LU86718A1 - Nouveau facteur pour la regulation de la croissance cellulaire - Google Patents

Description

952.605

’ ; ’ ίΓΐ* ? V fl GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG

a ' RrpvptNfo^ W / S

......................................... Monsieur le Ministre du 17 décembr e 19 86 de l’Économie et des Classes Moyennes , -ffîlrW. Service de la Propriété Intellectuelle

Titre délivré.................................................. Sg) LUXEMBOURG

Demande de Brevet d’invention ..................................................................................—........-............................................................. ( 1) I. Requête

La.....société dite..:.......ONCÛGEN,........société-en commandite,-3005......First ( 2)

Avenue , SEATTLE ., .... Was hing ton 9 8121, Etats-Unis -d ' Amér ique ,-- représentée......par......Monsieur- Jacques-de......Muyser , -agissant -en------------------- ......qualité......de.....mandataire__________________________________________________________________________________________ ( 3) déposant) ce........dix-sept ..décembre..1.900 cuatre~vingt-six---------------------- ( 4) à...........15....... .. heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: ......"nouveau......f acteur......po.ur.JLa -régulation de la-croissance---------- ( 5) .....cellulaire.11________________________________________________________________________________________________________ 2. la description en langue f rançaise. ..........de l’invention en trois exemplaires; 3. 3.....................................................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 17......décembre.....198 6 ; 5. la délégation de pouvoir, datée de..................................................... le------------------------------------------------------------- ; 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont): ( 6) 1. Joyce M.ZARIJNG,1400.........25tli Avenue, -E.-r-SEATILEi/ Washimfecffi 98112> E ïU · A.

2. Ltohammed.SHOYSB,.....24054^tiront Way Wr-£EATIÎEr-WasMngtaa 98199/'~E*Ô.A. ~ - 3. Hans MASQÜAKOT, 9222.....SE 46th St.. MERCER ISLAND, Washington 98040, E.P.A.

4. Marcia B.HANSON, 2531 NE 97th Street, SSAT^ E.Ü.A..................

5. Mario N.LTOUBIN,......4130.........156th.Âvenue SE^BELlS/Œ, ..Washington .98.0.0.6,..El.U JL.

6. Thomas Joseph BISWN, 6121 36th Avenus, N.W.. SEATTLE. Washington, E.Ü.A.

revendîque(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de ^ ) brevet ( 7) et......2 )........continuatiQn=in-part.— déposée(s>en (8) aux-Etats^ünis-d 'Amérique le (9)......................................1.) 2.0 décembre 1985---------2)_26..novembre 198 6................................................

sous le N° (10) 1) 811.235..................................................21—935..283_________—_—......................................................

au nom de (il?5.......U........inventeurs.......1,2,3+4____ 2 ) inventeurs......1,2,.3.,...4.,.5+.6.....................

élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg---------------------------------------------------------- _____________35,.......boulevard......Royal________________________________________________________________________ (12) sollicite(nt) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à_________„18 ___________________mois. (13) mandataire: L. --------------- -------------------------------—------------------------------------------------------------— (14) f Γ-' ^ ^ i Π. Procès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Intellectuelle à Luxembourg, en date du: 17 décembre 1986 '.V VL \ Pr. le Ministre de l’Economie et des Qasses Moyennes, 1 ζ ? ·,;<· ·."> : à .....+-. heures f « V t -è * p.d.

*· - : : jt t s; . - , / ~ Le chef du service de la propriété intellectuelle.

- W *\ W . ‘ / -¾ / * v ^ ,c A «tSUT__V +__ EXPUC ATÏoss RELATIVES Af FORMULAIRE DE DÉPÔT' ^ ' ' f : . r. iitaU "Demande du certificat d'addition aubreveipancipaî, à la demande de brevet pri^ipal No............du............**- (2) inscrire les nom. prénom. profession.

f «àrt-â co cvmandsûr. io^cuc celui-ci esr un particulier ou les dénomination sociale, forme junÊaûe. adresse du siège social, lorsque le demandeur est une personne morale - (3) inscrire les. nom. prenort adresse du mandataire agréé, conseil en propriété industrielle, muni d’un pourrir spécial, s’ü v alieu: "représenté par........... agissant en qualité de mandataire*' 3 52.605

REVENDICATION DE LA PRIORITE

de la demande de brevet / sbxjncadèhexdâiiitiitbx

Aux Etats-Unis d'Amérique Du 20 décembre 1985 (No. 811.235) et du 26 novembre 1986 (No. 935.283) continuation-in-part

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Mémoire Descriptif déposé à l'appui d'une demande de

BREVET D’INVENTION

au

Luxembourg au nom de : ONCOGEN, société en commandite SEATTLE, Washington 98121 (Etats-Unis d'Amérique) •pour* "Nouveau facteur pour la régulation de la croissance cellulaire." Λ ' t ϊ 1 t i

NOUVEAU FACTEUR POUR LA REGULATION DE LA CROISSANCE CELLULAIRE

FONDEMENT DE L'INVENTION Cadre de 11 invention 5 Des leucocytes, à la fols des lymphocytes et des monocytes, ont été impliqués dans l'inhibition de la croissance de tumeurs dans plusieurs types de tumeurs animales. L'incidence accrue de tumeurs malignes chez les humains immuno-déficients appuie l'affir-10 mation selon laquelle les globules blancs du sang jouent un rôle dans la régulation de la croissance néoplastique. Les facteurs protéiniques produits par ces globules blancs, qui inhibent la croissance des tumeurs ou modulent les fonctions immunitaires et qui 15 ont déjà été isolés et caractérisés, comprennent interférons, <p<- et ^-, facteur de nécrose tumorale, lymphotoxine, interleucine-2 et autres lymphocines. Puisque chacun des facteurs qui a été isolé a un spectre d'activités différent et peut avoir une inter-20 action différente en conjonction avec d'autres facteurs, il y a.toujours un intérêt continu et marqué pour l'isolement et la caractérisation de tous les facteurs qui produisent des globules blancs pour la modulation de la croissance cellulaire ou les fonctions immunitaires. Ces composés, individuellement ou ensemble, 25 peuvent être employés pour le traitement ou le diagnostic du cancer, en tant que promoteurs de la cicatrisation de blessures ou en tant qu'immunomodulateurs pour le traitement de patients dans des cas d'immunodéficiences, d'auto-immunité, de transplantations 30 d'organes, etc.

Il y a plusieurs difficultés qui peuvent se , présenter pour la découverte, l'isolement, la /U-\ 4 .

ï » * 2 / purification ou la caractérisation des facteurs apparaissant naturellement. Des méthodologies doivent être développées pour la séparation et la purification d'un facteur intéressant hors des autres facteurs dans 5 la matière de départ brute, sans dénaturer l'activité du facteur désiré; des bio-examens doivent être développés pour permettre l'identification des fractions durant des séparations qui concentrent un facteur particulier; un nouveau facteur doit pouvoir être distingué 10 des facteurs qui sont déjà connus ou d'autres facteurs inconnus qui peuvent être présents et peuvent influencer , soit négativement ou soit positivement, l'activité du facteur recherché; le facteur purifié doit être caractérisé; et le facteur purifié doit être concentré 15 en une quantité suffisante pour permettre une identification et une caractérisation du facteur. Par conséquent, à cause du nombre accru de facteurs qui ont été isolés, chaque nouveau facteur devient plus difficile à identifier, puisque son rôle et sa fonction peuvent 20 être masqués par les nombreux autres facteurs qui sont présents.

Description de la pratique antérieure

Beal et al., Cancer Biochem. Biophys, (1979) 3:93-96 rapportent la présence dans l'urine humaine de 25 peptides qui inhibent la croissance et la synthèse de l'ADN, plus dans des cellules transformées que dans des cellules normales. Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

(1980) 7£: 5989-5992 décrivent la purification d'inhibiteurs de la croissance des cellules épithéliales.

30 Letansky, Biosci. Rep. (1982) £:39-45 rapporte que des peptides purifiés provenant du placenta de bovins inhibent la croissance des tumeurs et l'incorporation de thymidine dans l'ADN en une mesure plus grande dans « des néoplasmes que dans des cellules normales. Chen, ί , J * 3

Trends Biochem. Sei. (1982) 7:364-365 rapporte l'isolement d'un peptide à partir d'un fluide ascitique avec la propriété de supprimer un cancer. Redding et Schally, Proc. Natl. Acad. Sei. (1982) 79:7014-7018 rapportent 5 l'isolement de peptide(s) purifié(s) à partir d'hypothalamus porcin qui présente une activité antimitogène contre plusieurs lignées de cellules normales et tumorales. Sone et al., Gann (1984) 75:920-928 rapportent la production d'un ou de facteur(s) produit(s) par des 10 macrophages humains qui inhibe(nt) la croissance de certaines cellules tumorales in vitro. Ransom et al., Cancer Res. (1985) 45:851-862, rapportent l'isolement d'un facteur appelé leucoréguline qui inhibe la réplication de certaines lignées de cellules tumorales et 15 apparaît distinct de la lymphytoxine, de l'interféron et des interleucines 1 et 2. La plupart de ces facteurs n'ont pas été complètement caractérisés et leurs structures primaires ne sont pas connues.

Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259: 20 686-691 ont purifié et caractérisé une lymphotoxine humaine (LT) produite par une lignée de cellules lympho-blastoïdes et, ultérieurement, de la LT séquencée (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1985) 260:2334). Le gamma interféron (^-IF) qui est produit par des cellu-25 les lymphoïdes et a une activité immunomodulatoire et d'inhibition tumorale a été cloné et exprimé (Gray et al., Nature (1982) 295 : 503: 508). Un facteur de nécrose tumorale (FNT) qui inhibe la croissance de quelques tumeurs et est produit par des macrophages et certaines 30 lignées de cellules de leucémie a été caractérisé et le FNT ADNc a été cloné et exprimé dans l'E^ Coli (Pennica et al., Nature (1984) 312:724).

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RESUME DE L’INVENTION

On fournit un nouveau facteur peptide et ses fragments biologiquement actifs, ce facteur étant obtenu à partir de leucocytes. Le facteur peut être 5 utilisé pour la modulation de la croissance cellulaire, comme l'inhibition de la croissance des cellules tumorales et la stimulation de la croissance des fibroblastes normaux, et il peut moduler les fonctions immunitaires. Le facteur a une séquence amino acide distinc-10 tement différente des séquences des autres composés qui ont été mentionnés comme ayant des propriétés analogues.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

La Figure 1 représente la séquence amino acide des fragments d'Oncostatin M; 15 la Figure 2 est une série de microphoto graphies de cellules traitées avec l'Oncostatin M dans dans lesquelles (A-C) sont des cellules de mélanome A375 traitées avec 0,5 et 100 unités AIC, respectivement, et (D-F) sont des fibroblastes W138 traités avec 20 0,5 et 100 unités AIC, respectivement; et la Figure 3 est une photographie d'une analyse SDS-PAGE de 11Oncostatin M.

DESCRIPTION DES APPLICATIONS SPECIFIQUES

On fournit un nouveau polypeptide, des 25 compositions de polypeptide, des fragments de polypeptide et des mutations, leur préparation et leur emploi, les compositions démontrant une activité dans la modu- . lation de la croissance cellulaire, particulièrement l'inhibition de la croissance des cellules tumorales et 30 la stimulation de la croissance des fibroblastes normaux. Un polypeptide selon l'invention, désigné par Oncostatin M, peut être obtenu à partir de leucocytes; ' p.ex. à partir de milieux conditionnés de cellules U937 A— 5: Γ 5 stimulées ou de milieux conditionnés de lymphocytes de sang périphérique humains normaux stimulés (LSP). Des fragments et des mutants du polypeptide ayant l'activité biologique de 1Oncostatin M intact, telle que 5 l'activité de modulation de la croissance cellulaire ou l'activité immunologique, peuvent aussi être obtenus.

Les fragments de polypeptide de cette invention sont des nouveaux polypeptides d'au moins 8 amino acides qui sont biologiquement actifs, au moins 10 sous forme d'une réaction croisée immunologique avec 1'Oncostatin M apparaissant naturellement. Par réaction croisée immunologique, on veut dire qu'un anticorps induit par un nouveau polypeptide de cette invention aura une réaction croisée avec 1'Oncostatin M intact, 15 au moins quand 1'Oncostatin M est dans un état dénaturé. Ces polypeptides sont par conséquent utiles pour induire des anticorps vis-à-vis de 1Oncostatin M qui peuvent être employés pour déterminer la concentration de 1'Oncostatin M dans un fluide corporel, pour se lier 20 à 1'Oncostatin M et par conséquent moduler son activité et pour purifier 1'Oncostatin M, comme par emploi dans une colonne d'affinité. Une portion des polypeptides peut aussi conserver l'activité de modulation de la croissance cellulaire de 1'Oncostatin M intact, bien 25 que l'activité puisse être modulée, habituellement réduite par comparaison à 1'Oncostatin M intact.

La Figure 1 représente la séquence amino acide de poly(amino acide)s à réaction croisée avec 1'Oncostatin M, la première séquence représentant le 30 N-terminus de 1'Oncostatin M.

Les poly(amino acide)s de la présente invention contiennent une séquence amino acide ayant au moins 8 amino acides consécutifs qui correspondent à une séquence amino acide décrite dans la Figure 1 et / 35 différant de cette séquence par pas plus de 3, /V_.

4 »' 6 habituellement pas plus de 1 amino acide. Cette différence peut être soit l'insertion d'un amino acide, la délétion d'un amino acide ou la substitution d'un amino acide par un autre, particulièrement une substitution 5 de conservation. Habituellement, les poly(amino acide)s contiendront au moins 10, plus souvent au moins 12, amino acides consécutifs qui correspondent aux séquences décrites dans la figure et qui ne diffèrent pas par plus d'un amino acide.

10 Pour les objectifs de la présente invention les divers amino acides seront divisés en un certain nombre de sous-classes. Le tableau suivant indique ces sous-classes : aliphatique 15 neutre

non-polaire G A P V L I

polaire S T C M N Q

acide D E

basique K R

20 aromatique F H Y W

Par substitution de conservation, on veut signifier que les amino acides de la meme sous-classe (c.a.d. soit aliphatique neutre, aliphatique acide, aliphatique basique ou aromatique), plus particulière-25 ment de la même polarité, seront substitués les uns par les autres. De préférence, des amino acides de deux à quatre atomes de carbone ou de cinq à six atomes de carbone définiront les groupages monomères dans la sous-classe aliphatique.

30 Les poly(amino acide)s n'excéderont pas environ 1.000 amino acides en longueur, habituellement, ils auront moins de cent amino acides, mieux encore moins de cinquante amino acides. Ainsi, les poly(amino * t acide)s peuvent être aisément synthétisés. Habituelle-35 ment, quand des poly(amino acide)s excèdent 100 amino » ί 7 ι acides en longueur, ces poly(amino acide)s peuvent être des polymères de fragments d'Oncostatin M ayant moins de 100 amino acides chacun, ou des protéines de fusion dans lesquelles le fragment est fusé à antigène, 5 enzyme, fragments d'enzymes, etc. Plus particulièrement, les poly(amino acide)s à poids moléculaire élevé peuvent être au moins un fragment de polypeptide de moins d'environ 100 amino acides unis par covalence à un grand porteur polypeptide immunogène pour fournir 10 l'immunogénicité. Des exemples de tels porteurs de protéines sont l'albumine de sérum bovin, 11hémocyanine de patelles (HP), etc. Ces polypeptides conjugués peuvent être utiles pour l'induction d'anticorps dans un organisme hôte approprié.

15 Les cellules U937 sont une lignée de cellu les dérivée d'une lignée de cellules de lyphome histiocytique (Sundstrom et Nilsson, Int. J. Cancer (19760 17:565-577) -qui peut être induite pour différencier des cellules possédant les caractéristiques 20 des macrophages, puis par traitement avec divers agents (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45:9-13).

Pour la production de l'Oncostatin M, les cellules U937 peuvent être cultivées d'ans un milieu nutritif conventionnel avec du sérum et puis traitées avec un 25 inducteur approprié. De façon adéquate, des phorbols ou des ingénols peuvent être employés, particulièrement le 12-0-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA). Habituellement, environ 5-20 ng/ml d'inducteur peuvent être utilisés. Le nombre initial de cellules 30 est d'environ 10 - 10 cellules/ml.

Après avoir laissé .les cellules à traiter avec l'inducteur durant une période suffisante, généralement trois à six jours, le surnageant est enlevé, ' les cellules sont lavées avec un milieu nutritif ♦ 35 exempt de sérum, les cellules fixées sont à nouveau 8 1 * lavées avec un milieu exempt de sérum et les cellules sont laissées pour incubation durant au moins 12 heures, habituellement pas plus d'environ 48 heures, dans un milieu nutritif exempt de sérum, p.ex. un 5 milieu RPMI-1640. Les surnageants sont ensuite recueillis et les cellules enlevées par centrifugation. Les surnageants exempts de cellules sont examinés quant à l'activité d'inhibition de la croissance cellulaire (AIC), comme décrit dans le plan expérimental. Le 10 surnageant contient environ 50 à 500 unités de AIC/ml (voir Expérience pour la définition des unités AIC).

L'Oncostatin M peut aussi être obtenu à partir de lymphocytes de sang périphérique humain normal stimulé par mitogène (LSP). Les LSP peuvent 15 être isolés à partir de leuco-fractions en diluant les fractions et en les centrifugeant sur des gradients Ficoll. Les cellules recueillies à partir de l'inter-— face du gradient sont lavées et lysées par choc pour éliminer les globules rouges sanguins. Les cellules 20 restantes sont recueillies par centrifugation à partir de cette solution, remises en suspension dans un .agent tampon contenant du sérum et de la thrombine, agitées et on laisse les agrégats en plaquettes se déposer durant une courte période de temps. Les cellules en 25 suspension sont transférées, récupérées par centrifugation, remises en suspension dans du sérum et transférées dans une colonne contenant de la laine de nylon.

La colonne est incubée pour permettre la fixation des monocytes et des lymphocytes B et puis elle est lavée. 30 La plupart des lymphocytes T du sang périphérique ne sont pas fixés et ils sont élués hors de la colonne.

Ces cellules sont cultivées à 37°C dans un milieu de culture, p.ex. milieu RPMI-1640, et traitées avec un inducteur approprié, p.ex. phytohémagglutinine ^ 35 (environ 1 à 5 mg/1), durant environ 100 heures et 1 * 9 ensuite les surnageants sont recueillis. Les surnageants sont centrifugés pour éliminer les cellules et puis concentrés par ultrafiltration ou dialyse.

