NO174556B - Fremgangsmaate for fremstilling av et cellevekstregulerende polype pti - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et cellevekstregulerende polypeptid.

Leukocytter, dvs. lymfocytter og monocytter, har i adskillige animalske tumormodeller vist seg å være involvert ved inhibering av tumorvekst. Den økte forekomst av ondartede tumorer hos immunokompromitterte mennesker underbygger påstanden om at de hvite blodlegemer spiller en rolle ved regulering av neoplastisk vekst. Proteinfaktorer som frem-bringes av disse hvite blodlegemer og som inhiberer tumorvekst eller modulerer immunfunksjoner, er allerede blitt isolert og karakterisert og omfatter a- og 7-interferonene, tumornekrosefaktorer, lymfotoxin, interleukin-2 og andre lymfokiner. Da hver av disse isolerte faktorer utviser et av-vikende aktivitetsspekter og kan vekselvirke på forskjellig måte i forbindelse med andre faktorer, er det en fortsatt og sterk interesse for å isolere og karakterisere alle de faktorer som de hvite blodlegemer frembringer ved modulering av cellevekst eller immunfunksjoner. Disse forbindelser kan alene eller sammen finne anvendelse ved behandling eller diagnose av cancer, som aktivatorer for sårlegning eller som immunomodulatorer for behandling av pasienter med immunmangler, autoimmunitet, organtransplantater o.l.

Oppdagelsen, isoleringen, rensingen eller karakter-iseringen av naturlig forekommende faktorer kan by på adskillige vanskeligheter. Det skal utvikles metoder til separ-ering og rensing av en faktor, som har interesse, fra andre faktorer i det urene utgangsmateriale uten å denaturere den ønskede faktors aktiviten, metoder til biologisk analyse som tillater identifisering av fraksjonene under separasjoner hvorved en særlig faktor konsentreres, metoder til å skjelne en hittil ukjent faktor fra faktorer som allerede er kjent, eller andre ukjente faktorer som kan være til stede og som enten negativt eller positivt kan påvirke aktiviteten av den etterstrebede faktor, metoder til karakterisering av den rensede faktor, og metoder til konsentrering av den rensede faktor i en tilstrekkelig mengde slik at identifisering og karakterisering av faktoren tillates. Som følge av det stig-ende antall faktorer som er blitt isolert, blir hver ny faktor derfor mer vanskelig å identifisere da dens rolle og funksjon kan være skjult av de tallrike andre tilstedeværende faktorer.

Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3_:93~96' beskriver nærvær av peptider i human urin, hvilke peptider inhiberer vekst og DNA-syntese i transformerte celler mer enn i normale celler. Holley et al., Proe. Nati. Acad. Sei.

(1980) T7_ : 5989-5992, beskriver rensing av epitel cellevekst-inhibitorer. Letansky, Biosci. Rep. (1982) 2^ 39-45, beskriver at peptider renset fra kvegplacenta, inhiberer tumorvekst og thymidininkorporering i DNA i større utstrekning i neoplasma enn i normale celler. Chen, Trends Biochemn. Sei. (1982) 7_ : 364-365, beskriver isolering av et peptid fra ascitesvæske med cancer-undertrykkende egenskap. Redding og Schally, Proe. Nati. Acad. Sei. (1982) 79: 7014-7018, beskriver isolering av ett eller flere rensede peptider fra svinehypothalamus, hvilke peptider utviser antimitogenaktivitet overfor atskillige normale cellelinjer og tumorcellelinjer. Sone et al., Gann (1984) 7_5_: 920-928, beskriver produksjonen av en eller flere faktorer som dannes av humane makrofager, hvilke faktorer inhiberer veksten av visse tumorceller in vitro. Ransom et al., Cancer Res. (1985) 4^:851-862, beskriver isolering av en faktor kalt leukoregulin, hvilken faktor inhiberer replikasjonen av visse tumorcellelinjer og synes å være forskjellig fra lymfotoxin, interferon og interleukin 1 og 2. De fleste av disse faktorer er ikke fullt ut karakterisert, og den primære struktur derav er heller ikke kjent.

Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:686-691, har renset og karakterisert humant lymfotoxin (LT) som er fremstilt fra en lymfoblastoid cellelinje, og har deretter sekvensoppdelt LT (Aggarwal et al., J. Biol. Chemn. (1985) 260:2334) . Gamma-interferon (-y-IF) , som er fremstilt av lymfoidceller og som utviser immunomodulatorisk og tumorinhi-berende aktivitet, er blitt klonet og fremstilt ved ekspresjon (Gray et al., Nature (1982) 295:503:508). Tumornekrosefaktor (TNF) som inhiberer vekst av visse tumorer og som fremstilles av makrofager og visse leukemiske cellelinjer,

er blitt karakterisert, og TNF-cDNA har vært klonet og frem-

stilt ved ekspresjon i E. coli (Pennica et al., Nature (1984) 312:724).

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et cellevekstregulerende polypeptid som er i stand til å inhibere proliferasjonen av neoplastiske celler og stimulerer proliferasjonen av normale, humane fibroblastceller, som ikke inhiberer humane, proliferative og cytotoksiske T-cellereaksjoner, ikke inhiberer granulocyttisk/myelocyttisk benmargscellekolonidannelse, har en molekylvekt i intervallet fra 17 til 19 kD ifølge bestemmelse ved gelutelukkelseskroma-tografi og 28 kD ifølge bestemmelse ved SDS-PAGE, og er relativt ufølsomt overfor moderat sure og basiske betingelser og stabilt ved en temperatur på 56°C, og omfatter minst én aminosyresekvens som høyst avviker med tre aminosyrer, og fortrinnsvis med ikke mer enn én aminosyre fra én av følgende sekvenser:

hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man isolerer leukocytter fra et pattedyr, hvilke leukocytter er valgt fra gruppen omfattende histocyttiske lymfomaceller og normale, humane, perifere blodlymfocytter, aktiverer leukocyttene med et induserende middel valgt fra gruppen omfattende ingenoler og forboler, når leukocyttene er valgt blant histocyttiske lymfomaceller, eller mitogener, når leukocyttene er valgt blant normale, humane, perifere blodlymfocytter, og fra de aktiverte leukocytter som er fri for cellulært materiale, isolerer det cellevekstregulerende polypeptid i en renhet som tilveiebringer en spesifikk aktivitet på minst 10 GIA-enheter/ng protein og fortrinnsvis minst 100 GIA-enheter/ng

protein.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et hittil ukjent polypeptid (eller også betegnet som peptid-faktor), samt biologisk aktive fragmenter derav, hvilken faktor kan oppnås fra leukocytter. Faktoren finner anvendelse ved modulasjon av cellevekst slik som inhibering av tumor-cellevekst og stimulering av veksten av normale fibroblaster, og kan modulere immunfunksjoner. Faktoren har en aminosyresekvens som tydelig adskiller seg fra sekvensene av andre forbindelser som er angitt å utvise analoge egenskaper.

