DK174094B1 - Polypeptider og polypeptidsammensætninger samt antistoffer herimod, DNA-sekvenser kodende herfor; diagnostiske sæt omfattende antistoffer og polypeptider; anvendelse af polypeptider til diagnostiske formål, til fremstilling af lægemidler...... - Google Patents

Description

DK 174094 B1

Den foreliggende opfindelse angår polypeptider, polypeptidsammensæt-ninger, antistoffer, som er specifikke herfor, en DNA-sekvens kodende herfor, diagnostiske sæt, fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider samt anvendelse deraf ved fremgangsmåder til fremstilling af lægemidler og 5 diagnostiske formål.

Leukocyter, dvs. både lymfocyter og monocyter, har i adskillige animalske tumormodeller vist sig at være involveret ved inhiberingen af tumorvækst. Den forøgede forekomst af maligne tumorer hos immunokompro-mitterede mennesker understøtter påstanden om, at de hvide blodlegemer 10 spiller en rolle ved reguleringen af neoplastisk vækst. Proteinfaktorer, der frembringes af disse hvide blodlegemer og som inhiberer tumorvækst eller modulerer immunfunktioner, er allerede blevet isoleret og karakteriseret og omfatter o- og /-interferonerne, tumornekrosefaktorer, lymfotoxin, interleu-kin-2 og andre lymfokiner. Da hver af disse isolerede faktorer udviser et af-15 vigende aktivitetsspektrum og kan vekselvirke på forskellig måde i forbindelse med andre faktorer, er der en fortsat og stærk interesse for at isolere og karakterisere alle de faktorer, som de hvide blodlegemer frembringer ved modulering af cellevækst eller immunfunktioner. Disse forbindelser kan alene eller sammen finde anvendelse ved behandlingen eller diagnosen af 20 cancer, som promotorer for sårheling eller som immunomodulatorer til behandling af patienter med immunmangler, autoimmunitet, organtransplantater o.l.

Opdagelsen, isoleringen, rensningen eller karakteriseringen af naturligt forekommende faktorer kan støde på adskillige vanskeligheder. Der skal 25 udvikles metoder til separering og rensning af en faktor, som har interesse, fra andre faktorer i det rå udgangsmateriale uden at denaturere den ønskede faktors aktivitet, metoder til biologisk analyse, som tillader identifikation af fraktionerne under separationer, hvorved en særlig faktor koncentreres, metoder til at skelne en hidtil ukendt faktor fra faktorer, som allerede er 30 kendt, eller andre ukendte faktorer, som kan være til stede og som enten negativt eller positivt kan påvirke aktiviteten af den efterstræbte faktor, metoder til karakterisering af den rensede faktor og metoder til koncentrering af den rensede faktor i en tilstrækkelig mængde, således at identificering og karakterisering af faktoren tillades. Som følge af det stigende antal faktorer, 35 der er isoleret, bliver hver ny faktor derfor mere vanskelig at identificere, da dens rolle og funktion kan være skjult af de talrige andre tilstedeværende faktorer.

2 DK 174094 B1

Beal et al., Cancer Biochem. Biophvs. (1979) 3:93-96, beretter om nærværelsen af peptider i human urin, hvilke peptider inhiberer vækst og DNA-syntese i transformerede celler mere end i normale celler. Holley et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 77:5989-5992 beskriver oprensningen af epitel 5 cellevækst-inhibitorer. Letansky, Biosci. Rep. (1982) 2:93-45 beretter, at peptider oprenset fra kvægplacenta inhibirer tumorvækst og thymidininkor-porering i DNA i større udstrækning i neoplasma end i normale celler. Chen,

Trends Biochenm. Sci. (1982) 7:364-365. beretter om isoleringen af et peptid fra ascitesvæske med cancer-undertrykkende egenskab. Redding og 10 Schally, Proc. Natl. Acad. Sci. (1982) 79:7014-1718, beretter om isoleringen af et eller flere oprensede peptider fra svinehypothalmus, hvilke peptider udviser antimitogen aktivitet over for adskillige normale cellelinier og tumor-cellelinier. Sone et al., Gann (1984) 75:920-928, beretter om produktionen af en eller flere faktorer, der frembringes af humane makrofager, hvilke fak-15 torer inhiberer væksten af visse tumorceller in vitro. Ransom et al.. Cancer Res. (1985) 45:851-862, beretter om isoleringen af en faktor kaldet leukore-gulin, hvilken faktor inhiberer replikationen af visse tumorcellelinier og synes forskellig fra lymfotoxin, interferon og interleukin 1 og 2. De fleste af disse faktorer er ikke fuldt ud karakteriseret og den primære struktur deraf er hel-20 ler ikke kendt.

Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:686-691. har oprenset og karakteriseret human lymfotoxin (LT), der er fremstillet af en lymfoblastoid cellelinie, og har derefter sekvensopdelt LT (Aggarwal et al., J. Biol. Chemn.

(1985) 260:2334). Gamma-interferon (y-lF), som er fremstillet af lymfoidcel-25 ler og som besidder immunomodulatorisk og tumorinhibitorisk aktivitet, er blevet klonet og fremstillet ved ekspression (Gray et al., Nature (1982) 295:503:508). Tumornekrosefaktor (TNF), som inhiberer vækst af visse tumorer og som fremstilles af makrofager og visse leukæmiske cellelinier, er blevet karakteriseret og TNF-cDNA hvar været klonet og fremstillet ved eks-30 pression i E. coli (Pennica et al., Nature (1984) 312:724).

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes en hidtil ukendt peptidfaktor samt biologisk aktive fragmenter deraf, hvilken faktor kan opnås fra leukocyter. Faktoren finder anvendelse ved modulation af cellevækst såsom inhibering af tumorcellevækst og stimulering afvæksten af normale fibro-35 blaster og kan modulere immunfunktioner. Faktoren besidder en aminosyre-sekvens, der tydeligt adskiller sig fra sekvenserne af andre forbindelser, der er angivet at besidde analoge egenskaber.

3 DK 174094 B1

Den foreliggende opfindelse beskrives i det følgende nærmere under henvisning til tegningen, hvor figur 1 angiver aminosyresekvensen for fragmenter af Oncostatin M, figur 2 viser en serie mikrofotografler af celler behandlet med Oncostatin 5 M, hvor mikrofotograf! (A-C) forestiller A375 melariomaceller behandlet med hhv. 0,5 og 100 GlA-enheder, og fotografi (D-F) forestiller W138 fibro-blastceller behandlet med hhv. 0, 5 og 100 GlA-enheder, og figur 3 viser et fotografi afen SDS-PAGE analyse af Oncostatin M.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes et hidtil ukendt polypeptid, polypep-10 tidsammensætninger, polypeptidderivater, en fremgangsmåde til fremstilling deraf, hvilke sammensætninger udviser aktivitet i retning af modulation af cellevækst, især inhibering af tumorcellevækst og stimulering af væksten af normale fibroblastceller. Et polypeptid ifølge opfindelsen betegnes som Oncostatin M og kan opnås fra leukocyter, fx. fra konditionerede medier af sti-15 mulerede U937 celler eller konditionerede medier af stimulerede normale humane perifere blodlymfocyter (PBL). Ifølge opfindelsen tilvejebringes ligeledes derivater af polypeptidet, hvilke derivater besidder det intakte Oncostatin M's biologiske aktivitet såsom cellevækstmodulerende aktivitet eller immunologisk aktivitet.

20 Polypeptidfragmenterne ifølge den foreliggende opfindelse er hidtil ukendte polypeptider med mindst otte aminosyrer, hvilke polypeptider er biologisk aktive, i det mindste med hensyn til immunologisk kryds-reaktivitet med naturligt forekommende Oncostatin M. Ved immunologisk kryds-reaktivitet forstås, at et antistof, som fremkaldes af et hidtil ukendt polypeptid iføl-25 ge opfindelsen, vil kryds-reagere med intakt Oncostatin M, i det mindste, når Oncostatin M befinder sig på denatureret form. Sådanne polypeptider er derfor nyttige til fremkaldelse af antistoffer mod Oncostatin M, hvilke antistoffer kan anvendes til bestemmelse af Oncostatin M koncentrationen i en legemsvæske, til at bindes til Oncostatin M og således modulere aktiviteten 30 deraf, og til rensning af Oncostatin M, fx. ved anvendelse i forbindelse med en affinitetskolonne. En del af polypeptiderne kan også bibeholde Oncostatin M's cellevækst-modulerende aktivitet, skønt aktiviteten kan være moduleret, sædvanligvis formindsket, i sammenligning med intakt Oncostatin M.

Figur 1 viser aminosyresekvensen af poly(aminosyrer), som kryds-rea-35 gerer med Oncostatin M, idet den første sekvens udgør N-terminaldelen af Oncostatin M.

