CN86108955A - 新的细胞生长调节因子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新的细胞生长调节组合物。该组合物可从白细胞中得到，例如人外周血液淋巴细胞(PBLs)或用一个或一个以上的诱导物培养的人组织细胞淋巴瘤系。自然存在的肽可通过仔细纯化上述细胞的条件培养基得到，并证明对某些细胞系具有选择性抑制活性和对其它一些细胞系具有选择性剌激活性。多肽可从培养的PBLs的或人组织淋巴瘤细胞系的条件培养基中分离出来，也可以合成，或可以通过基因克隆在一个合适的宿主里制备。本发明还提供了变体和片段。
Description
本申请是1985年12月20日受理的申请号为811，235的申请的后续部分。
在好几种动物肿瘤模式中，已发现白细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，与肿瘤生长的抑制作用有关。在免疫力受到破坏的人体中，恶性肿瘤发生率的增高支持了这样一种论点：白血细胞在调节肿瘤的生长方面具有一定的作用。由那些可以抑制肿瘤生长或调节免疫功能的白细胞产生的蛋白因子包括干扰素、α-和γ-肿瘤致死因子、淋巴细胞毒素、白细胞介素-2和其它淋巴细胞活素。这些蛋白因子已被分离出来并进行了特征描述。由于这些被分离的因子每一种都具有不同的作用范围，并可以不同方式分别与其它因子交互作用，因此，白细胞在调节细胞生长或免疫功能过程中所产生的因子的特征及分离引起了人们愈来愈大的兴趣。这些化合物可能用于癌的诊断或治疗，无论是单独使用还是一起使用都可。它们可作为伤口愈合促进因子、免疫调节因子用于具有免疫缺陷的患者和自身免疫患者的治疗、或用于器官移植等等。
对自然产生的因子进行发现、分离、纯化或特征描述过程中可能会遇到一些困难，因此必须设计一种新的系统方法以便从粗制的起始材料中将感兴趣的因子从其它因子中分离提纯出来，同时保证所需因子不失去活性;必须设计一种生物鉴定法，以便在分离富集特殊因子的过程中对各个组分进行检测;必须从那些已知因子及可能存在的并可从正向或逆向影响所需因子活性的其它未知因子中区别出一种新的因子;必须确定所纯化因子的特性;纯化因子的浓缩量必须保证能够对该因子进行鉴定和特征描述。因此，随着被分离因子的数目的增加，对每一种新因子的鉴定变得更加困难，因为一种因子的作用和功能可能由于其它一些因子的存在而难以确定。
Beal等在Cancer Biochem.Biophys.（1979）3：93-96页中报告在人尿液中存在有肽，它在转化细胞中比在正常细胞中更强烈地抑制细胞生长和DNA合成。Holley等在Pro.Natl.Acad.Sci.（1980）77：5989-5992页中描述了上皮细胞生长抑制因子的提纯。Letansky在Biosci。Re.（1982）2：39-45页中报告从牛胎盘中提取的肽类在肿瘤细胞中比在正常细胞中更加抑制肿瘤生长及胸苷的结合进DNA。Chen在Trends Biochem.Sci.（1982）7：364-365页中报告从腹液中分离得到了一种具有抑制肿瘤性质的肽。Redding和Schally在Pro.Natl.Acad.Sci.（1982）79：7014-7018页中报告了猪下丘脑纯化肽的分离方法，对好几个正常的及肿瘤细胞系，这些肽显示出抗细胞有丝分裂的活性。Sonne等在Gann（1984）75：920-928页中报告了用人巨噬细胞生产因子的方法，该因子可在离体中抑制某些肿瘤细胞的生长。Ransom等在Cancer Re.（1985）45：851-862页中报告了称为白细胞调节素（Leukoregulin）的因子的分离，该因子抑制某些肿瘤细胞系的扩增，而且表现出与淋巴细胞毒素、干扰素和白细胞介素1和2有所不同。这些因子大部分尚未进行完整的特征描述，它们的一级结构也不清楚。
Aggarwal等在J.Biol.Chem.（1984）259：686-691页中纯化了类淋巴母细胞系产生的人淋巴细胞毒素（LT）并描述了其特征，并对LT进行了序列测定（Aggarwal et.al.，J.Biol.Chem.，1985，260：2334）。类淋巴细胞产生的具有免疫调节和肿瘤抑制活性的γ干扰素（γ-IF）已经克隆并进行了表达（Gray et al.，Nature，1982，295∶503-508）。肿瘤致死因子（TNF）是由巨噬细胞和某些白血病变细胞系所产生，它可抑制某些肿瘤的生长，该致死因子的特征已经有过描述，而且，TNF的cDNA已经克隆并在大肠杆菌（E.Coli）中得到了表达（Pennica et al.，Natu-re，1984，312∶724）。
本发明提供了一种新的肽因子及其具有生物活性的片段，该因子可从白细胞中得到。该因子可用于调节细胞生长，例如抑制肿瘤细胞的生长和刺激正常的成纤维细胞的生长，还可以调节免疫功能。该因子具有一个氨基酸序列，此序列与已知具有类似性质的化合物的序列显著不同。
图1表示了Oncostatin M的片段的氨基酸序列;
图2是一系列经Oncostatin M处理的细胞的显微照片，其中A-C分别是经0、5和100GIA单位处理的A375恶性黑瘤细胞，D-F分别是用0、5和100GIA单位处理的WI38成纤维细胞;
图3是Oncostatin M的SDS-PAGE分析的照片。
本发明提供了一种新的多肽，多肽组合物，多肽片段及其变种，提供了它们的制备及应用方法，该组合物具有调节细胞生长的活性，尤其是具有抑制肿瘤细胞生长及刺激正常成纤维细胞生长的活性。一种称为Oncostatin M的所需多肽可从白细胞中获得，例如从被刺激的U937细胞或正常的人外周血淋巴细胞的条件培养基中得到。还提供了具有完整Oncostatin M的生物活性的多肽片段和变体，所谓生物活性包括细胞生长调节和免疫活性。