Foreliggende oppfinnelse beskrives i.det etterfølgende nærmere under henvisning til tegningen, hvori

figur 1 angir aminosyresekvensen for fragmenter av Oncostatin M,

figur 2 viser en serie mikrofotografier av celler behandlet med Oncostatin M hvor mikrofotografi (A-C) forestiller A375 melanomaceller behandlet med hhv. 0, 5 og 100 GIA-enheter, og fotografi (D-F) forestiller W138 fibroblastceller behandlet med hhv. 0, 5 og 100 GIA-enheter, og

figur 3 viser et fotografi av en SDS-PAGE-analyse av Oncostatin M.

Et polypeptid fremstilt ifølge oppfinnelsen betegnes som Oncostatin M og kan oppnås fra leukocytter, f.eks. fra kondisjonerte medier av stimulerte U937—celler eller kondisjonerte medier av stimulerte, normale, humane, perifere blodlymfocytter (PBL). Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes likeledes fragmenter og mutanter av polypeptidet, hvilke fragmenter og mutanter utviser det intakte Oncostatin M's biologiske aktivitet, slik som cellevekstmodulerende aktivitet eller immunologisk aktivitet.

Polypeptidfragnentene fremstilt ifølge oppfinnelsen er hittil ukjente polypeptider med minst 8 aminosyrer, hvilke polypeptider er biologisk aktive, i det minste med hensyn til immunologisk kryss-reaktivitet med naturlig forekommende Oncostatin M. Med immunologisk kryss-reaktivitet forstås at et antistoff som fremkalles av et hittil ukjent polypeptid ifølge oppfinnelsen, vil kryss-reagere med intakt Oncostatin M, i det minste når Oncostatin M befinner seg i denaturert form. Slike polypeptider er derfor nyttige til fremkallelse av antistoffer mot Oncostatin M, hvilke antistoffer kan anvendes til bestemmelse av Oncostatin M-konsentrasjonen i en kroppsvæske, til å bindes til Oncostatin M og således modulere aktiviteten derav, og til rensing av Oncostatin M, f.eks. ved anvendelse i forbindelse med en affinitetskolonne. En del av polypeptidene kan også bibeholde Oncostatin M's cellevekstmodulerende aktivitet, skjønt aktiviteten kan være modulert, vanligvis redusert i sammenligning med intakt Oncostatin M.

Figur 1 viser aminosyresekvensen av poly(aminosyrer) som kryss-reagerer med Oncostatin M, idet den første sekvens utgjør N-terminaldelen av Oncostatin M.

Poly (aminosyrer) fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholder en aminosyresekvens med minst 8 på hverandre følgende aminosyrer som svarer til en i figur 1 avbildet aminosyresekvens, og som høyst adskiller seg fra denne sekvens med hensyn til tre, og vanligvis ikke mere enn én aminosyre. Denne forskjell kan enten bestå i innføyelse av en aminosyre, utelatelse av en aminosyre eller substitusjon av en aminosyre med en annen, særlig en konservativ substitusjon. Vanligvis vil poly(aminosyrer) inneholde minst 10, og mere vanlig minst 12, på hverandre følgende aminosyrer som svarer til sekvenser avbildet i figuren, og som høyst adskiller seg derfra med hensyn til én aminosyre.

De forskjellige aminosyrer vil være oppdelt i et antall underklasser. Den nedenfor angitte tabell angir disse underklasser:

Med konservativ substitusjon menes at aminosyrer fra samme underklasse (dvs. enten nøytral alifatisk, sur alifatisk, basisk alifatisk eller aromatisk), i særdeleshet med samme polaritet, erstatter hverandre. Fortrinnsvis vil mono-mergrupperingene i den alifatiske underklasse bestå av aminosyrer inneholdende 2-4 carbonatomer eller 5-6 carbonatomer.

Angitte poly(aminosyrer) vil ikke ha en lengde som overstiger ca. 1.000 aminosyrer. Vanligvis vil de inneholde mindre enn 100 aminosyrer, og vanligvis mindre enn 50 aminosyrer. Således kan angitte poly(aminosyrer) lett syntetiseres. Poly(aminosyrer) hvis lengde overstiger 100 aminosyrer, vil vanligvis være polymerer av fragmenter av Oncostatin M, hvilke fragmenter hvert især inneholder mindre enn 100 aminosyrer, eller sammensmeltede proteiner hvor fragmentet er sammen-smeltet med et antigen, enzym, enzymfragment, etc. I særdeleshet kan poly(aminosyrer) med høyere molekylvekt bestå

av minst ett polypeptidfragment med mindre enn ca. 100 aminosyrer som er covalent bundet til en stor immunogen polypep-tidbærer for tilveiebringelse av immunogenitet. Eksempler på slike proteinbærere er kvegserumalbumin, såkalt keyhole limpet hemocyanin (KLH) o.l. Slike konjugerte polypeptider vil være nyttige til å fremkalle antistoffer i en passende vertsorganisme.

U937-celler er en cellelinje som er avledet fra en histiocytisk lymfomacellelinje (Sundstrøm og Nilsson,

Int. J. Cancer (1976) _17:565-577) som man kan få til å differensiere til celler med makrofagegenskaper etter behandling med forskjellige midler (Harris et al., Cancer Res.

(1985) 4_5:9-13). For fremstilling av Oncostatin M kan U937-cellene dyrkes i et konvensjonelt næringsmedium med serum og behandles med en passende induktor. Det kan hensiktsmessig anvendes forboler eller ingenoler, i særdeleshet 12-0-tetra-decanoylforbol-13-acetat (TPA). Vanligvis kan det anvendes fra ca. 5-20 ng/ml av induktoren. Begynnelsesantallet av celler ligger på fra ca. 10 5 til 10 6 celler/ml. Etter behandling av cellene med induktoren i et tilstrekkelig tidsrom, vanligvis fra 1 til 6 dager, fjernes supernatanten, cellene vaskes med serumfritt næringsmedium, bundne celler vaskes igjen med serumfritt medium, og cellene får inkubere i minst 12 timer, vanligvis ikke mer enn ca. 48 timer, i serumfritt næringsmedium, f.eks. RPMI-1640 medium. Supernatantene oppsamles deretter, og cellene fjernes ved sentrifugering. Cellefrie supernatanter avprøves med hensyn til cellevekst-inhiberende aktivitet (GIA) som beskrevet i den eksperimentelle del. Supernatanten inneholder ca. 50-500 enheter GIA pr. ml (med hensyn til definisjonen av GIA-enheter henvises det til den eksperimentelle del i det etterfølgende). Oncostatin M kan også oppnås fra mitogen-stimulerte, normale, humane, periferiske blodlymfocytter (PBL). PBL kan isoleres fra leukofraksjoner ved fortynning av fraksjonene og sentrifugering derav over "Ficoll"-gradienter. Celler som er oppsamlet fra gradientgrenselagene, vaskes og sjokk-lyseres for fjerning av røde blodlegemer. De resterende celler oppsamles fra denne oppløsning ved sentrifugering, resuspenderes i bufferholdig serum og trombin, ristes, og blodplateaggregatet får lov til å sette seg i et kort tidsrom. De suspenderte celler overføres, gjenvinnes ved sentrifugering, resuspenderes i serum og overføres til en kolonne som inneholder nylonull. Kolonnen inkuberes for å tillate at monocytter og B-lymfocytter bindes, og vaskes deretter. De fleste perifere blod-T-lymfocytter bindes ikke og elueres fra kolonnen. Disse celler dyrkes ved 37° i dyrkningsmedium, f.eks. RPMI-1640 medium, og behandles med en passende induktor, f.eks. fytohemagglutinin (ca. 1-5 mg/l) i ca. 100 timer, hvor-på supernatantene oppsamles. Supernatantene sentrifugeres for å fjerne celler og konsentreres f.eks. ved ultrafiltrering eller dialyse.

