KR920005920B1

KR920005920B1 - 신규세포 생장조절 인자

Info

Publication number: KR920005920B1
Application number: KR1019860010968A
Authority: KR
Inventors: 엠. 자알링 조이스; 쇼야브 모하메드; 마르쿠아르트 한스; 비. 한슨 마시아; 엔. 리오우빈 마리오; 요셉 브라운 토마스
Original assignee: 온코겐, 어 리미티드 파트너쉽; 원본미기재
Priority date: 1985-12-20
Filing date: 1986-12-19
Publication date: 1992-07-24
Also published as: FR2597108A1; FR2597108B1; CH675727A5; GR862936B; AT400444B; DE3645095C2; DE3643428A1; SE8605459L; IL81017A0; CN1017626B; DK174094B1; CA1340296C; FI865156A; FI865156A0; DK615386A; NL8603209A; AU639048B2; HU210694B; NZ218634A; GB8629997D0

Abstract

내용 없음.

Description

신규세포 생장조절 인자

제1도는 온코스타틴 M(0ncostatin M) 단편의 아미노산 배열임.

제2도는 온코스타틴 M으로 처리된 세포의 일련의 현미경 사진으로서, 여기서 (A-C)는 각각 0,5 및100 GIA 단위로 처리된 A375흑종세포이며, (D-F)는 각각 0,5 및 100GIA 단위로 처리된 WI38섬유 아세포임.

제3도는 온코스타틴 M의 SDS-PAGE분석 사진임.

백혈구, 즉 임파구와 단핵세포 모두는 여러가지 종류의 동물 종양에서 종양의 생장을 억제하는데 관련되어 있다. 면역 무방비 상태의 인체에 있어서 악성종양의 발병률이 증가한다는 것은 백혈구가 종양의 생장을 조절하는 역할을 하고 있다는 주장을 입증해주고 있다. 종양생장을 억제하거나 면역기능을 조절하는 이들 백혈구에 의해서 생산되고 이미 단리시켜 특성이 규정되어 있는 단백질 인자들로는 인터페론(α- 및 γ-),종앙 네크로시스(necrosis) 인자, 임파성독소, 인터류킨-2(interleukin-2) 및 기타 람포카인 등이 있다. 단리된 각 인자들이 상이한 활성 스팩트럼을 갖고 있고 기타 인자들과 연합하여 상이한 작용을 할 수 있으므로 세포의 생장 또는 면역기능을 조절하는데 있어서 백혈구가 생산하는 모든 인자를 단리시켜 특성을 규명하는 것은 지속적이고도 강한 관심사가 되어 왔다. 이들 화합물은 단독으로 또는 배합되어 암을 치료 또는 진단하는데 있어서, 상처의 치료촉진제 또는 면역결핍증, 자기면역성, 기관이식 둥과 같은 증상을 가진 환자를 치료하는데 면역 조절제로서 사용될 수 있다는 사실이 발견되었다.

자연적으로 발생하는 인자들을 발견, 단리, 정제하거나 특성을 규명하는데에는 여러가지 어려움에 부닥치게 된다. 요망되는 인자의 활성을 변성시키지 않고 조질의 출발물질중의 기타 인자들로부터 목적하는 인자를 분리 및 정제하는 방법들이 개발되어야만 한다. 즉, 특정인자를 농축하는 분리과정중 유분을 확인할 수있는 생물학적 정량분석법이 개발되어야만 하고 : 이미 공지이거나 또는 존재할지도 모르고 좋게 또는 나쁘게 영향을 끼칠 수 있는 기타 공지되지 않은 인자들로부터 신규의 인자를 분리하여 그 활성을 규명하여 정제된 인자를 특징화시키고 : 정제된 인자를 확인하여 특성을 규명하는데 충분한 양으로 농축시켜야만 한다. 그러므로 단리된 인자들의 수가 증가함에 따라 각각의 새로운 인자는 더욱 동정하기 어려워지는데, 이는 수많은 다른 인자들에 의해 그의 역할과 기능이 모호해질 수 있기 때문이다.

본 발명과 관련된 종래의 기술에 대한 에를들면 Cancer Biochem. Biophys.(1979)3 : 93-96에서 빌(Beal)외 공동 발표자는 정상의 세포에서 보다 변형된 세포에서 더 많이 생장 및 DNA합성을 억제하는 펩티드가 사람의 소변중에 존재한다고 보고하였다. Proc. Natl.Acad. Sci.(1980)77 : 5989-5992에서 홀리(Holley)외 공동연구자는 상피세포 생장 억제제를 정제하는 방법에 대하여 기술하였다. Biosci. Rep.(1982)2 : 39-45에 레탄스키(Letansky)외 공동발표자는 소의 태반으로부터 정제된 펩티드가 보통세포에서 보다종양에서 더 크게 종양의 성장 및 DNA에 있어서 티미딘 결합을 억제한다고 보고하였다. Trends Biochem. Sci.(1982)7 : 364-365에 첸(Chen)은 복수액(腹水液)으로부터 암 억제 성질을 가진 펩티드를 단리시키는 방법을 보고하였다. Proc. Natl. Acad. Sci. (1982)79 : 7014-7018에 레딩(Redding)과 샬리(Schally)는 여러가지 일반세포 계열과 종양세포 계열에 대한 항유사분열 생식작용을 갖고, 돼지의 시상하부로부터 정제된 펩티드에 대하여 보고하였다. Gann(1984)75 : 920-928에 손(Sone)외 공동발표자는 생체외에서 어떤 종양세포의 생장을 억제하는 인체의 대식세포에 의해서 생산되는 인자들을 생산하는 방법에 대하여 보고하였다. Cancer Res.(1985)45 : 851-862에 랜섬(Ransom)외 공동연구자는 어떤 종양세포 계열의 복제를 저해하고 임파성독소, 인터페론 및 인터류킨 1 및 2와도 다른 것으로 나타난 류코레귤린(leukoregulin)이라 불리어지는 인자를 단리시키는 방법에 대하여 보고하였다. 이들 인자의 대부분은 완전한 특성이 규정되어있지 않을 뿐만 아니라 기본구조도 알려져 있지 않다.

J.Biol.Chem.(1984)259 : 686-691에 아가왈(Aggarwal)외 공동연구자는 임파아구중 세포계열에 의해 생산된 인체의 임파성독소(LT)를 정제하여 특성을 규정하였고 이어서 LT의 유전자 배열을 확인하였다[Aggawal외 J.Biol.Chem.(l985) 260 : 2334참조]. 임파양 세포에 의해서 생산되고 면역조절 작용과 종양억제작용을 가진 감마 인터페론(λ-1F)이 무성생식되어 발현된 바 있다[Gary외 Nature(1982) 295 : 503 : 508참조]. 몇몇 종양의 성장을 억제하고 대식세포에 의해서 생산되는 종양 네크로시스 인자(TNF)와 어떤백혈병 세포 계열은 특성이 규정되어 있으며 TNFcDNA를 클로닝시켜 E.coli중에서 발현시킨바 있다[Pennica의 Nature(1984)312 : 724참조].

본 발명은 백혈구로부터 얻을 수 있는 신규의 펩티드 인자와 생물학적으로 활성인 그 단편을 제공한다.이 인자는 종양의 세포성장을 억제하고 정상의 섬유아세포의 성장을 촉진시키는 둥의 세포의 성장을 조절하는데 사용되며 면역기능을 조절할 수 있다. 이 인자는 유사한 성질을 갖은 것으로 보고된 기타 화합물의 배열과 분명히 다른 아미노산 배열을 갖는다.

