FI91484C - Menetelmä uuden solun kasvua säätelevän tekijän, onkostatiini M:n valmistamiseksi - Google Patents

Description

91484

Menetelma uuden solun kasvua saatelevan tekijan, onkosta-tllni M:n, valmistamiseksi

Leukosyytit, seka lymfosyytlt etta monosyytit, on 5 liitetty kasvainten kasvun estoon muutamissa kasvaineiain-malleissa. Pahanlaatuisten kasvainten kohonnut esiintymis-tiheys ihmisissa, joiden inununiteetti on alentunut, tukee sita vaitetta, etta valkoiset verisolut osallistuvat kasvainten kasvun saatelyyn. Naiden valkosolujen tuottamiin, 10 jo eristettyihin ja karakterisoituihin proteiinitekijOi-hin, jotka estavat kasvainten kasvua tal saatelevat im-muunitoimintoja, kuuluvat interferonit a- ja tuumorin nekroositekija, lymfotoksiini, interleukiini 2 ja muut lymfokiinit. Koska kullakin naista eristetyista tekijOista 15 on erilainen vaikutusspektri ja ne voivat olla eri tavalla vuorovaikutuksessa mulden tekijoiden kanssa, tunnetaan edelleen voimakasta kiinnostusta kaikkien tekijOiden, joi-ta valkosolut tuottavat såådellessåån solujen kasvua ja immuunitoimintoja, eristamiseen ja karakterisointiin. 20 Naille yhdisteille voi yksittain tai yhdessS lOytya kSyt-tOa syOvén hoidossa tai diagnosoinnissa, vammojen paran-tumisen edistSjina tai immunomodulaattoreina hoidettaessa immuunivajaus-, autoimmuuni-, elinsiirto- tms. potilaita.

Luonnossa esiintyvien tekijSiden lSytSmisesså, 25 eristémisessa, puhdistuksessa tai karakterisoinnissa voi-daan kohdata monia vaikeuksia. Tåytyy kehittåS menetelmia kiinnostuksen kohteen olevan tekijSn erottamiseksi ja puh-distamiseksi epSpuhtaassa lahtSaineessa esiintyvista muis-ta tekijSista denaturoimatta halutun tekijan aktiivisuut-30 ta; taytyy kehittaa biologisia maarityksia, jotka mahdol-listavat fraktioiden identifioinnin erotusten aikana, joissa konsentroidaan tiettya tekijaa; uusi tekija taytyy erottaa jo tunnetuista tekijOista tai muista tuntematto-mista tekijOista, joita voi olla lasna ja jotka voivat 35 vaikuttaa, joko negatiivisesti tai positiivisesti, halu- • · 2 91484 tun tekijan aktiivisuuteen; ja puhdistettua tekijaa tay-tyy konsentroida riittavassa maarin tekijan identifioin-nin ja karakterisoinnin mahdollistamiseksi. Siksi eris-tettyjen tekijiiiden lukumaaran kasvaessa kay jokainen uusi 5 tekija vaikeammaksi identifioida, silia sen roolia ja toi-mintaa voivat peittaa lasna olevat lukuisat muut tekijat.

Bealin et al.'n [Cancer Biochem. Biophys. 3 (1979) 93 - 96] mukaan ihmisen virtsassa esiintyy peptideja, jot-ka estavat kasvua ja DNA-synteesia voimakkaanunin muuttu-10 nelssa kuln normaaleissa solulssa. Holley et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. 77 (1980) 5 989 - 5 992] kuvaavat epltee-lisolujen kasvun inhibiittoreiden puhdlstusta. Letanskyn [Biosci. Rep. 2 (1982) 39 - 45] mukaan naudan istukasta puhdlstetut peptidit estavat kasvainten kasvua ja tymidii-15 nln sisailyttamista DNA:han suuremmassa maarin kasvalmissa kuln normaallsolukossa. Chen [Trends Biochem. Scl. 7 (1982) 364 - 365] kuvaa sydpaa tukahduttavan peptidin eristamista veslvatsanesteesta. Redding ja Schally [Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (1982) 7 014 -7 018] kuvaavat yhden 20 tai useamman peptidin, joilla on antimitogeeninen vaikutus useita normaali- ja kasvainsolulinjoja vastaan, eristamista sikojen hypotalamuksista. Sone et al. [Gann. 75 (1984) 920 - 928] kuvaavat ihmisen makrofagien tuottamien yhden tai useamman tekijan tuottamista, jotka estavat tiettyjen 25 kasvainsolujen kasvua in vitro. Ransom et al. [Cancer Res.

45 (1985) 851 - 862] kuvaavat leukoregulliiniksi kutsutun tekijan eristamista, joka estaa tiettyjen kasvainsolulin-jojen replikoitumista ja nayttaa olevan eri aine kuln lym-fotoksiini, interferoni ja interleukiini 1 ja 2. Useimpia 30 naista tekijOista ei ole karakterisoitu taydellisesti, eika niiden primaarirakennetta tunneta.

Aggarwal et al. [J. Biol. Chem. 259 (1984) 686 -691] ovat puhdistaneet ja karakterisoineet lymfoblastoidi-solulinjan tuottaman ihmislymfotoksiinin (LT) ja sekven-35 soineet sen mydhemmin [Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 260 3 91484 (1985) 2 334]. Gamma-Interferonla (/-IF), jota tuottavat lymfoidisolut ja jolla on immuunijarjestelmaa saateleva ja kasvaimia estava vaikutus, on tuotettu kloonauksen ja 11-mentamisen kautta (Gray et al., Nature 295 (1982) 503 -5 508). Tuumorin nekrooslteklj3 (TNF), joka estaa joldenkln kasvalnten kasvua ja jota tuottavat makrofaglt ja tietyt leukemlasolullnjat, on karakterlsoltu, ja TNF-cDNA on kloonattu ja saatettu ilmentymaan E. colissa [Pennica et al., Nature 312 (1984) 724].

10 KekslntO koskee menetelmaa uuden, leukosyyteista saatavlssa olevan peptiditekijan valmlstamiseksl. T3113 tekljaiia on kayttoa solujen kasvun saatelyssa, kuten kas-vainsolujen kasvun estamisessa ja normaallen fibroblastlen kasvun stimuloinnissa, ja se saattaa saadelia immuunitoi-15 mintoja. Τ3πι3η tekijan aminohapposekvenssi on selvasti erilainen kuin muilla yhdisteilia, joilla on ilmoitettu olevan vastaavia ominaisuuksia.

Kuvio 1 esittaa onkostatiini M:n fragmenttlen ami-nohapposekvenssej a; 20 kuvio 2 on sarja mikroskooppivalokuvia onkostatiini M:lia kasitellyista soluista, jossa (A-C) ovat A375-mela-noomasoluja, jotka on kasitelty 0, 5 ja vastaavasti 100 GIA-yksik61ia, ja (D-F) ovat W138-fibroblasteja, jotka on kasitelty 0, 5 ja vastaavasti 100 GIA-yksik01ia; ja 25 kuvio 3 on valokuva onkostatiini M:n SDS-PAGE-ana- lyysista.

Tarkemmin sanottuna keksintO koskee menetelmaa solu jatteista ja muista leukosyyttiproteiineista oleellises-ti vapaan onkostatiini M:n valmlstamiseksl, jolla on kyky 30 estaa kasvainsolujen proliferaatiota ja stimuloida ihmisen normaallen fibroblastien proliferaatiota, ja joka ei inhi-boi ihmisen proliferatiivisia eika sytotoksisia T-soluvas-teita eika granulosyyttisten/myelosyyttisten luuydinpesa-kesolujen muodostumista, ja jonka molekyylipaino on 17 -35 19 kD maaritettyna geeliekskluusiokromatografialla ja noin 4 91484 28 kD maaritettyna SDS-PAGE:11a, ja joka kestaa kasittelyn 1 N etikkahapolla ja 1 N ammonlumhydroksldllla ja 56 °C:n lSmpOtilaa yhden tunnin ajan. KeksinnOn mukaiselle mene-telmaile on tunnusoinalsta, etta 5 a) eristetaan leukosyytit, kuten histiosyyttlset lymfoomasolut tal normaallt ihmisen perlfeerisen veren lymfosyytlt, imettavaissoluviljelmasta tal imettavaisesta; b) aktlvoidaan leukosyytit indusoivalla aineella, kuten ingenolilla, forbolilla tal mitogeenilla; ja 10 c) eristetaan kromatografisesti aktivoiduista leukosyyteista onkostatiini M puhtaana muusta solumate-riaalista.

Leukosyytteja, joista onkostatiini M:aa voidaan saada, ovat esimerkiksi stimuloidut U937-solut tai stimu-15 loidut normaallt ihmisen aareisverilymfosyytit (PBL), joi-den kasvualustoihin tekijaa erittyy.

Polypeptidifragmentteja, jotka ovat vahintaan 8 aminohappoa kasittavia polypeptideja, jotka ovat biologisesti aktiivisia ainakin siina mielessa, etta ne reagoi-20 vat immunologisesti ristiin luonnossa esiintyvan onkostatiini M:n kanssa, esitetaan FI-patenttihakemuksessa 911 853. Immunologisesti ristireagoivalla tarkoitetaan sita, etta polypeptidin indusoima vasta-aine reagoi ristiin al-kuperaisen kokonaisen onkostatiini M:n kanssa ainakin on-25 kostatiini M:n ollessa denaturoituneessa tilassa. Nama po-lypeptidit ovat siksi kayttOkelpoisia vasta-aineiden in-dusointiin onkostatiini M:lle, joita vasta-aineita voidaan kayttaa onkostatiini M:n pitoisuuden maarittamiseen eli-mistOn nesteesta, onkostatiini M:n sitomiseen ja siten sen 30 aktiivisuuden saatelyyn ja onkostatiini M:n puhdistami-seen, esimerkiksi affiniteettikolonnissa kayttamaiia. Osassa polypeptideja voi sailya myOs alkuperaisen kokonaisen onkostatiini M:n solujen kasvua saateleva vaikutus, tosin tama aktiivisuus voi olla saadelty, tavallisesti 35 alentunut alkuperaiseen kokonaiseen onkostatiini M:aan verrattuna.

