NL8603209A - Nieuwe celgroei-regulerende factor. - Google Patents

Description

i a VO 8477

Nieuwe celgroei-regulerende factor.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuw poly(aminozuur) en en een werkwijze voor het verkrijgen daarvan met ten minste acht aminozuren, dat immunologisch kruisreactief is met een verbinding, welke verbinding een polypeptide is dat kan worden verkregen uit leukocyten, dat 5 in staat is de woekering van neoplastische cellen te remmen, de uitbreiding van normale humane fibroblasten te stimuleren, de humane uitbreidende cytotoxische T-celreacties niet remt en evenmin de granulocytische/ myelocytische beenmergkoloniecelvorming remt, werkwijzen voor het remmen van de woekering van neoplastische cellen en het bevorderen van wondgene-10 zing, voor het polypeptide specifieke antilichamen, een voor het polypeptide coderende DNA-volgorde alsmede diagnostische middelen.

Leukocyten, zowel lymfocyten als monocyten zijn betrokken bij de remming van tumorgroei bij verschillende diertumormodellen. Het verhoogde voorkomen van kwaadaardige tumoren bij mensen met gestoord immunosysteem 15 steunt de stelling, dat de witte bloedcellen een rol spelen bij de regulering van neoplastische groei. Protelnefactoren, die door deze witte cellen worden geproduceerd en die tumorgroei remmen of immuunfuncties moduleren, zijn reeds geïsoleerd en gekarakteriseerd, en omvatten de interferonen, a- en γ-, tumomecrosefactor, lymfotoxine, interleukine-2 20 en andere lymfokienen.

Aangezien elke factor die is geïsoleerd een ander spectrum van activiteiten bezit en anders zal samenwerken met andere factoren blijft er een voortdurend sterke belangstelling bestaan in de isolering van en karakterisering van alle factoren, die witte cellen bij de modulatie van 25 celgroei of:immuunfuncties produceren. Deze verbindingen kunnen individueel of tezamen toepassing vinden bij de behandeling of diagnose van kanker, als promotors voor wondheling of als immunomodulatoren voor de behandeling van patiënten met immunodeficiëntie, auto-immuniteit, orgaan-transplantaties, en dergelijke.

30 Men ondervindt verschillende moeilijkheden bij het ontdekken, isoleren, zuiveren of karakteriseren van natuurlijk voorkomende factoren.

Er moeten methodologieën worden ontwikkeld voor het scheiden en zuiveren van een belangwekkende factor van andere factoren in het ruwe uitgangsmateriaal zonder de activiteit van de gewenste factor te denatureren;

'3 Λ ^ ^ l' Λ A

ft c ΰ i ö 9 T f -2- er moeten biologische analyses worden ontwikkeld, waardoor de fracties gedurende de scheidingen, waarmee een bepaalde factor wordt geconcentreerd, kunnen worden geïdentificeerd? een nieuwe factor moet van andere factoren, die reeds bekend zijn of andere onbekende factoren, die aan-5 wezig kunnen zijn en hetzij negatief of positief de activiteit van de nagestreefde factor beïnvloeden, worden onderscheiden; de gezuiverde factor moet worden gekarakteriseerd en de gezuiverde factor moet in vol- doende hoeveelheid worden geconcentreerd om identificatie en karakterisering van de factor mogelijk te maken.

10 Met het stijgende aantal factoren die reeds zijn geïsoleerd, wordt het steeds moeilijker elke factor te identificeren, aangezien zijn rol en functie overschaduwd kan worden door de talrijke andere aanwezige factoren.

Beschrijving van de stand van de techniek 15 Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3^93-96 vermelden de aanwezigheid van peptiden in menselijk urine, waardoor de groei en DNA-synthese in getransformeerde cellen meer wordt geremd dan in normale cellen.

Holley et., Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 2Z!5989-5992 beschrij-20 ven de zuivering van epitele celgroei-remstoffen.

Letansky, Bisoci. Rep. (1982) 2:39-45 vermelden dat gezuiverde peptiden uit runderplacenta tumorgroei en thymidine-opname in DNA in grotere mate remmen in neoplasma's dan in normale cellen.

Chen, Trends Biochem. Sci. (1982) 25364-365 vermeldt de isole-25 ring van een peptide uit ascitesvloeistof met kanker-onderdrukkende eigenschappen.

Redding en Schally, Proc. Natl. Acad. Sci. (1982) 79:7014-7018 vermelden de isolering van gezuiverd(e) peptide(n) uit varkenshypothala-mus, die antimitogene activiteit tegen verschillende normale en tumor-30 cellijnen vertoont.

Sone et al., Gann (1984) 75:920-928 vermelden de.produktie van een factor (factoren), die door humane macrofagen worden geproduceerd en de groei van bepaalde tumorcellen in vitro remmen.

Ransom et al., Cancer Res. (1985) 45:851-862 vermelden de isole-35 ring van een factor, genaamd leukoreguline, die de replicatie van bepaalde tumorcellijnen remt en zich onderscheidt van lymfytoxine, interferon en intérleukine 1 en 2. De meeste van deze factoren zijn niet vol- > Λ y π ^ v i. y? ïjf * i -3- ledig gekarakteriseerd; evenmin zijn hun primaire structuren bekend.

Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:686-691 zuiverden en karakteriseerden humaan lymfotoxine (LT) geproduceerd door een lymfo-blastoide cellijn en bepaalden vervolgens de LT-sequentie (Aggarwal et al.

5 J. Biol. Chem. (1985) 260:2334. Gamma-interferon (γ-IF) dat door lymfo-ide cellen is geproduceerd en een immunomodulerend en tumor-remmende activiteit heeft is gekloneerd en tot expressie gebracht. (Gray et al., Nature (1982) 295:503-508). Tumor-necrosefactor (TNF), die de groei van bepaalde tumoren remt en wordt geproduceerd door macrofagen en de be-10 paalde leukemie-cellijnen is gekarakteriseerd, waarbij de TNFcDNA werd gekloneerd en tot expressie gebracht in E. Coli (Pennica et al., Nature (1984) 312:724).

Samenvatting van de uitvinding

Er wordt voorzien in een nieuwe peptidefactor en biologisch ac-15 tieve fragmenten daarvan, welke factor verkrijgbaar is uit leukocyten.

De factor is bruikbaar voor het moduleren van celgroei, zoals het remmen van de tumorcelgroei en het stimuleren van de groei van normale fibro-blasten en hij kan immuunfuncties moduleren. De factor heeft een amino-zuurvolgorde, die duidelijk verschilt van de volgordes van andere ver-20 bindingen, waarvan is vermeld dat zij analoge eigenschappen hebben.

Korte omschrijving van de tekeningen

Fig. 1 stelt de aminozuurvolgorde van fragmenten van Oncostatine M voor; fig. 2 is een reeks van microfoto's van cellen, behandeld met 25 Oncostatine M, waarbij (A-C) A375 melanomacellen behandeld met respectievelijk 0,5 en 100 GIA eenheden zijn en (D-F) WI38 fibroblasten zijn, behandeld met resp. 0,5 en 100 GIA- eenheden, terwijl fig. 3 een foto van een SDS-PAGE analyse van Oncostatine M is.

Er wordt voorzien in een nieuw polypeptide, polypeptideprepara-30 ten, polypeptidefragmenten en mutaties, de bereiding en toepassing ervan, waarbij de preparaten activiteit bij de modulering van celgroei, in het bijzonder het remmen van tumorcelgroei en het stimuleren van groei van normale fibroblasten demonstreren. Een onderhavig polypeptide, aangeduid als Oncostatine M is verkrijgbaar uit leukocyten; bijvoorbeeld uit 35 geconditioneerde media van gestimuleerde D937 cellen of geconditioneerde media van gestimuleerde normale humane periferale bloedlymfocyten (PBL).

8303209 ï * -4-

Fragmenten en mutanten van het polypeptide met de biologische activiteit van het intacte Oncostatine M, zoals celgroeimodulatieactiviteit of immunologische activiteit, worden tevens voorzien.

De polypeptidefragmenten van deze uitvinding zijn nieuwe poly-5 peptiden met ten minste acht aminozuren, die biologisch actief zijn, in zoverre dat zij tenminste immunologisch kruisactief zijn met het in de natuur voorkomende Oncostatine M. Onder immunologische kruisreactie ver- · staat men dat een antilichaam geïnduceerd door een nieuw polypeptide van deze uitvinding in kruisreactie zal treden met intact Oncostatine M, 10 tenminste wanneer Oncostatine M zich in een gedenatureerde toestand bevindt. Deze polypeptiden zijn derhalve geschikt voor het induceren van antilichamen ten opzichte van Oncostatine M, die bruikbaar zijn voor de bepaling van de concentratie van Oncostatine M in een lichaamsvloeistof, om Oncostatine M te binden en aldus zijn activiteit te moduleren en om 15 Oncostatine M te zuiveren, zoals door toepassing in een affiniteits-kolom.

Een deel van de polypeptiden kan tevens de celgroei-modulerende activiteit van intact Oncostatine M behouden, hoewel die activiteit kan worden gemodificeerd, gewoonlijk verminderd in vergelijking met het 20 intacte Oncostatine M.