본 발명은 신규의 폴리펩티드, 폴리펩티드 조성물, 폴리펩티드 단편 및 돌연변이체, 이들의 제조방법 및 용도를 제공하며, 또한 세포의 생장을 조절하는, 특히 종양세포의 생장을 억제하고 보통의 섬유아세포의 성장을 촉진시키는 작용을 하는 조성물을 제공한다. 온코스타틴 M(Oncostatin M)이라 불리어지는 주제의 폴리펩티드는 백혈구, 예컨대 활성화된 U937세포의 조정 배지 또는 활성화된 정상인의 혈액임파구(PBL)의 조정 배지로부터 얻을 수 있다. 또한 본 발명은 세포생장 조절작용 또는 면역학적 활성과 같은 본래의 온코스타틴 M의 생물학적 활성을 가진 이 폴리펩티드의 단편 및 돌연변이체도 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드 단편은 자연적으로 생성되는 온코스타틴 M과 적어도 면역학적으로 교차반응을 한다는 점에서 생물학적으로 활성인 최소한 8개의 아미노산을 가진 신규의 폴리펩티드이다. 면역학적 교차반응이란 본 발명의 신규 폴리펩티드에 의해서 유도되는 항체가 적어도 온코스타틴 M이 변성상태에 있을때 본래의 온코스타틴 M과 교차면역 반응하리라는 것을 의미한다. 그러므로 이들 폴리펩티드는 체액중의 온코스타틴 M의 농도를 측정하고, 온코스타틴 M과 결합하여 그의 활성을 조절하며, 친화 컬럼에서 사용됨으로써, 온코스타틴 M을 정제하는데 사용될 수 있는, 온코스타틴 M에 대한 항체를 유도하는데 유용하다. 또한 이 폴리펩티드의 일부분은 본래의 온코스타틴 M과 비교할때 그 활성이 변형, 즉 대개는 감소되기는 하지만 본래의 온코스타틴 M의 세포의 생장조절 활성을 유지할 수 있다.

제1도는 온코스타틴 M과 교차면역 반응하는 폴리펩티드의 아미노산 배열로서 첫번째 배열은 온코스타틴M의 N-말단부이다.

본 발명의 폴리펩티드들은 제1도에 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 최소한 8개의 연속 아미노산을 가지며 상기 제1도의 배열과는 기껏해야 3개, 대개는 1개의 아미노산만이 상이할 뿐이다. 이 차이점은 아미노산의 삽입, 아미노산의 결실 또는 다른 아미노산에 의한 치환, 특히 보존적 치환에 의할 수 있다. 통상적으로 이 폴리펩티드는 최소한 10개 이상, 통상적으로는 최소한 12개 이상의, 도면에 나타낸 배열예 해당하며 기껏해야 하나의 아미노산만이 차이가 나는 연속적인 아미노산을 함유할 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 여러가지 아미노산을 다음과 같이 몇가지 군으로 분류한다.

지방족

중성

비 극 성 GAPVLI

극성 STCMNQ

산성 DE

염 기 성 KR

방 향 족 FHYW

보존적 치환이란 같은 군으로 분류된 아미노산(즉, 중성 지방족, 산성 지방족, 염기성 지방족 또는 방향족 아미노산), 특히 같은 극성을 가진 것끼리 서로 치환되는 것을 의미한다. 바람직하게는 2-4개의 탄소원자를 가진 또는 5 내지 6개의 탄소원자를 가진 아미노산을 지방족 군에 있어서 단량체군으로 정의할 것이다.

이 폴리펩티드는 그 길이가 약 1000개의 아미노산을 초과하지 아니한다. 통상적으로, 이들은 아미노산을 100개 이하, 특히 50개 이하를 갖는다. 그래서 이 폴리펩티드는 쉽게 합성할 수 있다. 일반적으로 폴리펩티드의 길이가 100개의 아미노산을 초과할 경우에는 이들 폴리펩티드는 각각 100개 미만의 아미노산을 갖는 온코스타틴 M의 단편의 중합체이거나 또는 그 단편이 항원, 효소, 효소단편등으로 융합되는 융합 단백질일수 있다. 특히 고분자량의 폴리펩티드는 면역원 특성을 제공하기 위하여 큰 면역원의 폴리펩티드 담체와 공유결합된 약 100개 미만의 아미노산을 가진 최소한 1개 이상의 폴리펩티드 단편일 수 있다. 이러한 단백질 담체의 예를들면 소의 혈청 알부민, 키홀림펫 헤모시아닌(KLH)등과 같은 것이 있다. 이와 같은 결합 폴리펩티드는 적당한 숙주체내에서 항체를 유도하는데 사용될 수 있을 것이다.

U937세포는 여러가지 약제로 처리함으로써 대식세포의 특성을 갖는 세포로 분류하기 위하여 유도될 수있는 [Harris 외 Cancer Res.(1985)45 : 9-13]조직구 임파종 세포계열[Sundstrom and Nilsson, Int. J. Cancer(1976)17 : 565-577참조]로부터 유도된 세포계열이다. 온코스타틴 M을 제조하기 위하여 U937세포를 혈청으로 공지의 영양배지 내에서 생장시켜 적당한 유도질로써 처리할 수 있다. 편리하게는 포르볼(phorbol) 또는 인제놀(ingenol)을 사용할 수 있는데 특히 12-O-테트라데카노일 포르볼-13-아세데이트(TPA)가 좋다. 통상적으로 유도질 약 5-20ng/ml정도를 사용할 수 있다. 최초의 세포수는 약 10⁵-10⁶세포/ml이다.

세포를 충분한 시간, 일반적으로 3-6일 동안 유도질로써 처리한 다음 상징액을 제거하고, 이 세포를 혈청을 제거한 영양배지로써 씻어내고 부착된 세포는 다시 혈청을 제거한 영양배지로써 씻어낸 다음 세포는 혈청을 제거한 영양배지, 예컨대, RPML-1640배지중에서 최소한 12시간 이상, 통상 약 48시간을 초과하지 않는 시간 동안 항온기에 보관해 둔다. 그후 상징액을 수집하고 세포를 원심분리시켜 제거하였다. 세포를 제거한 상징액은 실험계획에 언급된 바와 같이 세포 생장 억제작용(GIA)에 대하여 시험하였다. 상징액에는 약 50-500GIA단위/ml가 함유되어 있다(GIA단위의 정의에 대한 실험참조).

또한 온코스타틴 M은 유사분열물질(mitogen)로 자극된 정상의 인체 말초혈액 임파구(PBL)으로부터도 얻을 수 있다. PBL은 백혈구 유분을 희석시켜 이들을 피콜 그레디언트(Ficoll gradient)상에서 원심분리시킴으로써 백혈구 유분으로부터 단리시킬 수 있다. 이 그레디언트 경계면에서 수집된 세포를 세척하고 적혈구를 제거시키기 위하여 충격 용해시켰다. 잔유 세포들은 그 용액을 원심분리시켜 수집하여 혈청과 트롬빈을 함유하는 완충액에 재현탁시킨 다음 교반하고 혈소판 덩어리는 단기간 안치시켰다. 현탁한 세포를 이송시켜 원심분리에 의해서 회수하고 혈청내에 재현탁시킨 다음 나일론 섬유가 들어있는 칼럼에 이송시켰다. 이 칼럼을 단핵세포와 B-임파구가 부착되도록 항온기에 넣은 다음 세척하였다. 대부분의 말초혈액 T임파구는 접착되지 아니하고 칼럼으로부터 용출된다. 이들 세포를 배지 예컨대, RPMI-1640 배지중에 37℃에서 배양하였으며 약 100시간 동안 적당한 유도질, 예컨대, 식물성 혈구응집소(약 1-5mg/l)로써 처리하여 상징액을 수집하였다. 상징액을 원심분리시켜 세포를 제거하고 한외여과 또는 투석에 의해서 농축시켰다.

U937세포 또는 보통 PBL로부터의 무세포 상징액을 단리시킨 후 조정 배지를 공동섬유기구 또는 한외 여과막을 사용하여 농축시킨 다음 초산으로 희석하여(0.1N초산 농도로) 약 10배로 농축시켜 희석 및 농축조작을 반복하였다. 농축물을 동결건조시켜 직접 사용하거나 동결 건조시킨 생성물은 더 정제시키기 위하여 사용될 수 있다.

주제의 온코스타틴 M은 각 유분에 대한 활성을 기록하는 바이오-실(Bio-sil)TSK250 칼럼상에 동일 유동상으로서 수성 40% 아세토니트릴-0.1% 트리플로오로아세트산을 사용하여 겔 침투 크로마토그래피법에 의해서 정제할 수 있다. 정제에 의해 활성유분중에 최소한 0.5-5×10⁴GIA 단위/ml을 포함하는 조성물이 제공된다.

겔 침투 크로마토그래피로부터 부분 정제된 생성물은 선상 그레디언트를 이용한 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의해서 더욱 정제할 수 있으며 여기서 일차용매는 물중의 0.1% 트리플루오로아세토산이며 이차용매는 0.1% 트리플루오로 아세토산을 함유하는 아세토니트릴이다. 이 스케쥴은 다양하게 변화시킬 수 있으며 일반적으로 이차용매의 30-45% 범위내에서 약 3-4시간을 요구하는 크로마로그래피를 실시하여 대부분의 시간이 상기 시간의 50%를 초과하며 약 80% 이상을 초과하지 않는다. 이러한 조건하에서 활성유분은 약 41-42%아세토니트릴에 용출한다.

