HU210694B - Method for production of new cell growth regulatory factor - Google Patents

Description

A találmány új, sejtnövekedést szabályozó faktorra, ennek fragmentumára és ezek előállítására vonatkozik.

Ismeretes, hogy a leukociták - mind a limfociták, mind a monociták - számos állati tumor-modellen daganatnövekedést gátló hatást mutatnak. Az immunszempontból veszélyeztetett embereken egyre növekvő számban észlelhető malignus megbetegedésekből arra következtethetünk, hogy a fehérvérsejtek szerepet játszanak a daganatnövekedés szabályzásában. Számos olyan, a fehérvérsejtek által termelt fehérjetermészetű faktort izoláltak már, amelyek a daganatnövekedést gátolják vagy az immunrendszer működését modulálják. Ilyenek például az a- és γ-interferon, a tumor nekrózis faktor, a limfotoxin, az interleukin-2 és más limfokinek. Minthogy az eddig izolált faktorok hatásspektruma különböző és mert más faktorokkal különböző kölcsönhatásokat mutatnak, az erőfeszítések tovább folynak az immunműködést és a sejtnövekedést szabályozó valamennyi, a fehérvérsejtek által termelt faktorok izolálása és jellemzése irányában. Ezek a vegyületek egyenként vagy együttesen a rák kezelésére vagy diagnosztizálására, sebek gyógyulásának elősegítésére, immunhiányos és autoimmun betegek gyógyítására, szervátültetések és hasonlók esetében alkalmazhatók.

A természetben előforduló faktorok esetében azok felfedezésekor, izolálásakor, tisztításuk és jellemzésük fázisában számos problémát kell megoldani. Módszert kell kifejleszteni a nyers kiindulási anyagból a kérdéses faktornak más faktorok mellől való kinyerésére és tisztítására, éspedig olyan módszert, amellyel a kívánt faktor denaturálódás, hatáscsökkenés nélkül izolálható; a kérdéses faktort a szeparálás során az adott faktorra nézve egyre töményebb frakciókban kell azonosítani, amelyhez megfelelő biológiai vizsgálati módszert kell kidolgozni; az új faktort meg kell tudni különböztetni a már ismert és esetleg további nem ismert olyan faktoroktól, amelyek az új faktor aktivitását akár pozitív, akár negatív irányban befolyásolhatják. A tisztított faktort megfelelő mennyiségben és koncentrált állapotban kell előállítani, hogy azonosítása és jellegzetességeinek megállapítása lehetséges legyen. Tehát, minél nagyobb a már izolált faktorok száma, annál nehezebb egy új faktort azonosítani, szerepének és működésének tisztázását megnehezíti ugyanis a számos egyéb faktor jelenléte.

Beái és munkatársai [Cancer Biochem. Biophys., 3., 93-96. (1979)] az emberi vizeletben olyan pepiidet találtak, amely a transzformált sejtek növekedését és DNSszintézisét nagyobb mértékben gátolja, mint a normális sejtekét. Holley és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 77., 5989-5992. (1980)] epiteliális sejtek növekedését gátló anyag tisztítását ismertették. Letansky [Biosci. Rep., 2., 39-45. (1982)] boíjú méhlepényből olyan peptideket állított elő tisztított állapotban, amelyek a daganatnövekedést gátolják, s amelyek a timidinnek DNS-be történő beépülését neoplazmás sejtek esetében erőteljesebben gátolják, mint normális sejtekben. Chen [Trends Biochem. Sci., 7., 364-365. (1982)] hasüregi folyadékból olyan pepiidet izolált, amely a rákos megbetegedésre nézve szupresszív hatású. Redding és Schally [Proc. Natl. Acad. Sci., 79., 7014-7018. (1982)] disznó hypothalamusból számos normális és tumor sejtvonallal szemben antimitogén hatást mutató pepiidet izolált és tisztított. Sone és munkatársai [Gann, 75., 920-928. (1984)] humán makrofágok által termelt faktor(ok) izolálását ismertetik, amely(ek) bizonyos tumor sejtek növekedését in vitro gátolták. Ransom és munkatársai [Cancer Rés., 45., 851-862. (1985)] egy leukoregulinnak nevezett faktor izolálásáról számolnak be, amely bizonyos daganatsejtvonalak replikációját gátolja. A faktor nem azonos a limfotoxinnal, interferonnal, sem az interleukin 1 vagy 2-vel. E faktorok többségének sem az összes tulajdonságait, sem a pontos szerkezetét nem ismerjük.

Aggarwal és munkatársai [J. Bioi. Chem., 259., 686-691. (1984)] egy limfoblaszt-típusú sejtvonal termékeként tisztán izolálták és jellemezték az emberi limfotoxint (LT), majd megállapították szekvenciáját [J. Bioi. Chem., 260., 2334., (1985)]. Alimfoid sejtek által termelt gamma interferon (γ—IF), amely immunmodulátor és daganatnövekedést gátló hatású, klónozási és expressziós vizsgálatát Gray és munkatársai végezték [Natúré, 295., 503-508. (1982)]. A több tumorfajta növekedését gátló tumor nekrózis faktort (TNF) makrofágok és bizonyos leukémia sejtvonalak termelik. Jellemzését, a TNF-eredetö cDNS klónozását és E. coliban történő kifejeződését Pennica és munkatársai [Natúré, 312., 724. (1984)] ismertetik.

A jelen találmány leukocita-eredetű új peptidfaktorra és ennek biológiailag aktív fragmentumaira vonatkozik. Az új faktor a sejtnövekedést szabályozza, így például a daganatsejtek növekedését gátolja, a normális fíbroblasztok növekedését stimulálja és az immunrendszer működését modulálhatja. A faktor aminosav-sorrendje jól megkülönböztethető eltéréseket mutat az analóg sajátságokkal rendelkező egyéb vegyületek szekvenciáihoz képest.

Zarling és munkatársai (1986) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83., 9739-9743. és Brown és munkatársai (1987), J. Immunoi., 139., 2977-2983. ismertetik, hogy mononukleáris sejtek által termelt faktorok, melyek közvetlenül gátolják a tumorsejt-osztódást és/vagy fokozzák a T-sejt immunválaszt vagy természetes killersejt és makrofág-aktivitást tumorokkal szemben, már korábban ismertek voltak. Ilyenek az interferonok, tumor nekrózis faktor, limfotoxin, B-típusú transzformáló növekedési faktor, interleukin 1 és 2, leukoregulin és mások. Az Oncostatin-M bizonyos fenti hatásokkal rendelkezik, ezért hasonlítottuk a fenti, ismert faktorokhoz. Azonban az aminosav-szekvencia, biológiai hatás és más fizikai jellemzők alapján megállapítottuk, hogy az Oncostatin-M új anyag. Az

1. ábra a találmány szerinti Onkosztatin-M polipeptid fragmentumok aminosav-szekvenciáit mutatja. A

2. ábrán Oncostatin-M-mel kezelt sejtekről készült mikroszkópos felvétel-sorozat látható. Az A-C felvételek 0, 5 és 100 GIA-egységgel (growth inhibitory activity = növekedés gátló hatás) kezelt A375 melanoma sejteket, a D-F felvételek 0, 5 és 100 GIA-egységgel kezelt WI38 fibroblasztokat ábrázolnak. A

HU 210 694 Β

3. ábra az Oncostatin-M SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel végzett elemzéséről készült felvételt mutatja.

