AT400444B - Verfahren zur herstellung von oncostatin m - Google Patents

Description

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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen von Zellbruchstücken und anderen Zellproteinen freiem Oncostatin M, das zur Inhibierung der Proliferation normaler humaner Fibroblasten befähigt ist, das die proliferativen und cytotoxischen humanen T-Zell-Reaktionen nicht inhibiert und die granulozytische/myelozytische Knochenmarkskoloniezelibildung nicht inhibiert, das ein Molekulargewicht von 17 bis 29 kD nach der Bestimmung durch Gelausschlußchromatographie und von etwa 28 kD nach der Bestimmung durch SDS-PAGE aufweist und relativ unempfindlich auf die Behandlung mit mäßiger (bis zu etwa 1N) Säure und Base sowie mit mäßig erhöhten Temperaturen ist und das eine N-terminale Aminosäuresequenz entsprechend der Sequenz der Aminosäurereste 15 10

Ala-Ala-Ile-Gly-ser-cys-ser-Lys-Glu-Tyr-Arg-val-Leu-Leu- 15 20 25

Gly-Gln-Leu-Gln-Lys-Gln-Thr-Asp-Leu-Met-Gln-Asp-Thr-Ser- 30 35 arc-iÄU-Leu- Asp-Pro-Tyr-Ile sowie interne angrenzende Aminosäuresequenzen umfaßt, die die folgenden Sequenzen von Aminosäureresten einschließen i 5 10

Gln-Arg-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Asp-Leu-Giu-Arg-Ser-Gly-Leu 15 20 Asn-Ile-Glu-Aep-Leu-Glu-Lys ! '5 10

Leu-Arg-Glu-Kis-Cys-Arg-Glu-Arg-Pro-Gly-Ala- 2he-?rc-*er· 15 20 Glu-Giu-Thr-Leu- Arg-Gly,

Zur Abstimmung der verschiedenen gebräuchlichen Aminosäureabkürzungen wird am Ende der Beschreibung eine Tabelle mit Angabe des 3-Buchstaben- und 1-Buchstaben-Codes beigelegt.

Leukozyten, sowohl Lymphozyten als auch Monozyten, wurden zur Inhibierung von Tumorwachstum bei verschiedenen tierischen Tumormodellen herangezogen. Das verstärkte Auftreten maligner Fälle bei immunschwachen Menschen unterstützt die Annahme, daß die weißen Blutkörperchen eine Rolle bei der Regulierung neoplastischen Wachstums spielen. Proteinfaktoren, die von diesen weißen Blutkörperchen produziert werden und das Tumorwachstum inhibieren oder die Immunfunktionen verändern, wurden bereits isoliert und charakterisiert und umfassen die Interferone a und γ, den Tumor-Nekrose-Faktor, Lymphotoxin, lnterleukin-2 und andere Lymphokine. Da jeder dieser isolierten Faktoren ein unterschiedliches Wirkungsspektrum hat und in Verbindung mit anderen Faktoren unterschiedlich reagieren kann, besteht weiter ein starkes Interesse an der Isolierung und Charakterisierung all dieser Faktoren, die von den weißen Blutkörperchen produziert werden und das Zellwachstum oder die Immunfunktionen verändern. Diese Verbindungen können einzeln oder gemeinsam bei der Behandlung oder Diagnose von Krebs, zur Unterstützung der Wundheilung oder als Immunomodulatoren zur Behandlung von Patienten mit Immunmängeln, Autoimmunität, Organtransplantationen und dergleichen verwendet werden.

Es bestehen verschiedene Schwierigkeiten, die bei der Entdeckung, Isolierung, Reinigung oder Charakterisierung natürlich auftretender Faktoren angetroffen werden können. Es müssen besondere Verfahren zur Abtrennung und Reinigung eines speziellen Faktors von anderen Faktoren aus dem rohen Ausgangsmaterial entwickelt werden, ohne die Aktivität des gewünschten Faktors zu denaturieren; Bioassays müssen entwickelt werden, die die Identifizierung der Fraktionen während der Abtrennungsvorgänge, die zur Konzentrierung des jeweiligen Faktors dienen, erlauben; ein neuer Faktor muß von anwesenden bereits 2

AT 400 444 B bekannten Faktoren oder von anderen unbekannten Faktoren, die die Wirkung des gesuchten Faktors negativ oder positiv beeinflussen können, unterschieden werden; der gereinigte Faktor muß charakterisiert werden; und der gereinigte Faktor muß in ausreichendem Maße konzentriert werden, um seine Identifizierung und Charakterisierung zu erlauben. Daher wird es bei steigender Anzahl der isolierten Faktoren für jeden neuen Faktor schwieriger, ihn zu identifizieren, da seine Rolle und Funktion durch die zahlreichen anderen anwesenden Faktoren verschleiert werden kann.

Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3, 93-96, berichten die Anwesentheit von Peptiden im menschlichen Urin, die das Wachstum und die DNA-Synthese bei transformierten Zellen stärker inhibieren als bei normalen Zellen. Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1980) 77, 5989-5992, beschreiben die Reinigung von epithelialen Zellwachstumsinhibitoren. Letansky, Biosci. Rep. (1982) 2, 39-45, berichtet, daß aus Rinderplacenta gereinigte Peptide das Tumorwachstum und den Thymidin-Einbau in DNA in Neoplasmen in einem stärkeren Ausmaß inhibieren als bei normalen Zellen. Weiters berichtet Chen, Trends Biochem. Sei. (1982) 7, 364-365, die Isolierung eines Peptids aus der Ascites-Flüssigkeit, das krebsverhindernde Eigenschaften hat. Redding und Schally, Proc. Natl. Acad. Sei. (1982) 79, 7014-7018, berichten die Isolierung von gereinigtem(n) Peptid(en) aus Schweinehypothalmen, das (die) eine antinitogene Wirkung gegen verschiedene normale und gegen Tumorzellinien hat (haben). Sone et al., Gann (1984) 75, 920-928 berichten die Gewinnung eines von menschlichen Makrophagen produzierten Faktors bzw. von Faktoren, die das Wachstum bestimmter Tumorzellen in vitro inhibieren. Ransom et. al Cancer Res. (1985) 45, 851-862 berichten die Isolierung eines Leukoregulin genannten Faktors, der die Replizierung bestimmter Tumorzellinien inhibiert und sich von Lymphotoxin, Interferon und Interleukin 1 und 2 unterscheidet. Die meisten dieser Faktoren wurden bisher noch nicht völlig charakterisiert, noch sind ihre Primärstrukturen bekannt.

Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259, 686-691 reinigten und charakterisierten humanes Lymphotoxin (LT), das von einer Lymphoblastoidzellinie produziert wurde, und sequenzierten anschließend das LT (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1985) 260, 2334.) Gamma-Interferon, (γ-IF), das von Lymphoidzellen produziert wird und immunomodulatorische und tumorinhibierende Eigenschaften hat, wurde geklont und exprimiert (Gray et al., Nature (1982) 295, 503-508). Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), der das Wachstum mancher Tumore inhibiert und durch Makrophagen und bestimmte Leukämie-Zellinien produziert wird, wurde charakterisiert und die TNFcDNA wurde geklont und in E.coli exprimiert (Pennica et al., Nature (1984) 312-724).

Es wird nun ein neuer Peptid-Faktor und biologisch wirksame Fragmente desselben bereitgestellt, wobei dieser Faktor aus Leukozyten erhalten wird. Der Faktor wird zur Modulierung des Zellwachstums verwendet, wie bei der Inhibierung von Tumorzellwachstum und der Stimulierung des Wachstums normaler Fibroblasten, und kann Immunfunktionen verändern. Der Faktor hat eine von den Sequenzen anderer bisher mit ähnlichen Eigenschaften beschriebener Verbindungen unterschiedliche Aminosäuresequenz. Der Faktor wurde als Oncostatin M bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Oncostatin M ist dadurch gekennzeichnet, daß man a) Leukozyten aus einem Säugetier isoliert; b) die isolierten Leukozyten mit einem Induktionsmittel aktiviert und c) aus diesen aktivierten Leukozyten das genannte Oncostatin M frei von anderem Zellmaterial isoliert.

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von Fragmenten von Oncostatin M; Fig. 2 ist eine Reihe von

Fotomikrografien von mit Oncostatin M behandelten Zellen, wobei (A-C) A375-<Melanom-Zellen sind, die mit 0,5 und 100 GIA-Einheiten behandelt wurden und (D-F) W138-Fibroblasten sind, die mit 0,5 und 100 GIA-Einheiten behandelt wurden, und Fig. 3 zeigt eine Aufnahme einer SDS-PAGE-Analyse von Oncostatin M.