구배 조건을 더 급격히 변화시키고 유속은 감소시켜, 역상 HPLC로 반복함으로써 수집된 활성 유분을 더욱 정제할 수 있다. 이러한 조건하에서 약 40.5-41.5% 아세토니트릴에서 활성이 나타난다.

역상 HPLC는 이차용매가 n-프로판올-0.1% 트리플루오로아세토산인 용매계를 변화시켜 반복 실시할수 있다. 선형구배가 이용되며 여기서 구배를 23-35% n-프로판올 범위에서 서서히 변화시킨다. 주요 활성도는 25.5-27.5% 프로판올 범위에서 관찰되며, 이는 비활성이 10 GIA단위/ng단백질보다 큰 실제로 균일한 생성물을 내는 것이다. 통상적으로 생성물을 정제하여 최소한 약 100 GIA 단위/ng단백질 특히, 150GIA 단위/ng의 비활성을 제공한다.

주제의 화합물은 사이즈 배제(size exclusion)크로마토그래피에 의해서 측정할 때 약 17-19킬로달톤(KD), 특히 약 18KD의 분자량을 가진 것을 특징으로 한다. 또한 주제의 화합물은 환원 또는 비환원 조건하에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해서 측정할때 약 28KD의 겉보기 분자량을 가진 것을 특징으로 한다.

정제된 온코스타틴 M단편의 아미노산 배열을 분석하였다. 온코스타틴은 실질적으로 제1도에 나타낸 아미노산 배열을 갖는다. 제1도를 참고하면 제1배열은 온코스타틴 M의 N-말단기를 예시한 것인 반면에 잔유배열은 이 폴리펩티드의 내부단편을 예시한 것이다.

단리된 온코스타틴 M의 활성제제는 고농도의 만노즈와 복합 N-결합 올리고 삭카라이드의 혼합물을 함유한다. 그러나 온코스타틴 M의 비글리코실화 제제는 세포생장 조절활성을 유지하였다.

또한 온코스타틴 M은 어떤 세포균주에 대한 활성을 갖은 것을 특징으로 한다. 주제의 폴리펩티드는WI26 및 WI38 인체 섬유아세포, 종양 네크로시스 인자에 예민한 새앙쥐 L929세포와 λ-인터페론 예민성인체 종양세포 계열에 대한 세포독소 활성이 없다. 또한 정상적인 인체 T-임파구의 증식을 억제하지 않고 100GIA단위/ml까지의 농도로는 골수세포로부터의 과립구/골수구 집락 형성을 억제하지 않는다는 것이 발견되었다. 더우기 온코스타틴 M은 WI38과 WI26세포로 예시된 바와 같이 정상인의 섬유아세포의 증식을 촉진시키머 A375, HBT10, A549 및 SK-MEL28과 같은 종양세포의 증식을 억제하고 정상의 골수로부터 집락 형성세포의 생장을 증진시킬 수 있다. 온코스타딘 M은 500 GIA 단위/ml의 농도로 혼합된 백혈구 배양반응(MLC)에서의 인체증식 또는 세포독소 T 세포반응을 억제시키지 않았다.

주제의 폴리펩티드는 보통의 산과 염기에 안전하고 56℃의 열처리에도 안전하다는 것이 발견되었다.

주제의 폴리펩티드의 아미노산 배열은 시판되는 시퀸서를 사용하여 완전히 동정할 수 있다. 그러므로 이 폴리펩티드는 역시 시판되는 자동합성기를 이용하여 공지기술로 합성할 수 있다.

다른한편, 주제의 폴리펩티드는 재조합 DNA기술에 의해서 제조할 수 있다. 부분적인 아미노산 배열로부터 프로브를 추론할 수 있으며, 이것은 인체의 게놈라이브러리(genomic library)를 선별하는데 이용될 수있다. 이 라이브러리는 cDNA라이브러리 또는 염색체 라이브러리일 수 있다. 일단 클론(들)이 프로브에 어닐링한 것으로 동정되면 목적하는 유전자를 함유하는 단편은 여러가지 방법으로 확인될 수 있으며, 또한 여러가지 방럼으로 조작될 수 있다. 엔도뉴클레아제에 의해 이 단편의 크기를 줄여, 결과된 단편을 클론시켜 목적하는 유전자 존재를 확인하는데 사용한다. 필요한 펩티드를 생산하거나 많은 량의 필요한 펩티드를 생산하는 세포는 메신저 RNA를 생산하는데 사용될 수 있다. 메신저 RNA로부터 단일가닥 cDNA를 제조할수 있다. 다음 이 cDNA는 폴리펩티드를 거의 생산하지 않는 세포로부터의 전체 메신저 RNA에 어닐링시킬 수 있다. 어닐링되지 않은 cDNA는 단리시켜 ds cDNA를 제조하는데 사용할 수 있으며 이것은 프로브로써 선별할 수 있다.

별법으로, DNA단편은 암호화 단편이 β-갈락토시다아제 유전자로부터 하류부분이고 그 골격내에서 있을 수 있도록 λgtll내에 삽입시킬 수 있다. 온코스타틴 M폴리펩티드에 대한 항체를 제조할 수 있으며 이를 교차면역반응을 위한 융합된 단백질을 선별하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 방법으로 주제의 폴리펩티드 또는 그 단편을 암호화하는 단편을 동정하여 목적하는 유전자를 확인하는데 사용할 수 있다.

완전한 유전자가 cDNA 또는 염색체 DNA로서 확인되면 여러가지 방법으로 이를 조작하여 발현시킬 수있다. 온코스타틴 M의 야생형 전사 및 번역 조절영역을 인식하는 숙주내에서 이 유전자를 발현시키고자 하는 경우, 그 야생형 5'- 및 3'조절부를 가진 전체 유전자를 적당한 발현벡터로 도입할 수 있다. 시미안 바이러스 40, 아데노 바이러스, 소의 유두종 바이러스, 우두 바이러스, 곤충의 바쿨로바이러스 등과 같이, 포유동물의 바이러스로부터의 복제기구를 이용하는 여러가지 발현벡터가 존재한다. 형질도입체의 선별 뿐만아니라 유전자가 삽입될 수 있는 편리한 제한 부위를 제공하기 위해 개발되어 왔다.

자연적으로 생성되는 야생형 전사 및 해독억제부를 인식하지 못하는 숙주내에 유전자를 발현시키고자 할때는 추가조작이 필요하다. 편리하게 3'-전사 조절부의 여러가지 형태가 알려져 있으며 정지 코돈(codon)의 하류부분에 삽입시킬 수 있다. 구조적 유전자로부터 상류부분인 비암호화 5'-부분은 엔도뉴클레아제, Bal 31 제한효소등에 의해 제거할 수 있다. 양자택일의 방법으로, 편리한 제한위치가 구조적 유전자의 5'-말단기 가까이에 존재한다면 그 구조유전자를 절단하여, 프로모터 영역에 구조유전자를 결합하는데 어댑터를 사용할 수 있으며, 이 더댑터는 구조유전자의 소실된 뉴클레오티드를 제공한다. 발현 카세트를 대비하여 여러가지 방법이 이용될 수 있는데, 이것은 전사의 5'-,3'-방향에서 전사 및 번역개시부를 가지며, 또한 조절을 유도하는 조절배열, 개시부의 전사 및 번역조절하에 있는 구조유전자와 전사 및 번역말단부를 포합할 수 있다.

예시적 전사개시부 또는 프로모터로는 박테리아용으로 β-갈(gal)프로모터, TAC프로모터, 람다 좌우 프로모터 등과, 효모용으로 ADH- I 및 -II프로모터, GPK프로모터, PGI프로모터, TRP프로모터등과 같은 글리콜리틱 효소 프로모터, 포유동물의 세포용으로 SV40조기 및 후기 프로모터, 아데노 바이러스주 후기 프로모터 등이 있다. 이미 지적한 바와 같이 발현카세트는 에피조옴의 유지를 위해 적합한 세포숙주내에 포함되거나 또는 복제기구없이 제공될 수 있는데, 이 경우에는 숙주의 게놈내로 포함되게 될 것이다. DNA는 예컨대 칼슘-포스페이트-침전 DNA를 이용하는 형질전환, 세포를 바이러스와 접촉시킴에 의한 형질도입, 세포등으로의 DNA의 마이크로 인잭션과 같은 공지 방법에 의해 숙주내에 도입시킬 수 있다.

