FR2597108A1 - Nouveaux polypeptides, leur procede d'obtention, anticorps monoclonaux specifiques pour ces polypeptides, et utilisation de ces polypeptides - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE DES NOUVEAUX POLYPEPTIDES, LEUR PROCEDE D'OBTENTION, DES ANTICORPS MONOCLONAUX SPECIFIQUES POUR CES POLYPEPTIDES, ET L'UTILISATION DE CES POLYPEPTIDES. CES POLYPEPTIDES CONTIENNENT UNE SEQUENCE D'ACIDES AMINES POSSEDANT AU MOINS 10 ACIDES AMINES CONSECUTIFS QUI CORRESPONDENT A LA SEQUENCE SUIVANTE: (CF DESSIN DANS BOPI) ET DIFFERANT DE LA SEQUENCE CI-DESSUS DE PAS PLUS DE 3 ACIDES AMINES. LES COMPOSITIONS DE POLYPEPTIDE DE CETTE INVENTION PERMETTENT LA MODULATION DE LA CROISSANCE DES CELLULES, EN PARTICULIER L'INHIBITION DE LA CROISSANCE DES CELLULES TUMORALES ET LA STIMULATION DE LA CROISSANCE DES FIBROBLASTES NORMAUX.

Description

La présente invention se rapporte d'une manière générale à un nouveau

facteur de régulation de la croissance des cellules, et concerne plus particulièrement

des nouveaux polypeptides, leur procédé d'obtention, des 5 anticorps monoclonaux spécifiques pour ces polypeptides, et l'utilisation de ces polypeptides.

On sait que les leucocytes, à savoir les lymphocytes et les monocytes, ont été impliqués dans l'inhibition de la croissance des tumeurs pour plusieurs types de tumeurs 10 chez les animaux. L'incidence accrue des malignités chez les êtres humains dont l'immunité est compromise, supporte l'affirmation que les globules blancs du sang jouent un rôle dans la régulation de la croissance néoplasique. Les facteurs protéiques produits par ces globules blancs, qui inhibent la croissance des tumeurs ou modulent les fonctions immunitaires et qui ont déjà été isolés et caractérisés, comprennent les interférons, X et T, les facteurs nécrosants ou tuant les tumeurs, la lymphotoxine, l'interleukine-2, et d'autres lymphokines. Etant donné que 20 chacun des facteurs qui ont été isolés comporte un spectre d'activités différent et peuvent interagir différemment conjointement à d'autres facteurs, il demeure qu'il y a un intérêt important et continu à isoler et à caractériser tous les facteurs que produisent les globules blancs lors 25 de la modulation de la croissance des cellules ou des fonctions immunitaires. Ces composés, individuellement ou ensemble, peuvent trouver application dans le traitement ou le diagnostic du cancer, comme promoteurs de la cicatrisation des plaies ou comme immunomodulateurs pour le traite30 ment des malades atteints d'immunodéficiences, d'autoimmunité,

de transplantations d'organes, et analogues.

Il y a plusieurs difficultés qui peuvent être rencontrées dans la découverte, l'isolation, la purification, ou la caractérisation des facteurs se produisant naturelle35 ment. Des méthodologies doivent être développées pour séparer et purifier un facteur d'intérêt des autres facteurs dans le matériau brut de départ sans dénaturer l'activité :: u ô: 0:::: ::::5 :20: A: f à::25 e

du facteur désiré. Des essais biologiques doivent être développés pour permettre l'identification des fractions pendant les séparations qui concentrent un facteur particulier. Un nouveau facteur doit être distingué des facteurs qui sont déjà connus ou d'autres facteurs inconnus qui peuvent être présents et peuvent affecter, soit négativement ou positivement, l'activité du facteur qui est recherché. Le facteur purifié doit être caractérisé. Et le facteur purifié doit être concentré suivant une quantité suffisante pour permettre l'identification et la caractérisation du facteur. Par conséquent, étant donné le nombre croissant de facteurs qui ont été isolés, chaque nouveau facteur devient plus difficile à identifier, puisque son rôle et sa fonction peuvent être obscurcis par les nombreux autres facteurs qui sont présents.

Beal et autres, Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3:93-96 décriventlaprésence de peptides dans l'urine humaine, lesquels inhibent la croissance et la synthèse d'ADN plus dans les cellules transformées que dans les cellules normales. Holley etautres, Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 77:5989-5992 décrivent la purification des inhibiteurs de croissance des cellules épithéliales. Letansky, Biosci. Rep. (1982) 2:3945 révèle que les peptides purifiés à partir de placenta bovin inhibent la croissance des tumeurs et l'incorporation de thymidine dans l'ADN d'une manière plus importante dans les néoplasmes que dans les cellules normales. Chen, Trends Biochem. Sci. (1982) 7:364-365 décrit l'isolation d'un peptide à partir de liquides ascites avec une propriété de suppression du cancer. Redding et Schally, Proc. Natl. Acad. Sci. (1982) 79: 7014-7018 décrivent l'isolation de peptide(s) purifiés à partir de l'hypothalamus porcin, qui présentent une activité antimitotique contre plusieurs lignées cellulaires tumorales et normales. Sone et autres, Gann (1984) 75:920-928 décrivent la production d'un facteur et de facteurs produits par les macrophages humains qui inhibent la croissance de certaines cellules tumorales in vitro. Ransom et autres, Cancer Res. (1985) :851-862, décrivent l'isolation d'un facteur appelé leukoréguline qui inhibe la réplication de certaines lignées de cellules tumorales, et qui apparaît distinct de la lymphotoxine, de l'interféron et de l'interleukine 1 et 2. La plupart de ces facteurs ni'ont pas été complètement caractérisés, et leurs structures primaires ne sont pas

connues non plus.

Aggarwal et autres, J. Biol. Chem. (1984) 259: 686-691 ont purifié et caractérisé la lymphotoxine humaine 10 (LT) produite par une lignée de cellules lymphoblastoîdes

et ont ensuite séquencé LT (Aggarwal et autres, J. Biol.

Chem. (1985) 260:2334). L'interféron gamma (-Y-IF) qui est produit par des cellules lymphoides et présente une activité d'inhibition des tumeurs et immunomodulatrice a 15 été cloné et exprimé. (Gray et autres, Nature (1982) 295: 503:508). Le facteur tuant les tumeurs (TNF), qui inhibe la croissance de certaines tumeurs et est produit par des macrophages et certaines lignées de cellules de la leucémie

a été caractérisé, et l'ADNc TNF a été cloné et exprimé 20 par E. coli (Pennica et autres, Nature (1984) 312:724).

Suivant l'invention, un nouveau facteur de peptide et des fragments biologiquement actifs de ce facteur sont proposés, lequel facteur peut être obtenu à partir des leucocytes. Ce facteur trouve une application dans la modulation de la croissance des cellules, telle que dans l'inhibition de la croissance des cellules tumorales et la stimulation de la croissance des fibroblastes normaux, et peut moduler les fonctions immunitaires. Ce facteur possède une séquence d'acides aminés qui est différente 30 des séquences des autres composés qui ont été décrits

comme ayant des propriétés analogues.

- La figure i représente la séquence d'acides aminés des fragments d'oncostatine M; - la figure 2 montre une série de microphotographies 35 de cellules traitées avec l'oncostatine M, les photographies A et C montrant des cellules de mélanome A375 traitées avec 0,5 et 100 unités GIA respectivement, et les photographies D à F sont des fibroblastes W138 traités avec 0,5 et 100 unités GIA respectivement; et - la figure 3 est une photographie d'une analyse SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide-sulfate de dodécyl sodium), de l'oncostatine M. La présente invention a pour objet un nouveau polypeptide, des compositions polypeptidiques, des mutations et fragments de ces polypeptides, leur préparation ainsi que leur utilisation, ainsi que les compositions démontrant 10 une activité dans la modulation de la croissance des cellules, particulièrement dans l'inhibition de la croissance des cellules tumorales et dans la stimulation de la croissance des fibroblastes normaux. Un polypeptide objet de cette invention et appelé oncostatine M peut être obtenu à partir des leucocytes; par exemple à partir de milieux conditionnés de cellules U937 stimulées ou de milieux conditionnés de lymphocytes du sang normaux périphériques et stimulés de l'être humain (PBL). Les

fragments et les mutants du polypeptide possédant l'acti-

30 35

vité biologique de l'oncostatine M intacte,telle une activité de modulation de la croissance des cellules ou une activité immunologique, font également l'objet de l'invention.