Fig. 1 stelt de aminozuurvolgorde voor van poly(aminozuren), die kruisreactief zijn met Oncostatine M, waarbij de eerste volgorde het N-eindstandige deel van Oncostatine M'voorstelt. Poly(aminozuren) volgens de uitvinding bevatten een aminozuurvolgorde met ten minste 8 25 achtereenvolgende aminozuren, die overeenkomen met de aminozuursequentie als voorgesteld in fig. 1 en die van die sequentie verschillen met niet meer dan 3, gewoonlijk niet meer dan 1 aminozuur. Dat verschil kan hetzij de insertie van een aminozuur, de deletie van een aminozuur en de substitutie van één aminozuur door een ander zijn, in het bijzonder een 30 conservatieve substitutie. Gewoonlijk zal het poly(aminozuur) ten minste 10, gewoonlijk ten minste 12, achtereenvolgende aminozuren bevatten, die overeenkomen met volgordes, die in de figuren zijn voorgesteld en die met niet meer dan 1 aminozuur verschillen. Voor de doeleinden van de onderhavige uitvinding zullen de verschillende aminozuren worden inge-35 deeld in een aantal subklassen. De volgende tabel geeft de subklassen aan: 8603203 i i -5- alifatisch neutraal

niet-polair G A P V L I

polair S T C M N Q

5 zuur D E

basisch K R

aromatisch F Η Y W

Onder conservatieve substituties verstaat men, dat aminozuren uit dezelfde subklasse (d.w.z. hetzij neutraal alifatisch, zuuralifatisch, 10 basisch alifatisch of aromatisch), meer in het bijzonder met dezelfde polariteit voor elkaar worden gesubstitueerd- Aminozuren met 2-4 koolstof-atomen of 5-6 koolstofatomen zullen bij voorkeur monomeergroeperingen in de alifatische subklasse vastleggen.

De poly(aminozuren) zijn niet langer dan 1000 aminozuren. Gewoon-15 lijk hebben zij minder dan 100 aminozuren, maar meestal minder dan 50.

Aldus kan het poly(aminozuur) gemakkelijk worden gesynthetiseerd. Gewoonlijk kunnen de poly(aminozuren) wanneer zij meer dan 100 aminozuren lang zijn, polymeren van fragmenten van Oncostatine M met elk minder dan 100 aminozuren, of fusieproteinen zijn, waarin het fragment aan een anti-20 geen, enzym, enzymfragmenten is gefuseerd. In het bijzonder kunnen de hoger-moleculaire poly(aminozuren) ten minste één polypeptidefragment van minder dan ongeveer 100 aminozuren covalent samengevoegd tot een grote immunogene polypeptidedrager zijn, die immunogeniciteit levert. Voorbeelden van dergelijke protexnedragers zijn runderserumalbumine, 25 keyhole limpet hemocyanine (KLH), en dergelijke. Dergelijke geconjugeerde polypeptiden zijn bruikbaar voor het induceren van antilichamen in een geschikt gastheerorganisme.

0937 cellen zijn een cellijn, afgeleid uit een histiocytische lym-fomacellijn (Sundstrom en Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17:565-577) die 30 ertoe kunnen worden aangezet zich te differentiëren in cellen met eigenschappen van macrofagen na behandeling met een veelvoud van middelen (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45:9-13). Voor de produktie van Oncostatine M kunnen de 0937 cellen worden gekweekt in een gebruikelijk voedingsmedium met serum en met een geschikte inducent worden behandeld.

8803209 I s -6-

Meestal kunnen forbolen of ingenolen worden toegepast, in het bijzonder 12-o-tetradecanoylforbol-13-acetaat (ΤΡΑ). Gewoonlijk kan ongeveer 5-20 ng/ml van de inducent worden toegepast. Het beginaantal cellen is 5 6 ongeveer 10 -10 cellen/ml.

5 Nadat men de cellen gedurende voldoende tijd met de inducent heeft laten behandelen, in het algemeen 3-6 dagen, wordt de bovenlaag verwijderd, worden de cellen gewassen met serumvrij voedingsmiddelmedium,' worden vastgehechte cellen opnieuw gewassen met serumvrij medium en worden de cellen gedurende ten minste 12 uur, gewoonlijk niet meer dan 48 10 48 uur geïncubeerd in serumvrij voedingsmiddelmedium, bijvoorbeeld RPMI-1640 medium. De bovenlagen worden daarna verzameld en de cellen door centrifugeren verwijderd. Celvrije bovenlagen werden onderzocht op celgroei-remmende activiteit (GIA) als beschreven in het experimentele overzicht. De bovenlaag bevat ongeveer 50-500 eenheden GIA/ml (zie expe-15 rimenteel voor definitie van GIA· eenheden).

Men kan tevens Oncostatine M verkrijgen uit mitogeen-gestimu-leerde normale humane periferale bloedlymfocyten (PBL's). Men kan PBL's isoleren uit leukofracties door de fracties te verdunnen en hen op Ficoll-gradiënten te centrifugeren. Cellen uit het gradiënt-grensvlak 20 verzameld, worden gewassen en door schokken gelyseerd ter verwijdering van rode bloedcellen. De resterende cellen worden uit die oplossing door centrifugeren verzameld, opnieuw gesuspendeerd in buffer die serum en thrombine bevat, geroerd, waarna men het plaatjesaggregaat gedurende een korte tijdsperiode laat bezinken, De gesuspendeerde cellen worden getrans-25 porteerd, gewonnen door centrifugering, opnieuw gesuspendeerd in serum en getransporteerd naar een kolom die nylonwol bevat. De kolom wordt geïncubeerd om de bevestiging van monocyten en B-lymfocyten mogelijk te maken en daarna gewassen. De meeste periferale bloed T-lymfocyten zullen niet kleven en worden uit de kolom geëlueerd. Genoemde cellen werden bij 30 37eC gekweekt in een kweekmedium, bijvoorbeeld RPMI-1640 medium en be handeld met een geschikte inducent, bijvoorbeeld fytohemagglutinine (ongeveer 1-5 mg/1) gedurende ongeveer 100 uur, waarna de bovenlagen werden verzameld. De bovenlagen werden gecentrifugeerd ter verwijdering van cellen en door ultrafiltratie of dialyse geconcentreerd. Na isole-35 ring van de celvrije bovenlaag uit hetzij U937 cellen of normale PBL's, wordt het geconditioneerde medium geconcentreerd, geschikt onder toepas- 8603209 * * -7- sing van een hol vezelsysteem of een ultrafiltratiemembraan, gevolg door verdunning met azijnzuur (tot een concentratie van 0,1N azijnzuur), gevolgd door ongeveer tienvoudige concentrering, waarbij de verdunning en concentrering worden herhaald. Het concentraat kan worden gevriesdoorgd 5 en direkt toegepast of het gevriesdroogde produkt kan voor verdere zuivering worden gebruikt. Het onderhavige Oncostatine M kan door een procedure van gelpermeatie-chromatografie onder toepassing van waterig 40%’s acetonitril-0,1% trifluorazijnzuur als een isocreatisch mobiele fase op een Bio-Sil TSK250 kolom worden gezuiverd, waarbij de activi- 10 teit voor elk van de fracties wordt bewaakt. De zuivering levert een 4 samenstelling met ten minste ongeveer 0,5-5x10 GIA eenheden/ml in de actieve fracties. Het gedeeltelijk gezuiverde produkt uit de gelpermea-tiechromatografie kan verder worden gezuiverd door gebruik te maken van omgekeerde fase-hogedruk-vloeistofchromatografie onder toepassing van 15 een lineaire gradiënt, waarbij het primaiore oplosmiddel 0,1% trifluorazijnzuur in water is en het secundaire oplosmiddel acetonitril met 0,1% trifluorazijnzuur is. Het schema kan worden gewijzigd, waarbij gewoonlijk de chromatografering ongeveer 3-4 uur vergt, en het grootste gedeelte van de tijdsperiode, meer dan ongeveer 50% maar niet meer dan 20 ongeveer 80% daarvan, in het 30-45% traject van het secundaire oplosmiddel ligt. Onder deze omstandigheden worden de actieve fracties ge— elueerd bij ongeveer 41-42% acetonitril. De samengevoegde actieve fracties kunnen verder worden gezuiverd door de omgekeerde fase HPLC te herhalen onder gebruik van een snellere wijziging in de gradiëntomstan-25 digheden en een tragere stroomsnelheid. Onder deze omstandigheden komt de activiteit te voorschijn bij ongeveer 40,5-41,5% acetonitril.

De omgekeerde fase HPLC kan dan worden herhaald, onder wijziging van het oplosmiddelsysteem, waarbij het secundaire oplosmiddel n-pro-panol-0,1% trifluorazijnzuur is.

30 Er wordt een lineaire gradiënt toegepast, waarbij de gradiënt langzaam in het traject van 23-35% n-propanól wordt gewijzigd. De hoofd-activiteit wordt waargenomen in het traject van 25,5-27,5 propanol, waarbij een nagenoeg homogeen produkt wordt verkregen met een specifieke activiteit meer dan 10 GIA eenheden/ng proteïne. Gewoonlijk wordt het 35 produkt gezuiverd en levert een specifieke activiteit van ten minste ongeveer 100 GIA eenheden/ng proteïne, meestal 150 GIA eenhedên/ng.

=350 3 2 0 9 i 1 -8-

De onderhavige verbindingen worden gekenmerkt door een molecuul-gewicht van ongeveer 17-19 kilo Dalton (kD), in het bijzonder ongeveer 18 kD, zoals bepaald volgens afmetingsexclusie-chromatografie. De onderhavige verbindingen worden verder gekenmerkt door een schijnbaar mole-5 cuulgewicht van bij benadering 28 kD, bepaald volgens polyacrylamidegel-elektroforese onder reducerende of niet-reducerende omstanditheden.