Etter isolering av den cellefrie supernatant fra

enten U937-celler eller normale PBL, konsentreres det kondisjonerte medium hensiktsmessig under anvendelse av et hulfibersystem eller en ultrafiltreringsmembran, etterfulgt av fortynning med eddiksyre (til en konsentrasjon på 0,1 N eddiksyre), konsentreres deretter ca. 10 ganger, hvoretter fortynning og konsentrering gjentas. Konsentratet kan lyofiliseres og anvendes direkte, eller det lyofiliserte produkt kan anvendes for ytterligere rensing.

Angitte Oncostatin M kan renses ved gelpermeeringskromatografi under anvendelse av 40% acetonitril-0,1% trifluoreddiksyre som isokratisk mobil fase på en "Bio-Sil TSK250"-kolonne, idet aktiviteten av hver fraksjon overvåkes. Rensingen gir en sammensetning med minst 0,5-5x10 4 GIA-enheter/ml i de aktive fraksjoner.

Det delvis rensede produkt fra gelpermeeringskromato-grafien kan ytterligere renses ved anvendelse av reversfase-høytrykksvæskekromatografi under anvendelse av en lineær gradient hvor det primære løsningsmiddel er 0,1% trifluoreddiksyre i vann, og det sekundære løsningsmiddel er acetonitril inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre. Tidsforløpet kan varieres idet kromatograferingen vanligvis krever ca. 3-4 timer, hvorved hovedparten av tiden, dvs. mere enn ca. 50% av tiden, og ikke mere enn ca. 80% av tiden, forbrukes i det gradient-intervall hvor konsentrasjonen av sekundært løsningsmiddel er 30-45%. Under disse betingelser eluerer de aktive fraksjoner ved en konsentrasjon på ca. 41-42% acetonitril.

De forenede aktive fraksjoner kan ytterligere renses ved å gjenta angitte reversfase-HPLC under anvendelse av en hurtigere forandring i gradientbetingelsene, og en langsommere strømningshastighet. Under disse betingelser fremkommer de aktive fraksjoner ved en konsentrasjon på ca. 40,5-41,5% acetonitril.

Angitte reversfase-HPLC kan deretter gjentas under forandring av løsningsmiddelsystemet, idet det som sekundært løsningsmiddel anvendes n-propanol-0,1% trifluoreddiksyre.

Det anvendes en lineær gradient hvor gradienten endres langsomt i intervallet fra 23-35% n-propanol. Den betydeligste aktivitet iakttaes i intervallet fra 25,5-27,5% propanol, hvilket gir et hovedsakelig homogent produkt med en spesifikk aktivitet som overstiger 10 GIA-enheter/ng protein. Vanligvis renses produktet under dannelse av en spesifikk aktivitet på minst

100 GIA-enheter/ng protein, og vanligvis 150 GIA-enheter/ng.

Angitte forbindelser er karakterisert ved en molekylvekt på ca. 17-19 kiloDalton (kD), i særdeleshet 18 kD,

ifølge bestemmelse ved størrelsesutelukkelseskromatografi. Angitte forbindelser er ytterligere karakterisert ved å utvise

en tilsynelatende molekylvekt på ca. 28 kD ifølge bestemmelse ved polyacrylamidgelelektroforese under reduserende eller ikke-reduserende betingelser.

Aminosyresekvensen av fragmenter av renset Oncostatin M analyseres. Oncostatin utviser hovedsakelig de i figur 1 angitte aminosyresekvenser. Idet det henvises til figur 1, illustrerer den første sekvens N-endedelen av Oncostatin M, mens de resterende sekvenser illustrerer indre fragmenter av polypeptidet.

Aktive sammensetninger av isolert Oncostatin M inneholdt en blanding med høyt innhold av mannose og komplekst N-bundet oligosaccharid. Imidlertid bibeholdt ikke-glycosylerte sammensetninger av Oncostatin M cellevekstmodulerende aktivitet.

Oncostatin M er ytterligere karakterisert ved aktiviteten derav overfor visse cellestammer. Det angitte polypeptid mangler cytotoksisk aktivitet overfor WI26 og WI38 humane fibroblastceller og L929 museceller som er følsomme overfor tumornekrosefaktor, og en -jr-interferonfølsom, human tumor-cellelinje. Det har også vist seg at det ikke inhiberer formering av normale, humane T-lymfocytter eller inhiberer granulocyttisk/myelocyttisk kolonidannelse fra benmargceller ved konsentrasjoner opp til 100 GIA-enheter/ml. Oncostatin M stimulerer enn videre formering av normale, humane fibroblastceller som er eksemplifisert ved WI38- og WI26-celler, og inhiberer formering av tumorceller slik som A375, HBT10, A549 og SK-MEL28, og kan øke veksten av kolonidannende celler fra normal benmarg. Oncostatin M undertrykker ikke humane, formerende eller cytotoksiske T-celleresponser ved blandede leukocyttkulturreaksjoner (MLC) ved konsentrasjoner på

500 GIA-enheter/ml.

Angitte polypeptid har vist seg å være stabilt overfor moderat syre- og basepåvirkning, og overfor varmebehandling ved 56°C.

Aminosyresekvensen for det omhandlede polypeptid kan bestemmes fullstendig under anvendelse av kommersielt til-gjengelige sekvensanalyseapparater.