Az Oncostatin-M aminosav részletes szekvenciáját és annak fragmenseit az 1. ábra ismerteti. Ez az elsőbbség időpontjában még ismeretlen volt, és azt csak később határoztuk meg, amikor már az Oncostatin-M-t rekombináns prokarióta és eukarióta gazdasejtekkel kifejeztük.

Az Oncostatin-M-t kódoló DNS szekvenciát és annak teljes aminosav-szekvenciáját a Mól. Cell. Bio., 9., 2847-2853. (1989) cikke ismerteti. Az 1. ábrán szereplő specifikus ffagmensek a 26-60., 115-135. és 70-89. aminosavaknak felelnek meg. Úgy találtuk, hogy az eredeti automatikus szekvencia-analízissel végzett meghatározás eredménye eltér a DNS szekvencia által meghatározottól, a 85., 86. és 88. helyzetekben.

A találmány új polipeptidre és polipeptid kompozícióra, a polipeptid fragmentumaira és mutációs változataira, továbbá ezek előállítására és alkalmazására vonatkozik. A találmány szerinti kompozíció sejtnövekedést szabályozó hatású, s főként a tumorsejtek növekedését gátolja, valamint a normális fibroblasztok növekedését stimulálja. Ez leukocitákból állítható elő, például stimulált normális emberi perifériás vér-eredetű limfociták (PBL) vagy stimulált U937 sejtek (ATCC CRL 1593) sejtek megfelelően előkészített tenyészetén. A polipeptid fragmentumai és mutánsai az intakt Oncostatin-M-ével azonos biológiai aktivitással rendelkeznek, azaz mind sejtnövekedést moduláló, mind immunológiai hatást mutatnak.

A találmány szerinti új polipeptid fragmentumok legalább 8 aminosavat tartalmaznak és biológiailag legalább olyan mértékben aktívak, hogy a természetben előforduló Oncostatin-M-mel immunológiai kereszt-reakciót adnak. Az immunológiai kereszt-reakció fogalmán azt értjük, hogy a találmány szerinti új polipeptidek hatására keletkező antitestek az intakt Oncostatin-M-mel reakcióba lépnek, s legkevésbé akkor, ha az Oncostatin-M denaturált állapotban van. E polipeptidek tehát főként arra használhatók, hogy az Oncostatin-M-re specifikus antitestek képződését kiváltsák, amely antitestek segítségével egyrészt meg lehet határozni a testnedvek Oncostatin-M koncentrációját, másrészt azáltal, hogy ezek az Oncostatin-M-hez kötődnek, szabályozni lehet az Oncostatin-M aktivitását, felhasználhatók továbbá affinitás kromatográfiás oszlopban az Oncostatin-M tisztítására. A polipeptidek egy része az intakt Oncostatin-M-re jellemző sejtnövekedést moduláló hatást is megtartja, bár ez, az Oncostatin-M-éhez képest általában csökkent mértékű.

Az Oncostatin-M-mel kereszt-reakciót adó poli(aminosav)ak aminosav-szekvenciáját az 1. ábra mutatja; az első szekvencia az Oncostatin-M N-terminálisát jelöli [(I) képlet],

A találmány szerinti poli(aminosav)ak egy legalább nyolc egymást követő aminosavból álló olyan aminosav-szekvenciát tartalmaznak, amely megfelel egy, az 1. ábrán feltüntetett aminosavsorrendnek és attól 3-nál nem több, rendszerint 1-nél nem több aminosavban eltérhet. A különbség előállhat egy aminosav betoldásától, vagy egynek az elhagyásától, vagy egynek egy másikra történő kicseréléséből rendszerint úgynevezett konzervatív szubsztitúció útján. A poli(aminosav)ak rendszerint legalább 10, előnyösen legalább 12, az ábrán feltüntetett szekvenciának megfelelő egymást követő aminosavat tartalmaznak és 1-nél nem több aminosavban térnek el attól.

A találmány szerinti vegyületekben szereplő aminosavakat az alábbi táblázatban feltüntetett módon csoportosíthatjuk:

alifás neutrális nem polárosG A P V LI polárosS T C Μ N Q savasD E bázikusK R aromásFHYW

Konzervatív szubsztitúció alatt olyan cserét értünk, amikor egy aminosavat azonos csoportba tartozó (tehát például neutrális alifás, savas alifás, bázikus alifás, illetve aromás), és ezen belül is azonos polaritású másik aminosavra cserélünk. Az alifás csoportban kívánt esetben 2-4 szénatomos, vagy 5-6 szénatomos aminosavak definiálnak egy monomer csoportot.

A poli(aminosav)ak hossza nem haladja meg az 1000 aminosavnak megfelelő lánchosszúságot. A lánc általában 100-nál kevesebb, még gyakrabban 50-nél kevesebb aminosavból áll. Tehát a poli(aminosav)ak egyszerűen szintetizálhatok. Ha a poli(aminosav) 100nál több aminosavból épül fel, az vagy az OncostatinM 100 aminosavnál rövidebb fragmentumainak polimerje, vagy valamely fúziós protein, amely egy ilyen fragmentum és egy antigén, enzim, vagy enzim-fragmentum fúziójával képződött. A nagyobb molekulatömegű poli(aminosav)ak főként úgy jönnek létre, hogy legalább egy 100-nál kevesebb aminosavból felépülő polipeptid fragmentum és egy nagyobb immunogén sajátságú hordozó protein kovalensen összekapcsolódik. Ilyen hordozó proteinek például a borjú szérumalbumin, a keyhole limpet típusú hemocianin (KLH) (Sigma Chemical Company) és hasonlók. Az ilyen konjugátumban levő polipeptidek alkalmasak arra, hogy megfelelő gazdaszervezetben antitest-képződést idézzenek elő.