本发明的多肽片段是新的多肽，它至少有8个具有生物活性的氨基酸，并至少能与天然产生的Oncostatin M发生免疫交叉反应。免疫交叉反应是指，本发明的新的多肽诱导的抗体至少在Oncosta-tin M处于变性状态时能与完整Oncostatin M发生交叉反应。这些多肽可用于诱导Oncostatin M的抗体，该抗体可用来测定体液中Oncostatin M的含量，可与OncostatinM结合以调节其活性及纯化Oncostatin M，正如亲和层析中的原理一样。多肽的一部分也可维持完整Oncostatin M的细胞生长调节活性，尽管该活性可能会有所改变，与Oncostatin M相比，一般情况下是被降低。
图1表明寡聚氨基酸与Oncostatin M进行交叉反应的氨基酸序列，第一个序列代表Oncostatin M的N-末端。
本发明的寡聚氨基酸含有一个氨基酸序列，该序列至少有8个连续的氨基酸与图1给出的氨基酸序列相对应，相差不多于3个氨基酸，通常不多于1个。这种差别可以是插入一个氨基酸，去掉一个氨基酸或是一个氨基酸取代另一个，尤其是保守置换。通常，寡聚氨基酸将至少含有10个，更通常至少含有12个连续的氨基酸与该图中给出的序列相对应，相差不多于1个氨基酸。
为了本发明的目的，将各种氨基酸分成若干小类。下表给出了这些小类：
脂肪族的
中性的
非极性 G A P V L I
极性 S T C M N Q
酸性的 D E
碱性的 K R
芳香族的 F H Y W
保守置换是指同一小类中的氨基酸之间的取代（即中性脂肪酸、酸性脂肪酸、碱性脂肪酸或芳香族），更具体地是指同极性氨基酸之间进行的取代。而且，最好将脂肪族小类中2-4个或5-6个碳原子的氨基酸分为单体小组。
寡聚氨基酸的长度不超过大约1000个氨基酸，通常少于100个氨基酸，更通常少于50个氨基酸。因此，该寡聚氨基酸很容易人工合成。通常，当寡聚氨基酸的长度超过100个氨基酸时，这些寡聚氨基酸可以是每个少于100个氨基酸的Oncostatin M的片段的聚合体;或者是融合蛋白质，其中该片段与一种抗原、酶、酶片段等相融合。具体地说，高分子量的寡聚氨基酸可以是至少一种少于100个氨基酸的多肽片段，该片段与较大的免疫原多肽载体共价结合以提供免疫原性。这种蛋白载体的例子有牛血清白蛋白、钥孔
血兰蛋白（KLH）及其类似物等。这些接合多肽可用于在合适的宿主生物中诱导抗体。
U937细胞是由组织淋巴瘤细胞系产生的细胞系（Sundstr-om和Nilsson，Int.J.Cancer，1976，17∶565-577页），通过各种试剂进行处理后，它可在诱导下分化成具有巨噬细胞特征的细胞（Harris等，Cancer Res.，1985，45∶9-13）。为了Oncostatin M的生产，U937细胞可在常规的带有血清的培养基中进行培养并用合适的诱导物进行处理。出于方便可使用佛波醇或ingenols，特别是12-0-十四烷酰佛波醇-13-乙酸盐（TPA），通常使用5-20毫微克/毫升的诱导物。细胞的初始数目大约为105-106个细胞/毫升。
用诱导物对细胞进行足够时间的处理，一般为3-6天，然后除去上清液，用无血清的营养培养基洗涤细胞，留下的细胞再一次用无血清培养基洗涤，然后将细胞培养至少12小时，通常不超过48小时。所用培养基为无血清培养基，例如RPMI-1640培养基。然后，收集上清液并通过离心除去细胞。无细胞的上清液如实验计划中所述用来检测细胞生长抑制活性（GIA）。每毫升上清液中大约含有50-500GIA单位（GIA单位的定义见实例）。
Oncostatin M还可从受细胞分裂剂作用的正常人外周血红淋巴细胞（PBL′s）中得到。PBL′s可通过稀释白细胞组分及在Ficoll梯度上离心分离而从白细胞组分中分离出来。洗涤在梯度界面处收集的细胞并进行震溶，以便除去红血细胞。溶液中的剩余细胞通过离心收集，将收集得到的细胞置于含血清和凝血酶的缓冲液中搅动，静置一段时间以使血小板团聚体沉淀。转移悬浮细胞，通过离心分离而回收，然后再置于血清中并转移到一个含有尼龙纤维的柱中。将该柱保温，以允许单核细胞与B-淋巴细胞的附着，然后洗涤。大多数外周血T淋巴细胞并不粘着，因此可从柱中洗下。在37℃下对这些细胞进行培养，所用培养基如RPMI-1640培养基，并用合适的诱导物如植物血球凝集素（大约为1-5毫克/升）处理大约100小时，然后收集上清液。使上清液离心以除去细胞并通过诸如超滤或渗析进行浓缩。
从U937细胞或正常PBL′s中分离出无细胞上清液后，浓缩此条件培养基，为方便起见可使用空心纤维系统或超滤膜，随后用乙酸进行稀释（至乙酸浓度为0.1N止），随后再浓缩大约10倍，然后这样反复地进行稀释和浓缩。可将浓缩物冷冻干燥或直接使用，干燥产品也可用来进行进一步纯化。
所需Oncostatin M也可通过凝胶渗透层析法提纯，在Bio-silTSK250柱上用40%乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液作为移动相，同时监测每个组分的活性。该纯化过程产生的组合物的活性组分至少具有0.5-5×104GIA单位/毫升。
由凝胶渗透层析法得到的部分纯化的产品可通过逆相高压液相层析进一步纯化，该方法采用线性梯度，初始溶剂为含0.1%三氟乙酸的水，第二溶剂为含0.1%三氟乙酸的乙腈。所用方法可以有所变化，但层析分离一般需要大约3-4小时。其中大部分时间，即多于50%和少于80%的时间，在第二溶剂的30-45%的浓度范围内。在这样的条件下，当乙腈浓度达到41-42%时，活性组分被洗下。
收集的活性组分可通过重复进行逆相HPLC过程而进一步提纯，此时可采用变化较大的梯度和更慢的流速。在这样的条件下，活性组分当乙腈浓度为40.1-41.5%时出现。
