DE3643428A1 - Zellwachstumsregulierende faktoren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue zellwachstumsregulierende Faktoren. Leukozyten, sowohl Lymphozyten als auch Monozyten wurden mit einbezogen in die Inhibierung von Tumorwachstum bei verschiedenen Tier-Tumor-Modellen. Das erhöhte Auftreten von bösartigen Erkrankungen bei immunokompromittierten Menschen stützt das Argument, daß die weißen Blutzellen eine Rolle in der Regulierung des neoplastischen Wachstums spielen. Proteinfaktoren, die durch diese weißen Zellen produziert sind, die das Tumorwachstum inhibieren oder Immunfuktionen modulieren, welche bereits isoliert und charakterisiert sind, schließen die Interferone, α- und γ-Tumor-Nekrosefaktor, Lymphotoxin, Interleukin-2 und andere Lymphokine ein.

Da jeder dieser isolierten Faktoren ein verschiedenes Aktivitätsspektrum besitzt und in Verbindung mit anderen Faktoren unterschiedlichen Einfluß ausüben kann, besteht weiterhin ein fortgesetztes und ernsthaftes Interesse an der Isolation und Charakterisierung all der Faktoren, welche weiße Zellen bei der Modulierung von Zellwachstum oder Immunfunktionen produzieren. Diese Verbindungen können einzeln oder zusammen Anwendung bei der Behandlung oder Diagnose von Krebs, als Beschleuniger bei der Wundheilung oder als Immunmodulatoren für die Behandlung von Patienten mit Immun-Mangelerscheinungen, Autoimmunität, Organtransplantaten u. dgl. finden.

Es gibt zahlreiche Schwierigkeiten, die bei der Auffindung, Isolierung, Reinigung oder Charakterisierung von natürlich vorkommenden Faktoren auftreten können. Es müssen Arbeitsweisen zum Abtrennen und Reinigen eines interessierenden Faktors von anderen Faktoren im rohen Ausgangsmaterial ohne Denaturierung der Aktivität des gewünschten Faktors entwickelt werden. Bioassays müssen entwickelt werden, welche die Identifizierung der Fraktionen während der Abtrennungen, welche einen bestimmten Faktor konzentrieren, erlauben. Ein neuer Faktor muß unterschieden werden von Faktoren, die bereits bekannt sind oder anderen Faktoren, welche vorliegen können und den erstrebten Faktor entweder negativ oder positiv in seiner Wirkung beeinflussen können. Der gereinigte Faktor muß charakterisiert werden. Der gereinigte Faktor muß auf ausreichende Mengen aufkonzentriert werden, um seine Identifizierung und Charakterisierung zu ermöglichen. Mit der ansteigenden Zahl der Faktoren, die isoliert sind, wird jeder neue Faktor schwieriger zu identifizieren, da seine Rolle und Funktion durch die zahlreichen anderen vorliegenden Faktoren verdeckt sein kann.

Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3: 93-96 berichten über das Vorhandensein von Peptiden in menschlichem Urin, welche das Wachstum und die DNA-Synthese eher in transformierten als in normalen Zellen inhibieren. Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 77: 5989-5992 beschreiben die Reinigung von Epithelzellen-Wachstumsinhibitoren. Letansky, Biosci. Rep. (1982) 2: 39-45 berichtet, daß aus Rinderplacenta gereinigte Peptide das Tumorwachstum und die Thymidin-Einlagerung in DNA in einem größeren Maße in Neoplasma inhibitieren als in normalen Zellen. Chen, Trends Biochem. Sci. (1982) 7: 364-365 berichtet über die Isolierung eines Peptids aus Ascites-Flüssigkeit mit einer krebsunterdrückenden Eigenschaft. Redding und Schally, Proc. Natl. Acad. Sci. (1982) 79: 7014-7018 berichten über die Isolation von gereinigtem Peptid bzw. Peptiden aus Schweine- Hypothalamus, welche antimitogene Aktivität gegen mehrere normale und Tumorzellinien zeigen. Sone et al., Gann (1984) 75: 920-928 berichten über die Produktion eines oder mehrerer Faktoren, die durch menschliche Makrophagen produziert werden und das Wachstum gewisser Tumorzellen in vitro inhibieren. Ransom et al., Cancer Res. (1985) 45: 851-862 berichten über die Isolation eines Leukoregulin genannten Faktors, der die Replikation von bestimmten Tumorzellinien inhibiert und sich vom Lyphotoxin, Interferon und Interleukin 1 und 2 zu unterscheiden scheint. Die meisten dieser Faktoren sind weder vollständig charakterisiert noch sind ihre Primärstrukturen bekannt.

Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259: 686-691 reinigten und charakterisierten menschliches Lymphotoxin (LT), das durch eine Lymphoblastoid-Zellinie produziert wird, und klärten anschließend die Sequenz von LT auf (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 2334). Gamma-Interferon (γ-IF), welches von Lymphoid-Zellen produziert wird und immunmodulatorische und tumorinhibitorische Wirkung hat, wurde kloniert und exprimiert. (Gray et al., Nature (1982) 295: 503-508.) Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), welcher das Wachstum von einigen Tumoren inhibiert und durch Makrophagen und bestimmte Leukämie-Zellinien produziert wird, wurde charakterisiert, und die TNF-cDNA wurde kloniert und in E. coli exprimiert (Pennica et al., Nature (1984) 312: 724).

Durch die Erfindung werden ein neuer Peptidfaktor und biologisch aktive Fragmente davon bereitgestellt, wobei der Faktor aus Leukozyten erhältlich ist. Der Faktor findet Anwendung in der Modulierung des Zellwachstums, so z. B. der Inhibierung von Tumorzellwachstum und der Stimulierung des Wachstums von normalen Fibroplasten, und kann Immunfunktionen modulieren. Der Faktor hat eine Aminosäuresequenz, die distinktiv verschieden von den Sequenzen anderer Verbindungen ist, von denen berichtet wurde, daß sie analoge Eigenschaften besitzen.

In der beiliegenden Zeichnung zeigen

Fig. 1 die Aminosäuresequenz von Fragmenten von Oncostatin M;

Fig. 2 eine Reihe von Mikrofotografien von Zellen, die mit Oncostatin M behandelt wurden, wobei (A-C) A375-Melanomzellen sind, die mit 0, 5 bzw. 100 GIA-Einheiten behandelt wurden, und (D-F) WI38-Fibroplasten sind, die mit 0, 5 bzw. 100 GIA-Einheiten behandelt sind; und

Fig. 3 eine Fotografie einer SDS-PAGE-Analyse von Oncostatin M.

Ein neues Peptid, Peptid-Zusammensetzungen, Peptid-Fragmente und Mutationen, ihre Herstellung und ihre Verwendung werden bereitgestellt, wobei die Zusammensetzungen Aktivität in der Modulation des Zellwachstums, insbesondere Inhibitierung von Tumor-Zellwachstum und Stimulierung des Wachstums normaler Fibroplasten zeigen. Ein Polypeptid, das als Oncostatin M bezeichnet wird, ist erhältlich aus Leukozyten, z. B. aus konditionierten Medien von stimulierten U937-Zellen oder konditionierten Medien von stimulierten normalen menschlichen Peripheren-Blutlymphozyten (PBL). Fragmente und Mutanten des Polypeptids mit der biologischen Aktivität des intakten Oncostatin M, wie Zellwachstumsmodulations-Aktivität oder immunologische Aktivität, werden ebenfalls bereitgestellt.

Die Polypeptid-Fragmente nach der Erfindung sind neue Polypeptide mit mindestens 8 Aminosäuren, die biologisch aktiv sind, zumindest immunologisch kreuzreaktiv mit natürlich vorkommendem Oncostatin M. Unter immunologisch kreuzreaktiv wird verstanden, daß ein durch ein neues Polypeptid nach der Erfindung induzierter Antikörper kreuzreagiert mit intaktem Oncostatin M, zumindest wenn Oncostatin M in einem denaturierten Zustand vorliegt. Diese Polypeptide sind deshalb nützlich zur Induzierung von Antikörpern für Oncostatin M, welche zur Bestimmung der Konzentration von Oncostatin M in einer Körperflüssigkeit verwendet werden können, weiterhin zur Bindung an Oncostatin M und somit zur Modulation seiner Aktivität, und zur Reinigung von Oncostatin M, z. B. durch Verwendung in einer Affinitätssäule. Ein Anteil der Polypeptide kann auch die Zellwachstumsmodulations-Aktivität des intakten Oncostatin M behalten, obwohl die Aktivität moduliert sein kann, gewöhnlich reduziert im Vergleich zum intakten Oncostatin M.