Es können auch Polypeptidfragmente gewonnen werden, die neue Polypeptide von mindesten 8 Aminosäuren darstellen, die biologisch aktiv und zumindest immunologisch kreuzreaktiv mit natürlich vorkommendem Oncostatin M sind. Unter dem Begriff immunologisch kreuzreaktiv versteht man, daß ein durch ein neues erfindungsgemäßes Polypeptid induzierter Antikörper eine Kreuzreaktion mit intaktem Oncostatin M eingeht, zumindest wenn Oncostatin M in denaturiertem Zustand vorliegt. Diese Polypeptide sind daher zur Induktion von Antikörpern für Oncostatin M verwendbar, die zur Konzentrationsbestimmung von Oncostatin M in einer Körperflüssigkeit, zur Bindung von Oncostatin M und somit Modulierung von dessen Wirkung und zur Reinigung von Oncostatin M z.B. durch Verwendung in einer Affinitätssäule, brauchbar sind. Ein Teil der Polypeptide kann auch die Zellwachstumsmodulierungswirkung des intakten Oncostatins M behalten, obwohl diese Wirkung im Vergleich zu intaktem Oncostatin M moduliert, in der Regel reduziert werden kann. 3

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Fig. 1 stellt die Amonosäuresequenz der mit dem Oncostatin M kreuzreaktiven Poly(aminosäure)n dar, wobei die erste Sequenz die N-Endstelle des Oncostatin M darstellt.

Die neuen Poly(aminosäure)n enthalten eine Aminosäuresequenz mit zumindest 8 aufeinander folgenden Aminosäuren, die einer in Fig.1 dargestellten Aminosäuresequenz entspricht und sich von dieser Sequenz um nicht mehr als 3, meist nicht mehr als 1 Aminosäure unterscheidet. Der Unterschied kann entweder der Einschub einer Aminosäure, die Deletion einer Aminosäure oder die Substitution einer Aminosäure durch eine andere, insbesondere eine konservative Substitution sein. Meist enthalten die Poly-(aminosäure)n zumindest 10, häufiger zumindest 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren, die den Sequenzen in der Figur entsprechen und sich um nicht mehr als eine Aminosäure unterscheiden.

Zum Zweck der vorliegenden Erfindung werden die verschiedenen Aminosäuren in eine Reihe von Unterklassen eingeteilt. Die folgende Tabelle gibt diese Unterklassen an: aliphatisch neutral unpolar polar sauer basisch aromatisch

GAPVII STCHNQ D E X R

F Η Y W

Unter konservativer Substitution versteht man, daß Aminosäuren derselben Unterklasse (d.h. entweder neutral-aliphatische, sauer-aliphatische, basisch-aliphatische oder aromatische) insbesondere der gleichen Polarität für einander substituiert werden. Wünschenswerterweise bilden Aminosäuren mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder 5 bis 6 Kohlenstoffatomen Monomergruppierungen in der aliphatischen Unterklasse.

Die Poly(aminosäure)n haben in der Länge nicht mehr als 1000 Aminosäuren. Meist haben sie weniger als 100 Aminosäuren, häufiger weniger als 50 Aminosäuren. Daher können die Poly(aminosäure)n leicht synthetisiert werden. In der Regel sind die Po!y(aminosäure)n, wenn sie mehr als 100 Aminosäuren in der Länge haben, Polymere von Oncostatin M-Fragmenten mit weniger als jeweils 100 Aminosäuren oder Fusionsproteine, bei denen das Fragment an ein Antigen, Enzym, Enzymfragment etc, fusioniert ist. Insbesondere können die höhermolekularen Poly(aminosäure)n aus zumindest einem Polypeptidfragment mit weniger als etwa 100 Aminosäuren bestehen, das kovalent an einen großen immunogenen Polypeptid-Träger zur Schaffung der Immunogenität gebunden ist. Beispiele solcher Proteinträger sind Rinderserumalbumin, Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) oder dergleichen. Diese konjugierten Polypeptide sind zur Induzierung von Antikörpern in einem geeigneten Wirtorganismus brauchbar. U937-Ze!len sind eine Zellinie, die von einer histiozytischen Lymphom-Zellinie abgeleitet ist (Sundstrom und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17, 565-577), die zur Differenzierung in Zellen mit Makrophagen-Eigenschaften in Anschluß an eine Behandlung mit einer Vielzahl von Mitteln veranlaßt werden kann (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45, 9-13). Zur Herstellung von Oncostatin M können die U937 Zellen in einem üblichen Nährmedium mit Serum gezüchtet und mit einem geeigneten Induziermittel behandelt werden. Üblicherweise können Phorbole oder Ingenole, insbesondere das 12-0-Tetradecanoylphorboi-13-acetat (TPA) verwendet werden. Meist werden etwa 5-20 ng/ml des Induziermittels eingesetzt. Die anfängliche Zellanzahl liegt bei etwa 105 - 106 Zellen/ml.

Nachdem man die Zellen eine ausreichende Zeit, meist 3 bis 6 Tage lang, mit dem Induziermittel behandelt hat, wird der Überstand entfernt, die Zellen mit serumfreiem Nährmedium gewaschen, die anhaftenden Zellen neuerlich mit serumfreiem Medium gewaschen und die Zellen zumindest 12 h, meist nicht mehr als etwa 48 h in serumfreiem Nährmedium, z.B. RPMI-1640 Medium bebrütet. Die Überstände werden abgenommen und die Zellen zentrifugiert. Die zellfreien Überstände wurden auf ihre Zellwachstumsinhibitionswirkung (GIA) nach den Angaben des Experimentellen Teils untersucht. Der Überstand enthält etwa 50 bis 500 Einheiten GIA/ml (zur Definition der GIA-Einheiten vgl. den Experimentellen Teil).

Oncostatin M kann auch aus mitogen-stimulierten normalen humanen peripheren Blutlymphozyten (PBL) gewonnen werden. BPL können aus Leukozytenfraktionen durch Verdünnen der Fraktionen und Zentrifugieren derselben mit Ficoll Gradienten isoliert werden. Die von der Gradientengrenzfläche gewonne- 4

AT 400 444 B nen Zellen werden gewaschen und schock-lysiert, um die roten Blutkörperchen zu entfernen. Die verbleibenden Zellen werden aus dieser Lösung abzentrifugiert, neuerlich in Puffer mit Serum und Thrombin suspendiert, gerührt und die Plättchen-Aggregate kurze Zeit absetzen gelassen. Die suspendierten Zellen werden übertragen, durch Zentrifugieren gewonnen, neuerlich in Serum suspendiert und in eine Nylon-Wolle enthaltende Säule übertragen. Die Säule wird inkubiert, um das Anhaften der Monozyten und B-Lymphozyten zu ermöglichen, worauf sie gewaschen wird. Die meisten peripheren Blut-T-Lymphozyten haften nicht und werden aus der Säule ausgespült. Diese Zellen wurden bei 37'C in Kulturmedium, z.B. RPMI-1640 Medium gezüchtet und mit einem geeigneten Induziermittel, z.B. Phytohämagglutinin (etwa 1 bis 5 mg/l) etwa 100 h behandelt und die Überstände gewonnen. Die Überstände wurden zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert und durch Ultrafiltration oder Dialyse konzentriert.

Nach der Isolierung zellfreier Überstände entweder aus U937-Zellen oder normalen PBL wird das konditionierte Medium eingeengt, meist durch Verwendung eines Systems von Hohlfasern oder mit einer Ultrafiltrationsmembran, worauf mit Essigsäure (auf eine Konzentration von 0,1 M Essigsäure) verdünnt und anschließend auf das etwa 10-fache konzentriert, dann verdünnt und wieder konzentriert wird. Das Konzentrat kann lyophilisiert und direkt verwendet werden oder das lyophilisierte Produkt wird weiter gereinigt.

Das gegenständliche Oncostatin M kann durch ein Gelpermeationschromatographieverfahren unter Verwendung von wässerigem 40%igem Acetonitril - 0,1 %iger Trifluoressigsäure als isokratische mobile Phase auf einer Bio-sil TSK250 Säule gereinigt werden, wobei die Aktivität jeder Fraktion überwacht wird. Die Reinigung schafft eine Zusammensetzung, die zumindest etwa 0,5 - 5 x 104 GIA Einheiten/ml in den aktiven Fraktionen enthält.

Das teilweise gereinigte Produkt aus der Geipermeationschromatographie kann weiter durch Umkehrp-hasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit einem linearen Gradienten gereinigt werden, wobei das primäre Lösungsmittel 0,1 %ige Trifluoressigsäure in Wasser und das sekundäre Lösungsmittel Acetonitril mit einem Gehalt von 0,1 % Trifluoressigsäure ist. Das Schema kann variiert werden, wobei die Chromatographie, die in der Regel etwa 3 - 4 h erfordert, mit der Hauptzeit von mehr als etwa 50 %, jedoch nicht mehr als etwa 80 % der Zeit, im Bereich von 30 - 45 % des Sekundärlösungsmittels liegt. Unter diesen Bedingungen eluieren die aktiven Fraktionen bei etwa 41 - 42 % Acetonitril.

Die gepoolten aktiven Fraktionen können weiter durch Wiederholung der Umkehrphasen-HPLC gereinigt werden, wobei ein rascherer Wechsel der Gradientenbedingungen und eine langsamere Durchflußrate verwendet werden.

