EP0354934A1 - Neutrophilen aktivierendes polypeptid, verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung als arzneimittel und diagnostikum - Google Patents

Neutrophilen aktivierendes polypeptid, verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung als arzneimittel und diagnostikum

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Publication number
EP0354934A1
EP0354934A1 EP88909527A EP88909527A EP0354934A1 EP 0354934 A1 EP0354934 A1 EP 0354934A1 EP 88909527 A EP88909527 A EP 88909527A EP 88909527 A EP88909527 A EP 88909527A EP 0354934 A1 EP0354934 A1 EP 0354934A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
monap
high pressure
neutrophil
activating polypeptide
pressure liquid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP88909527A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Enno Christophers
Jens-Michael SCHRÖDER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ferring Arzneimittel GmbH
Original Assignee
Ferring Arzneimittel GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Ferring Arzneimittel GmbH filed Critical Ferring Arzneimittel GmbH
Publication of EP0354934A1 publication Critical patent/EP0354934A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5421—IL-8
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Neutrophil activating polypeptide process for its preparation and its use as a medicament and diagnostic agent
  • the invention relates to a neutrophil activating polypeptide which has been isolated from human mononuclear cells.
  • This polypeptide is active for human neutrophil granulocytes and is therefore suitable as a medicament, in particular for increasing the cellular phagocyte-associated defense against inflammation and for stimulating granulation tissue and wound healing.
  • it is suitable as a diagnostic agent for testing the reactivity of the neutrophilic polymorphonuclear leukocytes in vivo or in vitro and as a reagent for the production of monoclonal antibodies using as antigen.
  • PMNL polymorphonuclear leukocyte activating factor released by human monocytes.
  • this factor appears to be related to PMNL degranulation (Klemper et al., 1978, J. Clin. Invest. 61: 1330) and the oxygen-dependent metabolism activate (Klempner et al., 1979, J. Clin. Invest. 64: 996).
  • Subsequent studies have shown that partially purified interleukin-1 preparations show these PMNL-stimulating activities (Sander et al., 1984, J. Immunol. 132: 828; Smith et al., 1985, J. Leucocyte Biology 37: 746), from which it was concluded that IL-1 is a PMNL activating cytokine.
  • IL-1 denotes a series of biochemically closely related cytokines that are produced by different cell types and includes the lymphocyte activating factor (LAF), endogenous pyrogen (EP), endogenous leukocyte mediator (LEM) or the mononuclear one Cell factor (MCF).
  • LAF lymphocyte activating factor
  • EP endogenous pyrogen
  • LEM endogenous leukocyte mediator
  • MCF mononuclear one Cell factor
  • IL-1 activity has been described in various biochemical forms, i.e. H. 17 kD species with IP 6, 8, 5, 4 and 5, 2, as well as forms with high molecular weights, with similar IP values. To date, however, it is not clear whether the biological properties of IL-1 can be attributed to a single molecular species of IL-1 or not.
  • a neutrophil-activating peptide (hereinafter also referred to as MONAP) has been found which differs from IL-1.
  • the invention therefore relates to a new, physiologically active polypeptide with a selective chemotactic effect on neutrophilic, polymorphonuclear leukocytes (MONAP). It also relates to the process for its production, to medicinal products containing it and to its use.
  • MONAP neutrophilic, polymorphonuclear leukocytes
  • the neutrophil-activating polypeptide according to the invention is isolated from human mononuclear cells stimulated with lipopolysaccharides, phythaemagglutin and / or phorbol esters. It is homogeneous and has a molecular weight of 10 kD as determined by a single band in sodium dodecyl sulfate-polyamide gel electrophoresis and by a single peak in high pressure liquid chromatography (HPLC) (exclusion chromatography). A single peak was also achieved in reversed phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC).
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • RP-HPLC reversed phase high pressure liquid chromatography
  • the polypeptide according to the invention can be defined chemically and physically as follows: a) it is a polypeptide; b) molecular weight determined by SDS electrophoresis: 10 kD; c) molecular weight determined by exclusion chromatography (TSK-2000-HPLC), likewise 10 kD; d) it binds to anion exchangers at pH 8; e) binds to "Reversed-Phase (RP-18)"column; f) it is stable under the following conditions:
  • mild oxidizing agents e.g. K 3 Fe (CN) 6
  • shorter-chain peptides can be isolated that show the same biological properties as the sequence of the 72 amino acids.
  • Long-chain peptides of the same type can also be isolated , such as the LYNAP with the pentapeptide terminus (AVLPR), which has been described in the meantime and which is followed by the above sequence of 72 amino acids:
  • novel biologically active polypeptide according to the invention has the following biological properties:
  • polypeptide according to the invention is stable against heating; its biological effects are not affected by heating.
  • MONAP is in conflict here to IL-1, whose heat sensitivity is known.
  • MONAP half-maximum chemotaxis doses (EC 50 ) / 1 mg MONAP (volume: 0.1 ml).
  • MONAP is therefore a very effective chemotaxin for human PMNL old a calculated EC 5 0 of nearly 5 x 10 - 11 M (based on the molecular weight of 10 kD).
  • MONAP can cause PMNL chemotaxis at doses approximately 10 to 40 times lower than C5a, which is known to have an EC ⁇ n of 1-3 x 10 -9 M.
  • polypeptide according to the invention can be produced as described below.
  • Human mononuclear cells are stimulated, in particular with lipopolysaccharides, phythaemagglutin and / or phorbol esters, in particular phorbol myristate acetate.
  • the supernatant obtained is purified by gel chronography, followed by separation by HPLC cation exchange chromatography, HPLC exclusion chromatography and reversed-phase HPLC.
  • Monocytes which can be obtained by purifying venous blood are used in particular as mononuclear cells. Such monocytes and their purification are described, for example, by B ⁇ yum, A. 1968, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21: 17.
  • the stimulation is preferably carried out with lipopolysaccharides, phythaemagglutinin and / or phorbol esters on cell cultures of the monocytes at 37 ° C. It is in the pH range of 7-8, e.g. B. worked at 7.4.
  • the pH value is achieved using a suitable buffer (e.g. gaseous carbon dioxide).
  • the stimulation can e.g. B. during 24 to 40 hours.
  • the degree of moisture is variable and depends on the cells. For example, a humidity of 95% in an air / carbon dioxide mixture (5% carbon dioxide / 95% air) can be used for 24 to 40 hours.
  • the supernatant obtained from the incubation is used to prepare MONAP. It is preferably first cleaned, which can be done, for example, by acidification to a pH of 2-4, in particular 4. Examples of acids are trifluoroacetic acid or formic acid. It is then centrifuged.
  • Gel filtration is carried out on conventional columns with Sephadex gels, at acidic to neutral pH, for example on G-75 columns (Pharmacia), for example equilibrated with ammonium formate at a pH of about 5.
  • HPLC cation exchange chromatography is preferably carried out in the acidified to neutral state, for example at pH 5.
  • formic acid can serve as the acid.
  • HPLC exclusion chromatography is preferably carried out on conventional silca columns, e.g. B. on a TSK-2000 HPLC column, at pH 2-3.
  • the RP-HPLC can, for example, on an organically modified silica column, e.g. B. on octadecyl silica column.
  • the polypeptide according to the invention is chemotactically and chemokinetically active for human neutrophilic granulocytes. It is suitable for use as a pharmaceutical or for the production of pharmaceutical preparations.
  • the formulation can be carried out in the customary manner, in the customary manner in auxiliaries and excipients.
  • the medicaments containing MONAP according to the invention are particularly suitable for increasing the cellular, phagocyte-associated defense against specific and non-specific inflammations through local or systemic use.
  • MONAP has been shown to stimulate granulation tissue and wound healing when used locally or systemically. Monap can therefore, for. B. in chronic. Inflammatory processes, poorly healing wounds, fistulas, bacterial infections and chronic infections of the skin and the underlying tissues caused by mycotic pathogens are used.
  • the application can z. B. in the form of a locally effective administration z. B. a solution.
  • MONAP can also be used as a diagnostic.
  • the invention thus also encompasses diagnostic methods in which MONAP is used to test the reactivity of polymorphonuclear leukocytes.
