μｌの45mM DTTを添加するこ
とにより還元した。タンパク質は、0.5N NaOH中の５μ
ｌヨード酢酸を添加してカルボキシメチル化し、室温で
暗所にて15分間インキュベートした。最後に、脱イオン
140μｌ及び配列決定用の等級のトリプシンの1mM HCl溶
液（200μg/ml）５μｌを添加し、試料を37℃で24時間
インキュベートした。
トリプシン消化物は、2.7％アセトニトリル/0.1％TFA
/H2Oで平衡化したVydac C18カラムに注入し、0.5ml/分
の流速でクロマトグラフを行い、1.0分毎の画分を集め
た。溶出パターンは技のとおりであった：緩衝液Ａ（0.
1％TFAの水溶液）中の2.7％緩衝液Ｂ（95％アセトトニ
トリル）を10分間、2.7％〜95％Ｂを123分（第１図を参
照）。ペプチド溶出は210nmでモニターした。ベックマ
ンシステムゴールドHPLCシステムをタンパク質及び消化
物のクロマトグラフィーのために使用した。
/H2Oで平衡化したVydac C18カラムに注入し、0.5ml/分
の流速でクロマトグラフを行い、1.0分毎の画分を集め
た。溶出パターンは技のとおりであった：緩衝液Ａ（0.
1％TFAの水溶液）中の2.7％緩衝液Ｂ（95％アセトトニ
トリル）を10分間、2.7％〜95％Ｂを123分（第１図を参
照）。ペプチド溶出は210nmでモニターした。ベックマ
ンシステムゴールドHPLCシステムをタンパク質及び消化
物のクロマトグラフィーのために使用した。
6.1.3.内皮細胞の化学走性アッセイ 6.1.3.1. 細胞の調製 ウサギの傷ついた毛細管内皮細胞（RWCE）を３−４プ
リマリア（Primaria,Falcon ＃3824）75cm2フラスコ上
で60〜85％の集密度になる迄増殖させた。アッセイの約
20〜24時間前に、媒質を除去し、フラスコをCa/Mgを含
まないハンクスの平衡塩類溶液で２回洗った。次に、メ
ディア199（Media−Tech）中の0.1％ラクトアルブミン1
2〜15mlを各フラスコに加え、培養物を１晩維持した。
翌日、ラクトアルブミン／媒質をフラスコから除去し、
細胞を６〜10mlのHBSSで洗った。次に、HBSS（Ca/Mg不
含）１当たり２×105KU DNAase（約100mg）及び１×1
05Uのコラゲナーゼ（約335mg）から成る酵素カクテル中
で室温にて細胞を14分間インキュベートすることによ
り、内皮細胞をフラスコから取り出した。次に、細胞を
フラスコの底部からはぎとり、0.2％ラクトアルブミン/
M199媒質中で遠心分離することにより洗浄した。生存細
胞の数は、トリパンブルー排除による移動アッセイの前
に決定した。
リマリア（Primaria,Falcon ＃3824）75cm2フラスコ上
で60〜85％の集密度になる迄増殖させた。アッセイの約
20〜24時間前に、媒質を除去し、フラスコをCa/Mgを含
まないハンクスの平衡塩類溶液で２回洗った。次に、メ
ディア199（Media−Tech）中の0.1％ラクトアルブミン1
2〜15mlを各フラスコに加え、培養物を１晩維持した。
翌日、ラクトアルブミン／媒質をフラスコから除去し、
細胞を６〜10mlのHBSSで洗った。次に、HBSS（Ca/Mg不
含）１当たり２×105KU DNAase（約100mg）及び１×1
05Uのコラゲナーゼ（約335mg）から成る酵素カクテル中
で室温にて細胞を14分間インキュベートすることによ
り、内皮細胞をフラスコから取り出した。次に、細胞を
フラスコの底部からはぎとり、0.2％ラクトアルブミン/
M199媒質中で遠心分離することにより洗浄した。生存細
胞の数は、トリパンブルー排除による移動アッセイの前
に決定した。