Unter diesen Bedingungen tritt die Aktivität bei etwa 40,5 - 41,5 % Acetonitril hervor.

Die Umkehrphasen HPLC kann mit Veränderung des Lösungsmittelsystems wiederholt werden, wobei das Sekundärlösungsmittel aus n-Propanol-0,1 % Trifluoressigsäure besteht. Es wird ein linearer Gradient verwendet, der langsam im Bereich von 23 - 35 % n-Propanoi geändert wird. Die Hauptaktivität wird im Bereich von 25,5 - 27,5 % Propanol beobachtet und ergibt ein im wesentlichen homogenes Produkt mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 10 GIA-Einheiten/ng Protein. In der Regel wird das Produkt gereinigt, um eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 100 GIA-Einheiten/ng Protein, häufiger 150 GIA-Einheiten/ng zu ergeben.

Die gegenständlichen Verbindungen sind durch ein Molekulargewicht von etwa 17 bis 19 kiloDalton (kD), insbesondere etwa 18 kD, bestimmt durch Größenausschlußchromatographie, gekennzeichnet. Die gegenständlichen Verbindungen sind weiters dadurch gekennzeichnet, daß sie ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 28 kD, bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen, aufweisen.

Die Amonosäure-Sequenz der Fragmente des gereinigten Oncostatin M wurde analysiert. Oncostatin hat im wesentlichen die in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenzen. Unter Bezugnahme auf Fig. 1 zeigt die erste Sequenz die N-Endstelle von Oncostatin M, während die anderen Sequenzen die inneren Fragmente des Polypeptids zeigen.

Aktive Präparationen von isoliertem Oncostatin M enthielten eine Mischung von mit Mannose und Komplex M hochverknüpftem Oligosaccarid. Die nicht-glykosylierten Präparationen von Oncostatin M behielten jedoch ihre Zellwachstumsmodulationswirkung.

Oncostatin M ist weiters durch seine Wirkung gegenüber bestimmten Zellstämmen gekannzeichnet. Das gegenständliche Polypeptid hat keine zytotoxische Wirkung gegen die humanen Fibroblasten W 126 und W 138, die Mäusezellen L929, die auf Tumor-Nekrose-Faktor empfindlich sind, und eine γ-lnterferon-empfindliche humane Tumorzellinie. Es wurde auch gefunden, daß es die Proliferation normaler humaner T-Lymphozyten oder die granulozytische/myelozytische Koloniebildung von Knochenmarkszellen bei Konzentrationen bis zu 100 GIA-Einheiten/ml nicht inhibiert. Weiters stimuliert das Oncostatin M die Proliferation normaler humaner Fibroblasten, wie beispielsweise der Zellen W138 und W126, inhibiert die Proliferation 5

AT 400 444 B von Tumorzellen, wie von A375, HBT10, A549 und SK-MEL28 und kann das Wachstum koloniebildender Zellen aus normalem Knochenmark verstärken. Oncostatin M unterdrückte nicht die humanen proliferativen oder zytotoxischen T-Zellen-Reaktionen in gemischten Leukozyten-Kultur-Reaktionen (MLC) bei Konzentrationen von 500 GIA-Einheiten/ml.

Das gegenständliche Polypeptid wurde bei mäßig sauren und basischen Bedindungen und einer Hitzebehandlung bei 56 *C als stabil befunden.

Die Aminosäuresequenz des gegenständlichen Polypeptids kann vollständig durch Verwendung handelsüblicher Sequenziereinrichtungen bestimmt werden. Das Polypeptid kann dann nach bekannten Verfahren unter Verwendung automatisierter Synthesizer, die ebenfalls im Handel erhältlich sind, bestimmt werden.

Andererseits kann das gegenständliche Polypeptid durch rekombinierende DNA-Verfahren hergestellt werden. Aus einer partiellen Aminosäuresequenz können Sondierungsproben abgeleitet werden, die zur Sichtung einer Humangenom-Bank verwendet werden können. Die Bank kann eine cDNA-Bank oder eine Chromosomen-Bank sein. Wenn der (die) Klon(e) einmal als übereinstimmend mit der Probe identifiziert wurde(n), können die das interessierende Gen enthaltenden Fragmente in verschiedener Weise identifiziert und vielfach manipuliert werden. Das Fragment kann durch Endonuclease-Restriktion in seiner Größe reduziert werden, wobei die entstehenden Fragmente geklont und auf die Anwesenheit des gewünschten Gens untersucht werden können. Die das gewünschte Peptid oder größere Mengen des gewünschten Peptids produzierenden Zellen können zur Produktion von Boten-RNA verwendet werden. Aus der Boten-RNA kann einzelstängige cDNA hergestellt werden. Die cDNA kann dann zu totaler Boten-RNA aus einer Zelle, die, wenn überhaupt, nur wenig des Polypeptids produziert, vergütet werden. Die nichtvergütete cDNA kann isoliert und zur Herstellung von ds cDNA verwendet werden, die mit den Proben verglichen werden kann.

Andererseits können die DNA-Fragmente in Xgt11 eingeführt werden, sodaß im Rahmen mit dem ß-Galactosidase-Gen und abwärts von diesem codierende Fragmente vorliegen. Antikörper für das Polypeptid Oncostatin M können hergestellt und zur Überprüfung der entstehenden fusionierten Proteine auf Kreuzreaktivität verwendet werden. Auf diese Weise können Fragmente, die für das gegenständliche Polypeptid codieren, oder Fragmente desselben identifiziert und zur Identifikation des gewünschten Gens verwendet werden.

Sobald ein komplettes Gen entweder als cDNA oder als chromosomale DNA identifiziert wurde, kann es auf verschiedenste Weise behandelt werden, um Expressionen zu schaffen. Wenn das Gen in einem Wirt exprimiert werden soll, der die Wild-Typentranskriptionellen und translationellen Regulationsbereiche des Oncostatin M erkannt hat, kann das ganze Gen mit seinen WildTyp-5'- und 3'-Regulationsbereichen in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden. Es gibt verschiedene Expressionsvektoren, die Replikationssysteme für Säugetier-Viren verwenden, wie für das Simian Virus 40, Adenovirus, Rinderpapillom-Virus, Vakzin-Virus, Insekten-Baculovirus etc. Diese Replikationssysteme wurden entwickelt, um Marker zu schaffen, die eine Selektion von Transfectanten erlauben, sowie günstige Restriktionsstellen schaffen, in die das Gen eingesetzt werden kann.

Wenn das Gen in einem Wirt exprimiert werden soll, der die natürlich vorkommenden wild-typen-transkriptionellen und translationellen Regulationsbereiche nicht erkennt, ist eine weitere Behandlung erforderlich. Günstigerweise sind verschiedene 3'-transkriptioneile Regulationsbereiche bekannt und können unterhalb der Stop-Codone eingesetzt werden. Die nichtcodierende 5'-Region oberhalb des strukturellen Gens kann durch Endonuclease-Restriktion, Bal31-Resektion oder dgl. entfernt werden. Andererseits kann, wenn eine geeignete Restriktionsstelle nahe der 5'-Endstelle des Strukturgens vorliegt, das Strukturgen restringiert und ein Adapter verwendet werden, um das Strukturgen an die Promotor-Region zu knüpfen, wo der Adapter für die verlorenen Nucleotide des Strukturgens sorgt. Verschiedene Strategien können zur Schaffung einer Expressionskassette eingesetzt werden, die in der 5'-, 3'-Richtung der Transkription einen transkriptionellen und translationellen Initiationsbereich hat, der auch Regulationssequenzen enthalten kann, die die Regulationsinduktion, das Strukturgen unter der transskriptionellen und translationellen Kontrolle der Initiationsregion und eine transkriptioneile und translationelle Abschlußregion erlauben.

Beispiele transkriptioneller Initiationsregionen oder Promotoren umfassen für Bakterien den jS-Gal-Promotor, den TAC-Promotor, Lambda links- und rechts-Promotoren, etc.; für Hefen glykolytische Enzympromotoren, wie ADH-I- und Il-Promotoren, den GPK-Promotor und PGI-Promotor, TRP-Promotor etc.; für Säugetierzellen die frühen und späten SV40 Promotoren, den Adenovirus Major Late Promotor etc. Wie bereits angedeutet, kann die Expressionskassette in einem Replikationssystem für episomale Bewahrung in einem geeigneten zellulären Wirt enthalten sein oder kann ohne Replikationssystem vorgesehen sein, wobei sie in das Genom des Wirts integriert werden kann. Die DNA kann nach bekannten Verfahren in den Wirt eingebracht werden, wie durch Transformation unter Verwendung von mit Calciumphosphat gefällter DNA, 6

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Transfection durch Kontakt der Zellen mit dem Virus, Mikroinjektion der DNA in Zellen oder dgl.