4 DK 174094 B1

Poly(aminosyrer) ifølge den foreliggende opfindelse indeholder en ami-nosyresekvens med mindst otte på hinanden følgende aminosyrer, som svarer til en i figur 1 afbildet aminosyresekvens og som højst adskiller sig fra denne sekvens med hensyn til tre og sædvanligvis ikke mere end én 5 aminosyre. Denne forskel kan enten bestå i indføjelse af en aminosyre, udeladelse af en aminosyre eller substitution af en aminosyre med en anden, især en konservativ substitution. Sædvanligvis vil poly(aminosyrer) indeholde mindst ti og mere sædvanligt mindst tolv på hinanden følgende aminosyrer, som svarer til sekvenser afbildet i figuren, og som højest adskil-10 ler sig herfra med hensyn til én aminosyre.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse vil de forskellige aminosyrer være opdelt i et antal underklasser. Den nedenfor anførte tabel angiver disse underklasser: alifatisk 15 neutral

ikke-polær G A P V L I

polær S T C Μ N Q

sur D E

basisk K R

20 aromatisk F Η Y W

Ved konservativ substitution menes, at aminosyrer fra samme underklasse (dvs. enten neutral alifatisk, sur alifatisk, basisk alifatisk eller aromatisk), nærmere betegnet med samme polaritet, erstatter hinanden. Ønsk-25 værdigt vil monomergrupperingerne i den alifatiske underklasse bestå af aminosyrer indeholdende 2-4 carbonatomer eller 5-6 carbonatomer.

Omhandlede poly(aminosyrer) vil ikke besidde en længde, som overstiger ca. 1.000 aminosyrer. Sædvanligvis vil de Indeholde mindre end 100 aminosyrer og mere sædvanligt mindre end 50 aminosyrer. Således kan 30 omhandlede poly(aminosyrer) let syntetiseres. Poly(aminosyrer), hvis længde overstiger 100 aminosyrer, vil sædvanligvis være polymere af fragmenter af Oncostatin M, hvilke fragmenter hver især indeholder mindre end 100 aminosyrer, eller sammensmeltede proteiner, hvor fragmentet er sammensmeltet med et antigen, enzym, enzymfragment, etc. Især kan poly(amino-35 syrer) med højere molekylvægt bestå af mindst et polypeptidfragment med mindre end ca. 100 aminosyrer, som er covalent bundet til en stor immunogen polypeptidbærer for tilvejebringelse af immunogenitet. Eksempler på 5 DK 174094 B1 sådanne proteinbærer er kvægserumalbumin, såkaldt keyhole limpet hæ-mocyanin (KLM) o.l. Sådanne konjugerede polypeptider vil være nyttige til at inducere antistoffer i en passende værtsorganisme.

U937-celler er en cellelinie, der stammer fra en histiocytisk lymfoma-5 cellelinie (Sundstrøm og Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17:565-577), man kan få til at differentiere til celler med makrofag-egenskaber efter behandling med forskellige midler (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45:9-13). Til fremstilling af Oncostatin M kan U937-cellerne dyrkes i et konventionelt næringsmedium med serum og behandles med en passende induktor. Der kan 10 bekvemt anvendes phorboier eller ingenoler, især 12-O-tetradecanoylphor- bol-13-acetat (TPA). Sædvanligvis kan der anvendes fra ca. 5-20 ng/ml af 5 6 mduktoren. Begyndelsesantallet af celler ligger fra ca. 10 til 10 celler/ml.

Efter behandling af cellerne med induktoren i tilstrækkelig tid, i almindelighed fra 1 til 6 dage, fjernes supernatanten, cellerne vaskes med se-15 rumfrit næringsmedium, bundne celler vaskes atter med serumfrit medium og cellerne får lov til at inkubere i mindst 12 timer, sædvanligvis ikke mere end ca. 48 timer, i serumfrit næringsmedium, fx. RPMI-1640 medium. Su-pernatanterne samles så og cellerne fjernes ved centrifugering. Cellefrie su-pernatanter afprøvedes for cellevækst-inhibitorisk aktivitet (GIA) som be-20 skrevet i den eksperimentelle del. Supernatanten indeholder ca. 50-500 enheder GIA per ml (med hensyn til definitionen på GIA-enheder henvises til den eksperimentelle del nedenfor).

Oncostatin M kan også opnås fra mitogen-stimulerede normale humane -periferiske blodlymfocyter (PBL). PBL kan isoleres fra leukofraktioner ved 25 fortynding af fraktionerne og centrifugering deraf over "FicoH'-gradienter.

Celler, der er opsamlet fra gradientgrænselagene, vaskes og chok-lyseres til fjernelse af røde blodlegemer. De resterende celler opsamles fra denne opløsning fra centrifugering, resuspenderes i pufferholdig serum og thrombin, rystes og blodpladeaggregatet får lov til at sætte sig i et kort tidsrum.

30 De suspenderede celler overføres, genvindes ved centrifugering, resuspenderes i serum og overføres til en kolonne, der indeholder nylonuld. Kolonnen inkuberes for at tillade, at monocyter og B-lymfocyter bindes, og vaskes derpå. De fleste perifere blod-T-lymfocyter bindes ikke og elueres fra kolonnen. Disse celler dyrkedes ved 37° i dyrkningsmedium, fx. RPMI-1640 me-35 dium, og behandledes med en passende induktor, fx. fytohæmagglutinin (ca. 1-5 mg/l) i ca. 100 timer, og derpå opsamledes supernatanterne. Su-pernatanterne centrifugeredes til fjernelse af celler og koncentreredes ved 6 DK 174094 B1 fx. ultrafiltrering eller dialyse.

Efter isolering af den cellefrie supernatant fra enten U937-celler eller normale PBL'er koncentreres det konditionerede medium bekvemt under anvendelse af et hulfibersystem eller en ultrafiltreringsmembran efterfulgt af 5 fortynding med eddikesyre (til en koncentration på 0,1 N eddikesyre), koncentreres atter ca. 10 gange, hvorefter fortynding og koncentrering gentag es. Koncentratet kan lyoftliseres og anvendes direkte eller det lyofiliserede produkt kan anvendes til yderligere oprensning.

Omhandlede Oncostatin M kan renses ved gelpermeeringskromatografi 10 under anvendelse af 40% acetonitril-0,1 % trifluoreddikesyre som isokratisk mobil fase på en "Bio-sil TSK250"-kolonne, idet aktiviteten af hver fraktion overvåges. Oprensningen giver en sammensætning med mindst ca. 0,5- 4 5x10 GiA-enheder/ml i de aktive fraktioner.

Det delvist rensede produkt fra gelpermeeringskromatografien kan yder-15 ligere oprenses ved anvendelse af reversfase-højtryksvæskekromatografi under anvnedelse af en lineær gradient, hvor det primære opløsningsmiddel er 0,1% trifluoreddikesyre i vand og det sekundære opløsningsmiddel er acetonitril indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre. Tidsforløbet kan varieres, idet kromatograferingen i almindelighed kræver ca. 3-4 timer, hvoraf hoved-20 parten af tiden, dvs. mere end ca. 50% af tiden og ikke mere end ca. 80% af tiden, forbruges i det gradientinterval, hvor koncentrationen af sekundært opløsningsmiddel er 30-45%. Under disse betingelser eluerer de aktive fraktioner ved en koncentration på ca. 41-42% acetonitril.

De forenede aktive fraktioner kan yderligere oprenses ved gentagelse af 25 omhandlede reversfase-HPLC under anvendelse af en hurtigere ændring i gradientbetingelseme og en langsommere flow-hastighed. Under disse betingelser fremkommer de aktive fraktioner ved en koncentration på ca. 40,5-41,5% acetonitril.

Omhandlede reversfase-HPLC kan derpå gentages under ændring af 30 opløsningsmiddelsystemet, idet der som sekundært opløsningsmiddel anvendes n-propanol-0,1% trifluoreddikesyre. Der anvendes en lineær gradient, hvor gradienten ændres langsomt i intervallet fra 23-35% n-propa-nol. Den betydeligste aktivitet iagttages i intervallet fra 25,5-27,5% propanol, hvilket giver et i alt væsentligt homogent produkt med en specifik akti-35 vitet, der overstiger 10 GIA-enheder/ng protein. Sædvanligvis oprenses produktet til opnåelse af en specifik aktivitet på mindst ca. 100 GIA-enheder/ng protein og mere sædvanligt til 150 GIA-enheder/ng.

7 DK 174094 B1

De omhandlede forbindelser er karakteriseret ved en molekylvægt på ca. 17-19 kiloDalton (kD), især ca. 18 kD, ifølge bestemmelse ved størrelsesudelukkelseskromatografi. De omhandlede forbindelser er yderligere karakteriseret ved at besidde en tilsyneladende molekylvægt på ca. 28 kD 5 ifølge bestemmelse ved polyacrylamidgelelektrofurese under reducerende eller ikke-reducerende betingelser.

Aminosyresekvensen af fragmenter af renset Oncostatin M analyseredes. Oncostatin besidder i alt væsentligt de i figur 1 angivne aminosy-resekvenser. Idet der henvises til figur 1, belyser den første sekvens N-ter-10 minaldelen af Oncostatin M, mens de resterende sekvenser belyser indre fragmenter af polypeptidet.