5 91484

Kuvio 1 esittaa onkostatiini Μ:n kanssa ristirea-goivien poly(aminohappojen) aminohapposekvenssej a; ensim-mainen sekvenssl edustaa onkostatiini M:n N-paata.

Taman keksinnOn tarkoituksia vårten erilaiset ami-5 nohapot jaetaan joukoksi alaryhmia. Alaryhmat osoitetaan seuraavalla taulukolla: alifaattiset neutraalit

polaarittomat G A P V L I

10 polaariset S T C M N Q

happamat D E

emaksiset K R

aromaattiset F Η Y W

15 U937-solut ovat histiosyyttisesta lymfoomasolulin- jasta johdettu solulinja [Sundstrttm ja Nilsson, Int. J. Cancer 17 (1976) 565 - 577], joka voidaan indusoida eri-laistumaan soluiksi, joilla on makrofagien ominaispiirtei-ta, kasittelemaiia erilaisilla aineilla [Harris et al., 20 Cancer Res. 45 (1985) 9 - 13]. Onkostatiini M:n tuottami-seksi U937-soluja voidaan kasvattaa tavanomaisessa, seeru-mia sisaitavassa ravintoalustassa ja kasitelia asianmukai-sella indusoijalla. On katevaa kayttaa forboleja tai in-genoleja, erityisesti 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-ase-25 taattia (TPA). Tavallisesti voidaan kayttaa noin 5-20 ng/ml indusoijaa. Solujen alkulukumaara on noin 105 - 106 solua/ml.

Kun soluja on kasitelty indusoijalla riittava aika, yleensa 3-6 vrk, supernatantti poistetaan, solut pestaan 30 seerumittomalla kasvualustalla, kiinnittyneet solut pestaan uudelleen seerumittomalla kasvualustalla ja solujen annetaan inkuboitua vahintaan 12 tuntia, yleensa korkein-taan noin 48 tuntia, seerumittomassa ravintoalustassa, esimerkiksi RPMI 1640 -alustassa. Sitten otetaan talteen 35 supernatant!t, ja solut poistetaan sentrifugoimalla. So- 6 91484 luttomista supernatanteista tutkittiin solujen kasvua es-tSvS aktiivisuus (GIA) kokeellisessa osassa kuvattavalla tavalla. Supernatantti sis&ltaa noin 50 - 500 GIA-yksik-koa/ml (GIA-yksik£>n maaritelma esitetaan kokeellisessa 5 osassa).

Onkostatiini M:éa voidaan saada my6s mitogeenilla stimuloiduista normaaleista ihmisen SSreisverilymfosyy-teista (PBL). PBL:t voidaan eristaa leukofraktioista lai-mentamalla fraktiot ja sentrifugoimalla ne Ficoll-gradien-10 teilla. Gradientin rajapinnalta talteenotetut solut pes-taan ja iskuhajoitetaan punaisten verisolujen poistami-seksi. Jaijelle jaaneet solut otetaan talteen liuoksesta sentrifugoimalla, suspendoidaan takaisin seerumia ja trom-biinia sisaitavaan puskuriin, sekoitetaan ja verihiutale-15 aggregaatin annetaan laskeutua vahan aikaa. Suspendoitu- neet solut siirretaan pois, otetaan talteen sentrifugoimalla, suspendoidaan takaisin seerumiin ja siirretaan nai-lonvillaa sisaitavaan kolonniin. Kolonnia inkuboidaan mo-nosyyttien ja B-lymfosyyttien kiinnittymisten mahdollista-20 miseksi ja pestSSn sitten. Useimmat Såreisveren T-lymfo-syytit eivat kiinnity ja huuhtoutuvat siten pois. Naita soluja viljeltiin lampOtilassa 37 °C kasvualustassa, esi-merkiksi RPMI 1640 -alustassa, ja kasiteltiin asianmukai-sella indusoijalla, esimerkiksi fytohemagglutiinilla (noin 25 1-5 mg/1) noin 100 tuntia, ja sitten supernatantit otet- tiin talteen. Supernatantit sentrifugoitiin solujen pois-tamiseksi ja konsentroitiin esimerkiksi ultrasuodattamalla tai dialysoimalla.

Kun soluvapaa supernatantti on eristetty joko U937-30 soluista tai normaaleista PBL:ista, kasitelty alusta kon-sentroidaan, katevSsti ontelokuitujSrjestelmaa tai ultra-suodatuskalvoa kåyttamålia, minka jalkeen se laimennetaan etikkahapolla (etikkahappopitoisuuteen 0,1 N), konsentroi-daan noin 10-kertaiseen pitoisuuteen ja toistetaan laimen-35 nus ja konsentrointi. Konsentraatti voidaan kylmakuivata 7 91484 ja kayttaa suoraan, tai kylmakuivattu tuote voidaan puh-distaa edelleen.

Onkostatiini M voidaan puhdistaa geelipermeaatio-kromatografiamenettelylia kayttamaiia vesiliuosta, joka 5 sisaitaa 40 % asetonitrlina ja 0,1 % tri fluor ietikkahap-poa, isokraattisena liikkuvana faasina Bio-sil TSK250 -kolonnissa ja seuraamalla kunkin fraktion aktiivisuutta. Puhdistamalla saadaan koostumus, joka sisaitaa vahintaan noin 0,5 - 5 x 104 GIA-yksikkiSa/ml aktiivisissa fraktiois-10 sa.

Geelipermeaatiokromatografiasta saatu, osittain puhdistettu tuote voidaan puhdistaa edelleen kayttamaiia RP-HPLC:ta (kaanteisfaasikorkeapainenestekromatografiaa), jossa kaytetaan lineaarista gradienttia, jossa primaari-15 liuottimena on 0,l-%:inen trifluorietikkahappo vedessa ja sekundaarisena liuottimena asetonitriili, joka sisaitaa 0,1 % trifluorietikkahappoa. Ohjelma voi olla vaihteleva; yleensa kromatografia vie noin 3-4 tuntia, suurimman osan ajasta, yli 50 % ja korkeintaan noin 80 % ajasta, 20 sekundaarisen liuottimen osuus on 30 - 45 %; aktiiviset fraktiot eluoituvat naissa olosuhteissa asetonitriilipi-toisuuden ollessa noin 41 - 42 %.

Yhdistetyt aktiiviset fraktiot voidaan puhdistaa edelleen toistamalla RP-HPLC muuttaen nopeammin gradient-25 tiolosuhteita ja kayttaen pienempaa virtausnopeutta. Nais sa olosuhteissa aktiivisuus eluoituu asetonitriilipitoi-suuden ollessa noin 40,5 - 41,5 %.

RP-HPLC voidaan sitten toistaa muuttamalla liuotin-systeemi sellaiseksi, etta sekundaarisena liuottimena on 30 0,1 % trifluorietikkahappoa sisaitava n-propanoli. Kayte taan lineaarista gradienttia, jossa n-propanolin pitoisuus muuttuu hitaasti 23 %:sta 35 %:iin. Paaosa aktiivisuudesta eluoituu propanolipitoisuudessa 25,5 - 27,5 %, jolloin saadaan suurin piirtein homogeeninen tuote, jonka ominais-35 aktiivisuus on yli 10 GIA-yksikkoa/ng proteiinia. Tuote 8 91484 puhdistetaan tavallisesti silia tavalla, etta ominaisak-tiivisuudeksi saadaan våhintaan noin 100 GIA-yksikkOå/ng proteiinia, tavallisemmin 150 GIA-yksikkoa/ng.

KeksinnOn mukalsestl saaduille yhdisteille on luon-5 teenomaista se, etta nilden molekyyllpaino on noln 17-19 kD (kilodaltonia), erityisesti noin 18 kD, maaritettyna molekyylikoon mukaan erottavalla kromatografialla. Yhdisteille on lisaksi luonteenomaista se, etta niiden naennai-nen molekyylipaino on noin 28 kD maaritettyna polyakryy-10 liamidigeelielektroforeesilla pelkistavissa tai pelkista-mattdmissa olosuhteissa.

Puhdistetun onkostatiini M:n fragmenttien aminohap-posekvenssit analysoitiin. Onkostatiiniin aminohapposek-venssit ovat suurin piirtein kuviossa 1 esitetyn kaltai-15 set. Kuviossa 1 ensimmåinen sekvenssi valaisee onkostatiini M:n N-paata, kun taas muut sekvenssit valaisevat polypeptidin sisaisia fragmentteja. Myfihemmin suoritetus-sa tarkemmassa analyysisså cDNA-klooneja sekvenssoimalla saadut aminohapposekvenssit, jotka tulivat Suomessa julki-20 siksi 15. huhtikuuta 1993, eroavat jonkin verran kuvion 1 sekvensseista, mika ei ole mitenkaan hammastyttavaa, silia eri menetelmilia saadut sekvenssit usein eroavat toisis-taan jonkin verran. cDNA-klooneja sekvenssoimalla saadut aminohapposekvenssit esitetaan seuraavassa, jolloin amino-: 25 hapoista kaytetaan kolmikirjaimisia lyhenteita. Kuten ku viossa 1, ensimmåinen sekvenssi valaisee onkostatiini M:n N-paata, kun taas muut sekvenssit valaisevat polypeptidin sisaisia fragmentteja.