Den angitte forbindelse kan anvendes i in vitro-kulturer for inhibering av veksten av celler eller cellelinjer som er følsomme overfor det angitte polypeptid, i motsetning til celler som ikke er følsomme. Heterogene celleblandinger eller cellelinjer kan således befris for uønskede celler når de uønskede celler er følsomme overfor det angitte polypeptid. Det angitte polypeptid kan administreres in vivo når det gjelder neoplastiske tilstander, f.eks. ved intralesjonal, peritoneal, subkutan eller lignende injeksjon. Den angitte forbindelse kan anvendes in vitro for eliminering av ondartede celler fra margen til autologe margtransplantater, eller for inhibering av formering eller eliminering av ondartede celler i annet vev, f.eks. blod, før reinfusjon.

Det angitte polypeptid anvendes ved en

fremgangsmåte for behandling av sår, slik som kutane sår, corneale sår og forskjellige andre epitele og stromale sår, slik som kronisk sår, forbrenninger, kirurgiske inngrep, traumatiske sår og skader på de hule epiteldekkede organer slik som øsofagus, mage, tykk- og tynntarm, munn, genitalier og urinveier. Metoden avhenger av den topiske påføring av et behandlingspreparat som inneholder Oncostatin M i en fysiologisk akseptabel bærer.

Preparatet kan anvendes til behandling av forskjellige typer sår, herunder hovedsakelig alle kutane sår, corneale sår og skader på de epitelbekledte hule organer i krop-pen. Sår som er egnet for behandling, omfatter slike sår som stammer fra trauma, slik som forbrenninger, avskrapninger, snitt o.l., såvel som fra kirurgiske prosedyrer slik som kirurgiske innsnitt og hudtransplantasjon. Andre tilstander som er egnet for behandling med sammensetningene ifølge oppfinnelsen, omfatter kroniske tilstander slik som kronisk sår, diabetisk sår og andre ikke-legende (trofiske) tilstander.

Oncostatin M kan inkorporeres i fysiologisk akseptable bærere for påføring på et påvirket område. Arten av bæreren kan variere og vil avhenge av det beregnede påføringsområde. For påføring på huden foretrekkes normalt en krem- eller salve-basis, idet en slik passende basis omfatter lanolin, "Silvaden"

(Marion) (særlig til behandling av forbrenninger), Aquaphor®

(Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut), o.l. Om ønsket, vil det være mulig å inkorporere Oncostatin M-holdige sammensetninger i bandasjer og andre sårforbindinger for å sørge for kontinuerlig eksponering av såret for peptidet. Aerosoladministrering kan også finne anvendelse.

Konsentrasjonen av polypeptidet i behandlingspreparatet er ikke kritisk. Polypeptidet vil være til stede i en epitelcelle-formeringsfremkallende mengde. Preparatene an-bringes topisk på det angrepne område, typisk som øyedråper til øyet eller som kremer, salver eller lotions på huden. Når det gjelder behandling av øyne, er en hyppig behandling ønskelig, vanligvis påføringer i intervaller på 4 timer eller mindre. På huden er det ønskelig å kontinuerlig opprettholde behandlingspreparatet på det påvirkede område under legningen, med påføringer av behandlingspreparatet fra 2 til 4 ganger daglig eller oftere.

Den anvendte mengde av det angitte polypeptid vil variere avhengig av administreringsmåten, anvendelsen av andre aktive forbindelser o.l., og vil generelt ligge i intervallet fra ca. 1 ug til 100 ug. Det angitte polypeptid kan anvendes med en fysiologisk akseptabel bærer slik som saltvann, fosfatbufret saltvann eller lignende. Mengden av anvendt forbindelse bestemmes empirisk på basis av reaksjonen av celler in vitro, og reaksjonen av forsøksdyr overfor de angitte polypeptider eller sammensetninger inneholdende de angitte polypeptider.

De angitte forbindelser finner anvendelse alene eller i kom-binasjon med andre vekstfaktorer eller inhibitorer eller immunomodulatorer slik som TNF, IL-2, r-interferon, mono-klonale antistoffer etc. Mengden av disse andre forbindelser vil generelt ligge i intervallet fra 1 ug til 100 ug. Konju-gater av de angitte forbindelser med område-dirigerende rester, f.eks. antistoffer, kan fremstilles i de tilfeller hvor antistoffene er spesifikke overfor særlig ondartede celler eller organer.

Oppfinnelsen belyses nærmere i det etterfølgende.

Materialer og metoder

Oncostatin M isolert fra U937- celler

Produksjon av en tumorcellevekstinhibitor fra en histiocyttisk lymfomacellelinje

U937-celler som er en histiocyttisk lymfomacellelinje (Sundstrøm og Nilsson,- Int. J. Cancer (1976) 17; 565-577) , ble dyrket i 850 cm 2 rullekolber (Corning C2540) ved en konsentrasjon på 4 x 10 5celler/ml, i et samlet volum på 300 ml RPMI-1640-medium supplert med 10% kalvefosterserum (FCS), penicillin/streptomycin (PS), L-glutamin og 10 ng/ml 12-0-tetradecanoylforbol-13-acetat (TPA). 4 dager senere ble supernatantene inneholdende FCS og TPA, fjernet, rullekolbene ble vasket 5 ganger med serumfritt RPMI-1640, og løsrevne celler (1 x IO<5> celler/ml) ble vasket 3 ganger med serumfritt medium og ble ført tilbake til kolbene, hvilket resulterte i et sluttvolum på 125 ml serumfritt RPMI-1640 medium pr. rullekolbe. En dag senere ble supernatantene samlet, sentrifugert for fjerning av cellene, ble filtrert gjennom et 0,45 mikrometers (u) Nalgene<®->filter og ble konsentrert under anvendelse av et hulfibersystem ("Amicon Cartridge HIP10-20") til et volum på 150 ml (startvolum 1500 ml). Oncostatin M ble isolert også fra supernatanter av serumfritt TPA-behandlede U937-celler i 150 cm 2 vevskulturkolber. Supernatanten ble konsentrert med en "Amicon Diaflo PM-10" membran som utviste en avskjæringsverdi på 10 kD, og ble dialysert. Etter dialyse ble konsentratet fortynnet med eddiksyre, hvilket resulterte i en sluttkonsentrasjon på 0,1 N eddiksyre i 500 ml, og ble konsentrert til 50 ml under anvendelse av et "Amicon PM-10"-filter. Dette 50 ml konsentrat ble fortynnet til

400 ml med 0,1 N eddiksyre og ble konsentrert til 40 ml med samme filter. Konsentratet ble fortynnet med 1 N eddiksyre, og den resulterende utfelling ble fjernet ved sentrifugering. Det erholdte konsentrat ble nedfrosset og lyofilisert. Det lyofiliserte materiale ble anvendt til rensetrinn.