Aktive sammensætninger af isoleret Oncostatin M indeholdt en blanding med højt indhold af mannose og komplekst N-bundet oligosaccharid. Imidlertid bibeholdt ikke-glycosylerede sammensætninger af Oncostatin M celle-15 vækstmodulatorisk aktivitet.

Oncostatin M er yderligere karakteriseret ved aktiviteten deraf over for visse cellestammer. Det omhandlede polypeptid mangler cytotoxisk aktivitet over for WI26 og WI38 humane fibroblastceller og L929 museceller, der er følsomme over for tumornekrosefaktor, og en y-interferonfølsom human tu-20 morcellelinie. Det har også vist sig, at det ikke inhiberer proliferation af normale humane T-lymfocyter eller inhiberer granulocytisk/myelocytisk kolonidannelse fra knoglemarvceller ved koncentrationer op til 100 GlA-enhe-der/ml. Oncostatin M stimulerer ydermere proliferationen af normale humane fibroblastceller som eksemplificeret ved WI38- og WI26-celler og inhibe-25 rer proliferation af tumorceller såsom A375, HBT10, A549 og SK-MEL28 og kan forøge væksten af kolonidannende celler fra normal knoglemarv. Oncostatin M undertrykte ikke humane proliferative eller cytotoxiske T-cellereaktioner ved blandede leukocytkulturreaktioner (MLC) ved koncentrationer på 500 GIA-enheder/mi.

30 Det omhandlede polypeptid har vist sig at være stabilt over for moderat syre- og basepåvirkning og over for varmebehandling ved 56°C.

Aminosyresekvensen for det omhandlede polypeptid kan bestemmes fuldstændigt under anvendelse af kommercielt tilgængelige sekvensanaly-seapparater. Polypeptidet kan derpå syntetiseres i overensstemmelse med 35 kendte metoder under anvendelse af automatiske synteseapparater, som også er kommercielt tilgængelige.

8 DK 174094 B1

Alternativt kan det omhandlede polypeptid fremstilles ved hjælp af re-kombinant-DNA-teknik. Probér kan udledes fra en partiel aminosyrese-kvens, hvilke prober derpå kan anvendes til screening af et humant ge-nombibliotek. Biblioteket kan være et cDNA-bibliotek eller et kromosom-5 bibliotek. Når først klonen eller klonerne er identificeret ved hjælp af normalisering med proben, kan fragmenterne, der indeholder det ønskede gen, identificeres på et antal måder og håndteres på et antal måder. Fragmentet kan formindskes ved hjælp af endonukleasenedbrydning, idet de fremkomne fragmenter klones og undersøges ved hjælp af prober for nærværelse af 10 det ønskede gen. Celler, som frembringer det ønskede peptid eller frembringer forøgede mængder af det ønskede peptid, kan anvendes til fremstilling af budbringer-RNA. Fra omhandlede budbringer-RNA kan den enkeltstrengede cDNA fremstilles. Omhandlede cDNA kan derpå normaliseres med hele budbringer-RNA'en fra en celle, der fremstiller en smule, om over-15 hovedet noget af polypeptidet. Den ikke-normaliserede cDNA kan derpå isoleres og anvendes til fremstilling af ds-cDNA, som kan screenes med proberne.

Alternativt kan DNA-fragmenterne indføjes i Agt11, således at kod-ningsfragmenteme befinder sig nedstrøms fra og i samme ramme som U-20 galaktosidase-genet. Antistoffer til Oncostatin M polypeptidet kan fremstilles og anvendes til screening af de fremkomne koblede proteiner med hensyn til kryds-reaktivitet. På denne måde kan fragmenter, som koder for det omhandlede polypeptid eller fragmenter deraf, identificeres og anvendes til identificering af det ønskede gen.

25 Når først et komplet gen er identificeret enten som cDNA eller kromo- som-DNA, kan det derpå manipuleres på et antal måder for at sørge for ekspression. Hvor ekspressionen af genet skal ske i en vært, som erkender transkriptions- og translations-regulerende områder af vildtypen i Oncostatin M, kan hele genet med dets vildtype 5'- og 3'-regulerende områder indføres 30 i en passende ekspressionsvektor. Der eksisterer forskellige ekspressionsvektorer, som anvender replikationssystemer fra mammale vira såsom Si-mianvirus 40, adenovirus, kvægpapillomavirus, vacciniavirus, insekt-baculo-virus, etc. Disse replikationssystemer er udviklet med henblik på at tilvejebringe markører, som tillader udvælgelse af transfektanter såvel som på at 35 tilvejebringe bekvemme restriktionspladser, hvor genet kan indføjes.

Hvor genet skal underkastes ekspression i en vært, som ikke erkender de naturligt forekommende transkriptions- og translations-regulerende om- 9 DK 174094 B1 råder af vildtypen, vil yderligere manipulation være påkrævet. Der kendes forskellige passende 3'-transkriptions-regulerende områder, som kan indføjes på nedstrømssiden fra stopkodoneme. Det ikke-kodende 5'-område på Opstrømssiden af det strukturelle gen kan fjernes ved endonuklease-5 restriktion, Ba131 -restriktion eller lignende. Hvor der findes et bekvemt restriktionssted nær 5'-terminaldelen af det strukturelle gen, kan det strukturelle gen alternativt underkastes restriktion og der anvendes en adaptor til at binde det strukturelle gen til promotorområdet, idet adaptoren tager hensyn til de mistede nukleotider i det strukturelle gen. Forskellige strategier 10 kan anvendes for at tilvejebringe en ekspressionskassette, som i transkriptionens 5'-, 3'-retning besidder et transkriptions- og translationsstartområde og som også kan omfatte regulerende sekvenser, som sørger for regulationsinduktion, det strukturelle gen under transkriptions- og translationskontrol af startområdet og et transkriptions- og translationsslutområ-15 de.

Eksempler på transkriptionsstartområder eller -promotorer omfatter med hensyn til bakterier β-gal-promotoren, TAC-promotoren, venstre og højre λ-promotoren, etc., med hensyn til gær glycolytiske enzympromotorer såsom ADH-I og -ll-promotorer, GPK-promotorer, PGI-promotorer, TRP-promoto-20 rer, etc., og med hensyn til mammale celler tidlige og sene SV40-promoto-rer, sene adenovirus-hovedpromotorer, etc. Som allerede anført kan ekspressionskassetten være indeholdt i replikationssystemet for episomal opretholdelse i en passende cellulær vært eller kan tilvejebringes uden et re-plikationssystem, hvor den kan blive integreret i værtgenomet. DNA'en kan 25 indføres i værten i overensstemmelse med kendte metoder såsom transformation under anvendelse af calciumphosphat-fældet DNA, transfektion ved at bringe cellerne i kontakt med virusset, mikroinjektion af DNA'en i celler eller lignende.

Når først det strukturelle gen er blevet indført i en passende vært, kan 30 værten dyrkes og vil udtrykke genet ved ekspression. I nogle tilfælde kan det være ønskværdigt at tilvejebringe en signalsekvens (sekretionsleder) på opstrømssiden fra og i læseramme med det strukturelle gen, hvilken sekvens sørger for sekretion af det strukturelle gen og fraspaltning af sekretionslederen, således at det udviklede polypeptid tilvejebringes i su-35 pematanten. Hvor der ikke er sørget for sekretion, kan værtscellerne så høstes, lyseres i overensstemmelse med konventionelle betingelser og det ønskede produkt isoleres og renses i overensstemmelse med kendte meto- 10 DK 174094 B1 der såsom kromatografi, elektrofurese, opløsningsmiddelekstraktion eller lignende.

De omhandlede forbindelser kan anvendes på forskellige måde både in vivo og in vitro. De omhandlede forbindelser kan anvendes til fremstilling af 5 antistoffer til de omhandlede forbindelser, hvilke antistoffer kan finde anvendelse in vivo eller in vitro. Antistofferne kan fremstilles på konventionelle måder enten ved at anvede det omhandlede polypeptid som et immunogen og injicere polypeptidet i en mammal vært, fx. mus, ko, ged, får, kanin, etc., især med et adjuvans, fx. komplek Freunds adjuvans, aluminiumhydroxidgel 10 eller lignende. Værten kan så tappes for blod og blodet anvendes til isolering af polyklonale antistoffer eller i tilfælde af mus kan de perifere blodlym-focyter eller miltlymfocyter (B-celler) anvendes til sammensmeltning med en passende myelomacelle til udødeliggørelse af kromosomerne til monoklonal ekspression af antistoffer, der er specifikke for de omhandlede forbindelser.

15 Der kan både fremstilles polyklonale eller monoklonale antistoffer, som derpå kan anvendes til diagnose eller påvisning af nærværelsen af det omhandlede polypeptid i en prøve såsom celler eller en fysiologisk væske. fx. blod. Antistofferne kan også anvendes ved affinitetskromatografi til oprensning af det omhandlede polypeptid og isolering deraf fra naturlige eller syn-20 tetiske kilder. Antistofferne kan også finde anvendelse ved kontrol af mængden af det omhandlede polypeptid i forbindelse med celler i kultur eller in vivo, hvorved cellernes vækst kan modificeres.