Les fragments de polypeptide selon cette invention sont des nouveaux polypeptides d'au moins 8 acides aminés qui sont biologiquement actifs, de façon à pouvoir au moins immunologiquement réagir par réaction croisée avec l'oncostatine M qui se produit naturellement. L'expression "immunologiquement réagir par réaction croisée" signifie qu'un anticorps induit par un nouveau polypeptide de cette invention réagira de façon croisée avec l'oncostatine M intacte au moins lorsque l'oncostatine M est à l'état dénaturé. Ces polypeptides sont par conséquent utiles pour induire des anticorps pour 1' oncostatine M, qui peuvent être utilisés pour déterminer la concentration de l'oncostatine M dans un fluide corporel, pour lier l'oncostatine M et ainsi moduler son activité, et pour purifier l'oncostatine M>tel que par utilisation dans une colonne d'affinité. Une partie des polypeptides peut également retenir l'activité de modulation de la croissance des cellules, de l'oncostatine M intacte, bien que cette activité puisse être modulée, habituellement réduite, comparativement à l'oncostatine M intacte. La figure i représente la séquence des acides aminés des polypeptides ou poly(acide aminé)s réagissant par réaction croisée avec l'oncostatine M, la première 10 séquence représentant le N-terminal de l'oncostatine M. Les polypeptides ou poly(acide aminé)s de la présente invention contiennent une séquence d'acides aminés possédant au moins 8 acides aminés consécutifs qui correspond à une séquence d'acides aminés montrée sur la figure i et diffère de cette séquence de pas plus de 3, habituellement pas plus de i acide aminé. Cette différence peut être soit l'insertion d'un acide aminé, la délétion d'un acide aminé ou la substitution d'un acide aminé par un autre, particulièrement une substitution conservative. 20 Habituellement les poly(amino acide)s contiennent au moins , plus souvent au moins 12, acides aminés consécutifs qui correspondent aux séquences montrées sur la figure

et diffèrent de pas plus d'un acide aminé.

Dans un but d'explication de la présente invention, 25 les divers acides aminés seront divisés en un certain nombre de sous-classes. Le tableau suivant indique les sous-classes: aliphatique neutre non-polaire G A P V L I polaire S T C M N Q acide D E basique K R aromatique F H Y W

15 20

30

Par substitution conservative, il faut comprendre que les acides aminés de la même sous-classe (c'est-à-dire soit aliphatique neutre, aliphatique acide, aliphatique basique ou aromatique), plus particulièrement de même polarité, peuvent être substitués l'un par l'autre. D'une manière désirable, les acides aminés de deux à quatre atomes de carbone ou de cinq à six atomes de carbone définissent des groupements de monomères dans la sous-classe aliphatique.

Les polypeptides ou poly(acides aminés) ne dépassent pas une longueur d'environ 1.000 acides aminés. Habituellement, ils comporteront moins de cent acides aminés, plus souvent moins de cinquante acides aminés. Ainsi, les polypeptides ou poly(acides aminés) peuvent être facilement synthétisés. Habituellement, lorsque les poly-acides aminés dépassent 100 acides aminés, ils peuvent être des polymères de fragments d'oncostatine M possédant moins de 100 acides aminés chacun, ou des protéines fusionnées dans lesquelles le fragment est fusionné avec un antigène, une enzyme, des fragments d'enzyme etc... En particulier, les poly-acides aminés de poids moléculaire plus élevé peuvent constituer au moins un fragment de polypeptide de moins d'environ 100 acides aminés réunis de manière covalente à un support polypeptidique immunogène important, de façon à réaliser l'immunogénicité. Des exemples de tels supports protéiques sont l'albumine de sérum bovin, le KLH ("keyhole limpet hemocyanin"), ou analogues. Ces polypeptides conjugués seront utiles pour induire des anticorps dans un organisme hâte approprié.

Les cellules U937 constituent une lignée cellulaire dérivant d'une lignée cellulaire de lymphomes histiocytiques (Sundstrom et Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17:565-577) qui peut être induite pour se différencier en cellules possédant des caractéristiques de macrophages à la suite d'un traitement avec une variété d'agents (Harris et autres, Cancer Res. (1985) 45:9-13). Pour produire l'oncostatine M, les cellules U937 peuvent être élevées dans un milieu nutritif classique avec du sérum et traitées avec un inducteur approprié. D'une manière commode, les phorbols ou les ingénols peuvent être utilisés, en particulier le 12-0tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA). Habituellement, on peut utiliser d'environ 5 à 20 ng/ml d'inducteur. Le nombre initial de cellules est compris entre environ 105

et 106 de cellules/ml.

Après avoir laissé les cellules à traiter avec l'inducteur pendant un temps suffisant, généralement de trois à six jours, le surnageant est éliminé, les cellules lavées avec un milieu nutritif sans sérum, les cellules attachées ou associées lavées à nouveau avec un milieu nutritif sans sérum, et les cellules sont soumises à l'incubation pendant au moins 12 heures, habituellement 15 pas plus d'environ 48 heures, dans un milieu nutritif sans sérum, par exemple le milieu connu sous la dénomination RPMI-1640. Les surnageants sont ensuite recueillis et les cellules sont éliminées par centrifugation. Les produits surnageants dépourvus de cellules furent testés 20 pour évaluer l'activité inhibitrice de la croissance des

cellules (GIA) comme décrit dans le programme expérimental.

Le surnageant contient environ de 50 à 500 unités de GIA/ml (voir données expérimentales pour la définition

des unités GIA).

L'oncostatine M peut également être obtenue à partir de lymphocytes périphériques humains normaux stimulées par mitogènes (PBL). Les PBL peuvent être isolés à partir de leuco-fractions en diluant les fractions et en les centrifugeant sur gradients de Ficoll. Les cellules 30 recueillies de l'interface des gradients sont lavées et lysées pour éliminer les globules rouges. Les cellules ou globules restants sont recueillis à partir de cette solution par centrifugation, puis remis en suspension dans un tampon contenant du sérum et de la thrombine, 35 agités et l'agrégat de plaquettes est laissé au repos pendant une courte période de temps. Les cellules en suspension sont transférées, récupérées par centrifugation, remises en suspension dans du sérum et transférées dans une colonne contenant de la laine de nylon. La colonne est laissée en incubation pour permettre les associations

de monocytes et de B-lymphocytes et est ensuite lavée.

La plupart des lymphocytes T périphériques n'adhèrent pas et sont élués depuis la colonne. Ces cellules sont cultivées à 37 C dans un milieu de culture, par exemple le milieu RPMI-1640, et traitées avec un inducteur approprié, par exemple la phytohémaglutinine (environ 1 à 10 5 mg/i), pendant environ 100 heures et ensuite les surnageants sont recueillis. Les surnageants sont soumis à une centrifugation jusqu'à élimination des cellules et

concentrés par ultrafiltration ou dialyse.

Après avoir isolé le surnageant dépourvu de cellules, de soit les cellules U937, soit les PBL normaux, le milieu conditionné est concentré, en utilisant commodément un système à fibres creuses ou une membrane d'ultrafiltration, ce après quoi on effectue une dilution avec de l'acide acétique (jusqu'à une concentration d'acide 20 acétique 0,1N), puis on concentre environ dix fois et la dilution et la concentration sont répétées. Le concentré peut être lyophilisé et utilisé directement ou bien le produit lyophilisé peut être utilisé pour purification ultérieure. L'oncostatine M objet de la présente invention, peut être purifiée par chromatographie sur gel en utilisant un mélange aqueux de 40% d'acétonitrile et 0,1% d'acide trifluoroacétique, sous la forme d'une phase mobile isocratique sur une colonne Bio-sil TSK250, puis on contrôle l'activité pour chacune des fractions. La purification donne une composition possédant au moins environ

0,5-5 x 10 unités GIA/ml dans les fractions actives.

Le produit partiellement purifié à partir de la chromatographie sur gel peut être encore purifié en employant la chromatographie liquide haute performance en phase inverse utilisant un gradient linéaire, et dans laquelle le solvant primaire est constitué par 0,1% d'acide

trifluoroacétique dans l'eau et le solvant secondaire par de l'acétonitrile contenant 0,1% d'acide trifluoroacétique.

On peut faire varier le programme de l'opération, étant entendu que généralement, la chromatographie exige environ 3 à4 heures, avec la plus grande partie du temps, plus

grande qu'environ 50% du temps et pas plus d'environ 80% du temps, dans l'intervalle 30-45% du solvant secondaire.

Dans ces conditions, les fractions actives sont éluées

à environ 41-42% d'acétonitrile.

Les fractions actives regroupées ou en masse peuvent être encore purifiées en répétant la chromatographie en phase inverse, en utilisant un changement plus rapide quant aux conditions de gradient, et un débit

d'écoulement plus lent. Dans ces conditions, l'activité 15 se situe à environ 40,5-41,5% d'acétonitrile.

La chromatographie haute performance en phase inverse peut ensuite être répétée, en changeant le système solvant, et o le solvant secondaire est du n-propanolacide trifluoroacétique 0,1%. Un gradient linéaire est 20 utilisé, lorsque le gradient est changé lentement dans l'intervalle 2335% de n-propanol. L'activité majeure est observée dans l'intervalle propanol 25,5-27,5%, pour donner un produit sensiblement homogène, possédant une activité spécifique de plus de 10 unités GIA/ng protéine. 25 Habituellement, le produit est purifié pour donner une activité spécifique d'au moins environ 100 unités GIA/ng

protéine, plus souvent 150 unités GIA/ng.