Gelpermeeringskromatografi

En "Bio-Sil TSK-250"-kolonne (600 x 21,5 mm)

(Bio-Rad) ble forbundet med et høytrykksvæskekromatografisk system. Den urene fraksjon (10 mg/ml) ble oppløst i 40% acetonitril i 0,1% vandig trifluoreddiksyre (0,1% TFA). En 20 ml aliquot av blandingen ble injisert, og elueringen ble utført isokratisk med en mobil fase bestående av 40% acetonitril i 0,1% TFA. Strømningshastigheten var 2,5 ml/minutt, og fremføringshastigheten for diagrampapiret ble innstilt til 0,25 cm/minutt. 5 ml fraksjoner ble oppsamlet. Kromato-grafien ble utført ved romtemperatur. En aliquot fra hver fraksjon ble inndampet og analysert tredobbelt med hensyn til vekstinhiberende aktivitet (GIA) overfor A375-celler.

De aktive fraksjoner (fraksjon 21 og 22) fra seks kjøringer ble forenet. Det forenede materiale utviste en aktivitet på i alt ca. 4,8 x 10 5GIA-enheter. Faktoren viste seg å ha en tilsynelatende molekylvekt på 18 kD ifølge bestemmelse ved hjelp av størrelsesutelukkelseskromatografi ("Bio-Sil TSK-250"-kolonne).

Reversfase- høytrykksvæskekromatografi ( HPLC) av TSK- 250-fraksjoner

De ovenfor beskrevne forenede TSK-250-fraksjoner 21 og 22 ble fortynnet to ganger med 0,1% TFA. Denne blanding ble injisert isokratisk på en "u-Bondapak-C18"-kolonne (7,8 x 300 mm) (betegnet som C18<1>) ved romtemperatur. Strømnings-hastigheten ble innstilt til 2,5 ml/minutt, og diagramhastigheten på skriveren ble innstilt til 0,25 cm/minutt. En lineær gradient ble anvendt mellom primært løsningsmiddel-0,1% TFA og det sekundære løsningsmiddel acetonitril-0,1% TFA. Gradientbetingelsene var 0-30% i løpet av 20 minutter, deretter 30-45% i løpet av 150 minutter, 45-55% i løpet av 20 minutter og 55-100% i løpet av 10 minutter. Alle løsningsmidler var av HPLC-kvalitet. Det ble oppsamlet 4 ml fraksjoner, og aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn til vekstinhiberende aktivitet. Fraksjon 72-75 viste seg å inneholde den overveiende aktivitet. De aktive fraksjoner ble eluert ved acetonitrilkonsentrasjoner på mellom 41 og 52%.

Fraksjon 72-75 ble forenet. 16 ml 0,1% TFA ble tilsatt til de forenede fraksjoner. Blandingen ble innsprøytet i en "u-Bondapak-C18"-kolonne (3,9 x 300 mm) (betegnet som C18 2) ved romtemperatur. Strømningshastigheten ble innstilt til 1 ml/minutt, og diagramhastigheten på skriveren ble innstilt til 0,25 cm/minutt. Gradientbetingelsene var 0-35% i løpet av 10 minutter, 35-45% i løpet av 100 minutter og 45-100% i løpet av 10 minutter. Fraksjonene ble oppsamlet, og aliquoter ble tatt ut og analysert med hensyn til GIA. Det meste av aktiviteten forlot kolonnen ved en acetonitrilkonsentrasjon på mellom 40,7 og 41,3% (retensjonstid 83-86 minutter).

De aktive fraksjoner ble forenet og fortynnet to ganger med 0,1% TFA og ble innsprøytet isokratisk på en "u-Bondapak-C18"-kolonne (3,9 x 300 mm) (betegnet som C18^) ved romtemperatur. Strømningshastigheten var 1 ml/minutt,

og diagramhastigheten på skriveren var 0,25 cm/minutt. Det ble anvendt en lineær gradient mellom primært løsnings-middel-0,1% TFA og det sekundære løsningsmiddel n-propanol-TFA (0,1%). Gradientbetingelsene var 0-23% i løpet av 20 minutter og 25-35% i løpet av 120 minutter. Fraksjonene ble oppsamlet, og aliquoter av hver fraksjon ble undersøkt med hensyn til GIA. Det meste av aktiviteten viste seg ved en propanolkonsentrasjon på mellom 25 og 26,5% (retensjonstid 59 minutter). Denne tilsynelatende homogene fraksjon inneholdt ca. 300 ng protein og utviste en aktivitet på 40.000 GIA-enheter.

Cellevekstmodulerende analyse under anvendelse av 3 H- thymidm-inkorporering i DNA ( GIA)

Analysene ble utført ved hjelp av plater forsynt med 96 flate brønner (Costar 3596) . Humane melanomaceller (A375) ble anvendt som en følsom indikatorcellelinje. Celler (3 x 10<3>) i 0,1 ml Dulbeccos modifiserte Eagles-medium (DMEM) supplert med 10% FCS og PS, ble anbragt i hver brønn. 3 timer senere ble 0,1 ml prøve tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert ved 37°C i 3 dager. Deretter ble det tilsatt 0,025 ml (0,5 uCi) av en oppløsning av <3>H-thymidin (spesifikk aktivitet 27 uCi/ug) til hver brønn for de siste 6 timer av inkuberingen. Cellene ble deretter overført til glassfilterstrimler under anvendelse av en inultibrønnshøster (PHD Cell Harvester, Cambridge Technology, Inc.). Filtrene ble overført til scintillasjonsglass til hvilke det ble tilsatt 2 ml scintilla-sjonsvæske (ScientiVerse II, Fisher Scientific Co.) før tell-ing i en scintillasjonsteller for bestemmelse av <3>H-thymidin-inkorporeringen.

Koloni- inhiberingsprøve på bløt agar ( TGI)

Et 0,5 ml basislag av 0,5% agar ("Agar Noble", Difco Laboratories, Detroit, Michigan) i DMEM med et innhold av 10% kalvefosterserum (FCS) ble tilsatt til Costar-vevskultur-plater med 24 brønner. 0,5 ml 0,3% agar som inneholdt samme blanding av medium og FCS, l-2,5xl0<3> A375-celler og forskjellige konsentrasjoner av faktoren som skulle undersøkes, ble anbragt oppå agarbasislaget. Platene ble inkubert ved 37°C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 i luft og ble etter 10 dager igjen tilsatt 0,5 ml 0,3% agar inneholdende samme medium og faktorkonsentrasjoner. Koloniene ble opptelt, løsnet og avfarget, og antallet av kolonier inneholdende mere enn 6 celler, ble bedømt mellom dag 7 og 14.