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von Poly(aminosäure bzw. -säuren), die kreuzreaktiv mit Oncostatin M sind, wobei die erste Sequenz das N-Ende von Oncostatin M darstellt.

Die Poly(aminosäure bzw. -säuren) nach der vorliegenden Erfindung enthalten eine Aminosäuresequenz mit mindestens 8 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die einer in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz entsprechen und von dieser Sequenz durch nicht mehr als 3, gewöhnlich nicht mehr als eine Aminosäure verschieden sind. Die Differenz kann entweder in der Einfügung einer Aminosäure, der Fehlstelle einer Aminosäure oder der Substitution einer Aminosäure durch eine andere, insbesondere in einer konservativen Substitution, bestehen. Normalerweise enthalten die Poly(aminosäure bzw. -säuren) mindestens 10, insbesondere mindestens 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren, die den in der Figur dargestellten Sequenz entsprechen und durch nicht mehr als eine Aminosäure unterschieden sind.

Für die Zwecke der Erläuterung der Erfindung sind verschiedene Aminosäuren in eine Anzahl von Unterklassen eingeteilt. Die folgende Tabelle zeigt die Unterklassen:

Unter konservativer Substitution wird verstanden, daß Aminosäuren aus derselben Unterklasse (d. h. entweder neutrale aliphatische, saure aliphatische, basische aliphatische oder aromatische), insbesondere derselben Polarität für einander ausgetauscht werden können. Vorzugsweise bilden Aminosäuren mit zwei bis vier C-Atomen oder fünf bis sechs C-Atomen Monomer- Gruppierungen in der aliphatischen Unterklasse.

Die Poly(aminosäure)n besitzen nicht mehr als ca. 1000 Aminosäuren in der Länge. Gewöhnlich haben sie weniger als 100 Aminosäuren, insbesondere weniger als 50 Aminosäuren. So können die Poly(aminosäure)n leicht synthetisiert werden. Wenn die Poly(aminosäure)n über 100 Aminosäuren in der Länge besitzen, dann können die Poly(aminosäure)n Polymere von Fragmenten von Oncostatin M mit jeweils weniger als 100 Aminosäuren sein oder Fusions-Proteine, bei denen das Fragment durch Fusion an ein Antigen, Enzym, Enzymfragment u. dgl. gebunden ist. Insbesondere die Poly(aminosäure)n mit höherem Molekulargewicht können mindestens ein Polypeptid-Fragment mit weniger als 100 Aminosäuren sein, das kovalent an einen großen immunogenen Polypeptidträger gebunden ist, um immunogene Eigenschaften zu schaffen. Beispiele für solche Proteinträger sind Rinderserumalbumin, Keyhole-Limpet-Hämozyanin (KLH) u. dgl. Diese konjugierten Polypeptide sind nützlich für das Induzieren von Antikörpern in einem geeigneten Wirtsorganismus.

U937-Zellen sind eine Zellinie, die aus einer histiozytischen Lymphom-Zellinie abgeleitet sind (Sundstrom und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577), die induziert werden können, in Zellen mit Charakteristika von Makrophagen zu differenzieren, gefolgt von einer Behandlung mit einer Vielzahl von Mitteln (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45: 9-13). Für die Herstellung von Oncostatin M kann man die U937-Zellen in einem konventionellen Nährmedium mit Serum wachsen lassen und mit einem geeigneten Inducer behandeln. Herkömmliche Phorbole oder Ingenole können verwendet werden, insbesondere 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA). Gewöhnlich werden ca. 5-20 ng/ml des Inducers verwendet. Die anfängliche Zellzahl liegt bei etwa 10⁵-10⁶ Zellen/ml.

Nachdem man den Inducer eine ausreichende Zeit auf die Zellen einwirken ließ, normalerweise drei bis sechs Tage, wird der Überstand entfernt, die Zellen werden mit serumfreiem Nährmedium gewaschen, angeheftete Zellen werden wiederum mit serumfreiem Medium gewaschen und dann werden die Zellen während mindestens 12 Stunden, gewöhnlich nicht mehr als ca. 48 Stunden, in einem serumfreien Nährmedium z. B. RPMI-1640 inkubiert. Überstände werden dann gesammelt, und die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt. Die zellfreien Überstände werden auf Zellwachstum-Inhibitionsaktivität (GIA) geprüft, wie im experimentellen Teil beschrieben. Der Überstand enthält ungefähr 50 bis 500 Einheiten GIA/ml (vgl. Experimentelles zur Definition von GIA-Einheiten).

Oncostatin M kann auch erhalten werden aus Mitogen-stimulierten normalen menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL's). PBL's können isoliert werden aus Leuko-Fraktionen durch Verdünnen der Fraktionen und Zentrifugieren über Ficoll-Gradienten. Zellen, die aus der Gradienten-Zwischenschicht gesammelt werden, werden gewaschen und schocklysiert, um die roten Blutzellen zu entfernen. Die verbleibenden Zellen werden aus der Lösung durch Zentrifugation abgetrennt, in Serum und Thrombin enthaltendem Puffer resuspendiert, aufgeschüttelt, und dann läßt man das plättchenartige Aggregat während einer kurzen Zeitdauer absetzen. Die suspendierten Zellen werden transferiert, durch Zentrifugation wiedergewonnen, in Serum resuspendiert und auf eine Nylonwolle enthaltende Säule transferiert. Die Säule wird inkubiert, um das Anheften von Monozyten und B-Lymphozyten zu ermöglichen, und dann gewaschen. Die meisten peripheren Blut-T-Lymphozyten haften nicht und werden aus der Säule eluiert. Diese Zellen werden bei 37°C in Kulturmedium, z. B. RPMI-1640-Medium kultiviert und mit einem geeigneten Inducer, z. B. Phytohämagglutinin (ca. 1 bis 5 mg/l) während ca. 100 Stunden behandelt, worauf die Überstände gesammelt werden. Die Überstände werden zentrifugiert, um Zellen zu entfernen und durch Ultrafiltration oder Dialyse konzentriert.

Nach der Isolation des zellfreien Überstandes aus entweder U937-Zellen oder normalen PBL's, wird das konditionierte Medium konzentriert, herkömmlich unter Verwendung eines Hohlfasersystems oder einer Ultrafiltrationsmembran, gefolgt von Verdünnung mit Essigsäure (bis zu einer Konzentration von 0.1-Essigsäure), gefolgt von einer Konzentrierung auf das ungefähr Zehnfache und eine wiederholte Verdünnung und Konzentrierung. Die Konzentrate können lyophilisiert und direkt verwendet werden, oder das gefriergetrocknete Produkt kann für eine weitere Reinigung verwendet werden.

Das Oncostatin M kann durch ein Gel-Permeations-Chromatographie- Verfahren gereinigt werden unter Verwendung von wäßrigem 40% Acetonnitril-0.1% Trifluoressigsäure als isokratische mobile Phase auf einer Bio-sil TSK250-Säule, unter Überwachung der Aktivität jeder der Fraktionen. Durch Reinigung wird eine Zusammensetzung erhalten, die mindestens ca. 0,5-5 × 10⁴-GIA-Einheiten/ml in den aktiven Fraktionen besitzt.

Das teilweise gereinigte Produkt aus der Gel-Permeations- Chromatographie kann weitergereinigt werden durch Anwendung der Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unter Anwendung eines linearen Gradienten, wobei das primäre Lösungsmittel 0,1%ige Trifluoressigsäure in Wasser und das sekundäre Lösungsmittel Acetonnitril ist, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält. Das Schema kann variiert werden, wobei die Chromatographie im allgemeinen ca. 3-4 Stunden dauert und der Hauptzeit-Aufwand von mehr als ca. 50% der Zeitdauer und nicht mehr als ca. 80% der Zeitdauer im Bereich von 30-45% des sekundären Lösungsmittels verstreichen. Unter diesen Bedingungen eluieren die aktiven Fraktionen bei ca. 41-42% Acetonnitril.

Die gepoolten Fraktionen können weiter gereinigt werden durch Wiederholung der Umkehrphasen-HPLC, wobei ein schnellerer Wechsel bei den Gradienten-Bedingungen vorgenommen und eine langsamere Durchflußrate angewendet wird. Unter diesen Bedingungen taucht die Aktivität bei ungefähr 40,5-41,5% Acetonntril auf.