Les composés de cette invention sont caractérisés par un poids moléculaire d'environ 17 à 19 kiloDaltons (kD), en particulier d'environ 18 kD, comme déterminé par chromatographie d'exclusion. Ces composés sont en outre caractérisés comme possédant un poids moléculaire apparent d'approximativement 28 kD comme déterminé par électrophorèse

sur gel de polyacrylamide sous conditions de non réduction 35 ou de réduction.

La séquence des acides aminés des fragments de l'oncostatine M purifiée fut analysée. L'oncostatine possède sensiblement les séquences d'acides aminés représentées sur la figure 1. En se référant à la figure 1, la première séquence illustre le N-terminal de l'oncostatine M, tandis que les séquences restantes illustrent les

fragments internes du polypeptide.

Des préparations actives de l'oncostatine M isolée contenaient un mélange de mannose supérieure et d'oligosaccharide complexe liés par N. Cependant, les préparations

non glycosylées d'oncostatine M retenaient l'activité de 10 modulation de la croissance des cellules.

L'oncostatine M est encore caractérisée par son activité contre certaines souches. Le polypeptide objet de l'invention manque d'activité cytotoxique contre les fibroblates humains W138 et W126, et les cellules de 15 souris L929 qui sont sensibles à un facteur tuant les tumeurs, et une lignée de cellules tumorales humaines sensibles au Y-interféron. Il a également été trouvé qu'il n'inhibe pas la prolifération des lymphocytes T humains normaux ou qu'il n'inhibe pas la formation des 20 colonies myélocytiques/granulocytiques à partir de cellules de moelle osseuse à des concentrations jusqu'à 100 unités GIA/ml. En outre, l'oncostatine M stimule la prolifération des fibroblastes humains normaux comme cela est par exemple le cas, par les cellules W126 et W138 et inhibe 25 la prolifération des cellules tumorales telles que A375, HBT10, A549 et SKMEL28 et peut augmenter la croissance des cellules formant une colonie à partir de la moelle osseuse normale. L'oncostatine M ne supprimait pas les réponses des cellules T humaines cytotoxiques ou prolifé30 rantes dans les réactions de culture de leucocytes

mélangés (MLC) à des concentrations de 500 GIA unités/ml.

Le polypeptide objet de l'invention est trouvé comme étant stable aux bases et acides modérés ainsi

qu'au traitement à la chaleur à 56 C.

La séquence d'acides aminés du polypeptide objet de l'invention peut être déterminée complètement en

utilisant des séquenceurs disponibles dans le commerce.

Le polypeptide peut ensuite être synthétisé selon les techniques connues, en utilisant des synthétiseurs automatiques-qui sont également disponibles dans le commerce. Alternativement, le polypeptide objet de l'invention

peut être produit par les techniques d'ADN recombinant.

A partir d'une séquence d'acides aminés partielle, on peut déduire des sondes qui peuvent ensuite être utilisées pour cribler une banque de gènes humains. La banque peut 10 être une barque d'ADNc (ADN complémentaire) ou une banque de chromosomes. Une fois que le ou les clones ont été identifiés comme se fixant après chauffage à la sonde, les fragments contenant le gène d'intérêt peuvent être identifiés suivant un certain nombre de manières et manipulés suivant un certain 15 nombre de manières. Le fragment peut être réduit en dimension par restriction endonucléasique, avec les fragments résultants clones et analysés avec sonde pour la présence du gène désiré. Les cellules qui produisent le peptide désiré ou produisent des quantités renforcées du 20 peptide désiré peuvent être utilisées pour la production d'ARN messager. A partir de 'ARN messager, un brin d'ADN complémentaire unique peut être préparé. L'ADNc peut être ensuite fixé après chauffage à 'ARN messager total à partir d'une cellule qui produit un peu, s'il y en a, de polypeptide. 25 L'ADNc non fixé par chauffage peut ensuite être isolé et utilisé pour préparer l'ADNc ds, qui peut être criblé

avec les sondes.

Alternativement, des fragments d'ADN peuvent être insérés dans Xgtll, de sorte que les fragments codant 30 peuvent être en aval de et encadrés avec le gène de f-galactosidase. Des anticorps peuvent être préparés pour le polypeptide d'oncostatine M et utilisés pour cribler les protéines fusionnées résultantes pour la réactivité croisée. De cette manière, les fragments codant pour le 35 polypeptide objet de l'invention ou son fragment peuvent

être identifiés et utilisés pour identifier le gène désiré.

Une fois qu'un gène complet a été identifié, soit comme ADNc ou ADN chromosomique, il peut ensuite être manipulé suivant une variété de manières pour réaliser l'expression. Si le gène doit être exprimé dans un hâte qui a reconnu les zones de régulation de la traduction et de la transcription du type sauvage, de l'oncostatine M, le gène entier avec ses zones de régulation 3' et 5' de type sauvage peut être introduit dans un vecteur d'expression approprié. Il existe divers vecteurs d'expression utilisant des systèmes de réplication à partir de virus des mammifères, tels que le virus Simian 40, l'adénovirus, le virus des papilles bovines, le virus de la vaccine, le baculovirus des insectes etc... Ces systèmes de réplication ont été développés pour procurer des marqueurs qui permettent la sélection des transfectants, 15 aussi bien que des sites de restriction convenables dans

lesquels le gène peut être inséré.

Si le gène doit être exprimé dans un hôte qui ne reconnaît pas les zones régulatrices de traduction et de transcription du type sauvage se produisant naturellement, 20 une manipulation ultérieure peut être exigée. D'une manière commode, une variété de zones régulatrices de transcription 3' est connue, et peut être insérée en aval des codonsstop. La zone 5' nOn codante en amont du gène structural peut être enlevée par restriction endonucléasique, par résection Bal3l, ou analogue. Alternativement, si un site de restriction convenable est présent près du terminal 5' du gène structural, le gène structural peut être restreint et un adaptateur utilisé pour lier le gène structural à la zone du promoteur, lorsque l'adaptateur fournit les nucléotides perdus du gène structural. Diverses stratégies peuvent être employées pour réaliser une cassette d'expression qui dans la direction 3', 5' de la transcription possède une région d'initiation de traduction et de transcription, qui peut également comprendre des séquences 35 de régulation permettant l'induction de la régulation le gène structural sous le contrôle de traduction et de transcription de la région d'initiation, et une région

terminale de traduction et de transcription.

Des promoteurs ou des régions d'initiation de transcription comprennent, à titre d'exemple, pour des bactéries, le promoteur /-gal, le promoteur TAC, les 5 promoteurs lambda droit et gauche etc..; pour la levure, des promoteurs d'enzyme glycolytiques, tels que les promoteurs ADH-I et -II, le promoteur GPK, et le promoteur PGI, le promoteur TRP etc...; pour les cellules de mammifères, les promoteurs retard et rapide SV40, les promoteurs 10 retard d'adénovirus etc... Comme cela a déjà été indiqué, la cassette d'expression peut être incluse dans un système de réplication pour le maintien épisomal dans un hôte cellulaire approprié ou peut être prévue sans système de réplication, si elle peut devenir intégrée dans le génome de l'hôte. L'ADN peut être introduit dans l'hôte suivant les techniques connues, comme par transformation, en utilisant de l'ADN précipité par le phosphate de calcium, la transfection par contact des cellules avec le virus, la microinjection de l'ADN dans les cellules, ou analogue. 20 Une fois que le gène structural a été introduit dans l'hôte approprié, l'hôte peut croître et exprimer le gène structural. Dans quelques cas, il peut être désirable de fournir une séquence de signal (leader de sécrétion) en amont du et dans un cadre de lecture avec le gène structu25 ral, ce qui procure la sécrétion du gène structural et le clivage du leader de sécrétion, de façon à réaliser le polypeptide formé dans le surnageant. S'il n'y a pas de sécrétion, alors les cellules hôtes peuvent être récoltées, et lysées suivant les conditions classiques, et le produit 30 désiré isolé et purifié selon les techniques connues, telles que chromatographie, électrophorèse, extraction

par solvant, ou analogues.

Les composés de l'invention peuvent être utilisés suivant une grande variété de manières, à la fois in vivo 35 et in vitro. Ces composés peuvent être utilisés pour fabriquer des anticorps pour les composés, qui peuvent trouver utilisation in vivo ou in vitro. Les anticorps peuvent être préparés d'une façon classique, soit en utilisant le polypeptide de l'invention comme un immunogène et en injectant le polypeptide dans un hôte mammifère, par

exemple souris, vache, chèvre, mouton, lapin etc..., par 5 exemple avec un adjuvant, par exemple un adjuvant Freunds complet, un gel d'hydroxyde d'aluminium, ou analogue.

L'hôte peut ensuite être saigné et le sang utilisé pour l'isolation des anticorps polyclonaux, ou dans le cas de la souris, les lymphocytes périphériques du sang ou les lymphocytes spléniques (cellules B) sont utilisés pour être fusionnés avec une cellule appropriée de myélome afin d'immortaliser les chromosomes pour l'expression monoclonale

des anticorps spécifiques pour les composés de l'invention.