  • the test can be performed locally or systemically in vivo.
  • in vitro use is also possible. For example, it can be determined whether or not leukocytes result in normal chemotaxis, enzyme release or proliferation of oxygen radicals.
  • Another application is the use of MONAP as a reagent.
  • MONAP can be used as an antigen for the production of monoclonal antibodies.
  • the MONAP-specific antibodies obtained and isolated in the usual way can be labeled or coupled with radioisotopes, enzymes, fluorescent or luminescent reagent it, as is known in the literature.
  • the antibodies labeled in this way can also be used as diagnostic agents.
  • the invention therefore also relates to diagnostic methods using the labeled antibodies obtained using MONAP in order to determine the MONAP concentrations in tissue or blood.
  • the labeled antibodies obtained using MONAP can also be used for the detection of MONAP-specific receptors in tissue and blood cells. For example, it is possible to mark activated antibodies by an in vitro representation of activated leukocytes. B. to perform tissue sections or smear preparations, and to obtain information about inflammatory processes by detection in the blood.
  • the MONAP-specific antibodies can also be used therapeutically. They are suitable, for example, for therapeutic methods for suppressing cellular, phagocyte-associated immune reactions, since the use of MONAP-specific antibodies or antagonists inhibits or antagonizes the effect of MONAP on the immune response of the organism.
  • the peptide according to the invention is therefore extremely suitable as a medicament and diagnostic agent; however, it can also be used as a reagent for the production of MONAP-specific monoclonal antibodies, which in turn can be used again for pharmaceutical and / or diagnostic purposes.
  • the monocytes were purified according to the above-mentioned reference Bt ⁇ yum, A. 1968. Venous blood anticoagulated with 1 aM EDTA was diluted to 1: 2 with isotonic saline solution, underlaid with Ficoll separation medium (Biochrom, Berlin) and for 35 minutes with 400 ⁇ g centrifuged at 20 ° C. The limit phase containing mononuclear cells was then obtained and the monocytes were obtained by reversible binding to human fibronectin on a gelatin-coated plastic surface according to Freundlich and Avdalovic (1983, J. Immunol. Method, 52:31).
  • the monocytes thus obtained showed a purity of 95 ⁇ 4% (alpha-naphthyl acetate esterase).
  • the contaminating cells were predominantly T-lymphocytes (2.1 ⁇ 3%) (Leu M I monoclonal antibody staining).
  • the monocyte preparation was Irei of neutrophils and contained less than 10% platelets. Viability over 97% (trypan blue dye exclusion test).
  • lipopolysaccharides from Salmonella minnesota RE 595 (Calbiochem, Marburg) were added (1 ng / ml) and the cultures were incubated at 37 ° C and 95% humidity in 5% CO 2 /95% air. The conditioned mediam were collected after 24-40 hours of incubation and stored below -70 ° C until chromatographic separation.
  • the column was calibrated with the following proteins: bovine albuain 60 kD; Ovalbumin 45 kD; Myoglobulin 17 kD; Ribonuclease A 13.8 kD and cytochrome C 12.4 kD.
  • the molecular weight of MONAP was determined on a graph of Ka v / log (MG).
  • MONAP was eluted after washing the column with 15 ml of buffer A with a gradient (5 ml) of 0.02 M tris-acetate containing 0.5 M sodium acetate (buffer B), followed by isocratic elution (5 ml) followed and with a gradient (15 al) to 100% buffer B, followed by another isocratic elution with B.
  • HPLC HPLC was performed at a flow rate of 1 ml / min and 1 ml fractions were measured. Samples from each fraction were taken for testing for MONAP.
  • Biologically active fractions from CM-TSK-HPLC batches or crude supernatants acidified with trifluoroacetic acid were lyophilized or concentrated to 0.3-0.5 ml and onto a TSK-2000 exclusion HPLC column (LKB, 0.8 ⁇ 60 cm), equilibrated with 0.1% (vol / vol) trifluoroacetic acid in water, applied.
  • MONAP was eluted with 0.1% trifluoroacetic acid.
  • the chromatography was carried out at a flow rate of 1 ml / min and fractions of 0.5 ml were collected. Samples from each fraction were taken for biological evaluation (chemotaxis or enzyme release).
  • the column was calibrated with the following proteins (Sigma): myoglobulin 17.4 kD, ribonuclease A 13, 7 kD, cytochrome C 12, 4 kD, aprotinin 6.5 kD, insulin 3, 5 kD and tetapeptide Val Gly Ser Glu 0 , 5 kD.
  • the molecular weights of MONAP were determined by plotting the elution time against log (MG).
  • Phase octadecyl silica column performed. Blution was monitored using a Kratos UV detector at 215 ml. The peak areas were determined by a Spectra-Physics
  • Solvent A was 0.1% trifluoroacetic acid in water and solvent B was 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile.
  • the column was equilibrated with 10% B in A. Fractions from TSK 2000-HPLC containing MONAP were pooled, concentrated and injected onto the column. MONAP was eluted with a 2-slope gradient: 10 to 40% B in 30 minutes, followed by 40 to 100% B in 10 minutes. Peak fractions were collected manually. Samples were taken for SDS-PAGE as well as for MONAP and LAF / IL-1 bioassay. The samples were stored below -70 ° C or lyophilized and redissolved in suitable buffers for further use. 9. Polyacrylamide gel electrophoresis
  • SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) for peptides was performed as described by Swank and Munkres, 1971, Anal. Biochem. 39: 462, performed using 13-lane, 160 x 120 x 1.50 mm gels, with 13.8% T, 9.1% C, in the presence of 8 M urea.
  • the proteins were visualized by silver staining (Amersham, Braunschweig).
  • the following proteins were used as the molecular weight standard: polypeptide molecular weight calibration kit (Pharmacia, Freiburg), containing sperm whale myoglobulin 17.2 kD; partial cyanogen bromide cleavage products I + II 14.6 kD; I 8.2 kD; II 6.4 kD; III 2.5 kD; Myoglobulin 1-14 1.7 kD, trypsinogen, PMSF treated, 24 kD; ⁇ -lactalbumin 14.2 kD; recombinant human tumor necrosis factor (TNF) 17 kD and cytochrome C 12.4 kD.
  • the molecular weight of MONAP was determined from an application of R f against log (MG).
  • PMNL Neutrophil stimulating activity
  • Chemotactic PMNL activity of samples was measured using the method of Creamer et al., 1983, Inflammation 7: 321. Boyden chambers (Bio Rad, Kunststoff) were filled with suitably diluted samples, covered with a polyvinyl pyrrolidone-free polycarbonate filter (pore size 3 ⁇ m) and with human PMNL, suspended in PBS, with a content of 0.9 mM CaCl 2 , 0.5 mM MgCl 2 and 1% BSA filled.
  • the Boyden chambers were incubated in a humid atmosphere at 37 ° C for 1 hour. The cover and filter were then carefully removed and migrated Cells remaining in the lower part of the Boyden chamber were dissolved by adding 10 ⁇ l of 1% Triton X-100 (vol / vol) and then incubating for 10 minutes. The entire content (110 ⁇ l) was incubated with 100 ⁇ l 0.01 M p-nitrophenyl- ⁇ -glucuronide (Sigma, Kunststoff) in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 4.0, 18 hours and the enzymatic reaction was carried out by suspension of 200 ul 0.6 M glycine buffer, pH 10, stopped.
  • p-Nitrophenolate was determined at 405 nm using a multi-channel photoneter (SLT 210, Kontron).
  • SLT 210 photoneter
  • dissolved PMNL 5 ⁇ 10 -3 - 2 ⁇ 10 4 cells
  • 110 ⁇ l PBS with a content of 0.1% (vol / vol) Triton X-100) were incubated with the ⁇ -glucuronidase substrate.
  • Chemotactic activity was expressed in PMNL equivalents, which migrated through the filter in 1 hour. Defined chemotaxins (C5a, 50 ng / ml, FMLP 4 ⁇ 10 -9 M, LTB 4 1 ng / ml) were used as controls.