6.1.3.2. フィルターの調製 実験においては、ヌクレオポア（Nucleopore）ポリプ
ロピレンフィルター（8.0μｍ孔、PVPF,Neuro Probe社
から）を使用した。フィルターの一面はフィブロネクチ
ン溶液でコーティングした（HBSS 1ml当たり１μｇフィ
ブロネクチン；ペトリ皿に溶液を入れ、次いでフィブロ
ネクチン溶液上に置くことにより各フィルターをコーテ
ィングするために、３〜4mlが使用された）。
ロピレンフィルター（8.0μｍ孔、PVPF,Neuro Probe社
から）を使用した。フィルターの一面はフィブロネクチ
ン溶液でコーティングした（HBSS 1ml当たり１μｇフィ
ブロネクチン；ペトリ皿に溶液を入れ、次いでフィブロ
ネクチン溶液上に置くことにより各フィルターをコーテ
ィングするために、３〜4mlが使用された）。
6.1.3.3. チャンバーの調製 ニューロプローブ48（Neuro Probe 48）ウエル化学走
性チャンバー（Chemotaxis Chamber）を実験に使用し
た。約26μｌの容積の試験ペプチドを下部室のウエルに
添加した。フィブロネクチンでコーティングされ、上述
のように調製されたフィルターを、次いで、底部ウエル
上に置いた。次に、上部チャンバーがとりつけられ、内
皮細胞懸濁液（0.75×106細胞/ml）を上部チャンバーの
大部分のウエルに添加した；残りのウエルはコントロー
ルとして細胞を含まない媒質で充填した。次に、チャン
バーは５％ CO2の湿潤雰囲気下で37℃にて４時間インキ
ュベートした。
性チャンバー（Chemotaxis Chamber）を実験に使用し
た。約26μｌの容積の試験ペプチドを下部室のウエルに
添加した。フィブロネクチンでコーティングされ、上述
のように調製されたフィルターを、次いで、底部ウエル
上に置いた。次に、上部チャンバーがとりつけられ、内
皮細胞懸濁液（0.75×106細胞/ml）を上部チャンバーの
大部分のウエルに添加した；残りのウエルはコントロー
ルとして細胞を含まない媒質で充填した。次に、チャン
バーは５％ CO2の湿潤雰囲気下で37℃にて４時間インキ
ュベートした。
6.1.3.4. フィルターの取りはずし及びふき取り フィルターを装置から取りはずした。もし底部チャン
バーが血管形成ペプチドを含んでいる場合には、頂部層
からの細胞はフィルターへ、及びそれを通って移動する
であろう。しかしながら、単にフィルターに付着しただ
けの非移動細胞は除去しておく必要があった。それゆ
え、細胞を含有するチャンバーに接触していたフィルタ
ー部分は、リン酸緩衝液（PBS）でぬらし、細胞のふき
取り用の刃でその表面をきれいにした。その時点で移動
した細胞を実質的に含有していたフィルターは、１晩乾
燥させ、ロイコスタット（Leukostat:フィッシャー）で
染色し、フィルターの部分の吸光度をデンシトメーター
を用いて読みとった。デンシトメトリー追跡時の相対的
な増加は、より多くの細胞移動の指標であり、それゆ
え、対応する下部チャンバーに含まれている試験ペプチ
ドの血管形成活性の指標であった。
バーが血管形成ペプチドを含んでいる場合には、頂部層
からの細胞はフィルターへ、及びそれを通って移動する
であろう。しかしながら、単にフィルターに付着しただ
けの非移動細胞は除去しておく必要があった。それゆ
え、細胞を含有するチャンバーに接触していたフィルタ
ー部分は、リン酸緩衝液（PBS）でぬらし、細胞のふき
取り用の刃でその表面をきれいにした。その時点で移動
した細胞を実質的に含有していたフィルターは、１晩乾
燥させ、ロイコスタット（Leukostat:フィッシャー）で
染色し、フィルターの部分の吸光度をデンシトメーター
を用いて読みとった。デンシトメトリー追跡時の相対的