De aminozuurvolgorde van fragmenten van gezuiverd Oncostatine M werd geanalyseerd. Oncostatine heeft nagenoeg de aminozuurvolgorde als voorgesteld in fig. 1. In fig. 1 illustreert de eerste volgorde het N-eind-10 standige deel van Oncostatine M, terwijl de resterende volgordes inwendige fragmenten van het. polypeptide illustreren. De actieve preparaten van geïsoleerd Oncostatine M bevatten een mengsel van hoog mannose en complex N-gekoppeld oligosaccharide. Niet-geglycosyleerde preparaten van Oncostatine M behielden echter hun celgroei-modulerende activiteit. 15 Oncostatine M wordt verder gekenmerkt door zijn activiteit ten opzichte van bepaalde celstammen. Het onderhavige polypeptide mist cytotoxische activiteit ten opzichte van WI26 en WI38 humane fibroblasten en muizen L929 cellen, die gevoelig zijn voor tumornecrosefactor en een γ-inter-feron-gevoelige humane tumorcellijn.

20 Er is tevens gevonden dat het niet de uitbreiding van normale humane T-lymfocyten remt of granulocytisch/myelocytische kolonievorming uit beenmergcellen bij concentraties tot 100 GIA eenheden/ml remt. Verder stimuleert Oncostatine M de uitbreiding van normale humane fibroblasten, zoals bijvoorbeeld wordt aangetoond door WI38 en WI26 cellen 25 en remt de woekering van tumorcellen, zoals A375, HBT 10, A549 en SK-MEL28 en kan bijdragen tot de groei van kolonie-vormende cellen uit normaal beenmerg. Oncostatine M onderdrukt niet de humane proliferatieve of cytotoxische T-celreacties in gemengde leukocyt-kweekreacties (MLC) bij concentraties van 500 GIA eenheden/ml. Het blijkt, dat het onderha-30 vige polypeptide stabiel is ten opzichte van gematigde zuren en basen en ten opzichte van een warmtebehandeling bij 56°C. De aminozuurvolgorde van het onderhavige polypeptide kan volledig worden vastgesteld met commercieel verkrijgbare sequentiemiddelen. Het polypeptide kan dan worden gesynthetiseerd volgens bekende technieken onder gebruik van automa-35 tische synthese-inrichtingen, die in de handel verkrijgbaar zijn. Naar keuze kan het onderhavige polypeptide worden geproduceerd door recombinant DNA-technieken. üit een gedeeltelijke aminozuurvolgorde kunnen

ö ώ η "Z 9 Λ Q

V V? Sim %J V

-9- * £ "peilmiddelen" worden gededuceerd, die bruikbaar zijn voor het uitsorteren van een humane genoom-bibliotheek. De bibliotheek kan een cDNA-bibliotheek of een chromosomale bibliotheek zijn. Wanneer eenmaal de klonen als gekoppeld aan het peilmiddel zijn geïdentificeerd, kunnen de 5 fragmenten die het gen van belang bevatten op een aantal wijzen worden geïdentificeerd en op een aantal wijzen worden gemanipuleerd. Van het fragment kan de afmeting worden verkleind door endonucleaserestrictie, waarbij de resulterende fragmenten worden gekloneerd en gepeild op de aanwezigheid van het gewenste gen. Cellen, die het gewenste peptide of 10 verhoogde hoeveelheden van het gewenste peptide produceren zijn bruikbaar voor de produktie van boodschapper RNA. Uit het boodschappen-RNA kan enkelstrengs cDNA worden bereid. Het cDNA kan dan worden gekoppeld aan het totale boodschappen-RNA uit een cel, die weinig of geen polypeptide produceert. Het niet-gekoppelde cDNA kan dan worden geïsoleerd 15 en toegepast ter bereiding van cDNA, dat kan worden üitgesorteerd met de peilmiddelen. Naar keuze kunnen DNA-fragmenten worden ingebracht in Agtll, zodat coderende fragmenten stroomafwaarts van en in het kader van het 8-galactosidase-gen liggen. Antilichamen kunnen ten opzichte van het Qncostatine M polypeptide worden bereid en toegepast voor het uitsorte-20 ren van de resulterende gefuseerde proteïnen op kruisreactiviteit.

Op deze wijze kunnen fragmenten die coderen voor het onderhavige polypeptide of een fragment daarvan worden geïdentificeerd en toegepast voor de identificatie van het gewenste gen. Wanneer eenmaal een volledig gen is geïdentificeerd, hetzij als cDNA of gewoon als normaal DNA kan 25 dit vervolgens op verschillende wijzen worden gemanipuleerd om het tot expressie te brengen. Wanneer het gen tot expressie moet worden gebracht in een gastheer, die het wild-type transcriptie en translatie-regulerende gebied van Encostatine M herkent, kan het totale gen met zijn wild-type 5'- en 31-regulerende gebieden in een geschikte expres-30 sievector worden ingevoerd. Er bestaan verschillende expressievectoren, waarbij replicatiesystemen uit zoogdiervirussen worden toegepast, zoals Simianvirus 40, Adenovirus, runderpapillomavirus, vacciniavirus, insec-tenbaculovirus, enz. Deze replicatiesystemen zijn ontwikkeld om te voorzien in merkstoffen, waarmee de selectie van transfectanten mogelijk 35 is, tevens wordt voorzien in geschikte restrictieplaatsen waarin het gen kan worden ingebracht.

3203209 i * -io-

Wanneer het gen tot expressie moet worden gebracht in een gastheer, die geen natuurlijk voorkomend wild-type transcriptie en trans-latie-regulerende gebieden herkent, zal een verdere manipulatie nodig zijn.. Het is geschikt dat een aantal 3'-transcriptie-regulerende gebieden 5 bekend zijn, die stroomafwaarts van de stopcodons kunnen worden ingébracht. Het niet-coderende 5'-gebied stroomopwaarts van het structuur-gen kan door endonucleaserestrictie, Ba 131 resectie, en dergelijke worden verwijderd. Naar keuze kan, wanneer een geschikte restrictieplaats nabij het 5'-einddeel van het structuurgen aanwezig is, het structuurgen 10 worden doorgeknipt'en een adapter toegepast om het structuurgen aan het promotorgebied te koppelen, waarbij de adapter de verloren nucleotiden van het structuurgen levert. Er zijn verschillende strategieën toegepast om te voorzien in een expressiecassette, die in de 5'-, 3'-richting van de transcriptie een transcriptie- en translatie-inleidingsgebied, dat 15 tevens regulerende volgordes kan omvatten, waarmee de regulering kan worden aangezet, het structuurgen onder de transcriptie- en translatie-besturing van het inleidergebied en een transcriptie- en translatie-terminatiegebied bezit.

Illustratieve transcriptié-inleidingsgebieden of promotors omvat-20 ten voor bacteriën de β-GAL promotor, de TAC promotor, de LAMBDA links en rechts promotors, enz.; voor gist, glycolytische enzympromotors, zoals ADH-I eh -II promotors, GPK promotor en GPI promotor, TRP promotor, enz.; voor zoogdiercellen SV40 vroege en late promotors, adenovirus hoofd-late promotors, enz. Als reeds aangeduid, kan de expressiecassette wor-25 den opgenomen binnen een replicatiesysteem in een plasmide in een geschikte cellulaire gastheer of kan worden geleverd zonder een replicatie-systeem, wanneer het in het gastheergenoom geïntegreerd wordt. Het DNA kan in de gastheer volgens bekende technieken worden ingevoerd, zoals transformatie, onder toepassing van calciumfosfaat-neergeslagen DNA, 30 transfectie door de cellen met het virus in aanraking te brengen, micro-injectie van het DNA in de cellen, enz. Wanneer eenmaal het structuurgen in de geschikte gastheer is ingevoerd, kan de gastheer worden vermenigvuldigd en het structuur-gen tot expressie brengen. In sommige gevallen kan het wenselijk zijn te voorzien in een signaalvolgorde 35 (secretoire signaalgever) stroomopwaarts van en in het afleeskader met het structuurgen, dat voorziet in de' secretie van het structuurgen en 8303209 * i -11- afsplitsing van de secretoire signaalgever teneinde het gerede polypeptide in de bovenlaag te leveren. Wanneer er niet is voorzien in secretie, kunnen de gastheercellen volgens gebruikelijke omstandigheden worden gewonnen, gelyseerd en het gewenste produkt volgens bekende technieken, 5 zoals chromatografie, elektroforese, oplosmiddelextractie, en dergelijke worden geïsoleerd en gezuiverd.

De onderhavige verbindingen kunnen op vele wijzen zowel in vivo als in vitro worden toegepast. De onderhavige verbindingen zijn bruikbaar voor het maken van antilichamen ten opzichte van de onderhavige ver-10 bindingen en zij kunnen toepassing vinden in vivo of in vitro. De anti-lichamen kunnen op gebruikelijke wijze worden bereid, hetzij door toepassing van het onderhavige polypeptide als een immunogeen en het injecteren van het polypeptide in een zoogdiergast, bijvoorbeeld muizen, koeien, geiten, schapen, konijnen, enz. in het bijzonder met een adju-15 vans, bijvoorbeeld het complete Freunds adjuvans, aluminiumhydroxydegel, en dergelijke. De gastheer kan dan worden afgetapt en het bloed toegepast voor de isolering van polyklonale antilichamen of in het geval van muizen de periferale bloedlymfocyten of miltlymfocyten (B-cellen), toegepast voor fusie met een geschikte myelomacel om de chromosomen voor 20 monoklonale expressie van voor de onderhavige verbinding specifieke antilichamen ontsterfelijk te maken.