  • the checkerboard analysis of chemokinetic PMNL activity was performed by adding defined concentrations of MONAP to the top and bottom of the Boyden chamber. The number of cells migrated was shown as a function of the MONAP concentration in the upper and lower chambers.
  • Meutrophilic chemotaxis and cheaokinesis studies were performed as described above.
  • the eosinophilic chemotaxis was measured in the same way using a nitrocellulose filter with a 0.45 ⁇ m pore size, followed by a polycarbonate filter (upper filter, nucleopore, pore size 3 ⁇ m) placed at the top End of the lower part of a Boyden chamber. Eosinophilic suspensions containing 10 cells / ml PBS / BSA were placed in the upper part of the chamber.
  • the Boyden chamber was then incubated for 2 hours at 37 ° C in a humid atmosphere.
  • the cells adhering to the nitrocellulose filters were fixed with methanol and according to the method of Kay, 1970, Clin. exp. Immunol. 7: 723, stained using hematoxylin and Chromotrop 2R and attached to glass slides. Cells from 5 statistically evaluated high power fields were counted under a microscope at 400x magnification and the average of two examinations was shown as cells per visual field.
  • Monocyte chemotaxis and statistical migration were examined using the Boyden chamber system using a double membrane filter technique with indirect quantitative evaluation of the migrated cells.
  • Cytoplasmic lactate dehydrogenase was used as the labeling enzyme.
  • the chemotactic activity was presented as a chemotactic index (CI).
  • the lactic acid dehydrogenase release was determined as a control of cell integrity, which in no case exceeded 3% of the total control.
  • Enzyme release activity was expressed either as OD 486 or as a percentage of the 100% control.
  • the cross-activities of PMNL cheaotaxin receptors were examined by preincubating 2 ⁇ 10 7 PMNL alt different chemotaxins at optimal concentrations (C5a: 100 ng / ml; PAF 3 ⁇ 10 -6 M; BOC-Met-Leu-Phe 10 - 5 M; LTB 4 10 -8 M; MONAP 10-1 0 M buffer) for 20 minutes at 37 ° C. This was followed by the addition of cytochalasin B (5 ⁇ g / ml) followed by incubation for 5 minutes at 37 ° C.
  • the cells were then stimulated with various stimuli (C5a, 100 ng / ml; FMLP 4 ⁇ 10 -8 M; PAF 10 -6 M; MONAP 10-1 0 M; LTB 4 10 -8 M, or buffer) and others Incubated for 30 minutes. Finally, the ⁇ -glucuronidase was determined.
  • the reduced cytochrome C in the supernatants was assessed by measuring the absorbances at 474.4 nm and 549.1 nm using vs. Blank samples containing 10 ⁇ g superoxide dismutase at the start of the study.
  • the O- 2 concentrations were calculated by evaluating the SOD-inhibitable cytochrome C reduction after calibration of the
  • MONAP was stable at pH 2.4 - 9 and under mild oxidizing and reducing conditions.
  • PMSF showed no change in biological activity.
  • phenylglyoxal and an arginine-reactive reagent reduced biological activity.
  • the biological activity of MONAP was not, or hardly changed, by heating to 60 ° C and 100 ° C.
  • Purified MONAP could be frozen, stored at 4 ° in 0.1% trifluoroacetic acid, pH 2.4, or lyophilized only with a slight loss of activity. However, storage without additional protein in PBS at 4 ° C (18 hours) resulted in a drastic loss of activity, evidently by binding to the plastic material.
  • the dose-response curves of purified MONAP in the PMNL chemotaxis assay, in the enzyme ( ⁇ -glucuronidase) release assay and in the superoxide anion release assay showed half-maximum stimulation of the PMNL cheaotaxis at 5 ⁇ 10 -1 1 M MONAP.
  • MONAP's checkerboard analysis demonstrated chemokinetic activity in addition to chemotactic activity (Table III).
  • the half-maximal release of azurophilic granule enzymes after pretreatment of PMNL with cytochalasin B took place at 2 x 10 -10 M.
  • O- 2 generation represented by cytochrome C examination, is activated in a dose-dependent manner by MONAP.
  • the amounts of O 2 - released are relatively small and could only be determined using high amounts of PMNL, pretreated with cytochalasin B.
  • MONAP In no case did highly purified MONAP preparations show IL-1 activity; in addition, IL-1, isolated in partially purified form from the RP-18 column, showed no neutrophil stimulating activity.
  • IL-1 isolated in partially purified form from the RP-18 column, showed no neutrophil stimulating activity.
  • cross-desensitization of PMNL reactions after preincubation of PMNL with chemotaxins was carried out. The results showed that the MONAP reactions of PMNL were reduced only when the lines were preincubated with MONAP, but not with the other chemotaxins mentioned.
  • the neutrophil activating peptide can be applied in a locally effective administration, e.g. B. as a solution for chronic inflammatory processes, poorly healing wounds, fistulas, bacterial infections and chronic infections caused by mycotic pathogens, the skin and the underlying tissues.
  • a locally effective administration e.g. B. as a solution for chronic inflammatory processes, poorly healing wounds, fistulas, bacterial infections and chronic infections caused by mycotic pathogens, the skin and the underlying tissues.
  • the strong leukotactic effect leads to cleaning and subsequent healing of the areas.
  • Another area of application extends to the production of monoclonal antibodies for diagnostic purposes. It is possible, by labeling the antibodies, for an in vitro display of activated leukocytes, for. B. to perform tissue sections or smear preparations, and to obtain information about inflammatory processes by detection in the blood. C) Dustibility studies:
  • test agents 10 ⁇ l of test agents, which are listed below, were added to 100 ⁇ l of highly purified MONAP in PBS: 10 mM dithiothreitol, 10 mM sodium dithionite, 1 mM potassium ferricyanide, 10 mM phenylglyoxal and 10 mM phenylmethylsulfonyl fluoride.
  • the samples including a buffer control sample, were diafiltered with 3 ml PBS containing 0.1% BSA on an Amicon YM-5 membrane and half the maximum dose causing neutrophil chemotaxis ( EC 50 ) was evaluated by determining five dilutions (in duplicate).

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Description

Neutrophilen aktivierendes Polypeptid, Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung als Arzneimittel und Diagnostikum
Die Erfindung betrifft ein Neutrophilen aktivierendes Polypeptid, das aus humanen mononukleären Zellen isoliert wurde. Dieses Polypeptid ist aktiv für humane neutrophile Granulozyten und ist daher geeignet als Arzneimittel, insbesondere zur Steigerung der zellulären Phagozyten-assoziierten Abwehr von Entzündungen sowie zur Stimulation von Granulationsgewebe und der Wundheilung. Darüber hinaus ist es als Diagnostikum zur Testung der Reaktionsfähigkeit der neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten in vivo oder in vitro sowie als Reagens zur Herstellung monoklonaler Antikörper unter Verwendung als Antigen geeignet.
Ein von humanen Monozyten freigesetzter polymorphkernige Leukozyten (PMNL) aktivierender Faktor ist bekannt. Dieser Faktor scheint neben der Chemotaxis (T.Tono-oka et al., 1980, Immunology 39: 607) die PMNL-Degranulation (Klemper et al., 1978, J. Clin. Invest. 61 : 1330) sowie den sauerstoffabhängigen Metabolismus zu aktivieren (Klempner et al., 1979, J. Clin. Invest. 64: 996). Spätere Untersuchungen ergaben, daß partiell gereinigte Interleukin-1-Präparationen diese PMNL-stimulierenden Aktivitäten zeigen (Sander et al., 1984, J. Immunol. 132: 828; Smith et al., 1985, J. Leucocyte Biology 37: 746), woraus geschlossen wurde, daß IL-1 ein PMNL-aktivierendes Zytokin darstellt.
IL-1 bezeichnet eine Reihe biochemisch nahe verwandter Cytokine, die von verschiedenen Zelltypen erzeugt werden und umfaßt den Lymphozyten aktivierenden Faktor (LAF), endogenes Pyrogen (EP) endogenen Leukozyten-Mediator (LEM) oder den mononukleären Zellfaktor (MCF) . Es wird angenommen, daß diese Faktoren zahlreiche biologische Effekte bewirken, wie Fieber , die Proliferation von Fibroblasten, die Produktion von akuten Phasen-Proteinen, die Stimulierung des Katabolismus von Muskelprotein und die Neutrophilen Chemotaxis (Dinarello , C.A; 1896 , The Year in Immunology 2 : 68) .