な増加は、より多くの細胞移動の指標であり、それゆ
え、対応する下部チャンバーに含まれている試験ペプチ
ドの血管形成活性の指標であった。
6.2. 結果及び考察 ペプチドＰ−１は、ポートン（Porton）2090e配列決
定装置において、ポートン専有のペプチドサポート上に
吸着させた後に、配列決定された。ペプチドの配列は次
のとおりであった:Thr−27.5pm,Thr−23.5pm,Ser−30.0
pm,Gln−26.5pm,Val−22.6pm,Arg−10.5pm,Pro−9.2pm,
Arg−4.7pm。ベックマンダンシルクロリド法を使用する
アミノ酸分析により、ペプチドの全配列が確認された。
より一層矛盾のない結果は、毛細管の内皮細胞化学走性
アッセイよりもギムブロン（Gimbrone）ら（1974,J.Nat
l.Cancer Inst.52:413−427）及びランダー（Langer）
ら（1976,Nature 263:797−800（下記第７節参照））の
研究の後でモデル化されたウサギの角膜移植アッセイシ
ステムを使用するときに観察された。我々の結果は、第
３図で総括したデータに加えて、少なくとも６個の異な
る実験において、＋２及び＋３の血管形成応答（１〜４
のスケールに対して）をもたらした。第３図は、オリジ
ナルのオクタペプチド（ペクチド１）、及びメリーフィ
ールド法により合成した７種のペプチド類縁体に関する
結果を要約した（Barany及びMirrifield（1980），“ペ
プチド”第２巻,Gross及びMeienhofer編，アカデミック
プレス,N.Y.）。第３図の結果は、コントロール移植体
に比較して、すべてのペプチドが若干の血管形成応答を
引き起こしたが、オクタペプチド１及びペンタペプチド
６が炎症を生じない極めて強力かつ特異的な血管形成応
答を引き起こしたことを明らかに示している。
定装置において、ポートン専有のペプチドサポート上に
吸着させた後に、配列決定された。ペプチドの配列は次
のとおりであった:Thr−27.5pm,Thr−23.5pm,Ser−30.0
pm,Gln−26.5pm,Val−22.6pm,Arg−10.5pm,Pro−9.2pm,
Arg−4.7pm。ベックマンダンシルクロリド法を使用する
アミノ酸分析により、ペプチドの全配列が確認された。
より一層矛盾のない結果は、毛細管の内皮細胞化学走性
アッセイよりもギムブロン（Gimbrone）ら（1974,J.Nat
l.Cancer Inst.52:413−427）及びランダー（Langer）
ら（1976,Nature 263:797−800（下記第７節参照））の
研究の後でモデル化されたウサギの角膜移植アッセイシ
ステムを使用するときに観察された。我々の結果は、第
３図で総括したデータに加えて、少なくとも６個の異な
る実験において、＋２及び＋３の血管形成応答（１〜４
のスケールに対して）をもたらした。第３図は、オリジ
ナルのオクタペプチド（ペクチド１）、及びメリーフィ
ールド法により合成した７種のペプチド類縁体に関する
結果を要約した（Barany及びMirrifield（1980），“ペ
プチド”第２巻,Gross及びMeienhofer編，アカデミック
プレス,N.Y.）。第３図の結果は、コントロール移植体
に比較して、すべてのペプチドが若干の血管形成応答を
引き起こしたが、オクタペプチド１及びペンタペプチド
６が炎症を生じない極めて強力かつ特異的な血管形成応
答を引き起こしたことを明らかに示している。
7.実施例：ウサギの角膜移植研究におけるペプチドの血
管形成作用 7.1. 材料及び方法 7.1.1. 移植体の調製 10％ヒドロン、１％ポリエチレングリコール及び70％