然后可改变溶剂系统重复逆相HPLC，第二溶剂采用n-丙醇-0.1%三氟乙酸。采用线性梯度，该梯度在23-35%n-丙醇的范围内缓慢改变。在25.5-27.5%丙醇的范围内观察到了较大的活性，产生了基本上均一的产物，它的比活为大于10GIA单位/毫微克蛋白质。通常，要将该产物纯化至比活至少达到100GIA单位/毫微克蛋白质，更多情况应达到150GIA单位/毫微克。
所需化合物的特征在于具有大约17-19千道尔顿（KD）的分子量，具体说大约是18KD，这是通过大小排阻层析法确定的。所需化合物进一步的特征为具有一个大约28KD的表观分子量，这是通过在还原或非还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定的。
分析了纯化的Oncostatin M的片段的氨基酸序列。Oncost-atin基本上具有一个如图1所示的氨基酸序列。参照图1，第一个序列代表Oncostatin M的N-终端，而剩余的序列表示多肽的中间片段。
分离的Oncostatin M的活性制备物含有由高甘露糖和复杂的N-连接的低聚糖构成的混合物。然而，Oncostatin M的非糖基化制备物也具有细胞生长调节活性。
Oncostatin M的进一步的特征在于其活性是专一于某些细胞株的。所述多肽对于WI26和WI38人成纤维细胞、对肿瘤致死因子敏感的小鼠L926细胞、及对γ-干扰素敏感的人肿瘤细胞系没有细胞毒性。还发现在浓度达100GIA单位/毫升条件下，它并不抑制正常人T淋巴细胞的增生或由骨髓细胞形成粒细胞/髓细胞的群落。进一步说，Oncostatin M刺激正常人成纤维细胞的增生，正如WI38和WI26细胞所表现的那样，而且，它还抑制肿瘤细胞如A375、HBT10、A549和SK-MEL28等的增殖并可能加强由正常骨髓形成细胞群落的生长。在白细胞混合培养反应中，Oncostatin M的浓度为500GIA单位/毫升时并不抑制人细胞增殖或细胞毒性的T细胞反应。
发现所述多肽对中等酸性和碱性及56℃下的热处理是稳定的。
所述多肽的氨基酸序列可用市售序列测定仪完全确定。然后根据已知技术人工合成多肽，在此可采用市售自动人工合成仪。
另外，所述多肽也可通过DNA重组技术产生。由一部分氨基酸序列可设计出探针，用它们来筛选人类基因组文库。该文库可以是CDNA文库或染色体文库。一旦鉴别出了与探针一起退火的克隆，则可通过若干方法鉴别含有所需基因的片段并进行操作。可用限制性核酸内切酶降低片段的大小，将所得片段进行克隆并用探针检测所需基因是否存在。产生所需肽的或产生大量所需肽的细胞可用来产生mRNA。单链cDNA可由mRNA制备得到。然后，cDNA可与来自一种几乎不产生多肽的细胞的全部mRNA一起退火。然后分离未退火的cDNA并用于制备可用探针筛选的双链cDNA。
另外，可将DNA片段插入λgt11中，以使编码片段位于β-半乳糖苷酶基因骨架中的下游部分。可制备Oncostatin M多肽的抗体并用于筛选交叉反应形成的融合蛋白质。以这种方式，可以鉴别出所述多肽或其片段的编码片段并用于鉴别所需要的基因。
一旦鉴别出完整的基因，不论是cDNA或是染色体DNA，就可用不同的操作方法进行表达。当基因在一个能识别Oncostatin M的野生型转录和转译调节区的宿主中进行表达时，可将带有野生型5′-和3′调节区的完整基因导入一个合适的表达载体中。多种表达载体均采用哺乳动物病毒的复制系统，如猿猴病毒40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、牛痘病毒、昆虫棒状病毒等。已经为这些复制系统设计了转移感染的选择标记，以及用于插入基因的限制性位点。
当基因在一个不能识别天然产生的野生型转录和转译调节区的宿主中进行表达时，则需要进行进一步操作。已经很容易地知道了许多3′转录调节区并可将它们插入终止密码子的下游。结构基因上游的5′-端非编码区可通过限制性核酸内切酶去掉，如用Bal31等切除。另外，结构基因的5′-端附近有合适的限制性位点时，可将结构基因切开并用连接子将结构基因和启动子区连接起来，连接子还可提供结构基因中被切去的核苷酸。为了提供一个表达体可采用各种战略，该表达体在转录的5′-、3′-方向上有转录和转译起始区，它还可含有诱导调节的调节序列、在起始区的转录和转译控制下的结构基因及转录和转译终止区。
典型的转录起始区或起动子在细菌中包括β-gal起动子、TAC启动子、λ左和右启动子等;酶母中的糖酵解酶启动子如ADH-Ⅰ和ADH-Ⅱ启动子、GPK启动子和PGI启动子、TRP启动子等;哺乳动物细胞中的SV40早期和晚期启动子、腺病毒晚期启动子等。正如已经指出的那样，表达体可被包含在复制系统中以使游离基因保持在一个合适的细胞宿主中，也可以不要复制系统而将它与宿主的基因组整合。通过已知技术可将DNA导入宿主，如转化、利用钙磷沉淀的DNA、与带病毒细胞的接触转染、将DNA显微注射进细胞中等等。
一旦结构基因被导入合适的宿主，便可培养宿主并表达结构基因。在某些例子中，希望在结构基因的骨架上游提供一个信号序列（分泌导体），它可使结构基因的产品分泌，然后切断分泌导体，以致在上清液中产生成熟的多肽。如果不能进行分泌，便可收集宿主细胞，按照常规技术裂解，所需产品可根据已知技术进行分离和提纯，诸如层析、电泳、溶剂萃取等等。
所述化合物可以多种方法使用，无论是在活体中还是在离体中都可。所述化合物可用来产生它的抗体，该抗体可用于活体及离体中。抗体可通过常规方法制备，或者使用所述多肽作为免疫原将其注入哺乳动物宿主中，例如鼠、母牛、山羊、绵羊、家兔等，尤其可以附加使用佐剂，如Freunds完全佐剂，氢氧化铝凝胶等。然后从宿主中放血，收集血样以便进行多克隆抗体的分离。在鼠的例子中，可采用外周血红淋巴细胞或脾淋巴细胞（B-细胞）与合适的骨髓瘤细胞融合以使染色体不致死亡，从而实现专一于所述化合物的抗体的单克隆表达。