Die Umkehrphasen-HPLC kann dann wiederholt werden, indem das Lösungssystem geändert wird, wobei das sekundäre Lösungsmittel n-Propanol-0,1% Trifluoressigsäure ist. Ein linearer Gradient wird angewendet, wobei der Gradient im Bereich zwischen 23 und 35% n-Propanol langsam verändert wird. Die Hauptaktivität wird im Bereich von 25,5-27,5% Propanol beobachtet und ein im wesentlichen homogenes Produkt erhalten wird mit einer spezifischen Aktivität größer als 10 GIA-Einheiten/ng-Protein. Normalerweise wird das Produkt gereinigt, um eine spezifische Aktivität von mindestens ca. 100 GIA-Einheiten/ng-Protein zu erreichen, insbesondere 150 GIA-Einheiten/ng.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden charakterisiert durch ein Molekulargewicht von ca. 17 bis 19 KiloDalton (kD), insbesondere ca. 18 kD, bestimmt durch Größenausschlußchromatographie. Die Verbindungen sind weiterhin gekennzeichnet durch ein scheinbares (apparent) Molekulargewicht von annähernd 28 kD, bestimmt durch Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen.

Die Aminosäuresequenz von Fragmenten von gereinigtem Oncostatin M wurde analysiert. Oncostatin hat im wesentlichen die Aminosäuresequenzen, die in Fig. 1 angegeben sind. In Fig. 1 erläutert die erste Sequenz das N-Ende von Oncostatin M, während die verbleibenden Sequenzen innere Fragmente des Polypeptids darstellen.

Aktive Präparationen von isoliertem Oncostatin M enthielten eine Mischung an Mannose-reichem und komplexem N-gebundenem Oligosaccharid. Nichtglykosylierte Präparationen von Oncostatin M behielten jedoch die zellwachstumsmodulierende Aktivität.

Oncostatin M ist weiterhin gekennzeichnet durch seine Aktivität gegenüber bestimmten Zellstämmen. Dem Polypeptid fehlt zytotoxische Aktivität gegen WI26 und WI38 menschliche Fibroplasten und Mäuse L929-Zellen, welche sensitiv gegenüber Tumor-Nekrosefaktor sind, und gegen eine γ-Interferonempfindliche menschliche Tumorzellinie. Es hat sich auch herausgestellt, daß es die Proliferation von normalen menschlichen T-Lymphozyten nicht inhibiert und auch nicht die granulozytische/ myelozytische Koloniebildung von Knochenmarkszellen bei Konzentrationen bis zu 100 GIA-Einheiten/ml. Weiterhin stimuliert Oncostatin M die Proliferation von normalen menschlichen Fibroplasten, wie am Beispiel von WI38- und WI26-Zellen gezeigt, und inhibiert die Proliferation von Tumorzellen wie A375, HBT10, A549 und SK-MEL28, und kann das Wachstum von Koloniebildungszellen von normalem Knochenmark vermehren. Oncostatin M unterdrückt nicht den menschlichen proliferativen oder zytotoxischen T-Zell-Response in gemischten Leukozytenkulturreaktionen (MLC) bei Konzentrationen von 500 GIA-Einheiten/ml.

Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Polypeptid stabil gegen mäßige Säure und Base und auch gegen Wärmebehandlung bei 56°C ist.

Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids kann vollständig bestimmt werden unter Anwendung handelsüblich erhältlicher Sequenzanalysier-Einrichtungen. Das Polypeptid kann synthetisiert werden in Übereinstimmung mit bekannten Techniken, unter Anwendung automatisierter Syntheseeinrichtungen, die ebenfalls kommerziell erhältlich sind.

Alternativ kann das erfindungsgemäße Polypeptid durch Rekombinaten- DNA-Techniken hergestellt werden. Aus einer partiellen Aminosäuresequenz können Proben abgeleitet werden, welche dann für das Screening einer menschlichen Genom-Bank verwendet werden können. Die Bank kann eine cDNA-Bank oder eine Chromosomen-Bank sein. Sind der oder die Klone einmal identifiziert als ansprechend auf die Probe, dann können die Fragmente, welche das Gen von Interesse enthalten, auf verschiedene Weise identifiziert und in vielfältiger Weise manipuliert werden. Das Fragment kann durch Endonuklease-Restriktion in der Größe reduziert werden, wobei die erhaltenen Fragmente kloniert und auf das Vorliegen der gewünschten Gene geprüft werden. Zellen, die die gewünschten Peptide produzieren oder vergrößerte Mengen des gewünschten Peptids produzieren, können zur Herstellung der Messenger-RNA verwendet werden. Aus der Messenger-RNA kann Einzelstrang-cDNA hergestellt werden. Die cDNA kann dann Einzelstrang-cDNA hergestellt werden. Die cDNA kann man dann an Gesamt-Messenger- RNA aus einer Zelle, die, wenn überhaupt, nur wenig von dem Polypeptid produziert, ansprechen lassen. Die nicht ansprechende bzw. angeheftete cDNA kann dann isoliert und zur Herstellung von ds cDNA verwendet werden, welche mit den Proben gescreent werden kann.

Alternativ können DNA-Fragmente in λgt11 eingesetzt werden, so daß die Kodierung der Fragmente abwärts von und im Rahmen mit dem λ-galactosidase-Gen erfolgen kann. Antikörper können zu dem Oncostatin M-Polypeptid hergestellt und zum Screening der erhaltenen fusionierten Proteine auf Kreuzreaktivität verwendet werden. Auf diese Weise können Fragmente, die das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon kodieren, identifiziert und zur Identifizierung des gewünschten Gens verwendet werden.

Ist einmal das vollständige Gen identifiziert, entweder als cDNA oder als Chromosomen-DNA, dann kann es auf verschiedene Weise zur Herbeiführung einer Expression manipuliert werden. Wenn das Gen in einen Wirt exprimiert wird, der die Wildtyp- transkriptionalen und translationalen Regulationsregionen von Oncostatin M erkennt, dann kann das vollständige Gen mit seinen Wildtyp 5′- und 3′-Regulationsregionen in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden. Verschiedene Expressionsvektoren existieren unter Anwendung von Replikationssystemen aus Säugetier-Viren, wie Simian-Virus 40, Adenovirus, Rinder-Papillom-Virus, Vaccinia-Virus, Insekten- Baculo-Virus u. dgl. Diese Replikationssysteme wurden entwickelt, um Marker zu schaffen, welche eine Selektion von Transfektanten erlauben, sowie bequeme Restriktionsstellen zu schaffen, in welche die Gene eingesetzt werden können.

Wenn das Gen in einen Wirt exprimiert werden soll, welcher die natürlich vorkommenden Wildtyp-transkriptionalen und translationalen Regulationsregionen nicht erkennt, sind weitere Manipulationen erforderlich. Eine Vielzahl von 3′- transkriptionalen Regulationsregionen sind bekannt und können außer- bzw. unterhalb des Stopcodons eingesetzt werden. Die nichtkodierende 5′-Region oberhalb des strukturellen Gens kann durch Endonuklease-Restriktion, Bal31-Resektion o. dgl. entfernt werden. Andererseits kann, wo eine bequeme Restriktionsstelle nahe dem 5′-Ende des strukturellen Gens vorhanden ist, das strukturelle Gen restriktiert werden und ein Adaptor verwendet werden zur Bindung der strukturellen Gene an die Prompoter-Region, wobei der Adaptor die verlorenen Nukleotide des strukturellen Gens liefert. Verschiedene Strategien können angewendet werden zur Schaffung einer Expressions- Kassette, welche in der 5′-, 3′-Richtung der Transkription eine transkriptionelle und translationelle Initiierungsregion besitzt, welche auch Regulatorsequenzen für die Induzierung der Regulation, das strukturelle Gen unter der transkriptionellen und translationellen Steuerung der Initiierungsregion und eine transkriptionelle und translationelle Terminierungsregion einschließen kann.

Beispielhafte transkriptionelle Initiierungsreaktionen oder Promotor umfassen für Bakterien, β-gal-Promoter, TAC-Promoter, Lambda-Links- und -Rechts-Promoter usw.; für Hefe, glykolytische Enzympromoter, wie ADH-I und -II-Promoter, GPK- Promoter und PGI-Promoter sowie TRP-Promoter usw.; für Säugetier- Zellen, SV40 Früh- und Spät-Promoter, Adenovirus Major-Spät-Promoter usw. Wie bereits angedeutet, kann die Expressions-Kassette innerhalb eines Replikationssystems für episomale Aufrechterhaltung in einem geeigneten zellulären Wirt vorhanden sein oder ohne ein Replikationssystem vorhanden sein, wo es in das Wirts-Genom integriert werden kann. Die DNA kann in den Wirt nach bekannten Techniken eingeführt werden, z. B. durch Transformation unter Verwendung von mit Calciumphosphat ausgefällter DNA, Transfektion durch Inkontaktbringen der Zellen mit dem Virus, Mikroinjektion der DNA in die Zellen u. dgl.