エタノールの溶液を等容積の試験ペプチドと混合するこ
とにより、移植用ペレットを調製した（50μｌヒドロン
溶液：約５〜10μｇのペプチドを含有する50μｌのペプ
チド溶液）。得られた混合物を激しくうず巻き様に攪拌
し、次いでプラスチックシート上に20μｌのアリコート
を置き、脱水させて乾燥ペレットを形成させた。各ペレ
ットは、約１又は２μｇの試験ペプチドを含有してい
た。
管形成作用 7.1. 材料及び方法 7.1.1. 移植体の調製 10％ヒドロン、１％ポリエチレングリコール及び70％
エタノールの溶液を等容積の試験ペプチドと混合するこ
とにより、移植用ペレットを調製した（50μｌヒドロン
溶液：約５〜10μｇのペプチドを含有する50μｌのペプ
チド溶液）。得られた混合物を激しくうず巻き様に攪拌
し、次いでプラスチックシート上に20μｌのアリコート
を置き、脱水させて乾燥ペレットを形成させた。各ペレ
ットは、約１又は２μｇの試験ペプチドを含有してい
た。
7.1.2. 外科的方法 得られた移植体は、一般的な麻酔下に、上縁毛細管床
（superiorlimbus capillary bed）から約２〜3mnのウ
サギの角膜内に置いた。ペレットは毛細管床から1mm以
内には置かなかった。
（superiorlimbus capillary bed）から約２〜3mnのウ
サギの角膜内に置いた。ペレットは毛細管床から1mm以
内には置かなかった。
7.1.3. 血管形成の追跡 眼は、ペレット方向への毛細管の直接の成長を3,5及
び７日目に調べ、第４図に従って部類分けした（Gimbro
neら,1974,J.Natl.Cancer Inst.52:413−427）。毛細管
の成長を記録するために、５及び／又は７日目に眼の写
真を撮った。７日目に動物を殺し、角膜の毛細管成長に
ついて（ヘマトキシリン及びエオシン染色で）組織学的
に検討した。
び７日目に調べ、第４図に従って部類分けした（Gimbro
neら,1974,J.Natl.Cancer Inst.52:413−427）。毛細管
の成長を記録するために、５及び／又は７日目に眼の写
真を撮った。７日目に動物を殺し、角膜の毛細管成長に
ついて（ヘマトキシリン及びエオシン染色で）組織学的
に検討した。
7.2. 結果及び考察 血管形成の目視検査により、７日目に毛細管の移動の
度合に依存して、０から＋４までに評価した。血管形成
指数（AI）は次式にて計算した。
度合に依存して、０から＋４までに評価した。血管形成
指数（AI）は次式にて計算した。
AI＝（合計得点/n×８）×100, 得点は観察された血管形成に対し次の数値を割り当てる
ことにより決定される： 陰性 ＝０ ＋／−＝１ ＋１ ＝２ ＋２ ＝４ ＋３ ＝６ ＋４ ＝８ ペプチドWohl 1−８の血管形成活性は、第Ｉ表に示さ
れている。ウサギ角膜移植アッセイ（RCIA）において８
個のペプチドの各々がコントロールの移植体よりもすぐ
れていることが観察され、ペプチドWhol−１及びWhol−
６は特に活性であることが判明した。
ことにより決定される： 陰性 ＝０ ＋／−＝１ ＋１ ＝２ ＋２ ＝４ ＋３ ＝６ ＋４ ＝８ ペプチドWohl 1−８の血管形成活性は、第Ｉ表に示さ
れている。ウサギ角膜移植アッセイ（RCIA）において８
個のペプチドの各々がコントロールの移植体よりもすぐ
れていることが観察され、ペプチドWhol−１及びWhol−
６は特に活性であることが判明した。
2.0μg/移植体に比較した1.0μg/移植体の血管形成活
性の組織学的評価の結果は、第II表に示されている。1.
0μg/移植体は、2.0μg/移植体よりも一層高い血管形成
指数を示すことが見い出された。
性の組織学的評価の結果は、第II表に示されている。1.