Après isolement du surnageant exempt de 5 cellules hors des cellules U937 ou des LSP normaux, le milieu conditionné est concentré, en utilisant de manière appropriée un système avec fibres creuses ou une membrane pour ultrafiltration, puis dilué avec de l'acide acétique (jusqu'à une concentration d'acide 10 acétique 0,1N), et ensuite concentré jusqu'à environ dix fois, et la dilution et la concentration sont répétées. Le produit concentré peut être lyophilisé et utilisé directement ou bien le produit lyophilisé peut être utilisé pour purification ultérieure.

15 L'Oncostatin M selon l'invention peut être purifié par un mode opératoire de chromatographie par perméation sur gel en utilisant une solution aqueuse à 40 % d'acétonitrile et 0,1 % d'acide trifluoroacéti-que comme phase mobile isocratique sur une colonne 20 Bio-sil TSK250, en déterminant l'activité de chacune des fractions. La purification fournit une composition ayant au moins environ 0,5-5 x 10 unités AIC/ml dans les fractions actives.

Le produit partiellement purifié provenant 25 de la chromatographie par perméation sur gel peut être ultérieurement purifié en utilisant une chromatographie liquide sous haute pression (CLHP) en phase inverse employant un gradient linéaire, dans laquelle le solvant primaire est de l'acide trifluoroacétique à 30 0,1 % dans l'eau et le solvant secondaire est de 1'acétonitrile contenant de l'acide trifluoroacétique à 0,1 ÿ. Le programme peut être modifié, l'opération de chromatographie exigeant généralement environ 3-4 heures, avec la plus grande partie du temps, supérieure / 35 à environ 50 % du temps et pas plus d'environ 80 % du ΐ ·' 10 temps, dans la gamme de 30-45 % du solvant secondaire.

Sous ces conditions, les fractions actives éluent à environ 41-42 % d'acétonitrile.

Les fractions actives rassemblées peuvent 5 être ultérieurement purifiées en répétant la CLHP en phase inverse, en utilisant un changement plus rapide des conditions du gradient et un débit plus lent. Sous ces conditions, l'activité émerge à environ 40,5-41,5 % d1acétonitrile.

10 La CLHP en phase inverse peut ensuite être répétée, en changeant le système solvant, dans lequel le solvant secondaire est n-propanol-0,1 % acide trifluoroacétique. On emploie un gradient linéaire dans lequel on fait varier lentement le gradient dans 15 la gamme de 23-35 % de n-propanol. L'activité majeure est observée dans la gamme de 25,5-27,5 % de propanol, pour donner un produit substantiellement homogène ayant une activité spécifique de plus de 10 unités — AIC/ng de protéine. Habituellement, le produit est 20 purifié pour fournir une activité spécifique d'au moins environ 100 unités AIC/ng de protéine, plus habituellement de 150 unités AIC/ng.

Les composés de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils ont un poids moléculaire d'environ 25 17 à 19 kiloDaltons (kD), particulièrement d'environ 18 kD, comme déterminé par chromatographie par exclusion de taille. Les composés de l'invention sont en outre caractérisés en ce qu'ils ont un poids moléculaire apparent d'environ 28 kD comme déterminé par 30 électrophorèse sur gel polyacrylamide sous des conditions réductrices ou non-réductrices.

La séquence amino acide des fragments d'Oncostatin M purifié a été analysée. L'OncostatinM possède substantiellement les séquences amino acide t représentées dans la Figure 1. En se référant à la 11 \ *'

Figure 1, la première séquence illustre le N-terminus de l'Oncostatin M, tandis que les autres séquences illustrent des fragments internes du polypeptide.

Des préparations actives d'Oncostatin M 5 isolé contenaient un mélange de mannose supérieur et d'oligosaccharide N-lié complexe. Cependant, les préparations d'Oncostatin M non-glycosylées conservaient une activité de modulation de croissance cellulaire L'Oncostatin M est en plus caractérisé par 10 son activité vis-à-vis de certaines souches de cellules. Le polypeptide de l'invention ne présente pas d'activité cytotoxique contré les fibroblastes humains W126 et W138, les cellules de souris L929 qui sont sensibles au facteur de nécrose tumorale, et une 15 lignée de cellules tumorales humaines sensible au ^-interféron. On a aussi constaté qu'il n'inhibe pas .

____ la prolifération des T-lymphocytes humains normaux,1 ni la formation de colonies granulocytiques/myélocytiques des cellules de moelle osseuse à des concentrations 20 s'élevant jusqu'à 100 unités AIC/ml. En outre, l'Oncostatin M stimule la prolifération des fibroblastes humains normaux comme par exemple les cellules W138 et W126 et inhibe la prolifération des cellules tumorales telles que A375, HBT10, A549 et SK-MEL28 et peut 25 augmenter la croissance de cellules formant des colonies provenant de la moelle osseuse normale. L'Oncosta-M ne supprime pas les réponses aux cellules T cytotoxiques ou proliférantes humaines dans des réactions de cultures de leucocytes mixtes (CLM) à des concentra-30 tions de 500 unités AIC/ml.

Le polypeptide de l'invention s'est révélé être stable aux acides et bases modérés et à un traitement thermique à 56°C.

*

La séquence amino acide du polypeptide de / 35 l'invention peut être complètement déterminée en : I"..-......

'1 * 12 / utilisant des dispositifs pour détermination de séquence disponibles dans le commerce. Le polypeptide peut ensuite être synthétisé suivant des techniques connues, en employant des synthétiseurs automatisés 5 qui sont aussi commercialement disponibles.

D'une autre manière, le polypeptide de l'invention peut être produit par des techniques de recombinaison de l'ADN. A partir d'une séquence partielle d'amino acide, on peut déduire des échantil-10 Ions-tests qui peuvent être utilisés pour l'examen d'une librairie génomique humaine. La librairie peut être une librairie ADNc ou une librairie chromosomique. Après que le (les) clone(s) a (ont) été identifié(s) comme étant en état d'annealing sur l'échantillon-test, 15 les fragments contenant le gène intéressant peuvent être identifiés selon de nombreuses manières et être manipulés selon de nombreuses façons. La dimension du fragment peut être réduite par restriction endonucléase, les fragments résultant étant clonés et testés 20 pour la présence du gène désiré. Les cellules qui produisent le peptide désiré ou produisent des quantités accrues du peptide désiré, peuvent être utilisées pour la production d'ARN messager. A partir de l'ARN messager, on peut préparer de l’ADNc à brin unique.

25 L'ADNc peut être ensuite mis en état d'annealing sur l'ARN messager total à partir d'une cellule qui produit peu ou pas du polypeptide. L'ADNc non mis en état d'annealing peut ensuite être isolé et utilisé pour préparer l'ADNc, qui peut être examiné avec les échan-30 tillons-tests.

D'une autre manière, les fragments d'ADN peuvent être insérés dans le \gtll, de telle façon que les fragments de codage puissent être en aval et dans le cadre du gène de ^-galactosidase. Des anticorps 35 peuvent être préparés vis-à-vis du polypeptide / __ _.

i 13 \ λ » \

Oncostatln M et utilisés pour l'examen des protéines fusées résultantes en ce qui concerne la réactivité croisée. De cette manière, des fragments codant pour le polypeptide de l'invention ou un de ses fragments 5 .peuvent être identifiés et utilisés pour l'identification du gène désiré.

Après identification complète du gène, soit comme ADNc ou comme ADN chromosomique, celui-ci peut ensuite être manipulé selon de nombreuses mani-10 ères pour fournir une expression. Quand le gène doit être exprimé dans un hôte qui reconnaît les régions de régulation translationnelles et transcriptionnelles de type sauvage de l'Oncostatin M, le gène entier, avec ses régions de régulation 3' et 5' de type sauva-15 , ge peut être introduit dans un vecteur d'expression approprié. Il existe divers vecteurs d'expression utilisant des systèmes de réplication à partir de virus de mammifères, tels que Simian Virus 40, adéno—-virus, virus papilloma de bovin, virus vaccinia, 20 baculovirus d'insecte, etc. Ces systèmes de réplication ont été développés pour fournir des marqueurs qui permettent une sélection des transfectants, ainsi que pour fournir des sites de restriction appropriés dans lesquels le gène peut être inséré.

25 Quand le gène doit être exprimé dans un hôte qui ne reconnaît pas les régions de régulation transcriptionnelles et translationnelles de type sauvage apparaissant naturellement, une manipulation additionnelle est nécessaire. De manière appropriée, 30 diverses régions de régulation 3'-transcriptionnelles sont connues et peuvent être insérées en aval des codons d'arrêt. La région 5' non-codante en amont du gène structurel peut être éliminée par restriction endonucléase, résection Bal31, etc. D'une autre mani-35 ère, quand un site de restriction approprié est ( . ♦ 14 présent près du terminus 5' du gène structurel, le gène structurel peut être soumis à restriction et un adaptateur peut être employé pour effectuer la liaison du gène structurel à la région promoteur, où l'adapta-5 teur fournit les nucléotides perdus du gène structurel. Diverses stratégies peuvent être employées pour fournir une cassette d'expression qui dans la direction de transcription 5', 3' a une région d'initiation transcriptionnelle et translationnelle, qui peut aussi 10 inclure des séquences de régulation permettant l'induction de la régulation, le gène structurel sous le contrôle transcriptionnel et translationnel de la région d'initiation et une région de terminaison transcriptionnelle et translationnelle.