Ist das Gen einmal in den geeigneten Wirt eingeführt, dann kann der Wirt wachsen und wird das strukturelle Gen exprimiert. In einzelnen Fällen kann es wünschenswert sein, eine Signalsequenz (Sektrionsleiter) oberhalb von und im Leserahmen mit dem strukturellen Gen vorzusehen, wodurch die Sekretion des strukturellen Gens und die Spaltung der Sekretionsleiter ermöglicht wird, so daß das reife Polypeptid im Überstand bereitgestellt wird. Ist eine Sekretion nicht vorgesehen, dann können die Wirtzellen geerntet, unter herkömmlichen Bedingungen lysiert und das gewünschte Produkt isoliert und nach bekannten Techniken gereinigt werden, wie z. B. durch Chromatographie, Elektrophorese, Lösungsmittelextraktion u. dgl.

Die erfindungsgemäßen Stoffe können ein breites Anwendungsfeld finden, und zwar sowohl in vivo als auch in vitro. Die Stoffe können zur Herstellung von Antikörpern für die Stoffe verwendet werden, die ihrerseits Anwendung in vivo oder in vitro finden können. Die Antikörper können auf herkömmliche Weise hergestellt werden, z. B. durch Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids als Immunogen und injizieren des Polypeptids in einen Säugetier-Wirt, z. B. eine Maus, eine Kuh, eine Ziege, ein Schaf, ein Kaninchen u. dgl., insbesondere zusammen mit einem Hilfsmittel, z. B. komplettem Freunds-Hilfsstoff, Aluminiumhydroxid-Gel u. dgl. Der Wirt kann dann geblutet werden und das Blut kann dann zur Isolation der polyklonalen Antikörper verwendet werden, oder im Falle der Maus, können die Peripheren-Blut-Lymphozyten oder Milz-Lymphozyten (B-Zellen) zur Fusion mit einer geeigneten Myelom-Zelle verwendet werden, um die Chromosomen für die monoklonale Expression von für die erfindungsgemäßen Stoffe spezifischen Antikörper unsterblich zu machen.

Es können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper hergestellt werden, welche dann zur Diagnose oder Aufspürung der erfindungsgemäßen Polypeptide in einer Probe, wie Zellen oder physiologischer Flüssigkeit, z. B. Blut, verwendet werden können. Die Antikörper können auch in der Affinitäts- Chromatographie zur Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide und zu ihrer Isolierung aus natürlichen oder synthetischen Quellen verwendet werden. Die Antikörper können auch Anwendung bei der Kontrolle bzw. Steuerung der Menge der erfindungsgemäßen Polypeptide in Verbund mit Zellen in einer Kultur oder in vivo Anwendung finden, wobei das Zellwachstum modifiziert werden kann.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch als Ligant zum Aufspüren des Vorhandenseins von Rezeptoren für die Verbindung verwendet werden. Auf diese Weise können Zellen unterschieden werden, die nach dem Vorliegen und der Dichte von Rezeptoren für die erfindungsgemäße Verbindung, wobei die Wirkung verschiedener Verbindungen auf das Vorhandensein solcher Rezeptoren überwacht wird.

Die erfindungsgemäße Verbindung bzw. die Verbindungen können verwendet werden in in vitro-Kulturen zum Inhibieren des Wachstums von Zellen oder Zellinien, die sensitiv gegenüber dem erfindungsgemäßen Polypeptid sind, im Unterschied zu Zellen die nicht sensitiv sind. Auf diese Weise können herterogene Zellmischungen oder Zellinien von unerwünschten Zellen befreit werden, wenn die unerwünschten Zellen sensitiv gegenüber dem erfindungsgemäßen Polypeptid sind. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch in vivo verabreicht werden, im Falle von neoplastischen Zuständen, beispielsweise durch Injektion, die intralesional, peritoneal, subcutan o. dgl. erfolgen kann. Die erfindungsgemäße Verbindung kann in vitro verwendet werden, um maligne Zellen aus Mark für autologe Marktransplantationen zu entfernen oder die Proliferation zu verhindern oder maligne Zellen in anderem Gewebe, z. B. Blut, vor einer Reinfusion zu entfernen.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch verwendet werden zur Behandlung von Wunden, wie Hautwunden, Augenhornhautwunden und verschiedenen Epithel- und Stützgewebe-Verletzungen und Risse, wie chronische Ulcera, Verbrennungen, chirurgische Schnitte, traumatische Wunden und Verletzungen der mit Epithel ausgegleiteten Hohlorgane, wie des Ösophagus, Magens, Dick- und Dünndarms, Mundes, der Genitalien und der Harnwege. Die Anwendung erfolgt durch örtliches Auftragen einer Behandlungs-Zusammensetzung, einschließlich Oncostatin M, in einem physiologisch akzeptierbaren Träger.

Die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung kann zur Behandlung einer Vielzahl von Wunden verwendet werden, einschließlich im wesentlichen aller Hautwunden, Augenhornhautwunden und Verletzungen der mit Epithel ausgegleiteten Hohlorgane des Körpers. Zur Behandlung bieten sich Wunden an, die durch Verletzungen, wie Verbrennungen, Schürfungen, Schnitte u. dgl. entstanden sind, wie auch durch chirurgische Eingriffe, z. B. chirurgische Schnitte und Hautübertragungen bzw. Pfropfungen. Andere Zustände, die sich für eine Behandlung mit den Zusammensetzungen nach der Erfindung eignen, sind unter anderem chronische Zustände, wie chronische Ulcera, Diabetes-Ulcera und andere nichtheilende (trophische) Zustände.

Oncostatin M kann in akzeptierbare Träger für die Anwendung am betroffenen Gebiet eingebracht werden. Die Natur des Trägers kann in weitem Bereich variieren und hängt von der jeweiligen Anwendungsstelle ab. Für die Anwendung auf der Haut ist eine Creme- oder Salbengrundlage normalerweise bevorzugt, geeignete Grundlagen sind beispielsweise Lanolin, Silvaden (Marion), insbesondere für die Behandlung von Verbrennungen, Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) u. dgl. Wenn erwünscht, ist es auch möglich, Oncostatin M enthaltende Zusammensetzungen in Bandagen und andere Wundauflagen einzubringen, um eine kontinuierliche Einwirkung des Peptids auf die Wunde zu ermöglichen. Auch Aerosol-Verabreichungen können Anwendung finden.

Die Konzentration des Polypeptids in der Behandlungs-Zusammensetzung ist nicht kritisch. Das Polypeptid ist normalerweise vorhanden in einer Menge, die die Proilferation der Epithel-Zellen induziert. Die Zusammensetzungen können örtlich auf das befallene Gebiet aufgebracht werden, typischerweise in Form von Augentropfen auf das Auge, oder als Creme, Salbe oder Lotion auf die Haut. Im Falle der Augen ist eine häufige Anwendung erwünscht, gewöhnlich in Applikations- Intervallen von 4 Stunden oder weniger. Bei der Haut ist es wünschenswert, die Behandlungs-Zusammensetzung auf der befallenen Stelle während der Heilung kontinuierlich vorliegen zu haben, insbesondere durch zwei- bis viermaliges oder häufigeres Auftragen der Behandlung-Zusammensetzung pro Tag.

Die Menge, die an dem erfindungsgemäßen Polypeptid verwendet wird, hängt von der Art und Weise der Verabreichung, der Verwendung anderer aktiver Verbindungen u. dgl. ab und liegt im allgemeinen im Bereich von ca. 1 µg bis 100 µg. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann mit einem physiologisch akzeptierbaren Träger, wie einer Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung o. dgl. angewendet werden. Die Menge an zu verwendender Verbindung kann empirisch bestimmt werden auf der Basis des Ansprechens von Zellen in vitro und des Ansprechens von Versuchstieren auf die erfindungsgemäßen Polypeptide bzw. Formulierungen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten. Die erfindungsgemäßen Verbindungen finden als solche Anwendung oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren oder Immunomodulatoren, wie TNF, IL-2, γ-Interferon, monoklonale Antikörper usw. Die Mengen dieser anderen Verbindungen bzw. Stoffe liegt im allgemeinen im Bereich von 1 µg bis 100 µg. Konjugate der erfindungsgemäßen Stoffe mit an die Einsatzstelle leitenden Einheiten, z. B. Antikörpern, können bereitet werden, wobei die Antikörper spezifisch für bestimmte malignen Zellen oder Organe sein können.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, insbesondere bevorzugter Ausführungsformen, nicht jedoch zur Beschränkung.

Experimentelles Materialien und Methoden Oncostatin M, isoliert aus U937-Zellen

Herstellung eines Tumorzellwachstums-Inhibitors aus einer histiozytischen Lymphom-Zellinie.