Az U937 sejtvonal (ATCC CLR-1593) egy hisztocita-típusú limfóma sejtvonalból származik [(Sundstrom és Nilsson: Int. J. Cancer, 17., 565-5TJ. (1976)], amely megfelelő indukáló vegyület hatására, és különböző szerekkel történő kezelés után makrofágokra jellemző tulajdonságú sejtekké differenciálódik [Harris és munkatársai: Cancer Rés. 45., 9-13. (1985)]. Oncostatin-M előállítása céljából az U937 sejteket szérumot tartalmazó táptalajon tenyésztjük és alkalmas indukáló hatású vegyülettel kezeljük. Ebből a célból rendszerint valamely forbolt vagy ingenolt, előnyösen 12-0-tetradekanoil-forbol-13-acetátot (TPA) alkalmazunk: leírásukat lásd Hecker, E.: Carcinogenesis - A comprehensive Survey Vol. 2., Mechanisms of Tumor Promotion and Carcinogenesis, Slaga, T. J. és munkatársai, Raven

HU 210 694 B

Press, 1979., 11-48. Az indukáló hatású vegyületet célszerűen 5-20 ng/ml mennyiségben használjuk, az indulási sejtkoncentráció 10⁵—10⁶ sejt/ml. Az aktiválás régóta ismert művelet; ennek részletes leírását adja a Hematology: 3rd Edition (1983) McGraw-Hill Book Company, New York, N. Y. 906. oldala.

A sejteket az indukáló vegyülettel megfelelő ideig, általában 3-6 napig kezeljük, majd a felülúszót eltávolítjuk. A sejteket szérummentes táptalajjal kétszer mossuk, majd a sejteket 12-48 órán át szérummentes táptalajon, például RPMI-1640 táptalajon (Gibco Laboratories, Grand Island, New York) inkubáljuk. A felülúszót összegyűjtjük és a sejtes részt centrifugáljuk. A sejt-mentesített felülúszót sejtnövekedést gátló hatásra (GIÁ) vizsgáljuk. A felülúszó általában 50-500 GIA-egységet tartalmaz ml-ként. A vizsgálat módját és a GIA-egység értelmezését a kísérleti részben adjuk meg.

Az Oncostatin-M mitogénnel stimulált normális emberi perifériás vér-eredetű limfocitákból (PBL) is előállítható. A PBL-t a leukofrakció hígítását követően Ficoll reagens (Pharmacia) [nátrium-3,5-diacetamido2,4,6-(trijód-benzoát)] jelenlétében végzett gradiens centrifugálással különítik el. A határfelületről az összegyűlt sejteket lemossák, rázással sejtlízist idéznek elő, hogy a vörösvérsejtek eltávolíthatók legyenek. A viszszamaradt sejtlizátumot centrifugálják, szérumot és trombint tartalmazó pufferben újra szuszpendálják, összerázzák és a vérlemezke aggregátumot rövid ideig kiülepedni hagyják. A szuszpenzióban maradt sejteket centrifugálással kinyerik, szérumban újra szuszpendálják és nylongyapotot tartalmazó oszlopra viszik. Az oszlopot inkubálják, hogy a monociták és B-limfociták megtapadjanak, majd átmossák. A perifériás vér-eredetű T-limfociták főtömege nem kötődik az oszlophoz és onnan eluálható. A PBL-sejteket 37 °C-on megfelelő tápoldatban, például RPMI-1640 tápoldatban tenyésztik és alkalmas indukálószerrel, például fitohemagglutininnel (körülbelül 1-5 mg/1) kezelik (körülbelül 100 óra), majd a felülúszót elkülönítik, centrifugálják a sejtek eltávolítása céljából, majd ultraszűréssel vagy dialízissel betöményítik.

Az akár az U937 sejtekből, akár a normális PBLekből származó sejtmentes felülúsző elkülönítése után az inkubált tápközeget - rendszerint lyukacsos szálas anyagon vagy ultraszurő membránon - betöményítik, ecetsavval hígítják, míg a közeg ecetsavra nézve 0,1 N lesz, majd betöményítik körülbelül tizedére, és a hígítást, majd betöményítést megismétlik. A koncentrátumot liofilizálják, és a liofilizált anyagot közvetlenül vagy további tisztítás után használják fel.

A találmány szerinti Oncostatin-M-et gél-kromatográfiás módszerrel tisztítjuk. A kromatografálást Biosil TSK-250 adszorbensen (Bio-Rad Laboratories) végezzük, a mozgó fázis (izokratikus) 40% acetonitrilt és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vizes oldat. Az egyes frakciók aktivitását megmérjük; a célvegyületet a körülbelül 0,5-5x10* GIA-egység/ml aktivitású frakciók tartalmazzák.

A gél-kromatográfiás módszerrel előtisztított terméket ezután fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás módszenei tovább tisztíthatjuk lineáris gradiens-elúciót alkalmazva. Az első oldószer 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav, a második 0,1%-os acetonitriles trifluor-ecetsav. Az elúció folyamán a két oldószer aránya változhat. A kromatografálás időigénye általában 3-4 óra, és az idő nagy részében, az idő több mint 50%-ában, de nem több mint 80%-ában a második oldószer 30-45%-át teszi ki az eluensnek. Ilyen körülmények között az aktív frakciók 41-42% acetonitriltartalomnál eluálódnak az oszlopról.

Az egyesített aktív frakciókat ismételt fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tovább tisztíthatjuk oly módon, hogy a gradienst gyorsabban változtatjuk és az előzőnél lassúbb áramlási sebességgel végezzük az elúciót. Ez esetben az aktív frakciók a 40,5-41,5%-os acetonitril tartalmú eluenssel oldódnak le az oszlopról.

A fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatografálást még egyszer ismételhetjük; ez esetben a második oldószer 0,1% trifluor-ecetsav-n-propanol. Az elúciót lineáris gradienssel végezzük és a gradienst 23-35% n-propanol tartalomnál lassan változtatjuk. Az aktív frakciók 25,5-27,5% propanol tartalomnál eluálódnak és a termék lényegében homogén 10 GIA-egység/ng fehérje fölötti fajlagos aktivitással. A termék tisztítását rendszerint mindaddig folytatjuk, míg fajlagos aktivitása legalább 100 GIA-egység/ng, előnyösen 150 GIA-egység/ng.

A találmány szerinti vegyületek molekulatömegét méret kizárásos kromatográfiás módszerrel 17 és 19 kilodalton (kD) közötti, főként 18 kD körüli értéknek találtuk. A találmány szerinti vegyületek látszólagos molekulatömegét poliakrilamid-gélelektroforézissel redukáló és nem redukáló körülmények között meghatározva közelítőleg 28 kD értéket kaptunk.