15 Des exemples de promoteurs ou de régions d'initiation transcriptionnelle comprennent, pour les bactéries, le promoteur ß-gal, le promoteur TAC, les promoteurs lambda gauche et droit, etc.; pour les levures, les promoteurs enzyme glycolytique, tels que 20 promoteurs ADH-I et -II, promoteur GPK et promoteur PGI, promoteur TRP, etc.; pour les cellules de mammifères, promoteurs SV40 précoces et tardifs, promoteurs tardifs majeurs d'adénovirus, etc. Comme déjà indiqué, la cassette d'expression peut être comprise dans un 25 système de réplication pour maintenance épisomique dans un hôte cellulaire approprié ou peut être fournie sans un système de réplication quand elle peut être intégrée dans le génome hôte. L'ADN peut être introduit dans l'hôte suivant des techniques connues, 30 telles que transformation, en utilisant de l'ADN précipité avec du phosphate de calcium, transfection en mettant en contact les cellules avec le virus, microinjection de l'ADN dans les cellules, etc.

Après introduction du gène structurel dans 35 l'hôte approprié, l'hôte peut ftre cultivé et /1 * * 15 exprimera le gène structurel. Dans quelques cas, il peut être intéressant de prévoir une séquence signal (guide de sécrétion) en amont du et dans le cadre de lecture relatif au gène structurel, ce qui fournit la 5 sécrétion du gène structurel et le clivage du guide de sécrétion afin de fournir ainsi le polypeptide mature dans le surnageant. Si la sécrétion n'est pas prévue, les cellules hôtes peuvent alors être recueillies, lysées suivant des conditions conventionnelles, et le 10 produit désiré peut être isolé et purifié suivant des techniques connues comme chromatographie, électrophorèse, extraction avec un solvant,etc.

Les composés de 11 invention peuvent être utilisés selon de nombreuses manières à la fois in 15 vivo et in vitro. Les composés de l'invention peuvent être employés pour la fabrication d'anticorps vis-à-vis des composés en question, qui peuvent être utilisés in vivo ou in vitro. Les anticorps peuvent être préparés selon des manières conventionnelles, en utili-20 sant le polypeptide de l'invention comme immunogène et en injectant le polypeptide dans un hôte mammifère, p.ex. souris, vache, chèvre, mouton, lapin, etc., particulièrement avec un adjuvant, p.ex. adjuvant de Freunds complet, gel d'hydroxyde d'aluminium, etc.

25 L'hôte peut' ensuite être soumis à une prise de sang et le sang est employé pour l'isolement d'anticorps polyclonaux, ou dans le cas de souris, les lymphocytes du sang périphérique ou les lymphocytes spléniques (cellules B) peuvent être employés pour fusion avec un 30 une cellule de myélome appropriée, afin d'immortaliser les chromosomes pour une expression monoclonale des anticorps spécifiques’des composés de l'invention.

On peut préparer des anticorps soit polyclonaux ou soit monoclonaux, qui peuvent ensuite être 35 utilisés pour le diagnostic ou la détection de la l'- * l * 16 présence du polypeptide de 11 invention dans un échantillon, tel que des cellules ou un fluide physiologique, p.ex. du sang. Les anticorps peuvent aussi être utilisés dans une chromatographie par affinité pour 5 une purification du polypeptide de l'invention et son isolement à partir de sources naturelles ou synthétiques. Les anticorps peuvent aussi être employés pour le contrôle de la quantité du polypeptide de l'invention associé à des cellules en culture ou in vivo, ce 10 par quoi la croissance des cellules peut être modifiée.

Le composé de l'invention peut être utilisé comme ligand pour la détection de la présence de récepteurs pour le composé de l'invention. De cette façon, des cellules peuvent être distinguées en fonc-15 tion de la présence et de la densité des récepteurs pour le composé de l'invention, en contrôlant l'effet des divers composés sur la présence de ces récepteurs.

Le composé de l'invention peut être utilisé dans des cultures in vitro pour inhiber la crois-20 sance^de cellules ou de lignées de cellules sensibles au polypeptide de l'invention, en les distinguant des cellules qui ne sont pas sensibles. Ainsi, des mélanges de cellules ou de lignées de cellules hétérogènes peuvent être débarassés des cellules indésirables, 25 quand les cellules indésirables sont sensibles au polypeptide de l'invention. Le polypeptide de l'invention peut être administré in vivo dans les cas de conditions néoplastiques, par exemple, par injection, par voie intralésionnelle, péritonéale, sous-cutanée, 30 etc„ Le composé de l'invention peut être utilisé in vitro pour éliminer les cellules malignes de la moelle pour des transplants de moelle autologue ou pour inhiber la prolifération ou éliminer les cellules malignes dans un autre tissu, p.ex. le sang avant réinfusion.

* 35 Le polypeptide de l'invention peut aussi 4 « * 17 f être utilisé dans un-procédé pour le traitement des blessures, telles que des blessures cutanées, blessures de cornée, et diverses autres lésions épithéliales et stromales, telles que ulcères chroniques, brûlures, 5 incisions chirurgicales, blessures traumatiques et lésions aux organes creux revêtus d'épithémium tels que oesophage, estomac, gros intestin et intestin grêle, bouche, région génitale et urinaire. Le procédé se base sur l'application topique d'une composition 10 pour traitement comprenant l'Oncostatin M dans un porteur physiologiquement acceptable.

La composition de la présente invention peut être utilisée pour le traitement d'une grande variété de blessures, y compris substantiellement 15 toutes les blessures cutanées, les blessures de cornée et les lésions aux organes corporels creux revêtus d'épithélium. Les blessures auxquelles le traitement peut être appliqué comprennent celles résultant d'un traumatisme tel que brûlures, écorchures, coupures, 20 etc., ainsi qûe celles découlant des interventions chirurgicales, telles que incisions chirurgicales et greffes de peau. D'autres conditions pouvant être traitées avec les compositions de la présente invention comprennent les conditions chroniques, telles que 25 les ulcères chroniques, les ulcères diabétiques et d'autres conditions de non-cicatrisation (trophiques).

L'Oncostatin M peut être incorporé dans ’ des porteurs physiologiquement acceptables pour application aux régions affectées. La nature des porteurs 30 peut varier largement et dépendra de l'endroit prévu pour l'application. Pour application sur la peau, on préfère habituellement une base de crème ou d'onguent, des bases appropriées comprennent lanoline, Silvadene (Marion) (particulièrement pour le traitement des / 35 brûlures), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, f i * * 18 /

Connecticut), etc. Si on le désire, il peut être possible d'incorporer des compositions contenant l'Oncosta-tin M dans des bandages et autres pansements pour blessures afin de placer la blessure en exposition 5 continue au peptide. Des applications par aérosol peuvent également être utilisées.

La concentration du polypeptide dans la composition traitante n'est pas critique. Le polypeptide doit être présentjen une quantité induisant la 10 prolifération des cellules épithéliales. Les compositions doivent être appliquées de manière topique aux régions affectées, typiquement sous forme de gouttes oculaires pour les yeux ou de crèmes, onguents ou lotions pour la peau. Dans le cas des yeux, un traite-15 ment fréquent est souhaité, habituellement par application à des intervalles de 4 heures ou moins. Sur la peau, il est préférable de maintenir continuellement la composition traitante sur la région affectée durant la cicatrisation, en appliquant la composition traitan-20 te de deux à quatre fois par jour, ou plus fréquemment.

La quantité employée de polypeptide de l'invention peut varier selon le type d'administration, l'emploi d'autres composés actifs, etc., "et est généralement comprise dans une gamme d'environ 1 ä 100 pg. 25 Le polypeptide de l'invention peut être employé avec un porteur physiologiquement acceptable, tel que salin, salin tamponné au phosphate, etc. La quantité de composé enmployée peut être déterminée de manière empirique, sur base de la réponse des cellules in vitro et de la 30 réponse des animaux pour expériences aux polypeptides de l'invention ou aux formulations contenant les polypeptides de l'invention. Les composés de l'invention peuvent être utilisés tels quels ou en combinaison avec d'autres facteurs ou inhibiteurs ou immunomodula-35 teurs de croissance, tels que FNT, IL-2, γ-interféron, i * ♦ 19 anticorps monoclonaux, etc. La quantité de ces autres composés sera généralement comprise dans la gamme de 1 jug à 100 jug. Des produits conjugués des composés de l'invention aux fractions d'orientation du site, p.ex.

5 des anticorps, peuvent être préparés, les anticorps pouvant être spécifiques pour des cellules malignes ou des organes particuliers.

Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration et non de limitation de la présente 10 invention.

EXPERIENCES

Matières et méthodes

Oncostatin M isolé à partir de cellules U937

Production d'un inhibiteur de croissance de cellules 15 tumorales à partir d'une lignée de cellules de lymphome histiocyctique

Des cellules U937, une lignée de cellules de lymphome histiocyctique (Sundstrom et Nilsson, Int.