U937-Zellen, eine histiozytische Lymphom-Zellinie (Sunstrom und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577, wurden in Rollflaschen (Corning C2540) bei einer Konzentration von 4 × 10⁵-Zellen/ml in einem Totalvolumen von 300 ml RPMI- 1640-Medium, das mit 10% fötalem Kalbsserum (FCS), Penicilin/ Streptomycin (PS), L-Glutamin und 10 ng/ml 12-0-Tetradecanoylphorbol- 13-acetat (TPA) ergänzt war. Vier Tage später wurden die Überstände, die FCS und TPA enthielten, entfernt. Die Rollflaschen wurden fünfmal mit serumfreiem RPMI-1640 gewaschen, und die losgelösten Zellen (1 × 10⁵- Zellen/ml) wurden dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in die Flaschen zurückgegeben, wobei ein Endvolumen von 125 ml serumfreiem RPMI-1640-Medium pro Rollflasche erhalten wurde. Einen Tag später wurden die Überstände gesammelt, zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, durch 0,45 Mikron (µ) Nalgen-Filter filtriert und unter Verwendung eines Hohlfasersystems (Amicon-Patrone HIP10-20) auf einem Volumen von 150 ml (Anfangsvolumen 1500 ml) konzentriert. Oncostatin M wurde auch aus Überständen von serumfreien, TPA-behandelten U937-Zellen in 150 cm² Gewebekultur-Kolben isoliert. Die Überstände wurden mit einer Amicon Diaflo-Membran PM-10 konzentriert, 10 kD abgeschnitten und dialysiert. Im Anschluß an die Dialyse wurde das Konzentrat mit Essigsäure verdünnt bis auf eine Endkonzentration von 0.1 N Essigsäure in 500 ml und auf 50 ml unter Verwendung eines Amicon PM 10-Filters konzentriert. Das 50 ml-Konzentrat wurde auf 400 ml mit 0.1 N Essigsäure verdünnt und mit demselben Filter auf 40 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 1 N Essigsäure verdünnt und das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt. Das erhaltene Konzentrat wurde eingefroren und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wurde für Reinigungsstufen verwendet.

Gel-Permeations-Chromatographie

Eine Bio-Sil TSK-250-Säule (600 × 21,5 mm) (Bio-Rad) wurde an ein Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-System angeschlossen. Die rohe Fraktion (10 mg/ml) wurde in 40% Acetonnitril in 0,1% wäßriger Trifluoressigsäure (0,1% TFA) aufgelöst. Eine 2 ml-Aliquot-Menge der Mischung wurde injiziert, und die Elution isokratisch mit einer mobilen Phase von 40% Acetonnitril in 0,1% TFA durchgeführt. Die Durchflußmenge betrug 2,5 ml/min und die Geschwindigkeit der Verschiebung wurde auf 0,25 cm/min eingestellt. 5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Chromatographie wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Aliquote Mengen einer jeden Fraktion wurden eingedampft und dreifach auf die Wachstumsinhibitor- Aktivität (GIA) auf A375-Zellen untersucht.

Die aktiven Fraktionen (Fraktionen 21 und 22) aus sechs Durchläufen wurden gepoolt. Das gepoolte Material hatte eine Gesamtmenge von annähernd 4,8 × 10⁵-GIA-Einheiten. Es wurde gefunden, daß der Faktor ein scheinbares Molekulargewicht (apparent molecular weight) von 18 kD besaß, bestimmt durch Größenausschluß-Chromatographie (Bio-Sil TSK-250-Säule).

Umkehrphasen-Hochdruck-Chromatographie (HPCL) von TSK-250-Fraktionen

Gepoolte TSK-250-Fraktionen 21 und 22, die oben beschrieben wurden, wurden mit 0,1% TFA auf das Zweifache verdünnt. Die Mischung wurde auf eine µ-Bondapak-C18-Säule (7,8 × 300 mm) (als C18¹ bezeichnet) bei Raumtemperatur isokratisch injiziert. Die Durchflußmenge wurde auf 2,0 ml/min eingestellt und die Fließgeschwindigkeit (chart speed) auf 0,25 cm/min. Der lineare Gradient wurde verwendet zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel Acetonnitril-TFA 0,1%. Die Gradienten-Bedingungen waren 0- 30% in 20 min; dann 30-45% in 150 min; 45-55% in 20 min; und 55-1000% in 10 min. Alle Lösungsmittel waren von HPCL-Qualität. 4 ml Fraktionen wurden gesammelt und gleiche Anteile von jeder Fraktion wurden auf die wachstumshemmende Aktivität untersucht. Es wurde gefunden, daß die Fraktionen 72-75 die Hauptaktivität enthielten. Die aktiven Fraktionen wurden zwischen 41 und 52% der Acetonnitril- Konzentration eluiert.

Die Fraktionen 72-75 wurden gepoolt. 16 ml von 0,1% TFA wurden den gepoolten Fraktionen zugegeben. Die Mischung wurde in eine µ-Bondapak-C18-Säule (3,9 × 300 mm) (als C18² bezeichnet) bei Raumtemperatur injiziert. Die Durchflußmenge wurde auf 1 ml/min eingestellt und die Verschiebe- bzw. Fließgeschwindigkeit auf 0,25 cm/min. Die Gradienten-Bedingungen waren 0-35% in 10 min; 35-45% in 100 min; und 45-100% in 10 min. Die Fraktionen wurden gesammelt und gleiche Anteile wurden genommen und auf GIA untersucht. Das meiste der Aktivität kam aus der Säule zwischen 40,7 und 41,3% Acetonnitril-Konzentration (Verweilzeit 83-86 min).

Aktive Fraktionen wurden gepoolt und zweifach mit 0,1% TFA verdünnt und isokratisch auf eine µ-Bondapak-C18-Säule (3,9 × 300 mm) (als C18³ bezeichnet) bei Raumtemperatur injiziert. Die Durchflußmenge war 1 ml/min und die Fließgeschwindigkeit 0,25 cm/min. Ein linearer Gradient wurde verwendet zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären-Lösungsmittel n-Propanol-TFA (0,1%). Die Gradienten- Bedingungen waren 0-23% in 20 min und 23-35% in 120 min. Fraktionen wurden gesammelt und gleiche Anteile einer jeden Fraktion wurden auf GIA geprüft. Das meiste der Aktivität erschien zwischen 25 und 26,5% Propanol-Konzentration (Verweilzeit 59 min). Diese offensichtlich homogene Fraktion enthielt annähernd 300 ng Protein und ungefähr 4000 GIA-Einheiten.

Zellwachstums-Modulations-Assay unter Verwendung von ³-Thymidin-Einlagerung in DNA (GIA)

Die Assays wurden durchgeführt in 96-Flachlochplatten (Costar 3596). Menschliche Melanomzellen (A375) wurden als sensitive Indikator-Zellinie verwendet. Zellen (3 × 10³) in 0,1 ml Dulbecco's modifiziertem Eagles-Medium (DMEM) ergänzt mit 10% FCS und PS, wurden in jedes Loch gegeben. Drei Stunden später wurden 0,1 ml der Testproben jedem Loch zugegeben. Die Platten wurden 3 Tage lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden 0,025 ml (0,5 µCi) einer Lösung von ³H-Thymidin (spezifische Aktivität 27 µCi/µ) einem jedem Loch für die letzten 6 Stunden der Inkubation zugegeben. Die Zellen wurden dann auf Glasfilterstreifen unter Verwendung eines Multiloch- Erntegerätes (multiwell harvester) (PHD Cell Harvester, Cambridge Technology, Inc.) transferiert. Die Filter wurden in Szintallationsgefäße überführt, denen 2 ml eine Szintillationsflüssigkeit (Scienti Verse II, Fisher Scientific Co.) vor dem Zählen in einem Szintillationszähler für das Quantisieren der ³H-Thymidin-Einlagerung zugegeben wurden.

Weichagar-Kolonie-Inhibierungsassay (TGI)

Eine 0,5 ml-Grundschicht von 0,5% Agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in DMEM, enthaltend 10% fötales Kalbsserum (FCS) wurde 24-Loch-Costar-Gewebekulturplatten zugegeben. 0,5 ml 0,3% Agar, enthaltend dieselbe Medium-FCS-Mischung, 1-2,5 × 10³ A375-Zellen und den zu prüfenden Faktor in verschiedenen Konzentrationen, wurden über die Agar-Grundschicht aufgelegt. Die Platten wurden bei 37°C in befeuchteter Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft inkubiert und nach 7 Tagen durch Zugabe von 0,5 ml 0,3% Agar, enthaltend dasselbe Medium und die Konzentrationen des Faktors, nachgefüttert. Die Kolonien wurden zwischen den Tagen 7 und 14 unfixiert und ungefärbt gezählt, und die Zahl der Kolonien mit mehr als 6 Zellen bewertet.