Des anticorps soit monoclonaux soit polyclonaux 15 peuvent être préparés, lesquels peuvent ensuite être utilisés pour le diagnostic ou la détection de la présence du polypeptide dans un échantillon, tel que des cellules ou un fluide physiologique, par exemple du sang. Les anticorps peuvent également être utilisés en chromatographie d'affi20 nité pour purifier le polypeptide et l'isoler des sources naturelles ou synthétiques. Les anticorps peuvent également trouver application dans le contrôle de la quantité du polypeptide associé à des cellules en culture ou in vivo, grâce à quoi la croissance des cellules peut être modifiée. 25 Le composéselon l'invention peut être utilisé comme un ligand pour détecter la présence de récepteurs pour le composé. De cette manière, les cellules peuvent être distinguées selon la présence et la densité des

récepteurs pour le composé, en contrôlant l'effet des 30 divers composés sur la présence de tels récepteurs.

Le composé peut être utilisé dans des cultures in vitro pour inhiber la croissance de cellules ou de lignées cellulaires sensibles au polypeptide que l'on distingue des cellules qui ne sont pas sensibles. Ainsi, des mélanges 35 de cellules hétérogènes ou des lignées de cellules peuvent être débarrassés des cellules indésirables, si les cellules indésirables sont sensibles au polypeptide. Le polypeptide peut être administré in vivo dans le cas de conditions néoplasiques, par exemple, par injection, à l'intérieur

des liaisons- par voie péritonéale, subcutanée ou analogue.

Le composé de l'invention peut être utilisé in vitro pour éliminer les cellules malignes de la moelle pour les transplantations de moelle autologue ou pour inhiber la prolifération ou éliminer les cellules malignes dans

d'autres tissus, par exemple du sang, avant réinfusion.

Le polypeptide objet de l'invention peut également être utilisé dans une méthode pour traiter les plaies,telles que les plaies cutanées, les plaies de la cornée et diverses autres dislocations du stroma et épithéliales, tels que les ulcères chroniques, les brûlures, les incisions chirurgicales, les plaies résultant d'un traumatisme et 15 les blessures aux organes creux et revêtus d'épithélium, tels que l'oesophage, l'estomac, le gros intestin, l'intestion grêle, la bouche, les organes génitaux et le tractus urinaire. La méthode consiste en une application topique d'une composition de traitement comprenant 20 l'oncostatine M dans un support physiologiquement

acceptable.

La composition selon la présente invention peut être utilisée pour traiter une grande variété de plaies comprenant toutes les plaies cutanées, les plaies de la cornée 25 et les blessures aux organes creux revêtus d'épithélium du corps. Les plaies convenant au traitement comprennent celles résultant d'un trauma, tel que des brûlures, des abrasions, des coupures ou analogues aussi bien que celles provenant d'interventions chirurgicales, tels que les incisions chirurgicales et les greffes de peau. D'autres conditions convenables pour le traitement avec les compositions de la présente invention comprennent les conditions chroniques, telles que les ulcères chroniques,

les ulcères diabétiques et d'autres conditions (trophiques) 35 de non cicatrisation.

L'oncostatine M peut être incorporée dans des supports physiologiquement acceptables pour pouvoir être appliquée sur la zone affectée. La nature des supports peut varier d'une manière importante et dépend de l'endroit désiré d'application. Pour une application sur la peau, une base d'onguent ou de crème est habituellement préférée, les bases par exemple étant constituées par des produits connus sous le nom de lanoline, de Silvadène (Marion) (particulièrement pour le traitement des brOlures) d'Aquafor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut), et analogues. Si on le désire, il est possible d'incorporer 10 des compositions contenant l'oncostatine M dans des bandages et d'autres éléments pour panser les blessures afin de réaliser une exposition continue de la plaie au peptide. Des applications en aérosols peuvent également

être utilisées.

La concentration du polypeptide dans la composition de traitement n'est pas critique. Le polypeptide est présent suivant une quantité induisant la prolifération des cellules épithéliales. Les compositions seront appliquées topiquement sur la zone affectée, typiquement sous la forme de gouttes pour les yeux ou sous la forme de crèmes, d'onguents ou de lotions pour lapeau. Dans le cas des yeux, un traitement fréquent est désirable, habituellement suivant des intervalles de 4 heures ou moins. Pour la peau, il est désirable de maintenir de manière continue la composition de traitement sur la zone affectée pendant la cicatrisation, avec des applications de la composition de

traitement deux à quatre fois par jour ou plus fréquemment.

La quantité utilisée du polypeptide de l'invention peut varier en fonction de l'administration, de l'utilisa30 tion d'autres composés actifs ou analogues, et se situe

généralement dans l'intervalle d'environ 1 pg à 100 pg.

Le polypeptide de l'invention peut être utilisé avec un support physiologiquement acceptable, tel qu'une solution saline, une solution saline tamponnée au phosphate, ou analogue. La quantité de composé utilisée sera déterminée d'une manière empirique, sur la base de la réponse des cellules in vitro et de la réponse des animaux d'expérience y

aux polypeptides ou aux formules contenant ces polypeptides.

Les composés sont applicables en eux-mêmes ou en combinaison avec d'autres immunomodulateurs, inhibiteurs ou facteurs de croissance, tels que TNF, IL-2, ' -interféron, anticorps monoclonaux, etc... Les quantités de ces autres composés se situent généralement dans l'intervalle de 1 ug à 100 g. Les conjugués des composés objets de l'invention pour des fragments de direction de site, par exemple des anticorps peuvent être préparés, lorsque les anticorps 10 peuvent être spécifiques pour des organes ou cellules

malignes particulières.

les exemples suivants sont donnés uniquement à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés

comme limitatifs.

EXPERIENCES

Matériaux et Méthodes Oncostatine M isolée à partir de cellules U937 Production d'un inhibiteur de croissance des cellules tumorales à partir d'une lignée dellulaire 20 de lymphomes histiocytiques Des cellules U937, à savoir une lignée cellulaire de lymphomes histiocytiques (Sundstrom et Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17:565-577) furent cultivées dans des bouteilles roulantes de 850 cm2 (Corning C2540), suivant 25 une concentration de 4 x 105 cellules/ml dans un volume total de 300 ml de milieu RPMI 1640 auquel on a ajouté 10% de sérum de veau foetal (FCS), de la pénicilline/ streptomycine (PS), de la L-glutamine et 10 ng/ml de 13acétate 12-0-tétradécanoylphorbol (TPA). Quatre jours 30 plus tard, les surnageants contenant FCS et TPA furent éliminés, les bouteilles roulantes furent lavées cinq fois avec du RPMI-1640 dépourvu de sérum et les cellules qui se détachaient (1 x 105 cellules/ml) furent lavées trois fois avec un milieu sans sérum et ajoutées à nouveau aux bouteilles, ce qui a donné un volume final de 125 ml de milieu RPMI-1640 sans sérum par bouteille roulante. Un jour plus tard, les surnageants furent recueillis, centrifugés pour éliminer les cellules, filtrés au travers d'un filtre de Nalgene de 0,45 micron et concentrées en utilisant un système à fibres creuses (cartouche Amicon HIP10-20)

jusqu'à un volume de 150 ml (volume initial 1.500 ml).

L'oncostatine M fut également isolée des surnageants de cellules U937 traitées avec TPA et sans sérum, dans des flacons de culture de tissu de 150 cm2. Le surnageant fut concentré avec une membrane Diaflo Amicon PM10, coupé à 10 kD et dialysé. A la suite de la dialyse, le concentré 10 fut dilué avec de l'acide acétique ce qui a donné une concentration finale d'acide acétique 0,1N dans 500 mi,

et fut concentré à 50 ml en utilisant un filtre Amicon PM 10.

Le concentré de 50 ml fut dilué jusqu'à 400 mi avec de l'acide acétique 0, 1N et concentré à 40 mi avec le même filtre. Le concentré fut dilué avec de l'acide acétique 1N

et le précipité résultant fut éliminé par centrifugation.

Le concentré résultant fut congelé et lyophilisé. Le matériau lyophilisé fut utilisé pour des opérations de purification. Chromatographie sur gel Une colonne Bio-sil TSK-250 (600 x 21,5 mm) (BioRad) fut fixée à un système de chromatographie liquide haute performance. La fraction brute (10 mg/mi) fut dissoute dans 40% d'acétonitrile dans 0,1% d'acide trifluoroacétique 25 aqueux (0,1% TFA). Un aliquote de 2 ml du mélange fut injecté et l'élution fut réalisée de manière isocratique avec une phase mobile de 40% d'acétonitrile dans 0,1% de TFA. Le débit de l'écoulement était de 2,5 ml/min et

la vitesse d'enregistrement fut établie à 0,25 cm/min.

Des fractions de 5 mi furent recueillies. La chromatographie fut réalisée à la température ambiante. Un aliquote de chaque fraction fut évaporé et soumis à des essais en trois fois pour l'activité inhibitrice de croissance (GIA)

des cellules A375.

Les fractions actives (fractions 21 et 22) de six essais furent regroupées. Le matériau regroupé possédait

un total d'approximativement 4,8 x 105 unités GIA.