Hetzij polyklonale of monoklonale antilichamen kunnen worden bereid, die daarna kunnen worden toegepast voor diagnose of detectie op de aanwezigheid van het onderhavige polypeptide in een monster, zoals cel-25 len of een fysiologische vloeistof, bijvoorbeeld bloed. De antilichamen zijn tevens bruikbaar in affiniteitschromatografie voor het zuiveren van het onderhavige polypeptide en het isoleren daarvan uit natuurlijke of synthetische bronnen. De antilichamen kunnen tevens worden gebruikt voor het instellen van de hoeveelheid van het onderhavige polypeptide, dat 30 verbonden is met cellen in kweek of in vivo, waardoor de groei van de cellen kan worden gemodificeerd.

De onderhavige verbinding is bruikbaar als een ligand voor het detecteren van de aanwezigheid van receptoren voor de onderhavige verbinding. Op deze wijze kunnen cellen worden onderscheiden naargelang 35 van de aanwezigheid en de dichtheid van de receptoren voor de onderhavige verbinding, waarbij het effect van verschillende verbindingen op de aanwezigheid van dergelijke receptoren kan worden bewaakt.

8303209 -12-

De onderhavige verbinding kan in in vitro kweken worden toegepast om de groei van cellen of cellijnen, die gevoelig zijn voor het onderhavige polypeptide als onderscheiden van cellen die niet gevoelig zijn, te remmen. Aldus kunnen heterogene celmengsels of cellijnen worden 5 bevrijd van ongewenste cellen, wanneer de ongewenste cellen gevoelig zijn voor het onderhavige polypeptide. Het onderhavige polypeptide kan in vivo in het geval van neoplastische aandoeningen, bijvoorbeeld door injectie, intralesionaal, peritoneaal, subcutaan, en dergelijke worden toegediend.

10 De onderhavige verbinding kan in vitro worden toegepast voor het elimineren van kwaadaardige cellen uit merg voor autologe mergtransplan-taties of voor het remmen van de woekering van kwaadaardige cellen of het verwijderen daarvan in andere weefsels, bijvoorbeeld bloed, vóór de her-infusie.

15 Het onderhavige polypeptide is tevens bruikbaar in een methode voor het behandelen van wonden, zoals huidwonden, hoornvlieswonden en verschillende andere epiteliale en stromale storingen, zoals chronische ulcera, brandwonden, chirurgische insnijdingen, traumatische wonden en letsels aan de holle, met epiteel beklede organen, zoals de slokdarm, 20 maag, grote en kleine ingewanden, mond, genitale organen en urinewegen.

De methode berust opo de topische toediening van een behandelingsprepa- · raat dat Oncostatine M in een fysiologisch aanvaardbare drager omvat.

De samenstelling van de onderhavige uitvinding kan worden gebruikt voor het behandelen van een groot aantal wonden met inbegrip van nagenoeg 25 alle huidwonden, hoornvlieswonden en letsels aan de met epiteel beklede holle organen van het lichaam. Wonden die voor behandeling geschikt zijn omvatten die welke zijn ontstaan door geweldadige inwerking, zoals brandwonden, schaafwonden, snijwonden, en dergelijke alsmede van chirurgische procedures, zoals chirurgische insnijdingen en huidtransplantatie.

30 Andere aandoeningen die geschikt met de samenstellingen van de onderhavige uitvinding behandeld kunnen worden omvatten chronische aandoeningen, zoals chronische ulcera, diabetiche ulcera en andere niet-helende (trofische) omstandigheden. Oncostatine M kan in fysiologisch aanvaardbare dragers voor toediening op het getroffen gebied worden op-35 genomen. De aard van de dragers kan sterk variëren en hangt af van de beoogde toedieningsplaats. Voor toediening op de huid wordt gewoonlijk de voorkeur gegeven aan een crème- of zalfbasis, waarbij geschikte bases 8 8 0 3. 2 0 9 -¾ 4 -13- lanoline, Silvadeen (Marion) (in het bijzonder voor de behandeling van brandwonden), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut), en dergelijke bevatten, Desgewenst is het mogelijk Oncostatine M-houden-de preparaten in zwachtels en andere wondverbanden op te nemen om te 5 voorzien in een continu contact van de wond met het peptide. Tevens zijn aerosol-toedieningen bruikbaar.

De concentratie van het polypeptide in de behandelingssamenstel-ling is niet kritisch. Het polypeptide zal in een epitele celuitbreiding-bevorderende hoeveelheid aanwezig zijn. De samenstellingen zullen uitwen-1Q dig op het getroffen gebied worden aangebracht, typerend als oogdruppels op het oog of als crèmes, zalven of lotions op de huid. In dat geval- van ogen is een herhaalde behandeling wenselijk, die gewoonlijk om de 4 uur of minder wordt herhaald. Voor de huid is het wenselijk de behandelings-samenstelling gedurende de heling continu op het betreffende gebied te 15 handhaven, waarbij de behandelingssamenstelling 2-4 x per dag of nog meer wordt toegediend. De toegepaste hoeveelheid van het onderhavige polypeptide hangt af van de wijze van toediening, de toepassing van andere actieve verbindingen, en dergelijke en ligt in het algemeen in het traject van ongeveer 1-100 microgram.

20 Het onderhavige polypeptide kan met een fysiologisch aanvaard bare drager, zoals pekel, fosfaat-gebufferde pekel, en dergelijke worden toegepast. De hoeveelheid toegepaste verbinding zal empirisch worden bepaald, gebaseerd op de reactie van cellen in vitro en de reactie van experimentele dieren op de onderhavige polypeptiden of preparaten die de 25 onderhavige polypeptiden bevatten.

De onderhavige verbindingen zijn op zichzelf bruikbaar of in combinatie met andere groeifactoren of remstoffen of immunomodulatoren, zoals. TNF, IL-2, γ-interferon, monoklonale antilichamen, enz. De hoeveelheden van deze andere verbindingen zullen in het algemeen in het traject 30 van 1 microgram tot 100 microgram liggen. Conjugaten van de onderhavige verbindingen met plaatszoekende eenheden, bijvoorbeeld antilichamen kunnen worden bereid, wanneer de antilichamen specifiek zijn voor bepaalde kwaadaardige cellen of organen.

De volgende voorbeelden worden ter illustratie en niet als beper-35 kend gegeven.

Λ Λ n *7 Λ Λ Λ S Ό ν ο ^ 0 9 ¥ *r -14- EXPERIMENTEEI.

Materialen en methoden;

Oncostatine M geïsoleerd uit U937-cellen

Produktie van een tumorcelgroeiremstof uit een histiocytische lymfoma-cellijn 5 U937-cellen, een histiocytische lymfomacellijn (Sundstrom en

Nilsson, Int. J. Cancer (1976) (1976) 17: 565-577) werden gekweekt in 2 5 850 cm rolflessen (Corning C2540) bij een concentratie van 4x10 cellen/ ml in een totaal volume van 300 ml RPMI 1640 medium, gesuppleerd met 10% foetaal kalfserum (FCS), penicilline/streptomycine (PS), L-glutamine en 10 10 ng/ml 12-O-tetradecanoylforbol 13-acetaat (TPA). Vier dagen later werden de bovenlagen die het FCS en TPA bevatten verwijderd, werden de rolflessen 5 x gewassen met serumvrij RPMI 1640 en werden de cellen die losraakten (lxlO5 cellen/ml) 3 x gewassen met serumvrij medium en teruggebracht in de flessen, hetgeen leidde tot een eindvolume van 125 ml 15 serumvrij RPMI 1640 medium/rolfles. Eén dag later werden de bovenlagen verzameld, gecentrifugeerd ter verwijdering van de cellen, gefiltreerd door een 0,45 micrometer Nalgen filter en geconcentreerd met behulp van een hol vezelsysteem (Amicon patroon HIP 10-20) tot een volume van 150 ml (beginvolume 1500 ml). Oncostatine M werd tevens uit bovenlagen 2 20 van serumvrij TPA-behandelde U937-cellen in 150 cm weefselkweekkolven geïsoleerd. De bovenlaag werd geconcentreerd met een Amicon-Diaflo membraan PM-10, 10 kD afsnijgrens en gedialiseerd. Na de dialyse werd het concentraat met azijnzuur verdund hetgeen leidde tot een eindconcentra-tie van 0,1N azijnzuur in 500 ml en geconcentreerd tot 50 ml met een 25 Amicon PM 10 filter. Het 50 ml concentraat werd tot 400 ml verdund met 0,1N azijnzuur en tot 40 ml geconcentreerd met hetzelfde filter. Het concentraat werd verdund met IN azijnzuur en het verkregen neerslag werd door centrifugeren verwijderd. Het verkregen concentraat werd bevroren en gevriesdroogd. Het gevriesdroogde materiaal werd voor zuiverings-30 trappen toegepast,

Gelpermeatiechromatografie

Een Bio-Sil TSK-250 kolom (600x21,5 mm) (Bio-Rad) werd aan een hogedrukvloeistofchromatografiesysteem bevestigd. De ruwe fractie (10 mg/ml) werd in 40% acetonitril in 0,1% waterig trifluorazijnzuur 35 (0,1% TFA) opgelost. 2 ml aliquot van het mengsel werd geïnjecteerd en de elutie werd isocratisch met een mobiele fase van 40% acetonitril in 0,1% 86 0 3 2 0 9 -15- TFA uitgevoerd. De stroomsnelheid was 2,5 ml/minuut en de optekensnel-heid werd ingesteld op 0,25 cm/minuut. Er werden 5 ml fracteis verzameld. De chromatografie werd bij kamertemperatuur uitgevoerd. Een aliquot van elke fractie werd verdampt en in triplicaat geanalyseerd op groeiremmende 5 activiteit (G1A) van A375 cellen, De actieve fracties (fracties 21 en 22) uit zes proeven werden samengevoegd- Het samengevoegde materiaal bevatte 5 in totaal bij benadering 4,8x10 GIA eenheden. De factor bleek een schijnbaar molecuulgewicht van 18 kD te hebben, bepaald volgens afmetings-uitsluitingschromatografie (Bio-Sil-TSK-250 kolom).