无论是多克隆抗体还是单克隆抗体均可以制备，该抗体可用来诊断或检测样品中所述多肽是否存在，所述样品指细胞或生理液体如血液。抗体还可用于亲和层析分离中，进行所述多肽的纯化或将多肽从天然或人工来源的物质中分开。抗体还可以用于控制与培养的或活体的细胞相结合的多肽的数量，由此调节细胞的生长。
所述化合物可用作配体检测所述化合物的受体是否存在。在这种情况下，可根据所述化合物受体的存在与否及密度来区分细胞，监测不同化合物对此受体的存在的影响。
所述化合物可用于离体培养，抑制那些对其敏感的细胞或细胞系的生长，以将它们与那些对此多肽不敏感的细胞区分开来。这样，能够将不需要的细胞从杂细胞混合体或细胞系中去除，所述不需要的细胞即对多肽敏感的那些细胞。可将所述多肽用于带有肿瘤细胞的活体内，例如，采用内注射、腹腔注射、皮下注射等方法。所述化合物可用于离体的自身骨髓移植中，以从所用骨髓中去除恶性细胞，或者抑制增殖或去除其它组织中的恶性细胞，如再灌输前的血液。
所述多肽也可用于伤口处理，如表皮创伤，角膜创伤和各种上皮性及间质性损伤，如慢性溃疡、烧伤、外科切口、外创性伤口及空腔型上皮器官的损伤，如食管、胃、大小肠、口、生殖及泌尿道等器官的损伤。所用方法依赖于包括Oncostatin M的处理组合物的局部应用，所述处理组合物包含在生理上可接受的载体中。
本发明所述的组合物可用于多种创伤，基本上包括所有的皮层创伤、角膜创伤和管状上皮空腔器官的创伤。可以处理的创伤包括由外创导致的如烧伤、擦伤、划伤及类似创伤，以及由外科手术导致的如切口和皮肤再植等。其它适于用本发明组合物处理的情况包括属于慢性的疾病，如慢性溃疡，糖尿性溃疡及属于非愈合性（营养性）的情况。
Oncostatin M可被结合进生理上可接受的载体中以便在所需区域进行应用。载体特性可有很大的不同，根据应用的目的而定。对于皮肤应用来说，一般最好是选择乳剂型或软膏型，合适的基型还包括羊毛脂、Silvadene（Marion）（尤其适于烧伤处理）、Aquaphor（Duke实验室，South Norwalk，康涅狄格州）、及其类似物。如果需要，还可将含有Oncostatin M的组合物结合进绷带和其它伤口包扎物中，以使伤口与肽持续接触。还可进行气溶胶的应用。
处理组合物中的多肽含量并不是关键的。其数量所达到的效果为能够促使上皮细胞增殖。将组合物局部施用于需要的部位，具体地说如用于眼睛的眼药水、用于皮肤的乳剂、软膏或洗涤剂。对于眼睛，应进行较为频繁的处理，一般每隔4小时或更短的时间处理一次。对于皮肤，在治疗部位整个愈合期都应保持有处理组合物，一天换药2-4次或者更多。
所述多肽的使用数量随应用方式、其它活性化合物的使用等而改变，一般在大约1微克到100微克范围内。所述多肽可与生理上可接受的载体一起使用，如生理盐水、磷酸盐缓冲液等。所用化合物的数量由经验决定，即根据离体细胞及实验动物对多肽或含有多肽的制剂的反应而定。所述多肽可独立使用或与其它生长因子、抑制因子或免疫调节因子结合使用，如TNF、IL-2、γ-干扰素、单克隆抗体等。这些其它化合物的数量一般在1微克到100微克范围内。可以制备所述化合物与位点定向组分如抗体的结合物，所述抗体是专一于特殊的恶性细胞或组织的。
下列例子作为进一步的说明而并不限定本发明。
实例
材料和方法
由U937细胞中分离的Oncostatin M
从组织淋巴细胞系中生产肿瘤细胞生长抑制因子
U937细胞是一种组织淋巴瘤细胞系（Sundstrom和Nil-sson，Int.J.Cancer，1976，17∶565-577），将它在850平方厘米的滚动瓶中（Corning C2540）进行培养，浓度为4×105个细胞/毫升溶液，培养总体积为300毫升的RPMI1640培养基，其中加有10%的胎小牛血清（FCS）、青霉素/链霉素（PS）、L-谷氨酰胺和10毫微克/毫升的12-0-十四烷酰佛波醇-13-乙酸盐（TPA）。四天后，除去含有FCS和TPA的上清液，滚动瓶用无血清RPMI1640培养基洗涤5遍，分离出的细胞（1×105个细胞/毫升）用无血清的培养基洗涤3遍后重新加入瓶内，每一滚动瓶中最终得到125毫升的无血清RPMI1640培养基。一天之后，收集上清液，离心分离以移去细胞，通过0.45微米的Nalgene过滤器并利用空心纤维系统（Amicon cartridge HIP10-20）浓缩至总体积为150毫升（初始体积为1500毫升）。从150Cm2的组织培养瓶中无血清及TPA的处理过的U937细胞的上清液中也分离出了Oncostatin M。用Amicon Diaflo膜PM-10（透析界限为10KD）使上清液透析而进行浓缩。在透析后，用乙酸稀释浓缩物，使之最终在500毫升中含有0.1N的乙酸，并用Amicon PM10滤膜再次将其浓缩至50毫升。用0.1N乙酸将50毫升浓缩物稀释至400毫升并用同样的滤膜将其浓缩至40毫升。用1N乙酸将上述浓缩物稀释并用离心除去产生的沉淀物。使最终的浓缩物进行冰冻干燥。冻干的材料用来进行进一步纯化。
凝胶渗透层析
将Bio-sil TSK-250柱（600×21.5mm）装在高压液相层析系统中。将原始组分（10毫克/毫升）溶于含40%乙腈的0.1%的三氟乙酸（TFA）水溶液中。注入2毫升该混合物，用含有40%乙腈的0.1%的TFA作为移动相进行洗脱。流速为2.5毫升/分钟，记录纸速为0.25cm/分钟。每5ml收集一个组分。层析在室温下进行。从每一组分中取样进行蒸发并用三个平行检测A375细胞的生长抑制活性（GIA）。