J. Cancer (1976) Γ7:565-577) ont été cultivées dans 2 20 des bouteilles type tambour de 850 cm (Corning C2540) g a une concentration de 4 x 10 cellules/ml dans un volume total de 300 ml d'un milieu RPMI 1640 complété avec 10 % de sérum de foetus de veau (SFV), pénicil-' line/streptomycine (PS), L-glutamine et 10 ng/ml de 25 12-0-tétradécanoylphorbol 13-acétate (TPA). Quatre jours plus tard, les surnageants contenant le SFV et le TPA ont été enlevés, les bouteilles tambour ont été lavées cinq fois avec du RPMI-1640 exempt de sérum et les cellules qui s'étaient détachées (1 x 10 cellules/ 30 ml) ont été lavées 3 fois avec un milieu exempt de sérum et ont été replacées dans les bouteilles, ce qui a donné un volume final de 125 ml de milieu RPMI-1640 exempt de sérum par bouteille tambour. Un jour plus h \ i v · i 20 tard, les surnageants ont été recueillis, centrifugés pour enlever les cellules, filtrés au travers d'un filtre Nalgene de 0,45 microns (ju) et concentrés en utilisant un système avec fibres creuses (cartouche 5 Amicon HIP10-20) jusqu'à un volume de 150 ml (volume initial 1.500 ml). L'Oncostatin M a été également isolé hors des surnageants des cellules U937 traitées avec TPA exemptes de sérum, dans des flacons de 150 cm pour culture tissulaire. Le surnageant a été 10 concentré avec une membrane Amicon Diaflo PM-10, avec interruption à 10 kD, et a été dialysé. Après dialyse, le produit concentré a été dilué avec dé. l'acide acétique pour donner une concentration finale d'acide acétique 0,1N" dans 500 ml et a été concentré jusqu'à 15 50 ml en utilisant un filtre Amicon PM 10. Le produit concentré (50 ml) a été dilué jusqu'à 400 ml avec de l'acide acétique 0,1 N et a été concentré jusqu'à 40 ml avec le même filtre. Le produit concentré a été dilué avec de l'acide acétique IN et le précipité 20 résultant a été enlevé par centrifugation. Le produit concentré résultant a été congelé et lyophilisé. La matière lyophilisée a été utilisée pour les étapes de purification.

Chromatographie par perméation sur gel 25 Une colonne Bio-sil TSK-250 (600 x 21,5 mm) (Bio-Rad) a été reliée à un système de chromatographie liquide haute pression. La fraction brute (10 mg/ml) a été dissoute dans de 1'acétonitrile à 40 % dans de l'acide trifluoroacétique aqueux à 0,1 % (ATF 0,1 %).

30 Une fraction de 2 ml du mélange a été injectée et une élution a été effectuée de manière isocratique avec une phase mobile d'acétonitrile à 40 % dans du ATF 0,1 %. Le débit était de 2,5 ml/min''et la vitesse A d'enregistrement a été fixée à 0,25 cm/min. Des ' * j 4 * 21 / fractions de 5 ml ont été recueillies. La chromatographie a été effectuée à température ambiante. Une portion de chaque fraction a été évaporée et a été examinée en triple quant à l'activité d'inhibition de 5 la croissance (AIC) des cellules A375.

Les fractions actives (Fractions 21 et 22) provenant de six essais ont été rassemblées. La matière rassemblée était au total d'environ 4,8 x 10^ unités AIC. On a constaté que le facteur avait un 10 poids moléculaire apparent de 18 kD, comme déterminé par chromatographie par exclusion de dimension (colonne Bio-Sil TSK-250)..

Chromatographie sous haute pression en phase inverse (CLHP) des fractions TSK-250 15 Les fractions TSK-250 rassemblées 21 et 22 décrites ci-dessus ont été diluées deux fois avec de 1'ATF à 0,1 %. Ce mélange a été injecté de manière iso-cratique sur une colonne ju-Bondapak-C18 (7,8 x 300 mm) (désignée par C18 ) à température ambiante. Le débit 20 a été fixé à 2,0 ml/min et la vitesse d'enregistrement était de 0,25 cm/min. Le gradient linéaire a été utilisé entre un solvant primaire ATF 0,1 % et le solvant secondaire acétonitrile-ATF 0,1 %. Les conditions du gradient étaient 0-30 % en 20 min.; ensuite 30-45 % en 25 150 min.; 45-55 % en 20 min.; et 55-100 % en 10 min.

Tous les solvants étaient de qualité CLHP. Des fractions de 4 ml ont été recueillies et des portions de chaque fraction ont été examinées quant à l'activité d'inhibition de la croissance. Les fractions 72-75 se 30 sont révélées contenir la majorité de l'activité. Les fractions actives éluaient entre 41-52 % de la concentration d'acétonitrile.

Les fractions 72-75 ont été rassemblées.· * ~ “ ”*“ “ ““ i ι « 22 rassemblées. Le mélange a été injecté dans une colonne p p-Bondapak-C18 (3,9 x 300 mm) (désignée par C18 ) à température ambiante. Le débit a été fixé à 1 ml/min. et la vitesse d'enregistrement était de 0,25 cm/min.

5 Les conditions du gradient étaient 0-35 % en 10 min, 35-45 % en 100 min, et 45-100 % en 10 min. Les fractions ont été recueillies et des portions ont été prélevées et examinées quant à l'AIC. La majeure partie de l'activité émergeait de la colonne entre les 10 concentrations en acétonitrile de 40,7 à 41,3 % (durée de rétention 83-86 min).

Les fractions actives ont été rassemblées et diluées deux fois avec de l'ATF 0,1 % et injectées de manière isocratique sur une colonne μ-Bondapak-ClS 15 (3,9 x 300 mm) (désignée par C18 ), à température

ambiante. Le débit était de 1 ml/min et la vitesse d'enregistrement était de 0,25 cm/min. Un gradient _ linéaire a été utilisé entre le solvant primaire, ATF

0,1 % et le solvant secondaire n-propanol-ATF (0,1 %). 20 Les conditions du gradient étaient de 0-23 % en 20 min et 23-35 % en 120 min. Des fractions ont été recueillies et des portions de chaque fraction ont été examinées en ce qui concerne l'AIC. La plus grande partie de l'activité apparaissait entre 25-26,5 % de concen-25 tration du propanol (durée de rétention 59 min). Cette fraction apparamment homogène contenait environ 300 ng de protéines et environ 40.000 unités AIC.

Détermination de la modulation de croissance cellulaire en utilisant l'incorporation de 30 3H-thymidine dans de l'ADN (AIC)

Les déterminations ont été effectuées dans des plaques à 96 alvéoles plates (Costar 3596). Des cellules de mélanome humain (A375) ont été utilisées y en tant que lignée de cellules indicatrices sensibles.

I i I j i > t 23 ο

Des cellules (3 x 10 ) dans 0,1 ml d'un milieu Eagles modifié de Dulbecco (MEMD) complété avec 10 % de SFV et PS ont été placées dans chaque alvéole. Trois heures plus tard, 0,1 ml des échantillons testés a 5 été ajouté dans chaque· alvéole. Les plaques ont été incubées à 37°C durant 3 jours. Ensuite, 0,025 ml (0,5 juCi) d'une solution de H-thymidine (activité spécifique 27 μC±/μg) a été ajouté dans chaque alvéole pendant les 6 dernières heures d'incubation. Les 10 cellules ont été ensuite transférées sur des lamelles filtres en verre en utilisant un collecteur multi-. alvéoles (PHD Cell Harvester, Cambridge Technology, Inc.) Les filtres ont été transférés dans des flacons à scintillation dans lesquels on a ajouté 2 ml d'un 15 fluide de scintillation (Scientiverse II, Fisher

Scientific Co.) avant d'effectuer le comptage, dans un compteur à scintillation, pour quantifier 1'incorpora- 3 tion de H-thymidine.

Détermination de l'inhibition de colonies 20 sur agar doux (TGI)

Une couche de base de 0,5 ml consistant en 0,5 % d'agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) dans du MEMD contenant 10 % de sérum de foetus de veau (SFV) a été déposée sur plaques à 24 25 alvéoles pour culture tissulaire Costar. 0,5 ml d'agar à 0,3 % contenant le même mélange milieu -SFV, 1-2,5 x 3 10 cellules A375 et le facteur à tester en diverses concentrations, ont été déposés sur la couche d'agar de base. Les plaques ont été incubées à 37°C dans une 30 atmosphère humide à 5 % de C02 dans de 1'air et ont été réalimentées après 7 jours par addition de 0,5 ml d'agar à 0,3 % contenant le même milieu et les mêmes concentrations du facteur. Les colonies non-fixées et non-colorées ont été dénombrées et le nombre de > * * 24 colonies de plus de 6 cellules a été enregistré entre le 7ème et le 14ème jour.

Résultats Séquences de l'Oncostatin M isolé à partir 5 des cellules U937

La séquence N-Terminale et les fragments internes de l'Oncostatin M ont été déterminés par analyse de microséquence du polypeptide S-pyridinéthylé et réduit et des peptides obtenus à partir des produits de diges-10 tion enzymatique de l'Oncostatin M réduit et S-pyridinéthylé avec 1'endoprotéinase Lys-C et le protéase du Staphylococcus aureus V8. Les fragments de peptides ont été purifiés par CLHP en phase inverse, en utilisant des solvants volatils. Les peptides ont 15 été soumis à dégradation Edman répétitive automatisée dans un appareil pour séquences de protéines Modèle 470A (Applied Biosystems, Inc.). Les phénylthiohydan-toïne amino acides ont été analysés par CLHP en phase inverse (Applied Biosystems, Inc.) avec une colonne 20 PTH-C18 (2,1 x 220 mm, ABI), en utilisant pour l'élu-tion un gradient acétate de sodium tampon/tétrahydro-furanne/acétonitrile.