Die IL-1-Aktivität wurde in verschiedenen biochemischen Formen beschrieben, d. h. Species mit 17 kD mit IP 6 ,8 , 5 ,4 und 5 ,2 , sowie Formen mit hohen Molekulargewichten, mit ähnlichen IP-Werten. Es ist jedoch bis heute nicht klar , ob die biologischen Eigenschaften von IL-1 einer einzigen Molekülspecies von IL-1 zugeschrieben werden können oder nicht .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun ein Neutrophilen aktivierendes Peptid (im folgenden auch als MONAP bezeichnet) gefunden, das sich von IL- 1 unterscheidet.
Die Erfindung betrifft daher ein neues , physiologisch aktives Polypeptid mit selektiv-chemotaktischer Wirkung auf neutrophile, polymorphkernige Leukozyten (MONAP) . Sie bezieht sich auch auf das Verfahren zu seiner Gewinnung , sowie auf dieses enthaltende Arzneimittel und auf seine Verwendung .
Das erfindungsgemäße Neutrophilen aktivierende Polypeptid wird aus mit Lipopolysacchariden, Phythämagglutin und/oder Phorbolestem stimulierten humanen mononukleären Zellen isoliert. Es ist homogen und weist ein Molekulargewicht von 10 kD auf , wie ermittelt durch eine einzelne Bande bei Natriumdodecylsulfat-Polyamid-Gel-Elektrophorese und durch einen einzelnen Peak bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Ausschlußchromatographie) . Ein einzelner Peak wurde auch bei der Reversed-Phasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) erzielt .
Das erfindungsgemäße Polypeptid läßt sich chemisch-physikalisch wie folgt definieren : a) es handelt sich um ein Polypeptid; b) nach SDS-Elektrophorese ermitteltes Molekulargewicht: 10 kD; c) nach Ausschlußchromatographie (TSK-2000-HPLC) ermitteltes Molekulargewicht, ebenfalls 10 kD; d) es bindet bei pH 8 an Anionenaustauscher; e) es bindet an "Reversed-Phasen (RP-18)"-Säule; f) es ist unter folgendex: Bedingungen stabil:
1) 10 min/60 ºC
2) 5 min/100 ºC
3) mehrfaches Einfrieren und Auftauen
4) milde Oxidationsmittel (z. B. K3 Fe(CN)6)
5) milde Reduktionsmittel (z. B. Dithiothreitol)
6) pH 2,4 - 9 g) es ist empfindlich gegenüber Phenylglyoxal.
Die Bestimmung der Aminosäuresequenz von MONAP ergab folgenden Aufbau aus 72 Aminosäuren:
SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEK-FLKRAENS
Es ist bis jetzt nicht gesichert/ welcher Teil der Sequenz die biologische Aktivität bewirkt. So lassen sich neben MONAP auch kürzerkettige Peptide isolieren, die die gleichen biologischen Eigenschaften wie die Sequenz aus den 72 Aminosäuren zeigen. Auch längerkettige gleichartig wirkende Peptide lassen sich isolieren' wie das zwischenzeitlich beschriebene LYNAP mit den Pentapeptid-Terminus (AVLPR), an den sich die vorstehende Sequenz aus 72 Aminosäuren anschließt:
(AVLPR)SAKELR...
(Gregory, Young, Schröder, Nrowietz, Christophers, Biochem. and Biophys.
Res. Comm., Vol. 151, No. 2, March 15, 1983, Seiten 883-890). Die analytische i soelektri sche Fokussierung von MONAP zeigt bei einheitlichem Aminoterminus eine Ladungsmi kroheterogeni tät mi t Hauptkomponenten mit isoelektrischen Punkten bei 4,7 , 4,9 , 6,4 und 6,9 , die al le chemotakti sch aktiv sind. Die Ermitt lung erfolgte gemäß Schröder, Mrowietz und Christophers, Biochem. and
Biophys. Res. Comm., Vol. 152, No. 1 , Apri l 15, 1988, Seiten 277-284.
Das erfindungsgemäße neue biologisch aktive Polypeptid besitzt folgende biologische Eigenschaften:
a) es ist chemotaktisch und cheraokinetisch aktiv für humane neutrophile Granulozyten; b) es induziert die Freisetzung lysosomaler Enzyme aus Cytochalasin B vorbehandelten humanen neutrophilen Granulozyten; c) es setzt Super oxid- An ionen aus humanen neutrophilen Granulozyten frei; d) es bindet an einen separaten Rezeptor auf humanen Granulozyten; e) es aktiviert nicht die Chemotaxis humaner Monozyten , eeoossiinnoopphhiilleerr GGrraannuulloozzyytteenn uunndd LLyymphozyten ( < 6 x 10~ M) f) es besitzt keine IL-1 -Aktivität.
Es fällt auf , daß das erfindungsgemäße Polypeptid stabil gegen Erwärmen ist; seine biologische Wirkung wird durch Erwärmen nicht beeinträchtigt. MONAP steht hier im Gegensatz zu IL-1 , dessen Wärmeempfindlichkait bekannt ist.
Die spezifische Aktivität von vollständig gereinigtem MONAP betrug nahezu 10 halbmaximale Chemotaxis-Dosierungen (EC50) / 1 mg MONAP (Volumen: 0 , 1 ml) . MONAP ist daher ein sehr wirksames Chemotaxin für humane PMNL alt einer berechneten EC5 0 von nahezu 5 × 10- 11 M (basierend auf dem Molekulargewicht von 10 kD) . Tatsächlich kann MONAP eine PMNL-Chemotaxis bei Dosierungen bewirken, die etwa 10 bis 40-fach geringer sind als C5a, von dem bekannt ist, daß es eine ECςn von 1 - 3 x 10-9 M hat.
Cross-Desensibilierungsuntersuchungen unter Verwendung bekannter Chemotaxine (C5a, FLMP, LTB4, PAF) zeigen keine
Cross-Reaktion mit derartigen Chemotaxinen.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann wie im folgenden beschrieben hergestellt werden.
Humane mononukleäre Zellen werden stimuliert, insbesondere mit Lipopolysacchariden, Phythämagglutin und/oder Phorbolestem, insbesondere Phorbol-Myristat-Acetat.
Der erhaltene Oberstand wird durch Gelchronatographie gereinigt, worauf sich eine Separation durch HPLC-Kationen-Austauschchrormatographie , HPLC -Ausschlußchromatographie und Reversed-Phasen-HPLC anschließen.
Als mononukleäre Zellen werden insbesondere Monozyten verwendet, die durch Reinigung von venösem Blut erhalten werden können. Derartige Monozyten und ihre Reinigung werden beispielsweise beschrieben von B∅yum, A. 1968 , Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 : 17. Die Stimulation erfolgt bevorzugt mit Lipopolysacchariden, Phythämagglutinin und/oder Phorbolester an Zellkulturen der Monozyten bei 37ºC. Es wird im pH-Bereich von 7-8, z. B. bei 7,4 gearbeitet. Der pH-Wert wird durch einen geeigneten Puffer (z. B. gasförmiges Kohlendioxid) erzielt. Die Stimulation kann z. B. während 24 bis 40 Stunden erfolgen. Der Feuchtigkeitsgrad ist variabel und hängt von den Zellen ab. Beispielsweise kann bei einer Feuchtigkeit von 95 % in einem Luft/Kohlendioxid-Gemisch (5 % Kohlendioxid/95 % Luft) während 24 bis 40 Stunden gearbeitet werden.
Der bei der Inkubation erhaltene überstand wird zur Herstellung von MONAP verwendet. Bevorzugt wird er zunächst gereinigt, was beispielsweise durch Ansäuern auf einen pH-Wert von 2-4, insbesondere 4, erfolgen kann. Beispiele für Säuren sind Trif luoressigslure oder Ameisensäure. Anschließend wird zentrifugiert.