0μg/移植体は、2.0μg/移植体よりも一層高い血管形成
指数を示すことが見い出された。
8.実施例：ラット切開モデルにおける傷治療活性 以下の実験は、本発明のペプチド投与が、実験動物モ
デル、即ち、正常なラットにおける切開モデルにおいて
傷治療を促進することを示す。
デル、即ち、正常なラットにおける切開モデルにおいて
傷治療を促進することを示す。
8.1. 材料及び方法 8.1.2. 試験物質の調製 1.0mlの牛コラーゲン（Vitrogen 100,Collagen社,Pal
o Alto,CA）を一連の12×75mmのポリプロピレン管に置
き、１時間半凍結乾燥した。一群の実験において、コラ
ーゲン媒体は、pH7.0〜7.4のダルベツコのリン酸緩衝液
（DPBS）中10.0μg/ml又は30.0μg/mlの濃度のＰ−１ペ
プチド1.0mlを含むように再調製された。実験の他の群
において、コラーゲン媒体はpH7.0〜7.4のDPBS中10μg/
ml、30.0μg/ml又は100.0μg/mlの濃度のＰ−１ペプチ
ド1.0mlを含むように再調製された。コントロールにつ
いては、コラーゲン媒体はpH7.0〜7.4のDPBS緩衝液100
μｌ中にて再調製した。相応の試験物質のアリコート
（100μｌ）を調製し、実験動物に投与される迄氷上で
保持した。
o Alto,CA）を一連の12×75mmのポリプロピレン管に置
き、１時間半凍結乾燥した。一群の実験において、コラ
ーゲン媒体は、pH7.0〜7.4のダルベツコのリン酸緩衝液
（DPBS）中10.0μg/ml又は30.0μg/mlの濃度のＰ−１ペ
プチド1.0mlを含むように再調製された。実験の他の群
において、コラーゲン媒体はpH7.0〜7.4のDPBS中10μg/
ml、30.0μg/ml又は100.0μg/mlの濃度のＰ−１ペプチ
ド1.0mlを含むように再調製された。コントロールにつ
いては、コラーゲン媒体はpH7.0〜7.4のDPBS緩衝液100
μｌ中にて再調製した。相応の試験物質のアリコート
（100μｌ）を調製し、実験動物に投与される迄氷上で
保持した。
8.1.2. 外科的方法 体重300〜350gの正常のSprague Dawleysラットをエー
テルで麻酔した。その背部の毛をそり、70％ FTOH及び
ベタジン（Betadine）洗浄液で滅菌した。正中線の両側
において、２つの6cmの線形切開を全厚1.5cmで行った。
テルで麻酔した。その背部の毛をそり、70％ FTOH及び
ベタジン（Betadine）洗浄液で滅菌した。正中線の両側
において、２つの6cmの線形切開を全厚1.5cmで行った。
０日目に、ポジティブ置換ピペットを使用して、一方
の切開の端部に100μｌの相応の試験物質を適用した。
同様にして、他の切開に100μｌのコントロール物質を
適用した。切開口は４個の外科クリップで接合した（オ
ートクリップ,Bechton Dickinson社のClay Adams Divis
ion,Parsippany,N.J.）。
の切開の端部に100μｌの相応の試験物質を適用した。
同様にして、他の切開に100μｌのコントロール物質を
適用した。切開口は４個の外科クリップで接合した（オ
ートクリップ,Bechton Dickinson社のClay Adams Divis
ion,Parsippany,N.J.）。
動物を囲いに入れ、通常の方法で飼育した。手術後、
7,14又は21日目に動物を殺し、切開の破壊強さ（breaki
ng strength）及び引張強さ（tensile strength）を測
定した。
7,14又は21日目に動物を殺し、切開の破壊強さ（breaki
ng strength）及び引張強さ（tensile strength）を測
定した。
8.1.3. 引張強さの測定 動物は過剰のエーテルにより安楽死させ、背部の皮膚
全体を摘出した。切開の端部から0.5cmのところから始
めて、1.0cm増加ごとに印をつけ、各端部に0.5cm残し
た。1.0cmの小片を切り取り、反対側の切開の対応する
小片と対を形成しうるように印をつけた。各切開から得
た４〜５の小片を、引張強さが測定される迄４℃でリン
酸緩衝液に貯蔵した。動物が死んでから２〜３時間以内
に試料の試験を行った。
全体を摘出した。切開の端部から0.5cmのところから始
めて、1.0cm増加ごとに印をつけ、各端部に0.5cm残し
た。1.0cmの小片を切り取り、反対側の切開の対応する
小片と対を形成しうるように印をつけた。各切開から得
た４〜５の小片を、引張強さが測定される迄４℃でリン
酸緩衝液に貯蔵した。動物が死んでから２〜３時間以内
に試料の試験を行った。
50kgの容量のトランスデューサーを有するインストロ
ン張力計（モデル1011,インストロム（Instrom）社,Par
k Ridge,IL）を使用して、傷の破壊強さ又は引張強さに
ついて、試料を試験した。試料は適所でクランプし、4m
m/分のスピードで引っ張った。データは、チャートリコ
ーダーを使ってチャート速度5.0cm/分、感度1.0ボルト
で記録した。
ン張力計（モデル1011,インストロム（Instrom）社,Par
k Ridge,IL）を使用して、傷の破壊強さ又は引張強さに
ついて、試料を試験した。試料は適所でクランプし、4m
m/分のスピードで引っ張った。データは、チャートリコ
ーダーを使ってチャート速度5.0cm/分、感度1.0ボルト
で記録した。
8.2. 結果及び考察 破壊又は引張強さ（グラムで示す）は、張力計を使用
して、得られたグラフの最高の高さから計算した。デー
タは次いで、独立した観察についてのＴテスト及び対合
のＴテスト（paired T Test）を使用して統計的に分析
した。結果は、第５図（Ａ及びＢ）及び第６図に示され
ている。
して、得られたグラフの最高の高さから計算した。デー
タは次いで、独立した観察についてのＴテスト及び対合
のＴテスト（paired T Test）を使用して統計的に分析
した。結果は、第５図（Ａ及びＢ）及び第６図に示され