Sobald das Strukturgen in den geeigneten Wirt eingebracht wurde, kann der Wirt gezüchtet werden und das Strukturgen exprimieren. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, für eine Signalsequenz (secretory leader) oberhalb von und im Leserahmen mit dem Strukturgen zu schaffen, die die Sekretion des Strukturgens und Spaltung des secretory leaders bewirkt, um das reife Polypeptid im Überstand zu schaffen. Wenn für eine Sektretion nicht Sorge getragen wurde, können die Wirtszellen geerntet, nach bekannten Verfahren lysiert werden und das gewünschte Produkt isoliert und nach bekannten Verfahren, wie Chromatographie, Elektrophorese, Lösungsmittelextraktion oder dgl., gereinigt werden.

Die gegenständlichen Verbindungen können auf vielfache Weise, sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden. Die gegenständlichen Verbindungen können zur Herstellung von Antikörpern für sich selbst verwendet werden, die in vivo oder in vitro Verwendung finden können. Die Antikörper werden auf übliche Weise entweder durch Verwendung des gegenständlichen Polypeptids als Immunogen und Injizie-rung des Polypeptids in einen Säugetierwirt, z.B. eine Maus, Kuh, Ziege, ein Schaf, Kaninchen etc. insbesondere unter Zusatz eines Hilfsmittels, z.B. des vollständigen Freund-Hilfsmittels, von Aluminiumhydroxid-Gel oder dgl., hergestellt werden. Der Wirt kann dann ausgeblutet werden und das Blut zur Isolierung der polyklonalen Antikörper verwendet werden oder, im Fall der Maus, können die peripheren Blutlymphozyten oder Milz-Lymphozyten (B-Zellen) zur Fusion mit einer geeigneten Myelomzelle zur Immortalisierung der Chromosomen verwendet werden, um monoklonale Antikörper zu exprimieren, die für die gegenständlichen Verbindungen spezifisch sind.

Sowohl die polyklonalen als auch die monoklonalen Antikörper können hergestellt werden und können dann zur Diagnose oder zur Feststellung der Anwesenheit der gegenständlichen Polypeptide in einer Probe verwendet werden, so z.B. in Zellen oder einer physiologischen Flüssigkeit, wie z.B. Blut. Die Antikörper können auch bei der Affinitätschromatographie zur Reinigung der gegenständlichen Polypeptide und Isolierung derselben aus natürlichen oder synthetischen Quellen verwendet werden. Die Antikörper können auch bei der Kontrolle der Menge des gegenständlichen Polypeptids in Kombination mit Zellen in Kultur oder in vivo verwendet werden, wobei das Wachstum der Zellen verändert werden kann.

Die gegenständliche Verbindung kann als ein Ligand zur Bestimmung der Anwesenheit von Rezeptoren für die gegenständliche Verbindung verwendet werden. Auf diese Weise können Zellen je nach der Anwesenheit und Dichte von Rezeptoren für die gegenständliche Verbindung unterschieden werden, wobei die Wirkung der verschiedenen Verbindungen auf die Anwesenheit solcher Rezeptoren überwacht wird.

Die gegenständliche Verbindung kann in in vitro Kulturen zur Inhibierung des Zellwachstums von Zellinien verwendet werden, die auf das gegenständliche Polypeptid empfindlich sind zum Unterschied von Zellen, die nicht empfindlich sind. Auf diese Weise können heterogene Zellmischungen oder Zellinien von unerwünschten Zellen befreit werden, wenn die unerwünschten Zellen auf die gegenständlichen Polypeptide empfindlich sind. Das gegenständliche Polypeptid kann im Fall neopiastischer Bedingungen in vivo verabreicht werden, beispielsweise durch Injektion, auf intralesionale, peritoneale, subcutane oder dgl. Weise. Die gegenständliche Verbindung kann in vitro zur Abtrennung maligner Zellen aus Mark zur autologen Marktransplantation oder zur Inhibierung der Proliferation oder Eliminierung maligner Zellen in anderem Gewebe, z.B. Blut, vor der Reinfusion verwendet werden.

Das gegenständliche Polypeptid kann auch zu einer Wundbehandlung verwendet werden, wie für Hautwunden, Hornhautwunden und verschiedene andere epitheliale und stromale Verletzungen, wie chronische Geschwüre, Verbrennungen, chirurgische Einschnitte, traumatische Wunden und Verletzungen der epithelial ausgekleideten Hohlorgane, wie Speiseröhre, Magen, Dick- und Dünndarm, Mund, Genitalien und Harntrakt. Das Verfahren beruht auf der topischen Anwendung einer Behandlungszusammensetzung, die Oncostatin M in einem physiologisch verwendbaren Träger beinhaltet.

Diese Zusammensetzung kann zur Behandlung einer großen Vielzahl von Wunden, inklusive praktisch aller Hautwunden, Hornhautwunden und Verletzungen der epithelial ausgekleideten Hohlorgane des Körpers verwendet werden. Zur Behandlung geeignete Wunden sind u.a. jene, die von Traumen, wie Verbrennungen, Abschürfungen, Schnitten und dgl. stammen, sowie von chirurgischen Eingriffen, wie chirurgischen Einschnitten und Hautverpflanzungen. Andere zur Behandlung mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignete Zustände umfassen chronische Zustände, wie chronische Geschwüre, diabetische Geschwüre und andere nichtheilende (trophische) Zustände.

Oncostatin M kann zur Aufbringung auf die befallenen Stellen in physiologisch verwendbare Träger eingearbeitet werden. Die Art dieser Träger kann in weitem Maße variieren und hängt von der beabsichtigten Locierung der Anwendung ab. Für Anwendungen auf der Haut wird normalerweise eine Creme oder Salbe bevorzugt, wobei geeignete Grundlagen Lanolin, Silvaden (Marion), insbesondere für die Behandlung von Verbrennungen, Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) und dgl. sind. Gewünsch-tenfalls ist es möglich, Oncostatin M enthaltende Zusammensetzungen auf Bandagen und andere Wundver- 7

AT 400 444 B bände aufzubringen, um die Wunde dauernd dem Peptid auszusetzen. Aerosol-Anwendungen können ebenso Verwendung finden.

Die Konzentration des Polypeptids in der Behandlungszusammensetzung ist nicht kritisch. Das Polypeptid wird in einer Menge vorliegen, die zur Induzierung der epithelialen Zellproliferation ausreicht. Die Zusammensetzungen werden topisch auf die befallenen Stellen, typischerweise als Augentropfen in das Auge oder als Cremen, Salben oder Lotionen auf die Haut aufgebracht. Im Fall des Auges ist eine häufige Behandlung wünschenswert, meist ein Aufbringen in Intervallen von 4 h oder weniger. Auf der Haut ist es wünschenswert, die Behandlungszusammensetzung während des Heilens auf der befallenen Stelle zu belassen, wobei die Anwendung zwei bis vier mal pro Tag oder häufiger erfolgt.

Die verwendete Menge an gegenständlichem Polypeptid hängt von der Art der Verabreichung, der Verwendung anderer Wirkstoffe und dergleichen ab und liegt meist im Bereich von etwa 1 ug bis 100 u.g. Das gegenständliche Polypeptid kann mit einem physiologisch, verwendbaren Träger, wie einer Salzlösung, phosphatgepufferten Salzlösung oder dgl. verwendet werden. Die Menge an verwendeter Verbindung wird empirisch festgelegt, basierend auf der Reaktion der Zellen in vitro und der Reaktion von Versuchstieren auf die gegenständlichen Polypeptide oder auf dieselben enthaltende Formulierungen. Die gegenständlichen Verbindungen werden an sich oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren oder -Inhibitoren oder Immunomodulatoren, wie TNF, IL-2, γ-lnterferon, monoklonalen Antikörpern etc. verwendet. Die Mengen dieser anderen Verbindungen liegen meist im Bereich von 1 ug bis 100 ug. Konjugate der gegenständlichen Verbindungen mit stellungsweisenden Gruppierungen, z.B. Antikörpern, können hergestellt werden, wenn die Antikörper für spezielle maligne Zeilen oder Organe spezifisch sind.

Die folgenden Beispiele werden als Erläuterung, nicht als Einschränkung der Erfindung dargelegt.

Experimenteller Teil

Materialien und Methoden

Oncostatin M, isoliert aus U937 Zellen.