从六个导管中收集活性组分（组分21和22）。合并物质的GIA总值约为4.8×105单位。该因子的表观分子量为18KD，这是通过大小排阻层析确定的（Bio-sil TSK-250柱）。
TSK-250组分的逆向高压层析（HPLC）
上述收集的TSK-250组分21和22用0.1%TFA稀释两倍。将该混合物于室温下注入μ-Bondapak-C18柱上（7.8×300mm）（称为C181）。流速定为2.0ml/分钟，记录纸速为0.25cm/分钟。在0.1%TFA的初始溶剂和乙腈-TFA0.1%的第二溶剂之间采用线性梯度。梯度条件为，在20分钟内，0-30%，然后在150分钟内，30-45%，在20分钟内，45-55%，以及在10分钟内，55-100%。所有溶剂均是HPLC级。收集4ml的组分并从每一组分中取样检测生长抑制活性。发现组分72-75含有较大的活性。活性组分在41-52%的乙腈浓度范围内洗脱。
合并组分72-75。向其中加入16ml的0.1%TFA。将混合物于室温下注入μ-Bondapak-C18柱中（3.9×300mm）（称为C182）。流速调至1ml/分钟，记录速度为0.25cm/分钟。梯度条件是：10分钟内，0-35%，100分钟内，35-45%，10分钟内，45-100%。收集组分并抽取液样以检测GIA。柱中出现的最大活性在40.7%～41.3%的乙腈浓度范围内（滞留时间为83-86分钟）。
合并活性组分并用0.1%TFA稀释两倍，在室温下注入μ-Bondapak-C18柱上（3.9×300mm）（称为C183）。流速为1ml/分钟，记录速度为0.25cm/分钟。在初始溶剂0.1%TFA和第二溶剂n-佛波醇-TFA（0.1%）之间采用线性梯度。梯度条件为：20分钟内，0-23%，120分钟内，23-35%。收集组分并从每一组分中取样检测GIA。最大活性出现在25-26.5%的佛波醇浓度之间（滞留时间为59分钟）。这种表观均一的组分含有近300ng的蛋白质和大约40，000GIA单位。
用3H-胸苷在DNA（GIA）中的结合进行细胞生长调节检测
该测定用96孔平板培养皿（Costar3596）进行。用人黑素瘤细胞（A375）作为灵敏指示细胞系。将0.1ml Dulbeco改进的、加有10%FCS和PS的Eagles培养基（DMEM）中的细胞（3×103）置于每个小孔中。3小时后将0.1ml的试验样品加到每个小孔中。将培养皿置于37℃下保温3天。然后将0.025ml（0.5μCi）的3H-胸苷溶液（比强为27μCi/μg）加入每个小孔中，最后再保温6小时。然后利用多孔收集器（PHD Cell Harrester，Cambridge Technology，Inc.）将细胞移至玻璃滤器中。将滤器转移到闪烁瓶中，并在用闪烁计数器定量测定3H-胸苷的结合数量之前，向小瓶内加入2ml闪烁液（ScientiverseⅡ，Fisher Scientific Co.）。
软琼脂菌落抑制检测（TGI）
将含有10%胎牛血清（FCS）的DMEM中的0.5ml 0.5%的琼脂基质层（Agar Noble;Difco Laboratories，Detroit Michigan）加到24孔的Costar组织培养皿中。将含有相同培养基-FCS混合物、1～2.5×103个A375细胞和有待在各种浓度下进行检测的因子的0.5ml0.3%琼脂涂在琼脂基质层上。将培养皿在含有5%CO2的潮湿空气中于37℃下保温，并在7天后加入0.5毫升含有同样培养基和同样浓度因子的0.3%琼脂。计算未确定的和未染色的菌落，并在7天和14天之间确定大于6个细胞的菌落数目。
结果
从U937细胞分离出的Oncostatin M的序列
已经通过微序列分析法测定了Oncostatin M的N-端和中间片段的序列，测定是利用还原及S-吡啶乙基化的多肽及从其酶解得到的肽段进行的，所述酶解是用内蛋白酶Lys-C和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）V8蛋白酶进行的。肽段通过反相高压液相层析利用挥发性溶剂而纯化。使肽在470A型蛋白序列测定仪（Applied Biosystems，Inc，）中自动进行反复的Edman降解。利用带有PTH-C18柱（2.1×220mm，ABI）的反相高压液相层析（Applied Biosystems，Inc.），使用钠乙酸盐缓冲液/四氢呋喃/乙腈梯度进行洗脱以分析乙内酰苯硫脲氨基酸。
所得到的氨基酸序列大体上如图1所示。
将这些序列与现存的蛋白质数据库中的（PIRRelease 9.0，May 1986）相比，没有出现与任何其它已知序列显著同源的序列。此外，与肿瘤坏死因子、淋巴细胞毒素、菌落刺激因子、内白细胞素1或2、或β-转化生长因子相比也无相同的序列。
肿瘤细胞增生的抑制和正常人成纤维细胞增生的加强
使用上述软琼脂菌落抑制试验得到下述结果：
表1.在软琼脂中利用从U937细胞分离的纯化Oncostatin M抑制A375黑素瘤细胞菌落形成＊
GIA单位/孔 %菌落抑制 菌落形成
250 4 96
83 6 94
27 11 89
45 32 69
0 106 -
＊将A375细胞涂布在软琼脂上，如上所述，在最终2ml体积中带有或不带有因子。所使用的因子来自带有最大肿瘤生长抑制活性（GIA）的C18丙醇柱的组分。11天后计算菌落的数目。一个菌落定义为至少有6个细胞的群。一个GIA单位定义为在上述微孔中抑制50%3H-胸苷的并入A375细胞。
在下一个研究项目中，利用各种处理测定它们对于所述多肽的化学或物理活性的处理效果。下表列出结果。
表2.TPA诱导的U937细胞上清液的各种处理对肿瘤生长抑制活性的效果＊