A tisztított Oncostatin-M fragmentumainak aminosav-sorrendjét elemeztük. Az aminosav-szekvenciákat az 1. ábra mutatja. Az ábrán bemutatott első szekvencia az Oncostatin-M N-terminális fragmentumát, a többi a polipeptidlánc belsejében elhelyezkedő fragmentumokat reprezentálja.

Az izolált Oncostatin-M aktív preparátumai magas mannóz és komplex N-hez kapcsolódó oligoszacharid tartalmú keveréket tartalmaznak. A nem glikozilezett Oncostatin-M preparátumok is megtartják azonban sejtnövekedést moduláló hatásukat.

Az Oncostatin-M-et néhány sejttörzzsel szembeni aktivitásra is vizsgáltuk. A találmány szerinti polipeptid a WI26 és WI38 emberi fibrolasztokkal, a tumor nekrózis faktorra érzékeny egér L929 sejtekkel és az emberi daganatsejtvonalakra érzékeny γ-interferonnal szemben nem mutatott citotoxikus hatást. Sem a normális emberi Tlimfociták proliferációját, sem a csontvelő sejtjeiből származó granulociták telepformálását nem gátolta 100 GIA egység/ml koncentrációig. Ezen túlmenően, az Oncostatin-M stimulálja a normális emberi fibroblasztok, így például a WI38 és WI26 sejtek proliferációját, gátolja az egyes tumorsejtek, így például az A375, a HBT10, az A549 és SK-MEL28 sejtek szaporodását és javíthatja a normális csontvelőből származó telepképző sejtek növe4

HU 210 694 B kedését. Az Oncostatin-M 500 GIA egység/ml koncentrációig nem nyomja el az emberi proliferatíve vagy citotoxikus T-sejtes immunválaszokat kevert leukocita tenyészetben [mixed leukocyte culture (MLC)] végbemenő reakciókban.

A találmány szerinti polipeptid mérsékelten savas és bázikus közegben, valamint 56 °C-on végzett hőkezeléskor is stabilis.

A találmány szerinti polipeptid aminosavsorrendje a forgalomban lévő szekvencia-meghatározókkal teljesen meghatározható, majd ezután önmagában ismert módszerekkel szintetizálható, például forgalomban lévő automatikus szintetizáló berendezés segítségével.

Alternatív megoldásként a találmány szerinti polipeptidet rekombináns DNS-technikával is előállíthatjuk. Egy aminosav szekvencia részletből visszakövetkeztethetünk egy adott minta szerkezetére, amely azután valamely emberi genom szerkezetének szkrinelézéséhez felhasználható. A vizsgált szerkezet lehet komplementes DNS-szerkezet vagy kromoszómaszerelvény. Ha sikerült az adott mintával komplementaritást mutató (illetve kapcsolódni képes) kiónt vagy kiónokat azonosítani, a kérdéses gént tartalmazó fragmentumot többféleképpen is identifikálhatjuk és manipulálhatjuk. Például egy fragmentumot a restrikciós endonukleáz segítségével hasíthatunk és a kapott fragmentum-részletet klónozhatjuk és megvizsgálhatjuk, tartalmazza-e a keresett gént. Az olyan sejteket, amelyek a kívánt pepiidet termelik, illetve nagyobb menynyiségben termelik, felhasználhatjuk messenger RNS előállítására. A kapott messenger RNS-ből egyszálú komplementes DNS-t állíthatunk elő, amelyet ezután egy olyan sejttől származó teljes RNS-hez kapcsolunk (annealing), amely sejt nem, vagy csak alig termeli a kérdéses polipeptidet. A nem kapcsolódott komplementer DNS-t ezután izolálhatjuk és kettős szálú komplementer DNS-sé alakíthatjuk, amelyet azután az adott mintával szkrinelhetünk.

Egy másik lehetőség, hogy a DNS fragmentumokat Xgtll-be építjük be. A betoldás történhet oly módon, hogy a kódoló fragmentum a β-galaktozidáz-gén vázába, vagy ettől lefele épül be. Az Oncostatin-M-re specifikus antitesteket termeltethetünk és a toldás után kapott fúziós proteint az antitestekkel szemben keresztreakció szempontjából vizsgálhatjuk. Ezzel a módszerrel a találmány szerinti polipeptidet vagy fragmentumát kódoló fragmenseket azonosíthatjuk és a keresett gén identifikálásához felhasználhatjuk.

A teljes gén (akár komplementes DNS, akár kromoszomális DNS-jellegű) azonosítása után kerülhet sor annak expresszió céljából történő manipulálására valamely ismert módon. Ha a gén kifejeződésére olyan gazdaszervezetet alkalmazunk, amely felismeri az Oncostatin-M vad-típusú transzkripciós és transzlációs régióit, a teljes gént - annak vad-típusú 5'- és 3'-helyzetű szabályzó szekvenciáival együtt - beépíthetjük az alkalmas expressziós vektorba. Többféle különböző olyan expressziós vektor is ismeretes, amelyek emlősök vírusainak replikációs rendszerként szolgálnak; így például a majomvírus 40, az adenovírus, a borjú papilloma vírus, a vakciniavfrus, a rovar baculovírus stb. Ezeket a replikációs rendszereket egyrészt azért fejlesztették ki, hogy a transzfekció után kapott objektumok szelekciójához markerként szolgáljanak, másrészt azért, hogy alkalmas restrikciós helyeikkel lehetővé tegyék a gének beépítését.

Ha a gén kifejeződésére olyan gazdaszervezetet alkalmazunk, amely a természetes előfordulású vad-típusú transzkripciós és transzlációs szabályzó régiókat nem ismeri fel, akkor további manipulációra van szükség. Többféle 3'-helyzetü transzkripciós szabályzó régió ismeretes, s ezek a stop-kodonoktól lefelé alkalmas módon beépíthetők. A struktúrgéntől felfelé elhelyezkedő, nem kódoló, 5'-helyzetű régió például endonukleáz hasítással, így Bal3l restrikcióval, vagy egyéb módon távolítható el. Alternatív megoldás lehet, hogy ha a struktúrgén 5'-terminálisához közel egy alkalmas hasító hely található, akkor a struktúrgén is hasítható, majd a struktúrgént és a promotert egy, a struktúrgén elvesztett nukleotidjai pótlására szolgáló úgynevezett adapterrel kapcsoljuk össze. Az expressziós rendszer kialakítása többféle stratégiával is lehetséges. Egy ilyen rendszer a transzkripció 5'-, 3'-irányban transzkripciós és transzlációs iniciációs régiót és adott esetben a szabályzás elindulását lehetővé tevő szabályzó szekvenciákat tartalmazhat; tartalmazhatja továbbá az iniciációs régió transzkripciós és transzlációs szabályzása alatt álló struktúrgént, továbbá a transzkripció és transzláció leállításáért felelős terminátor régiót.