Die Gelfiltration erfolgt an üblichen Säulen mit Sephadex Gelen, bei saurem bis neutralem pH, beispielsweise an G-75-Säulen (Pharmacia), beispielsweise equilibriert mit Ammoniumformi at bei einem pH-Wert von etwa 5.
Die HPLC-Kationenaustauschchromatographie erfolgt bevorzugt im angesäuerten bis neutralem Zustand, beispielsweise bei pH 5. Als Säure kann beispielsweise Ameisensäure dienen.
Die HPLC-Ausschlußchromatographie ertolgt bevorzugt an üblichen Silcasäulen, z. B. an einer TSK-2000-HPLC-Säule, bei pH 2-3.
Die RP-HPLC kann beispielsweise an einer organisch modifizierten Silica-Säule, z. B. an Octadecyl-Silica-Säule erfolgen. Das erfindungsgemäße Polypeptid ist chemotaktisch und chemokinetisch aktiv für humane neutrophile Granulozyten . Es ist geeignet zur Anwendung als Arzneimittel bzw. zur Herstellung pharmazeutischer Präparate . Die Formulierung kann zur systemischen oder lokalen Anwendung in üblicher Weise alt üblichen Hilfs- und Trägerstoffen erfolgen .
Die erfindungsgemäßen MONAP enthaltenden Arzneimittel sind insbesondere geeignet zur Steigerung der zellulären , Phagozyten-assoziierten Abwehr von spezifischen und unspezifischen Entzündungen durch lokale oder systemische Anwendung . Insbesondere hat sich gezeigt, daß MONAP das Granulationsgewebe und die Wundheilung bei lokaler oder systemischer Anwendung stimuliert. Monap kann daher z. B. bei chronische. Entzündungsprozessen, schlechtheilenden Wunden, Fisteln, bakteriellen Infektionen und chronischen durch mykotische Erreger bedingten Infektionen der Haut und der darunterliegenden Gewebe verwendet werden. Die Anwendung kann dabei z. B. in Form einer lokal wirksamen Verabreichung z. B. eine Lösung erfolgen.
MONAP kann jedoch auch als Diagnostikum eingesetzt werden . Durch die Erfindung werden somit auch diagnostische Verfahren umfaßt, bei denen MONAP eingesetzt wird, um die Reaktionsfähigkeit polymorphkerniger Leukozyten zu testen. Der Test kann lokal oder systemisch in vivo durchgeführt werden. Es ist jedoch auch eine Anwendung in vitro möglich. Beispielsweise kann festgestellt werden, ob Leukozyten eine normale Chemotaxis, Enzyefrei setzung oder Proliferation von Sauerstoffradikalen ergeben oder nicht. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit liegt in der Verwendung von MONAP als Reagens. So kann MONAP als Antigen zur Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet werden. Die in üblicher Weise erhaltenen und isolierten MONAP- spezifischen Antikörper können wie in der Literatur bekannt mit Radioisotopen, Enzymen, fluoreszierenden bzw. lumineszierenden Reagent it markiert bzw. gekoppelt werden.
Die so markierten Antikörper können ebenfalls als Diagnostikum eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft daher auch diagnostische Verfahren unter Verwendung der unter Einsatz von MONAP erhaltenen markierten Antikörper, um die MONAP- Konzentrationen in Gewebe oder Blut zu bestimmen.
Die unter Verwendung von MONAP erhaltenen markierten Antikörper lassen sich auch zum Nachweis von MONAP- spezifischen Rezeptoren in Gewebe- und Blutzellβn verwenden. Beispielsweise ist es möglich, durch Markierung der Antikörper eine in vitro-Darstellung von aktivierten Leukozyten z. B. an Gewebsschnitten oder Ausstrichpräparaten durchzuführen, sowie durch Nachweis im Blut Aufschluß über Entzündungsvorgänge zu erhalten.
Abgesehen von der diagnostischen Verwertbarkeit der MONAP- spezifischen Antikörper können letztere auch therapeutisch eingesetzt werden. Sie sind beispielsweise geeignet für therapeutische Verfahren zur Unterdrückung zellulärer, Phagozyten-assoziierter Immunreaktionen, da durch die Anwendung MONAP- spezifischer Antikörper oder Antagonisten die Wirkung von MONAP auf die immunologische Abwehrreaktion des Organismus inhibiert bzw. antagonisiert wird.
Das erfindungsgemäße Peptid eignet sich somit ausgezeichnet als Arzneimittel und Diagnostikum; es kann jedoch auch als Reagens zur Herstellung von MONAP- spezifischen monoklonalen Antikörpern verwendet werden, die ihrerseits wieder für pharmazeutische und/oder diagnostische Zwecke Verwendung finden können.
Im folgenden wird eine genauere Spezifizierung der praktischen Herstellung end Charakterisierung von MONAP in Form von Beispielen angegeben.
A) Herstellung von MONAP:
1. Reinigung der Monozyten
Die Reinigung der Monozyten erfolgte gemäß der vorstehend ganannten Literaturstelle Bt∅yum, A. 1968. Mit 1 aM EDTA antikoaguliertes venöses Blut wurde mit isotonischer Salzlösung auf 1 : 2 verdünnt, mit Ficoll-Trennmedium (Biochrom, Berlin) unterlegt und 35 Minuten mit 400 × g bei 20 ºC zentrifugiert. Anschließend wurde die mononukleäre Zellen enthaltende Grenzphase gewonnen und die Monozyten wurden durch reversible Bindung an humanes Fibronectin an einer mit Gelatine überzogenen Kunststoffoberfläche gemäß Freundlich und Avdalovic ( 1983 , J. Immunol . Methode , 52 : 31 ) gereinigt .
Die so erhaltenen Monozyten zeigten eine Reinheit von 95 ± 4 % (alpha-Naphthyl-acetat-esterase ) . Die verunreinigenden Zellen waren vorwiegend T-Lymphozyten ( 2 , 1 ± 3 %) (Leu M I monoklonales Antikörper-Staining) . Das Monozytenpräparat war Irei von Neutrophilen und enthielt weniger als 10 % Blutplättchen. Lebensfähigkeit über 97 % (Trypan-Blau-FarbstoffExklusionstest) .
2. MONAP-Herstellung
Periphere Blutaonozyten, wie vorstehend erhalten, wurden in Gewebekulturkolben (Falcon) in einer feuchten Atmosphäre mit einem Gehalt von 5 % CO2 bei 37 ºC in Medium 199 mit einem Gehalt von Earles-Salzen und 20 mM HEPES (Zelldichte = 1-2 × 106 Zellen/ml) eingebracht. Nach anfänglicher Inkubation von 1 Stunde, Entfernen der nicht-haftenden Zellen und dreifacher Wäsche-mit Medium 199 , wurden 50 ng/ml PMA zugesetzt und die Monozyten wurden weitere 2 - 12 Stunden kultiviert . Anschließend wurden Lipopolysaccharide aus Salmonella minnesota RE 595 (Calbiochem, Marburg) zugesetzt ( 1 ng/ml) und die Kulturen wurden bei 37 ºC und 95 % Feuchtigkeit in 5 % CO2/95 % Luft inkubiert. Die konditionierten Mediam wurden nach 24 - 40 Stunden Inkubation gesammelt und unter -70 ºC bis zur chromatographischen Trennung gelagert.
3. Reinigung von MONAP
Alle Reinigungsvorgänge wurden, soweit möglich, bei 4 ºC durchgeführt. 50 - 700 ml Inkubations-Überstände wurden nicht länger als 2 Wochen bei -70 ºC gelagert. Sie wurden aufgetaut, mit Trifluoressigsäure oder Ameisensäure auf pH 4 eingestellt und anschließend durch Zentrifugieren geklärt. Die überstände wurden auf das 100 - 400-fache an einer Amicon YM-5-Membrane konzentriert und durch Zentrifugieren geklärt.
4. Gelfiltrationschromatographic
3 ml konzentriertes Inkubationsmedium wurden auf eine 2,6 × 75 cm G-75 (Pharmacia)-Säure, equilibriert mit 0,05 M Amaoniumformiat, pH 5, aufgebracht, Es wurde mit Ammoniumformiat mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/h eluiert und es wurden Fraktionen von 5 ml gesammelt. Fraktionen mit neutrophil stimulierender Aktivität (Chemotaxis, Enzymfreisetzung) wurden unter Verwendung von Amicon YM-5-Membranen konzentriert und anschließend chromatographiert oder bei -70 ºC gefroren.