Den omhandlede forbindelse kan anvendes som en ligand til påvisning af nærværelsen af restriktorer for den omhandlede forbindelse. På denne 25 måde kan celler skelnes i overensstemmelse med nærværelsen af og tætheden af receptorer for den omhandlede forbindelse, idet virkningen af forskellige forbindelser på nærværelsen af sådanne restriktorer undersøges.

Den omhandlede forbindelse kan anvendes in vitro kulturer til inhibering af væksten af celler eller cellelinier, der er følsomme over for det omhand-30 lede polypeptid i modsætning til celler, som ikke er følsomme. Heterogene celleblandinger eller cellelinier kan således befries for uønskværdige celler, når de uønskværdige celler er følsomme over for det omhandlede polypeptid. Det omhandlede polypeptid kan administreres in vivo i tilfælde af neoplastiske tilstande, fx. ved introlæsional, peritoneal, subkutan eller lig-35 nende injektion. Den omhandlede forbindelse kan anvendes in vitro til eliminering af maligne celler fra marven til autologe marvtransplantater eller til inhibering af proliferation eller eliminering af maligne celler i andre væv, fx.

11 DK 174094 B1 blod, før reinfusion.

Det omhandlede polypeptid kan også anvendes ved en fremgangsmåde til behandling af sår såsom kutane sår, corneale sår og forskellige andre epithele og stromale sår såsom kronisk ulcer, forbrændinger, kirurgiske ind-5 snit, traumatiske sår og beskadigelser på de hule epitheldækkede organer såsom øsophagus, mave, tyk- og tyndtarm, mund, genitalier og urinveje.

Metoden afhænger af den topiske applikation af en behandlingspræparat, som indeholder Oncostatin M i en fysiologisk acceptabel bærer.

Præparatet ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til behand-10 ling af forskellige typer sår, herunder i alt væsentligt alle kutane sår, corneale sår og beskadigelser på de epithelbeklædte hule organer i kroppen. Sår, der er egnede til behandling, omfatter sådanne sår, der stammer fra trauma såsom forbrændinger, afskrabninger, snit o.l. såvel som fra kirurgiske fremgangsmåder såsom kirurgiske indsnit og hudtransplantation. An-15 dre tilstande, som er egnet til behandling med sammensætningerne ifølge opfindelsen, omfatter kroniske tilstande såsom kronisk ulcer, diabetisk ulcer og andre ikke-helende (trofiske) tilstande.

Oncostatin M kan inkorporeres i fysiologisk acceptabel bærere til applikation i et påvirket område. Arten af bæreren kan variere og vil afhænge af 20 det beregnede applikationsområde. Til applikation på huden foretrækkes normalt en creme- eller salvebasis, idet en sådan passende basis omfatter lanolin, "Silvaden" (Marion) (især til behandling af forbrændinger), "Aquaphof" (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut), o.l. Om ønsket vil det være muligt at inkorporere Oncostatin M-holdige sammen-25 sætninger i bandager og andre sårforbindinger for at sørge for kontinuerlig eksponering af såret for peptidet. Aerosolapplikationer kan også finde anvendelse.

Koncentrationen af polypeptidet i behandlingspræparatet er ikke kritisk. Polypeptidet vil være til stede i en epithel celle-proliferationsinducerende 30 mængde. Præparaterne vil blive anbragt topisk i det påvirkede område, typisk som øjendråber til øjet eller som cremer, salver eller lotioner til huden. I tilfælde af øjne er hyppig behandling ønskværdig, sædvanligvis applikationer med intervaller på 4 timer eller mindre. På huden er det ønskværdigt kontinuerligt at fastholde behandlingspræparatet på det påvirkede område 35 under helingen med applikationer af behandlingspræparatet fra 2 til 4 gange om dagen eller oftere.

12 DK 174094 B1

Den anvendte mængde af det omhandlede polypeptid vil variere i af-* hængighed af administrationsmåden, anvendelsen af andre aktive forbind elser o.l. og vil generelt ligge i intervallet fra ca. 1 pg til 100'pg. Det omhandlede polypeptid kan anvendes med en fysiologisk acceptabel bærer 5 såsom saltvand, phosphatpuffer-indstillet saltvand eller lignende. Mængden af anvendt forbindelse bestemmes empirisk på basis af reaktionen af celler in vitro og reaktionen af forsøgsdyr over for de omhandlede polypeptider eller sammensætninger indeholdende de omhandlede polypeptider. De omhandlede forbindelser finder anvendelse alene eller i kombination med an-10 dre vækstfaktorer eller inhibitorer eller immunomodulatorer såsom TNF, IL-2, y-interferon, monoklonale antistoffer, etc. Mængden af disse andre forbindelser vil generelt ligge i intervallet fra 1 pg til 100 pg. Konjugater af de omhandlede forbindelser med område-dirigerende rester, fx. antistoffer, kan fremstilles i de tilfælde, hvor antistofferne er specifikke overfor særlige ma-15 ligne celler eller organer.

Opfindelsen belyses i det følgende nærmere.

Materialer og metoder 20

Oncostatin M isoleret fra U937-celler

Produktion af en tumorcellevækstinhibitor fra en histiocvtisk Ivmfomacelle- linie 25 U937-celler, der er en histiocytisk lymfomacellelinie (Sundstrøm og

Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17:565-577) dyrkedes i 850 cm^ rulleflasker 5 (Corning C2540) ved en koncentration på 4 x 10 celler/ml i et samlet volumen på 300 ml RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), penicillin/streptomycin (PS), L-glutamin og 10 ng/ml 12-O-tetrade-30 canoylphorbol-13-acetat (TPA). Fire dage senere fjernedes supernatan-terne indeholdned FCS og TPA, rulleflaskerne vaskedes 5 gange med se- 5 rumfrit RPMI-1640, og løsrevne celler (1x10 celler/ml) vaskedes 3 gange med serumfrit medium og førtes tilbage til flaskerne, hvilket resulteredes i et slutvolumen på 125 ml serumfrit RPMI-1640 medium per rulleflaske. Én dag 35 senere samledes supernatanterne, centrifugeredes til fjernelse af cellerne, filtreredes igennem et 0,45 mikron (p) "Nalgene'-filter og koncentreredes under anvendelse af et hulfibersystem ("Amicon Cartridge HIP10-20") til et 13 DK 174094 B1 volumen på 150 ml (startvolumen 1500 ml). Oncostatin M isoleredes også 2 fra supematanter af serumfrit TPA-behandlede U937-celler i 150 cm vævskulturkolber. Supernatanten koncentreredes med en "Amicon Diaflo PM-10,'-membran, der besad en afskæringsværdi på 10 kD, og dialy-5 seredes. Efter dialyse fortyndedes koncentratet med eddikesyre, hvilket resulterede i en slutkoncentration på 0,1 N eddikesyre i 500 ml, og koncentreredes til 50 ml under anvendelse af et "Amicon PM-10"-filter. Dette 50 ml koncentrat fortyndedes til 400 ml med 0,1 N eddikesyre og koncentreredes til 40 ml med samme filter. Koncentratet fortyndedes med 1 N eddikesyre 10 og den resulterende udfældning fjernedes ved centrifugering. Det fremkomne koncentrat blev nedfrosset og lyofiliseret. Det lyofiliserede materiale anvendtes til oprensningstrin.

Gelpermeerinaskromatoarafi 15 En "Bio-sil TSK-250"-kolonne (600 x 21,5 mm) (Bio-Rad) blev forbundet med et højtryksvæskekromatografisk system. Den rå fraktion (10 mg/ml) opløstes i 40% acetonitrol i 0,1% vandig trifluoreddikesyre (0,1% TFA). En 2 ml alikvot af blandingen injiceredes og elueringen udførtes isokratisk med en mobil fase bestående af 40% acetonitril i 0,1% TFA. Flow-hastigheden 20 var 2,5 ml/minut og fremføringshastigheden for diagrampapiret indstilledes til 0,25 cm/minut. 5 ml fraktioner opsamledes. Kromatografien udførtes ved stuetemperatur. En alikvot fra hver fraktion inddampedes og analyseredes tredobbelt med hensyn til vækstinhibitorisk aktivitet (GIA) over for A375-cel-ler.

25 De aktive fraktioner (fraktion 21 og 22) fra seks kørsler forenedes. Det 5 forenede materiale besad en aktivitet på ialt ca. 4,8 x 10 GlA-enheder.

Faktoren viste sig at besidde en tilsyneladende molekylvægt på 18 kD ifølge bestemmelse ved hjælp af størrelsesudelukkelseskromatografi ("Bio-Sil TSK-250"-kolonne).