ている。
第５図（Ａ及びＢ）に示されているように、切開の傷
は、1.0μｇのペプチドＰ−１で処理した動物又はプラ
シーボのコントロールに比較して、切開当たり3.0μｇ
のペプチドＰ−１で処理した動物においてより急速に治
療された。傷の引張強さは、切開後７日目及び14日目に
おいて測定した時、より大きかった。傷治療の最大の促
進は、プラシーボコントロールと比較した時14日目に記
録された。
は、1.0μｇのペプチドＰ−１で処理した動物又はプラ
シーボのコントロールに比較して、切開当たり3.0μｇ
のペプチドＰ−１で処理した動物においてより急速に治
療された。傷の引張強さは、切開後７日目及び14日目に
おいて測定した時、より大きかった。傷治療の最大の促
進は、プラシーボコントロールと比較した時14日目に記
録された。
第６図に示されるように、ペプチドＰ−１は、切開当
たり3.0μｇ及び10μｇの濃度で投与すると、傷の治療
を増大させた。引張強さは、切開後14日目に測定した。
切開当たり3.0μｇの用量は、引張強さを改善する際に
最も活性であるように見えた；しかしながら、切開当た
り10.0μｇの用量はほぼ同程度に活性であった。
たり3.0μｇ及び10μｇの濃度で投与すると、傷の治療
を増大させた。引張強さは、切開後14日目に測定した。
切開当たり3.0μｇの用量は、引張強さを改善する際に
最も活性であるように見えた；しかしながら、切開当た
り10.0μｇの用量はほぼ同程度に活性であった。
結果は、本発明のペプチドＰ−１が、ヒトに投与され
る用量に相当する濃度で、ラットの切開モデルにおいて
傷の治療を増大させる点で活性であることを明らかに示
している。ペプチドＰ−１の効果的な用量の単独投与
は、ラットの切開モデルにおいて治療を促進するために
十分に活性である。これらの観察は、促進された治療及
び／又は血管形成を必要とする病的状態において本発明
のペプチドを治療のために使用しうることを実証してい
る。
る用量に相当する濃度で、ラットの切開モデルにおいて
傷の治療を増大させる点で活性であることを明らかに示
している。ペプチドＰ−１の効果的な用量の単独投与
は、ラットの切開モデルにおいて治療を促進するために
十分に活性である。これらの観察は、促進された治療及
び／又は血管形成を必要とする病的状態において本発明
のペプチドを治療のために使用しうることを実証してい
る。
本発明は、上述の態様に特に言及して詳細に記載し
た。しかしながら、本発明は、本発明の例示として意図
され、開示された態様の範囲に限定されるべきでないこ
とは理解される。
た。しかしながら、本発明は、本発明の例示として意図
され、開示された態様の範囲に限定されるべきでないこ
とは理解される。
実際、本明細書で示され、そして記載されたものに加
えて、本発明の種々の修飾が前述の記載から当業者に対
して明らかになるであろう。かかる修飾は、本発明の特
許請求の範囲内に入ることが意図される。
えて、本発明の種々の修飾が前述の記載から当業者に対
して明らかになるであろう。かかる修飾は、本発明の特
許請求の範囲内に入ることが意図される。
本明細書では種々の参考文献が引用された；これらは
すべて参照によりここに引用されるものとする。
すべて参照によりここに引用されるものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウォール，ロバート アメリカ合衆国 11720 ニューヨーク 州 サウス セトーケット，ソーンリッ ジ レーン 15 (72)発明者 ダフ，ロナルド ジー. アメリカ合衆国 11940 ニューヨーク 州 イースト モリチェス，インレット ビュー パス 67 (56)参考文献 特表 昭61−501708（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 5/10 C07K 14/47 A61K 38/00 C07K 7/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列： からなる群より選択される血管形成ペプチド。
- 【請求項２】請求項１記載のペプチドを製剤学上適切な
担体中に含ませてなる、組織の血管形成を誘導するため
の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63182390A | 1990-12-21 | 1990-12-21 | |
| US631,823 | 1990-12-21 | ||
| PCT/US1991/009813 WO1992011021A1 (en) | 1990-12-21 | 1991-12-20 | Angiogenic peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06504064A JPH06504064A (ja) | 1994-05-12 |
| JP3159705B2 true JP3159705B2 (ja) | 2001-04-23 |
Family
ID=24532905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50527992A Expired - Lifetime JP3159705B2 (ja) | 1990-12-21 | 1991-12-20 | 血管形成ペプチド |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5470831A (ja) |
| EP (1) | EP0563329B1 (ja) |
| JP (1) | JP3159705B2 (ja) |
| KR (1) | KR100204400B1 (ja) |
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| CA (1) | CA2098921C (ja) |
| DE (1) | DE69129121T2 (ja) |