A transzkripciós iniciátor régiók vagy promoterek példái baktérium esetében a β-gal promoter, a TAC promoter, a lambda bal- és jobb-promoter stb.; élesztők esetében a glikolitikus enzim promoterek, mint amilyenek az ADH-I és -II promoterek, a GPK-promoter és a PGI-promoter, továbbá a TRP-promoter stb.; emlős sejtek esetében az SV40 korai és késői promoter, az adenovírus főbb késői promoterei stb. Mint már említettük, az expressziós rendszer beépíthető megfelelő sejtekkel rendelkező gazdaszervezet replikációs rendszerébe (episzomális fenntartás), vagy fenntartható replikációs rendszer nélkül is a gazdaszervezet genomjába integráltan. A DNS önmagában ismert módszerekkel juttatható be a gazdaszervezetbe, így például transzformáció útján (kalcium-foszfáttal kicsapott DNS alkalmazásával), transzfekció útján (a vírus és a sejtek érintkeztetésével), a DNS-nek mikroinjektálással a sejtbe juttatásával, vagy hasonló módszerekkel.

A struktúrgénnek a gazdasejtbe való bevitele után a gazdasejteket tenyésztjük, miközben azokban a struktúrgén kifejeződik (termelődik). Bizonyos esetben szignál szekvenciát kell beépíteni a struktúrgéntől fölfelé, vagy annak kódoló szakaszába, ahhoz hogy a struktúrgén termelődjék és hogy a jelzőszekvencia lehasadjon, azaz, hogy érett polipeptid kerüljön a felülúszóba. Ha a struktúrgén kiválasztódásról nem kell ilyen módon gondoskodni, akkor a gazdasejtek önmagában ismert módon végzett lízise után izolálhatjuk a kívánt terméket, majd azt ismert módon, például kromatográfiás, extrakciós, elektroforetikus vagy más hasonló módszerrel tisztítjuk.

HU 210 694 Β

A találmány szerinti vegyületeket többféleképpen akár in vivő, akár in vitro alkalmazhatjuk. A találmány szerinti vegyületeket felhasználhatjuk az e vegyületekre specifikus antitestek termeltetésére, amely antitesteket akár in vivő, akár in vitro alkalmazhatunk. Az antitesteket önmagában ismert módon, vagy például úgy állíthatjuk elő, hogy a találmány szerinti polipeptiddel, mint immunogén anyaggal, valamely emlős gazdaszervezetet (például egeret, tehenet, kecskét, birkát, nyulat stb.) oltunk be. A polipeptidet célszerűen valamely adjuvánssal, előnyösen teljes Freund-adjuvánssal, alumínium-hidroxid-géllel vagy hasonlóval együtt alkalmazzuk. Ezután a gazdaállattól vett vérből poliklonális antitesteket izolálunk, illetve egér esetében perifériás vér-eredetű limfocitákat vagy lép-eredetű limfocitákat (B-sejtek) nyerünk, majd ezeket alkalmas mieloma sejtekkel fuzionáljuk, ily módon megőrizve a kromoszómákat, amelyek a találmány szerinti vegyületekre specifikus antitestek monoklonális kifejeződését teszik lehetővé.

A kapott poliklonális, illetve monoklonális antitesteket diagnosztikai célra alkalmazhatjuk, illetve a találmány szerinti polipeptidek különböző mintákban (például sejtekben, fiziológiai folyadékokban, főként vérben) való kimutatására használhatjuk. Az antitesteket a találmány szerinti polipeptidek affinitás-kromatográfiával történő tisztítására, továbbá a polipeptidek természetes vagy szintetikus miliőből való izolálására is használhatjuk. Ezenkívül az in vivő, vagy a sejttenyészetben lévő sejtekhez kötődő találmány szerinti polipeptidek menynyiségének szabályozására, s ezáltal a sejtnövekedés módosítására is felhasználhatjuk az antitesteket.

A találmány szerinti vegyületek ligandumként is alkalmazhatók a találmány szerinti vegyületre specifikus receptorok jelenlétének kimutatására. Ily módon a találmány szerinti vegyületekre specifikus receptorok sűrűsége és jelenléte alapján a sejtek megkülönböztethetők, illetve követni lehet a különböző vegyületek hatását az ilyen receptorok jelenlétére.

A találmány szerinti vegyületek segítségével in vitro sejttenyészetekben vagy sejtvonalakban a találmány szerinti polipeptidre érzékeny sejtek a többi sejttől megkülönböztethetők. Tehát heterogén sejtkeverékek és sejtvonalak elválaszthatók a találmány szerinti polipeptidre érzékeny nemkívánatos sejtektől. A találmány szerinti polipeptidet neoplazmás állapotok esetén in vivő alkalmazzuk, például a kórosan elváltozott részbe adva az injekciót, vagy intraperitoneálisan vagy szubkután, vagy más hasonló módon juttatjuk azt a szervezetbe. A találmány szerinti vegyületet in vitro alkalmazhatjuk például az átültetni kívánt autológ csontvelő esetében malignus sejtek eltávolítása céljából, továbbá egyéb szövetek, például vér esetében a proliferáció gátlására, illetve a malignus sejtek eltávolítására a vérátömlesztést megelőzően.

A találmány szerinti polipeptid gyógyászati eljárásban alkalmazható, például sebek, így például bőrön, szaruhártyán vagy egyéb epiteliális részen lévő sebek kezelésére, továbbá például krónikus fekélyek, égések, sebészeti bemetszések, baleset okozta sebek, az üreges, epiteliummal bontott szervek (például nyelőcső, gyomor, vékony- és vastagbelek, száj, genitális szervek és a húgyvezeték) sérülései kezelésére. A gyógyászati eljárás Oncostatin-M hatóanyagot és gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot tartalmazó készítmény lokális alkalmazásán alapul.

A találmány szerinti gyógyászati készítményt igen sokféle seb, így gyakorlatilag az összes bőrön előfordulható sebek, szaruhártya sérülések, valamint az üreges, epiteliummal bontott szervek sérülései kezelésére használhatjuk. A kezelhető sebek lehetnek traumás eredetűek (például égés, horzsolás, vágás és hasonlók), vagy sebészeti beavatkozástól származók (sebészeti metszés, bőrátültetés). Egyéb, a készítménnyel kezelhető állapotok lehetnek krónikus elváltozások (például krónikus vagy diabetikus fekélyek) és egyéb nem gyógyuló elváltozások.