Ergebnisse: Sequenzen von Oncostatin M, isoliert aus U937-Zellen

Die N-endständige Sequenz und innere Fragmente von Oncostatin M wurden durch Mikrosequenz-Analyse bestimmt, die an reduziertem und S-pyridinäthyliertem Polypeptid und an Peptiden durchgeführt wurden, die aus der enzymatischen Verdauung von reduziertem und S-pyridinäthyliertem Oncostatin M mit Endoproteinase Lys-C und Staphylococcus aureaus V8-Protease erhalten wurden. Die Peptid-Fragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung flüchtiger Lösungsmittel gereinigt. Die Peptide wurden einer automatischen wiederholbaren Edman-Degradation im Modell 470A-Proteinsequenzer (Applied Biosystems, Inc.) unterworfen. Die Phenylthiohydantoin- Aminosäuren wurden durch Umkehrphasen HPLC (Applied Biosystems, Inc.) mit einer PTH-C18-Säule (2,1 × 220 mm, ABI) unter Verwendung eines Natriumacetat-Puffer/Tetrahydrofuran/ Acetonnitril-Gradienten für die Eluierung analysiert.

Die erhaltenen Aminosäuresequenzen sind im wesentlichen wie in Fig. 1 dargestellt.

Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denjenigen, die in der gegenwärten Protein-Datenbank (PIR Release 9.0, May 1986) gespeichert sind, ergab keine signifikanten Sequenz-Homologien mit anderen bekannten Sequenzen. Darüber hinaus gibt es keine Homologie mit Tumornekrose-Faktor, Lymphotoxin, Koloniestimulierungs- Faktor, Interleukin 1 oder 2 oder β-Transformierungs- Wachstums-Faktor.

Inhibierung der Proliferation von Tumorzellen und Vermehrung der Proliferation von normalen menschlichen Fibroplasten

Unter Anwendung des oben beschriebenen Weichagar-Kolonie-Inhibierungs- Assay wurden die nachfolgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle 1

Inhibierung der A375-Melanom-Zellkolonie-Bildung in Weichagar durch gereinigtes Oncostatin M aus U937-Zellen*

Bei der nächsten Untersuchung wurden verschiedene Behandlungen angewendet, um die Wirkung der Behandlung, sei sie chemisch oder physikalisch, auf die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu bestimmten. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 2

Wirkung von verschiedenen Behandlungen auf Überstände von TPA-induzierte U937-Zellen auf Tumorwachstums- Inhibitions-Aktivität*

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß Oncostatin M in dem dialysierten Überstand im wesentlichen beständig gegenüber Inaktivierung durch 1 N Essigsäure und 1 N Ammoniumhydroxid ist. Somit sind die erfindungsgemäßen Verbindungen relativ unempfindlich gegenüber mäßig starker Säure und mäßig starker Base. Die Verbindungen sind wärmebeständig bei 56°C über 1 Stunde jedoch nicht bei 90°C über 30 Minuten.

Die Verbindung wurde auch im Hinblick auf die Wärmestabilität der Aktivität untersucht, und es wurde gefunden, daß sie ihre Aktivität nach 1 Stunde bei 56°C behielt, jedoch im wesentlichen die gesamte Aktivität verloren hatte nach 30 Minuten bei 95°C.

Im nächsten Versuch wurde die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide zur Inhibierung der Tumorzell-Replikation einer Vielfalt von neoplastischen Zellen untersucht. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse.
Tumorzellen³H-TdR-Einlagerung

A549 (Lungenkrebs)21 HTB10 (Neuroblastom)81 A375 (Melanom) 0,3

Tumorzellen wurden 3 Stunden vorher in Mikrolöcher eingegeben, bevor die Zugabe von verschiedenen Verdünnungen von Oncostatin M, das durch Umkehrphasen-HPLC, wie oben beschrieben, gereinigt war, zugegeben wurden. Für die letzten 6 Stunden einer 3-tägigen Inkubation wurden die Zellen in 0,2 ml Medium mit ³

H-Thymidin (³

H-TdR) (0,5 µCi/Loch) markiert. Eine Einheit der Tumorwachstums-Inhibitionsaktivität (GIA) ist definiert in der Legende zu Tabelle 1 als die Menge, welche eine 50%ige Inhibition der ³

H-TdR-Einlagerung in A375-Melanom-Zellen bewirkt. Eine Einheit wurde bestimmt als annähernd 10 pg des gereinigten Proteins. Dementsprechend betrug die Konzentration (ng/ml) zur Verursachung einer 30%igen Inhibition von ³

H-TdR in A549-, HTB10- bzw. A375- Zellen annähernd 1,4, 4,0 bzw. 0,015 ng/ml. Die ³

H-TdR-Einlagerung in WI26 normale menschliche Fibroplasten war durch den U937-Faktor in keinem Experiment unterdrückt.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß Oncostatin M selektiv in seiner Fähigkeit ist, Replikation zu inhibieren, wobei in Abhängigkeit von der Natur der Zellen breit variierende Effekte vorliegen. Die erfindungsgemäße Verbindung ist wirksam gegen Melanom-Zellen, wie A375-Melanom-Zellen, squamöse Lungenkrebs- Zellen, wie A549, und Neuroblastom-Zellen, wie HTB10.

Tumorzellen wurden eingesetzt mit 3 × 10³ Zellen/Loch und normale Fibroplasten mit 1,5 × 10³ Zellen/Loch und zwar in 96-Lochplatten für 3 Stunden. Die verschiedenen Konzentrationen von gereinigtem Oncostatin M, das aus der Fraktion der C18³-Säule mit hoher antiproliferativer Aktivität gegen A375-Zellen erhalten wurde, wurden zugegeben und 3 Tage später wurde die ³H-Thymidin-Einlagerung in die Zellen gemessen und zwar in drei Löchern pro Konzentration. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4

Inhibition der Proliferation von Tumorzellen und Vermehrung der Proliferation von normalen Fibroplasten durch Oncostatin M

Zusätzlich zu dem beobachteten differentiellen Effekt auf die ³H-Thymidin-Einlagerung in Tumorzellen und in normale menschliche Fibroplasten, wurde auch ein differentieller Effekt auf die Morphologie und die Zellzahl im Anschluß an die 3-tägige Behandlung der beiden Zelltypen mit Oncostatin M, wie in Fig. 2 gezeigt, beobachtet.

Das verwendete Oncostatin M stammte aus der HPLC-C18³-Säulenfraktion mit hoher Aktivität für die Inhibierung der Proliferation von A375-Zellen. Fig. 2 stellt eine Serie von Mikrofotografien von A375-Melanom-Zellen dar, welche unbehandelt sind (A), behandelt mit 5 Wachstumsinhibierungsaktivitäts (GIA)-Einheiten von Oncostatin M (B) oder 100 Einheiten (C). Die Mikrofotografien von WI38-Fibroplasten, die unbehandelt sind, sind in (D) gezeigt, behandelte mit 5 Einheiten GIA in (E) oder mit 100 Einheiten in (F). Die Zellen wurden mit Kristall-violett in 0,5% Methanol gefärbt. Vergrößerung 63-fach.

NaDodSO₄/PAGE von Oncostatin M

Es wurde gefunden, daß gereinigtes Oncostatin M, NaDodSO₄ unter reduzierenden Bedingungen unterworfen, ein scheinbares (apparent) Molekulargewicht von annähernd 28 kD besitzt, wie in Fig. 3 gezeigt. Die nachfolgenden Proteine wurden als Standard-Proteine verwendet (Bahn A): Eialbumin, Mr = 43 kD; Chymotrypsinogen α, Mr = 25,7 kD; Lactoglobulin β, Mr = 18,4 kD; Lysozym, Mr = 14,2 kD; Rindertrypsin-Inhibitor = 6,2 kD; Insulin A und B-Kette, Mr = 2,3 kD bzw. 3,4 kD. Oncostatin M wurde auf Bahn bzw. Spur B aufgetragen.

Oncostation M wurde PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen unterworfen und hatte ebenfalls ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kD und Protein, das aus der Bande elektroeluiert wurde, zeigte Inhibierung der Proliferation von A375-- Zellen.