30 1 5 10

Ala-Ala-Ile-Gly-Ser-Cys-Ser-Lys-Glu-Tyr-Arg-Val-Leu-Leu-15 20 25

Gly-Gln-Leu-Gln-Lys-Gln-Thr-Asp-Leu-Met-Gln-Asp-Thr-Ser-30 35 35 Arg-Leu-Leu-Asp-Pro-Tyr-Ile, 9 91484 15 10

Gln-Arg-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Asp-Leu-Glu-Arg-Ser-Gly-Leu- 5 15 20

Asn-Ile-Glu-Asp-Leu-Glu-Lys ja 15 10

Leu-Arg-Glu-His-Cys-Arg-Glu-Arg-Pro-Gly-Ala-Phe-Pro-Ser- 10 15 20

Glu Glu-Thr-Leu-Arg-Gly jolssa Ala on alaniini, Cys on kysteiini, Asp on aspara-15 giinihappo, Glu on glutamilnihappo, Gly on glysiini, His lOon histidiini, Ile on isoleusiini, Lys on lysiini, Leu on leusiini, Met on metioniini, Asn on asparagiini. Pro on proliini, Gin on glutamiini, Arg on arginiini, Ser on se-riini, Thr on treoniini, Val on valiini ja Tyr on tyrosii-20 ni.

Eristettyé onkostatiini M:aa sisSltåvSt aktiiviset valmisteet sisaisivat seosta, jossa oli runsasmannoosista ja monimutkaista N-sidottua oligosakkaridia. Glykosyloitu-mattomat onkostatiini M-valmisteet olivat kuitenkin my6s 25 solujen kasvua saatelevasti vaikuttavia.

Kuten aikaisemmin on mainittu, onkostatiini M:lle on lisaksi luonteenomaista aktiivisuus tiettyja solukanto-ja vastaan. KeksinnOn mukaisesti saatavalta polypeptidilta puuttuu sytotoksinen vaikutus WI26- ja Wl38-ihmisfibro-30 blasteja, tuumorin nekroositekijaile herkkia hiiren L929- soluja ja/^-interferonille herkkaa ihmisen kasvainsolulin-jaa vastaan. On myOs havaittu, ettei se esta normaalien ihmisen T-lymfosyyttien proliferaatiota eika granulosyyt-ti/myelosyyttipesakkeiden muodostumista luuydinsoluista

35 pitoisuuksiin 100 GIA-yksikkOa/ml asti. Onkostatiini M

10 91484 stimuloi lisaksi normaalien ihmisen fibroblastien, joista esimerkkeina ovat WI38 ja Wl26-solut, proliferaatiota ja estaa kasvainsolujen, kuten A375-, HBT10-, A549- ja SK-MEL28-solujen, proliferaatiota ja saattaa edistaa pesak-5 keitfi muodostavien solujen kasvua normaalista luuytimesta. Onkostatiini M ei vaimentanut ihmisen proliferatiivisten tai sytotoksisten T-solujen reaktioita leukosyyttiseosvil-jelmareaktioissa (MLC) pitoisuuksina 500 GIA-yksikktta/ml.

KeksinnOn mukaisesti saatavan polypeptidin amino-10 happosekvenssi voidaan maarittaa kokonaan kayttamaiia myynnissa olevia sekvenaattoreita. Polypeptidi voidaan sitten syntetisoida tunnetuin menetelmin, kayttamaiia sa-moin myynnissa olevia automaattisia syntetisointilaittei-ta.

15 KeksinnOn mukainen polypeptidi voitaisiin vaihtoeh- toisesti valmistaa yhdistelma-DNA-menetelmin. Osittaisesta aminohapposekvenssista voidaan paatelia koettimia, joita voidaan sitten kayttaa ihmisgenomikirjaston seulomiseen. Kirjasto voi olla cDNA-tai kromosomikirjasto. Kun koetti-20 men kanssa pariutuvat yksi tai useampi klooni on identi-fioitu, voidaan kiinnostuksen kohteena olevan geenin si-saitavat fragmentit identifioida erilaisin tavoin ja kasi-telia niita lukuisin tavoin. Fragmentin kokoa voidaan pie-nentaa endonukleaasipilkonnalla ja kloonata tuloksena ole-25 vat fragmentit ja tutkia niista halutun geenin lasnaolo. Soluja, jotka tuottavat haluttua peptidia tai tuottavat sita kohonneina maarina, voidaan kayttaa mRNA:n tuotan-toon. mRNA:sta voidaan valmistaa yksisaikeinen cDNA. Tama cDNA voidaan sitten pariuttaa kokonais-mRNA:n kanssa, joka 30 on peraisin solusta, joka tuottaa vahan, mikali ollenkaan, polypeptidia. Pariutumaton cDNA voidaan sitten eristaa ja kayttaa kaksisaikeisen cDNA:n valmistukseen, joka voidaan tutkia koettimien avulla.

DNA-fragmentit voidaan vaihtoehtoisesti insertoida 35 gtllreen, niin etta koodaavat fragmentit voivat olla β- 11 91484 galaktosidaasigeenin peråsså ja samassa kehyksesså sen kanssa. Onkostatiini M -polypeptidille voidaan valmistaa vasta-aineita ja kayttaa nilta tuloksena olevien fuusioi-tujen proteiinien ristireaktiivisuuden tutkimiseen. Talla 5 tavalla voidaan kekslnndn mukaisestl saatavaa polypeptldia tal sen fragmenttia koodaavla fragment te ja tunnlstaa ja kayttaa halutun geenln Identlflsolntlln.

Kun koko geenl on identifioitu, joko cDNAina tal kromosom!-DNA:na, sita voidaan kasitelia eri tavoin ilmen-10 tymisen aikaansaamiseksi. Kun geenl on maara saattaa 11-mentymaan isannassa, joka on tunnistanut villia tyyppia olevat onkostatiini M:n kopiointia ja luentaa saatelevat alueet, voidaan koko geenl villin tyypin 5'- ja 3'-saate-lyalueineen vieda sopivaan ilmentymisvektoriin. On ole-15 massa erilaisia ilmentymisvektoreita, jotka kayttavat ni-sakkaiden virusten, kuten Simianvirus 40:n, adenoviruk-sen, naudan papilloomaviruksen, vacciniaviruksen, hyiSn-teisten bakuloviruksen jne., replikoitumisjarjestelmia. Naita replikoitumisjarjestelmia on kehitetty, jotta saa-20 taisiin markkereita, jotka mahdollistavat transfektanttien valikoinnin samoin kuin katevien restriktiokohtien, joihin geenl voidaan insertoida, aikaansaannin.

Kun geeni on maara saattaa ilmentymaan isannassa, joka ei tunnista luonnossa esiintyvia villin tyypin kopi-25 oita ja luentaa saatelevia alueita, tarvitaan lisakasitte-lya. Tunnetaan erilaisia katevia 3'-paan kopioinnin saa-telyalueita, joita voidaan sij.oittaa lopetuskodonien jai-keen. Koodaamaton 5*-paan alue voidaan poistaa rakennegee-nin edelta endonukleaasirestriktiolla, Bal31-resekoinnilla 30 tms. Kun rakennegeenin 5'-paan lahelia on kateva restrik-tiokohta, voidaan vaihtoehtoisesti irrottaa rakennegeeni ja kayttaa adaptoria rakennegeenin kytkemiseksi promootto-rialueeseen, jolloin adaptori tuo mukanaan rakennegeenin menetetyt nukleotidit. Voidaan kayttaa erilaisia strate-35 gioita ilmentymisvektorin aikaansaamiseksi, jossa on ko- 12 91484 piointisuunnassa 5':sta 3':een kopioinnin ja luennan aloi-tusalue, johon voi sisaitya myOs saatelysekvensseja, jotka mahdollistavat saatelyn Induktion, rakennegeeni, jonka luenta ja kopiointi on initiaatioalueen ohjauksessa, ja 5 kopioinnin ja luennan lopetusalue.

Tyypillisiin kopioinnin aloitusalueisiin tai pro-moottoreihin kuuluvat β-gal-promoottori, TAC-promoottori, lambdafaagin vasen ja oikea promoottori jne. bakteereja vårten; glykolyyttisten entsyymien promoottorit, kuten 10 ADH-I ja -Il-promoottorit, GPK-promoottori, PGI-promoot-tori, TRP-promoottori jne. hiivoja vårten; SV40:n varhai-nen ja myOhainen promoottori, adenoviruksen myOhåinen paapromoottori jne. nisakassoluja vårten. Kuten jo mainit-tiin, ilmentymisyksikkO voidaan sisailyttaa replikoitumis-15 jarjestelmaan episomin yliapitamiseksi sopivassa soluisan- nassa, tai se voi olla ilman replikoitumisjarjestelmaa, jolloin se voi integroitua isannan genomiin. DNA voidaan tuoda isantaan tunnetuin menetelmin, kun transformaatiol-la, jossa kaytetaan kalsiumfosfaatilla saostettua DNA;ta, 20 transfektiolla, jossa solut saatetaan kosketukseen viruk-sen kanssa, mikroinjektoimalla DNA soluihin tms. tavalla.