Le facteur fut trouvé comme ayant un poids moléculaire apparent de 18 kD comme déterminé par chromatographie

d'exclusion (colonne TSK-250 Bio-Sil).

Chromatographie haute performance en phase inverse (HPLC) des fractions TSK-250 Les fractions regroupées 21 et 22 de TSK-250

décrites ci-dessus furent diluées deux fois avec 0,1% TFA.

Ce mélange fut injecté de manière isocratique dans une colonne u-BondapakC18 (7,8 x 300 mm), appelée C181,à la 10 température ambiante. Le débit de l'écoulement fut établi à 2 ml/min et la vitesse d'enregistrement était de 0,25 cm/min. Le gradient linéaire fut utilisé entre le solvant primaire 0,1% TFA et le solvant secondaire acétonitrile-TFA 0,1%. Les conditions de gradient étaient 15 0-30% en 20 minutes; ensuite 30-45% en 150 minutes; 45-55% en 20 minutes; et 55-100% pendant 10 minutes. Tous les solvants étaient de pureté HPLC. Des fractions de 4 ml furent recueillies et des aliquotes de chaque fraction furent soumis à l'essai pour l'activité inhibitrice de 20 croissance. Les fractions 72 à 75 furent trouvées comme contenant la majorité de l'activité. Les fractions actives

furent éluées entre 41-52% de la concentration d'acétonitrile.

Les fractions 72 à 75 furent réunies. 16 ml de 0,1% TFA furent ajoutés aux fractions regroupées. Le mélange fut injecté dans une colonne pBondapak-C18 (3,9 x 300 mm), appelée C182, à la température ambiante. Le débit de l'écoulement fut établi à 1 ml/min et la vitesse d'enregistrement était de 0,5 cm/min. Les conditions de gradient étaient 30 de 0,35% pendant 10 minutes; 35-45% pendant 100 minutes; et 45-100% pendant 10 minutes. Les fractions furent recueillies et des aliquotes furent prélevés et soumis à l'essai pour GIA. La plus grande partie de l'activité est apparue

de la colonne entre 40,7 et 41,3% de concentration 35 d'acétonitrile (temps de rétention 83-86 minutes).

Les fractions actives furent regroupées et diluées deux fois avec 0,1% de TFA et injectées de manière isocratique sur une colonne p-Bondapak-C18 (3, 9 x 300 mm), appelée C183,à la température ambiante. Le débit de l'écoulement était de I ml/min et la vitesse d'enregistrement ou

de défilement du papier graphique était de 0,25 cm/min.

Un gradient linéaire fut utilisé entre le solvant primaire 0,1% TFA et le solvant secondaire de n-propanol-TFA (0,1%). Les conditions de gradient étaient 0-23% sur 20 minutes et 23-35% sur 120 minutes. Les fractions furent recueillies et des aliquotes de chaque fraction furent soumis-à l'essai 10 pour GIA. La plus grande partie de l'activité est apparue entre 25-26,5% de concentration en propanol (temps de rétention 59 minutes). Cette fraction apparemment homogène contenait approximativement 300 ng de protéine et environ

40.000 unités GIA.

Essai de modulation de la croissance des cellules en utilisant l'incorporation de 3H-thymidine dans l'ADN (GIA) Les essais furent réalisés dans 96 plaques planes avec des puits (Costar 3596). Des cellules de mélanome humain (A375) furent utilisées comme une lignée cellulaire sensible d'indication. Les cellules (3 x 103) dans 0,1 ml de milieu Eagles modifié de Dulbecco (DMEM) avec addition de 10% de FCS et PS, furent placées dans chaque puits. Trois heures plus tard, 0,1 ml d'échantillon d'essai fut ajouté 25 dans chaque puits. Les plaques furent incubées à 37 C pendant 3 jours. Ensuite 0,025 ml (0,5 pCi) d'une solution de 3H-thymidine (activité spécifique 27 pCi/pg) fut ajouté à chaque puits pour les 6 heures finales de l'incubation. Les cellules furent ensuite transférées sur des bandes de filtre 30 en verre en utilisant un récolteur à puits multiples (PHD Cell Harvester, Cambridge Technology, Inc.). Les filtres furent transférés dans des fioles de scintillation auxquelles on a ajouté 2 ml d'un fluide de scintillation (ScientiVerse II, Fischer Scientific Co.) avant d'effectuer le comptage

dans un compteur de scintillation pour quantifier l'incorporation de 3Hthymidine.

Essai d'inhibition des colonies dans l'agar mou Une couche de base de 0,5 ml de 0,5% d'agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Détroit, Michigan) dans du DMEM

contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS), fut placée 5 dans des plaques de culture de tissu Costar à 24 puits.

0,5 ml-0,3 % d'agar contenant le même mélange avec FCS, 1-2,5 x 103 cellules A375 et le facteur à tester à diverses concentrations, furent disposés sur la couche de base d'agar. Les plaques furent incubées à 37 C dans une atmos10 phère humide de 5% de C02 dans l'air et re-alimentées après 7 jours par addition de 0,5 ml de 0,3% d'agar contenant le même milieu et les mêmes concentrations de facteur. Les colonies non fixées et non tachées furent dénombrées, et le

nombre de colonies supérieures à 6 cellules fut établi 15 entre les jours 7 et 14.

Résultats Séquences d'Oncostatine M isolée à partir de cellules U937 La séquence du N-terminal et les fragments internes 20 d'oncostatine M furent déterminés par analyse de microséquence du polypeptide réduit et Spyridinéthylé et des peptides obtenus à partir des produits de digestion enzymatiques de l'Oncostatine M réduite et S-pyridinéthylée avec l'endoprotéinase Lys-C et la protéase V8 Staphylococcus 25 aureus. Les fragments peptidiques furent purifiés par chromatographie HPLC en phase inverse, en utilisant des solvants volatils. Les peptides furent soumis à une dégradation Edman répétitive et automatique dans le séquenceur de protéines modèle 470A (Applied Biosystems, Inc.). Les 30 acides aminés de phénylthiohydantoine furent analysés par chromatographie haute performance en phase inverse (Applied Biosystems, Inc.) avec une colonne PTH-C18 (2,1 x 220 mm,ABI), en utilisant pour l'élution un gradient tampon acétate de sodium/tétrahydrofurane/acétonitrile. Les séquences d'acides aminés résultantes sont

sensiblement celles illustrées sur la figure 1.

Une comparaison de ces séquences avec celles contenues dans la base de données courante des protéines (PIR Release 9, Mai 1986), n'a révélé aucune homologie

de séquence significative avec les autres séquences connues.

En outre, il n'y a pas d'homologie avec le facteur tuant les tumeurs, la lymphotoxine, le facteur de stimulation des colonies, l'interleukine 1 ou 2 ou le facteur de

croissance A-transformant.

Inhibition de la prolifération des cellules tumorales et augmentation de la prolifération 10 des fibroblastes humains normaux En utilisant l'essai décrit ci-dessus d'inhibition des colonies par de l'agar mou, les résultats suivants furent obtenus: Tableau 1. Inhibition de la formation d'une colonie de cellules de mélanome A375 dans de 1'agar mou par de l'oncostatine M purifiée isolée à partir de cellules U937 *

25 30

Unités GIA/puits

250 83 27 45

o0 4 6 il Inhibition des # colonies

96 94 89 69

Formation de colonies * Des cellules A375 furent mises sur des plaques dans de l'agar mou, avec ou sans facteur dans un volume final de

2 ml, comme décrit ci-dessus. Le facteur utilisé provenait d'une fraction de colonne de propanol C18 avec une activité inhibitrice de croissance tumorale pic (GIA). Onze jours plus tard, les nombres de colonies furent décombres. Une colonie était définie comme un groupe d'au moins 6 cellules. Une unité GIA fut définie comme la quantité provoquant 50% d'inhibition de l'incorporation de 3H-thymidine dans les cellules A375, dans les micropuits, comme décrit en détail ci-dessus.

Dans l'étude suivante, divers traitements furent utilisés pour déterminer l'effet du traitement, soit

chimique ou physique, sur l'activité du polypeptide objet de l'invention. Le tableau suivant indique les résultats.

Tableau 2 - Effet de divers traitements des supernageants des cellules U937 induites par TPA sur l'acti5 vité inhibitrice de croissance tumorale * Dilution finale du supernageant 1:4 1:8 1:16 Témoin milieu - - - 39.780 Surnageant non traité 7.206** 13.896 16.000 Acide acétique 1N 6.670 17. 073 18.783

1NH40H 6.956 15.016 13.923

* Les cellules U937 furent traitées avec TPA (10 ng/ml) pendant 3 jours et ensuite les cellules furent lavées avec 15 les milieux et incubées pendant 24 heures dans des milieux dépourvus de sérum avant de recueillir les surnageants. Les surnageants furent traités avec de l'acide acétique 1N ou de l'hydroxyde d'ammonium 1N (NH40H). Ils furent ensuite dialysés à l'encontre du milieu et testés pour leur possibi20 lité d'inhiber l'incorporation de 3H-thymidine dans les cellules A375. Les cellules A375 furent marquées avec de la 3H-thymidine (3H-TdR) pendant les 6 dernières heures d'une

incubation de 3 jours.