구조유전자가 적당한 숙주내에 도입되면 이 숙주는 생장하여 구조유전자를 발현할 것이다. 몇가지 경우에서, 구조유전자의 상류부인 시그날 시퀸스(분비근)와 해독부내의 시그날 시퀀스를 준비할 필요가 있을 것이다. 이것은 상징액내의 성숙한 폴리펩티드에 대비하도록 구조유전자의 분비 및 분비근(secretory leader)의 분열에 대비하는 것이다. 분비가 대비되지 않는 경우 숙주세포를 수확할 수 있으며 통상의 조건에 따라 용해시켜 필요한 생성물을 크로마토그래피, 전기영동법, 용매추출등과 같은 공지의 기술 수단에 의해서 단리및 정제할 수 있다.

주제의 화합물은 생체내 및 생체외에 여러가지 방법으로 사용될 수 있다. 주제의 화합물은 생체내 또는 생체외에 용도를 발견할 수 있는 주제의 화합물에 대한 항체를 만드는데 사용될 수 있다. 항체는 면역원으로서 주제의 폴리펩티드를 사용하고, 예컨대, 완전한 프레운스 첨가제, 수산화 알루미늄 겔등과 같은 첨가제를 가한 예컨대, 새앙쥐, 소, 염소, 양, 토끼등과 같은 포유동물 숙주에 폴리펩티드를 주입시키는 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 숙주의 피를 빼고 그 피를 폴리클로날 항체를 단리시키는데 사용되거나, 또는 새앙쥐의 경우에 말초혈액 임파구 또는 비장의 임파구(B-세포)가 주제의 화합물에 특이한 항체의 모노클로날 표현을 의한 염색체를 죽지않게 하기 위하여 적당한 골수종 세포와 융합시키는데 사용한다.

세포 또는 생리적 체액, 예컨대 혈액과 같은 시료내에 주제의 폴리펩티드의 존재를 식별 또는 검출하는데 사용될 수 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 또한 항체는 주제의 폴리펩티드를 정제하고 천연 또는 합성원료로부터 이것을 단리시키는데 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 항체는 배양중 또는 생체내에서 세포와 결합되는 주제의 폴리펩티드의 양을 조절하여 세포의 생장을 조절하는데 사용될 수 있다.

주제의 화합물은 주제의 화합물에 대한 섭수체의 존재를 검출하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 주제의 화합물에 대한 섭수체의 존재여부 및 밀도에 따라, 이러한 섭수체의 존재에 미치는 여러 화합물의 영향을 모니터함으로써 세포를 식별할 수 있다.

주제의 화합물은 민감하지 않은 세포와 구분되는 주제의 폴리펩티드에 민감한 세프 또는 세포계열의 생장을 억제하기 위하여 생체내의 배양기에 사용될 수 있다. 그래서 이종세포 혼합물 또는 세포계열은 불필요한 세포를 제거할 수 있으며, 이에 불필요한 세포는 주제의 폴리펩티드에 민감하다. 주제의 폴리펩티드는 예를들어 정맥내, 복강내, 피하조직내와 같은 경로에 주사하는 등의 방법으로 암 증상의 생체내에 투여할 수 있다. 주제의 화합물은 자기골수이식을 위한 골수로부터 악성종양세포를 제거하거나 재융합시키기 전에 기타조직, 예컨대 혈액내에 악성종양세포의 증식을 억제하거나 또는 이를 제거하기 위하여 생체내에 사용할 수있다.

또한 주제의 폴리펩티드는 피부상처, 각막상처와 같은 상처, 만성궤양, 화상, 외부절개, 창상과 같은 기타 여러가지 상피 및 기조직 붕괴, 및 식도, 위, 대장, 소장, 구강, 생식기 및 비뇨기와 같은 우묵한 곳의 상처를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 생물학적으로 허용되는 담체내에 온코스타틴 M을 포함하는 치료용 조성물을 국소투여하는 것에 따른다.

본 발명의 조성물은 모든 피부상처, 각막상처, 및 인체의 상피-우묵한 기관의 상처를 비룻한 여러가지상처를 치료하는데 사용될 수 있다. 치료에 적합한 상처는 화상, 찰과상, 절단등과 같은 외상은 물론 외부절개 및 피부이식과 같은 외과 치료방법으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물로써 치료하는데 적합한 기타조건은 만성궤양, 당뇨병 환자 궤양과 같은 만성적인 증상과 기타 회복되지 않는 (만성적)증상도 포함된다.

온코스타틴 M은 필요한 곳에 적용시키기 위하여 생물학적으로 허용되는 담체에 혼합시킬 수 있다. 담체의 종류는 여러가지가 있을 수 있으며 사용부위에 따라 달라진다. 통상적으로 피부에 이용하기 위하여 크림또는 연고제로 하는 것이 적합하며, 적합한 기초재료는 라놀린, 실바덴(마리온)(특히 화상치료용), 아쿼포(Aquaphor)(Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut)등이 있다. 필요에 따라 펩티드에 상처를 계속적으로 접촉시키기 위하여 붕대 및 기타 상처용 붕대에 온코스타틴 M을 함유하는 조성물을 투입할 수있다. 또한 에어로솔 형태로 사용할 수 있다.

치료용 조성물중의 폴리펩티드의 농도는 일정하지 않다. 폴리펩티드는 상피세포 증식 유도량이 되게 사용한다. 이 조성물은 일반적으로 눈에 아이드롭, 피부에 크림, 연고 또는 로숀과 같은 환부에 알맞게 사용될수 있다. 눈의 경우에 자주 사용할 필요가 있으며 보통 4시간 이내의 간격으로 사용된다. 피부의 경우에는 1일에 2-4차례 또는 이보다 더 자주 치료용 조성물을 사용함으로써 치료중 환부에 치료용 조성물을 계속적으로 유지시킬 필요가 있다.

주제의 폴리펩티드의 사용량은 투여방법, 기타 활성 화합물의 사용량 등에 따라 달라지지만 일반적으로약 1μg-100μg이 사용된다. 주제의 폴리펩티드는 염수, 인산염 완충 염수 등과 같은 생물학적으로 허용되는 담체와 같이 사용될 수 있다. 사용된 화합물의 양은 주제의 폴리펩티드 또는 주제의 폴리펩티드를 함유하는 제제에 대한 실험동물의 반응 및 생체내에서의 세포의 반응을 기초로 하여 실험적으로 결정된다. 주제의 화합물은 그 자체로서 또는 TNF, IL-2,λ-인터페론, 모노클로날 항체 등과 같은 기타 생장인자 또는 억제제 또는 면역조절제와 혼합하여 사용할 수 있다. 이들 기타 화합물의 사용량은 일반적으로 1μg-100μg범위내이다. 어떤 부위에 사용하기 위하여 주제의 화합물의 배합물을 제조할 수 있다. 여기서 항체는 특수 악성종양세포 또는 기관에 특효약이 될 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명하며 이들 실시예로서 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

[실험예]

재료 및 방법

U937 세포로부터 단리된 온코스타틴 M

조직구 임파종 세포주로부터 종양세포 생장역제제의 제조

조직구 임파종 세포주인 U937세포(Sundstrom and Nilson, Int. J.Cancer(1976)17 : 565-577 : 를 850㎠로울러보틀(Cornig C2540)중에 10%태아송아지혈청(FCS), 페니실린/스트렙토마이신(PS), L-글루타민 및 10ng/ml 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트(TPA)를 보충한 전체 용량 300ml RPMI-1640배지중의 4×105⁵세포/ml의 농도로 배양하였다. 4일후에 FCS와 TPA를 함유하는 상징액을 제거하고 로울러보틀은 혈청을 제거시킨 RPMI-1640으로 5차례 세척하여 분리된 세포(1×10⁵세포/ml)는 혈청이 제거된 매질로써 3차례 세척하고 보틀에 다시 가하여 롤러보틀 1개당 혈청이 제거된 RPMI-1640매질 125ml(최종용량)을 얻었다. 1일후에 상징액을 수집하여 원심분리시켜 세포를 제거시키고 0.45미크론(μ)날젠여과기(Nalgene filter)를 통하여 여과시킨 다음 동공섬유기구(Amiconcartridge HIP10-20)를 사용하여 150ml(처음 용적 1500ml)의 용적으로 농축시켰다. 또한 온코스타틴 M은 150㎠조직배양 플라스크내에 혈청을 제거시킨 TPA-처리 U937세포의 상징액으로부터 단리시켰다. 이 상징액을 아미콘 다이아플로 박막 PM-10으로써 농축시켜 10KD유분으로 절단, 투석하였다. 투석한 다음 농축액을 초산으로 희석시켜 500ml의 0.1N의 초산농도를 얻은 다음 아미큰 PM10여과기를 사용하여 50ml로 농축시켰다. 농축물 50ml를 0.1N 초산을 이용하여 400ml로 희석시켜 같은 여과기를 사용하여 40ml로 농축시켰다. 이 농축물을 다시 1N초산으로써 희석하여 생성된 침전물은 원심분리시켜 제거하였다. 농축액을 동결건조시켰다. 이 동결건조물질을 정제단계에 사용하였다.