Herstellung eines Tumorzellen-Wachstumsinhibitors aus einer histiozytischen Lymphom-Zellinie. U937 Zellen, eine histiozytische Lymphom-Zellinie (Sundstrom und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17, 565-577), wurden in 850 cm2 Rollflaschen (Corning C2540) mit einer Konzentration von 4x105 Zellen/ml in einem Gesamtvolumen von 300 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% Fötalem Kalbsserum (FCS), Penicillin/Streptomycin(PS), L-Glutamin und 10 ng/ml 12-0-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) gezüchtet. Vier Tage später wurden die das FCS und TPA enthaltenden Überstände entfernt, die Rollfiaschen fünf mal mit serumfreien RPMI 1640 gewaschen und die sich ablösenden Zellen (1 x 105 Zellen/ml) 3 mal mit serumfreiem Medium gewaschen und in die Flaschen zurückgebracht, wobei ein Endvolumen von 125 ml serumfreiem RPMI Medium pro Rollflasche entstand. 1 Tag später wurden die Überstände abgenommen, zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert und über 0,45 am Nalgen-Filter filtriert, worauf unter Verwendung eines Hohlfasersystems (Amicon Kartusche HIP10-20) auf ein Volumen von 150 ml eingeengt wurde (Ausgangsvolumen 1500 ml). Auch aus den Überständen der mit serumfreiem TPA behandelten U 937 Zellen in 150 cm2 Gewebekulturflaschen wurde Oncostatin M isoliert. Der Überstand wurde mit einer Amicon Diaflo Membran PM-10 eingeengt, 10 kD abgetrennt und diaiysiert. Im Anschluß an die Dialyse wurde das Konzentrat mit Essigsäure verdünnt, wobei eine Endkonzentration von 0,1 N Essigsäure in 500 ml resultierte und unter Verwendung eines Amicon Filters PM 10 auf 50 ml eingeengt wurde. Das Konzentrat von 50 ml wurde mit 0,1 N Essigsäure auf 400 ml verdünnt und mit dem gleichen Filter auf 40 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 1 N Essigsäure verdünnt und der entstehende Niederschlag abzentrifugiert. Das entstehende Konzentrat wurde eingefroren und lyophilisiert. Das lyophilisierte Material wurde für die Reinigungsstufe eingesetzt.

Gelpermetationschromatographie

Eine Bio-sil TSK-250-Säule (600 x 21,5 mm) (Bio-Rad) wurde an ein Hochdruck-Flüssigkeits-Chromato-graphie-System angeschlossen. Die rohe Fraktion (10 mg/ml) wurde in einer Lösung von 40 % Acetonitril in 0,1 %-iger wässriger Trifluor essigsäure (0,1 % TFA) gelöst. Ein 2 ml Aliquot der Mischung wurde eingespritzt und die Eluierung isokratisch mit einer mobilen Phase von 40 % Acetonitril in 0,1 % TFA vorgenommen. Die Durchflußrate betrug 2,5 ml/min und die Vorschubgeschwindigkeit wurde auf 0,25 cm/min eingestellt. Fraktionen von 5 ml wurden aufgefangen. Die Chromatographie erfolgte bei Raumtemperatur. Ein Aliquot jeder Fraktion wurde eingedampft und dreifach auf Wachstumsinhibierungswirkung 8 .........:

AT 400 444 B (GIA) bei A375-Zellen untersucht.

Die aktiven Fraktionen (Fraktionen 21 und 22) von 6 Läufen wurden gepoolt. Das gepoolte Material hatte insgesamt etwa 4,8 x 105 GIA-Einheiten. Der Faktor hatte ein ungefähres Molekulargewicht von 18 kD, bestimmt durch Größenausschlußchromatographie (Bio-Sil TSK-250-Säule). 5

Umkehrphasen-Hochdruck-Chromatographie (HPLC) der TSK-250-Fraktionen

Die oben beschriebenen gepoolten TSK-250-Fraktionen 21 und 22 wurden mit 0,1 % TFA auf das Doppelte verdünnt. Diese Mischung wurde isokratisch auf eine n-Bondapak -C18-Säule (7,8 x 300 mm) (als 70 C181 bezeichnet) bei Raumtemperatur aufgespritzt. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde mit 2,0 mt/min und die Vorschubgeschwindigkeit mit 0,25 cm/min eingestellt. Ein linearer Gradient wurde zwischen primärem Lösungsmittel, 0,1 % TFA, und sekundärem Lösungsmittel, Acetonitril - 0,1 % TFA, eingestellt. Die Gradientenbedingungen betrugen 0-30 % in 20 min; dann 30-45 % in 150 min; 45-55 % in 20 min; und 55-100 % in 10 min. Alle Lösungsmittel hatten HPLC-Qualität. Fraktionen von 4 ml wurden aufgefangen und 15 Aliquote jeder Fraktion wurden auf die Wachstumsinhibitionswirkung untersucht. Bei den Fraktionen 72 - 75 wurde die Hauptaktivität gefunden. Die aktiven Fraktionen eluierten zwischen 41 und 52 % der Acetonitril-Konzentration.

Die Fraktionen 72 - 75 wurden gepoolt. 16 ml 0,1 % TFA wurden zu den gepoolten Fraktionen zugesetzt. Die Mischung wurde auf eine u-Bondapak-Cl8-Säule (3,9 x 300 mm) (als C182 bezeichnet) bei 20 Raumtemperatur aufgebracht. Die Durchflußrate wurde mit 1 ml/min und die Vorschubgeschwindigkeit mit 0,25 cm/min festgesetzt. Die Gradientenbedingungen waren: 0 - 35 % in 10 min; 35 - 45 % in 100 min und 45 - 100 % in 10 min. Die Fraktionen wurden aufgefangen und Aliquote genommen und auf GIA geprüft. Die Hauptaktivität kam aus der Säule bei einer Konzentration von 40,7 bis 41,3 % Acetonitril (Retentionszeit 83-86 min). 25 Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und auf das Doppelte mit 0,1 % TFA verdünnt, worauf sie isokratisch auf eine u-Bondapak-C18-Säule (3,9 x 300 mm) (als C193 bezeichnet) bei Raumtemperatur aufgebracht wurden. Die Durchflußrate wurde auf 1 ml/min und die Vorschubgeschwindigkeit auf 0,25 cm/min eingestellt. Ein linear Gradient zwischen primärem Lösungsmittel, 0,1 % TFA, und sekundärem Lösungsmittel, n-Propanol-0,1 % TFA, wurde verwendet. Die Gradientenbedingungen waren: 0 - 23 % in 20 30 min und 23 - 35 % in 120 min. Die Fraktionen wurden aufgefangen und Aliquote von jeder Fraktion wurden auf GIA untersucht. Die Hauptaktivität trat bei einer Propanolkonzentration zwischen 25 und 26,5 % (Retentionszeit 59 min) auf. Diese offensichtlich homogene Fraktion enthielt etwa 300 ng Protein und etwa 40.000 GiA-Einheiten. 35 Zellwachstumsmodulations-Assay unter Verwendung des 3H-Thymidin-Einbaus in DNA (GIA)

Die Untersuchungen wurden in Platten mit 96 flachen Mulden (Costar 3596) durchgeführt. Humane Melanom-Zellen (A 375) wurden als sensitive Indikator-Zellen verwendet. 3 x 103 Zellen in 0,1 ml Dulbeco’s modifiziertem Eagels-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % FCS und PS, wurden in jede Mulde eingebracht. 40 Nach drei Stunden wurde 0,1 ml Testprobe zu jeder Mulde zugesetzt. Die Platten wurden 3 Tage bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 0,025 ml (0,5 JiCi) einer Lösung von 3H-Thymidin (spezifische Aktivität 27 p.Ci/ug) während der letzten 6 h Inkubationszeit in jede Mulde eingebracht. Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines Muitiwell-Harvesters (PHD Cell-Harvester, Cambridge Technology Inc.) auf Glasfilterstrips übertragen. Die Filter wurden dann in Scintillationsfläschchen übertragen, in die 2 ml SeintiIlations-45 flüssigkeit (ScientiVerse II, Fisher Scientific Co.) vor dem Auszählen in einem Scintillationszähler zur quantitatiiven Bestimmung es3H-Thymidin-Einbaus zugesetzt wurden.

Weichagar-Kolonieinhibierungs-Assay (TGI) so Eine 0,5 ml Grundschicht von 0,5 %igem Agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in DMEM mit einem Gehalt von 10 % Fötalem Kalbsserum (FCS) wurde auf 24-Muiden-Costar-Gewebskultur-Platten aufgebracht. 0,5 ml 0,3 %iger Agar mit derselben Medium-FCS-Mischung, 1 - 2,5 x 103 A375-Zellen und der zu untersuchende Faktor in verschiedenen Konzentrationen wurden in Schichten auf der Agargrundlage aufgebracht. Die Platten wurden bei 37 · C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 50 % CO2 in 55 Luft inkubiert und nach 7 Tagen neuerlich durch Zusatz von 0,5 ml 0,3 %igem Agar mit dem gleichen Medium und den gleichen Faktorkonzentrationen gefüttert. Die Kolonien wurden unfixiert und ungefärbt gezählt und die Anzahl von Kolonien mit mehr als 6 Zellen wurde zwischen den Tagen 7 und 14 angemerkt. 9

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Ergebnisse

Sequenzen des Oncostatin M, das aus U937-Zellen isoliert wurde.