| DK (1) | DK0563329T3 (ja) |
| ES (1) | ES2117045T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992011021A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5776892A (en) * | 1990-12-21 | 1998-07-07 | Curative Health Services, Inc. | Anti-inflammatory peptides |
| ATE276272T1 (de) * | 1993-06-18 | 2004-10-15 | Curative Tech Inc | Entzündungshemmende peptide |
| AU7161096A (en) * | 1995-09-19 | 1997-04-09 | Texas Biotechnology Corporation | Compositions and methods for inhibiting the binding of pecam |
| US6693081B2 (en) * | 1995-09-26 | 2004-02-17 | Osteopharm Inc. | Bone stimulating factor |
| IL125756A (en) | 1996-02-15 | 2003-05-29 | Biosense Inc | Catheter for use in surgery |
| US6443974B1 (en) * | 1996-07-28 | 2002-09-03 | Biosense, Inc. | Electromagnetic cardiac biostimulation |
| US6342051B1 (en) * | 1997-06-12 | 2002-01-29 | Gholam A. Peyman | Treatment of anoxic tissue with angiogenesis-inducing implants |
| ES2255155T3 (es) | 1998-02-05 | 2006-06-16 | Biosense Webster, Inc. | Dispositivo para la administracion intracardiaca de farmacos. |
| US20030113303A1 (en) * | 1998-02-05 | 2003-06-19 | Yitzhack Schwartz | Homing of embryonic stem cells to a target zone in tissue using active therapeutics or substances |
| US20030129750A1 (en) * | 1998-02-05 | 2003-07-10 | Yitzhack Schwartz | Homing of donor cells to a target zone in tissue using active therapeutics or substances |
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| WO2005116729A2 (en) | 2004-05-20 | 2005-12-08 | Coopervision, Inc., | Corneal onlays and wavefront aberration correction to enhance vision |
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| WO1992013874A2 (en) * | 1991-01-02 | 1992-08-20 | Fox Chase Cancer Center | Angiogenic peptides |
-
1991
- 1991-12-20 DE DE69129121T patent/DE69129121T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-20 CA CA002098921A patent/CA2098921C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-20 JP JP50527992A patent/JP3159705B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-20 KR KR1019930701919A patent/KR100204400B1/ko not_active IP Right Cessation
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- 1991-12-20 EP EP92904736A patent/EP0563329B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-20 AT AT92904736T patent/ATE164167T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1991-12-20 ES ES92904736T patent/ES2117045T3/es not_active Expired - Lifetime
-
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- 1993-03-24 US US08/037,486 patent/US5470831A/en not_active Expired - Lifetime
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