30

Reversfase-høitrvksvæskekromatoarafi (HPLC) af TSK-250-fraktioner De ovenfor beskrevne forenede TSK-250-fraktioner 21 og 22 fortyndedes to gange med 0,1% TFA. Denne blanding injiceredes isokratisk på en np-Bondapak-C18"-kolonne (7,8 x 300 mm) (betegnet som C18 ) ved stue-35 temperatur. Flow-hastigheden indstilledes til 2,5 ml/minut og diagramha- stighedne på skriveren indstilledes til 0,25 cm/minut. En lineær gradient anvendtes imellem primært opløsningsmiddel-0,1% TFA og det sekundære 14 DK 174094 B1 opløsningsmiddel acetonitril-0,1% TFA. Gradientbetingelserne var 0-30% i løbet af 20 minutter, derpå 30-45% i løbet af 150 minutter. 45-55% i løbet af 20 minutter og 55-100% i løbet af 10 minutter. Alle opløsningsmidler var af HPLC-kvalitet. Der opsamledes 4 ml fraktioner og alikvoter af hver fraktion 5 analyseredes med hensyn til vækstinhibitorisk aktivitet. Fraktionerne 72-75 viste sig at indeholde den overvejende aktivitet. De aktive fraktioner eluere- des ved acetonitrilkoncentrationer på mellem 41 og 52%.

Fraktionerne 72-75 forenedes. 16 ml 0,1% TFA sattes til de forenede fraktioner. Blandingen indsprøjtedes i en "p-Bondapakt-C18"-kolonne (3,9 x 2 10 300 mm) (betegnet som C18 ) ved stuetemperatur. Flow-hastigheden ind stilledes til 1 ml/minut og diagramhastigheden på skriveren indstilledes til 0,25 cm/minut. Gradientbetingelserne var 0-35% i løbet af 10 minutter, 35-45% i løbet af 100 minutter og 45-100% i løbet af 10 minutter. Fraktionerne opsamledes og alikvoter blev udtaget og analyseret med hensyn til GIA. Det 15 meste af aktiviteten forlod kolonnen ved en acetonitrilkoncentration på mellem 40,7 og 41,3% (retentionstid 83-86 minutter).

De aktive fraktioner forenedes og fortyndedes to gange med 0,1% TFA og indsprøjtedes isokratisk på en "p-Bondapak-C18"-kolonne (3,9 x 300 3 mm) (betegnet som C18 ) ved stuetemperatur. Flow-hastigheden var 1 20 ml/minut og diagramhastigheden på skriveren var 0,25 cm/minut. Der anvendtes en lineær gradient imellem primært opløsningsmiddel-0,1% TFA og de sekundære opløsningsmiddel n-propanol-TFA (0,1%). Gradientbetingelserne var 0-23% i løbet af 20 minutter og 25-35% i løbet af 120 minutter.

Fraktionerne opsamledes og alikvoter af hver fraktion undersøgtes med 25 hensyn til GIA. Det meste af aktiviteten viste sig ved en propanol- koncentration på mellem 25 og 26,5% (retentionstid 59 minutter). Denne tilsyneladende homogene fraktion indeholdt ca. 300 ng protein og besad en aktivitet på 40.000 GlA-enheder.

3 30 Cellevækstmodulatorisk analyse under anvendelse af H-thvmidin-inkorpo-rerinq i DNA (GIA)

Analyserne udførtes ved hjælp af plader forsynet med 96 flade brønde (Costar 3596). Humane melanomaceller (A375) anvendtes som en følsom 3 indikatorcellelinie. Celler (3x10 ) i 0,1 ml Dulbecco's modificeret Eagles-35 medium (DMEM) suppleret med 10% FCS og PS anbragtes i hver brønd. 3 timer senere tilsattes 0,1 ml prøver til hver brønd. Pladerne inkuberedes o ved 37°C i 3 dage. Derpå sattes 0,025 ml (0,5 pCi) af en opløsning af "n- 15 DK 174094 B1 thymidin (specifik aktivitet 27 pCi/pg) til hver brønd for de sidste 6 timer af inkuberingen. Cellerne overførtes så til glasfilterstrimler under anvendelse afen multibrøndshøster (PHD Cell Harvester, Cambridge Technology, Inc.).

Filtrene overførtes til scintillationsglas, hvortil sattes 2 ml scintillationsvæske 5 (ScientiVerse 11, Fisher Scientific Co.) før tælning i en scintillationstæller til 3 bestemmelse af H-thymidin-inkorporering.

Koloni-inhiberinasprøve på blød aaar (TGh

Et 0,5 ml basislag af 0,5% agar ("Agar Noble", Difco Laboratories, De* 10 troit, Michigan) i DMEM med indhold af 10% føtalt kalveserum (FCS) sattes til Costar-vævskulturplader med 24 brønde. 0,5 ml 0,3% agar, der indeholdt 3 samme blanding af medium og FCS, 1-2,5x10 A375-celler og forskellige koncentrationer af faktoren, som ønskedes afprøvet, anbragtes oven på agarbasislaget. Pladerne inkuberedes ved 37°C i en befugtet atmosfære af 15 5% COj i luft og tilsattes efter 7 dage atter 0,5 ml 0,3% agar indeholdende samme medium og faktorkoncentrationer. Kolonier optaltes, løsnedes og farvedes, og antallet af kolonier indeholdende mere end 6 celler blev fundet mellem dag 7 og 14.

20 Resultater

Sekvenser af Oncostatin M isoleret fra U937-celler N-terminalsekvensen og indre fragmenter af Oncostatin M betemtes ved hjælp af mikrosekvensanalyse af det reducerede og S-pyridin-ethyierede 25 polypeptid og af peptider, som var opnået ved enzymatisk nedbrydning af reduceret og S-pyridin-ethyleret Oncostatin M med endoproteinase Lys-C og Staphylococcus aureus V8 protease. Peptidfragmenterne oprensedes ved reversfase-HPLC under anvendelse af flygtige opløsningsmidler. Peptiderne underkastedes automatisk repetitiv Edman-nedbrydning i et "Model 30 470A"-proteinsekvensopdelingsapparat (Applied Biosystems, Inc.). Phenyl- thiohydantoinaminosyreme analyseredes ved reversfase-HPLC (Applied Biosystems, Inc.) med en "PTH-C18"-kolonne (2,1x220mm, ABI) under anvendelse af en natriumacetatpuffer/tetrahydrofuran/acetonitrilgradient til elu-ering.

35 De resulterende aminosyresekvenser er i alt væsentligt de i figur 1 af bildede.

16 DK 174094 B1

En sammenligning af disse sekvenser med sekvenser opbevaret i den gældnede proteindatabase (PIR Release 9,0, maj 1986) afslørede ingen signifikante sekvenshomologier med nogen anden kendt sekvens. Hertil kommer, at der ikke er nogen homologi med tumornekrosefaktor, lymfotoxin 5 koloni-stimulerende faktor, interleucin 1 eller 2 eller β-transformerende vækstfaktor.

Inhiberinq af proliferation af tumorceller og forøgelse af proliferation af normale humane fibroblastceller 10 Under anvendelse af det ovenfor beskrevne koloni-inhiberingsforsøg på blød agar opnåedes følgende resultater:

Tabel 1

Inhiberina af A375-melanomaceHe-kolonidannelse i blød agar med oprenset 15 Oncostatin M. der er isoleret fra U937-celler*

GlA-enheder/brønd % Inhiberinq af kolonier Kolonidannelse 250 4 96 83 6 94 20 27 11 89 45 32 69 0 106 25 * A375-celler pladedyrkedes i blød agar med eller uden faktor i et slutvo- lumen på 2 ml som beskrevet ovenfor. Den anvendte faktor stammede fra en Cl8-kolonne-propanolfraktion med maksimal tumorvækst-inhibitorisk aktivitet (GIA). 11 dage senere optaltes antallet af kolonier. En koloni defineredes som en klynge af mindst 6 celler. 1 GlA-enhed defineredes som den 30 mængde, der bevirker 50% inhibering af H-thymidin-inkorporering i A375-celler i mikrobrønde som anført ovenfor.

I forbindelse med næste undersøgelse anvendtes forskellige behandlinger til bestemmelse af virkningen af behandlingen, som enten var af ke-35 misk eller fysisk art, på aktiviteten af det omhandlede polypeptid. Resultaterne er anført i nedenstående tabel.

17 DK 174094 B1

Tabel 2

Virkning af forskellige behandlinger af supernatanter af TPA-inducerede U937-celler på tumorvækst-inhibitorisk aktivitet* 5 Slutfortynding af supernatant 1:4 1:8 1:16

Kontrolmedium ... 39.780

Ubehandlet supernatant 7.206** 13.986 16.000 10 1N eddikesyre 6.670 17.073 18.783 1NNH4OH 6.956 15.016 13.923 * U937-celler behandledes med TPA (10 ng/ml) i 3 dage og derpå vaskedes cellerne med mediet og inkuberedes i 24 timer i serumfrit medium 15 før supernatanterne samledes. Supernatanterne behandledes med 1N ed dikesyre eller 1N ammoniumhydroxid (NH .OH). De dialyseredes så imod ^ 3 mediet og testedes med hensyn til evne til inhibering af H-thymidin-inkor- 3 3 porering i A375-celler. A375-celleme mærkedes med H-thymidin ( H-TdR) i mindst 6 timer under forløbet af en 3-dages inkubation.