Die N-endständige Sequenz und die inneren Fragmente des Oncostatin M wurden durch Mikrosequenzanalyse des reduzierten und S-pyridinethylerten Polypeptids und an Peptiden, die durch enzymatische Verdauung des reduzierten und S-pyridinylethylierten Oncostatin M mit der Endoproteinase LYS-C und Staphylococcus aureus V8· Protease erhalten wurden, bestimmt. Die Peptidfragmente wurden durch Umkehrphasen· HPLC unter Verwendung flüchtiger Lösungsmittel gereinigt. Die Peptide wurden in dem Proteinsequenzer Modell 470 A (Applied Biosystems, Inc) einem automatisierten repetitiven Edman-Abbau unterworfen. Die Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurden durch Umkehrphasen HPLC (Applied Biosystems Inc.) mit einer PTH-Cl8-Säule (2,1 x 220 mm ABI) analysiert, wobei ein Gradient von Natriumacetat-Puffer/Tetrahydrofuran/Acetonitrilzur Eluierung verwendet wurde.

Die entstehenden Aminosäuresequenzen sind im wesentlichen so wie in Fig. 1 dargestellt.

Ein Verlgeich dieser Sequenzen mit den in der gültigen Protein-Datenbank (PIR Release 9,0, Mai 1986) gespeicherten ergab keine signifikanten Sequenzhomologien mit anderen bekannten Sequenzen. Zusätzlich dazu besteht keine Homologie mit Tumor-Nekrose-Faktor, Lymphotoxin, Kolonie-Stimulations-Faktor, Interleukin 1 oder 2 oder ^-transformierendem Wachstumsfaktor.

Inhibierung der Proliferation von Tumorzellen und Verstärkung der Proliferation normaler humaner Fibropla-sten.

Bei Verwendung des oben beschriebenen Weichagar-Kolonieinhibierungs-Assays wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle 1

Inhibierung der Koloniebildung Von A375 Melanom-Zellen in Weichagar durch gereinigtes Oncostatin M, das aus U937-Zellen ’ isoliert wurde. GIA-Einheiten/Mulde # Kolonien % Inhibierung der Koloniebildung 250 4 96 83 6 94 27 11 89 45 32 69 0 106 *A375-Zellen wurden in Weichagar aufgebracht, mit oder ohne Faktor in einem Endvolumen von 2ml nach obiger Beschreibung Der verwendete Faktor stammte aus einer C18 Propanol-Säulenfraktion mit höchster Tumorwachstumsinhibitionswirkung (GIA). 11 Tage später wurde die Anzahl der Kolonien ausgezählt. Als Kolonie wurde eine Ansammlung von mindestens 6 Zellen definiert. Eine GIA-Einheit wurde als die Menge definiert, die eine 50 %ige Inhibierung des 3H-Thymidin-Einbaus in A375-Zellen in Mikromulden gemäß obiger Beschreibung verursacht.

Bei der nächsten Studie wurden verschiedene Behandlungen vorgenommen, um sowohl die chemische als auch die physikalische Wirkung auf das gegenständliche Polypeptid zu bestimmen. Die folgende Tabelle gibt die erhaltenen Resultate: 10

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Tahf»ii«a 7r Wirkung verschiedener Behandlungen auf die Überstunde von TPA-induzierten U937-Zellen auf die Tumorwachstums-Inhibi t i -onswirkung x)

Endgültige Verdünnung des Überstands 1:4 1:8 1:16 Medi enkontrol1e - - - Unbehandelter Oberst. 7.206** 13.896 16.000 IN Essigsäure 6.670 17.073 18.783 IN IfflUOH 6.956 15.016 13.923 x) U937-Zellen wurden mit TPA (10 ng/ml) 3 Tage lang behandelt lrnd die Zellen dann mit Medium gewaschen und 24h in serumfreiem Medium inkubiert, bevor die überstände abgezogen wurden. 20

Oie Überstände wurden mit IN Essigsäure oder IN Ammoniumhydroxid (NH.OH) behandelt. Sie wurden dann gegen Medium dialysiert * 3 und auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung des H-Thymidin-Einbaus 25 in A375-Zellen untersucht. Die A375-Zellen wurden mit 3H-Thymidin (3H-TdR) während der letzten 6 h einer dreitägigen Inkubation markiert. 30 2 xx) Die angegebenen Werte sind die ^H-TdR-Einbau-Zähler pro Minute. 35 Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das Oncostatin M in dem dialysierten Überstand praktisch resistent gegen die Inaktivierung durch 1N Essigsäure und 1N Ammoniumhydroxid ist. Somit sind die gegenständlichen Verbindungen sowohl auf mäßig starke Säure als auch auf mäßig starke Base relativ unempfindlich. Die gegenständliche Verbindung ist bei einer Wärmebehandlung auf 56 · C während 1 h stabil, nicht jedoch bei 90 · C während 30 min. 40 Die gegenständliche Verbindung wurde auch auf Hitzestabilität untersucht und es wurde gefunden, daß sie ihre Wirkung nach 1-stündiger Einwirkung einer Temperatur von 56 °C beibehielt, nach einer Einwirkungszeit von 30 min bei einer Temperatur von 95 *C jedoch praktisch ihre gesamte Wirkung verlor.

Bei der nächsten Untersuchung wurde die Fähigkeit der gegenständlichen Polypeptide zur Inhibierung der Tumorzellenreplikation verschiedener neoplastischer Zellen geprüft. Die folgende Tabelle zeigt die 45 Ergebnisse: 50 11 55

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Tabelle 3: Inhibierung der Replikation von Tumorzellen durch gereinigtes Oncostatin M. aus U937-Zellen. GIA-Einheiten zur Bewirkung einer 30 %igen Inhibition

Tumorzellen 3 H-—TdR-Einbau A549 (Lungenkrebs) 21 HTB10 (Neuroblastom) 81 A375 (Melanom) 0,3

Die Tumorzellen wurden 3 h vor Aufbringung der verschiedenen Verdünnungen des nach obiger Beschreibung durch Umkehrphasen-HPLC gereinigten Oncostatins M in die Mikromulden eingebracht. Während der letzten 6 h einer dreitägigen Inkubation wurden die Zellen in 0,2 ml Medium mit 3H-Thymidin (3H-TdR) (0,5 uCi/Mulde) markiert. Eine Einheit der Tumorwachstumsinhibitionswirkung (GIA) ist in der Legende von Tabelle 1 definiert als die Menge, die eine 50 %ige Inhibition des 3H-TdR-Einbaus in A375-Melanom-Zellen bewirkt. Eine Einheit wurde als etwa 10 pg des gereinigten Proteins bestimmt, weshalb die Konzentration (ng/ml) zur Bewirkung einer 30 %igen Inhibierung von 3H-TdR in A549, HTB10 und A375-Zellen etwa 1,4, 4,0 und 0,015 ng/ml betrug. Der 3H-TdR-Einbau in normale humane Fibroblastzellen W126 wurde bei keinem Versuch durch den U937-Faktor unterdrückt.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das Oncostatin M selektiv in seiner Fähigkeit zur Inhibierung der Replikation ist, wobei es je nach der Art der Zelle stark unterschiedliche Wirkungen hat. Die gegenständliche Verbindung wirkt gegen Melanom-Zellen wie A375-Melanom-Zellen, squamöse Lungenkrebszellen, wie A549, und gegen Neuroblastom-Zellen, wie HTB1Q.

Tumorzellen wurden mit 3 x 103 Zellen/Mulde ausgesät und normale Fibroplasten wurden mit 1,5 x-103 Zellen/Mulde für 3 Stunden in 96-Mulden-Platten eingebracht. Verschiedene Konzentrationen von gereinigtem Oncostatin M, das aus der C183-Säulenfraktion gewonnen wurde und höchste antiproliferative Wirkung gegen A375-Zellen hatte, wurden zugegeben und drei Tage später wurde der 3H-Thymidin-Einbau in die Zelle an jeweils drei Mulden für jede Konzentration gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. 12

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Tabelle 4: Inhibierung der Proliferation von Tumorzellen und Zunahme der Proliferation normaler Fibroblasten durch Oncostatin M GIA-Einheiten 25 30 35 40 45 50 io 15 20 pro Mulde % Inhibition %Stimulati< Vers.1 16 A37583 W138 25 4 62 30 1 46 46 A375 HTB10 W126 Vers.2 27 NT 28 46 9 87 22 36 3 76 11 52 A3 7 5 A549 Vers.3 75 89 30 25 85 22 8 71 16 A3 7 5 SK-MEL28 Vers.4 20 87 44 5 75 25 1 59 11