上清液的最终稀释度
1∶4 1∶8 1∶16
对照培养基 - - - 39780
未处理的上清液 7206＊＊13896 16000
1N醋酸 6670 17073 18783
续表2
1N NH4OH 6956 15016 13923
＊将U937细胞用TPA（10ng/ml）处理3天，然后用培养基洗涤细胞并在收集上清液之前，在无血清培养基中保温24小时。用1N醋酸或1N NH4OH处理上清液。然后使上清液在培养基中透析并测试上清液抑制3H胸苷并入A375细胞的能力。在3天保温的最后6小时用3H胸苷（3H-TdR）标记A375细胞。
＊＊所列数据是所结合的3H-TdR在每分钟内的计数。
上述结果表明，透析过的上清液中的Oncostatin M对于1N醋酸和1N NH4OH的纯化作用有显著的抵抗作用。因此，所述化合物对中等强度的酸和中等强度的碱都不太敏感。它在56℃下加热处理1小时是稳定的，但在90℃下加热处理30分钟却不行。
还对所述化合物进行了热稳定性试验，发现它在56℃下1小时后仍保持活性，但在95℃下30分钟后就基本失去其全部活性。
在下面的研究项目中，研究了所述多肽抑制各种肿瘤细胞的增殖作用的能力。下表列出了结果。
表3.从U937细胞中纯化的Oncostatin M对肿瘤细胞增殖的抑制
引起30%抑制的GIA单位
肿瘤细胞3H-TdR结合
A549（肺肿瘤） 21
HTB10（神经母细胞瘤） 81
A375（黑素瘤） 0.3
在加入通过上述反相高压液相层析纯化的不同稀释度的Oncost-atin M之前3小时，将肿瘤细胞涂布在微孔中。在3天保温的最后6小时中，将0.2ml培养基中的细胞用3H-胸苷（3H-TdR）（0.5μCi/孔）进行标记。一个单位的肿瘤生长抑制活性（GIA）已在表1中定义为引起50%抑制3H-TdR并入A375黑素瘤细胞。一个单位测定为大约有10pg的纯化蛋白质，因此引起30%抑制3H-TdR并入A549、HTB10和A375细胞的浓度（ng/ml）大约分别是1.4、4.0和0.015ng/ml。利用U937因子在各试验中不抑制3H-TdR并入WI26正常人成纤维细胞。
上述结果表明，Oncostatin M抑制增殖的能力是有选择性的，它对于不同特性的细胞具有广泛不同的效应。所述化合物能有效地抑制黑素瘤细胞如A375黑素瘤细胞、鳞状肺肿瘤细胞如A549，以及神经母细胞瘤细胞如HTB10。
将肿瘤细胞（3×103细胞/孔）与正常成纤维细胞（1.5×103细胞/孔）接种在96孔的培养皿中保温3小时。加入不同浓度的纯化Oncostatin M，它们是从具有防止A375细胞增生的最大活性的C183柱中的组分得到的，在3天之后，每个浓度用3个重复孔测定3H-胸苷并入细胞的量。其结果列于表4。
表4.利用Oncostatin M抑制肿瘤细胞增生和加强
正常成纤维细胞增生
GIA
单位/孔 %抑制 %刺激
试验1 A375 WI28
16 83 25
4 62 30
1 46 46
续表4
试验2 A375 HTB10 WI26
27 NT 28 46
9 87 22 36
3 76 11 52
试验3 A375 A549
75 89 30
25 85 22
8 71 16
试验4 A375 SK-MEL28
20 87 44
5 75 25
1 59 11
所示结果分别是百分抑制或百分刺激3H-胸苷并入肿瘤（A375、HTB10、A549和SK-MEL28）和正常成纤维细胞（WI26和WI28）。表1所示的一个GIA单位定义为引起50%抑制3H-胸苷并入A375细胞的Oncostatin M的数量。
除了观察到3H-胸苷并入肿瘤细胞和正常人成纤维细胞不同效果之外，图2还给出了所观察到的另一种不同效应，这是用Oncos-tatin M处理两种类型细胞3天后在形状上和细胞数目上所产生的不同效应。
所使用的Oncostatin M来自具有对于A375细胞增生最大抑制活性的HPLC-C183柱的组分。图2是A375黑素瘤细胞的一组显微照片，（A）是未处理的，（B）是用5个生长抑制活性（GIA）单位的Oncostatin M处理的，（C）是用100单位处理的。（D）是未处理的VI38成纤维细胞的显微照片，（E）是用5单位GIA处理的，（F）是用100单位处理的。细胞在0.5%甲醇中用晶体紫色着色。放大倍数为63倍。
Oncostatin M的SDS/PAGE
在还原条件下进行SDS电泳的纯化Oncostatin M的表观分子量如图3所示大约是28KD。下列蛋白质作为标准使用（A行）：卵清蛋白，Mr＝43KD;胰凝乳蛋白酶原α，Mr＝25.7KD;乳球蛋白β，Mr＝18.4KD;溶菌酶，Mr＝14.2KD;牛胰蛋白酶抑制剂＝6.2KD;胰岛素A和B链分别为Mr＝2.3KD，Mr＝3.4KD。将Oncostatin M加到B行上。
在非还原条件下进行PAGE电泳的Oncostatin M也具有28KD的表观分子量，并且发现从带中电洗脱的蛋白质抑制A375细胞的增生。
Oncostatin M合成肽抗体在放射免疫沉淀中与125I标记的Oncostatin M的反应
a）肽合成：如前人所述，利用Beckman自动化装置的固相技术合成相当于Oncostatin M蛋白质中的残基6-19的肽段（Gentry et al.，J.Biol.Chem.，（1983）258∶11219）。利用“低-高”HF方法从树脂中切下肽段（Tam et al.，J.Amer.Chem.Soc.（1983）105：6442-6445）。利用已有的高压液相层析进行纯化。