3 20 ** De viste data er H-TdR-inkorporering bestemt som tætning per minut.

Det fremgår af de ovenstående resultater, at Oncostatin M i den dialyserede supernatant i alt væsentligt er resistent over for inaktivering med 1N eddikesyre og 1N ammoniumhydroxid. De omhandlede forbindelser er såle-25 des relativt ufølsomme over for både moderat stærk syre og moderat stærk base. Den omhandlede forbindelse er stabil overfor varmebehandling ved 56°C i 1 time, men ikke ved 90°C i 30 minutter.

Den omhandlede forbindelse afprøvedes også med hensyn til varmestabilitet og viste sig at bibeholde sin aktivitet efter udsættelse for 56°C i 1 30 time, men at mist i alt væsentligt hele aktiviteten efter udsættelse for 95°C i 30 minutter.

Endvidere undersøgtes de omhandlede polypeptiders evne til at in-hibere tumorcellereplikation hos forskellige neoplastiske celler. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel.

35 18 DK 174094 B1

Tabel 3

Inhiberinq af replikation af tumorceller med oprenset Oncostatin M fra U937-celler 5 Enheder GIA, der be virker 30% inhibering 3

Tumorceller H-TdR-inkorporerina A549 (lungecancer) 21 HTB10 (neuroblastoma) 81 10 A375 (melanoma) 0,3

Tumorceller pladedyrkedes i mikrobrønde 3 timer forud for tilsætningen af forskellige fortyndinger af Oncostatin M, der var oprenset ved reversfase- HPLC som angivet ovenfor. De sidste 6 timer af en inkubering over 3 dage 3 3 15 mærkedes cellerne i 0,2 ml medium med H-thymidin (H-TdR) (0,5 pCi/brønd). Én enhed tumorvækst-inhibitorisk aktivitet (GIA) er defineret i 3 noten til tabel 1 som den mængde, der bevirker 50% inhibering af H-TdR-inkorporering i A375-melanomaceller. Det påvistes, at én enhed svarede til ca. 10 pg renset protein, og derfor var koncentrationen (ng/ml), som forår- 3 20 sagede 30% inhibering af inkorporering af H-TdR i A549-, HTB10- og A375-celler, hhv. ca. 1,4, 4,0 og 0,015 ng/ml. 3H-TdR-inkorporering i WI26 normale humane fibroblastceller blev ikke undertrykt af U937-faktoren ved noget eksperiment.

Det fremgår af ovenstående resultater, at evnen hos Oncostatin M til at 25 inhibere replikation, er selektiv og at Oncostatin M har stærkt varierende virkning i afhængighed af cellens art. Den omhandlede forbindelse er effektiv over for melanomaceller såsom A375-melanomaceller, pladeepithel-kræftceller såsom A549- og neuroblastomaceller såsom HTB10.

Tumorceller podes i 3 timer på plader indeholdende 96 brønde under 3 3 30 anvendelse af 3 x 10 celler/brønd og for normale fibroblastceller 1,5 x 10 celler/brønd. Forskellige koncentrationer af oprenset Oncostatin, der var op- 3 nået fra C18 -kolonnefraktionen med maksimale antiproliferativ aktivitet 3 over for A375-celler, tilsattes og 3 dage senere maltes H-thymidin-inkorpo-rering i cellerne ved tredobbelte forsøg for hver koncentration. Resultaterne 35 fremgår af tabel 4.

19 DK 174094 B1

Tabel 4

Inhibering af proliferation af tumorceller oa forøgelse af proliferation af normale fibroblastceller med Oncostatin M

5 GIA

enheder/brønd % inhibering % stimulering A375 WI38

Forsøg 1 16 83 25 4 62 30 10 1 46 46 A375 HTB10 WI26

Forsøg 2 27 NT 28 46 9 87 22 36 15 3 76 11 52 A375 A549

Forsøg 3 75 89 30 25 85 22 20 8 71 16 A375 SK-MEL28

Forsøg 4 20 87 44 5 75 25 25 1 59 11

De viste resultater er den procentvise inhibering eller procentvise stimule- 3 ring af H-thymidin-inkorporering i hhv. tumorceller (A375, HTB10, A549 og SK-MEL28) og normale fibroblastceller (WI26 og WI38). Én GlA-enhed er 30 defineret i noten til tabel 1 som den mængde Oncostatin M, der bevirker en 3 50% inhibering af H-thymidin-inkorporering i A375-celler.

3

Ud over den iagttagede forskelsvirkning på H-thymidin-inkorporering i tumorceller og i normale humane fibroblastceller iagttages også som vist i 35 figur 2 en forskelsvirkning på morfologi og celleantal efter behandling i 3 dage af de to celletyper med Oncostatin M.

20 DK 174094 B1

Det anvendte Oncostatin M stammede fra HPLC-C18-koionnefraktionen med maksimal aktivitet med hensyn til inhibering af proliferation af A375-celler. Figur 2 viser en serie af mikrofotografier af A375-melanomaceller, som var ubehandlet (A), behandlet med 5 GIA-enheder (vækstinhibitorisk 5 aktivitetsenheder) Oncostatin Μ (B) eller 100 enheder (C). Desuden vises mikrofotografier af WI38-fibroblastceller, som var ubehandlet (D), behandlet med 5 GIA-enheder (E) eller 100 enheder (F). Cellerne farvedes med krystalviolet i 0,5% methanol. Forstørrelsen er 63 gange.

10 NaDodSO ,/PAGE af Oncostatin M -4—--

Oprenset Oncostatin M udsattes for NaDodSO^-undersøgelse under reducerende betingelser og viste sig at besidde en tilsyneladende molekylvægt på ca. 28 kD, hvilket fremgår af figur 3. Følgende proteiner anvendtes som standarder (spor A): ovalbumin, Mr = 43 kd, kymotrypsinogen a, Mr = 15 25,7 kD, lactoglobulin β, Mr = 18,4 kD, lysozym, Mr = 14,2 kD, kvægtrypsin- inhibitor, Mr = 6,2 kD og insulin A-kæde og B-kæde, hhv. Mr = 2,3 kD og 3,4 kD. Oncostatin M anbragtes i spor B.

Oncostatin M, der udsættes for PAGE-undersøgelse under ikke-redu-cerende betingelser, besidder også en tilsyneladende molekylvægt på 28 20 kD, og protein, der elektroelueredes fra båndet, viste sig at inhibere proliferation af A375-celler.

125

Antistof over for et syntetisk peptid af Oncostatin M reagerer med F mærket Oncostatin M ved radioimmunoloaiske præcipitationer 25 a) Peptidsvntese

Peptidet svarer til resterne 6-19 i Oncostatin M proteinet og syn tetiseredes ved fastfaseteknik på et automatiseret Beckman-instrument som beskrevet i Gentry et al., J. Biol. Chem. (1983) 258:11219. Peptidet spalte-30 des fra harpiksen under anvendelse af "lav-høj" HF-metoden (Tam et al., Jl Amer. Chem. Soc. (1983) 105:6442-6445). Oprensningen udførtes ved hjælp af præparativ HPLC.

b) Fremstilling af antistoffer 35 Peptidet kobledes med kvæg-K-globulin som beskrevet i Gentry og Lawton, Virology (1986) 152:421-431. Hvide New Zealand kaniner injiceredes og modtog booster-injektioner (5 gange) subkutant i 4 områder 21 DK 174094 B1 som beskrevet af Gentry og Lawton, Virology (1986) 152:421-431. Det anvendte antiserum opnåedes 2 uger efter den femte booster-injektion.

c) loderinq af Oncostatin M

5 En prøve af delvist oprenset Oncostatin M radiomærkedes med iod 125 under anvendelse af de af Linsley et al., PNAS (1985) 82:356-360 beskrevne metoder. En alikvot af den mærkede sammensætning, som indeholdt 100.000 cpm, blandedes med kanin-antiserum, som var rettet imod de N-terminale 17 aminosyrer af Oncostatin M (slutfortynding 1:20) i fravær el-10 ler nærvær af N-terminalpeptidet (de N-terminale 17 aminosyrer af Oncostatin M) (2 pg) og underkastedes immunpræcipitationsanalyse som beskrevet af Lindley et al., Biochemistry (1986) 25:2978-2986.

Specielt præ-inkuberedes et glas, som indeholdt 5 pi, med 2 pg af N-terminalpeptidet i 10 ml TNEN (20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM 15 NaCI, 0,05% "Nonidet P-40") indeholdende 0,1% BSA i 30 minutter ved 4°C før tilsætning af I125 Oncostatin M i 85 pi TNEN indeholdende 0,1% BSA og 40 mM dithiothreitol (DTT). Syv glas indeholdende 5 pi antiserum 125 inkuberedes med I Oncostatin M i 85 pi TNEN indeholdende 0,1% BSA og 40 mM DTT i 30 minutter ved 4°C før tilsætning af 50 pi 10% formalin-20 fikseret Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem).