Die gezeigten Resultate sind die % Inhibition oder % Stimulation des 3H-Thymidin-Einbaus in Tumorzellen (A375, HTB10, A549 und SK-MEL28) sowie in normale Fibroblasten (W126 und W138). Eine GIA-Einheit ist in der Legende zu Tabelle 1 als die Menge Oncostatin M definiert, die eine 50 %ige Inhibierung des 3H-Thymidin-Einbaus in A375-Zellen verursacht. Zusätzlich zu dem unterschiedlichen Effekt auf den 3H-Thymidin-Einbau in Tumorzellen und normale humane Fibroblasten zeigt sich auch ein unterschiedlicher Effekt auf die Morphologie und die Zellanzahl 3 Tage nach der Behandlung der beiden Zeilarten mit Oncostatin M, wie in Fig. 2 dargestellt ist. Das verwendete Oncostatin M stammte aus der HPLC-C183-Säulenfaktion mit der höchsten Wirkung zur Inhibierung der Proliferation von A375-Zellen. Fig. 2 stellt eine Reihe von Fotomikrografien von A375 Melanom-Zellen dar, die (A) unbehandelt, (B) mit 5 Einheiten (GIA) Wachstumsinhibitionswirkung von Oncostatin M oder (C) mit 100 Einheiten behandelt wurden, sowie Fotomikrografien der unbehandelten Fibroblasten W138 (D), der mit 5 GIA-Einheiten (E) oder mit 100 Einheiten (F) behandelten Fibroblasten. Die Zellen wurden mit Kristallviolett in 0,5 % Methanol gefärbt. Vergrößerung = 63 x. NaDodSOt/PAGE von Oncostatin M

Gereinigtes Oncostatin M, das unter reduzierenden Bedingungen NaDodSO* ausgesetzt war, hatte ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 28 kD, wie aus Fig. 3 hervorgeht. Die folgenden Proteine wurden als Standard benützt (Streifen A) : Ovalbumin, Mr = 43 kD, Chymotrypsinogen o, Mr = 25,7 kD; Lactoglobuiin ß, Mr = 18,4 kD; Lysozyme, Mr - 14,2 kD; Rinder-Trypsin-Inhibitor = 6,2 kD; Insulin A- und B-Kette, Mr = 2,3 kD und 3,4 kD Oncostatin M wurde auf Streifen B aufgebracht. Oncostatin M hatte bei der PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen auch ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kD und aus das dem Band elektroeluierte Protein wurde als proliferationsinhibierend für A375-Zellen befunden. Der Antikörper für ein synthetische Peptid von Oncostatin M reagiert in 125 l-markiertem Oncostatin M bei Radioimmun-Fällungen. a) Peptidsynthese: Das Peptid entspricht den Resten 6-19 des Oncostatin M-Proteins und wurde durch Festphasenverfahren auf einem automatischen Beckman-Instrument synthetisiert (Gentry et al., J.Biol.Chem. (1983) 258, 11219). Das Peptid wurde unter Verwendung des "niedrig-hoch" HF-Verfahrens 13 55

AT 400 444 B von dem Harz abgespalten (Tarn et al., J.Amer.Chem-Soc. (1983) 105, 6442-6445). Die Reinigung erfolgte durch präparative HPLC. b) Herstellung der Antikörper: Das Paptid wurde, wie beschrieben, an Rinder-y-globulin gekoppelt (Gentry und Lawton, Virology (1986) 152, 421-431). Weiße Neuseeland-Kaninchen wurden primiert und 5 5 mal wie beschrieben an 5 Stellen subcutan aufgefrischt (Gentry und Lawton, Virology (1986) 152, 421-431).Die verwendeten Antisera wurden 2 Wochen nach der fünften Auffrischung erhalten. c) lodierung von Oncostatin M: Eine Probe eines teilweise gereinigten Oncostatins M wurde mit Jod 125 unter Verwendung bekannter Verfahren radiomarkiert (Linsley et al., PNAS (1985) 82, 356-360). Ein Aliquot der markierten Zubereitung mit einem Gehalt von 100.000 cpm wurde mit Kaninchen-Antiserum, io das gegen die N-endständigen 17 Aminosäuren des Oncostatin M gerichtet war (endgültige Verdünnung 1:20) in An- oder Abwesenheit des N-endständigen Peptids (der N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M) (2ug) gemischt und, wie beschrieben, einer Immunfällungsanalyse unterworfen (Linsley et al., Biochemistry (1986) 25, 2978-2986).

Ein Röhrchen, das 5 ul enthielt, wurde mit 2ug des N-endständigen Peptids in 10 ml TNEN (20 mM 75 Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 0,05 % Nonidet P-40) mit 0,1 % BSA 30 min bei 4'C vorinkubiert, bevor 12S I-Oncostatin M in 85 X TNEN mit 0,1 % BSA und 40 mM Dithiothreitol (DTT) zugesetzt werden. Sieben Röhrchen mit 5ul Antiserum wurden mit 125 I-Oncostatin M in 85 ul TNEN mit 0,1 % BSA und 40 mM DTT 30 min bei 4‘C inkubiert, bevor 50 ul 10 % Formalin-fixierter Staphilococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem) zugesetzt wurden. 20 Nach einer weiteren Inkubation von 30 min bei 4”C wurden die Röhrchen mikrofugiert und die Pellets 4 mal mit 1 ml TNEN gewaschen, bevor sie der PAGE-Analyse unterworfen wurden. Eine diffuse Bande von Mr = 32 kD wurde nach der SDS/PAGE-Analyse der Immunopräzipitate beobachtet. Die Ausfällung dieser Spezies wurde durch Einschluß von überschüssigem unmarkiertem Peptid, das den N-endständigen 17 Aminosäuren des Oncostatin M entsprach, inhibert, was darauf hindeutet, daß die Ausfällung für dieses 25 Peptid spezifisch ist.

Die Kohlenhydrat-Zusammenset2ung des Oncostatin M wurde durch Untersuchung auf die Glycosidase-Empfindlichkeit geprüft. Nach c) bereitete Immunopräzipitate wurden mit Puffer, Endoglycosidase H oder Neuraminidase behandelt, wie von Linsley et al (1986) beschrieben. Die Behandlung mit Endoglycosidase H, einem Enzym mit Spezifität für N-verknüpfte hoch-Mannose-haltige Oligosaccharide ergab das Auftreten 30 einer Spezies mit niedrigerem Molekulargewicht von Mr = 24 kD. Nur ein Teil des radiomarkierten Materials war auf dieses Enzym empfindlich, was darauf hindeutete, daß nicht alle Moleküle hoch-Mannose-haltige Oligosaccharide enthielten. Die Behandlung mit Neuraminidase ergab das Auftreten einer einzigen Bande von Mr = 27 kD, was darauf hindeutet, daß die Heterogenität in der Größe des unbehandelten 1251-markierten Oncostatin M auf eine molekulare Heterogenität im Glycoproteinkern zurückzuführen ist. Die 35 Ergebnisse zeigten, daß die aktiven Zubereitungen von Oncostatin M eine Mischung von hoch-Mannosehal-tigen und komplexen N-gebundenen Oligosaccharid-Seitenketten enthielten.

Oncostatin M, isoliert aus normalen humanen peripheren Blutlymphozyten (PBL)

40 Herstellung eines Tumorzellwachstumsinhibitors aus PBL

Leukofraktionen mit einem Gehalt an PBL, die aus einer Blutbank erhalten worden waren, wurden 1:1 mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS) verdünnt. 35 ml verdünntes Blut wurden mit 10 ml einer Lösung unterlegt, die aus 9 % Ficoll mit einem Gehalt an 20 Vol.-% 50 %igem Natriumdiatrizoat bestand 45 (endgültiges spezifisches Gewicht 1,080). Die Gradienten wurden bei Raumtemperatur 20 min bei 850 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden von der Gradienten-Grenzfläche abgenommen und mit PBS gewaschen. Rote Blutkörperchen wurden 3-4 min mit 10 - 20 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 0,8 % Ammoniumchlorid und 0,1 % Nat-EDTA schock-lysiert.

Aus der Lysatlösung der roten Blutkörperchen wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 600 x g 50 während 10 min gewonnen und in 10 ml RPMI 1640 Medium (GIBCO) mit 5 % fötalem Rinderserum neuerlich suspendiert. Thrombin wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 E/'ml zugesetzt. Die Zellsuspension wurde 5 min bei 37 *C gerührt und das Plättchenaggregat 5 min absetzen gelassen. Die suspendierten Zellen wurden in neue Röhrchen transferiert, zentrifugiert und neuerlich in 1 ml fötalem Rinderserum suspendiert, worauf sie auf eine Säule aufgebracht wurden, die 0,5 g einer gebürsteten, 55 vorgefeuchteten Nylonwolle, Typ 200 (Fenwal) enthielt.

Die Säule mit der Nylonwolle wurde 60 min bei 37’C inkubiert, um ein Haften der Monocyten und B Lymphozyten zu erlauben. Dann wurde die Säule mit 3 Volumina RPMI 1640 Medium mit einem Gehalt an 5 % fötalem Rinderserum bei 37 "C gewaschen und die nichthaftenden Zellen (PBL) eluiert. 14

AT 400 444 B 2 x 106 PBL-Zellen/ml wurden bei 37'C 96 h in 5 % C02-95 % Luft in RPMi-1640-Medium (10,4 g/l) mit einem Gehalt an Fe$0**7H20 (1 mg/l), ZnSCU ·7Η2θ (2 mg/l) Na2SeC>3*5H20 (0,017 mg/l), 1-Aminoethanol (1 mg/l) human Transferrin (5mg/I), Rinderserumalbumin-Linolsäure Konjugat (Sigma) (200 mg/I), L-Glutamin (300 mg/l), Penicillin/Strptomycin (100,000 E/e) und Phytoheumagglutinin-P (Wellcome) (2 mg/l). gezüchtet. Die Überstände wurden abgenommen, zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, durch Ultrafiltration eingeengt (Amicon Diaflo Membran YM-10, 10 kD Abtrennung) und gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert (Dialyserohre Spectrapore 3). Das geklärte Retentat wurde lyophilisiert.