Az Oncostatin-M hatóanyagot gyógyászatilag elfogadható vivőanyagba keverten lokálisan, az elváltozás helyén alkalmazhatjuk. A vivőanyagok fajtája - az alkalmazási helytől függően - sokféle lehet. így a bőrön való alkalmazás esetén, a vivőanyag előnyösen valamely krém- vagy kenőcsalap, így például lanolin, Silvadene (gyártó: Marion; főként égési sebek kezelésére), Aquaphor (gyártó: Duke Laboratories) és hasonlók. Kívánt esetben az Oncostatin-M tartalmú készítményt steril pólyába vagy egyéb sebkötöző anyagba is inkorporálhatjuk, miáltal a seb a pepiiddel folyamatos érintkezésben van. A készítmény aeroszol formájában is alkalmazható.

A kezelésre használt készítmény polipeptid-koncentrációja nem kritikus; a polipeptidnek azonban olyan mennyiségben kell jelen lennie, amely elegendő a sejt-proliferáció megindításához. A készítményt a sérült felületen lokálisan alkalmazzuk, szemsérülés esetén szemcsepp, bőrsérülés esetén krém, kenőcs, borogatóvíz formájában. Szemkezelés esetén 4 óránként vagy ennél rövidebb időközökkel tanácsos a készítményt alkalmazni. Bőrkezelés esetén a sérült felületen kívánatos a készítményt folyamatosan rajta tartani a gyógyulás folyamán, oly módon, hogy a készítményt naponta 2-4-szer, vagy gyakrabban visszük fel a sérült felületre.

A találmány szerinti polipeptidből beadott mennyiség a beadás módjától és az alkalmazott egyéb hatásos vegyületek mennyiségétől függően változhat; rendszerint azonban 1-100 gg mennyiségben alkalmazzuk. A találmány szerinti polipeptidet gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal, így sóoldattal vagy foszfáttal pufferolt sóoldattal vagy hasonlóval összekeverten alkalmazzuk. A vegyületből alkalmazandó mennyiséget kísérletileg, in vitro sejt-reakciók vagy a kísérleti állatokon nyert adatok birtokában határozzuk meg. A találmány szerinti vegyületeket önmagukban, vagy más növekedési faktorokkal, vagy inhibitorokkal, vagy immunmodulátorokkal (így például TNF, IL-2, γ-interferon, monoklonális antitestek stb.) kombinációban használhatjuk. Ezek az egyéb vegyületek rendszerint 1100 gg mennyiségben alkalmazhatók. A találmány szerinti vegyületek és kapcsolódási helyet meghatározó

HU 210 694 Β egyéb vegyületek (például antitestek) konjugátumait is előállíthatjuk, ha az antitestek az adott malignus sejtre vagy szervre specifikusak.

A találmányt közelebbről a következő példákkal szemléltetjük anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk.

Kísérleti rész

Anyagok és módszerek

1. példa

U937 sejtekből izolált Oncostatin-M

a) Daganatsejt növekedést gátló vegyület előállítása hisztocita limfóma sejtvonal tenyésztésével.

U937 sejteket - amelyek hisztocita limfóma sejtvonalból származnak [Sundstrom és Nilsson: Int. J. Cancer, 17., 565-577. (1976)]. 850 ml-es himbált lombikokban (Corning C2540) tenyésztünk. A tenyésztést 4X10⁵ sejt/ml koncentrációjú tápoldatban végezzük, amely 300 ml RPMI1640 táptalajt, 10% borjúembrió szérumot (FCS), penicillin/sztreptomicin (PS) adalékot, L-glutamint és 10 ng/ml 12-0-tetradekanoil-forbol-13-acetátot (TPA) tartalmaz. 4 nap elteltével az FCS és TPA-tartalmú felülúszót eltávolítjuk, a himbált palackok tartalmát ötször szérummentes RPMI 1640 tápoldattal mossuk, a különvált sejteket (lxlO⁵ sejt/ml) háromszor szérummentes tápoldattal mossuk és a lombikba visszajuttatjuk; ily módon az egyes lombikok 125 ml szérummentes RPMI 1640 tápoldatot tartalmaznak. Egy nappal később a felülúszókat egyesítjük, a sejteket centrifugálással eltávolítjuk, 0,45 μ-os Nalgen szűrőn átszűrjük, és laza szálas anyagon (ΗΙΡ10-20 Amicon szűrőbetét) 150 ml-re töményítjük be (eredeti térfogat 1500 ml). Ugyancsak Oncostatin-M-et izoláltunk a szérummentes TPA-val kezelt U937 sejtek 150 ml-es tenyésztőedényekből nyert felülúszóiból. a felülúszót ΡΜ-10-es Amicon Dialfo membránon betöményítettük, a 10 kD-os frakciót dializáltuk. A dialízis után a koncentrátumot ecetsavval hígítottuk (ecetsavra nézve 0,1 N koncentrációjú 500 ml oldat), majd PM 10-es Amicon filteren 50 ml-re betöményítjük. A koncentrátumot 0,1 M ecetsavval 400 ml-re hígítjuk, majd ugyanazon a filteren 40 ml-re betöményítjük. A maradékot 1N ecetsavval hígítjuk, a kivált csapadékot centrifugálással eltávolítjuk és a kapott koncentrátumot liofilizáljuk. A liofilizált anyagot használjuk fel a következő tisztítási lépésekben.

b) Gélkromatogáfia

600x21,5 mm-es Bio-sil TSK-250 töltetű kolonnát (Bio-Rad Laboratories) nagynyomású folyadékkromatográfhoz kapcsolunk. A nyers frakciót (10 mg/ml) 40% acetonitrilt tartalmazó 0,1%-os vizes trifluor-ecetsavban (0,1% TFA) oldjuk. Az oldatból 2 ml alikvot részt a kromatográfra injektálunk, és az elúciót izokratikus körülmények között 40% acetonitrilt tartalmazó 0,1%-os TFA mozgó fázissal végezzük. Az áramlási sebesség 2,5 ml/perc, a regisztráló papír sebessége 0,25 cm/perc. A kromatografálást szobahőmérsékleten folytatjuk le és 5 ml-es frakciókat szedünk. Minden frakcióból egy alikvot részt bepárolunk és A375 sejteken háromszoros parallelben mérjük a sejtnövekedést gátló hatást (GIA).