Die Säule wurde mit folgenden Proteinen kalibriert: Rinderalbuain 60 kD; Ovalbumin 45 kD; Myoglobulin 17 kD; Ribonuclease A 13,8 kD und Cytochrome C 12,4 kD. Das Molekulargewicht von MONAP wurde auf einer Grafik von Kav/log (MG) ermittelt.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführt.
5. CM-Ionenaustauschchromatographie
80 - 300 ml roher überstände, angesäuert mit Ameisensäure auf den pH 5, wurden konzentriert unter Verwendung von Amicon YM-5-Membranen und einer Diafiltration gegen 0,01 M Ammoniumformiat, pH 5,0, unterworfen. Die Proben wurden zentrifugiert, auf eine vorher mit 0,01 M Ammonluaformiat equilibrierte TSK CM-3SW-HPLC-Säule (7,5 × 150 mm) aufgebracht und nach der Wäsche mit 10 ml 0,01 Ammoniumformiat, pH 5, mit einem 30-ml-Gradienten von 0,01 bis 0,5 M Ammoniumformiat eluiert. HPLC wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt und es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Proben jeder Fraktion wurden auf MONAP-Aktivität getestet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführt.
6. DEAE-Ionenaustauschchromatographie
20-80 ml Oberstände wurden konzentriert unter Verwendung von Amicon YM-5-Membranen, gegen 0,02 M Tris/Natriumacetat, pH 8 ,0, diafiltriert. Die Proben wurden zentrifugiert und auf eine TSK DEAE-5 PW-HPLC-Säule (LKB, 7,5 × 75 mm) , die vorher mit 0,02 M Tris-acetat, pH 8 (Puffer A) equilibriert worden war, aufgebracht. MONAP wurde nach der Wäsche der Säule mit 15 ml Puffer A mit einem Gradienten (5 ml) von 0,02 M Tris-acetat mit einem Gehalt von 0,5 M Natriumacetat (Puffer B) eluiert, worauf eine isokratische Elution ( 5 ml) folgte und mit einem Gradienten ( 15 al) bis 100 % Puffer B, gefolgt von einer weiteren isokratischen Elution mit B.
Die HPLC wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml /min durchgeführt und es wurden Fraktionen von 1 ml gessmmelt. Proben jeder Fraktion wurden zur Untersuchung auf MONAP entnommen.
7. Ausschluß-HPLC (TSK 2000-HPLC)
Biologisch aktive Fraktionen von CM-TSK-HPLC-Ansätzen oder rohen mit Trifluoressigsäure angesäuerten überständen wurden lyophilisiert oder auf 0 ,3 - 0,5 ml konzentriert und auf eine TSK-2000-Ausschluß-HPLC -Säule (LKB, 0,8 × 60 cm) , equilibriert mit 0, 1 % (Vol/Vol) Trifluoressigsäure in Wasser, aufgebracht. MONAP wurde mit 0,1 % Trifluoressigsäure eluiert. Die Chromatographie wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt und es wurden Fraktionen von 0 ,5 ml gesammelt. Proben jeder Fraktion wurden zur biologischen Bewertung (Chemotaxis oder Enzymfreisetzung) entnommen . Die Säule wurde mit folgenden Proteinen (Sigma) kalibriert : Myoglobulin 17,4 kD, Ribonuclease A 13 ,7 kD, Cytochrome C 12 ,4 kD, Aprotinin 6 ,5 kD, Insulin 3 ,5 kD und Tet apeptid Val Gly Ser Glu 0,5 kD. Die Molekulargewichte von MONAP wurden aus einem Auftrag der Elutionszeit gegen log (MG) ermittelt.
8. Reversed-Phasen-Hochdruckflüssigkeltschromatographie (RP-HPLC)
Die HPLC wurde an einem chromatographischen Speetra-Physics¬
Sy stem mit 4 ,6 × 250 mm Nucleosil - 5 μm - einer Reversed¬
Phasen-Octadecyl-silica-Säule durchgeführt. Die Blution wurde unter Verwendung eines Kratos UV-Detektors bei 215 ML überwacht. Die Peakflächen wurden durch eine Spectra-Physics
SP 4270-Integrator berechnet.
Das Lösungsmittel A war 0, 1 % Trifluoressigsäure in Wasser und das Lösungsmittel B war 0, 1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril. Die Säule wurde mit 10 % B in A equilibriert. MONAP enthaltende Fraktionen von TSK 2000-HPLC wurden gepoolt, konzentriert und auf die Säule injiziert. MONAP wurde mit einem 2-Slope-Gradienten eluiert: 10 bis 40 % B in 30 Minuten, gefolgt durch 40 bis 100 % B in 10 Minuten. Peakfraktionen wurden manuell gesammelt. Proben wurden für SDS-PAGE sowie für MONAP- und LAF/IL-1-Bioassay entnommen. Die Proben wurden unter -70 ºC gelagert oder lyophilisiert und für die weitere Anwendung in geeigneten Puffern erneut gelöst. 9. Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) für Peptide wurde wie von Swank und Munkres, 1971, Anal. Biochem. 39: 462, beschrieben, durchgeführt unter Verwendung von 13-lane, 160 × 120 × 1,50 mm Gels, mit 13,8 % T, 9,1 % C, in Anwesenheit von 8 M Harnstoff. Als Elektrophoresepuffer wurde 0,1 M Phosphorsäure, eingestellt mit Tris auf pH 6,8, mit einem Gehalt von 1 % (Gew./Vol.) SDS, verwendet. Die Proteine wurden durch Silber-Staining visualisiert (Amersham, Braunschweig). Die folgenden Proteine wurden als Molekulargewichtsstandard verwendet: PolypeptidMolekulargewichts-Kalibrations-Kit (Pharmacia, Freiburg), enthaltend Sperm-Whale-Myoglobulin 17,2 kD; partielle Cyanogen-Bromid-Spaltungsprodukte I + II 14,6 kD; I 8,2 kD; II 6,4 kD; III 2,5 kD; Myoglobulin 1-14 1,7 kD, Trypsinogen, PMSF behandelt, 24 kD; α-Lactalbumin 14,2 kD; rekombinanter humaner Tumor-Nekrosefaktor (TNF) 17 kD und Cytochrom C 12,4 kD. Das Molekulargewicht von MONAP wurde aus einem Auftrag von Rf gegen log (MG) ermittelt.
10. Ergebnisse
Herstellung der PBM-Überstände
Die Verarbeitung von 500 ml Blut ergab gereinigte Monozyten für die Herstellung von 100 ml mit MONAP angereicherten Überständen, die typischerweise 8 - 12 × 104 Dosierungen zur Stimulierung der halbmaximalen PMNL-Chemotaxis (EC50) enthielten. Der Proteingehalt, die Aktivität und die berechnete Ausbeute für jede Stufe der MONAP-Reinigung sind in der folgenden Tabelle I angegeben.
Reinigung von menschlichem MONAP
Untersuchungen haben gezeigt, daß die Konzentration der rohen überstände am günstigsten bei pH 3-4 durchgeführt wird.
Der Durchlauf an angesäuerten überständen durch Sephadex G-75 unter Verwendung von 0,05 M Ammoniumformiat, pH 5, als Eluierpuffer war wirksamer als die Verwendung von PBS. Bei der Kationanaustauschchromatographie wurde die MONAPAktivität in den Fraktionen 11-18 eluiert. Bei der Chromatographie wurden 90 % des Proteins entfernt.
Bei der HPLC-Ausschlußchromatographie unter Verwendung der TSK 2000 SW-Säule wurde die MONAP-Aktivität in einem einzigen Peak mit neutrophil stimulierender Aktivität eluiert.
Die RP-HPLC zeigte einen einzigen Peak. SDS-PAGE dieses Materials ergab eine einzige Linie entsprechend einem Molekulargewicht von 10 kD. Dieses Molekulargewicht wurde auch durch TSK 2000 HPLC ermittelt.