10 Omgekeerde fase-hogedrukchromatografle (HPLC) van TSK-250 fracties.

De samengevoegde TSK-250 fracties 21 en 22 als boven beschreven werden tweevoudig verdund met 0,1% TFA. Dit mengsel werd isocratisch geïnjecteerd in een^i-Bondapak C18 kolom (7,8x300 mm)(aangeduid als 018^)bij kamer-kamertemperatuur. De stroomsnelheid werd ingesteld op 2,0 nu./minuut en 15 de optekensnelheid was 0,25 cm/minuut. Er werd een lineaire gradiënt tussen het primaire oplosmiddel 0,1% TFA en het secundaire oplosmiddel 0,1%'s TFA en het secundaire oplosmiddel Acetonitril-TFA 0,1% toegepast.

De gradiënt-omstandigheden waren 0-30% in 20 minuten; daarna 30-45% in 150 minuten; 45-55% in 20 minuten en 55-100% in 10 minuten. Alle oplos-20 middelen’waren HPLC kwaliteit. Er werden 4 ml fracties verzameld en aliquots van elke fractie werden onderzocht op groeiremmende activiteit.

De fracties 72-75 bleken de grootste activiteit te bezitten. De actieve fracties werden tussen 41-52% acetonitrilconcentratie geëlueerd. Fracties 72-75 werd tezamen gevoegd. Er werd 16 ml van 0,1% TFA aan de samengevoegde 25 fracties toegevoegd. Het mengsel werd geïnjecteerd in een u-Bondapak-C18 2 kolom (3,9x300 mm) (aangeduid als CIS ) bij kamertemperatuur. De stroomsnelheid werd ingsteld op 1 ml/minuut en de kaartafleessnelheid op 0,25 cm/minuut. De gradiëntomstandigheden waren 0-35% in 10 minuten en 35-45% in 100 minuten en 45-100% in 10 minuten.

30 De fracties werden verzameld en aliquots afgenomen en onderzocht op GIA. De meeste activiteit ontstond uit de kolom tussen 40,7 - 41,3% acetonitrilconcentratie (retentietijd 83 - 86 minuten). Actieve fracties werden samengevoegd en tweevoudig verdund met 0,1% TFA en isocratisch geïnjecteerd in een ^i-Bondapak-C18 kolom (3,9-200 mm) (aangeduid als C183) 35 bij kamertemperatuur. De stroomsnelheid was 1 ml/minuut en de kaartafleessnelheid 0,25 cm/minuut. Er werd een lineaire gradiënt toegepast tussen « 9 S 0 3 2 0 9 «* -16- het primaire oplosmiddel 0,1% TFA en het secundaire oplosmiddel n-propa-. nol-TFA (0,1%). De gradiëntomstandigheden waren 0-23% in 20 minuten en 23-35% in 120 minuten. Er werden fracties verzameld en aliquots van elke fractie werden onderzocht op GIA. De meeste activiteit verscheen tussen 5 25-26,5% propanolconcentratie (retentietijd 59 minuten). Deze kennelijk homogene fractie bevatte bij bendering 300 ng proteïne en ongeveer 40.000 GIA eenheden.

Celgroei-modulerende analyse onder toepassing van 3H-thymidine opname in DNA (GIA) 10 De analyses werden uitgevoerd met platte platen met 96 cupjes (Costar 3596). Humane melanomacellen (A375) werden als gevoelige indica-torcellijn toegepast. Cellen (3xl03) in 0,1 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagles medium (DMEM) gesuppleerd met 10% FCS en PS werden in elk cupje gebracht. 3. uur later werd 0,1 ml van de proefmonsters aan elk cupje toe-15 gevoegd. De platen werden gedurende 3 dagen bij 37°C geïncubeerd. Daarna werd 0,025 ml (0,5 ^iCi) van een oplossing van 3H-thymidine (specifieke activiteit 27 jiC±/q) aan elk cupje gedurende de laatste 6 uur incubatie toegevoegd. De cellen werden daarna overgebracht in glazen filterstroken onder toepassing van een meervoudig cupjeswintoestel (PHD cell Harvester, 20 Cambridge Technology, Inc.). De filters werden overgebracht naar scintil-latie7flesjes, waaraan 2 ml scintillatie-fluldum (ScientiVerse II,

Fisher Scientific Co.) werden toegevoegd, alvorens er werd geteld in een scintillatie-teller, voor het kwantificeren van de 3H-thymidine opname.

3 Q y -3 \J <3 ' > t -17-

Zachte agarkonolie-remmingsproef (TGX)

Een 0,5 ml basislaag van 0,5% agar (Agar Noble; Difco

Laboratories, Detroit, Michigan) in DNEM dat 10% foetaal kalfsserum (FCS) bevatte, werd aan Costar-weefselkweekplaten met 24 cupjes toegevoegd.

3 5 0,5 ml 0,3% agar dat hetzelfde medium-FCS mengsel bevatte, 1-2,5x10 A375 cellen en de te onderzoeken factor werden bij verschillende concentraties als een deklaag aangebracht op de basislaag van agar,

De platen werden bij 37°c in een vochtige atmosfeer van 5% C02 in lucht gelncubeerd waarbij na 7 dagen opnieuw werd gevoed door toevoeging van 10 0,5 ml 0,3% agar dat hetzelfde medium en concentraties van de factor bevatte. De kolonies werden ongefixeerd en ongekleurd genummerd en het aantal kolonies groter dan 6 cellen werd tussen dagen 7 en 14 geteld.

Resultaten 15 Volgordes van Oncostatine M geïsoleerd uit U937 cellen

De N-eindstandige volgorde en de inwendige fragmenten van OncostatineMwerden vastgesteld door microvolgordeanalyse van het gereduceerde en S-pyridine —-geëthyleerde polypeptide en van peptiden verkregen uit enzymatische ontsluitprodukten van gereduceerde en S-20 pyridine-geêthyleerd Oncostatine M met het endoproteinase Lys-C en

Staphylococcus aureus V8 protease. De peptidefragmenten werd door omgekeerde fase HPLC met behulp van vluchtige oplosmiddelen gezuiverd.

De peptiden werden aan geautomatiseerde repeterende Edman degradatie in het Model 470A protelnesequentiemeter (Applied Biosysterns, Ine.) 25 onderworpen. De fenylthiohydantolne aminozuren werden geanalyseerd door omgekeerde fase HPLC (Applied Biosystems, Inc.) met een PTH-C18 kolom(2,1x220 mm, ABI) onder toepassing van een natriumacetaatbuffer/ tetrahydrofuran/acetonitrilgradiënt voor elutie.

De verkregen aminozuurvolgordes zijn nagenoeg dezelfde als 30 geïllustreerd in fig. 1, Een vergelijking van deze volgordes met die opgeslagen in de huidige proteïnedatabasLs (PIR Release 9,0, mei 1986), onthulden geen significante volgordehomologen met elke andere bekende volgorde. Tevens is er geen homologie met tumornecrosefactor, lymfo-toxine, kolonie-stimulerende factor, interleukiné 1 of 2 of β-trans-35 formerende groeifactor.

^ ? ολ ζ N«^ v V \J v ^ -18-

Remming van woekering van tumorcellen en vermeerdering of uitbreiding van normale humane fibroblasten

Onder toepassing van de zachte agarkolonieremmingsanalyse als boven beschreven werden de volgende resultaten verkregen: 5 Tabel A. Remming van A375 Melanoma celkolonievorming in zachte agar door gezuiverd- Oncostatine M geïsoleerd uit U937 cellen* GIA eenheden/cupje % Remming van kolonies Kolonievorming 250 4 96 83 6 94 t 10 27 11 89 45 32 69 0 106 * A375 cellen werden op platen zacht agar aangebracht, met of zonder factor in een eindvolume van 2 ml, zoals boven beschreven. De toe-15 paste factor kwam uit een C18 propanolkolomfractie met piek tumorgroei-remmende activiteit (GIA). Elf dagen later werden de aantallen kolonies genummerd. Een kolonie werd gedefinieerd als een. groep van ten minste 6 cellen. Een GIA eenheid werd gedefinieerd als de 'hoeveelheid die een 50% remming van 3H-thymidine-20 opname in A375 cellen in microcupjes als boven gedetailleerd beschreven veroorzaakte.

In de volgende studie werden verschillende behandelingen toegepast ter bepaling van het effect van de behandeling, hetzij chemisch of fysisch, op de activiteit van het onderhavige polypeptide. De vol-25 gende tabel geeft een indicatie van de resultaten.

Tabel B. Effect van verschillende behandelingen van bovenlagen van TPA-geinduceerd U937 cellen op tumorgroei-remmende activiteit*

Eindverdunning van bovenlaag 30 1:4 1:8 1:16

Mediacontrole - - 39.780

Onbehandelde boven- 7.206** 13.896 16.000 laag IN azijnzuur 6.670 17.073 18.783 IN.OH 6.956 15.016 13.923 4 35 * U937 cellen werden met TPA (10 ng/ml) gedurende 3 dagen behandeld waarna de cellen met media werden gewassen en gedurende 24 uur in serumvrije media werden gelncubeerd alvorens verzameling

SoO 3208 -19- van de bovenlagen. De bovenlagen werden behandeld met IN azijnzuur of IN ammoniumhydroxyde (NH^OH). Ze werden daarna gedialyseerd tegen hst medium en onderzocht op hun geschiktheid 3H-thymidine-opname in A375 cellen te remmen. A375 cellen werden gemerkt met 3H-thymidine (3H-TdR) 5 gedurende de laatste 6 uur van een 3 dagen durende incubatie.