b）抗体的制备：如前人所述将肽偶联到牛γ-球蛋白上（Gen-try and Lawton，Virology（1986）152：421-431）。如前人所述在4个部位进行皮下注射以活化并加强新西兰白兔（5次）（Gentry and Lawton，Virology（1986）152：421-431）。在第5次加强两周后抽取所用的抗血清。
C）Oncostatin M的碘化：将部分纯化的Oncostatin M的试样用碘-125按已发表的方法进行放射性标记（Linsley et al.，PNAS（1985）82：356-360）。如前人所述，在没有或有N端肽（Oncostatin M的N端17个氨基酸）（2μg）存在的情况下，将含有100，000cpm的标记制备物的试样与抗Oncostatin M N端17个氨基酸的兔抗血清混合（最终稀释度为1∶20）并进行免疫沉淀分析（Linstey et al.，Bioche-mistry（1986）25：2978-2986）。
更具体地说，在将I125Oncostatin M加入含有0.1%BSA和40mM二硫苏糖醇（DTT）的85λTNEN之前，将含有5μl的试管与2μg的N末端肽一起在含有0.1%BSA的10ml的TNEN（20mM Tris，PH7.5，5mM乙二胺四乙酸，150mM NaCl，0.05%诺乃洗涤剂（Nonidet）P-40）中在4℃下预保温30分钟。在加入5μl10%福尔马林固定的金黄色葡萄球菌（Pansorbin，Calbiochem）之前，将七个含有5μl抗血清的试管与I125Oncostatin M一起在含有0.1%BSA和40mMDTT的85μl TNEN中在4℃下保温30分钟。
接着在4℃下保温30分钟，使试管微浊化，在对沉淀进行PAGE电泳分析之前，用1ml TNEN洗涤沉淀4次。在SDS/PAGE免疫沉淀分析之后，观察到Mr＝32KD的扩散带。此带的沉淀被过量含有的相当于Oncostatin M N端17氨基酸的未标记肽所抑制，表明这种沉淀是这种肽所特有的。
利用糖苷酶敏感性试验检测Oncostatin M的糖类成分。如Linsley等人所述（1986）用缓冲液、糖苷内切酶M或神经氨酸苷酶处理上述C中制备的免疫沉淀物。用糖苷内切酶处理导致出现一种Mr＝24KD的较低分子量的物质，该酶是一种对N连接的高甘露糖低聚物有特异性的酶。只有经放射性标记的物质部分对这种酶是敏感的，表明不是所有分子都含有高甘露糖低聚物。用神经氨酸苷酶处理的结果导致出现一种Mr＝27KD的单带，表明未经125I标记处理的Oncostatin M的大小不均一性是由糖蛋白核心唾液化（Sialyation）的分子不均一性引起的。这个结果表明Oncos-tatin M的活性制备物中含有高甘露糖和复合的N连接低聚糖侧链混合物。
从正常人外周血液淋巴细胞（PBL）分离的Oncostatin M从PBL产生肿瘤细胞生长抑制因子
由血库获得的含有PBL的无色部分用磷酸盐缓冲液，pH7.4（PBS）稀释成1∶1。将10ml含有9%Ficoll的溶液置于35ml稀释血液之下，该溶液含有20%体积的50%的泛影钠（Sodium diatrizoate）（最终比重为1.080）。将该梯度在室温和850×g下离心20分钟。从梯度界面收集细胞并用PBS洗涤。将红细胞用10-20ml含有0.8%氯化铵和0.1%Na4-EDTA的溶液震溶3-4分钟。
在600×g下离心10分钟，从红细胞裂解液中收集细胞并在10ml含有5%胎牛血清的RPMI1640培养基（GIBCO）中再悬浮。将凝血酶加到0.5单位/ml的最终浓度。在37℃下将细胞悬浮液搅动5分钟并使血小板团聚体沉淀5分钟。将悬浮细胞移到新试管中，并通过离心分离回收，然后在1ml胎牛血清中再悬浮并且上到含有0.5克擦洗过并预先润湿的尼龙纤维柱中，型号为200（Fenwl）。
将尼龙纤维柱在37℃下保温60分钟，以使单核细胞和B淋巴细胞附着。然后用3倍体积的含有5%胎牛血清的RPMI1640培养基（37℃）洗脱并收集洗脱的未附着的细胞（PBL）。
在RPMI-1640培养基（10.4g/1）中，在5%CO2-95%空气和37℃的条件下，将PBL（2×106细胞/ml）培养96小时，培养基中含有FeSO4·7H2O（1mg/1）、ZnSo4·7H2o（2mg/1）、Na2SeO3·5H2o（0.017mg/1）、1-氨基乙醇（1mg/1）、人铁传递蛋白（5mg/1）、牛血清清蛋白-亚油酸结合物（Sigma）（200mg/1）、L-谷氨酰胺（300mg/1）、青霉素/链霉素（100，000单位/1）和植物血球凝集素-P（Wel-lcome）（2mg/1）。收集上清液，离心分离上清液以去除细胞，通过超滤（Amicon Diaflo membrane YM-10，10KD cut off）浓缩上清液，然后使上清液在0.1M醋酸中透析（Spectrapore3透析管）。使澄清的滞留物冷冻干燥。
凝胶渗透层析
在20ml 1M（50mg/ml）的醋酸中使粗制组分重新溶解，并且使其在低于0.5ml/分钟的速率下上到用1M醋酸平衡过的BioGel P-100柱（2.6×88cm）上。收集12ml的组分。将每个组分的试样进行蒸发并用一式三份检测A375细胞的生长抑制活性（GIA）。集中活性部分，冷冻干燥，并如前述在Bio-Sil TSK-250柱（600×21.5mm）上再进行层析分离。
TSK-250组分的反相高压层析
基本上如前述通过反相高压层析使集中的TSK-250组分完成最终纯化。由PBL产生的肿瘤细胞抑制因子分别在40-41%乙腈和26.5%n-丙醇浓度时从μ-Bondapak C18柱中洗脱。
用125I-碘脱氧尿苷并入DNA进行细胞生长调节的检测（GIA）