Kun rakennegeeni on viety sopivaan isantaan, isan-taa voidaan viljelia, ja saada aikaan rakennegeenin ilmen-tyminen. Joissakin tapauksissa voi olla toivottavaa si-25 joittaa signaalisekvenssi (erittymisesijakso) rakennegee nin edelle ja samaan lukukehykseen sen kanssa, joka sek-venssi saa aikaan rakennegeenin erittymisen ja erittymis-esijakson irtoamisen, niin etta saadaan aikaan valmiin polypeptidin erittyminen supernatanttiin. Ellei aiheuteta 30 erittymista, isfintasolut voidaan kerata talteen, hajottaa tavanomaisella tavalla ja puhdistaa tavanomaisin menetelmin, kuten kromatografisesti, elektroforeettisesti, liuo-tinuutolla tms. tavalla.

KeksinnOn mukaisesti valmistettuja yhdisteita voi-35 daan kayttaa hyvin monel la tavalla seka in vivo etta in 91484 13 vitro. Yhdisteita voidaan kayttaa vasta-aineidensa val-mistukseen, joita vasta-aineita voidaan kayttaa in vitro tai in vivo. Vasta-aineita voidaan valmistaa tavanomaisin menetelmin, esimerkiksi kayttSmailå keksinndn polypeptidiå 5 immunogeenina ja injektoimalla sita nisakasisantaan, esimerkiksi hiireen, lehmaan, vuoheen, lampaaseen, kaniiniin jne., erityisesti apuaineen, esimerkiksi taydellisen Freundin apuaineen, alumiinihydroksidigeelin tms., kanssa. Isannasta voidaan sitten ottaa verta ja kayttaa se poly-10 klonaalisten vasta-aineiden eristamiseen, tai hiiren ol-lessa kyseessa fuusioida aareisveren lymfosyytit tai per-nan lymfosyytit (B-solut) sopivan myeloomasolun kanssa kromosomien tekemiseksi kuolemattomiksi keksinndn mukai-sille yhdisteille spesifisten monokloonaalisten vasta-ai-15 neiden tuottamiseksi.

Voidaan valmistaa joko polyklonaalisia tai mono-klonaalisia vasta-aineita, joita voidaan sitten kayttaa diagnostisoitiin tai kyseessa olevan polypeptidin detek-tointiin naytteesta, kuten soluista tai fysiologisesta 20 nesteesta, kuten veresta. Vasta-aineita voidaan kayttaa myds affiniteettikromatografiassa kyseesså olevan polypeptidin puhdistamiseksi ja sen eristamiseksi luonnon tai synteettisesta lahteesta. Vasta-aineita voidaan kayttaa myds saatamaan soluihin liittyvan kyseessa olevan polypep-25 tidin maaraa viljelmassa tai in vivo, mita kautta voidaan saadelia solujen kasvua.

Keksinndn mukaisesti valmistettua yhdistetta voidaan kayttaa ligandina taman yhdisteen reseptorien lasnå olon havaitsemiseen. Tålla tavalla reseptorit voidaan 30 erottaa toisistaan tamån yhdisteen reseptorien lasna olon ja niiden tiheyden suhteen seuraamalla erilaisten yhdis-teiden vaikutusta tailaisten reseptorien lasna oloon.

Keksinndn mukaisesti valmistettua yhdistetta voidaan kayttaa in vitro -viljelmissa estamaan taile polypep-35 tidille herkkien solujen tai solulinjojen, jotka reagoivat 14 91484 eri tavalla kuin epaherkat solut, kasvua. Heterogeenisista soluseokslsta tai solulinjoista voidaan talla tavalla polstaa epatoivottavat solut, kun epdtolvottavat solut ovat herkkia naille polypeptidille. KeksinnOn mukaisesti 5 valmistettua polypeptidia voidaan antaa in vivo kasvainti-lojen ollessa kyseessa, esimerkiksi injektioina, kasvai-mensisaisesti, peritoneaalisesti, ihonalaisesti tms. tavalla. Yhdistetta voidaan kayttaa in vitro poistamaan pa-hanlaatuisia soluja autologisiin luuydinsiirtoihin kaytet-10 tavasta luuytimesta tai estamaan muussa kudoksessa, esimerkiksi veressa, olevien pahanlaatuisten solujen prolife-raatiota tai poistamaan ne ennen uudelleeninfusointia.

Keksinnttn mukaisesti saatua polypeptidia voidaan kayttaa myiJs vammojen, kuten ihovammojen, sarveiskalvovam-15 mojen ja erilaisten mulden epiteeli- ja peruskudosvammo-jen, kuten kroonisten haavaumien, palovammojen, leikkaus-haavojen, tapaturmaisten vammojen ja onttojen, epiteelin peittamien elinten, kuten ruokatorven, mahalaukun, pienten ja isojen suolien, suun, sukuelinten ja virtsateiden vam-20 mojen hoitamiseksi. Potilaille annetaan paikallisesti hoi-tokoostumusta, joka sisaitaa onkostatiini M:aa fysiologisesti hyvaksyttavassa kantajassa.

Onkostatiini M:aa sisaitavaa koostumusta voidaan kSyttéa monien erilaisten vammojen, suurin piirtein kaikki 25 ihovammat, sarveiskalvovammat ja epiteelin peittamien onttojen elinten vammat mukaan luettuina, hoitoon. Hoidetta-viksi soveltuviin vammoihin kuuluvat tapaturmien seurauk-sena syntyvat vammat, kuten palovammat, hankautumat, leik-kaushaavat tms., samoin kuin kirurgisista toimenpiteista, 30 kuten leikkauksista ja ihonsiirroista seuraavat vammat. Muihin onkostatiinia sisaitavilia koostumuksilla hoidetta-viksi soveltuviin tiloihin kuuluvat krooniset tilat, kuten krooniset haavaumat, sokeritautiin liittyvat haavau-mat ja muut parantumattomat (troofiset) tilat.

35 15 91484

Onkostatiini M:aa voidaan sisailyttaa fysiologisesti hyvaksyttaviin kantajiin vaurioituneelle alueelle le-vittamista vårten. Kantajien luonne voi vaihdella suures-ti ja riippuu kulloisestakin antokohdasta. Iholle tapah-5 tuvaa antamista vårten on tavallisesti edullinen voide-tai salvapohja: soveltuviin pohjiin kuuluvat lanoliini,

Silvadene (Marion) (erityisesti palovammojen hoitoon), Aguaphoe (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) tms. Onkostatiini M:aa sisaitavia koostumuksia voidaan ha-10 luttaessa sisailyttaa siteisiin ja muihin vanunojen peitta-miseen tarkoitettuihin tuotteisiin vamman kasittelemiseksi jatkuvasti peptidilia. MyOs aerosolisovellutuksia voidaan kayttaa.

Polypeptidin pitoisuus hoitokoostumuksessa ei ole 15 ratkaiseva. Polypeptidia tulee olla lasna epiteelisolujen proliferaation indusoiva maara. Koostumuksia annetaan pai-kallisesti vaurioituneelle alueelle, tyypillisesti silma-tippoina silmaan tai voiteina, salvoina tai maitoina iholle. Silmien ollessa kyseessa on toivottavaa toistaa kasit-20 tely tiheasti, tavallisesti 4 tunnin vaiein tai tiheammin. Ihon ollessa kyseessa on toivottavaa pitaa hoitokoostumus-ta vaurioituneelle alueella jatkuvasti parantumisen aikana levittamaiia hoitokoostumusta 2-4 kertaa vuorokaudessa tai useammin.

25 Kaytettava maara keksinnOn mukaisesti valmistettua polypeptidia vaihtelee antotavan, muiden aktiivisten yh-disteiden kaytOn tms. mukaan ja on yleensa noin 1 - 100 pg. Polypeptidia voidaan kayttaa yhdessa fysiologisesti hyvaksyttavan kantajan, kuten fysiologisen suolaliuoksen, 30 fosfaattipuskuroidun suolaliuoksen tms. kanssa. Yhdisteen kayttiSmaara maaritetaan kokeellisesti solujen reagoinnin in vitro ja koe-eiainten vasteen keksinnOn mukaisille po-lypeptideille tai niita sisaitaville formuloille perus-teella. Yhdisteita voidaan kayttaa yksinaan tai yhdistet-35 tyina muihin kasvutekijOihin, inhibiittoreihin tai immuno- 16 91484 modulaattoreihin, kuten TNF:S3n, IL-2:een, -interferonlin, monoklonaalisiin vasta-aineisiin jne. NSiden muiden yhdisteiden madrat ovat yleensd alueella 1 - 100 pg. Voi-daan valmistaa yhdisteiden konjugaatteja tiettyyn kohtaan 5 ohjautuvien ryhmien, esimerkiksi vasta-aineiden, kanssa, jolloin vasta-aineet voivat olla spesifisia tietyille pa-hanlaatuisille soluille tai tietyille elimille. Seuraavat esimerkit annetaan keksinnOn valaisemiseksi eika niilia ole tarkoitus rajoittaa sita.