Les séquences amino acides résultantes sont substantiellement comme illustré dans la Figure 1. 25 Une comparaison de ces séquences avec celles conservées dans la base des données des protéines courantes (PIR Release 9,0, Mai 1986) ne révèle aucune homologie de séquence significative avec aucune autre séquence connue. De plus, il n'y a aucune homo-30 logie avec un facteur de nécrose tumorale, lymphotoxine, facteur de stimulation de colonies, interleucine 1 ou 2 ou facteur de croissance /^-transformant.

/U.

i > * « 25

Inhibition de la prolifération des cellules tumorales et augmentation de la prolifération des fibroblastes humains normaux

En utilisant la détermination de l'inhibi-5 tion des colonies sur agar doux décrite ci-dessus, on a obtenu les résultats suivants :

Tableau 1. Inhibition de la formation de colonies de cellules de mélanome A375 dans de 1'agar doux par l'Oncostatin M purifié isolé à 10 partir de cellules U937^ % d'inhibition Formation

Unités AlC/alvéole des colonies 4 de colonies 250 4 96 83 6 94 15 27 11 89 45 32 69 0 106 *Les cellules A375 ont été placées dans de l'agar doux, avec ou sans facteur, en un volume final de 2 ml, 20 comme décrit ci-dessus. Le facteur utilisé provenait d'une fraction sur colonne au propanol C18 avec une activité d'inhibition de la croissance tumorale en pic (AIC). Onze jours plus tard, le nombre des colonies a été déterminé. Une colonie a été définie comme étant 25 un groupe d'au moins 6 cellules. Une unité AIC a été définie comme étant la quantité provoquant 50 % d'inhibition de l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules A375 dans les micro-alvéoles, comme détaillé ci-dessus.

30 Dans l'étude suivante, divers traitements ont été employés pour déterminer l'effet du traitement, soit chimique ou soit physique, sur l'activité du polypeptide de l'invention. Le tableau suivant indique les résultats obtenus.

i \ / V _ V % * 26

Tableau 2 : Effet des divers traitements des surnageants des cellules U937 induites par TPA sur l'activité d'inhibition de la croissance tumorale* 5 Dilution finale du surnageant 1:4 1:8 1:16

Milieu témoin - - 39.780

Surnageant non-traité 7.206** 13.896 16.000

Acide acétique IN 6.670 17.073 18.783 10 IN NH40H 6.956 15.016 ‘13.923 *Les cellules U937 ont été traitées avec du TPA (10 ng/ml) durant 3 jours et ensuite les cellules ont été lavées avec les milieux et incubées durant 24 heures dans des milieux exempts de sérum avant de 15 recueillir les surnageants. Les surnageants ont été traités avec de l'acide acétique IN ou de 1'hydroxyde d'ammonium IN (NH4OH). Ils ont été ensuite dialysés contre le milieu et testés quant à leur aptitude à inhiber 1'incorporation de ^H-thymidine dans les 20 cellules A375. Les cellules A375 ont été marquées avec la 3H-thymidine (3H-TdR) durant les 6 dernières heures d'une incubation de 3 jours.

**Les résultats présentés sont des comptages d'incorporation de 3n-TdR par minute.

25 Les résultats ci-dessus démontrent que l'Oncostatin M dans le surnageant dialysé est substantiellement résistant à une inactivation par de l'acide acétique IN et de l'hydroxyde d'ammonium IN. Ainsi, les composés de l'invention sont relativement insensi-30 blés à la fois à un acide modérément fort et à une base modérément forte. Le composé de l'invention est stable à un traitement thermique durant 1 h à 56°C mais pas à 90°C durant 30 minutes.

Le composé de 1'invention a aussi été 35 testé en ce qui concerne sa stabilité thermique et on a constaté qu'il conserve son activité après une exposition à 56°C durant 1 heure mais qu'il perd substantiellement toute son activité après exposition à 95°C

K. .

\ , * 27 durant 30 minutes.

Dans l'étude suivante, on a examiné l'aptitude des polypeptides de l'invention à inhiber la réplication des cellules tumorales de diverses cellu-5 les néoplastiques. Le tableau suivant indique les résultats obtenus.

Tableau 3. Inhibition de la réplication des cellules „ tumorales par l'Oncostatin M purifié prove nant des cellules U937 10 Unités d'AIC pour provoquer 30 % d'inhibition 3

Cellules tumorales Incorporation de H-TdR

A549 (cancer du poumon) 21 HTB10 (neuroblastome) 81 15 A375 (mélanome) 0,3

Les cellules tumorales ont été placées dans des microalvéoles 3 heures avant' l'addition des diverses dilutions d'Oncostatin M, purifié par CLHP en phase inverse comme détaillé ci-dessus. Durant les 6 derni-20 ères heures d'une incubation de 3 jours, les cellules dans 0,2 ml du milieu ont été marquées avec la H-thymidine (3H-TdR) (0,5 μθΐ/alvéole). Une unité d'activité d'inhibition de la croissance tumorale (AIC) est définie dans la légende du Tableau 1 comme étant la 25 quantité qui provoque une inhibition de 50 % de 3 l'incorporation de H-TdR dans les cellules de mélanome A375. On a déterminé qu'une unité était environ 10 pg de protéine purifiée, par conséquent, la concentration (ng/ml) pour provoquer une inhibition de 30 % 30 de 3H-TdR dans des cellules A549, HTB10 et A375 était approximativement de 1,4, 4,0 et 0,015 ng/ml, respectivement. Dans aucune expérience, l'incorporation de 3 H-TdR dans ces fibroblastes humains normaux W126 n'a ^ été supprimée par le facteur U937-.

28 > * *

Les résultats ci-dessus démontrent que l'Oncostatin M est sélectif dans son aptitude à inhiber la réplication, en ayant des effets variant très fortement selon la nature de la cellule. Le composé de 5 l'invention est efficace contre les cellules de mélanome telles que les cellules de mélanome A375, les cellules du cancer du poumon squameux telles que A549 et les cellules de neuroblastome telles que les HTB10.

3

Des cellules tumorales, à raison de 3 x 10 10 cellules/alvéole, et des fibroblastes normaux, à raison de 1,5 x 10 cellules/alvéole, ont été déposés dans des plaques à 96 alvéoles durant 3 heures.

Diverses concentrations d'Oncostatin M purifié, obtenu g à partir de la fraction provenant de la colonne C18 15 avec une activité d'anti-prolifération en pic contre les cellules A375, ont été ajoutées et, trois jours 3 plus tard, l'incorporation de H-thymidine dans les cellules a été mesurée en triple dans les alvéoles pour chaque concentration. Les résultats sont indiqués 20 dans le Tableau 4.

Λ, y

X

x.

i 29 > » * f

Tableau 4. Inhibition de la prolifération des cellules tumorales et augmentation de la prolifération des fibroblastes normaux par 1'Oncostatin M

5 Unités AIC/ cellule % d'inhibition % de stimulation Ä375 W138

Exp. 1 16 83 25 4 62 30 10 1 46 46 A375 HTB10 W126

Exp. 2 27 NT 28 46 9 87 · 22 36 3 76 11 52 15 A375 A549

Exp. 3 75 89 30 25 85 22 8 71 16 A375 SK-MEL28 20 Exp T" 4 20 87 44 5 75 25 1 59 11

Les résultats indiquent le % d'inhibition ou le % de stimulation de la 3H-thymidine incorporée dans les 25 cellules tumorales (A375, HTB10, A549 et SK-MEL28) et dans les fibroblastes normaux (W126 et ¥138), respectivement. Une unité AIC est définie dans la légende du Tableau 1 comme étant la quantité d'Oncostatin M qui provoque une inhibition de 50 % de l'incorporation de 30 ^H-thymidine dans les cellules A375.

En plus de l'effet différentiel observé 3 sur l'incorporation de H-thymidine dans les cellules tumorales et les fibroblastes humains normaux, on a aussi constaté un effet différentiel sur la morpholo-; 35 gie et le nombre de cellules après un traitement des deux types de cellules durant 3 jours avec 1'Oncostatin M, comme indiqué à la Figure 2.

L'Oncostatin M utilisé provenait d'une 3 ! fraction de colonne CLHP-C18 avec une activité en pic 30 / pour l'inhibition de la prolifération des cellules A375. La Figure 2 est une série de microphotographies des cellules de mélanome A375 qui ont été non-traitées (A), traitées avec 5 unités d'activité d'inhibition 5 de croissance (AIC) d'Oncostatin Μ (B), ou 100 unités (C). Les microphotographies des fibroblastes W138 qui ont été non-traités (D), traités avec 5 unités AIC (E), ou 100 unités (F) sont aussi présentées. Les cellules ont été colorées avec du cristal violet dans du métha-10 nol à 0,5 %. Grossissement = 63X.

NaDodSO^/PAGE d'Oncostatin M

L'Oncostatin M purifié, soumis à NaDodSO^ sous des conditions de réduction, s'est révélé avoir un poids moléculaire apparent d'environ 28 kD comme 15 indiqué à la Figure 3. Les protéines suivantes ont été utilisées comme étalons (bande A) : ovalbumine, Mr = 43 kD chymotrypsinogène o< , Mr = 25,7 kD; lactoglobu-lineß , Mr = 18,4 kD; lysozyme, Mr = 14,2 kD; inhibiteur trypsine bovin = 6,2 kD; chaîne d'insuline A et B, 20 Mr = 2,3 kD et 3,4 kD respectivement. L'Oncostatin M a été appliqué à la bande B.