Antikörper zu einem synthetischen Peptid von Oncostatin M reagiert in ¹²⁵I-markierten Oncostatin M in Radioimmun- Präzipitation

• a) Peptid-Synthese: Das Peptid entsprach den Resten 6-19 des Oncostatin M-Proteins und wurde durch Fest-Phasentechnik, wie beschrieben, auf einem Beckman-automatisierten Gerät synthetisiert (Gentry et al., J. Biol. Chem. (1983) 258: 11219). Das Peptid wurde vom Harz unter Verwendung der "low-high" HF-Verfahrensweise (Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. (1983) 105: 6442-6445) gespalten.
• b) Herstellung von Antikörpern: Das Peptid wurde an Rinder- γ-Globulin wie beschrieben gekuppelt (Gentry und Lawton, Virology (1986) 152: 421-431). Weiße Neuseeland- Kaninchen wurden geprimed und fünfmal verstärkt und zwar subcutan an 4 Stellen, wie beschrieben (Gentry und Lawton, Virology (1986) 152: 421-431). Antiseren wurden 2 Wochen nach der fünften Verstärkung (boost) erhalten.
• c) Jodierung von Oncostatin M: Eine Probe von partiell gereinigten Oncostatin M wurde mit Jod 125 unter Anwendung veröffentlicher Verfahrensweisen radiomarkiert (Linsley et al, PNAS (1985) 82: 356-360). Eine aliquote Menge der markierten Präparation, die 100.000 cpm enthielten, wurde mit Kaninchen-Antiserum vermischt, welches gegen die N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M gerichtet war (Endverdünnung 1 : 20), und zwar in Abwesenheit oder Anwesenheit des N-endständigen Peptids (die N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M) (2 µg) und der Immunpräzipitationsanalyse unterworfen, wie beschrieben (Linsley et al., Biochemistry (1986) 25: 2978-2986).

Speziell wurde ein 5 µl enthaltendes Rohr präinkubiert mit 2 µg des N-endständigen Peptids in 10 Ml TNEN (20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% Nonidet P-40), das 0,1% BSA enthielt, und zwar während 30 Minuten bei 4°C, bevor die Zugabe von I¹²⁵ Oncostatin M in 85 λ TNEN, das 0,1 § BSA uund 40 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt, erfolgte. Sieben Rohre, die 5 µl Antiseren enthielten, wurden mit I¹²⁵ Oncostatin M in 85 µl TNEN, das 0,1% BSA und 40 mM Dtt enthielt, während 30 Minuten bei 4°C inkubiert, bevor die Zugabe von 50 µl 10% formalinfixiertem Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem) erfolgte.

Im Anschluß an eine zusätzliche Inkubation während 30 Minuten bei 4°C wurden die Rohre mikrofugiert, und die Pellets wurden viermal mit 1 ml TNEN gewaschen, bevor sie der PAGE- Analyse unterworfen wurden. Eine diffuse Bande von Mr = 32 kD wurde nach der SDS/PAGE-Analyse des Immunpräzipitats beobachtet. Die Präzipitation dieser Spezies wurde durch den Einschluß eines Überschusses an unmarkiertem Peptid inhibiert, das den N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M entsprach, was anzeigt, daß die Präzipitation spezifisch für dieses Peptid ist.

Die Kohlenhydrat-Zusammensetzung von Oncostatin M wurde durch Testen auf Glykosidase-Empfindlichkeit geprüft. Immunpräzipitate, die wie in c) oben hergestellt wurden, wurden mit Puffer, Endoglykosidase H oder Neuraminidase behandelt, wie von Linsley et al. (1986) beschrieben. Die Behandlung mit Endoglykosidase H, einem Enzym mit Spezifität für N-gebundene Oligosaccharide mit hohem Mannoseanteil führte zum Erscheinen einer Spezies mit einem niedrigerem Molekulargewicht von Mr = 24 kD. Nur ein Teil des radiomarkierten Materials war empfindlich auf dieses Enzym, was anzeigt, daß nicht alle Moleküle Oligosaccharide mit hohem Mannoseanteil enthielten. Die Behandlung mit Neuraminidase führte zum Erscheinen einer einzelnen Bande von Mr = 27 kD, was anzeigt, daß die Heterogenität in der Größe von unbehandeltem ¹²⁵I- markiertem Oncostatin M auf eine Molekularheterogenität bei der Sialyation des Glykoproteinkerns zurückzuführen war. Die Ergebnisse zeigen, daß aktive Präparationen von Oncostatin M eine Mischung von Mannose-reicher und komplexer N-gebundener Oligosaccharid-Seitenketten enthielt.

Oncostatin M isoliert aus normalen menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL) Herstellung eines Tumorzellwachstumsinhibitors aus PBL's

Leukofraktionen, die von der Blutbank erhaltene PBL's enthielten, wurden 1 : 1 mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) verdünnt. 35 ml verdünntes Blut wurden mit 10 ml einer Lösung aus 9% Ficoll, enthaltend 20 Volumen-% an 50%igem Natriumditriozat (Enddichte 1,080), unterschichtet. Die Gradienten wurden bei Raumtemperatur während 20 Minuten bei 850 × g zentrifugiert. Zellen wurden aus der Gradienten-Zwischenschicht gesammelt und mit PPBS gewaschen. Rote Blutzellen wurden während 3-4 Minuten mit 10-20 ml einer Lösung, die 0,8% Ammoniumchlorid und 0,1% Na₄-EDTA enthielt, schocklysiert.

Die Zellen wurden aus der Lysierungslösung der roten Blutzellen durch Zentrifugation bei 600 × g während 10 Minuten gesammelt und in 10 ml RPMI-1640-Medium (GIBCO), das 5% fötales Rinderserum enthielt, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde während 5 Minuten bei 37°C bewegt, und man ließ die plättchenförmigen Aggregate während 5 Minuten absetzen. Die suspendierten Zellen wurden in neue Rohre überführt, durch Zentrifugation gewonnen, in 1 ml fötalem Rinderserum resuspendiert und auf eine Säule überführt, welche 0,5 g gebürstete, vorbenetzte Nylonwolle, Typ 200 (Fenwal) enthielt.

Die Nylonwoll-Säule wurde bei 37°C während 30 Minuten inkubiert, um eine Anheftung der Monozyten und B-Lymphozyten zuzulassen. Die Säule wurde dann gewaschen mit 3 × Volumen von RPMI-1640-Medium (37°C), das 5% fötales Rinderserum enthielt, und die eluierten nichtanhaftenden Zellen (PBL) wurden gesammelt.

PBL (2 × 16⁶ Zellen/ml) wurden bei 37°C 5% CO₂-95% Luft während 96 Stunden in RPMI-1640-Medium (10,4 g/l) kultiviert, das FeSO₄ · 7H₂O (1 mg/l), ZnSO₄ · 7H₂O (2 mg/l) Na₂SeO₃ · 5H₂O (0,017 mg/l), 1-Aminomäthanol (1 mg/l) menschliches Transferrin (5 mg/l), Rinderserum Albumin-Linolsäurekonjugat (Sigma) (200 mg/l), L-Glutamin (300 mg/l), Pinicillin/ Streptomycin (100.000 Einheiten/l) und Phytohämagglutinin-P (Wellcome) (2 mg/l) enthielt. Die Überstände wurden gesammelt, zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, konzentriert durch Ultrafiltration (Amicon Diaflo-Membran YM-10, 10 kD abgeschnitten), und gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert (Spectrapore 3 Dialyserohre). Der geklärte Rückstand wurde lyophilisiert.

Gel Permeations-Chromatographie

Die rohe Fraktion wurde in 20 ml 1 M Essigsäure (50 mg/l) rekonstruiert und auf eine BioGel P-100-Säule (2,6 × 88 cm), die mit 1 M Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht war, mit einer Durchflußmenge von 0,5 ml/min aufgetragen. 12 ml Fraktionen wurden gesammelt. Eine aliquote Menge einer jeden Fraktion wurden eingedampft und in dreifachen Ansätzen auf die Wachstumsinhibitionsaktivität (GIA) von A375-Zellen geprüft. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt, lyophylisiert und auf einer Bio-Sil TSK-250-Säule (600 × 21,5 mm) rechromatographiert, wie beschrieben.

Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie von TSK-250-Fraktionen

Die endgültige Reinigung der gepoolten TSK-250-Fraktionen wurde erreicht durch Umkehrphasen HPLC, im wesentlichen wie beschrieben. Der PBL-abgeleitete Tumorzellinhibitor eluierte aus µ-Bondapak C18 bei 40-41% Acetonnitril- bzw. 26,5% n-Propanol-Konzentrationen.

Zellwachstums-Modulationsprüfung unter Verwendung einer ¹²⁵I-Joddeoxyuridin-Einlagerung in DNA (GIA):

Diese Prüfungen wurden durchgeführt in 96-Loch Gewebekulturschalen mit flachem Boden (Costar 3596). Menschliche Melanom- Zellen, A375 (4 × 10³) in 50 µl Testprobe wurden jedem Loch zugegeben und während 3 Tagen bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden 24 Studen lang mit ¹²⁵I-IdU (0,05 µCi/Loch) markiert und weitere 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, mit einem Mehrfachprobenernter geerntet, und die Radioaktivität wurde in einem Gammazähler gezählt.