10 Kokeellinen osa

Materiaalit 1a menetelmat U937-soluista erlstetty onkostatiini M: kasvainso-lulen kasvun lnhibiittorin tuottaminen histiosvvttisesta lvmfoomasolulinjasta 15 U937-soluja, histiosyyttista lymfoomasolulinjaa [SundstrOm ja Nilsson, Int. J. Cancer 17 (1976) 565 - 577] viljeltiin 850 cm2:n pyOrityspulloissa (Corning C2540) pi-toisuuteena 4 x 10s solua/ml kaikkiaan 300 ml:ssa RPMI 1640 -alustaa, joka oli tåydennetty 10 %:lla naudan sikiOseeru-20 mia (FCS), penisilliini/streptomysiinilia (PS), L-gluta-miinilla ja 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatilla (TPA, 10 ng/ml). Neljån vuorokauden kuluttua FCS:S3 ja TPA:ta sisSltSvat supernatantit poistettiin, pyOrityspul-lot pestiin viidesti seerumittomalla RPMI 1640:113 ja ir-25 ronneet solut (1 x 10s solua/ml) pestiin kolmesti seerumittomalla alustalla ja ne lisattiin takaisin pulloihin, jolloin lopputilavuudeksi tuli 125 ml seerumitonta RPMI 1640 -alustaa pydrityspulloa kohden. Vuorokauden kuluttua otettiin talteen supernatantit, sentrifugoitiin ne solujen 30 poistamiseksi, suodatettiin 0,45 μπκη Nalgene-suodattimen 13pi ja konsentroitiin kaytt3m31ia ontelokuitujSrjestelméa (Amicon-patruuna HIP10-20), jolloin lopputilavuudeksi tuli 150 ml (alkutilavuus 1500 ml). Onkostatiini M:&£ eristet-tiin myiJs 150 cm2:n kudosviljelypulloissa olevien, seeru-35 mittomalla TPA:11a kSsiteltyjen U937-solujen supernatan- 17 91484 teista. Supernatantti konsentroitiin Amicon Diaflo -kal-volla PM-10 (lSpSisyraja 10 kD) ja dialysoitiin. Dialyysin jaikeen konsentraatti laimennettiin etikkahapolla siten, etta tuloksena oli etikkahappopitoisuus 0,1 N 500 ml:n 5 tilavuudessa, ja konsentroitiin Amicon PM 10 -suodatinta kayttamana 50 ml:ksi. Tama konsentraatti (50 ml) laimennettiin 400 ml:ksi 0,1 N etikkahapolla ja konsentroitiin 40 ml:ksi samalla suodattimella. Konsentraatti laimennettiin 1 N etikkahapolla, ja syntyva sakka poistettiin sent-10 rifugoimalla. Saatu konsentraatti pakastettiin ja kylma- kuivattiin. Kylmakuivattua materiaalia kaytettiin puhdis-tusvaiheisiin.

Geellpermeaatiokromatoarafia

Bio-sil TSK-250 -kolonnin (600 x 21,5 mm) (BioRad) 15 liitettiin korkeapainenestekromatograflajSrjestelmSSn.

Raakafraktio (10 mg/ml) liuotettiin vesiliuokseen, joka sisalsi 40 % asetonitriilia ja 0,1 % trifluorietikkahap-poa (0,l-%:inen TFA). Injektoitiin 2 ml:n annos seosta, ja eluoitiin isokraattisesti kSyttåen liikkuvana faasina 20 liuosta, joka sisalsi 40 % asetonitriilia ja 0,1 % TFA:ta vedessa. Virtausnopeus oli 2,5 ml/min ja piirturipaperin liikkumisnopeus 0,25 cm/min. Kerattiin 5 ml:n fraktioita. Kromatografia tehtiin huoneen lampditilassa. Kustakin frak-tiosta otettu nayte haihdutettiin ja siita tutkittiin kol-25 mena rinnakkaismaarityksena A375-solujen kasvua estava ak-tiivisuus (GIA, growth inhibitory activity).

Kuudesta ajosta saadut aktiiviset fraktiot (21 ja 22) yhdistettiin. Yhdistetty materiaali sisalsi kaikkiaan noin 4,8 x 105 GIA-yksikkda. Tekijan naennaisen molekyyli-30 painon havaittiin olevan 18 kD maaritettyna koon mukaan erottelevalla kromatografialla (Bio-sil TSK-250 -kolonni).

TSK-250-fraktioiden RP-HPLC (kaanteisfaasikorkea-painekromatoarafia)

Edel1a kuvatut yhdistetyt TSK-250-fraktiot 21 ja 22 35 laimennettiin kaksinkertaiseen tilavuuteen 0,l-%:isella 18 91484 TFA:11a. TSma seos injektoitiin isokraattisesti μ-Bonda-pak-Cl8-kolonnllle (7,8 x 300 nun) (josta kdytetaan nimi-tysta C181) huoneen lamptttilassa. Virtausnopeus saadettiin arvoon 2,0 ml/min, ja pilrturin nopeus oli 0,25 cm/min.

5 Kaytettiin lineaarista gradienttia primaariliuottimesta (0,1 % TFA:ta) sekundaariseen liuottimeen (asetonitriili, 0,1 % TFA:ta). Gradienttiolosuhteet olivat 0 -> 30 % 10 min:ssa, sitten 30 -> 45 % 150 min:ssa; 45 -> 55 % 20 minrssa, ja 55 -> 100 % 10 min:ssa. Kaikki liuottimet oli-10 vat HPLC-laatua. Kerattiin 4 ml:n fraktioita, ja kustakin fraktiosta otetusta naytteesta tutkittiin kasvua estava aktiivisuus. Fraktioiden 72 - 75 havaittiin sisaitavdn paaosan aktiivisuudesta. Aktiiviset fraktiot eluoituivat asetonitriilipitoisuuden ollessa 41 - 52 %. Fraktiot 72 -15 75 yhdistettiin. Yhdistettyihin fraktioihin lisattiin 16 ml 0,l-%:ista TFA:ta. Seos injektoitiin p-Bondapak-C18-kolonniin (3,9 x 300 nun) (josta kaytetaan nimitysta C182) huoneen lampdtilassa. Virtausnopeus saadettiin arvoon 1 ml/min, ja piirturin nopeus oli 0,25 cm/min. Gradientti-20 olosuhteet olivat 0 -> 35 % 10 min:ssa; 35 -> 45 % 100 min:ssa; ja 45 -> 100 % 10 min:ssa. Kerattiin fraktiot, otettiin niista naytteet, ja naytteista tutkittiin GIA. Suurin osa aktiivisuudesta eluoitui kolonnista asetonitriilipitoisuuden ollessa 40,7 - 41,3 % (retentioaika 83 -25 86 min).

Aktiiviset fraktiot yhdistettiin, laimennettiin kaksinkertaiseen tilavuuteen 0,l-%:isella TFA:11a ja injektoitiin isokraattisesti μ-Bondapak-Cie-kolonnille (3,9 x 300 mm) (josta kaytetaan nimitysta C183) huoneen lampOti-30 lassa. Virtausnopeus oli 1 ml/min, ja piirturipaperin nopeus 0,25 cm/min. Kaytettiin lineaarista gradienttia pri-maariliuottimessa (0,l-%:inen TFA) sekundaariseen liuottimeen (n-propanoli, 0,1 % TFA:ta). Gradienttiolosuhteet olivat 0 -> 23 % 20 min:ssa ja 23 -> 35 % 120 min:ssa. 35 Kerattiin fraktiot ja kustakin fraktiosta otetusta nayt- 19 91484 teesta tutkittiin GIA. Suurin osa aktiivisuudesta eluoltui propanolipitoisuuden ollessa 25-26,5 % (retentloalka 59 min). Tama ilmeisesti homogeenlnen fraktio sisalsi noin 300 ng proteiinia ja noin 40 000 GIA-yksikkOa.

5 Maarltvs. 1ossa tutkltaan solu1en kasvun saatelva kavttamaiia 3H-tvmidiinin sisailvttamista DNAihan (GIA)

Kokeet tehtiin 96-kuoppaisilla, tasapohjaisilla kuoppalevyilia (Costar 3596). Herkkana indikaattorisolu-linjana kaytettiin ihmisen melanoomasoluja (A375). Kuhun-10 kin syvennykseen laitettiin soluja (3 x 103) 1,1 ml:ssa Dulbeccon muunnettua Eagles-alustaa (DMEM), joka oli taydennetty 10 %:lla FCS:aa ja PS:lia. Kolmen tunnin ku-luttua lisattiin kuhunkin kuoppaan 0,1 ml tutkittavaa nay-tetta. Levyja inkuboitiin 37 °C:ssa 3 vrk. Sitten kuhunkin 15 kuoppaan lisåttiin 0,025 ml (0,5 pCi )3H-tymidiiniliuosta (spesifinen aktiivisuus 27 pCi/ug) ja inkuboitiin viela 6 tuntia. Solut siirrettiin sitten lasisuodatinliuskoille kayttamana monikarkipipettia (PHD Cell Harvester, Cambridge Techology, Inc). Suodattimet siirrettiin tuikelas-20 kentapulloihin, joihin lisattiin 2 ml tuikenestetta (ScientiVerse II, Fisher Scientific Co.), ja tehtiin sitten tuikelaskenta 3H-tymidiinin sisailytyksen maarittami-seksi kvantitatiivisesti.

Pehmvtaaarilla tehtava pesakkeiden eston maaritvs- 25 1 TGI) 0,5 ml:n pohjakerros, joka sisaisi 0,5 % agaria (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) DMEM:ssa, joka sisaisi 10 % naudan sikiOseerumia (FCS), lisattiin 24-kuoppaisille Costar-kudosviljelylevyille.

30 Agarpohjakerroksen paaile levitettiin 0,5 ml samaa alusta- FCS-seosta, joka sisaisi 0,3 % agaria, 1 - 2,5 x 103 A375-solua ja tutkittavaa tekijaa erilaisina pitoisuuksina.

Levyja inkuboitiin 37 °C:n lampOtilassa kostutetussa at-mosfaarissa, joka sisaisi 5 % C02 ilmassa, ja lisattiin 35 7 vrk:n kuluttua vieia 0,5 ml samaan alustaan tehtya 20 91484 0,3-%:ista agaria, jossa tekijan pitoisuus oli sama. Pe-sakkeet laskettiin kiinnittamattOmina ja varjaamattOmina, ja laskennassa otettiin huomioon pesakkeet, jotka paivien 7 ja 14 vaiissa sisaisivåt yli 6 solua.