L'Oncostatin M soumis à PAGE sous des conditions non-réductrices, a aussi un poids moléculaire apparent de 28 kD et une protéine électro-éluée 25 provenant de la bande s'est révélé inhiber la prolifération des cellules A375.

Anticorps d'un peptide synthétique de l'Qncostatin M réagissant dans de l'Oncostatin M marqué à L'I125 dans des précipitations radioimmunisées 30 a) Synthèse du peptide : Le peptide corres pond aux résidus 6-19 de la protéine Oncostatin M et a été synthétisé par des techniques en phase, solide sur un instrument automatisé Beckman, comme décrit (Gentry L-x / i » .- 31 et al., J. Biol. Chem. (1983) 258:11219). Le peptide a été clivé à partir de la résine en utilisant le mode opératoire HF "Low-High" (Tam et al., J. Amer. Chem.

Soc. (1983) 105 :6442-6445)♦ La purification a été 5 accomplie par CLHP préparative.

b) Production des anticorps : Le peptide a été couplé à de la ^-globuline de bovin comme décrit (Gentry et Lawton, Virology (1986) 152:421-431). Des lapins blancs de Nouvelle Zélande ont été inoculés et 10 ont reçu une injection supplémentaire (5 fois) en quatre sites sous-cutanés comme décrit (Gentry et Lawton,.Virology (1986) 152:421-431). Les antisérums utilisés ont été obtenus 2 semaines après la cinquième injection.

15 c) Iodisation de l'Oncostatin M : Un échantil lon d'Oncostatin M partiellement purifié a été radiomarqué avec de l'iode 125 en utilisant des inodes opératoires déjà publiés (Linsley et al., PNAS (1985) 82: 356-360). Une partie de la préparation marquée, conte-20 nant 100.000 cpm, a été mélangée avec un antisérum de lapin dirigé contre les 17 amino acides N-terminaux de l'Oncostatin M (dilution finale de 1:20), en absence ou en présence du peptide N-terminal (les 17 amino acides N-terminaux de l'Oncostatin M) (2 μ§) et a été 25 soumise à analyse par précipitation immunisée comme décrit (Linsley et al., Biochemistry (1986) 25:2978-2986).

De manière spécifique, un tube contenant 5 μΐ a été pré-incubé avec 2 du peptide N-terminal 30 dans 10 ml de TNEN (20 mM tris pH 7,5, 5mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05 % Nonidet P-40) contenant 0,1 % de BSA durant 30 minutes à 4°C avant l'addition de-l'Oncostatin Μ I125 dans 85 XtNEN contenant 0,1 % de BSA et 40 mM de dithiothréitol (DTT). Sept tubes conte-35 nant 5 μΐ d· antisérums ont été incubés avec

/L

i . i * 125 32 / 1'Oncostatin Μ I dans 85 μΐ de TNEN contenant 0,1 % de BSA et 40 mM de DTT durant 30 minutes à 4°C avant addition de 50 μΐ de Staphylococcus aureus fixé sur de la formaline à 10 % (Pansorbin, Calbiochem).

5 Après incubation supplémentaire durant 30 minutes à 4°C, les tubes ont été microfugés et les boulettes ont été lavées 4 fois avec 1 ml de TNEN avant d'être soumises à analyse PAGE. Une bande diffuse de Mr = 32 kD a été observée après analyse 10 SDS/PAGE des précipités immunisés. La précipitation de cette espèce a été inhibée par l'inclusion d'un excès de peptide non-marqué correspondant au 17 amino acides N-terminaux de 1'Oncostatin M, indiquant que la précipitation était spécifique pour ce peptide.

15 La composition de carbohydrate de 1'Oncos tatin M a été examinée par un test sur la sensibilité au glycosidase. Les précipités immunisés préparés comme dans c) ci-dessus ont été traités avec un tampon^ un endoglycosidase H ou un neuraminidase, comme décrit 20 par Linsley £t al. (1986). Un traitement avec un endoglycosidase H, un enzyme spécifique des oligosaccharides de mannose supérieur N-liés, a eu pour résultat l'apparition d'une espèce à poids moléculaire plus bas, de Mr = 24 kD. Une partie seulement de la matière 25 radio-marquée était sensible à cet enzyme, indiquant que toutes les molécules ne contenaient pas des oligosaccharides de mannose supérieur. Un traitement avec un neuraminidase a eu pour résultat l'apparition d'une seule bande de Mr = 27 kD, indiquant que l'hétérogé-’ 30 néité de la dimension de 1'Oncostatin M non-traité marqué à l'I12^ était due à l'hétérogénéité moléculaire dans la sialyation du noyau glycoprotéine. Les résultats indiquaient que des préparations actives / d*Oncostatin M contenaient un mélange de chaînes ·* · » i * 33 i latérales d'oligosaccharide N-lié complexe et de mannose supérieur.

Oncostatin M isolé à partir de lymphocytes de sang périphérique humain normal (LSP)

5 Production d'un inhibiteur de croissance cellulaire tumorale à partir des LSP

Des leuco-fractions contenant des LSP, obtenus à la Banque du Sang, ont été dilués 1:1 avec un salin tamponné au phosphate, pH 7,4 (STP). Trente-10 cinq ml de sang dilué ont été mis en contact avec ..

10 ml d'une solution consistant en 9 % de Ficoll contenant 20 % en volume de diatrizoate de- sodium à 50 % (poids spécifique final de 1,080). Les gradients ont été centrifugés à température ambiante durant 20 15 minutes à 850 x g. Les cellules ont été recueillies à partir de 1'interface du gradient et ont été lavées avec du STP. Les cellules des globules rouges ont été lysées par choc durant 3-4 minutes avec 10-20 ml d'une solution contenant 0,8 % de chlorure d'ammonium et 20 0,1 % de Na4-EDTA.

Les cellules ont été recueillies hors de la solution de lyse des globules rouges par centrifugation à 600 x g durant 10 minutes et puis remises en suspension dans 10 ml d'un milieu RPMI 1640 (GIBCO) 25 contenant 5 % de sérum de foetus bovin. De la thrombine a été ajoutée jusqu'à une concentration finale de 0,5 U/ml. La suspension de cellules a été agitée durant 5 minutes à 37°C et l'agrégat en plaquettes a été laissé pour sédimentation durant 5 minutes. Les 30 cellules en suspension ont été transférées dans de nouveaux tubes, récupérées par centrifugation, remises en suspension dans 1 ml de sérum de foetus bovin, et ont été- transférées dans une colonne contenant 0,5 g de laine de nylon pré-mouillée, brossée, type 200 35 (Fenwal).

34 s Λ- > «

La colonne de laine de nylon a été incubée à 37°C durant 60 minutes pour permettre l'attachement des monocytes et des lymphocytes B. La colonne a été ensuite lavée avec 3 x un volume du milieu RPMI 1640 5 (37°C) contenant 5 % de sérum de foetus bovin et les cellules éluées non-adhérantes (LSP) ont été recueillies.

Les LSP (2 x 10 cellules/ml) ont été cultivées à 37°C dans 5 % de C02-95 % d'air durant 96 10 heures dans un milieu RPMI-1640 (10,4 g/1) contenant

FeS04.7H20 (l mg/1), ZnS04-7H20 (2 mg/1), Na2Se03.5H20 (0,017 mg/1), 1-aminoéthanol (1 mg/1) transferrine humaine (5 mg/1), produit conjugué acide linoléique-albumine de sérum bovin (Sigma) (200 mg/1), 15 L-glutamine (300 mg/1), pénicilline/streptomycine (100.000 unités/1) et phytohémagglutinine-P (Wellcome) (2 mg/1). Les surnageants ont été recueillis, centrifugés pour éliminer les cellules, concentrés par ultrafiltration (membrane Amicon Diaflo YM-10, arrêt à 20 10 kD) et à nouveau dialysés vis-à-vis de l'acide acé tique 0,1 M (dispositif tubulaire pour dialyse 3 Spectrapore). Les produits retenus ont été lyophilisés.

Chromatographie par perméation sur gel 25 La fraction brute a été reconstituée dans 20 ml d'acide acétique 1 M (50 mg/ml) et a été appliquée à une colonne BioGel P-100 (2,6 x 88 cm) équilibrée avec de l'acide acétique 1 M à un débit de 0,5 ml/ min. Des fractions de 12 ml ont été collectées. Une 30 partie de chacune des fractions a été évaporée et examinée trois fois en ce qui concerne l'activité d'inhibition de la croissance (AIC) des cellules A375. Les fractions actives ont été rassemblées, lyophilisées et chromatographiées à nouveau sur une colonne t 35 Bio-Sil TSK-250 (600 x 21,5 mm), comme décrit.

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35 i

Chromatographie à pression élevée en phase inverse des fractions TSK-250

La purification finale des fractions TSK-250 rassemblées a été réalisée par une CLHP en phase 5 inverse essentiellement comme décrit. L'inhibiteur de cellules tumorales dérivé des LSP éluait sur support μBondapak C18 à des concentrations de 40-41 % d'acéto-nitrile et 26,5 % de n-propanol, respectivement.