B) Charakterisierung von MONAP:
MONAP-Assays:
Die Neutrophilen stimulierende Aktivität (PMNL) wurde auf dreifache Weise gemessen:
Chemotaktische PMNL-Aktivität von Proben wurde unter Verwendung der Methode von Creamer et al., 1983, Inflammation 7: 321, gemessen. Boyden-Kammern (Bio Rad, München) wurden mit geeignet verdünnten Proben gefüllt, mit einem Polyvinyl- pyrrolidon-freien Polycarbonatfilter (Porengröße 3 μm) bedeckt und mit humanem PMNL, suspendiert in PBS, mit einem Gehalt von 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 und 1 % BSA gefüllt.
Die Boyden-Kammern wurden in einer feuchten Atmosphäre 1 Stunde bei 37 ºC inkubiert. Anschließend wurden die Bedeckung und das Filter sorgfältig entfernt und migrierte Zellen, die in dem unteren Teil der Boyden-Kammer verblieben , wurden durch Zusatz von 10 μl 1 % Triton X-100 (Vol/Vol) und anschließendes Inkubieren während 10 Minuten aufgelöst. Der gesamte Gehalt ( 110 μl) wurde mit 100 μl 0,01 M p-Nitrophenyl-ß-glucuronid (Sigma, München) in 0, 1 M Natriumacetatpuffer, pH 4 ,0, 18 Stunden inkubiert und die enzymatische Reaktion wurde durch Susatz von 200 μl 0,6 M Glyzinpuffer, pH 10, gestoppt. p-Nitrophenolat wurde bei 405 nm unter Verwendung eines Mehrkanal-Photoneters (SLT 210, Kontron) bestimat. Zur Eichung wurden auf gelöste PMNL (5 × 10-3 - 2 × 104 Zellen) in 110 μl PBS mit einem Gehalt von 0,1 % (Vol/ Vol) Triton X-100) mit dem ß-Glucuronidasesubstrat inkubiert.
Die chemotaktische Aktivität wurde in PMNL-Äquivalenten dargestellt, die durch das Filter in 1 Stunde wanderten. Definierte Chemotaxine (C5a, 50 ng/ml , FMLP 4 × 10-9M, LTB4 1 ng/ml, wurden zur Kontrolle verwendet.
Die Checkerboard-Analysenbestimmung der chemokinetisehen PMNL-Aktivität wurde durchgeführt durch Zusatz definierter Konzentrationen von MONAP zu dem oberen und dem unteren Teil der Boyden-Kammer. Die Anzahl der migrierten Zellen wurde als eine Funktion der MONAP -Konzentration in der oberen und der unteren Kammer dargestellt.
2. Chemotaxis-Untersuchungen
Meutrophile Chemotaxis- und Cheaokinese-Untersuchungen wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die eosinophile Chemotaxis wurde in gleicher weise gemessen unter Verwendung eines Nitrocellulosefilters mit 0,45 μm Porengröße, gefolgt von einem Polycarbonatfilter (oberes Filter, Nucleopore, Porengröße 3 μm) , plaziert am oberen Ende des unteren Teils einer Boyden-Kammer. Eosinophile Suspensionen mit einem Gehalt von 10 Zellen/ml PBS/BSA wurden in den oberen Teil der Kammer eingebracht.
Anschließend wurden die Boyden-Kammer 2 Stunden bei 37 ºC in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Die an den Nitrocellulosefiltern haftenden Zellen wurden mit Methanol fixiert und nach der Methode von Kay, 1970, Clin. exp. Immunol. 7: 723, unter Verwendung von Hämatoxylin und Chromotrop 2R gefärbt und auf Glasträgern befestigt. Zellen von 5 statistisch bewerteten High Power-Feldern wurden unter einem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung gezählt und das Mittel von zwei Untersuchungen wurde als Zellen pro Gesichtsfeld dargestellt.
Die Monozyten-Chemotaxis und die statistische Wanderung wurden unter Verwendung des Boyden-Kammersystems unter Verwendung einer Doppelmembran-Filtertechnik mit indirekter quantitativer Bewertung der migrierten Zellen untersucht. Als Markierungsenzym wurde cytoplasmische Lactat-Dehydrogenase verwendet.
Die chemotaktische Aktivität wurde als chemotaktischer Index (CI) dargestellt.
3. Enzymfreisetzung
PMNL (107/ml PBS) wurde mit Cytochalasin B (5 μg/ml, Sigma) präinkubiert. Anschließend wurden 100 μl Proben mit geeigneten Verdünnungen zugesetzt und weitere 30 Minuten inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurden 100 ul überstand 18 Stunden mit 100 ul 0 ,01 M p-Nitrophenyl-ß-D-glucuronid in 0, 1 M Natrium acetat, pH 4 , inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zusatz von 200 μl 0 ,4 Mol/l Glyzinpuffer, pH 10 , gestoppt. Die ß-Glucuronidase-Freisetzung wurde als Prozent einer Gesamtkontrolle dargestellt, wobei 0,2 % (Vol/Vol) Triton X-100 statt eines Stimulus (= 100 % Kontrolle) zugesetzt wurde.
In einigen Fällen wurde eine rasche Bestimmung der PMNL-Enzymfreisetzungs-Aktivität durchgeführt, durch Testen der Überstände stimulierter Zellen die Myeloperoxidase-Aktivität (MPO) . 100 μl Überstände wurden mit 100 μl 0,01 M o-Phenylendiamin-dihydrochlorid in 0, 1 M Citrat/Phosphatpuffer, pH 5 , mit einem Gehalt von 0,001 % Wasserstoffperoxid 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zusatz von 100 μl 2 M Schwefelsäure gestoppt und die bräunliche Färbung wurde in Mikrotiterplatten bei 485 nm unter Verwendung eines Mehrkanal-Photpmeters bestimmt . Geeignete
Kontrollen erhielt man durch Inkubieren von Zellen mit C5a (100 ng/ml), FMLP (4 × 10-7 M) , 0,1 % Hexadecyltrimethylammoniumbromid (= 100 % Kontrolle). Die MiIchsäure-Dehydrogenase-Freisetzung wurde als Kontrolle der ZeilIntegrität bestimmt, die in keinem Falle 3 % der Gesamtkontrolle überschritt.
Die Enzymfreisetzungs-Aktivität wurde entweder als OD486 oder als Prozent der 100 % Kontrolle ausgedrückt.
4. Desenaibilisierungs-Untersuchungen
Die Cross-Aktivitäten von PMNL Cheaotaxin-Rezeptoren wurden untersucht durch Präinkubieren von 2 × 107 PMNL alt verschiedenen Chemotaxinen bei optimalen Konzentrationen (C5a: 100 ng/ ml; PAF 3 × 10-6 M; BOC-Met-Leu-Phe 10-5 M; LTB4 10-8 M; MONAP 10- 1 0 M Puffer) während 20 Minuten bei 37 ºC . Anschließend folgte die Zugabe von Cytochalasin B (5 μg/ml) mit anschließender Inkubation während 5 Minuten bei 37 ºC . Dann wurden die Zellen mit verschiedenen Stimuli gereizt (C5a, 100 ng/ml ; FMLP 4 × 10-8 M; PAF 10-6 M; MONAP 10- 1 0 M; LTB4 10-8 M, bzw. Puffer) und weitere 30 Minuten inkubiert . Schließlich wurde die ß-Glucuronidase bestimmt.
5. Erzeugung von Superoridanionen(O-2)
250 μl PMNL-Suspension (8 × 106/ml PBS) mit einem Gehalt von 0,8 mM CaCI2, 0,5 mM MgCl2 und 0,1 % BSA) wurden mit 5 μg/ml Cytochalasin B (5 Minuten bei 37 ºC) vorbehandelt und anschließend mit 500 μl oxidiertem Cytochrom C (Sigma) in PBS/0,1 % BSA und 250 ul der geeigneten Verdünnung des. Stimulus, jeweils vorgewärmt auf 37 ºC, versetzt. Nach 20 Minuten wurde die O-2-Erzeugung durch Kühlen in Eis/Wasser gestoppt, worauf zentrifugiert wurde (400 g/10 min). Das reduzierte Cytochrom C wurde in den Überständen bewertet durch Messen der Extinktionen bei 474,4 nm und 549,1 nm unter Verwendung von vs. Blindproben mit einem Gehalt von 10 μg Superoxid-Dismutase zu Beginn der Untersuchung. Die O-2-Konzentrationen wurden berechnet durch Bewertung der SOD-inhibierbaren Cytochrom-C-Reduktion nach Eichung des
Spectro-Photometers mit völlig reduziertem (Natirumdithionit) und völlig oxidiertem Cytochrom C.