5 Tulokset U937-soluista eristetyn onkostatiini M:n sekvenssit Onkostatiini M:n N-terminaalinen sekvenssi ja sisaiset fragmentit maaritettiin tekemaiia mikrosekvenssi-analyysi pelkistetysta ja S-pyridiinietyloidusta polypep-10 tidista ja peptideista, jotka saatiin pilkkomalla pelkis-tetty ja S-pyridiinietyloitu onkostatiini M entsymaat-tisesti endoproteinaasilla Lys-C ja Staphylococcus aureus V8 -proteinaasilla. Peptidifragmentti puhdistettiin RP-HPLCrlia kayttaen haihtuvia liuottimia. Peptideille teh-15 tiin automaattinen toistuva Edman-hajotus Model 470A -pro- teiinisekvenaattorissa (Applied Biosystems, Inc.). Fenyy-litiohydantoiiniaminohapot analysoitiin RP-HPLC:lia (Applied Biosystems, Inc.) kayttamaiia PTH-C18 -kolonnia (2,1 x 220 mm, ABI) ja eluoitiin kayttaen natriumasetaat-20 tipuskuri-tetrahydrofuraani-asetonitriiligradienttia.

Tuloksena olevat aminohapposekvenssit ovat suurin piirtein kuviossa 1 esitetyn kaltaiset.

Verrattaessa naitå sekvensseja ajan tasalla olevaan proteiinitietokantaan (PIR Release 9,0, toukokuu 1986) , 25 talletettuihin sekvensseihin ei havaittu merkittavaa sek- venssihomologiaa minkaan tunnetun sekvenssin kanssa. Homo-logiaa ei ole mydskaan tuumorin nekroositekijan, lymfotok-siinin, pesakkeita stimuloivan tekijan, interleukiini l:n eika 2:n eika β-transformoivan kasvutekijan kanssa.

30 Kasvainsolujen proliferaation esto ja ihmisen nor- maallfibroblastien proliferaation stimulointi

Kayttamaiia edelia kuvattua pehmytagarpesåkeinhibi-tiokoetta saatiin seuraavia tuloksia: t 21 91484

Taulukko 1 U937-soluista eristetyn, puhdistetun onkostatiini M:n aikaansaama A375-melanoomasolujen pesSkkeenmuodostuksen esto* 5 GIA-yksikkOa/ Pesdkkeiden PesSkkeen muodostuk- kuoppa_lukumaarS_sen esto (% 1_ 250 4 96 83 6 94 27 11 89 10 45 32 69 0 106 *A375-solut siirrostettiin edellå kuvatulla tavalla pehmytagariin tekijan kera tal sita ilman lopputilavuuden 15 ollessa 2 ml. KMytetty faktor! oli C18-propanolikolonnista saatu fraktio, jossa kasvainten kasvua estavé aktiivisuus (GIA) oli korkeimmillaan. Pesakkeiden lukumaara laskettiin 11 vrk:n kuluttua. Pesakkeeksi maariteltiin våhintaan 6 solua sisaitava rykelma. Yksi GIA-yksikk6 maariteltiin 20 siksi maaraksi, joka aiheuttaa 3H-tymidiinin sisailytyksen mikrokuopassa oleviin A375-soluihin 50-%:isen eston edelia kuvatussa kokeessa.

Seuraavassa kokeessa maariteltiin erilaisten, joko kemiallisten tai fysikaalisten, kasittelyjen vaikutus ky-25 seessa olevaan polypeptidiin. Tulokset annetaan seuraavassa taulukossa.

Taulukko 2 TPA-indusoitujen U937-solujen supernatanttien erilaisten 30 kasittelyjen vaikutus kasvainten kasvua estavaan aktiivi-• suuteen*

Supernatantin lopullinen laimennussuhde 1:4 1:8 1:16

Alusta, vertailundyte - - - 39,780 35 KasittelematOn supern. 7,206** 13,896 16,000 1 N etikkahappo 6,670 17,073 18,783 ;· IN NH40H 6,956 15,016 13,923 22 91484 *U937-soluja k&siteltiin TPAtlla (10 ng/ml) 3 vrk, sitten solut pestiin alustalla, inkuboitiin 24 tuntia see-rumittomassa alustassa ja supernatantit otettlin talteen. Supernatantit kasiteltiin 1 N etikkahapolla tal 1 N ammo-5 nlumhydroksidllla (NH40H). Ne dialysoitiin alustaa vastaan ja tutkittiin nilden kyky estaa 3H-tymidiinin sisailytys A375-soluihin. A375-soluja leimattiin 3H-tymidiinilia (3H-TdR) viimeiset 6 tuntia 3 vrk:n inkubointiajasta.

** Tulokset esittSvat 3H-TdR:n sisailytysta pulssei-10 na minuutissa.

Edelia esitetyt tulokset osoittavat, ettei dialy-soidussa supernatantissa oleva onkostatiini M juurikaan inaktivoidu 1 N etikkahapon eika 1 N ammoniumhydroksidin vaikutuksesta. Keksinndn mukaisesti valmistetut yhdisteet 15 ovat siten suhteellisen epSherkkia seka kohtalaisen vah-valle hapolie etta kohtalaisen vahvalle emakselle. Yhdiste kestaa 1 tunnin lampdkasittelyn 56 °C:ssa, muttei 30 min:n kasittelya 90 °C:ssa.

Tutkittiin myOs yhdisteen lampbstabiilisuus ja ha-20 vaittiin, etta yhdisteen aktiivisuus sailyi pidettaessa sita 1 tunti 56 °C:ssa, mutta havisi suurin piirtein koko-naan pidettaessa sita 30 min 90 °C:ssa.

Seuraavassa kokeessa tutkittiin keksinndn mukaisesti valmistettujen polypeptidien kykya estaa erilaisten 25 kasvainsolulinjoja replikoitumista. Tulokset esitetaan seuraavassa taulukossa.

Taulukko 3

Kasvainsolujen replikoitumisen estyminen U937-soluista 30 saadun, puhdistetun onkostatiini M:n vaikutuksesta 30-%:isen inhibition aiheuttava GIA-yksikkOmaara Kasvainsolut 3H-TdR:n otto soluihin A549 (keuhkosydpå) 21 HTB10 (neuroblastooma) 81 35 A375 (melanooma) 0,3 23 91484

Kasvainsolut siirrostettiin mikrokuoppiin 3 tuntia ennen RP-HPLC:lia edellS kuvatulla tavalla puhdistetun onkostatiini M:n lisa&mista erilaisissa suhteissa laimen-nettuna. Viimeisten 6 tunnin ajan 3 vrk:n inkuboinnista 5 soluja, jotka olivat 0,2 ml:ssa alustaa, leimattiin 3H-ty- midlinilia (3H-TdR) (0,5 pCi/syvennys). Yksl yksikkO kas-valnten kasvua estavaa aktiivisuutta (GIA) maarlteltlln taulukon 1 selityksessa maaraksl, joka vahentaa 50 %:lla 3H-TdR:n sisailytysta A375-melanooinasoluihin. Yhden yksi-10 kOn maaritettiin olevan noin 10 pg puhdistettua proteii-nia; siten pitoisuus (ng/ml), joka aiheuttaa 30-%risen inhibition 3H-TdR:n sisailytyksessa A549-, HTB10-ja A375-soluihin oli noin 1,4, 4,0 ja vastaavasti 0,015 ng/ml.

U937-tekija ei vahentanyt 3H-TdR:n sisailytysta ihmisen 15 normaaleihin WI16-fibroblasteihin missaan kokeessa.

Edelia esitetyt tulokset osoittavat, etta onkostatiini M:n kyky estaa replikoitumista on selektiivinen; vaikutus vaihtelee suuresti solun luonteen mukaan. Yhdiste on tehokas melanoomasoluja, kuten A375-melanoomasoluja, 20 suomukeuhkosyOpasoluja, kuten A549-soluja, ja neuroblas- toomasoluja, kuten HTBlO-soluja, vastaan.

Kasvainsoluja siirrostettiin tiheydeksi 3 x 103 so-lua/kuoppa ja normaaleja fibroblasteja tiheydeksi 1,5 x 103 solua/kuoppa 96-kuoppaisille levyille 3 tunnin ajaksi. 25 Lisattiin puhdistettua onkostatiini M:aa, joka saatiin C183-kolonnin siita fraktiosta, jossa oli suurin antiproli-feratiivinen aktiivisuus A375-soluja vastaan, erilaisina pitoisuuksina, ja mitattiin kolmesta rinnakkaisesta kuo-pasta 3H-tymidiinin sisSllytys kussakin pitoisuudessa. Tu-30 lokset esitetddn taulukossa 4.

24 91484

Taulukko 4

Kasvainsolujen proliferaation estyminen ja normaalien fib-roblastien proliferaation edistyminen onkostatiini M:n vaikutuksesta 5 GIA- yksikkba/ inhibitio-% stlmulaatio(%) swennvs A375 WI38

Koe 1 16 83 25 10 4 62 30 1 46 46 A375 HTB10 WI26

Koe 2 27 NT 28 46 9 87 22 36 15 3 76 11 52 A375 A549

Koe 3 75 89 30 25 85 22 8 71 16 20 A375 SK-MEL28

Koe 4 20 87 44 5 75 25 1 59 11 25

Tulokset osoittavat 3H-tymidiinin sisSllytyksen kasvainsoluihin (A375, HTB10, A549 ja SK-MEL28) ja normaa-leihin fibroblasteihin (W126 ja W138) inhibition (%) ja vastaavasti stimulaation (%). Yksi GIA-yksikkO maaritel-30 laan taulukon 1 selityksessa siksi måårSksi onkostatiini M:aa, joka aiheuttaa 3H-tymidiinin sisållytyksen A375-so-luihin estymisen 50 %:lla.