Resultater

Sekvenser av Oncostatin M isolert fra U937- celler

N-endesekvensen og indre fragmenter av Oncostatin M ble bestemt ved hjelp av mikrosekvensanalyse av det reduserte og S-pyridin-ethylerte polypeptid, og av peptider som var oppnådd ved enzymatisk nedbrytning av redusert og S-pyridin-ethylert Oncostatin M med endoproteinase Lys-C og Staphylococcus aureus V8 protease. Peptidfragmentene ble renset ved reversfase-HPLC under anvendelse av flyktige løsningsmidler. Peptidene ble underkastet automatisk gjentatt Edman-nedbrytning i et "Model 470A"-proteinsekvensoppdelingsapparat (Applied Biosystems, Inc.). Fenylthiohydantoinaminosyrene ble analysert ved reversfase-HPLC (Applied Biosystems, Inc.) med en "PTH-C18"-kolonne (2,1x220 mm, ABI) under anvendelse av en natriumacetatbuffer/tetrahydrofuran/acetonitrilgradient for elueringen.

De resulterende aminosyresekvenser er hovedsakelig som avbildet i figur 1.

En sammenligning av disse sekvenser med sekvenser oppbevart i den gjeldende proteindatabase (PIR Release 9,0, mai 1986), avslørte ingen signifikante sekvenshomologier med noen annen kjent sekvens. I tillegg er det ikke noen homo-logi med tumornekrosefaktor, lymfotoxin koloni-stimulerende faktor, interleucin 1 eller 2 eller (3-transformerende vekst-faktor.

Inhibering av formering av tumorceller og økning av formering av normale, humane fibroblastceller

Under anvendelse av det ovenfor beskrevne koloni-inhiberingsforsøk på bløt agar ble følgende resultater oppnådd:

I forbindelse med neste undersøkelse ble det anvendt forskjellige behandlinger for bestemmelse av virkningen av behandlingen som enten var av kjemisk eller fysisk art, på aktiviteten av det angitte polypeptid. Resultatene er angitt i den etterfølgende tabell.

Det fremgår fra de ovenfor angitte resultater at Oncostatin M i den dialyserte supernatant hovedsakelig er resistent overfor inaktivering med IN eddiksyre og IN ammonium-hydroxyd. De angitte forbindelser er således relativt uføl-somme overfor både moderat sterk syre og moderat sterk base. Den angitte forbindelse er stabil overfor varmebehandling ved 56°C i 1 time, men ikke ved 90°C i 30 minutter.

Den angitte forbindelse ble også testet med hensyn til varmestabilitet og viste seg å bibeholde sin aktivitet etter en varmebehandling ved 56°C i 1 time, men mistet hovedsakelig hele aktiviteten ved 95°C i 30 minutter.

Enn videre ble de angitte polypeptiders evne til å inhibere tumorcellereplikasjon hos forskjellige neoplastiske celler undersøkt. Resultatene fremgår fra den etterfølgende tabell.

Tumorceller ble platedyrket i mikrobrønner 3 timer før tilsetning av forskjellige fortynninger av Oncostatin M som var renset ved reversfase-HPLC som ovenfor angitt. De siste 6 timer av en inkubering over 3 dager ble cellene merket i 0,2 ml medium med 3 H-thymidin ( 3H-TdR) (0,5 uCi/brønn). En enhet tumorvekst-inhiberende aktivitet (GIA) er definert i fotnoten til tabell 1 som den mengde som bevirker 50% inhibering av <3>H-TdR-inkorporering i A3 75-melanomaceller. Det ble påvist at en enhet svarte til ca. 10 pg renset protein, og derfor var konsentrasjonen (ng/ml) som forårsaket 30% inhibering av inkor-porering av <3>H-TdR i A549-, HTB10- og A-375-celler, hhv. ca. 1,4, 4,0 og 0,015 ng/ml. <3>H-TdR-inkorporering i WI26 normale, humane fribroblastceller ble ikke undertrykket av U937-faktoren ved noe forsøk.

Det fremgår fra de ovenfor angitte resultater at Oncostatin M's evne til å inhibere replikasjon er selektiv, og at Oncostatin M har sterkt varierende virkning avhengig av cellens art. Den angitte forbindelse er effektiv overfor melanomaceller slik som A375-melanomaceller, plateepitelkreft-celler slik som A549- og neuroblastomaceller slik som HTB10.

Tumorceller ble podet i 3 timer på plater inneholdende

96 brønner, under anvendelse av 3 x 10 3 celler/brønn, og for normale fibroblastceller, 1,5 x 10 3 celler/brønn. Forskjellige konsentrasjoner av renset Oncostatin som var erholdt fra C18 3-kolonnefraksjonen med maksimal antiformerende aktivitet overfor A375-celler, ble tilsatt, og 3 dager senere ble <3>H-thymidin-inkorporeringen i cellene målt ved tredoble forsøk for hver konsentrasjon. Resultatene fremgår fra tabell 4.

De angitte resultater er den prosentvise inhibering

eller prosentvise stimulering av H-thymidin-mkorporering i hhv. tumorceller (A375, HTB10, A549 og SK-MEL28) og normale fibroblastceller (WI26 og WI38). En GIA-enhet er definert i fotnoten til tabell 1 som den mengde av Oncostatin M som bevirker en 50% inhibering av H-thymidin-mkorporering i A375-celler.

I tillegg til den iakttatte forskjellsvirkning på <3>H-thymidin-inkorporering i tumorceller og i normale, humane fribroblastceller ble det som vist i figur 2, også iakttatt en forskjellsvirkning på morfologi og celleantall etter behandling i 3 dager av de to celletyper med Oncostatin M.

Det anvendte Oncostatin M stammet fra HPLC-C18-kolonne-fraksjonen med maksimal aktivitet med hensyn til inhibering av formering av A375-celler. Figur 2 viser en serie av mikrofotografier av A375-melanomaceller som var ubehandlet (A), behandlet med 5 GIA-enheter (vekstinhiberende aktivitetsenheter)

Oncostatin M (B) eller 100 enheter (C). Dessuten er det vist mikrofotografier av WI38-fibroblastceller som var ubehandlet (D), behandlet med 5 GIA-enheter (E) eller 100 enheter (F). Cellene ble farvet med krystallfiolett i 0,5% methanol. Forstørr-elsen er 63 ganger.

NaDodSO^/ PAGE av Oncostatin M

—Renset Oncostatin M ble underkastet NaDodSO -undersøk-else under reduserende betingelser og viste seg å ha en tilsynelatende molekylvekt på ca. 2 8 kD, hvilket fremgår av figur 3. Følgende proteiner ble anvendt som standarder (spor A): ovalbumin, Mr = 43 kD, chymotrypsinogen a, Mr = 25,7 kD, lacto-globulin |3, Mr = 18,4 kD, lysozym, Mr = 14,2 kD, kvegtrypsin-inhibitor, Mr = 6,2 kD og insulin A-kjede og B-kjede, hhv.

Mr = 2,3 kD og 3,4 kD. Oncostatin M ble anbragt i spor B.