Efter inkubering i yderligere 30 minutter ved 4°C mikrocentrifugeredes glassene og præcipitateme udvaskedes 4 gange med 1 ml TNEN før de underkastedes PAGE-analyse. Et diffust bånd med Mr = 32 kD iagttoges efter. SDS/PAGE-analyse af immunpræcipitaterne. Præcipitation af denne art in-25 hiberedes ved at inkludere et overskud af umærket peptid svarende til de N-terminale 17 aminosyrer af Oncostatin M, hvilket antyder, at præcipitationen var specifik for dette peptid.

Carbohydratsammensætningen af Oncostatin M undersøgtes ved glyco-sidase-sensitivitetstests. Immunpræcipitater, der var fremstillet som under 30 c) ovenfor, behandledes med puffer, endoglycosidase H eller neuraminidase som beskrevet af Linsley et al. (1986). Behandling med endoglycosidase H, som er et enzym med specificitet for N-bundne højmannose-oli-gosaccharider, resulterede i fremkomst af en forbindelse med lavere molekylvægt, Mr = 24 kD. Kun en del af det radiomærkede materiale var følsomt 35 over for dette enzym, hvilket indikeredes, at ikke alle molekyler indeholdt højmannose-oligosaccharider. Behandling med neuraminidase resulterede i fremkomst af et enkelt bånd med Mr = 27 kD, hvilket indikerede, at hetero- DK 174094 B1 125 22 geniciteten med hensyn til størrelsen af ubehandlet l-mærket Oncostatin M skyldtes molekylær heterogenicitet i sialyeringen af glycoproteinkernen.

Resultaterne indikerede, at aktive sammensætninger af Oncostatin M indeholdt en blanding af højmannose- og komplekse N-bundne oligosaccharid-5 sidekæder.

Oncostatin M isoleret fra normale humane perifere blodlvmfocvter (PBL)

Produktion af en tumorcellevækstinhibitor fra PBL 10 Fra blodbanken opnåede leukofraktioner med indhold af PBL fortynd edes 1:1 med phosphatpuffer-indstillet saltvand, pH 7,4 (PBS). 10 ml afen opløsning bestående af 9% "Ficoll" indeholdende 20 voiumen-% 50% na-triumdiatrizoat (endelige specifikke vægtfylde 1,080) anbragtes under 35 ml fortyndet blod. Gradienterne centrifugeredes ved stuetemperatur i 20 minut-15 ter ved 850 x G. Cellerne opsamledes fra gradientgrænsefladen og vaskedes med PBS. Røde blodlegemer chok-lyseredes i 3-4 minutter med 10-20 ml af en opløsning, der indeholdt 0,8% ammoniumchlorid og 0,1% Na^-EDTA.

Celler opsamledes fra lyseringsopløsningen for de røde blodlegemer 20 ved centrifugering ved 600 x G i 10 minutter og de resuspenderedes i 10 ml RPMI-1640 medium (Gibco), som indeholdt 5% føtalt kvægserum. Thrombin tilsattes til opnåelse af en slutkoncentration på 0,5 U/ml. Cellesuspensionen omrystedes i 5 minutter ved 37°C og blodpladeaggregatet fik lov at sætte sig i 5 minutter. De suspenderede celler overførtes til nye glas, gen-25 vandtes ved centrifugering, resuspenderedes i 1 ml føtalt kvægserum og overførtes til en kolonne, som indeholdt 0,5 g børstet, forud befugtet nylonuld, type 200 (Fenwal).

Nylonuldkolonnen inkuberedes ved 37°C i 60 minutter for at tillade fæstnelse af monocyter og B-lymfocyter. Kolonnen vaskedes så med 3 vol.

30 RPMI-1640 medium (37°C), der indeholdt 5% føtalt kvægserum, og de eluerede ikke-fæstnede celler (PBL) opsamledes.

PBL (2x10® celler/m!) dyrkedes ved 37°C og under anvendelse af 5% C02-95% luft i 96 timer i RPMI-1640 medium (10,4 g/l), som indeholdt FeS04.7H20 (1 mg/l), ZnS04.7H20 (2 mg/l), Na2SeC>3.5H20 (0,017 35 mg/l), 1 -aminoethanol (1 mg/l), humant transferrin (5 mg/l), kvægserumal-bumin-linoliesyrekonjugat (Sigma) (200 mg/l), L-glutamin (300 mg/l), penicil-lin/streptomycin (100.000 enheder/l) og fytohæmagglutinin-PXWellcome) (2 23 DK 174094 B1 mg/l). Supematanteme opsamledes, centrifugeredes til fjernelse af cellerne, koncentreredes ved ultrafiltrering ("Amicon Diaflo YM-10"-membran med 10 Kd afskæring) og dialyseredes imod 0,1 M eddieksyre ("Spectrapore 3"-dia-lyserørsystem). Det klarede retentat lyofiliseredes.

5

Gelpermeerinaskromatoqrafi

Den rå fraktion rekonstitueredes i 20 ml 1 M eddikesyre (50 mg/ml) og indførtes på en "BioGel P-100"-kolonne (2,6 x 88 cm), som var ækvilibreret med 1 M eddikesyre, ved en flow-hastighed på 0,5 ml/minut. Der opsamle-10 des 12 ml fraktioner. En alikvot fra hver fraktion inddampedes og der udførtes en tredobbelt afprøvning for vækstinhibitorisk aktivitet (GIA) på A375-celler. De aktive fraktioner forenedes, lyofiliseredes og rekromatograferedes på en "Bio-Sil TSK-250"-kolonne (600 x 21,5 mm) som beskrevet.

15 Reversfasehøjtrykskromatoorafi af TSK-250 fraktioner

Den endelige oprensning af forenede TSK-250 fraktioner opnåedes i alt væsentligt som beskrevet ved reversfase-HPLC. Den PBL-tumorcellein-hibitor eluerede fra "p-Bondapak-C18"-kolonnen ved en acetonitrilkon-centration på 40-41% og en n-propanolkoncentration på 36,5%.

20 125

Cellevækstmodulatorisk prøve under anvendelse af l-iod-deoxvuridin-in-korporerinq i DNA (GlAj

Disse prøver udførtes i fladbundede vævsdyrkningsbakker (Costar 3596) med 96 brønde. Humane melanomaceller, A375 (4 x 10 ), i 50 μΙ 25 testprøven sattes til hver brønd og inkuberedes i 3 dage ved 37°C. Cellerne 125 mærkedes i 24 timer med l-ldU (0,05 pCi/brønd) og inkuberedes yderligere 24 timer. Cellerne vaskedes 3 gange, høstedes med et flerdobbelt høstapparat og radioaktiviteten bestemtes ved hjælp af en gammatæller.

30 Resultater

En PBL-afledt tumorcelle-inhibitorsammensætning underkastedes automatiseret repetitiv Edman-nedbrydning. N-terminalaminosyresekvensen er følgende: 24 DK 174094 B1 X betegner en aminosyre, som ikke er blevet identificeret.

En sammenligning af denne sekvens med U937-faktorsekvensen indi-5 kerer tydeligt identiteten med N-terminaldelen af den PBL-afledte faktor.

PBL-faktor U937-faktor 10

Evnen af PBL-afledt Oncostatin M til at påvirke replikation af et antal forskellige celler undersøgtes dernæst. Det viste sig, at L929-museceller var ufølsomme over for PBL-afledt Oncostatin M ved anvendelse af op til 1.000 GIA-enheder/ml. Humane fibroplastceller, WI26, vækst-stimuleredes ved 15 behandling med 1.000 GIA-enheder/ml. Normal human T-lymfocyt- proliferation 72 timer efter mitogenese påvirkedes ikke af op til 500 GIA-enheder/ml.

Det fremgår tydeligt af ovenstående resultater, at der er tilvejebragt et hidtil ukendt polypeptid og ukendte polypeptidfragmenter, som kan anvend-20 es til modulation af cellulær vækst. Forbindelsen viste sig at besidde forskellig aktivitet i afhængighed af den involverede cellelinies art, således at den kan anvendes alene eller sammen med andre forbindelser til modulation af cellulær vækst. De omhandlede peptider kan derfor anvendes med blandinger af celler både in vivo og in vitro til selektivt at reducere eller 25 forøge cellulær proliferation af en særlig type celler.

Især kan faktoren anvendes til at behandle celler med henblik på autolog knoglemarvtransplantation. Anvendelse af faktoren inhiberer væksten af tumorceller i marven og kan stimulere kolonicetledannelse. Oncostatin M kan også anvendes til at stimulere væksten af epithelceller og dermed frem-30 me sårheling. Desuden kan det intakte polypeptid eller fragmenter deraf anvendes som immunogener til induktion af antistofdannelse. De inducerede antistoffer kan anvendes til styrkebestemmelse af Oncostatin M, som er til stede i en legemsvæske eller til at modulere aktiviteten af faktoren ved at bindes dertil. Ydermere tjener disse antistoffer sammen med renset Onco-35 statin M eller fragmenter deraf som bestanddele i et diagnostisk sæt sammen med andre reagenser, især antistoffer til påvisning og mængdebestemmelse af Oncostatin M.