Sen lisaksi, etta vaikutus 3H-tymidiinin sisailytyk-seen kasvainsoluihin on erilainen kuin ihmisen normaalei-35 hin fibroblasteihin, havaitaan myOs erilainen vaikutus morfologiaan ja solulukumaaraan, kun naita kahta solutyyp-pia on kasitelty 3 vrk onkostatiini M:lia, kuten kuviosta 2 ilmenee.

Kaytetty onkostatiini M saatiin HPLC-C183-kolonnin 40 siita fraktiosta, jossa A375-solujen proliferaatiota esta-va aktiivisuus oli suurimmillaan. Kuvio 2 on sarja mik-roskooppivalokuvia A375-melanoomasoluista, jotka olivat 25 91484 kåsittelemåttGmia (A), joita oli kasitelty 5 GIA-yksi-kGlia (kasvua estava aktiivisuus -yksikGlia) onkostatiini M:aa (B) ja joita oli kasitelty 100 yksikGlia (C), seka mikroskooppivalokuvia Wl38-fibroblasteista, jotka olivat 5 kasittelemattOmia (D), kasiteltyja 5 GIA-yksikGlia (E) tai 100 yksikGlia (F). Solut varjattiin 0,5-%:isella kristal-livioletin metanoliliuoksella. Suurennus on 63-kertainen.

Onkostatiinl M;n NaDodSO^/PAGE

Puhdistetun onkostatiinl M:n, jolle tehtiin 10 NaDodS04-PAGE pelkistavissa olosuhteissa, naennaisen mole-kyylipainon havaittiin olevan noin 28 kD, kuten kuviosta 3 ilmenee. Standardeina (kaista A) kaytettiin seuraavia pro-teiineja: ovalbumiini, molekyylipaino 43 kD; kymotrypsino-geeni a, molekyylipaino 25,7 kD; laktoglobuliini β, mole-15 kyylipaino 18,4 kD; lysotsyymi, molekyylipaino 14,2 kD, naudan trypsiinin inhibiittori, molekyylipaino 6,2 kD; insuliinin A- ja B-ketju, molekyylipaino 2,3 kD ja vas-taavasti 3,4 kD. Onkostatiini M laitettiin kaistalle B.

Onkostatiini M:n, jolle tehtiin PAGE pelkistamattG-20 missa olosuhteissa, naennainen molekyylipaino oli myGs 28 kD, ja proteiinin, joka elektroeluoitui vyGhykkeesta, havaittiin estavan A375-solujen proliferaatiota.

Synteettisen onkostatiini M -peptidin vasta-aine reaqoi 125I-leimatun onkostatiini Mrn kanssa radioimmuuni-25 saostuksissa a) Peptidisynteesi: Peptidi vastaa onkostatiini M -proteiinin ryhmia 6-19, ja se syntetisoitiin kiinteafaa-simenetelmaiia automaattisella Beckman-laitteella kirjal-lisuudessa kuvatulla tavalla [Gentry et al., J. Biol.

30 Chem. 258 (1983) 11 219]. Peptidi irrotettiin hartsista kayttåmaiia "matala-korkea"-HF-menettelya [Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. 105 (1983) 6 442 - 6 445].

b) Vasta-aineiden tuotanto: Peptidi liitettiin naudan gammaglobuliiniin kirjallisuudessa kuvatulla tavalla 35 [Gentry ja Lawton, Virology 152 (1985) 421 - 431]. Val- 26 91484 keille New Zealand -kaniineille annettiin peptidia perus-annoksena ja viitena tehosteannoksena 4 kohtaan ihonalai-sesti kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Gentry ja Law-ton, Virology 152 (1986) 421 - 431]. Antiseerumit otettiin 5 2 viikon kuluttua viidennesta tehosteannoksesta.

c) Onkostatiini M;n lodaus: Nayte osittain puhdis-tettua onkostatiini M:aa radioleimattiin jodi-125:lia kdyttamaiia julkaistuja menettelyja [Linsley et al., PNAS 82 (1985) 356 - 360]. Annos leimattua preparaattia, joka 10 sisalsi 100 000 pulssia/min, sekoitettiin kaniinin anti-seerumiin, joka oli muodostunut onkostatiini M:n 17 N-terminaalista aminohappoa vastaan (lopullinen laimennus-suhde 1:20), N-terminaalisen peptidin (onkostatiini M:n 17 N-terminaalista aminohappoa, 2 pg) lasna tai poissa olles-15 sa, ja tehtiin immuunisaostusanalyysi kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Linsley et al.. Biochemistry 25 (1986) 2 978 - 2 986].

Tarkemmin ilmaistuna yhta putkea, joka sisaltaa 5 μΐ naytetta, esi-inkuboitiin 2 pg:n kanssa N-terminaali-20 sia peptidia 10 mlrssa TNEN-liuosta (20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05 % Nonidet P-40), joka sisalsi 0,1 % BSA:ta, 30 min 4 °C:ssa, minka jaikeen lisattiin 125I-onkostatiini M:aa 85 pl:ssa TNEN-liuosta, joka sisalsi 0,1 % BSA:ta ja 40 mmol/1 ditiotreitolia (DTT). Seitsemaa 25 putkea, jotka sisaisivat 5 μΐ antiseerumia, inkuboitiin 125I-onkostatiini M:n kanssa, joka oli 85 pl:ssa TNEN-liuosta, joka sisalsi 0,1 % BSA:ta ja 40 mmol/1 DDT:ta, 30 min 4 °C:ssa, minka jaikeen lisattiin 50 μΐ 10-%:isella forma-liinilla kiinnitettya Staphylococcus aureusta (Pansorbin, 30 Calbiochem).

Kun oli inkuboitu vielå 30 min 4 °C:ssa, putket sentrifugoitiin mikrosentrifugissa, ja pelletit pestiin neljasti 1 ml:11a TNEN-liuosta, minka jaikeen tehtiin PAGE-analyysi. Havaittiin diffuusi vyiihyke, joka vastasi 35 molekyylipainoa 32 kD, immuunisakkojen SDS/PAGE-analyysin 27 91484 jaikeen. Taman vyOhykkeen saostumista esti ylimaara lei-maamatonta peptidia, joka vastasi onkostatiini M:n 17 N-terminaalista aminohappoa, mika osoittaa, etta saostuminen oli spesifinen taman peptidin suhteen.

5 Onkostatiini M:n hiilihydraattikoostumusta tutkit- tiin testaamalla glykosidaasiherkkyys. Edelia kohdassa c) kuvatulla tavalla valmistetut immuunisakat kasiteltiin puskurilla, endoglykosidaasi H:lla tai neutramidaasilla Linsleyn et al.'n (1986) kuvaamalla tavalla. Kasittely 10 endoglykosidaasi H:lla, N-kytkeytyneille, paljon mannoo-sia sisaitaville oligosakkarideille spesifiselia entsyy-milia, johti pienimolekyylisemman vydhykkeen (molekyyli-paino 24 kD) ilmaantumiseen. Vain osa radioleimatusta ma-teriaalista oli herkkaa talle entsyymille, mika osoittaa, 15 etteivét kaikki molekyylit sisaltaneet runsasmannoosisia oligosakkarideja. Kasittely neuramidaasilla johti yhden vyOhykkeen (molekyylipaino 27 kD) ilmaantumiseen, mika osoittaa, etta kasittelemattttman 125I-leimatun onkostatiini M:n koon heterogeenisyys aiheutui heterogeenisyydesta gly-20 koproteiiniytimen sialyloitumisessa. Tulokset osoittivat, etta aktiiviset onkostatiini M-valmisteet sisaisivat run-sasmannoosisten ja monimutkaisten N-sidottujen oligosakka-ridisivuketjujen seoksen.

Ihmisen normaaleista aareisverilvmfoswteista (PBL) 25 eristettv onkostatiini M; kasvainsolulen kasvun estaian tuottaminen PBLiista

Veripankista saadut PBLria sisaitavat leukofraktiot laimennettiin suhteessa 1:1 fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, pH 7,4, (PBS), 10 ml liuosta, 30 joka sisalsi 9 % Ficollia ja 20 til-% 50-%:ista natriumdi- • atritsoaattia (lopullinen ominaispaino 1,080), laitettiin 35 ml:n paaile laimennettua vérta. Gradientteja sentrifu-goitiin huoneen lampOtilassa 20 min kiihtyvyydelia 850 x g. Solut kerattiin gradientin rajapinnalta ja pestiin 35 PBSrlia. Punaiset verisolut hajoitettiin kasittelemaiia 28 91484 3-4 min 10 - 20 ml:11a liuosta, joka sisålsi 0,8 % ammoniumklor idia ja 0,1 % Na4-EDTA:ta.

Solut otettiin talteen punasolujen hajotusliuok-sesta sentrifugoimalla tåtå kiihtyvyydellå 600 x g 10 min 5 ja suspendoitiin takaisin 10 ml:aan RPMI 1640 -alustaa (GIBCO), joka sisålsi 5 % naudan sikidseerumia. Lisåttiin trombiinia loppupitoisuudeksi 0,5 yksikkdå/ml. Solususpen-siota sekoitettiin 5 min 37 eC:ssa ja verihiutaleaggregaa-tin annettiin laskeutua 5 min. Suspendoituneet solut siir-10 rettiin uusiin putkiin, otettiin talteen sentrifugoimalla, suspendoitiin takaisin 1 ml:aan naudan sikidseerumia ja siirrettiin kolonniin, joka sisålsi 0,5 g harjattua, esi-kostutettua nailonvillaa (tyyppi 200, Fenwal).