**De getoonde gegevens zijn 3H-TdR opnametellingen per minuut.

De bovengenoemde resultaten demonstreren dat Oncostatine M in de gedialyseerde bovenlaag nagenoeg resistent is ten opzichte van inactivering door één normaal azijnzuur en één normaal ammoniumhydroxyde. 10 Aldus zijn de onderhavige verbindingen betrekkelijk ongevoelig voor zowel gematigd sterk zuur als gematigde sterke base. De onderhavige verbinding is stabiel ten opzichte van een warmtebehandeling gedurende 1 uur bij 56°C maar niet gedurende 30 minuten bij 90°C.

De onderhavige verbinding werd tevens onderzocht op warmte-15 stabiliteit en bleek zijn activiteit na blootstelling gedurende 1 uur aan 56°C te behouden, maar nagenoeg al zijn activiteit te verliezen na blootstelling aan 95eC gedurende 30 minuten.

In de volgende studie werd het vermogen van de onderhavige polypeptiden tumorcelreplicatie van een veelvoud van neoplastische 20 cellen te remmen onderzocht. De volgende tabel geeft een indicatie van de resultaten.

Tabel C. Remming van replicatie van tumorcellen door gezuiverd OncostatineMuit U937 cellen

Eenheden GIA die 30% remming veroorzaken 25 Tumorcellen 3H-TdR opname A549 (longkanker) 21 HTB1Q (neuroblastoma) 81 A375 (melanoma) 0,3

Tumorcellen werden in microcupjes in platen aangebracht 3 uur vóór 30 de toevoeging van verschillende verdunningen van Oncostatine M, gezuiverd door omgekeerde fase HELC als boven in detail toegelicht.

Gedurende de laatste 6 uur van een 3 daagse incubatie werden de cellen in 0,2 ml medium gemerkt met 3£ï-thymidine (3H-TdR) (0,5 ^tCi/cupje). Eén eenheid tumorgroei-remmende activiteit (GIA) wordt in de toelichting 8 A η τ 9 r» § .

V V V V > Μ -20- van tabel A gedefinieerd als die hoeveelheid die 50% remming van 3H-TdR opname in A375 melanomacellen veroorzaakt. Vastgesteld werd dat één eenheid bij benadering 10 pg gezuiverd proteïne was, zodat derhalve de concentratie (ng/ml) om 30% remming 3H-TdR in A549, HTB10 en A375 5 cellen te veroorzaken bij benadering resp. 1,4, 4,0 en 0,015 ng/ml was. 3H-TdR opname in W126 normale humane fibroblasten werd niet door de U937 factor in welk experiment dan ook onderdrukt.

De bovenstaande resultaten demonstreren dat Oncostatine M selectief is wat zijn vermogen betreft replicatie te remmen, en ruim varië-10 rende effecten heeft afhankelijk van de aard van de cel. De onderhavige verbinding is effectief tegen melanomacellen, zoals A375 melanomacellen, longkankercellen, zoals A549 en neuroblastomacellen, zoals HTB10.

Tumorcellen werden in een hoeveelheid van 3xl03 cellen per cupje geënt en 3 normale fibroblasten in een hoeveelheid van 1,5x10 cellen per cupje in 15 platen met 96 cupjes gedurende 3 uur. Verschillende concentraties van gezuiverd Oncostatine M, verkregen uit de fractie van de C18 kolom met piek antiwoekeringsactiviteit tegen A375 cellen werden toegevoegd en drie dagen later de 3H-thymidine-opname in de cellen in triplicaatcupjes bij elke concentratie gemeten. De resultaten worden in tabel D aangegeven.

20 Tabel D. Remming van woekering van tumorcellen en vermeerdering van uitbreiding van normale fibroblasten door Oncostatin M

GIA

eenheden/cupje % Remming % Stimulering A3 75 WI38 25 Voorbeeld 1 16 83 25 4 62 30 1 46 46 A375 HTB10 WI26

Voorbeeld 2 21 NT 28 46 30 9 87 22 36 3 76 11 52 A375 A549

Voorbeeld 3 75 89 30 25 85 22 35 8 71 16 A375 SK-MEL28

Voorbeeld 4 20 87 44 5 75 25 1 59. 11 « ’λ fï ΌΛΟ

J J v i· V W

-21-

De getoonde resultaten zijn % remming of % stimulering van 3H-thymidine opgenomen in tumorcellen (A375, HTB1Q, A549 en SK-MEL28) en normale fibroblasten (WI26 en WI38). Een GIA eenheid wordt in de toelichting bij tabel A gedefinieerd als de hoeveelheid OncostatineM die 50% rem-5 ming van 3H-thymidine-opname in A375 cellen veroorzaakt.

Naast het waargenomen differentiële effect op 3H—thymidine-opname in tumorcellen en normale humane fibroblasten werd er tevèns een differentieel effect van morfologie en celaantal waargenomen na 3 dagen behandeling van de twee celtypen met OncostatineMzoals blijkt 10 uit fig. 2.

Het toegepaste OncostatineMkwam uit de HPLC-C183 kolomfrac-tie met piekactiviteit voor het remmen van woekering van A375 cellen.

Fig. 2 is een reeks van microfoto's van A375 melanomacellen bestaande uit onbehandeld (A), behandeld met 5 groei-remmende activiteit (GIA) eenheden 15 Oncostatine Μ (B), of 100 eenheden (C). Voorts microfoto·' s van WI38 fibroblasten die onbehandeld waren (D), behandeld met 5 eenheden GIA (E), of 100 eenheden (F). De cellen werden gekleurd met kristal-violet in 0,5% methanol. Vergroting = 63x.

NaDodSO^/PAGE van Oncostatine M

20 Gezuiverd Oncostatine M onderworpen aan NaDOdS04 uitgevoerd onder reducerende omstandigheden, bleek een schijnbaar molecuulgewicht van bij benadering 28,kD te hebben als blijkt uit fig.3. De volgende proteïnen werden als standaarden gebruikt (strook A).* ovalbumine, Mr =

43 kD chymotrypsinogeen a, Mr = 25,7 kD; lactoglobuline 8, Mr - 18,4 kD? 25 lysozym, Mr - 14,2 kD; rundertrypsineremstof =6,2 kD; insuline A en B

keten, Mr * 2,3 kD en 3,4 kD. OncostatineMwerd in strook B aangebracht.

Oncostatine. M, onderworpen aan PAGE onder niet-reducerende omstandigheden, heeft tevens een schijnbaar molecuulgewicht van 28 kD en proteïne dat door elektroëlutie uit de band was verkregen bleek woeke-30 ring van A375 cellen te remmen.

Antilichaam ten opzichte van een synthetisch peptide van Oncostatine M 125 reageert in I-gemerkt Oncostatine. M in radiolmmuunprecipitaties a) Peptidesynthese: Het peptide komt overeen met de resten 6-19 van het OncostatineMproteïne en werd gesynthetiseerd door vaste fase-35 technieken met een Beekman geautomatiseerd instrument als beschreven (Gentry et al., J. Biol. Chem. (1983) 258;11219). Het peptide werd van het hars gesplitst volgens de "laag-hoog" HF procedure (Tam et al..

8 60 3 20 9.

5 -22- j„ Amer. Chem. Soc. (1983) 105:6442-6445). De zuivering werd tot stand gebracht met preparatieve HPLC.

b) Zuivering van Antilichamen Het peptide werd gekoppeld aan runder γ-globuline als beschreven (Gentry en Lawton, Virology (1986) 5 152:421-431). Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden geprepareerd en op vier plaatsen subcutaan gestimuleerd (5 maal) als beschreven (Gentry en Lawton, Virology (1986) 152:421-431). De gebruikte antisera werden 2 weken na de vijfde stimulans verkregen.

c) Jodering van Oncostanine M·.: Een monster van gedeeltelijk ge-10 zuiverd Oncostatine Mwerd radioactief gemerkt met jodium-125 volgens gepubliceerde procedures (Linsley et al., PNAS (1985) 82:356-360).

Een deel van het gemerkte preparaat dat 100.000 cpm bevatte werd gemengd met konijne-antiserum gericht tegen de N-eindstandige 17 aminozuren van Oncostatine M (eindverdunning van 1:20) , in afwezigheid of aan-15 wezigheid van het N-eindstandige peptide (de N-eindstandige 17 aminozuren van Oncostatine M) (2 ^g) en onderworpen aan immuunprecipitatie-analyse als beschreven (Linsley et al., Biochemistry (1986) 25:2978-2986.

In het bijzonder werd één buis die 5 ^iliter bevatte van tevoren

20 geïncubeerd met 2 yag van het N-eindstandige peptide in 10 Ml TNEN

(20 mM Tris pH 7,5, 5mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% Nonidet P-40) dat 0,1% 125

BSA bevatte gedurende 30 minuten bij 4°C voor de toevoeging van I

Oncostatin in 85λ TNEN dat 0,1% BSA en 40 mM dithiothreltol (DTT) bevatte. Zeven buizen die 5 uliter antisera bevatten werden geïncubeerd 125 25 met I OncostatineMin 85 uliter THEN dat 0,1% BSA en 40 mM DTT bevatte gedurende 30 minuten bij 4°C vóór de toevoeging van 50 filter van 10% formaline-gefixeerd Staphylococcus aureus (Pansorbine, Calbiochem).