Claims (52)

1. Polypeptid indeholdende mindst 8 aminosyrer, hvilket polypeptid er im- 5 munologisk kryds-reaktivt med en forbindelse, hvilken forbindelse i) er Oncostatin M eller et derivat deraf, som kan opnås fra leukocyt- ter, 10 ii) er i stand til at inhibere proliferation af neoplastiske celler, iii) stimulerer proliferation af normale humane fibroblastceller, iv) ikke inhiberer humane proliferative og cytotoksiske T-cellereak- 15 tioner, v) ikke inhiberer granulocytisk/myelocytisk knoglemarvscelle-kolo-nidannelse, 20 vi) besidder en molekylvægt i intervallet på fra ca. 17 til 19 kD, for trinsvis ca. 18 kD, ifølge bestemmelse ved størrelsesudelukkelseskromatografi, og en molvægt på ca. 28 kD ifølge bestemmelse ved SDS-PAGE, og 25 vii) er forholdsvis ufølsomt over for moderat sure og basiske betingelser såsom henholdsvis 1 N eddikesyre og 1 N ammoniumhydroxid, og viii)er forholdsvis ufølsomt over for moderat forhøjede temperaturer såsom 56°C i 1 time. 30

2. Polypeptid ifølge krav 1 indeholdende mindst 10 aminosyrer, der svarer til en aminosyresekvens som afbildet i figur 1, og som afviger fra denne sekvens med ikke mere end 3 aminosyrer,

3. Polypeptid ifølge krav 2, som afviger fra en aminosyresekvens som af bildet i figur 1 med ikke mere end 1 aminosyrer. DK 174094 B1

4. Polypeptid ifølge krav 1 indeholdende mindst 12 aminosyrer, der svarer til en aminosyresekvens, som er afbildet i figur 1, og som afviger fra denne sekvens med ikke mere end 1 aminosyre, hvilken afvigelse enten er en udeladelse eller en konservativ substitution. 5

5. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, der i det væsentlige er fri for cellerester og andre leukocytiske proteiner.

6. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, der er et isoleret 10 polypeptid.

7. Polypeptid ifølge krav 5 eller 6 som er Oncostatin M.

8. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7 med en specifik 15 aktivitet på mindst ca. 100 GIA-enheder/ng protein.

9. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8 til anvendelse som et lægemiddel. 20

10.Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8 til anvendelse ved fremstilling af et lægemiddel til modulation af cellevækst eller immunfunktioner.

11 .Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 10, som er opnået 25 fra konditionerede medier valgt blandt gruppen bestående af stimulerede normale humane perifere blodlymfocytter og stimulerede humane histiocy-tiske lymfomaceller, fortrinsvis U937 celler.

12. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 10, som er in vitro 30 syntetiseret.

13. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 10, som er opnået fra en vært omfattende en DNA-sekvens kodende for polypeptidet, hvilken vært er en heterolog vært for den pågældende DNA-sekvens. 35

14. Polypeptidsammensætning omfattende et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 og en farmaceutisk acceptabel bærer. DK 174094 B1

15.Polypeptidsammensætning ifølge krav 14, hvilken sammensætning udviser en specifik aktivitet på mere end 10 GIA enheder/ng protein. 5

16.Antistof som er specifikt over for et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13.

17. Monoklonalt antistof, som er specifikt over for et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13. 10

18. DNA-sekvens kodende for et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13.

19. Diagnostisk sæt omfattende et antistof ifølge krav 16 eller 17 og mindst 15 ét polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller mindst én polypeptidsammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15.

20. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anven- 20 delse ved en fremgangsmåde til modulation af cellevækst eller immunfunktioner.

21 .Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anven-25 delse ved en fremgangsmåde til inhibering af proliferationen af neoplastiske celler.

22. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anven- 30 delse ved en fremgangsmåde til stimulering af proliferationen af normale humane fibroblastceller.

23. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anven- 35 delse ved en fremgangsmåde til diagnosticering og/eller behandling af cancer. DK 174094 B1

24.Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptid-sammensaetning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anvendelse ved en fremgangsmåde til sårheling. 5

25.Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptid-sammensaetning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af patienter med immunmangler. 10

26.Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptid-sammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af autoimmunitet.

27. Po!ypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptid-15 sammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 tiM 5 til anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af organtransplantater.

28. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptid-sammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anven- 20 delse ved en fremgangsmåde til eliminering af maligne celler fra marv til autologe marvtransplantater.

29. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptid-sammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 til anven- 25 delse ved en fremgangsmåde til inhibering af proliferation eller eliminering af maligne celler i væv, fortrinsvis blod, før reinfusion.

30. Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 30 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til modulation af cellevækst eller immunfunktioner.

31. Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 35 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til inhibering af proliferationen af neoplastiske celler. DK 174094 B1

32. Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til stimulering af proliferationen af normale humane fibroblastceller. 5

33. Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til diagnosticering og/eller behandling af cancer. 10

34. Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til sårheling. 15

35.Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til behandling af patienter med immunmangler. 20

36.Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til behandling af autoimmunitet.

37. Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 25 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til behandling af organtransplantater.

38. Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 30 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til eliminering af maligne celler fra marv til autologe marvtransplantater.

39. Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 35 til 15 ved fremstilling af et lægemiddel til inhibering af proliferation eller til eliminering af maligne celler i væv, fortrinsvis blod, før reinfusion. DK 174094 B1

40.Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 tiM 3 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 i en fremgangsmåde til in vitro-modulation af cellevækst eller immunfunktioner. 5

41 .Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15 i en fremgangsmåde til in vitro-stimulering af proliferationen af normale humane fibroblastceller, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man bringer 10 cellerne i kontakt med en proliferationsstimulerende mængde af polypeptidet.

42.Anvendelse af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 15 til 15 i en fremgangsmåde til fremstilling af et antistof, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man i) anvender polypeptidet som et immunogen og injicerer dette i en pattedyrsvært, fortrinsvis sammen med et adjuvans, 20 ii) tapper værten for blod efter et passende tidsrum, og iii) isolerer antistoffet indeholdt i blodet. 25

43.Anvendelse ifølge krav 42, hvori værten er en mus, fra hvilken perifere blodlymfocytter og/eller miltlymfocytter kan isoleres og anvendes til sammensmeltning med en passende myelomacelle til monoklonal ekspression af antistof, der er specifikt rettet mod polypeptidet. 30

44.Fremgangsmåde til påvisning af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller en polypeptidsammensætning ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15, hvilken fremgangsmåde omfatter de trin, at man i) kombinerer en prøve, der er mistænkt for at indeholde nævnte polypep-35 tid eller polypeptidsammensætning, med et antistof ifølge krav 16 eller 17, og DK 174094 B1 ii) bestemmer omfanget af kompleksdannelse med nævnte antistof.

45. Fremgangsmåde til in vitro-inhibering af proliferationen af neoplastiske celler, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man bringer cellerne i kontakt 5 med en proliferationsinhiberende mængde af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15.

46. Fremgangsmåde til in vitro-eliminering af maligne celler fra marv til auto-10 loge marvtransplantater, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man bringer cellerne i kontakt med en farmaceutisk effektiv mængde af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15. 15

47. Fremgangsmåde til in vitro-diagnosticering af cancerceller i en prøve, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man bringer cancerceller i kontakt med en diagnostisk og/eller farmaceutisk effektiv mængde af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen 20 ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15.

48. Fremgangsmåde til in vitro-eliminering af maligne celler i væv, fortrinsvis blod, før reinfusion, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man bringer de maligne celler i kontakt med en diagnostisk og/eller farmaceutisk effektiv 25 mængde af polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13 eller polypeptidsammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 15.

49. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13, hvilken fremgangsmåde omfatter de trin, at man 30 i) dyrker en cellekultur, der indeholder celler med en ekspressionsopbygning, der omfatter en DNA-sekvens, som koder for polypeptidet, hvilken DNA-sekvens er under kontrol af transkriptions- og translationsregulerende signaler, som fungerer i cellerne, på en sådan måde, at polypeptidet dan- 35 nes ved ekspression, og ii) isolerer polypeptidet. DK 174094 B1

50.Fremgangsmåde ifølge krav 49, hvor de transkriptions- og translations-regulerende signaler medierer regulationsinduktion. 5

51 .Fremgangsmåde ifølge krav 49, hvor ekspressionsopbygningen, der om fatter en DNA-sekvens, som koder for polypeptidet, på opstrømssiden af DNA-sekvensen omfatter en signalsekvens i læseramme med det strukturelle gen, hvilken signalsekvens koder for en sekretionsleder, der medierer sekretion og tilvejebringer det udviklede polypeptid i supernatanten. 10

52.Fremgangsmåde ifølge krav 49, hvor polypeptidet er isoleret på en form, som i alt væsentligt ikke indeholder cellulært materiale. 15