Nailonvillakolonnia inkuboitiin 37 °C:ssa 60 min, 15 jotta monosyytit ja B-lymfosyytit påasivåt kiinnittymåån. Sitten kolonni huuhdottiin kolminkertaisella tilavuudella RPMI 1640 -alustaa (37 °C), joka sisålsi 5 % naudan sikid-seerumia, ja otettiin talteen eluoituneet, tarttumattomat solut (PBL:t).

20 PBL:iå (2 x 106 solua/ml) viljeltiin 37 °C:ssa at- mosfåårisså, joka sisålsi 5 % C02 ja 95 % ilmaa, 96 tuntia RPMI 1640 -alustassa (10,4 g/1), joka sisålsi FeS04.7H20 (1 mg/1), ZnS04.7H20 (2 mg/1), Na2Se03.5H20 (0,017 mg/1), 1-aminoetanolia (1 mg/1), ihmisen transferriinia (5 mg/1), 25 naudan seerumialbumiini-linoleiinihappokonjugaattia (Sigma) (200 mg/1), L-glutamiinia (300 mg/1), penisillii-ni/streptomysiiniå (100 000 yksikkdå/1) ja fytohemagglu-tiniini-P:tå (Wellcome) (2 mg/1). Keråttiin supernatantit, sentrifugoitiin solujen poistamiseksi, konsentroitiin ult-30 rasuodattamalla (Amicon Diaflo-kalvo YM-10, låpåisyraja 10 kD) ja dialysoitiin 0,1 M etikkahappoa vastaan (Spectrapo-re 3 -dialyysiletku). Kirkastettu retentaatti kylmåkuivat-tiin.

29 91484

Geellpermeaatiokromatoarafia

Raakafraktio sekoitettiin 20 ml:aan 1 M etikkahap-poa (50 mg/ml) ja laitettiin BioGel P-100 -kolonniin (2,6 x 88 cm), joka oli tasapainotettu 1 M etikkahapolla, vir-5 tausnopeudella 0,5 ml/min. KerSttiin 20 ml:n fraktioita. Kustakin fraktiosta otettu nSyte haihdutettiin ja siita tutkittiin kolmena rinnakkaismaarityksena A375-solujen kasvua estava aktiivisuus (GIA). Aktiiviset fraktiot yh-distettiin, kylmakuivattiin ja kasiteltiin uudelleen kro-10 matografisesti Bio-sil TSK-250 -kolonnilla (600 x 21,5 mm) edelia kuvatulla tavalla.

TSK-250-fraktioiden RP-HPLC

Yhdistettyjen TSK-250-fraktioiden lopullinen puh-distus tehtiin RP-HPLC:llé suurin piirtein edelia kuvatul-15 la tavalla. PBL:ista peraisin oleva kasvainsoluinhibiitto-ri eluoitui Bonda-pak C18 -kolonnista asetonitriilipitoi-suudessa 40 - 41 % ja n-propanolipitoisuudessa 26,5 %.

Solu4en kasvun saatelvn tutkiminen kavttamaiia l25I-1odldeoksiurldiinln sisailvttamista DNA:han (GIA) 20 Ndma kokeet tehtiin tasapohjaisilla 96-kuoppaisilla kudosviljelylevyilia (Costar 3596). Kuhunkin kuoppaan li-sattiin ihmisen melanoomasoluja (A375, 4 χ 103) 50 pl:ssa tutkittavaa naytetta ja inkuboitiin 3 vrk 37 °C:ssa. Solu-ja leimattiin 24 tuntia 125I-IdU:lla (0,05 pCi/kuoppa), ja 25 inkuboitiin viela 24 tuntia. Solut pestiin kolmesti, ke-rattiin monikarkipipetilia, ja radioaktiivisuus maaritet-tiin gammalaskurissa.

Tulokset:

Yhdelle PBL-peraiselle kasvainsoluinhibiittorival-30 misteelle tehtiin automaattinen toistuva Edman-hajotus. Aminoterminaalinen aminohapposekvenssi on seuraava: 1 5 10 15

A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K

jolloin X edustaa identifioimatonta aminohappoa.

35 91484 30

Taman sekvenssin vertaaminen U937-tekijan sekvens-siin osoittaa selvSsti identtisyyden PBL-perSisen tekijan N-paan kanssa.

5 PBL-tekij a A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K

U937-tekija A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K

Seuraavassa tutkimuksessa tutkittiin PBL-peraisen onkostatiini M:n kykya vaikuttaa erilaisten solujen repli-10 koltumlseen. Havaittiin, etta hliren L929-solut elvat ol-leet herkkia PBL-perdlselle onkostatiini M:lle, kun tata kaytettiin korkeintaan pitoisuutena 1 000 GIA-yksikkoa/ml. Xhmisen WI26-fibroblastien kasvua stimuloi kasittely 1 000 GIA-yksikGlia/ml. Korkeintaan 500 GIA-yksikkOa/ml ei vai-15 kuttanut ihmisen normaalien T-lymfosyyttinen proliferaa- tioon 72 tunnin kuluttua mitogeneesista.

Edelia esitettyjen tulosten perusteella on ilmeis-ta, etta on saatu aikaan uusi polypeptidi ja polypeptidi-fragmentteja, joita voidaan kayttaa solujen kasvun saate-20 lyyn. Yhdisteelia on kyseessa olevan solulinjan luonteen mukaan vaihteleva aktiivisuus, niin etta sita voidaan kayttaa yksinaan tai yhdistettyna muihin yhdisteisiin solu j en kasvun saatelyyn. KeksinnOn mukaisesti valmistetut polypeptidit merkitsevat siten uutta polypeptidia, jota 25 voidaan kayttaa soluseoksissa seka in vivo etta in vitro vahentamaan tai edistamaan selektiivisesti tietyn solutyy-pin proliferaatiota. Tekijaa voidaan kayttaa erityisesti solujen kasittelyyn autologisia luuydinsiirtoja vårten. Taman tekijan kayttO estaa luuytimessa olevien kasvainso-30 lujen kasvua ja saattaa stimuloida pesakesolujen muodostu-mista. Onkostatiini M:aa voidaan kayttaa myds epiteeliso-lujen kasvun stimulointiin ja siten vammojen parantumisen edistamiseen. Kokonaista polypeptidia tai sen fragmentteja voidaan kayttaa lisaksi immunogeeneina vasta-ainetuotannon 35 indusointiin. Indusoituja vasta-aineita voidaan kayttaa • 31 91484 maaritettaessa elimistOn nesteessa esiintyva onkostatiini M tal saatelemaan tekijan aktllvlsuutta sltoutumlsen kaut-ta. Lisaksi tama vasta-aine yhdessa puhdistetun onkostatiini M:n tai sen fragmenttien kanssa toimivat komponent-5 teina diagnostisissa vaiineistOissa yhdessa mulden reagenssien, erityisesti onkostatiini M:n detektointiin ja kvantitatiiviseen maarittamiseen tarkoitettujen vasta-ai-neiden kanssa.

Vaikka keksintda on kuvattu melko yksityiskohtai-10 sesti valaisevassa ja esimerkinomaisessa mielessa sen ym-martamisen helpottamiseksi, lienee ilmelsta, etta siihen voidaan tehda tiettyja muutoksia ja muunnoksia poikkeamat-ta liitteena olevien patenttivaatimusten piirista.

Claims (10)

32 91484

1. Menetelma solujatteista ja muista leukosyytti-proteiineista oleellisesti vapaan onkostatiini M:n valmis- 5 tamiseksi, jolla on kyky estaa kasvainsolujen proliferaa-tiota ja stimuloida ihmisen normaalien fibroblastien pro-liferaatiota ja joka ei inhiboi ihmisen proliferatiivisia eika sytotoksisia T-soluvasteita eika granulosyyttisten/-myelosyyttisten luuydinpesakesolujen muodostumista, jonka 10 molekyylipaino on 17 - 19 kD maaritettyna geeliekskluu-siokromatografialla ja noin 28 kD maaritettyna SDS-PA6E:lla ja joka kestaa kasittelyn 1 N etikkahapolla ja 1 N ammoniumhydroksidilla ja 56 °C:n lampOtilaa yhden tunnin ajan, tunnettu siita, etta 15 a) eristetaan leukosyytit, kuten histiosyyttiset lymfoomasolut tai normaalit ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit, imettavaissoluviljelmasta tai imettavaisesta; b) aktivoidaan leukosyytit indusoivalla aineella, kuten ingenolilla, forbolilla tai mitogeenilla; ja 20 c) eristetaan kromatografisesti aktivoiduista leukosyyteista onkostatiini M puhtaana muusta solumate-riaalista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta leukosyytit ovat histiosyyt- .. 25 tisia lymfoomasoluj a.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettå histiosyyttiset lymfoomasolut ovat U937-soluja.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelma, 30 tunnettu siita, etta indusoiva aine on ingenoli tai forboli.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta forboli on 12-0-tetradekano-yyliforboli-13-asetaatti. 33 91484

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmS, tunnettu siita, etta leukosyytit ovat normaaleja ihmisen perifeerisen veren lymfosyyttej a.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmS, 5 tunnettu siita, etta indusoiva aine on mitogeeni.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta mitogeeni on fytohemaggluti-niini P.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen mene-10 telma, tunnettu siita, etta onkostatiini M:n puh- tausaste on sellainen, etta ominaisaktiivisuus on vahin-taan noin 10 GIA-yksikkdia/ng proteiinia.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta onkostatiini M:n 15 puhtausaste on sellainen, etta ominaisaktiivisuus on va-hintaan 100 GIA-yksikkOa/ng proteiinia. 34 91484