这些试验在平板96孔组织培养皿（Costar3596）中进行。将50μl试验样品中的人黑素瘤细胞即A375（4×103）加到每个孔中并在37℃下保温3天。用125I-IdU（0.05μCi/孔）对细胞进行24小时标记，然后再保温24小时。将细胞洗涤三次，用多孔采样器收集细胞，并用γ计数器测定放射性强度。
结果：
使PBL产生的肿瘤细胞抑制因子制备物反复进行自动的Edman降解，氨末端氨基酸序列如下：
1 5 10 15
A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K
X表示未确定的氨基酸。
将此序列与U937因子的序列相比较清楚表明二者是一致的。
1 5 10 15
PBL因子 A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K
U937因子 A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K
接下去研究了由PBL得到的Oncostatin M影响多种细胞增殖的能力。发现小鼠L929细胞对PBL产生的高达1000GIA单位/ml的Oncostatin M是不敏感的。用1000GIA单位/ml进行处理能刺激人成纤维细胞WI26的生长。正常人T淋巴细胞增生在有丝分裂后72小时不受500单位/ml的影响。
上述结果表明，所提供的新的多肽和肽段能够用于调节细胞生长。该化合物的活性依赖所涉及的细胞的特性而有广泛的不同，因此它能单独地或与其它化合物相结合用于调节细胞生长。因此，所述多肽与一个能与细胞混合体一起使用的附加多肽一起，不仅能在体内而且能在离体中选择性地削弱或加强特殊类型细胞的增生。
尤其是，因子能用于处理自身骨髓移植的细胞。使用这种因子能抑制骨髓肿瘤细胞生长并可以刺激群体细胞的生长。Oncostatin M也可以用于刺激上皮细胞生长，因此能促进创伤愈合。此外，完整多肽或其片段能用作诱发抗体形成的免疫原。这种诱导的抗体可用于滴定存在于体液中的Oncostatin M或通过与Oncostatin M的结合调节因子的活性。此外，这些抗体及纯化的Oncostatin M或其片段，连同其它试剂尤其是定量测定Oncostitin M的抗体一起，可作为诊断箱的成分使用。
为了清楚理解起见，虽然已通过附图和实例非常详细地描述了上述发明，但显然在不超出权利要求范围的情况下，可以对本发明进行某些改变和修饰。
Claims (18)
1、一种新的至少含有8个氨基酸的寡聚氨基酸，它能与一种物质进行免疫交叉反应，所述物质是一种可从白细胞中得到的多肽，它能够抑制肿瘤细胞增生，刺激正常人成纤维细胞增生，不抑制人的增殖的和细胞毒性的T细胞反应以及不抑制粒细胞/骨髓细胞群落的形成，用凝胶排阻层析测定的分子量大约是17-19KD，用SDS-PAGE测定的分子量大约是28KD，并且对中等强度的酸和碱及一般高温相对是不敏感的。
2、根据权利要求1的寡聚氨基酸，它的氨基酸序列中至少有10个连续的氨基酸对应于图1所示的序列，并与上述序列的差别决不超过3个氨基酸。
3、根据权利要求2的寡聚氨基酸，它含有12个连续的氨基酸对应于图1所示的氨基酸序列，并与上述序列的差别决不超过一个氨基酸，上述区别或者是一个氨基酸的减少，或者是一个氨基酸的保守置换。
4、一种可从白细胞中得到的新多肽的组合物，它含有一个组分：能够抑制肿瘤细胞增生，刺激正常人成纤维细胞增生，不抑制人的增殖的和细胞毒性的T细胞反应以及不抑制粒细胞/骨髓细胞群落的形成，用凝胶排阻层析测定的分子量大约是17-19KD，用SDS-PAGE测定的分子量大约是28KD，并且对中等强度的酸和碱及一般高温是较不敏感的;它的纯度为能提供至少大约10GIA单位/ng蛋白质的比活。
5、根据权利要求4的多肽组合物，其中所述白细胞是细胞分裂剂活化的正常人外周血液淋巴细胞。
6、根据权利要求4的多肽组合物，其中所述白细胞是佛波醇二酯诱导的人组织淋巴瘤细胞。
7、根据权利要求4的多肽组合物，其中基本上不含有细胞组分。
8、一种得自权利要求4所述组合物的多肽，该多肽的比活至少为100GIA单位/ng蛋白质。
9、一种基本上没有细胞碎片和其它白细胞蛋白质的多肽，它能够抑制肿瘤细胞增生，刺激正常人成纤维细胞增生，不抑制人的增殖的和细胞毒性的T细胞反应以及不抑制粒细胞/骨髓细胞群落的形成，用凝胶排阻层析测定的分子量大约是17-19KD，用SDS-PAGE测定的分子量大约是28KD，对中等强度的酸和碱及一般高温是较不敏感的，并含有相应于图1所示序列的氨基酸序列，此序列和所示序列的差别不超过3个氨基酸。
10、根据权利要求9的多肽，其中相应的序列与所示序列的差别决不超过一个氨基酸。
11、一种抑制肿瘤细胞增生的方法，该方法包括用权利要求8所述组合物的足够抑制增生的数量接触所述肿瘤细胞。
12、一种加速伤口愈合的方法，包括用权利要求8所述多肽的能刺激成纤维细胞增生的剂量接触创伤处。
13、一种专一于权利要求1或4所述多肽组合物的抗体。
14、根据权利要求13的单克隆抗体。
15、一种检测权利要求4所述多肽组合物的方法，该方法包括：
将可能含有上述组合物的试样与权利要求13所述的抗体混合;以及
测定组合物与上述抗体形成复合体的数量。
16、一种编码权利要求8的多肽的DNA序列。
17、一种产生权利要求8所述多肽的方法，该方法包括：
培养一种细胞培养物，其中的细胞具有一个含有编码权利要求4所述多肽的DNA序列的表达结构，该编码序列在所述细胞的转录和转译调节信号肽的调控下，以此表达上述多肽，以及
分离基本上不含有细胞组分的上述多肽。
18、一种诊断箱，它包括权利要求13的抗体和至少一种权利要求1的寡聚氨基酸或一种权利要求8的多肽。
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