Détermination de la modulation de croissance 10 cellulaire en utilisant l'incorporation de I125-iodo-déoxyuridine dans l'ADN (AIC) :

Ces déterminations ont été effectuées dans des bacs pour cultures tissulaires comportant 96 alvéoles à fond plat (Costar 3596). Des cellules de 15 mélanome humain, A375 (4 x 10 ) dans 50 μΐ d'un échantillon test, ont été ajoutées dans chacune des alvéoles et incubées durant 3 jours à 37°C. Les cellules

A p C

ont été marquées durant 24 heures avec I -IdU (0,05 juCi/alvéole) et incubées 24 heures supplémen-20 taires. Les cellules ont été lavées trois fois, collectées avec un dispositif pour récolter des échantillons multiples, et la radioactivité a été mesurée dans un compteur gamma.

Résultats : 25 Une préparation d'un inhibiteur de cellules de tumeur . dérivées de LSP a été soumise à une dégradation Edman répétitive automatisée. La séquence amino acide amino-terminale est la suivante : 15 10 15 A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K 30 X représente un amino acide qui n'a pas été iden tifié.

j’i Une comparaison de cette séquence avec 36 . > \ celle du facteur U937 indique clairement une identité avec le N-terminus du facteur dérivé des LSP.

1 5 10 15

Facteur LSP A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K Facteur U937 A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K

5 Dans 1'étude suivante, 1'aptitude de l'Oncostatin M dérivé des LSP à effectuer une réplication de diverses cellules a été examinée. On a constaté que des cellules de souris L929 étaient insensibles à l'Oncostatin M dérivé des LSP en utilisant jusqu'à 10 1.000 unités AIC/ml. La croissance des fibroblastes humains W126 a été stimulée par traitement avec 1.000 unités AIC/ml. La prolifération des lymphocytes T humains normaux, 72 heures après mitogénèse, n'était pas affectée jusqu'à 500 unités AIC/ml.

15 A partir des résultats ci-dessus, il est évident qu'un nouveau polypeptide et des fragments de polypeptide ont été obtenus, et qu'ils peuvent être utilisés pour moduler une croissance cellulaire. On a constaté que le composé a une activité différente 20 selon la nature de la lignée de cellules concernée, de telle sorte qu'il peut être utilisé tel quel ou en conjonction avec d'autres composés pour la modulation de la croissance cellulaire. Les. polypeptides de l'invention fournissent un polypeptide supplémentaire 25 qui peut être utilisé avec des mélanges de cellules, à la fois in vivo et iji vitro, pour réduire ou augmenter sélectivement la prolifération cellulaire d'un type particulier de cellules.

En particulier, le facteur peut être utili-30 sé pour traiter des cellules de transplants de moelle osseuse autologues. L'utilisation du facteur inhibe la croissance des cellules tumorales dans la moelle et λ peut stimuler la formation de colonies de cellules.

^ L'Oncostatin M peut aussi être employé pour stimuler 37 ·♦ * f t la croissance des cellules épithéliales, favorisant ainsi la cicatrisation des blessures. De plus, le polypeptide intact ou ses fragments peuvent être utilisés comme immunogènes pour induire la formation d'un 5 anticorps. Les anticorps induits peuvent être utilisés pour titrer l'Oncostatin M présent dans un fluide corporel ou pour moduler l'activité du facteur en se liant à lui. En outre, ces anticorps avec l'Oncostatin M purifié ou ses fragments servent de composants de 10 kits pour diagnostics en conjonction avec d'autres réactifs, en particulier des anticorps, pour détecter et quantifier l'Oncostatin M.

Bien que la présente invention ait été décrite de manière détaillée grâce aux illustrations 15 et aux exemples afin de faciliter sa compréhension, il est bien entendu que certains changements et modifications peuvent être apportés tout en restant dans le cadre des revendications en annexe.

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Claims (18)

1. Nouveau poly(amino acide), caractérisé en ce qu'il comprend au moins huit amino acides et est à réaction croisée immunologique avec un composé, ce 5 composé étant un polypeptide pouvant être obtenu à partir de leucocytes, capable d'inhiber la prolifération des cellules néoplastiques, de stimuler la prolifération des fibroblastes humains normaux, de ne pas inhiber les réponses des cellules T cytotoxiques et 10 proliférantes humaines et de ne pas inhiber la formation de colonies cellulaires de la moelle osseuse granulocytique/myélocytique, ayant un poids moléculaire dans la gamme d'environ'17 à 19 kD déterminé par chromatographie par exclusion sur gel et d'environ 15 28 kD déterminé par SDS-PAGE, et étant relativement insensible aux acides et bases modérés ainsi qu'aux températures modérément élevées. -

2. Poly(amino acide) suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence amino 20 acide ayant au moins dix amino acides consécutifs qui correspondent à une séquence amino acide décrite à la Figure 1 et ne différant pas de cette séquence par plus de trois amino acides.

3. Poly(amino acide) suivant la revendication 25 2, caractérisé en ce qu'il contient 12 amino acides consécutifs qui correspondent à une séquence amino acide décrite à la Figure 1 et ne différant pas de cette séquence par plus d'un amino acide, cette différence étant soit une délétion ou soit une substitution 30 de conservation.

4. Nouvelle composition de polypeptide, caractérisée en ce qu'elle peut être obtenue à partir t 1^^^^ ^ leucoc^^es' con,t:^en^ un composant capable d'inhiber / v ♦ 39 t * w la prolifération des cellules néoplastiques, de stimuler la prolifération des fibroblastes humains normaux, de ne pas inhiber les réponses des cellules T cytotoxiques et proliférantes humaines et de ne pas 5 inhiber la formation des colonies de cellules de moelle osseuse granulocytique / myélocytique, ayant un poids moléculaire dans la gamme d'environ 17 à 19 kD déterminé par chromatographie par exclusion sur gel et d'environ 28 kD déterminé par SDS-PAGE, et étant 10 relativement insensible aux acides et bases modérés ainsi qu'aux températures modérément élevées; et présente une pureté fournissant une activité spécifi-, que d'au moins environ 10 unités AIC/ng de protéine.

5. Composition de polypeptide suivant la 15 revendication 4, caractérisée en ce que les leucocytes sont des lymphocytes de sang périphérique humain normaux activés par mitogène.

6. Composition de polypeptide suivant la revendication 4, caractérisée en ce que les leucocytes 20 sont des cellules de lymphome histiocytique humain induites par diester de phorbol.

7. Composition de polypeptide suivant la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est substantiellement exempte de composants cellulaires.

8. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'une composition suivant la revendication 4, son activité spécifique étant d'au moins environ 100 unités AIC/ng de protéine.

9. Polypeptide substantiellement exempt de 30 débris cellulaires et d'autres protéines leucocytes, caractérisé en ce qu'il est capable d'inhiber la prolifération des cellules néoplastiques, de stimuler la i / prolifération des fibroblastes humains normaux, de ne ·« * « 40 l pas inhiber les réponses des cellules T cytotoxiques et proliférantes humaines et de ne pas inhiber la formation des colonies cellulaires de moelle osseuse granulocytique/myélocytique, ayant un poids moléculai-5 re dans la gamme d'environ 17 à 19 kD déterminé par chromatographie par exclusion sur gel et d'environ 28 kD déterminé par SDS-PAGE, et étant relativement insensible aux acides et bases modérés ainsi qu'aux températures modérément élevées, et incluant des 10 séquences amino acides correspondant aux séquences représentées à la Figure 1, avec des différences de pas plus de trois amino acides entre la séquence décrite et la séquence correspondante.

10. Polypeptide suivant la revendication 9, 15 caractérisé en ce que la séquence correspondante diffère de pas plus d'un amino acide par rapport à la séquence décrite.

11. Procédé d'inhibition de la prolifération des cellules néoplastiques, caractérisé en ce qu'on 20 met en contact les cellules avec une quantité d'un composé suivant la revendication 8 inhibant la prolifération. · .

12. Procédé pour favoriser la cicatrisation des blessures, caractérisé en ce qu'on met en contact 25 une blessure avec une quantité de polypeptide suivant la revendication 8 stimulant la prolifération des fibroblastes.

13. Anticorps caractérisés en ce qu'ils sont spécifiques pour une composition de polypeptide ' 30 suivant la revendication 1 ou la revendication 4.

14. Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils correspondent à la revendication 13. • « / ; « 1 41

15. Procédé pour la détection de la présence d'une composition de polypeptide suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend : la combinaison d'un échantillon suspecté 5 de contenir cette composition avec un anticorps suivant la revendication 13, et la détermination de la quantité de formation d'un complexe avec cet anticorps.

16. Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle 10 encode un polypeptide suivant la revendication 8.

17. Procédé pour la production d'un polypeptide suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend : la croissance d'une culture cellulaire contenant des cellules ayant une structure d'expression comprenant une séquence d'ADN encodant un polypeptide suivant la revendication 4 sous contrôle régulateur des signaux de régulation translationnels et transcriptionnels, fonctionnels dans ces cellules, ce qui permet l'expression du polypeptide; et l'isolation du polypeptide substantiellement exempt de matériaux cellulaires.

18. Kit pour diagnostics, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps suivant la revendication „ 13 et au moins un poly(amino acide) suivant la revendication 1 ou un polypeptide suivant la revendication 8. t