Hat kromatografálási menet aktív frakcióit (21. és

22. frakciók) egyesítjük; ezek összaktivitása körülbelül 4,8xl0⁵ GIA-egység. A növekedésszabályozó fraktor látszólagos molekulatömege méret kizárásos kromatografálással (Bio-Sil TSK-250-es oszlop) 18 kD-nak bizonyult.

c) A TSK-250-es frakciók fordított fázisú nagynyomásúfolyadékkromatográfiás tisztítása (HPLC)

Az előzőek szerint kapott, összegyűjtött TSK-25-es frakciókat (21. és 22. frakció) 0,1%-os TFA-val kétszeres térfogatúra hígítjuk. Az elegyet izokratikusan 7,8x300 mm-es μ-Bondapak-ClS (Waters Co.) oszlopra (a továbbiakban: C18¹) injektáljuk szobahőmérsékleten. Az áramlási sebesség 2,0 ml/perc, a papírsebesség 0,25 cm/perc. Az elúciót lineáris gradienssel végezzük. Az első oldószer 0,1%-os TFA, a második acetonitriles 0,1%-os TFA. A gradiens 0-30% 20 percig; majd 3045% 150 percig; 45-55% 20 percig; és 55-100% 10 percig. Az alkalmazott oldószerek HPLC-hez megfelelő tisztaságúak voltak. A kromatografálás során 4 ml-es frakciókat szedtünk, és minden frakcióból egy-egy alikvot részt növekedésgátló hatásra megvizsgáltunk. A 7275. frakciók tartalmazzák a hatásos vegyület főtömegét; ezek 41 = 52% acetonitril tartalomnál eluálódtak.

A 72-75. frakciókat egyesítettük és 16 ml 0,1%-os TFA-t adtunk hozzá. Az elegyet 3,9x300 mm-es μBondapak-C 18-as oszlopra (a továbbiakban Cl8²) injektáltuk szobahőmérsékleten. Az áramlási sebesség 1 ml/perc, a papírsebesség 0,25 cm/perc volt. Az elúciós gradiens 0-35% 10 percig; 35-45% 100 percig és 45-100% 10 percig. Az egyes frakciók alikvot részét növekedésgátló hatásra megvizsgáltuk. Az aktív vegyület főtömege 40,7-41,3/ acetonitril tartalomnál eluálódott (retenciós idő: 83-86 perc).

Az aktív vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, 0,1%-os TFA-val kétszeres térfogatúra hígítjuk, majd szobahőmérsékleten, izokratikus körülmények között 3,9x300 mm-es μ-Bondapak-ClS oszlopra (a továbbiakban: C18³) injektáljuk. Az áramlási sebesség 1 ml/perc, a papírsebesség 0,25 cm/perc. Az első oldószer (0,1%-os TFA) és a második oldószer (n-propanol és 0,1%-os TFA) között lineáris gradiens volt. Az alkalmazott gradiens 023% 20 percig és 23-35% 120 percig. Az egyes frakciók alikvot részeit növekedésgátló hatásra vizsgáltuk. Az aktív vegyület főtömege 25-26,5% propanoltartalomnál eluálódik (retenciós idő: 59 perc). Ez, a már homogénnek tekinthető frakció körülbelül 300 ng proteint tartalmazott, és aktivitása körülbelül 40 000 GIA egység.

d) Sejtnövekedést moduláló hatás vizsgálata DNSbe beépített H³-timidin alkalmazásával (GIA)

A vizsgálatot 96 laposfenekű mélyedéssel ellátott tálcákban (Costar 3596) végeztük. Érzékeny indikátor sejtvonalként A375 humán mielóma sejteket használtunk. 3X1O³ sejtet 0,1 ml Dulbecco szerint módosított Eagles-oldatban - amely oldathoz 10% FCS és PS adalékot adtunk - tettünk minden mélyedésbe. 3 óra

HU 210 694 Β elteltével az egyes mélyedésekbe 0,1 ml teszt-oldatot adtunk és a tálakat 3 napig 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubációs periódus utolsó 6 órájára 27 J-lCi/pg fajlagos aktivitású 0,025 ml (0,5 gCi) ³H-timidin oldatot adtunk az egyes mélyedésekbe. Ezután egy, a sokmély edésö edényekhez adaptálható sejt-összeszedő (PHD cell Harvester, Cambridge Technology Inc.) segítségével a sejteket üvegszűrócsíkokra vittük át, majd a szűrőket szcintillációs üvegcsékbe tettük, majd az üvegcsékhez - a számlálás megkezdése előtt - 2 ml szcintillációs folyadékot adtunk (Scienti Vorse II, Fischer Scientific Co.), s ezt követően a ³H-timidin beépülés mértékét szcintillációs számlálóban meghatároztuk.

e) A telepformálódás gátlásának vizsgálata lágy agaron (TG1) mélyedéses Costar szövettenyésztő tálca mélyedéseibe 10% boíjúembriószérumot (FCS) tartalmazó és 0,5% agart (Agár Nobb, Difco Laboratories, Detroit, Michigan) tartalmazó DNEM oldatból 0,5 ml-es alapréteget teszünk. Az alaprétegre 0,3% agart tartalmazó azonos tápoldat-FCS keverékből 0,5 ml-t, valamint 1-2,5x1ο³ A375 sejtet, továbbá a tesztelni kívánt faktor különböző koncentrációit rétegezzük. A tálcákat 5% széndioxidot tartalmazó nedvesített levegő atmoszférában 37 °C-on inkubáljuk és 7 nap elteltével újabb 0,5 ml 0,3% agart tartalmazó azonos tápoldatot, valamint a faktor azonos koncentrációit adjuk a tenyészetekhez. A telepeket fixálás és festés nélkül megszámoljuk, és a 7-14. nap közötti időben 6-nál több sejtből álló telepeket veszünk tekintetbe.

Eredmények

f) Az U937 sejtekből izolált Oncostatin-M szekvenciája

Az Oncostatin-M N-terminális szekvenciáját és belső fragmentumait a redukált és S-piridin-etilezett polipeptid, valamint az Oncostatin-M redukciója és S-piridin-etilezése után kapott anyag enzimes emésztésével (endoproteináz Lys-C és Staphylococcus aureus V8 proteáz) nyert peptid mikroszekvencia analízisével határoztuk meg. A peptid fragmentumokat fordított fázisú HPLC segítségével, illékony oldószereket alkalmazva tisztítottuk. A peptidek automatikus, ismételt Edman-degradálását az Applied Biosystems, Inc. 470A sz. fehéije szekvencia-meghatározójával végeztük. A feniltio-hidantoin tartalmú aminosavakat fordított fázisú HPLC-vei (Applied Biosystems, Inc.) PTH-C18 oszlopon (2,1x220 mm, ABI) elemeztük nátrium-acetát puffer(tetrahidrofurán)acetonitril oldószerekkel végzett gradiens elúcióval.

A kapott aminosavsorrendet az 1. ábra mutatja.