Oncostatin M som ble underkastet PAGE-undersøkelse

under ikke-reduserende betingelser, utviser også en tilsynelatende molekylvekt på 28 kD, og protein som ble elektroeluert fra båndet, viste seg å inhibere formering av A375-celler.

Antistoff overfor et syntetisk peptid av Oncostatin M reagerer

125 . ■

med I- merket Oncostatin M ved radioimmunologiske utfell-inger

a) Peptidsyntese

Peptidet svarer til restene 6-19 i Oncostatin M-proteinet

og ble syntetisert ved fastfaseteknikk på et automatisert Beckman-instrument som beskrevet i Gentry et al., J. Biol. Chem.

(1983) 2_58:11219. Peptidet ble spaltet fra harpiksen under anvendelse av "lav-høy" HF-metoden (Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. (1983) 105:6442-6445). Rensingen ble utført ved hjelp av preparativ HPLC.

b) Fremstilling av antistoffer

Peptidet ble koblet med kveg-7-globulin som beskrevet

i Gentry og Lawton, Virology (1986) 152:421-431. Hvite New Zealand-kaniner ble injisert og mottok booster-injeksjoner

(5 ganger) subkutant i 4 områder som beskrevet av Gentry og Lawton, Virology (1986) 152:421-431. Det anvendte antiserum ble oppnådd 2 uker etter den femte booster-injeksjon.

c) Jodering av Oncostatin M

En prøve av delvis renset Oncostatin M ble radiomerket

med jod 125 under anvendelse av de av Linsley et al., PNAS

(1985) 82^:356-360 beskrevne metoder. En aliquot av den merkede sammensetning og som inneholdt 100.000 cpm, ble blandet med kanin-antiserum som var rettet mot de N-terminale 17 aminosyrer av Oncostatin M (sluttfortynning 1:20) i fravær eller nærvær av N-endepeptidet (de N-terminale 17 aminosyrer av Oncostatin M) (2 vig) og ble underkastet immunutfellingsanalyse som beskrevet av Lindley et al., Biochemistry (1986) 25:2978-2986.

Spesifikt ble et rør som inneholdt 5 ul, preinkubert med 2 ug av N-endepeptidet i 10 ml TNEN (20 mM tris pH 7,5,

5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% Nonidet<®> P-40) inneholdende 0,1% BSA i 30 minutter ved 4°C, før tilsetning av I Oncostatin M

i 85 ul TNEN inneholdende 0,1% BAS og 40 mM dithiothreitol (DTT). 7 rør inneholdende 5 ul antiserum, ble inkubert med I<125>Oncostatin M i 85 val TNEN inneholdende 0,1% BSA og 40 mM

DTT i 30 minutter ved 4°C før tilsetning av 50 ul 10% formalin-fiksert Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem).

Etter inkubering i ytterligere 30 minutter ved 4°C ble rørene mikrosentrifugert, og bunnfallene ble vasket 4 ganger med 1 ml TNEN før de ble underkastet PAGE-analyse. Et diffust bånd med Mr = 32 kD, ble iakttatt etter SDS/PAGE-analyse av immunutfellingene. Utfelling av denne art ble inhibert ved å innbefatte et overskudd av umerket peptid svarende til de N-terminale 17 aminosyrer av Oncostatin M, hvilket antyder at ut-fellingen var spesifikk for dette peptid.

Carbohydratsammensetningen av Oncostatin M ble undersøkt ved glycosidase-sensibilitetstester. Immunutfellinger som var fremstilt som beskrevet under c) ovenfor, ble behandlet med buffer, endoglycosidase H eller neuraminidase som beskrevet av Linsley et al. (1986). Behandling med endoglycosidase H, som er et enzym med spesifisitet overfor N-bundne høymannose-oligosaccharider, resulterte i tilsynekomst av en forbindelse med lavere molekylvekt, Mr = 24 kD. Bare en del av det radio-merkede materiale var følsomt overfor dette enzym, hvilket indikerte at ikke alle molekyler inneholdt høymannose-oligo-saccharider. Behandling med neuraminidase resulterte i tilsynekomst av et enkelt bånd med Mr = 27 kD, hvilket indikerte at heterogenisiteten med hensyn til størrelsen av ubehandlet 125 I-merket Oncostatin M skyldtes molekylær heterogenisitet i sialyeringen av glycoproteinkjernen. Resultatene indikerte at aktive sammensetninger av Oncostatin M inneholdt en blanding av høymannose- og komplekse N-bundne oligosaccharidsidekjeder.

Oncostatin M isolert fra normale, humane, perifere blodlymfocytter ( PBL)

Produksjon av en tumorcellevekstinhibitor fra PBL

Leukofraksjoner inneholdende PBL erholdt fra blodbanken, ble fortynnet 1:1 med fosfatbufret saltvann, pH 7,4 (PBS).

10 ml av en løsning bestående av 9% "Ficoll" inneholdende

20 volum% 50% natriumdiatrizoat (sluttelig spesifikk vekt på 1,080) ble anbragt under 35 ml fortynnet blod. Gradientene ble sentrifugert ved romtemperatur i 20 minutter ved 850 x G.

Cellene ble oppsamlet fra gradientgrenseflaten og ble vasket med PBS. Røde blodlegemer ble sjokk-lysert i 3-4 minutter med 10-20 ml av en løsning som inneholdt 0,8% ammoniumklorid og 0,0% Na^-EDTA.

Celler ble oppsamlet fra lyseringsoppløsningen for de røde blodlegemer ved sentrifugering ved 600 x G i 10 minutter, og disse ble resuspendert i 10 ml RPMI-1640 medium (Gibco) som inneholdt 5% kvegfosterserum. Trombin ble tilsatt under dannelse av en sluttkonsentrasjon på 0,5 U/ml. Cellesuspensjonen ble ristet i 5 minutter ved 37°C, og blodplateaggregatet fikk avleires i 5 minutter. De suspenderte celler ble overført til nye glass, ble gjenvunnet ved sentrifugering, ble resuspendert i 1 ml kvegfosterserum og overført til en kolonne som inneholdt 0,5 g børstet, på forhånd fuktet nylonull, type 200 (Fenwal).

Nylonullkolonnen ble inkubert ved 37°C i 60 minutter for å tillate festing av monocytter og B-lymfocytter. Kolonnen ble deretter vasket med 3 vol. RPMI-1640 medium (37°C) som inneholdt 5% kvegfosterserum, og de eluerte ikke-festede celler (PBL) ble oppsamlet.