** Les résultats donnés correspondent au comptage par 25 minute correspondant à l'incorporation de 3H-TdR.

Les résultats ci-dessus démontrent que l'oncostatine M dans le surnageant dialysé est sensiblement résistante à l'inactivation par de l'acide acétique un normal et de l'hydroxyde d'ammonium un normal. Ainsi, les composés objets de l'invention sont relativement insensibles à la fois aux acides modérément forts et aux bases modérément fortes. Le composé est stable au traitement à la chaleur

à 56 C pendant 1 heure mais pas à 90 C pendant 30 minutes.

Le composé de l'invention fut également testé pour 35 la stabilité à la chaleur et on a trouvé qu'il retenait son activité après une exposition à 56 C pendant 1 heure, mais il perdait sensiblement toute son activité après une

exposition à 95 C pendant 30 minutes.

Dans l'étude suivante, la capacité des polypeptides selon l'invention à inhiber la réplication des cellules tumorales d'une variété de cellules néoplasiques, fut considérée. Le tableau suivant donne les résultats. Tableau 3 - Inhibition de la réplication des cellules tumorales par de I'Oncostatine M purifiée à partir de cellules U937 Unités GIA provoquant % d'inhibition Cellules tumorales Incorporation 3H-TdR A549 (cancer du poumon) HTB10 (neuroblastome) 15 A375 (mélanome)

21 81 0,3

Les cellules tumorales furent mises sur des plaques dans des micropuits 3 heures avant l'addition de diverses dilutions d'oncostatine M, purifiée par chromatographie HPLC en phase inverse comme expliqué en détail ciavant. Pendant 20 les 6 heures finales d'une incubation de 3 jours, les cellules dans un milieu de 0,2 ml furent marquées avec de la 3H-thymidine (3H-TdR) (0,5 pCi/puits). Une unité (GIA) d'activité inhibitrice de la croissance tumorale est définie dans le Tableau 1 comme la quantité qui provoque 50% d'inhibition de l'incorporation de 3H-TdR dans des cellules de mélanome A375. Une unité fut déterminée comme étant approximativement 10 pg de protéine purifiée, par conséquent la concentration (ng/ml) provoquant 30% d'inhibition de

H-TdR dans les cellules A549, HTB10 et A375, était approxi30 mativement de 1,4, 4 et 0,015 ng/ml, respectivement.

L'incorporation de 3H-TdR dans des fibroblastes humains normaux W126 n'était pas supprimée par le facteur U937

dans toutes les expériences.

Les résultats ci-dessus démontrent que l'oncosta35 tine M est sélective dans sa capacité à inhiber la réplication et possède des effets très variables en fonction de la nature de la cellule. Le composé de l'invention est efficace contre les cellules de mélanome, telles que les cellules de mélanome A375, les cellules de squame du cancer du poumon, telles que A549, et les cellules de neuroblastome, telles que HTB10. Des cellules tumorales furent ensemencées suivant 3 x 103 cellules/puits et également des fibroblastes normaux suivant 1,5 x 103 cellules/puits, dans des plaques à 10 96 puits pendant 3 heures. Diverses concentrations d'oncostatine M purifiée, obtenues de la fraction de la colonne C183 avec une activité pic d'antiprolifération contre des cellules A375, furent ajoutées et 3 jours plus tard l'incorporation de 3H-thymidine dans les cellules fut 15 mesurée dans trois puits à chaque concentration. Les

résultats sont illustrés dans le Tableau 4.

Tableau 4 - Inhibition de la prolifération des cellules tumorales et augmentation de la prolifération des fibroblastes normaux par l'oncostatine M Unités GIA/ puits % d'inhibition % stimulation

A375 W128

Exp. 1 16 83 25

4 62 30

1 46 46

A375 HTB10 W126

Exp. 2 27 NT 28 46

9 87 22 36

3 76 11 52

A375 A549

Exp. 3 75 89 30

25 85 22

8 71 16

A375 SK-MEL28

Exp. 4 20 87 44

75 25

1 59 11

Les résultats donnés sont en % d'inhibition ou % de stimulation de 3Hthymidine incorporéedans les cellules tumorales (A375, HTB10, A549 et SKMEL28) et les fibroblastes normaux (W126 et W138) respectivement. Une unité GIA est définie dans le Tableau i comme la quantité d'oncostatine M qui provoque 50% d'inhibition de l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules A375. En plus de l'effet différentiel observé sur l'incorporation de 3H-thymidine dans les cellules tumorales et les fibroblastes humains normaux, il existe aussi un effet différentiel observé de morphologie et du nombre de cellules à la suite de 3 jours de traitement de deux types de

cellule avec l'oncostatine M, comme montré sur la figure 2.

L'oncostatine M utilisée provenait de la fraction de colonne HPLC-C183 avec une activité pic pour inhiber la prolifération de cellules A375. La figure 2 illustre une 15 série de microphotographies de cellules de mélanome A375 qui furent non traitées (A), traitées avec 5 unités (GIA) d'activité inhibitrice de croissance,de l'oncostatine M (B), ou 100 unités (C). On a montré des microphotographies des fibroblastes W138 qui ne furent pas traités (D), qui

furent traités avec 5 unités GIA (E), ou 100 unités GIA (F).

Les cellules furent colorées avec du violet cristallin dans

0,5% de méthanol. Agrandissement = X63.

NaDodSO4/PAGE de l'oncostatine M De l'oncostatine M purifiée, soumise à NaDodSO4 25 réalisé sous des conditions de réduction, fut trouvée comme ayant un poids moléculaire apparent d'approximativement 28 kD comme montré sur la figure 3. Les protéines suivantes furent utilisées comme témoins (voie A): ovalbumine, Mr = 43 kD chymotrypsinogène 0<, Mr = 25,7 kD; 30 lactoglobuline/p, Mr = 18,4 kD: lysozyme, Mr - 14,2 kD; inhibiteur de trypsine bovine = 6,2 kD; chaîne A et B

d'insuline, Mr = 2,3 kD et 3,4 kD respectivement.

L'oncostatine M fut appliquée sur la voie B. L'oncostatine M, soumise à l'analyse PAGE sous des condi35 tions de non réduction, présente également un poids moléculaire apparent de 28 kD et la protéine électroéluée de la bande fut trouvée comme inhibant la prolifération

des cellules A375.

Anticorps pour un peptide synthétique d'Oncostatine M réagissant dans l'oncostatine M marquée par IT5 dans des précipitations radioimmunologiques a) Synthèse du peptide: Le peptide correspond aux résidus 6-19 de la protéine d'oncostatine M et fut synthétisé par des techniques de phase solide sur un instru10 ment automatique Beckman comme décrit dans Gentry et autres J. Biol. Chem. (1983) 258:11219. Le peptide fut clivé de la résine en utilisant le processus HF "low-High" (Tam et autres, J. Amer. Chem. Soc. (1983) 105:6442-6445). La

purification fut accomplie par chromatographie HPLC 15 préparative.

b) Production des anticorps: Le peptide fur couplé à la Y -globuline bovine comme décrit dans Gentry et Lawton, Virology (1986) 152:421-431. Des lapins blancs de Nouvelle Zélande ont subi des administrations poussées 20 (5 fois) sur 4 sites par voie sous-cutanée comme décrit par Gentry et Lawton, Virology (1986) 152:421-431. Les antisérums utilisés furent obtenus deux semaines après

la cinquième administration.

c) Iodation de l'oncostatine M: Un échantillon d'oncostatine M partiellement purifiée fut radioactivement marqué avec de l'iode-125 en utilisant le processus publié dans Linsley et autres, PNAS (1985) 82:356360. Une portion de la préparation marquée contenant 100.000 cpm fut mélangéeavec de l'antisérum de lapin dirigé contre 30 les 17 acides aminés du N-terminal de l'oncostatine M (dilution finale de 1:20), en l'absence ou en présence du peptide N-terminal (les 17 acides aminés du N- terminal de

l'oncostatine M) (2 pg), et fut soumiseà une analyse de précipitation immunologique comme décrit par Linsley et 35 autres, Biochemistry (1986) 25:2978-2986.

Spécifiquement parlant, un tube contenant 5 pl fut préincubé avec 2 yg du peptide N-terminal dans 10 ml de TNEN (20 mM tris Ph 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% Nonidet P-40) contenant 0,1% de BSA, pendant 30 minutes à 4 C avant l'addition d'oncostatine M 1125 dans TNEN 85 contenant 0,1% de BSA et 40 mM de dithiothréitol (DTT). Sept tubes contenant 5 yl d'antisérum furent incubés avec de l'oncostatine 1125 dans 85 P1 de TNEN contenant 0,1% de BSA et 40 mM de DTT pendant 30 minutes à 4 C avant l'addition de 50 Pl de 10% de Staphylocossus aureus fixé sur

formaline (Pansorbin, Calbiochem).