Na een extra incubatie gedurende 30 minuten bij 4°C werden de buizen aan microcentrifugering, onderworpen en werden de pellets 30 viermaal gewassen met 1 ml TNEN alvorens zij aan PAGE analyse werden onderworpen. Er werd na SDS/PAGE analyse van de immuunprecipitaten een diffuse band van Mr = 32 kD waargenomen. Precipitatie van dit type werd geremd door het insluiten van een overmaat van niet gemerkt peptide overeenkomend met de N-eindstandige 17 aminozuren van Oncostatine M 35 hetgeen aanwees dat de precipitatie voor dit peptide specifiek was.

De koolhydraatsamenstelling van Oncostatine M werd onderzocht door beproeving op glycosidasegevoeligheid. Immuunprecipitaten, bereid 8603209 -23- als in c boven werden behandeld met buffer, endoglycosidase H of neuraminidase, als beschreven door Linsley et al» (1986). De behandeling met endoglycosidase H, een enzym met specificiteit voor N-gekoppelde hoog mannose oligosacchariden resulteerde in het verschijnen van een 5 laagmoleculair verbindingstype van Mr = 24 kD. Slechts een deel van het radioactief gemerkte materiaal was gevoelig voor dit enzym, hetgeen erop wijst dat niet alle moleculen hoog mannose oligosacchariden bevatten. De behandeling met neuraminidase resulteerde in het verschijnen van een enkele band van Mr = 27 kD, hetgeen erop wees dat de hetero- 125 10 geniteit in de afmeting van onbehandeld I-gemerkt Oncostatine M wijten was aan moleculaire heterogeniteit in de sialyatie van de glycoproteinekem. De resultaten wezen erop dat actieve preparaten van Oncostatine M een mengsel van hoog mannose en complexe N-gekoppelde oligosaccharidezijketens bevatten.

15 Oncostatine M geïsoleerd uit normale humane periferale bloedlymfocyten (PBL)

Produktie van een tumorcel-groeiremstof uit PBL's

Leukofracties die PBL's bevatten, verkregen uit de bloedbank, werd 1:1 verdund met fosfaat-gebufferde pekel, pH 7,4 (PBS). 35 ml 20 verdund bloed werd op een laag gebracht van 10 ml van een oplossing bestaande uit 9% Ficoll die 20 vol.% 50% natriumdiatrizoaat’ (eind . soortelijk gewicht van 1,080) bevatte. De gradiënten werden bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten bij 850 x g gecentrifugeerd.

Cellen werden verzameld uit het gradiëntgrensvlak en gewassen met PBS.

25 Rode bloedcellen werden door schokken gedurende 3-4 minuten gelyseerd met 10-20 ml van een oplossing die 0,8% ammoniumchloride en 0,1%

Na -EDTA bevatte.

4

Cellen werden uit de rode bloedcel-lyserende oplossing verzameld door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 600 x g en opnieuw gesus-30 pendeerd in 10 ml RPMI 1640 medium (G1BC0) dat 5% foetaal runderserum bevatte. Trombine werd tot een eindconcentratie van 0,5 ü/ml toegevoegd. De celsuspensie werd gedurende 5 minuten bij 37°C geroerd en de plaatjesaggregaten liet men gedurende 5 minuten bezinken. De gesuspendeerde cellen werden in nieuwe buizen overgebracht, gewonnen door 35 centrifugering, opnieuw gesuspendeerd in ml foetaal runderserum en overgebracht in een kolom die 0,5 g geborstelde, voorbevochtigde nylon-wol, type 200 (Fenwal) bevatte.

R « n " o o 9 -24-

De nylon-wolkolom werd bij 37°C gedurende 60 minuten gelncu-beerd om bevestiging van monocyten en B lymfocyten toe te laten. De kolom werd daarna met 3 x vol.dln RPMI 1640 medium (37°C), dat 5% foetaal runderserum bevatte,gewassen en de geëlueerde niet-hechtende cellen 5 (PBL) verzameld.

g PBL'(2 x 10 cellen/ml) werden bij 37°C, 5% C02~95% lucht gedurende 96 uur in RPMI-1640 medium (10,4 g/1) gekweekt, welk medium FeS04.7H20 (1 mg/1), ZnS04.7H20 (2 mg/1), Na2Se03.5H20 (0,017 mg/1), 1-aminoethanol (1 mg/1), humaan transferrine (5 mg/1), runderserum 10 albumine-linolzuurconjugaat (Sigma) (200 mg/1), L-glutamine (300 mg/1), penicilline/streptomycine (100.000 eenheden/1) en fytohemagglutinine-P (Wellcome) (2 mg/1) bevatte. De bovenlagen werden verzameld, gecentrifugeerd ter verwijdering van de cellen, door ultrafiltratie geconcentreerd (Amicon Diaflo membraan YM-10, 10 Kd afsnijpunt), en gedia-15 lyseerd tegen 0,1 M azijnzuur (Spectrapore 3 dialysebuizen). Het geklaarde retentaat werd gevriesdroogd.

Gelpermeatiechromatografie

De ruwe fractie werd aangemaakt in 20 ml 1 M azijnzuur (50 mg/ml) en aangebracht op een BioGel P-100 kolom (2,6 x 88 cm) in evenwicht 20 gebracht met 1 M azijnzuur bij een stroomsnelheid van 0,5 ml/min.

Er werden 12 ml fracties verzameld. Een aliquot uit elke fractie werd verdampt en in drievoud geanalyseerd op groei-remmende activiteit (GIA) van A375 cellen. De actieve fracties werden samengevoegd, gevriesdroogd en opnieuw gechromatografeerd over een Bio-Sil TSK-250 kolom (600 x 25 21,5 mm), als beschreven.

Omgekeerde fase hogedrukchromatografie van TSK-250 fracties

De eindzuivering van samengevoegde TSK-250 fracties werd tot stand gebracht door omgekeerde fase HPLC in wezen als beschreven. PBL- afgeleide tumorcel-remstof werd geëlueerd uit ^ïBondapak C 18 drager 30 bij 40-41% acetonitril en bij 26,5% n-propanol concentraties.

125

Celgroei-modulerende analyse onder toepassing van I-jood-deoxyuridine-opname in DNA (GIA):

Deze analyses werden uitgevoerd in kweekbakken met een vlakke bodem die 96 cupjes bevatten (Costar 3596). Humane melanome cellen, 35 A375 (4xl03) in 50 filter van het proefmonster werden aan elk cupje toegevoegd en gedurende 3 dagen bij 37°C geïncubeerd. De cellen werden

ö λ A 7 O A

y Ό J i u b 125 / c -25- gedurende 24 uur gemerkt met I-IdU (0,05 uCi/cupje) en een extra 24 uur geïncubeerd. De cellen werden driemaal gewassen, gewonnen met een veelvoudig monster-wintoestel en de radioactiviteit werd in een gamma-teller geteld.

5 Resultaten:

Een preparaat van PBL-afgeleide tumorcel-remstof werd onderworpen aan geautomatiseerde repeterende Edman degradatie. De amino-eindstandige aminozuurvolgorde is als volgt: 15 10 15

10 A-A—I-G-X—X-X—K-E-Y-X-V—L-X-X-Q-L-Q-K

X stelt een aminozuur voor dat nog niet is geïdentificeerd.

Een vergelijking van deze volgorde met die van de CJ937 factor toont duidelijk de identiteit met de N-eindstandige groep van PBL-af geleide factor aan.

15 1 5 10 15

PBL-factor A-A-I-G—X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X—X-Q-L-Q-K

U937-factor A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K

In de volgende studie werd het vermogen van PBL afgeleid Oncostatine M om replicatie van een veelvoud van cellen tot stand te 20 brengen onderzocht. Gevonden werd dat muize-L929 cellen ongevoelig waren voor PBL-afgeleid Oncostatin waarbij tot 1000 GIA eenheden/ml werden gebruikt. Humane fibroblasten, WI25 werden tot groei aangezet door behandeling met 1000 GXA eenheden/ml. Normale humane T-lymfocytuit-breiding bij 72 uur na mitogenese werd niet beïnvloed door tot 25 500 GIA eenheden/ml.

Het is duidelijk uit de bovengenoemde resultaten dat nieuwe polypeptide en polypeptidefragmenten worden geleverd die bruikbaar zijn voor het moduleren van de cellulaire groei. De verbinding blijkt een variërende activiteit te bezitten afhankelijk van de aard van de 30 betrokken cellijn, zodat deze op zichzelf kan worden toegepast of samenhangt met andere verbindingen voor het moduleren van de cellulaire groei. De onderhavige polypeptiden voegen derhalve een extra polypeptide toe dat gebruikt kan worden met mengsels van cellen, zowel in vivo als in vitro, voor het selectief reduceren of versterken van de cellu-35 laire woekering of uitbreiding van een bepaald type cel.

8303209 -26-

In het bijzonder kan de factor worden toegepast voor het behandelen van cellen voor autologe beenmergtransplantaties. Door toepassing van de factor wordt de groei van tumorcellen in het merg geremd en kan koloniecelvorming worden gestimuleerd. Oncostatine M kan tevens worden 5 toegepast voor het stimuleren van de groei van epithele cellen waardoor wondgenezing wordt bevorderd. Tevens kunnen het intacte polypeptide of fragmenten daarvan worden gebruikt als immunogenen voor het induceren van antilichaamvorming. De geïnduceerde antilichamen vinden toepassing voor het titreren van Oncostatine M dat in een lichaamsvloeistof aan-10 wezig is of voor het moduleren van de activiteit van de factor door daaraan te binden. Verder dienen deze antilichamen tezamen met gezuiverd Oncostatine M of fragmenten daarvan als component van diagnostische kits in samenhang met andere reagentia, in het bijzonder antilichamen voor het detecteren en kwantificeren van Oncostatine M.