Ergebnisse:

Eine Präparation von PBL-abgeleitetem Tumorzell-Inhibitor wurde einem automatisierten wiederholten Edman-Abbau unterworfen. Die aminoendständige Aminosäuresequenz ist wie folgt:

X bedeutet eine Aminosäure, die nicht identifiziert wurde.

Ein Vergleich dieser Sequenz mit der von U937-Faktor zeigt klar die Identität mit dem N-Ende des PBL-abgeleiteten Faktors.

Bei der nächsten Untersuchung wurde die Fähigkeit von PBL- abgeleitetem Oncostatin M zur Beeinflussung der Replikation einer Vielzahl von Zellen untersucht. Es wurde gefunden, daß Mäuse L929-Zellen unempfindlich gegenüber PBL-abgeleitetem Oncostatin M unter Verwendung bis 1.000 GIA-Einheiten/ml sind. Menschliche Fibroplasten, WI26, wurden durch Behandlung mit 1.000 GIA-Einheiten/ml im Wachstum stimuliert. Normale menschliche T-Lymphozyten-Proliferation 72 Stunden nach der Mitogenese wurde nicht beeinflußt durch bis zu 500 GIA- Einheiten/ml.

Aus den obigen Ergebnissen zeigt sich, daß ein neues Polypeptid und Polypeptid-Fragmente bereitgestellt wurden, welche für die Modulierung des Zellwachstums verwendet werden können. Es wurde gefunden, daß die Verbindung eine variierende Aktivität besitzt in Abhängigkeit von der Natur der betroffenen Zellinie, so daß sie selbst oder in Verbindung mit anderen Verbindungen zur Modulierung von Zellwachstum verwendet werden kann. Die erfindungsgemäßen Polypeptide fügen deshalb ein zusätzliches Polypeptid zu, das mit Mischungen von Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden kann, um selektiv die Zellproliferation eines bestimmten Zelltyps zu vermindern oder zu erhöhen.

Insbesondere kann der Faktor verwendet werden zur Behandlung von Zellen für autologe Knochenmarkstransplantate. Die Verwendung des Faktors inhibiert das Wachstum von Tumorzellen im Mark und kann die Koloniezellbildung stimulieren. Oncostatin M kann auch zum Stimulieren des Wachstums von Epithel- Zellen verwendet werden, wodurch es die Wundheilung beschleunigt. Zusätzlich können intaktes Polypeptid oder Fragmente davon als Immunogene verwendet werden, um die Antikörperbildung zu induzieren. Die induzierten Antikörper finden ihrerseits Verwendung zum Titern von in einer Körperflüssigkeit vorhandenem Oncostatin M oder zur Modulierung der Aktivität des Faktors durch Bindung an ihn. Weiterhin können diese Antikörper zusammen mit gereinigtem Oncostatin M oder Fragmenten davon als Komponent von diagnostischen Kits verwendet werden in Verbindung mit anderen Reagenzien, insbesondere Antikörpern, um Oncostatin M aufzuspüren und zu quantifizieren.

Obwohl die vorhergehende Erfindung zum Zwecke der Erläuterung und zum guten Verständnis im Detail beschrieben wurde, so ist es für den Fachmann klar, daß Abweichungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Umfang der Ansprüche zu verlassen.

Claims (19)

1. Poly(aminosäure) mit mindestens acht Aminosäuren, welche immunologisch kreuzreaktiv mit einer Verbindung ist, welche ein aus Leukozyten erhältliches Polypeptid ist, zur Inhibition der Proliferation von neoplastischen Zellen fähig ist, die Proliferation von normalen menschlichen Fibroplasten zu stimulieren vermag, menschlichen proliferativen und zytotoxischen T-Zell-Response nicht inhibiert und granulozytische/myelozytische Knochenmarkskolonie- Zellbindung nicht inhibiert, ein Molekulargewicht im Bereich von ca. 17 bis 19 kD, bestimmt durch Gel-Exlusionschromatographie, und von ca. 28 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, besitzt und von ca. 28 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, besitzt und relativ unempfindlich gegenüber milde Säure und Base und mäßig erhöhte Temperaturen ist.

2. Poly(aminosäure) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäuresequenz mit mindestens zehn aufeinanderfolgenden Aminosäuren besitzt, welche einer in Fig. 1 wiedergegebenen Aminosäuresequenz entspricht, und von dieser Sequenz durch nicht mehr als drei Aminosäuren abweicht.

3. Poly(aminosäure) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwölf aufeinanderfolgende Aminosäuren enthält, welche einer in Fig. 1 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, und von dieser Sequenz durch nicht mehr als eine Aminosäure abweicht, wobei diese Abweichung entweder eine Leerstelle oder eine konservative Substitution ist.

4. Neue Polypeptid-Zusammensetzung, die aus Leukozyten erhältlich ist, und eine Komponente enthält, die zur Inhibition der Proliferation von neoplastischen Zellen und zur Stimulierung der Proliferation von normalen menschlichen Fibroplasten fähig ist, menschlichen proliferativen und zytotoxischen T-Zell-Response nicht inhibiert und granulozytische/myelozytische Knochenmarkskolonie- Zellbildung nicht inhibiert, ein Molekulargewicht im Bereich von ca. 17 bis 19 kD, bestimmt durch Gel-Exklusionschromatographie, und ca. 28 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, besitzt und relativ unempfindlich ist gegenüber mäßige Säure bzw. Base und mäßig erhöhte Temperaturen und eine Reinheit besitzt, die eine spezifischen Aktivität von mindestens ca. 10 GIA-Einheiten/ng-Protein ergibt.

5. Polypeptid-Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Leukozyten mitogenaktivierte normale menschliche periphere Blutlymphozyten sind.

6. Polypeptid-Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Leukozyten Phorbol-Diester-induzierte menschliche histiozytische Lymphomzellen sind.

7. Polypeptid-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen frei von Zellbestandteilen ist.

8. Polypeptid, erhältlich aus einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Aktivität des Polypeptids bei mindestens ca. 100 GIA-Einheiten/ng-Protein liegt.

8. Polypeptid, erhältlich aus einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Aktivität des Polypeptids bei mindestens ca. 100 GIA-Einheiten/ng-Protein liegt.

9. Polypeptid, das im wesentlichen frei von Zell-Bruchstücken und anderen leukozytischen Proteinen ist, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Inhibition der Proliferation von neoplastischen Zellen und zur Stimulierung der Proliferation von normalen menschlichen Fibroplasten in der Lage ist, menschlichen proliferativen und zytotoxischen T-Zell-Response nicht inhibiert, granulozytische/ myelozytische Knochenmarkskolonie-Zellbildung nicht inhibiert, ein Molekulargewicht im Bereich von ca. 17 bis 19 kD, bestimmt durch Gel-Exclusionschromatographie, und ca. 28 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, besitzt und relativ unempfindlich gegenüber mäßiger Säure und Base und mäßig erhöhte Temperaturen ist und Aminosäuresequenzen besitzt, die den in Fig. 1 angegebenen Sequenzen entsprechen, wobei nicht mehr als drei Aminosäure-Abweichungen zwischen der dargestellten Sequenz und der entsprechenden Sequenz vorliegen.

10. Polypeptid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die entsprechende Sequenz durch nicht mehr als eine Aminosäure von der dargestellten Sequenz abweicht.

11. Verfahren zum Inhibieren der Proliferation von neoplastischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit einer die Proliferation inhibierenden Menge der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 8 in Kontakt bringt.

12. Verwendung einer die Proliferation von Fibroplasten stimulierenden Menge eines Polypeptids nach Anspruch 8 zur Beschleunigung der Wundheilung.

13. Für eine Polypeptid-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, insbesondere nach Anspruch 1 oder Anspruch 4 spezifische Antikörper.

14. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 13.

15. Verfahren zum Auffinden des Vorhandenseins einer Polypeptid- Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe, von der man annimmt, daß sie die Zusammensetzung enthält, mit einem Antikörper nach Anspruch 13 kombiniert und die Menge der Komplexbildung mit dem Antikörper bestimmt.

16. DNA-Sequenz, die ein Polypeptid nach Anspruch 8 kodiert.

17. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zellkultur wachsen läßt, die Zellen mit einem Expressions-Bauteil mit einer DNA-Sequenz enthalten, die ein Polypeptid nach Anspruch 4 kodiert, und zwar unter der regulierenden Kontrolle von transkriptionellen und translationellen Regulationssignalen, die funktionell in den Zellen vorhanden sind, wobei das Polypeptid exprimiert wird, und daß man das Polypeptid im wesentlichen frei von Zellmaterial isoliert.

18. Diagnostischer Kit mit einem Antikörper nach Anspruch 13 und mindestens einer Poly(aminosäure) nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 10.