6. Ergebnisse
Die Wirkung verschiedener Mittel und Einflußnahmen auf die MONAP-Aktivität ist in der Tabelle II dargestellt. MONAP war stabil beim pH-Wert 2,4 - 9 sowie unter milden oxidierenden und reduzierenden Bedingungen. Darüber hinaus ergab PMSF keine Änderung der biologischen Aktivität. Jedoch verringerten Phenylglyoxal und ein Arginin-reaktives Reagens die biologische Aktivität.
Durch Erwärmen auf 60 ºC und 100 ºC wurde die biologische Aktivität von MONAP nicht bzw. nahezu nicht verändert.
Gereinigtes MONAP konnte gefroren werden, bei 4 º in 0, 1 % Trifluoressigsäure, pH 2,4 , gelagert werden oder nur unter geringem Aktivitätsverlust lyophilisiert werden. Eine Lagerung ohne zusätzliches Protein in PBS bei 4 ºC (18 Stunden) ergab jedoch einen drastischen Aktivitätsverlust, offensichtlich durch Binden an das Kunststoffmaterial.
Die Dosis-Reaktions-Kurven von gereinigtem MONAP beim PMNL-Chemotaxis-Assay, beim Enzym (ß-Glucuronidase) -Release-Assay sowie beim Superoxid-Anionen-Release-Assay zeigten eine halbmaximale Stimulierung der PMNL-Cheaotaxis bei 5 × 10-1 1 M MONAP. Die Checkerboard-Analyse von MONAP demonstrierte eine chemokinetische Aktivität zusätzlich zur chemotaktischen Aktivität (Tabelle III) . Die halbmaximale Freisetzung von azurophilen Granula -Enzymen nach Vorbehandlung von PMNL mit Cytochalasin B erfolgte bei 2 x 10-10 M.
Die O-2-Erzeugung, dargestellt durch Cytochrom C-Untersuchung wird durch MONAP in dosisabhängiger Weise aktiviert. Jedoch sind die Mengen an freigesetztem O2- relativ gering und waren nur unter Verwendung hoher Mengen von PMNL, vorbehandelt mit Cytochalasin B, feststellbar.
In keinem Falle zeigten hochgereinigte MONAP-Präparate eine IL-1-Aktivität; außerdem zeigte IL-1 , isoliert in teilweise gereinigter Form, aus der RP-18-Säule, keine Neutrophilen stimulierende Aktivität. Um festzustellen, ob MONAP an Chemotaxin-Rezeptoren bekannter Chemotaxine bindet, wurden Cross-Desensibilisierungen von PMNL-Reaktionen nach Präinkubation von PMNL mit Chemotaxinen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß die MONAP- Reafctionen von PMNL nur dann verringert wurden, wenn die Zeilen mit MONAP präinkubiert wurden, jedoch nicht mit den anderen genannten Chemotaxinen.
Es wurde auch festgestellt, daß weder menschliche Monozyten noch Eosinophile stimuliert werden konnten, chemotaktisch in Konzentrationen bis zu 6 × 10-10 M zu migrieren, was die spezifische neutrophile Wirkung von MONAP unter diesen Bedingungen zeigt.
Angewendet werden kann das Neutrophilen aktivierende Peptid in einer lokal-wirksamen Verabreichung z. B. als Lösung bei chronischen Entzündungsprozessen, schlechtheilenden Wunden, Fisteln, bakteriellen Infektionen und chronischen durch mykotische Erreger bedingten Infektionen, der Haut und der darunterliegenden Gewebe. Durch die starke leukotaktische Wirkung kommt es zu einer Reinigung und nachfolgenden Abheilung der Bereiche.
Ein weiteres Anwendungsgebiet erstreckt sich auf die Herstellung monoklonaler Antikörper für diagnostische Zwecke. Dabei ist es möglich, durch Markierung der Antikörper eine in vitro-Darstellung von aktivierten Leukozyten z. B. an Gewebsschnitten oder Ausstrichpräparaten durchzuführen, sowie durch Nachweis im Blut Aufschluß über Entzündungsvorgänge zu erhalten. C) Staubilitätsuntersuchungen:
Zur Untersuchung der chemischen Stabilität wurden 10 μl Testagentien, die im folgenden aufgeführt sind, zu 100 μl hochgereinigtem MONAP in PBS gefügt: 10 mM Dithiothreitol, 10 mM Natriumdithionit, 1 mM Kaliumferricyanid, 10 mM Phenylglyoxal und 10 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. Nach 1 Stunde bei 37 ºC wurden die Proben, einschließlich einer Puffer-Kontrollprobe, mit 3 ml PBS mit einem Gehalt von 0,1 % BSA an einer Amicon YM-5-Membran diafiltriert und die halbe maximale Dosis, die eine neutrophile Chemotaxis hervorruft (EC50), wurde durch Bestimmung von fünf Verdünnungen (im Doppel) bewertet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle II aufgeführt.

Claims

Patentansprüche
1 . Neutrophilen aktivierendes Polypeptid
- isolierbar aus mit Lipopolysacchariden, Phythämagglutin und/oder Phorbolestern stimulierten humanen mononukleären Zellen;
- mit einem Molekulargewicht von 10 000 Dal ton
- nachweisbar durch eine einzelne Bande bei Natriuadodecylsulfat-Polyamid-Gel-Elektrophorese und
- nachweisbar durch einen einzelnen Peak bei der
Ausschluß-Hochdruckflüssigkeitschromatographie; und
- mit einem einzelnen Peak bei Reversed-Phasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie .
2. Verfahren zur Herstellung des Neutrophilen aktivierenden Polypeptids nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch folgende Stufen: a) Stimulation humaner mononukleärer Zellen mit Lipopolysacchariden, Phythämagglutin und/oder Phorbolestern, b) Auftrennung des Überstands mittels Gelchromatographie, e) weitere Separation durch Kationenaustausch-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter sauren Bedingungen, d) anschließende Ausschluß-Hochdruckflüssigkeitschromatographie und e) Reversed-Phasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie
3. Arzneimittel, enthaltend das Neutrophilen aktivierende
Polypeptid nach Anspruch 1 , neben üblichen pharmazeutisch verträglichen Hilfsmitteln und Trägerstoffen.
4. Verwendung des Neutrophilen aktivierenden Polypeptids nach Anspruch 1 als Diagnostikum.
5. Verwendung des Neutrophilen aktivierenden Polypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung monoklonaler Antikörper.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3133305B2 (ja) * 1987-11-19 2001-02-05 ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト 好中球活性化因子
US5652338A (en) * 1988-03-16 1997-07-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Neutrophil chemotactic factor
US5266684A (en) * 1988-05-02 1993-11-30 The Reagents Of The University Of California Peptide mixtures
AU634508B2 (en) * 1988-12-08 1993-02-25 Sandoz Ag Neutrophil-activating peptide-2
US5241049A (en) * 1989-12-22 1993-08-31 Zymogenetics, Inc. Neutrophil chemoattractants
US5182366A (en) * 1990-05-15 1993-01-26 Huebner Verena D Controlled synthesis of peptide mixtures using mixed resins
US5252296A (en) * 1990-05-15 1993-10-12 Chiron Corporation Method and apparatus for biopolymer synthesis
CN1043350C (zh) * 1994-03-15 1999-05-12 中国人民解放军第458医院 心肌细胞生长刺激肽的制备方法
DE19952622A1 (de) * 1999-11-02 2001-05-10 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Interleukin-8 und Interleukin-8 Muteinen

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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