15 8 60 3209

Claims (23)

1. Nieuw poly(aminozuur) met ten minste acht aminozuren dat immunologisch kruis-reactief is met een verbinding, welke verbinding een polypeptide is, dat kan worden verkregen uit leukocyten die in staat zijn tot het remmen van de woekering van neoplastische cellen, het stimuleren 5 van de uitbreiding van normale humane fibroblasten, het niet remmen van humane uitbreidende en cytotoxisch T-celreacties en het niet remmen van granulocytische/myelocytische beenmergkoloniecelvorming, met een molecuulgewicht in het traject van ongeveer 17 tot 19 kD als bepaald door gelexclusiechromatografie en ongeveer 28 kD als bepaald door 10 SDS-PAGE, dat betrekkelijk ongevoelig is voor gematigde zuren en basen en gematigde verhoogde temperaturen.

2. Poly(aminozuur) volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat dit een aminozuur-volgorde bevat met ten minste tien achtereenvolgende amonozuren die overeenkomen met een aminozuurvolgorde zoals 15 aangegeven in fig. 1 en die van genoemde volgorde met niet meer dan drie aminozuren verschilt.

3. Poly(aminozuur) volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat dit twaalf achtereenvolgende aminozuren bevat die overeenkomen met een aminozuurvolgorde voorgesteld in fig. 1 en die van genoemde volgorde 20 met niet meer dan één aminozuur verschilt, welk verschil hetzij een deletie of een conservatieve substitutie is.

4. Nieuw polypeptidepreparaat dat men uit leukocyten kan verkrijgen, dat een component bevat: die in staat is de woekering van neoplastische cellen te voorkomen, de uitbreiding 25 van normale humane fibroblasten te stimuleren, de humane uitbreidende en cytotoxisch T celreacties niet te belemmeren en de granulocytische/ myelocytische beenmergkoloniecelvorming niet te remmen, met een molecuulgewicht in het traject van ongeveer 17 tot 19 kD als bepaald door gelexclusiechromagrafie en ongeveer 28 kD als bepaald door SDS-PAGE, 30 dat betrekkelijk ongevoelig is voor gematigd zuur en gematigde base en gematigd verhoogde temperaturen; en met een zuiverheid die een specifieke activiteit van ten minste ongeveer 10 GIA eenheden/ng proteïne levert. S o 0 3 2 0 9 :r * -28-

5. Polypeptidepreparaat volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat genoemde leukocyten mitogeen-geactiveerd normale humane periferale bloedlymfocyten zijn,

6. Polypeptidepreparaat volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat 5 genoemde leukocyten forboldiëster-geinduceerde humane histiocytische lymfomacellen zijn.

7. Polypeptidepreparaat volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat dit nagenoeg vrij is van cellulaire componenten.

8. Polypeptide verkregen uit een preparaat volgens conclusie 4, 10 met het kenmerk, dat de specifieke activiteit van genoemd polypeptide ten minste ongeveer 100 GIA eenheden/ng proteïne is.

9. Polypeptide dat nagenoeg vrij is van cellulaire afval en andere leukocytische proteïnen, welk polypeptide in staat is de woekering van neoplastische cellen te remmen, de uitbreiding van humane fibro- 15 blasten te stimuleren, de humane uitbreidende en cytotoxische T-celreacties niet te remmen en de granulocytische/myelocytische been-mergkoloniecelvorming niet te remmen, met een molecuulgewicht in het traject van ongeveer 17 tot 19 kD als bepaald door gelexclusie-chromatografie en ongeveer 28 kD als bepaald door SDS-PAGE, en dat 20 betrekkelijk ongevoelig is voor gematigde zuren en basen en gematigd verhoogde temperaturen en aminozuurvolgordes omvat die overeenkomen met de volgordes aangegeven in fig. 1, waarbij er niet meer dan drie aminozuurverschillen tussen de voorgestelde volgorde en genoemde overeenkomstige volgorde bestaan.

10. Polypeptide volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat genoemde overeenkomstige volgorde met niet meer dan één aminozuur van genoemde aangegeven volgorde verschilt.

11. Werkwijze voor het remmen van de woekering van neoplastische cellen, omvattende het in contact brengen van genoemde cellen met een 30 de woekering remmende hoeveelheid van een preparaat volgens conclusie 8.

12. Werkwijze voor het versterken van wondheling omvattende het in aanraking brengen van een wond met een fibroblastuitbreidings-stimule-rende hoeveelheid van een polypeptide volgens conclusie 8.

13. Antilichamen specifiek voor een polypeptidepreparaat volgens 35 conclusie 1 of 4.

14. Monoklonale antilichamen volgens conclusie 13. 8S032O9 -29- m

15. Werkwijze voor het detecteren van de aanwezigheid van een polypeptidepreparaat. volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat deze omvat: het combineren van een monster waarvan vermoed wordt dat het het 5 genoemde preparaat bevat met een antilichaam volgens conclusie 13, en het bepalen van de hoeveelheid complexvorming met genoemd antilichaam.

16. DNA-volgorde die codeert voor een polypeptide volgens conclusie 8.

17. Werkwijze voor het produceren van een polypeptide volgens conclusie 8, omvattende: het laten groeien van een celkweek die cellen bevat met een expressieconstructie bestaande uit een DNA-volgorde die codeert voor een polypeptide volgens conclusie 4 onder de regulerende besturing 15 van transcriptie en translatie regulerende signalen die in genoemde cellen functioneel zijn, waardoor genoemd polypeptide tot expressie wordt gebracht; en het isoleren van genoemd polypeptide nagenoeg vrij van cellulair materiaal.

18. Diagnostische kit omvattende een antilichaam volgens conclu sie 13 en ten minste één van een poly(aminozuur) volgens conclusie 1 of een polypeptide volgens conclusie 8. P. & & ~ o n o V Ki “» yi VEREENIGDE OCTROOIBUREAUX Nederlandse octrooiaanvrage nr. 8603209 'Sogravenhage (holuand) beh. bij schrijven dd. 14 mei. 19 87 Ln/657 — Verbetering(en) van erratum(a) in de beschrijving, behorende bij octrooiaanvrage nr. 8603209 voorgesteld door aanvrager(ster) onder datum 14 mei 1987 cc oc oc cc er tc «<r cc cc cc cc « cc cc Toegevoegd worden de volgende conclusies 19-23. · ·- ,

19. Werkwijze voor het produceren van een nieuw poly(aminozuur) met ten minste acht aminozuren, dat immunologisch kruisreactief is met een verbinding, welke verbinding een polypeptide is dat van leukocyten kan worden verkregen, in staat is om de woekering van neoplastische cellen te remmen, in staat is om de uitbreiding van normale humane fibroblasten te stimuleren, humane uitbreiding en cyto.toxische T-cel reacties niet remt en granulo.cytische/myelocytische beenmerg koloniecel-vorming niet remt, met een molecuulgewicht in het bereik van ongeveer 17-19 kD zoals bepaald met geluitsluitings-chromato-grafie en ongeveer 28 kD zoals bepaald met SDS-PAGE, en dat relatief ongevoelig is voor gematigde zuren en basen en gematigde verhoogde temperaturen, waarbij een celcultuur wordt gekweekt die cellen bevat met een expressieconstruct, dat een DNA sequentie omvat welke codeert voor genoemde poly(aminozuur) onder de regulerende controle van transcriptie en translatie regelsignalen die in genoemde cellen functioneel zijn, waardoor het poly(aminozuur) tot expressie wordt gebracht, en het poly(aminozuur) in essentie vrij van celmateriaal wordt geïsoleerd. Sa Λ V O Λ ·Λ o w j l ‘j y ......545 33- * Μ

20. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij het poly(aminozuur) een aminozuursequentie bevat met ten minste tien opvolgende aminozuren die corresponderen met een in Fig. 1 weergegeven aminozuursequentie en van genoemde sequentie in niet meer dan drie aminozuren verschillen.

21. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij het poly(aminozuur) twaalf opvolgende aminozuren bevat die corresponderen met een in Fig. 1 weergegeven aminozuursequentie en van die sequentie in niet meer dan een aminozuur verschillen, welk verschil een deletie of een opvolgende subsitutie is.

22. Werkwijze voor het produceren van een polypeptide, dat in essentie vrij is van celresten en andere leukocytische eiwitten, welk polypeptide in staat is om de woekering van neoplastische cellen te remmen, in staat is om de uitbreiding van normale humane fibroblasten te stimuleren, humane uitbreidende en cytotoxische T-cel reacties niet remt en granulocytische/ myelocytische beenmerg koloniecelvorming niet remt, met een molecuulgewicht in het bereik van ongeveer 17-19 kD zoals bepaald met geluitsluitings-chromatografie en ongeveer 28 kD zoals bepaald met SDS-PAGE, en dat relatief ongevoelig is voor gematigde zuren en basen en gematigde verhoogde temperaturen, en aminozuursequenties omvat die corresponderen met de in Fig. 1 weergegeven sequenties met niet meer dan 3 verschillen in aminozuren tussen de getoonde sequentie en de genoemde overeenkomstige r sequentie, waarbij een celcultuur wordt gekweekt die cellen bevat met 8603209 ' -32:- een expressieconstruct dat een DNA sequentie omvat dat codeert voor genoemde polypeptide onder de regulerende controle van transcriptie en translatie regelsignalen die in genoemde cellen functioneel zijn, waarbij genoemde polypeptide tot expressie wordt gebracht, en het polypeptide in essentie vrij van celmateriaal wordt geïsoleerd.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, waarbij genoemde corresponderende sequentie in niet meer dan een aminozuur van de genoemde getoonde sequentie verschilt. 0 γΛ f\ W \J **'