Après une incubation supplémentaire pendant 30 minutes 4 4 C, les tubes furent réduits en très petits grains et les grains furent lavés 4 fois avec 1 ml de TNEN avant de les soumettre à l'analyse PAGE. Une bande diffuse de Mr = 32 kD fut observée après analyse SDS-PAGE des 15 précipités immunologiques. La précipitation de l'espèce fut inhibée par l'inclusion d'un excès de peptide non marqué correspondant aux 17 acides aminés du N-terminal de l'oncostatine M, ce qui indique que la précipitation a

été spécifique pour ce peptide.

La composition de carbohydrate de l'oncostatine M

fut examinée par des essais de sensibilité à la glycosidase.

Les précipités immunologiques préparés comme dans le paragraphe c cidessus furent traités avec un tampon, de l'endoglycosidase H,ou de la neuraminidase, comme 25 décrit par Linsley et autres (1986). Le traitement avec l'endoglycosidase H, un enzyme avec spécificité pour les oligosaccharides à mannose élevé liés à N, a procuré l'apparition d'une espèce de poids moléculaire faible de Mr = 24 kD. Seulement une partie du matériau radio30 activement marqué fut sensible à cet enzyme, ce qui indique que pas toutes les molécules contenaient des oligosaccharides à mannose élevé ou supérieur. Le traitement avec la neuraminidase a procuré l'apparition d'une bande unique de Mr = 27 kD, ce qui indique que l'hétéro35 généité en dimension de l'oncostatine M non traitée et marquée par I125, était due à une hétérogénéité moléculaire dans la sialyation du coeur de la glycoprotéine. Les résultats indiquaient que les préparations actives d'oncostatine M contenaient un mélange de mannose élevé et des chaînes latérales complexes d'oligosaccharide lié par N. Oncostatine M isolée à partir de lymphocytes

périphériques humains normaux (PBL).

Production d'un inhibiteur de croissance de cellules tumorales a partir des PBL Des leucofractions contenant des PBL, obtenues de 10 la Banque duSang, furent diluées suivant un rapport 1:1 avec une solution saline tamponnée de phosphate, pH 7,4 (PBS). Trente-cinq ml de sang dilué furent rehaussés avec 10 ml d'une solution consistant de 9% de Ficoll contenant % en volume de 50% de diatrizoate de sodium (gravité spécifique finale de 1,080). Les gradients furent centrifugés à la température ambiante pendant 20 minutes à 850 x g. Les cellules furent recueillies de l'interface de gradient et lavées avec PBS. Les globules rouges furent

lysés pendant 3 à 4 minutes avec 10-20 ml d'une solution 20 contenant 0, 8% de chlorure d'ammonium et 0,1% de Na4-EDTA.

Les cellules furent recueillies à partir de la solution lysante de globules rouges par centrifugation à 600 x g pendant 10 minutes et remises en suspension dans ml de RPMI 1640 (GIBCO) contenant 5% de sérum bovin 25 foetal. De la thrombine fut ajoutée à une concentration finale de 0,5 U/ml. La suspension de cellules fut agitée pendant 5 minutes à 37 C et l'agrégat de plaquettes fut laissé au repos pendant 5 minutes. Les cellules en suspension furent transférées dans des nouveaux tubes, récupérées 30 par centrifugation, remises en suspension dans 1 ml de sérum bovin foetal, et transférées dans une colonne contenant 0,5 g de laine de nylon préhumidifiée et brossée,

type 200 (Fenwal).

La colonne de laine de nylon fut incubée à 37 C pendant 60 minutes pour permettre la fixation des monocytes et des lymphocytes B. La colonne fut ensuite lavée avec 3 volumes de milieu RPMI 1640 (37 C) contenant 5% de sérum bovin foetal et les cellules éluées non adhérentes (PBL)

furent recueillies.

Les PBL (2 x 106 cellules/ml) furent cultivés à 37 C, sous 5% de C02-95% d'air pendant 96 heures, dans du RPMI 1640 (10,4 g/l) contenant FeSO4, 7H20 (1 mg/1), ZnS04,7H20 (2 mg/l), Na2SeO3,5H20 (0,017 mg/1), du 1aminoéthanol (1 mg/l), de la transferrine humaine (5 mg/l), un conjugué d'acide linéoléique-aibumine de sérum bovin (Sigma) (200 mg/1), de la Lglutamine (300 mg/l), de la 10 pénicilline/streptomycine (100.000 unités/l), et de la phytohémagglutinine-P (Wellcome) (2 mg/l). Les surnageants furent recueillis, centrifugés pour éliminer les cellules, concentrés par ultrafiltration (membrane Amicon Diaflo YM-10, coupure 10 kD), et dialysés contre de l'acide acétique 0,1M (tube dialyse 3 spectrapore). Le produit

de rétention clarifié fut lyophilisé.

Chromatographie sur gel La fraction brute fut reconstituée dans 20 ml d'acide acétique 1 M (50 mg/ml) et appliquée sur une 20 colonne BioGel P100 (2,6 x 88 cm) équilibrée avec de

l'acide acétique 1 M suivant un débit d'écoulement de 0,5 ml/min. Des fractions de 12 ml furent recueillies.

Une partie de chaque fraction fut évaporéeet soumiseà trois essais pour l'activité inhibitrice de croissance 25 (GIA),;des cellules A375. Les fractions actives furent regroupées, lyophilisées, et repassées à la chromatographie sur une colonne TSK-250 Bio-Sil (600 x 21,5 ml),comme décrit. 35 Chromatographie haute performance en phase inverse des fractions TSK-250 La purification finale des fractions TSK-250

réunies fut réalisée par chromatographie HPLC en phase inverse essentiellement comme cela a été décrit. L'inhibiteur de cellules tumorales dérivant des PBL fut élué sur un support C18 uBondapak à des concentrations de 40-41% d'acétonitrile et de 26,5% de n-propanol respectivement.

Essai de modulation de la croissance cellulaire utilisant l'incorporation de 125I-iododéoxyuridine dans l'ADN (GIA): Ces essais furent réalisés dans des plateaux de culture de tissu à 96 puits et à fond plat (Costar 3596). Des cellules de mélanome humain, A375 (4 x 103), dans Pl d'un échantillon d'essai furent placées dans chaque puits et incubées pendant 3 jours à 37 C. Les cellules furent marquées pendant 24 heures avec 125I- IDU (0,05 pCi/ 10 puits) et incubées pendant 24 heures supplémentaires. Les cellules furent lavées 3 fois, récoltées avec un récolteur d'échantillons multiples, et la radioactivité fut évaluée

dans un compteur de rayonnement gamma.

Résultats Une préparation d'inhibiteur de cellules tumorales dérivant du PBL fut soumise à une dégradation Edman répétée et automatique. La séquence des acides aminés dugroupe aminooterminal est la suivante:

1 5 10 15

A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K

X représente un acide aminé qui n'a pas été identifié. Une comparaison de cette séquence avec celle du

facteur U 937 indique clairement une identité avec le 25 N-terminal du facteur dérivant du PBL.

1 5 10 15

Facteur PBL A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K Facteur U937 A-A-I-G-SC-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K Dans l'étude qui suit, la capacité de l'oncosta30 tine M dérivant des PBL, à effectuer la réplication d'une variété de cellules a été examinée. Il a été trouvé que les cellules L929 de souris étaient insensibles à l'oncostatine M dérivant des PBL en utilisant jusqu'à 1.000 unités GIA/ml. Des fibroblates humains, W126, furent 35 stimulés pour croître par traitement avec 1.000 unités GIA/ml. La prolifération de T-lymphocytes humains normaux à 72 heures après mitogénèse, ne fut pas

affectée par jusqu'à 500 unités GIA/ml.

Il est évident des résultats ci-dessus, qu'un nouveau polypeptide et des nouveaux fragments de polypeptide sont proposés, lesquels peuvent être utilisés pour moduler la croissance cellulaire. Le composé a été trouvé comme possédant des activités variables en fonction de la nature de la lignée cellulaire appliquée, de sorte qu'il peut être utilisé en soi ou conjointement avec d'autres composés pour moduler la croissance cellulaire. Les O10 polypeptides objets de cette invention constituent par conséquent un polypeptide supplémentaire qui peut être utilisé avec des mélanges de cellules à la fois in vivo et in vitro pour renforcer ou réduire sélectivement la prolifération cellulaire d'un type particulier de cellule. 15 En particulier, le facteur peut être utilisé pour traiter des cellules pour les transplantations de moelle osseuse autologue. L'utilisation du facteur inhibe la croissance des cellules tumorales dans la moelle et peut stimuler la formation de colonies de cellules. L'oncosta20 tine M peut également être utilisée pour stimuler la croissance des cellules épithéliales pour faciliter la cicatrisation des plaies. En outre, le polypeptide intact ou ses fragments peut être utilisé comme un immunogène induisant la formation d'anticorps. Les anti25 corps induits trouvent une utilisation pour titrer l'oncostatine M présente dans un fluide corporel ou pour moduler l'activité du facteur par liaison avec lui. En outre, ces anticorps avec l'oncostatine M purifiée ou ses fragments servent comme composés d'ensembles ou kits 30 de diagnostic conjointement avec d'autres réactifs, en particulier des anticorps pour détecter et quantifier l'oncostatine M. Bien que la présente invention ait été décrite en utilisant des exemples afin de clarifier sa compréhension,

il est bien entendu que certaines modifications peuvent être apportées à l'invention, sans sortir de son cadre, si ces modifications sont effectuées suivant son esprit.