겔 침투 크로마토그래피

바이오-실 TSK-250칼럼(600×215mm)(Bio-Rad)을 고압 액체 크로마토그래피 기구에 부착시켰다. 조제의 유분(10mg/ml)을 0.1% 수성 트리플루오로아세트산(0.1% TFA)중의 40% 아세토니트릴에 용해시켰다. 이 혼합물의 2ml분취액을 주입하고 0.1% TFA중의 40% 아세토니트릴의 이동상으로 균일하게 용출시켰다. 유속은 2.5ml/min였고 챠트속도는 0.25cm/min로 기록되었다. 유분 5ml를 수집하였다. 실온에서 크로마토그래피를 시행하였다. 각 유분으로부터 얻은 분취액을 증발시키고 A375세포의 생장억제활성(GIA)을 3차례 측정하였다.

6회의 수행으로부터 활성유분(유분 21과 22)을 모았다. 수집된 이 물질은 총 약 4.8×10⁵GIA단위를 가졌다. 이 인자는 사이즈 배제 크로마토그래피(Bio-sil TSK-250칼럼)에 의해서 측정한 결파 18KD의 곁보기 분자량을 갖는다는 것을 알았다.

TSK-250유분의 역상 고압 크로마토그래피(HPLC)

상기 수집된 TSK-250유분 21 및 22를 0.1% TFA로써 2배로 희석시켰다. 이 혼합물을 실온에서 μ-본다팩(Bondapak) -C18 칼럼(7.8×800mm)에 동일하게 주입하였다(C18¹라 칭함). 유속은 2.0ml/min였고 챠트속도는0.25cm/min였다. 일차용매 0.1%TFA와 2차용매 아세토 니트릴 TFA0.1%사이에 선형구배를 이용하였다. 구배조건은 20분에 0-30%였고, 그 다음 150분에 30-45%,20분에 45-55% 및 10분에 55-100%였다. 모든 용매는 HPLC규격이었다. 4ml의 유분을 수집하여 각 유분의 분취액을 생장 억제 활성에 대하여 분석하였다. 유분 72-75는 대부분의 활성을 나타낸다는 사실을 알았다. 활성유분은 아세토니트릴농도 41-52%에서 용출하였다.

유분 72-75를 수집하였다. 0.1%TFA 16ml를 수집된 유분에 첨가시켰다. 혼합물을 실온에서 μ-본다팩-C18 칼럼(3.9×300mm)에 주입하였다(C18²라 칭함). 유속은 1ml/min였고 챠트속도는 0.25cm/min였다. 구배 조건은 10분에 0-35%, 100분에 35-45%, 10분에 45-100%였다. 유분을 수집하고 각 부분으로 분리시켜 GIA에 대하여 분석하였다. 대부분의 활성은 40.7-41.3%의 아세토니트릴 농도(체류시간 83-86분)사이의 칼럼에서 나타났다.

활성유분들을 모아서 0.1% TFA로써 희석하고 실온에서 μ-본다팩-C18칼럼(3.9×300mm)에 주입하였다.(C18³이라 칭함). 유속은 1ml/min였고 챠트속도는 0.25cm/min였다. 1차용매 0.1% TFA와 2차용매 n-프로판올-TFA(0.1%)사이에 선형구배를 이용하였다. 구배조건은 20분에 0.23%와 120분에 23-35%였다. 유분을 수집하여 각 부분의 유분을 GIA에 대하여 분석하였다. 대부분의 활성은 25-26.5%프로판올 농도 사이에 나타났다(체류시간 59분). 이 균일한 유분은 약 300mg의 단백질과 약 40,000GIA단위를 함유하고 있었다.

DNA로의³H-티미딘 인코포레이션에 의한 세포생장조절 분석(GIA).

96프래트 웰판(Costar 3596)에서 분석을 수행하였다. 인체의 흑종세포(A375)를 감작지시 세포주로서 사용하였다. 10% FCS와 PS가 보강된 둘베코(Dulbecco)의 개량 이글스배지(DMEM) 0.1ml중의 세포(3×10³)를 각 웰에 넣었다. 3시간후에 시료 0.1ml를 각 웰에 첨가시켰다. 판을 3일동안 37℃의 항온기에 넣어 보관하였다.³H-티미딘용액(비활성도 27μCi/μg) 0.025ml(0.5μCi)를 각 웰에 첨가시켜 최종 6시간동안 항온기에서 보관하였다. 이 세포를 멀티웰 수확기(PHD Cell Harvester, Cambridge Technology, Inc.)를 사용하여 초자 여과조에 이송시켰다. 여과조를³H-티미딘 혼입량을 측정하기 위하여 신틸레이션 계수기로써 계수하기 전에 신틸레이션액(Scientiverse II, Fisher Scientific Co.)2ml을 첨가시킨 신틸레이션 바이알에 이송시켰다.

연질 한천집락억제 분석(TGI)

10%태아 송아지혈청(FCS)를 함유하는 DMEM중의 0.5%한천(Agar Noble : Difco Laboratories, Detroit, Michigan)0.5ml 기본층을 24개의 웰 코스타 조직배양판에 첨가시켰다. 같은 배지-FCS혼합물, 1-2.5×10³A375세포 및 여러가지 농도로 시험될 인자를 함유하는 0.3% 한천 0.5ml를 기본 한천층에 오버레이시켰다. 이 판을 공기중에 5% CO₂를 함유하는 함습 공기중에서 37℃호 항온 보관한 다음 7일후에 같은 배지와 같은 농도의 인자를 함유하는 0.3%한천 0.5ml를 첨가시켜 재투입하였다. 고착되지 않고 염색되지 않는 집락수를 세고 세포수가 6개를 넘는 군락의 수를 7일과 14일째 되는 날에 계산하였다.

결과

U937세포로 부터 단리된 온코스타틴 M의 배열.

온코스타틴 M의 N-말단 배열 및 내부단편의 배열은 엔도프로테이나제 Lys-C와 스타필로코커스 아우레우스 V8프로테아제에 의해 환원 및 S-피리딘에틸화된 온코스타틴 M의효소 분해물로 부터 얻은 펩티드와 환원 및 S-피리딘에틸화된 폴리펩티드의 현미경 배열분석에 의해서 결정하였다. 펩티드 단편을 휘발성용매를 사용하여 역상 HPLC에 의해서 정제하였다. 이 펩티드를 모델 470A단백질 배열분석기(Applied Bio systems, Inc.)에서 자동반복 에다만식 분해를 시켰다. 용리액으로서 아세트산나트륨 완충액/테트라히드로퓨란/아세트니트릴 구배를 이용하여, PTH-C18컬럼(2.1×220mm, ABI)로 역상 HPLC(Applied bio systems, Inc.)에 의해 페닐티오히단토인 아미노산을 분석하였다. 이와 같이 얻은 아미노산 배열은 제1도에 도시된 것과 실질적으로 같다.

최근 단백질 데타 베이스(PIR Release 9.0,1986년 5월)에 저장된 것과 이들 배열을 비교하면 기타 공지의 배열과는 이렇다할 배열 상등성을 나타내지 않았다. 이에 더하여 종양 네크로시스 인자, 임파성독소, 군락자 극인자, 인터류킨 1 또는 2 또는 β-형질전환 생장인자와도 상등성이 없다.

종양세포의 증식억제 및 정상적인 인체 섬유아세포 증식의 중가.

상기 연질한 천집락 억제분석을 이용하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

[표 1] U973로 부터 단리된 정제 온코스타틴 M에 의한 연질한천중에서의 A375흑종세포집락형성의 억제.