PBL (2 x IO<6> celler/ml) ble dyrket ved 37°C og under anvendelse av 5% C02~95% luft i 96 timer i RPMI-1640 medium (10,4 g/l) som inneholdt FeS04.7H20 (1 mg/l), ZnS04.7H20

(2 mg/l), Na2Se03.5H20 (0,017 mg/l), 1-aminoethanol (1 mg/l), humant transferrin (5 mg/l), kvegserumalbumin-linolsyrekonjugat (Sigma) (200 mg/l), L-glutamin (300 mg/l), penicillin/strepto-mycin (100.000 enheter/l) og fytohemagglutinin-P' (Wellcome)

(2 mg/l). Supernatantene ble oppsamlet, sentrifugert for fjerning av cellene, ble konsentrert ved ultrafiltrering ("Amicon Diaflo YM-10"-membran med 10 kD avskjæring) og dialysert mot 0,1 M eddiksyre ("Spectrapore 3"-dialyserørsystem). Det klarede retenat ble lyofilisert.

Gelpermeeringskromatografi

Den urene fraksjon ble rekonstituert i 20 ml 1 M eddiksyre (50 mg/ml) og ble innført på en "BioGel P-100"-kolonne (2,6 x 88 cm) som var ekvilibrert med 1 M eddiksyre, ved en strømningshastighet på 0,5 ml/minutt. 12 ml fraksjoner ble oppsamlet. En aliquot av hver fraksjon ble inndampet, og det ble utført en tredobbelt test med hensyn til vekstinhiberende aktivitet (GIA) på A375-celler. De aktive fraksjoner ble forenet, lyofilisert og rekromatografert på en "Bio-Sil TSK-250"-kolonne (600 x 21,5 mm) som ovenfor beskrevet.

Reversfase- høytrykkskromatografi av TSK- 250 fraksjoner

Den sluttelige rensing av de forenede TSK-250 fraksjoner ble oppnådd hovedsakelig som beskrevet ved reversfase-HPLC. PBL-tumorcelleinhibitor ble eluert fra "u-Bondapak-C18"-kolonnen ved en acetonitrilkonsentrasjon på 40-41% og en n-propanolkonsentrasjon på 36,5%.

125 Cellevekstmodulerende prøve under anvendelse av I- jod-deoxyuridin- inkorporering i DNA ( GIA)

Disse prøver ble utført i flatbunnede vevdyrkningsbrett (Costar 3596) med 96 brønner. Humane melanomaceller, A375 (4 x 10 3) i 50 ul av testprøven ble tilsatt til hver brønn og ble inkubert i 3 dager ved 37°C. Cellene ble merket i 24 timer med 125

I-IdU (0,05 uCi/brønn) og ble ytterligere inkubert i 24 timer. Cellene ble vasket 3 ganger, ble høstet med et multippelt høste-apparat, og radioaktiviteten ble bestemt ved hjelp av en gamma-teller.

Resultater

En PBL-avledet tumorcelle-inhibitorsammensetning ble underkastet automatisk gjentatt Edman-nedbrytning. N-ende-aminosyresekvensen er følgende:

X betegner en aminosyre som ikke er blitt identifisert.

En sammenligning av denne sekvens med U937-faktor-sekvensen indikerer tydelig identiteten med N-endedelen av den PBL-avledede faktor.

PBL-avledet Oncostatin M's evne til å påvirke replikasjon av et antall forskjellige celler ble deretter undersøkt. Det viste seg at L929-museceller var ufølsomme overfor PBL-avledet Oncostatin M ved anvendelse av opp til 1.000 GIA-enheter/ml. Humane fibroblastceller, WI26, ble vekst-stimulert ved behandling med 1.000 GIA-enheter/ml. Normal, human T-lymfo-cytt f ormer ing 72 timer etter mitogenese ble ikke påvirket av opp til 500 GIA-enheter/ml.

Det fremgår tydelig fra de ovenfor angitte resultater at det er tilveiebragt et hittil ukjent polypeptid og ukjente polypeptidfragmenter som kan anvendes til modulering av cellulær vekst. Forbindelsen har vist seg å utvise forskjellig aktivitet avhengig av den involverte cellelinjes art slik at den kan anvendes alene eller sammen med andre forbindelser til modulering av cellulær vekst. De angitte peptider kan derfor anvendes med blandinger av celler både in vivo og in vitro for selektivt å redusere eller øke cellulær formering av en særlig type celler.

I særdeleshet kan faktoren anvendes for å behandle celler med henblikk på autolog benmargtransplantasjon. Anvendelse av faktoren inhiberer veksten av tumorceller i margen og kan stimulere kolonicelledannelse. Oncostatin M kan også anvendes for å stimulere veksten av epitelceller og dermed fremme sårlegning. Dessuten kan det intakte polypeptid eller fragmenter derav anvendes som immunogener for fremkallelse av antistoff dannelse. De dannede antistoffer kan anvendes til styrke-bestemmelse av Oncostatin M som er til stede i en kroppsvæske, eller for å modulere aktiviteten av faktoren ved å bindes der-til. Enn videre kan disse antistoffer sammen med renset Oncostatin M eller fragmenter derav, anvendes som bestanddeler

i et diagnostisk sett sammen med andre reagenser, i særdeleshet antistoffer, for påvisning og mengdebestemmelse av Oncostatin M.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et cellevekstregulerende polypeptid som er i stand til å inhibere proliferasjonen av neoplastiske celler og stimulerer proliferasjonen av normale, humane fibroblastceller, som ikke inhiberer humane, proliferative og cytotoksiske T-cellereaksjoner, ikke inhiberer granulocyttisk/myelocyttisk benmargscellekolonidannelse, har en molekylvekt i intervallet fra 17 til 19 kD ifølge bestemmelse ved gelutelukkelseskroma-tografi og 28 kD ifølge bestemmelse ved SDS-PAGE, og er relativt ufølsomt overfor moderat sure og basiske betingelser og stabilt ved en temperatur på 56°C, og omfatter minst én aminosyresekvens som høyst avviker med tre aminosyrer, og fortrinnsvis med ikke mer enn én aminosyre fra én av følgende sekvenser: karakterisert ved at man isolerer leukocytter fra et pattedyr, hvilke leukocytter er valgt fra gruppen omfattende histocyttiske lymfomaceller og normale, humane, perifere blodlymfocytter, aktiverer leukocyttene med et induserende middel valgt fra gruppen omfattende ingenoler og forboler, når leukocyttene er valgt blant histocyttiske lymfomaceller, eller mitogener, når leukocyttene er valgt blant normale, humane, perifere blodlymfocytter, og fra de aktiverte leukocytter som er fri for cellulært materiale, isolerer det cellevekstregulerende polypeptid i en renhet som tilveiebringer en spesifikk aktivitet på minst 10 GIA-enheter/ng protein og fortrinnsvis minst 100 GIA-renheter/ng protein.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man utvelger U937-celler som histocyttiske lymfomaceller.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1-2, karakterisert ved at man utvelger 12-0-tetra-decanoylforbol-13-acetat som forbol.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man utvelger fytohemagglutinin-P som mitogen.