Claims (18)

R E V E N D I C A T I O NS

1.- Polypeptide ou poly(acide aminé) d'au moins huit acides aminés, caractérisé en ce qu'il peut réagir immunologiquement par réaction croisée avec un composé, lequel composé est un polypeptide pouvant être obtenu à partir de leucocytes, qui peut inhiber la prolifération de cellules néoplasiques, stimuler la prolifération de fibroblastes humains normaux, ne pas inhiber les réponses des cellules T cytotoxiques et proliférantes humaines et ne pas inhiber la formation de colonies de cellules de moelle osseuse myélocytiques / 10 granulocytiques, possédant un poids moléculaire dans l'intervalle compris entre environ 17 et 19 kO comme déterminé par chromatographie d'exclusion et d'environ 28 kD comme déterminé par analyse SDS-PAGE, et qui est

relativement insensible aux bases et acides modérés et aux 15 températures modérément élevées.

2.- Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'acides aminés possédant au moins 10 acides aminés qui correspondent à une séquence d'acides aminés:

1 5 10 15 20

A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K-Q

30 35

T-D-L-M-Q-D-T-S-T-L-L-T-P-Y-I

1 5 10 15 20

Q-R-L-P-K-A-Q-D-L-E-R-S-G-L-N-I-E-O-L-E-K

1 5 10 15 20

L-R-E-H-C-R-E-R-P-G-A-F-P-S-E-Q-Q-L-I-G

et différant de cette séquence de pas plus de 3 acides aminés. 3.Polypeptide suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient 12 acides aminés consécu30 tifs qui correspondent à la séquence précitée et différant de ladite séquence de pas plus d'un acide aminé, cette différence étant soit une délétion ou une substitution conservative.

4.Composition de polypeptide pouvant être obtenue à partir de leucocytes, caractérisée en ce qu'elle contient un composé capable d'inhiber la prolifération de cellules néoplasiques, de stimuler la prolifération des fibroblastes humains normaux, de ne pas inhiber les réponses des cellules T cytotoxiques et proliférantes humaines et de ne pas inhiber la formation de colonies de cellules de moelle osseuse myélocytiques/granulocytiques, possédant un poids moléculaire dans l'intervalle compris entre environ 17 et 19 kO comme déterminé par chrcmatographie d'exclusion et d'environ 28 kO comme déterminé par analyse SOS-PAGE, et étant relativement insensible aux bases et acides modérés et aux températures modérément élevées; et possédant une pureté procurant une activité

spécifique d'au moins environ 10 unités GIA/ng de protéine.

5.- Composition de polypeptide ssuivant la revendication 4, caractérisée en ce que les leucocytes 20 précités sont des lymphocytes périphériques humains

normaux activés par mitogène.

6.- Composition de polypeptide suivant la revendication 4, caractérisée en ce que les leucocytes précités sont des cellules de lymphomes humains histiocytiques induites par le diester de phorbol 7.- Composition de polypeptide suivant la

revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est sensiblement dépourvue de composés cellulaires.

8.- Polypeptide obtenu à partir d'une composition 30 suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'activité spécifique dudit polypeptide est d'au moins

environ 100 unités GIA/ng de protéine.

9.- Polypeptide sensiblement dépourvu de débris cellulaires et d'autres protéines leucocytiques, caracté35 risé en ce qu'il est capable d'inhiber la prolifération des cellules néoplasiques, de stimuler la prolifération des fibroblastes humains normaux, de ne pas inhiber les I

. 1 1%

réponses des cellules T cytotoxiques et proliférantes

humaines et de ne pas inhier 1I fn,mc- o A,: A...

ru Aià s L\ VolaUil ue coulonns de cellules de moelle osseuse myélocytiques/granulocytiques, possédant un poids moléculaire dans l'intervalle compris entre environ 17 et 19 kO comme déterminé par chromatographie d'exclusion et d'environ 28 kD comme déterminé par analyse SOS-PAGE, et étant relativement insensible aux bases et acides modérés et aux températures modérément élevées, et comprenant des séquences d'acides aminés correspondant aux séquences suivant la revendication 2, avec pas plus de trois différences d'acides aminés entre ladite séquence selon la revendication 2 et ladite séquence correspondante. 10.- Polypeptide suivant la revendication 9, 15 caractérisé en ce que la séquence correspondante précitée diffère de pas plus d'un acide aminé de la séquence selon

la revendication 2.

11.- Utilisation d'une composition suivant la revendication 8, pour inhiber la prolifération de cellules néoplasiques par contact de ces cellules avec une certaine

quantité de ladite composition.

12.- Utilisation du polypeptide suivant la revendication 8 pour favoriser la cicatrisation des plaies par contact de la plaie avec une certaine quantité dudit

polypeptide stimulant la prolifération des fibroblastes.

13.- Anticorps caractérisés en ce qu'ils sont spécifiques pour une composition de polypeptide selon

la revendication 1 ou 4.

14.- Anticorps suivant la revendication 13, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont des anticorps monoclonaux. 15.- Utilisation d'un anticorps suivant la revendication 13 pour la détection de la présence d'une composition de polypeptide selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle consiste à combiner un échantillon susceptible de contenir ladite composition avec ledit B anticorps, et à déterminer la quantité du complexe formé

avec ledit anticorps.

16.- Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle

code un polypeptide selon la revendication 8.

17.- Procédé pour produire un polypeptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste: à faire croître une culture de cellules contenant des cellules possédant une structure d'expression comprenant une séquence d'ADN codant un polypeptide selon la revendication 4 sous le contrôle de régulation de signaux régulateurs de traduction et de transcription, grâce à quoi ledit polypeptide est exprimé; et à isoler ledit

polypeptide sensiblement dépourvu de matériau cellulaire.

18.- Ensemble ou kit de diagnostic, caractérisé 15 en ce qu'il comprend un anticorps suivant la revendication 13 et un polypeptide selon la revendication 8 ou au moins l'un des polypeptides ou poly(acide aminé) selon

la revendication 1.

19.- Procédé pour produire un polypeptide ou poly(acide aminé) d'au moins huit acides aminés tel que défini dans au moins la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste: à faire croître une culture de cellules contenant des cellules possédant une structure d'expression compre25 nant une séquence d'ADN codant ledit polypeptide sous le contrôle de régulation de signaux régulateurs de traduction et de transcription, grâce à quoi ledit polypeptide est exprimé; et

à isoler ledit polypeptide sensiblement dépourvu 30 de matériau cellulaire.

20.- Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le polypeptide précité contient une séquence d'acides aminés possédant au moins 10 acides aminés qui correspondent à une séquence d'acides aminés:

::: X; 0: X

: ::: 0 :

::0: D::

:::: :::: S A: A:;:P

::::::

:: 0: : ::::: : -:

; 0 10

:::::: :

:0:;: : :: : \ :::

:;: 15

:::: 0:::::

: : f ::::

: 0 -0

:: ::: : ::

:: A::

::::::

0 : 25 : | ::: :: et: Ouf: 0: 00::: 30

: 0

:; :: ::0: Rif: A: :

1 5 10 15 20

A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K-Q

30 35

T-D-L-M-Q-D-T-S-T-L-L-T-P-Y-I

1 5 10 15 20

Q-R-L-P-K-A-Q-D-L-E-R-S-G-L-N-I-E-D-L-E-K

1 5 10 15 20

L-R-E-H-C-R-E-R-P-G-A-F-P-S-E-Q-Q-L-I-G

et différant de cette séquence de pas plus de 3 acides aminés.

21.- Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le polypeptide précité contient 12 acides aminés consécutifs qui correspondent à une séquence d'acides aminés:

1 5 10 15 20

A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K-Q

30 35

T-D- L-M-Q-D-T-S-T- L- L-T-P-Y-I

1 5 10 15 20

Q-R-L-P-K-A-Q-D-L-E-R-S-G-L-N-I-E-D-L-E-K

1 5 10 15 20

L-R-E-H-C-R-E-R-P-G-A-F-P-S-E-Q-Q-L-I-G

et différant de ladite séquence de pas plus d'un acide aminé, cette différence étant soit une délétion ou une substitution conservative.

22.- Procédé pour produire un polypeptide sensiblement dépourvu de débris cellulaires et d'autres protéines leucocytiques, ledit polypeptide étant défini dans au moins la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste: à faire croître une culture de cellules contenant des cellules possédant une structure d'expression comprenant une séquence d'ADN codant ledit polypeptide sous le contrôle de régulation de signaux régulateurs de traduction et de transcription, grâce à quoi ledit polypeptide est exprimé; et à isoler ledit polypeptide sensiblement dépourvu de matériau cellulaire. 23.- Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ladite séquence correspondante diffère de ladite séquence selon la revendication 2 de pas plus d'un acide aminé.