* A375세포를 전술한 것과 같이 최종용역 2ml중에 인자를 포함하거나 포함하지 않는 연질 한천에 플레이팅하였다. 사용된 인자는 최고의 종양억제활성(GIA)을 가진 C18프로판을 컬럼 유분으로 부터 얻었다. 11일후에 집락의 수를 세어 보았다. 집락은 최소한 6개 이상의 세포의 집단으로 정의하였다. 1 GIA단위는상술한 바와 같이 미세 웰중의 A375세포로의³H-티미딘의 인코포레이션을 50%억제하는 양으로서 정의하였다.

그 다음의 연구에서 주제의 폴리펩티드의 활성에 미치는 화학적 또는 물리적 처리효과를 측정하기 위하여 여러가지 처리방법이 이용되었다. 다음 표 2는 이 결과를 나타낸 것이다.

[ 표 2] 종양성장 억제활성에 미치는 TPA-유도 U937세포 상징액의 여러가지 처리효과.

* U937세포는 3일동안 TPA(10ng/ml)로써 처리한 다음 세포를 배지로써 세척하여 상징액을 수집하기 전에 혈청을 제거시킨 배지에서 24시간 동안 항온 보관하였다. 상징액을 1N초산 또는 1N수산화암모늄(NHOH)로 처리하였다. 배지에 대한 투석을 실시한 다음 A375세포로의³H-티미딘의 인코포레이션을 억제할수 있는 능력을 시험하였다. A375세포는 3일간은 항온보관중 최종 6시간동안³H-티미딘³(H-TdR)로써 라벨을 부착시켰다.

* *표시된 데이타는 상징액중의³H-TdR인코포레이션 계수이다.

상기 결과는 투석된 상징액중의 온코스타틴 M이 1N초산과 1N수산화암모늄에 의한 비활성화에 실질적으로 내성을 나타낸다는 사실을 보여준다. 그래서 주제의 화합물은 보통의 강산 및 보통의 강염기에 비교적 민감하지 않다. 주제의 화합물은 1시간 동안 56℃로 열처리하여도 안전하나 90℃에서 30분동안 열처리하면 그러하지 아니하다.

또한 주제의 화합물에 대하여 열안정성 시험을 실시하여 56℃에서 1시간동안 노출시킨 후 그 활성이 유지된다는 사실을 발전하였으나 95℃에서 30분동안 노출시킨 후에 그 활성이 거의 전부 상실된다는 사실을 알았다.

이 다음의 연구로 여러가지 암세포의 종양세포 복제를 억제시키는 주제의 폴리펩티드의 능력을 시험하였다. 이 결과는 다음표 3과 같다.

[ 표 3] U937세포로 부터 정제한 온코스타틴 M에 의한 종양세포의 복제억제.

상기와 같이 역상 HPLC에 의해서 정제한 온코스타틴 M을 여러가지 비율로 희석시켜 첨가시키기 3시간전에 마이크로 웰에 플레이팅하였다. 3일간의 배양중 최종 6시간동안 0.2ml배지중의 세포를³H-티미딘 C³H-TdR)(0.5μCi/well)로써 표지시켰다. 1단위 종양성장 억제활성(GIA)은 A375흑종 세포로의³H-TdR의 인코포레이션을 50%억제하는 양으로 표 1각주에서 정의한 바 있다. 1단위는 정제한 단백질 약 10pg으로 결정되었다. 그러므로 A549, HTB10 및 A375세포로의³H-TdR의 인코포레이션을 30%억제시키는 농도(ng/ml)는 각각 1.4, 4.0 및 0.015ng/ml이었다. WI26정상인의 섬유아세포로의³H-TdR의 인코포레이션은 어떤 시험에서도 U937인자에 의해서 억압되지 아니하였다.

상기 결과는 온코스타틴 M이 선택적인 복제 억제능력을 가지며 세포의 특성에 따라 광범위한 효과를 갖는다는 사실을 입증해 준다. 주제의 화합물은 A375흑종세포와 같은 흑종세포, A549와 같은 비늘형 폐암세포와 HTB10과 같은 신경아세포종 세포에 대하여 효과가 있다.

96웰판에서 3시간동안 종양세포를 3×10³세포/웰로 접종하고 정상 섬유아세포는 1.5×10³세포/웰로 접종하였다. A375세포에 대한 최고의 항증식 활성을 가진 C18³칼럼에서 비롯된 유분에서 얻은 다양한 농도의 정제한 온코스타틴 M을 첨가시키고 3일후에 세포중에³H-티미딘의 인코포레이션양을 각 농도의 웰을 3차례 측정하였다. 그 결파는 다음표 4와 같다.

[표 4] 온코스타틴 M에 의한 종양세포의 증식의 억제 및 정상 섬유아세포의 증식의 증가.

나타난 결과는 종양세포(A375, HTB10, A549 및 SK-MEL28)와 정상 섬유아세포(WI26 및 WI38)내에 인코포레이션된³H-티미딘의 억제율(%) 및 촉진율(%)이다. 1GIA단위는 A375세포로의³H-티미딘의 인코포레이션을 50%억제하는 온코스타틴 M의 양으로서 표 1의 각주에 정의한 바 있다.

종양세포와 정상인의 섬유아세포로의³H-티미딘의 인고포레이션에 대하여 관찰된 상이한 효과에 부가하여, 제2도에 도시된 바와 같이 온코스타틴 M과 2가지 세포형태를 3일간 처리한데 따른 형태학 및 세포수의 상이한 효과에 관하여도 관찰되었다.

사용된 온코스타틴 M은 A375세포의 증식을 억제하는데 최고의 활성을 가진 HPLC-C18³칼럼 유분에서 얻은 것이다. 제2도는 처리되지 않은것(A), 온코스타틴 M의 5성장억제 활성(GIA)단위로 처러한 것(B), 또는 100단위로 처리한 것 (C)인 A375흑종 세포의 일련의 현미경사진과 처리하지 않은것 (D), 5단위 GIA로 처리한것 (E) 또는 100단위로 처리한것 (F)인 WI38섬유아세포의 현미경 사진이다. 세포들은 0.5%메틴올중의 밝은 보라빛으로 염색되었다. 배율=63X.

온코스타틴 M의 NaDodSO₄/PAGE.

환원 조건하에서 NaDodSO로 처리하여 정제한 온코스타틴 M이 제3도에 도시된 바와 같이 약 28KD의 겉보기 분자량을 갖는다는 사실이 발견되었다. 다음 단백질을 표준치(레인 A)로 사용하였다. 즉, 오발부민, Mr=43KD : 키모트립시노겐α, Mr=25.7KD : 락토글로불린β, Mr=18.4KD : 리소자임, Mr=14, 2KD; 소의 트립신 억제제=6.2KD : 인슐린 A 및 B체인, 각각 Mr=2.3KD 및 3.4KD. 온코스타틴 M은 레인 B에 사용되었다.

또한 비환원 조건하에서 PAGE 처리한 온코스타틴 M은 겉보기 분자량이 28KD이며 밴드로부터 전기 용출된 단백질은 A375 세포의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 온코스타틴 M의 합성펩티드에 대한 항체는 방사선 면역 침전물중의¹²⁵I-라벨을 붙인 온코스타틴 M 층에서의 반응함(a) 펩티드 합성 : 펩티드는 온코스타틴 M 단백질의 잔사 6-19에 해당하며 기술한 바와같이 벡크만 자동기구 상에서 고체 상태 기술[Gentry et al., J. Biol. Chem.(1983) 258 : 11219]에 의해서 합성되었다. 펩티드를 "로우-하이" HF 공정을 이용하여 수지로부터 절단하였다[Tam 외., J. Amer. Chem. Soc.(1983) 105 : 6442-6445]. 정제는 예비 HPLC로 수행하였다.

(b) 항체의 생산 : 펩티드를 기술된 바와같이[Gentry 및 Lawton, Virology (1986) 152 : 421-431] 소의γ-글로불린과 결합시켰다. 뉴질랜드산 백색토끼를 프라임시켜 4부위에서 피하 부스트(5회) 시켰다(Gentry및 Lawton, Virology(1986) 152 : 421-431). 사용된 항혈청은 5번째 부스트 후 2주후에 얻어진 것이었다.