Gelpermeationschromatographie

Die rohe Fraktion wurde in 20 ml 1 M Essigsäure (50mg/ml) aufgenommen und auf eine BioGel-Säule P-100 (2,6 x 88 cm), die mit 1 M Essigsäure äquilibriert worden war, bei einer Durchflußrate von 0,5 ml/min aufgebracht. 12 ml Fraktionen wurden aufgefangen. Ein Aliquot von jeder Fraktion wurde eingedampft und dreifach auf Wachstumsinhibitionswirkung (GIA) bei A375-Zellen untersucht. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt, lyophilisiert und neuerlich über einer Bio-Sil-Säule TSK-250 (600 x 21,5 mm) wie beschrieben chromatographiert.

Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie von TSK-250 Fraktionen.

Die endgültige Reinigung der gepoolten TSK-250-Fraktionen wurde durch Umkehrphasen HPLC im wesentlichen wie beschrieben erreicht. Der aus PBL gewonnene Tumorzellen-Inhibitor eluierte von dem u.Bondapak-C18-Träger bei Konzentrationen'von 40 - 41 % Acetonitril und 26, 5 % n-Propanol.

Zellwachstumsmodulations-Assay mit Verwendung des Einbaus von 125l-loddeoxyuridin in DNA (GIA).

Diese Untersuchungen wurden in flachbödigen 96-Mulden-Gewebskulturplatten (Costar 3596) durchgeführt. Humane Melanom-Zellen A375 (4 x 103) in 50 u.l Testprobe wurden in jede Mulde eingebracht und 3 Tage bei 37'C inkubiert. Die Zellen wurden 24 h mit 1251-ldU (0,05 uCi/Mulde) markiert und weitere 24 h inkubiert. Dann wurden die Zellen 3 mal gewaschen, mit einem Mehrproben-Harvester geerntet und die Radioaktivität mit einem Gamma-Zähler gemessen.

Ergebnisse

Eine Zubereitung von aus PBL abgeleitetem Tumorzellen-Inhibitor wurde dem automatisierten repetiti-ven Edman-Abbau unterworfen. Die amino-endständige Aminosäuresequenz ist folgende: 15 10 15

A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K X bedeutet eine nicht identifizierte Aminosäure.

Ein Vergleich dieser Sequenz mit der des U937-Faktors zeigt klar die Identität mit der N-Endstelle des aus PBL abgeleiteten Faktors. 15 10 15

PBL- Faktor A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K

U937-Faktor A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K

Bei der nächsten Untersuchung wurde die Fähigkeit des aus PBL abgeleiteten Oncostatin M zur Bewirkung der Replikation verschiedener Zellen untersucht. Es wurde gefunden, daß die Mauszellen L929 unempfindlich gegen das aus PBL abgeleitete Oncostatin M bei Verwendung von bis zu 1000 GIA-Einheiten/ml war. Humane Fibroblasten W126 wurden durch Behandlung mit 1000 GIA-Einheiten/ml zum Wachstums angeregt. Die Proliferation der normalen humanen T-Lymphozyten 72 h nach der Mitogenese wurde durch bis zu 500 GIA-Einheiten/ml nicht beeinflußt. 15

Claims (10)

1. AT 400 444 B Aus den obigen Resultaten geht klar hervor, daß ein neues Polypeptid und Polypeptidfragmente zur Verfügung gestellt werden, die zur Modulierung des Zellwachstums verwendet werden können. Die Verbindung hat je nach der Natur der involvierten Zellinie eine unterschiedliche Aktivität, sodaß sie allein oder in Verbindung mit anderen das Zellwachstum modulierenden Verbindungen verwendet werden kann. Die gegenständlichen Polypeptide stellen somit ein zusätzliches Polypeptid dar, das sowohl in vivo als auch in vitro in Zellmischungen zur selektiven Herabsetzung oder Verstärkung der Zell-Proliferation einer bestimmten Zellart verwendet werden kann. Insbesondere kann der Faktor zur Behandlung von Zellen für die autologe Knochenmarkstransplantation verwendet werden. Die Verwendung des Faktors inhibert das Wachstum der Tumorzellen im Mark und kann die Zellkoloniebildung stimulieren. Oncostatin M kann auch zur Stimulierung des Wachstums epithelialer Zellen verwendet werden und dadurch die Wundheilung promovieren. Zusätzlich dazu können das intakte Polypeptid oder Fragmente desselben als Immunogene zur Induzierung der Antikörperbildung verwendet werden. Die induzierten Antikörper können zur Bestimmung von Oncostatin M in einer Körperflüssigkeit oder zur Modulierung der Aktivität des Faktors bei der Bindung an dasselbe verwendet werden. Weiters dienen diese Antikörper gemeinsam mit dem gereinigten Oncostatin M oder Fragmenten desselben als Komponente von diagnostischen Kits, wo sie in Verbindung mit anderen Reagentien, insbesondere Antikörpern zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Oncostatin M, verwendet werden. Aminosäure 3-Buchstaben Abkürzung 1 -Buchstaben Symbol Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Asparaginsäure Asp D Asparagin oder Asparaginsäure Asx B Cystein Cys C Glutamin Gin Q Glutaminsäure Glu E Glutamin oder Glutaminsäure Glx Z Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser s Threonin Thr T Tryptophan Trp w Tyrosin Tyr Y Valin Val V Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen von Zellbruchstücken und anderen Zellproteinen freiem Oncostatin M, das zur Inhibierung der Proliferation normaler humaner Fibroblasten befähigt ist, das die proliferativen und cytotoxischen humanen T-Zell-Reaktionen nicht inhibiert und die granulozyti-sche/myelozytische Knochenmarkskoloniezellbildung nicht inhibiert, das ein Molekulargewicht von 17 bis 29 kD nach der Bestimmung durch Gelausschlußchromatographie und von etwa 28 kD nach der Bestimmung durch SDS-PAGE aufweist und relativ unempfindlich auf die Behandlung mit mäßiger (bis zu etwa 1N) Säure und Base sowie mit mäßig erhöhten Temperaturen ist und das eine N-terminale Aminosäuresequenz entsprechend der Sequenz der Aminosäurereste 16 AT 400 444 B 15 10 Ala-Ala-lls-Gly-Ser-cys-Ser-Lys-Glu-Tyr-Arg-val-Leu-Leu- 15 20 25 Gly-Gln-Leu-Gln-Lys-Gln-Thr-Asp-Leu-Met-Gln-Asp-THr-Ser- 30 35 Ärq-Lau-Leu- Asp-?r o-Tyr-Ile sowie interne angrenzende Aminosäuresequenzen umfaßt, die die folgenden Sequenzen von Aminosäureresten einschließen Gln-Arg-Leu-?ro-Lys-Ala-Gla-Aep-iÄu-Glu-Arg-Ser-Giy-i»*u 15 20 _ Asn-I le-G lu-Asp-Leia-Glu-^y s 1 5 10 Lau-Arg-Glu-Kis-Cys-Arg-Glu-Arg-Prc-Gly-Ala- ?he-?rc-=>er· 13 2° Glu-Glu-Thr-Leu- Arg-Gl>, dadurch gekennzeichnet, daß man a) Leukozyten aus einem Säugetier isoliert; b) die isolierten Leukozyten mit einem Induktionsmittel aktiviert und c) aus diesen aktivierten Leukozyten das genannte Oncostatin M frei von anderem Zellmaterial isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Leukozyten histiozytische Lymphomzellen sind.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten histiozytischen Lymphomzellen U937-Zellen mit der Bezeichnung ATCC CRL 1593 sind.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Induktionsmittel ein Ingenol oder Phorbol ist.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Phorbol 12-O-Tetradecanoylphor-bol-13-acetat ist.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Leukozyten normale humane periphere Blutlymphozyten sind.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Induktionsmittel ein Mitogen ist.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Mitogen Phytohämagglutinin ist.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Oncostatin M mit einer Reinheit erhalten wird, die für eine spezifische Aktivität von mindestens 10 GIA-Einheiten/ng Protein sorgt. 17 5 70 75 20 25 30 35 40 45 50 AT 400 444 B
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Oncostatin M mit einer Reinheit erhalten wird, die für eine spezifische Aktivität von mindestens 100 GIA-Einheiten/ng Protein sorgt. Hiezu 3 Blatt Zeichnungen 18 55