(c) 온코스타틴 M의 요오드화 : 일부 정제한 온코스타틴 M의 시료에 공개된 방법(Linsley et al., PNAS(1985) 82 : 356-360)을 이용하여 요오딘-125로써 방사선 라벨을 붙였다. 100,000cpm을 함유하는 라벨을 붙인 제제의 일부분을 N-말단 펩티드(온코스타틴 M의 N-말단 아미노산 17개)(2μg)의 존재 또는 부재하에 온코스타틴 M(최종 희석율 1 : 20)의 N-말단 아미노산에 대해 지향된 토끼의 항혈청과 혼합시켜 공개된 바와같이[Linsley 외., Biochemistry(1986) 25 : 2978-2986] 면역침전 분석하였다.

특히 5μl를 함유하는 1개의 관에 0.1% BSA 및 디티오트레이톨(DTT) 40mM을 함유하는 TNEN 85λ중에 I¹²⁵온코스타틴 M을 첨가시키기 전에 4℃에서 30분동안 0.1% BSA를 함유하는 10ml의 TNEN(20mM Tds pH7.5,5mM EDTA,150mM NaCl.,0.05% Nonidet P-40)에 N-말단 펩티드 2μg을 미리배양시켰다. 이 5μl 항혈청을 함유하는 7개의 관을 10% 포르말린을 혼합한 스타필로 코쿠스 아우레우스(Pansorbin, Calbiochem) 50μl을 첨가시키기전에 4℃에서 30분동안 0.1% BSA 및 40mM DTT를 함유하는 85μl TNEN 중의 I¹²⁵온코스타틴 M과 함께 배양하였다.

4℃에서 30분간 더 배양시킨다음 이 관을 마이크로퓨즈시켜 얻은 펠릿을 PAGE 분석을 행하기전에 TNEN 1ml로써 4차레 세척하였다. 면역침전물을 SDS/PAGE 분석시킨후에 Mr=32KD의 확산밴드가 관찰되었다. 이 표본의 침전은 온코스타틴 M의 N-말단 17 아미노산에 해당하는 과량의 비표지 펩티드를 포함시킴으로써 억제되며 이는 침전이 이 펩티드에 특이적임을 가리키는 것이다.

온코스타틴 M의 탄수화물 조성을 글리코시다아제 감작성에 대해 테스트함으로써 시험하였다. 상기 (C)에서 제조된 면역침전물을 린슬리외 공동연구자(1986)에 의해서 기술된 바와같이 완충제, 엔도글리코시다아제 H 또는 뉴라미니다아제로 처리하였다. N-결합 고 만노즈 올리고삭 카라이드에 특이적인 효소인 엔도글리코시다아제로써 처리하면 Mr=23KD인 저분자량의 종이 출현되었다. 방사선 레벨을 붙인 물질의 일부분만이 이 효소에 민감하였으며, 이는 모든 세포가 고 만노즈 올리고삭카라이드를 함유하지는 않는다는 것을 가리킨다. 뉴라미니다아제로써 처리하면 Mr=27KD인 단일밴드가 출현되었다. 이 사실은 미처리¹²⁵I-라벨을 붙인 온코스타틴 M의 규격이 불균일한 것은 당단백질 중심부의 시알리에이션 분자이질성에 기인된다는 것을 나타내준 것이다. 이 결과는 온코스타틴 M의 활성제제는 고 만노즈 및 복합 N-결합 올리고삭카라이드 측쇄의 혼합물을 포함하고 있다는 사실을 나타내 주었다.

정상인의 말초혈액 임파구(PBL)로부터 단리된 온코스타틴 MPBL로부터의 종양세포 생장억제제의 제조

혈액은행으로부터 수득한 PBL을 함유하는 류코프렉션(Leucofraction)을 인산염 완충염수, pH7.4(PBS)로써 1 : 1로 희석시켰다. 희석한 현액 35ml을 50% 소듐 디아트리조에이트(최종비중 1.080) 20%(용량)를 함유하는 9% 피콜로 구성되는 용액 10ml로써 밑에 깔았다. 구배물을 850xg로 20분동안 실온에서 원심분리시켰다. 구배내면에서 세포를 수집하여 PBS로 세척하였다. 적혈구를 0.8% 염화암모늄과 0.1% Na-EDTA를 함유하는 용액 10-20ml로써 3-4분동안 충격 용해시켰다.

세포는 적혈구 용해액으로부터 600xg로 10분동안 원심분리시켜 수집하여 5% 태아 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지(GIBCO) 10ml에 현탁시켰다. 트롬빈을 최종농도 0.5U/ml이 되게 첨가시켰다. 세포현탁액을 37℃에서 5분동안 교반한다음 혈소판체를 5분동안 정치시켰다. 현탁시킨 세포를 새로운 관에 이송시켜 원심분리시켜 회수하고 1ml의 태아 송아지 혈청에 재현탁시켜 닦고 가습시킨 나일론울(200형)(Fenwal)0.5g을 함유하는 칼럼에 이송시켰다.

나일론울 컬럼을 60분동안 37℃에서 배양하여 단핵세포와 B 임파구를 부착시켰다. 그 다음 칼럼을 5% 태아송아지 혈청을 함유하는 RPMI 140 배지(37℃) 3배 용량으로 세척하여 용융된 비부착착성 세포(PBL)를 용출시켰다.

PBL(2×10⁶세포/ml)은 FeSO₄7H₂O(lmg/l), ZnSO₄7H₂O(2mg/l), Na₂SeO₃5H₂O(0.017mg/l), 1-아미노에탄올(lmg/1), 인체 트란스페린(5mg/l), 소의 혈청 알부민리노레산 접합물(시그마)(200mg/ι), L-글루타민(300mg/ι), 페니실린/스트렘토마이신(100,000만위/l) 및 피토헤마글루티닌-P(웰컴) (2mg/ι)을 함유하는 RPMI-1640 배지(10.4g/l)중에서 37℃ 5% CO₂-95% 공기 조건하에 배양하였다. 상징액을 수집하여 초여과(Amicon Diaflo membrane YM-10,10Kd 유분)에 의해서 농축시킨 다음 0.1M 초산에대하여 투석하였다.(Spectrapore 3 dialysis tubing) 정제한 잔유물을 동결건조시켰다.

겔 침투 크로마토그래피

조제의 유분을 1M 초산(50mg/ml) 20ml 중에 재구성하여 0.5ml/min의 유속으로 1M 초산과 평행을 이룬 BioGel P-100 칼럼(2.6×88cm)에 투입하였다. 12ml의 유분을 수집하였다. 각 유분으로부터 일부분을 증발시켜 A375 세포의 생장억제활성(GIA)에 대하여 3차례 시험하였다. 활성유분을 모아서 동결건조시킨다음 전술한 바와같은 Bio-Sil TSK-250 칼럼(600×21.5mm)에서 재크로마토그래피를 시행하였다.

TSK-250 유분의 역상고압 크로마토그래피

혼합 TSK-250 유분의 최종정제는 상기 역상 HPLC에 의해서 수행하였다. μBondapak C18로부터 용출된 PBL-유도종양세포 억제제는 각각 40-41% 아세토니트릴과 26.5% n-프로판올 농도로 보충한다.

DNA(GIA)에 혼합한¹²⁵I-요오도데옥시우리딘을 사용한 세포 생장조절 시험

이 시험은 평면저면부를 가진 96-웰 조직 배양트레(Costar 3596)에서 실시하였다. 시료 50μl 중에 인체흑종세포 A375(4×10³)을 각 웰에 첨가시킨 다음 37℃에서 3일동안 배양하였다. 세포는¹²⁵I-IdU(0.05μCi/웰)로써 24시간동안 라벨을 부착시켜 다시 24시간동안 배양시켰다. 세포를 3차례 세척하여 다중시료수확기로써 수확하여 방사능을 감마 계수기내에서 측정하였다.

결과

PBL-유도종양세포 억제제의 제제는 자동 반복 에드만식으로 분해시켰다. 아미노 말단의 아미노산 배열은 다음과 같다.

여기서 X는 확인되지 않은 아미노산을 나타낸다.

이 배열과 U937 인자와의 비교는 PBL-유도인자의 N-말단과의 동일성을 나타내준다.

그, 다음의 연구에서, 여러가지 세포의 복제에 영향을 미치게 하는 PBL 유도 온코스타틴 M의 능력에 대하여 연구하였다. 새앙쥐의 L929 세포가 1000 GIA 단위/ml 미만을 사용한 PBL-유도 온코스타틴 M에 민감하지 않다는 사실을 발견하였다. 인체 섬유아세포 WI26은 1000 GIA 단위/ml로 처리함으로써 생장이 촉진되었다. 유사분열로부터 72시간후의 정상적인 인체의 T-임파구의 증식은 500 GIA 단위/ml 미만에까지 영향을 껴치지 않았다.

상기 결과로부터 세포의 생장을 조절하는데 사용될 수 있는 신규의 폴리펩티드 및 폴리펩티드 단편을 제공할 수 있다는 사실이 명백해졌다. 이 화합물은 관련된 세포계열의 종류에 따라서 활성이 변화하는 것을 발견하였다. 그러므로 세포의 생장을 조절하는데 있어서 그 자체로서 사용하거나 다른 화합물과 혼합하여 사용할 수 있다. 그러므로 주제의 폴리펩티드는 특별한 형태의 세포의 생장을 선택적으로 억제 또는 증대시키기 위하여 생체내 또는 생체외에서 세포의 혼합물과 함께 사용될 수 있는 부가적인 폴리펩티드를 첨가시킨다.

특히 그 인자는 자기 골수이식을 위하여 세포를 처리하는데 사용될 수 있다. 이 인자를 사용하면 골수내의 종양세포의 생장을 억제하며 군락세포의 형성을 자극시킬 수 있다. 또한 온코스타틴 M은 상처의 치료를 촉진시키는 상피세포의 생장을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 이에 더하여 본래 그대로의 폴리펩티드 또는 그 단편은 항체 형성을 유발하기 위한 면역소로서 사용될 수 있다. 유발된 항체는 그것과 결합시커 인자의 활성을 조절하거나 체액내에 존재하는 온코스타틴 M을 적정하는데 사용할 수 있다는 것을 발전하였다. 또한 정제한 온코스타틴 M 또는 그 인자와 더불어 포함한 이들 항체는 기타 시약과 혼합되어 진단용 시약의 한성분으로서 특히 온코스타틴 M을 검출 및 평량하는 항체로서 사용한다.

본 발명을 더욱 정확하게 이해시키기 위하여 실시예를 들어 자세히 설명하였지만 본 발명의 청구범위내에서 어떤 변경 또는 개선이 이루어질 수 있다는 사실을 인식해야만 될 것이다.

Claims

다음의 특성, 즉, 백혈구로부터 얻어지고, 종양세포의 증식은 억제하는 반면 정상적인 인체 섬유 아세포의 증식은 촉진하며, 인체의 증식 T 세포 응답 및 세포독성 T 세포 응답을 억제하지 않고, 과립구/골수구의 골수 집락 세포 생성을 억제하지 않으며, 그 분자량은 겔 배제 크로마토그래피로 측정할때 약 17 내지 19kD 범위이고, SDS-PAGE로 측정된 겉보기 분자량은 약 28kD이며, 온화한 산과 염기, 온화하게 상승된 온도에 비교적 민감하지 않은등의 특성을 갖는 폴리펩티드 화합물과 면역학적으로 교차반응함을 특징으로 하는 8개 이상의 아미노산으로 이루어진 신규의 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 제1도의 아미노산 배열에 해당하는 최소한 10개 이상의 연속적인 아미노산으로 된 아미노산 배열을 함유하고, 이때 상기 제1도의 아미노산 배열과는 3개 이하의 아미노산만이 서로 다른 것이 특징인 폴리펩티드.
제2항에 있어서, 제1도의 아미노산 배열에 해당하는 최소한 12개 이상의 연속적인 아미노산으로 된 아미노산 배열을 함유하고, 이패 상기 제1도의 아미노산 배열과는 1개 이하의 아미노산만이 서로 다르며, 이 상이점이 결실 또는 보존적 치환에 기인하는 것이 특징인 폴리펩티드.
백혈구로부터 얻어지고, 종양세포의 증식은 억제하는 반면 정상적인 인체 섬유 아세포의 증식은 촉진하여, 인체의 증식 T 세포 응답 및 세포독성 T 세포 응답을 억제하지 않고 과 과립구/골수구의 골수 집락세포 생성을 억제하지 않으며, 그 분자량은 겔 배제 크로마토그래피로 측정할때 약 17 내지 19kD 범위이고, SDS-PAGE로 측정된 겉보기 분자량은 약 28kD이며, 온화한 산과 염기, 온화하게 상승된 온도에 비교적 민감하지 않은 등의 특성을 갖는 폴리펩티드를 활성성분으로 하여, 최소한 약 10GIA 단위 이상/ng단백질의 비활성을 제공하는 순도의 상기 폴리펩티드와 약리적으로 허용되는 담체로 이루어짐을 특징으로하는 세포 생장조절 조성물.
제4항에 있어서, 상기 백혈구가 유사분열물질(mitogen)에 의해 활성화된 정상적인 인체 말초혈액임파구인 것이 특징인 세포 생장조절 조성물.
제4항에 있어서, 실질적으로 세포성분이 없는 것이 특징인 세포 생장조절 조성물.
제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 비활성이 약 100GIA 단의 이상/ng 단백질인 것이 특징인 세포생장조절 조성물.
종양세포의 증식은 억제하는 반면 정상적인 인체 섬유 아세포의 종식은 촉진하며, 인체의 증식 T 세포 응답 및 세포독성 T 세포응답을 억제하지 않고, 과립구/골수구의 골수 집락 세포 생성을 억제하지 않으며, 그 분자량은 겔 배제 크로마토그래피로 측정할때 약 17 내지 19kD 범위이고, SDS-PAGE로 측정된 겉보기 분자량은 약 28kD이며, 온화한 산과 염기, 온화하게 상승된 온도에 비교적 민감하지 않고, 제1도의 아미노산 배열에 해당하는 아미노산 배열을 포함하며, 이때 상기 제1도의 배열과 비교할때 3개 이하의 아미노산만이 서로 다른 것이 특징인, 세포 파괴물(cell debris)과 기타 백혈구 단백질이 실질적으로 없는 폴리펩티드.
제8항에 있어서, 상기 제1도의 아미노산 배열에 해당하는 아미노산 배열이 제1도의 배열과 비교할 때, 1개 이하의 아미노산만이 서로 다른 것이 특징인 폴리펩티드.
종양세포를 제8항에 따른 조성물의 증식 억제량과 접촉시킴을 특징으로 하는 종양세포의 생체외 증식 억제방법 .
로 표시된 아미노산 배열을 코오드화함을 특징으로 하는, 제8항에 따른 폴리펩티드를 코오드화하는 DNA배열(이때 상기 도시된 아미노산 배열중 3개 이하의 아미노산이 결실되거나 보존적으로 치환될 수 있음).
제8항에 따른 폴리펩티드를 코오드화하는 DNA 배옅을 포함하는 발현구조물을 갖는 세포의 배양체를 상기 세포내에서 작용 가능한 전사 및 번역 조절 시그날의 조절적 통제하에서 배양시킴으로써, 상기 폴리펩티드를 발현시킨 다음 : 세포물질이 실질적으로 없도록 상기 폴레펩티드를 분리하는 것으로 됨을 특징으로 하는, 제8항에 따른 폴리펩티드의 제조방법.
제1항에 따른 폴리펩티드를 코오드화하는 DNA 배열을 포함하는 발현 구조물을 갖는 세포의 배양체를 상기 세포내에서 작용 가능한 잔사 및 번역조절 시그날의 조절적 통제하에서 배양시킴으로써, 상기 폴리펩티드를 발현시킨다음 : 세포물질이 실질적으로 없도록 상기 폴리펩티드를 분리하는 것으로 됨을 특징으로하는, 제1항에 따른 폴리펩티드의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제1도의 아미노산 배열에 해당하는 최소한 10개 이상의 연속적인 아미노산으로된 아미노산 배열을 함유하고, 이때 상기 제1도의 배열과는 3개 이하의 아미노산만이 서로 다른 것이 특징인 제1항에 따른 폴리펩티드의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제1도의 아미노산 배열에 해당하는 최소한 12개 이상의 연속적인 아미노산으로 된 아미노산 배열을 함유하고, 이때 상기 제1도의 배열과는 1개 이하의 아미노산만이 서로 다르며, 이상이점이 결실 또는 보존적 치환에 기인하는 것이 특징인 제1항에 따른 폴리펩티드의 제조방법.
제12항에 있어서, 제1도에 도시한 배열과 그에 해당하는 배열을 비교할때 단지 1개 이하의 아미노산만이 서로 다른 것이 특징인 제8항에 따른 폴리펩티드의 제조방법.