Az így kapott szekvenciát összehasonlítottuk az aktuális protein adatbázisban tárolt egyéb szekvenciákkal (PÍR 9,0 sz. kiadvány, 1986. május) és nem találtunk lényeges szekvencia homológiát az ismert szekvenciákkal. Ugyanígy nem volt homológia a tumor nekrózis faktorhoz, a limtofoxinhoz, a telepnövekedést stimuláló faktorhoz, az interleukin 1 vagy 2-höz, illetve a β-transzformáló növekedési faktorhoz képest.

ii) A daganatsejtek proliferációjának gátlása és a normális emberi fibroblasztok proliferációjának fokozása

A fent leírt lágy agaros telepképzés gátlási tesztek alkalmazásával a következő táblázatban bemutatott eredményeket kaptuk.

1. táblázat

Lágy agaron tenyésztett A375 melanoma sejtek telepképzésének gátlása U937 sejtekből izolált és tisztított Oncostatin-M-mel*

Gl A egység/edény	A telepnövekedés gátlása (%)	Telepek száma
250/4	96	4
83/6	94	6
27/11	89	11
45/32	69	12
0/106	-	106

* Az A375 sejteket a faktorral együtt, vagy anélkül 2 ml végtérfogatban lágy agarra létegeztük a fent leírtak szerint. A faktort a C18 oszlop, propanolos legaktívabb (legnagyobb daganatnövekedés gátló hatású) frakciójából nyertük. 11 nap elteltével a telepeket megszámoljuk. A legalább hat sejt csoportosulásából álló képződményt tekintettük telepnek. 1 GIA-egységnek azt a mennyiséget vettük, amely a fenti mikrotiterű edényekben lévő A375 sejtekbe való ³H-timidin beépülést 50%-kal gátolta.

A következő kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a találmány szerinti polipeptid aktivitására milyen hatással vannak a különböző (akár fizikai, akár kémiai) kezelések. Az eredményeket a következő 2. táblázat mutatja.

2. táblázat

Különböző kezelések hatása TPA jelenlétében tenyésztett U937 sejtek felülúszóinak daganatnövekedést gátló aktivitására*

	A felülúszó véghígítása
1:4	1:8	1:16
Kontroll oldat	-	-	-	39,780
Kezeletlen felülúszó	7,206**	13,896	16,000
In ecetsavval kezelt felülúszó	6,670	17,073	18,783
In ammónium-hidroxiddal kezelt felülúszó	6,956	15,016	13,923

* Az U937 sejteket 3 napon át 10 ng/ml TPA-val kezeljük, majd a sejteket tápoldattal mossuk, 24 órán át szérum-mentes tápoldattal inkubáljuk, s végül a felülúszót elkülönítjük. A felülúszókat 1 N ecetsavval vagy 1 N ammónium-hidroxiddal kezeljük, ezután a tápoldattal szemben dializáljuk, majd a ³H-timidin A375 sejtekbe történő beépülését gátló hatásra teszteljük. Az A375 sejteket a 3 napos inkubáció utolsó 6 órájában jelöljük ³H-timidinnel (³H-TdR).

** Az adatok a ³H-TdR beépülés mértékét szcintilláció/perc értékben szemléltetik.

HU 210 694 Β

A fenti adatokból látható, hogy a dializált felülúszóban lévő Oncostatin-M normál ecetsav és normál ammónium-hidroxid hatására lényegében változatlan aktivitású marad; azaz a találmány szerinti vegyület mind mérsékelten erős savval, mind mérsékelten erős bázissal szemben viszonylag érzéketlen. A találmány szerinti vegyület 1 órán át tartó 56 °Con végzett hőkezelés esetén stabilnak, 30 percig 90 °C-on végzett hőkezelés esetén instabilnak bizonyult.

A találmány szerinti vegyület hőstabilitását vizsgálva azt találtuk, hogy 1 órás 56 °C-on végzett hőkezelés esetén aktivitását megtartja, 30 perces 90 °C-on végzett hőkezelés esetén azonban aktivitását praktikusan elveszti.

A következő kísérletekben a találmány szerinti polipeptidek daganatsejt replikációt gátló hatását vizsgáltuk különböző tumorsejteken. Az eredményeket a következő 3. táblázat mutatja.

3. táblázat

U937 sejtekből kinyert és tisztított Oncostatin-M gátló hatása különböző daganatsejtek replikációjára* (30%-os gátlást eredményező GIA-egység esetén)

Daganatsejtek	H3-TdR beépülés
A549 (tüdőrák)	21
HTB10 (neuroblasztoma)	81
A375 (melanoma)	0,3

* A daganatsejteket mikrotiterű tenyésztőedényekben 3 órán át tenyésztjük, majd a már ismertetett fordított fázisú HPLC eljárással tisztított Oncostatin-M különböző hígításait adjuk a tenyészetekhez. A 3 napos inkubációs periódus utolsó 6 órájában a 0,2 ml tápoldathoz lévő sejteket 0,5 pCi/edény aktivitású ³H-timidinnel (³H-TdR) jelöljük. A tumomövekedést gátló hatás (GIA) egységét az 1. táblázat lábjegyzetében úgy definiáltuk, hogy 1 egység az A375 melanoma sejtekbe történő ³H-TdR beépülését 50%-kal gátolja. 1 egység körülbelül 10 pg tisztított proteinnek felel meg. Következésképp az a koncentráció (ng/ml), amely a ³H-TdR beépülését A549, HTB10 és A375 sejtekbe 30%-kal gátolja, közelítőleg 1,4; 4,0, illetve 0,15 ng/ml. A kísérletek során az U937 faktor nem gátolja a ³H-TdR beépülését WI26 normális emberi fibroblasztokba.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy az Oncostatin-M replikációt gátló hatása szelektív, azaz hatása nagyban függ a sejt fajtájától. A találmány szerinti vegyület hatásos a melanoma sejtekkel szemben (például A375 melanoma sejtek), az epidermális tüdőrák sejtekkel szemben (például A549 sejtek) és a neuroblasztoma sejtekkel szemben (például HTB10).

96-lyukú tálcákban 3xl0³ tumorsejt/mélyedés és l,5xl0³ normális fibroblaszt/mélyedés koncentrációban 3 órán át tenyésztettük a sejteket. Az OncostatinM C18³ HPLC tisztításával nyert, az A375 sejtekkel szemben legaktívabb frakcióból különböző koncentrációkat adtunk a tenyészetekhez, és 3 nap elteltével és minden koncentrációból háromszoros paralelben mértük a ³H-timidin beépülést. Az eredményeket a következő 4. táblázat mutatja.

4. táblázat

Daganatsejtek proliferációjának gátlása és normális fibroblasztok proliferációjának fokozása Oncostatin-M-mel

GIA egység/edény	%-os gátlás	%-os stimulálás
	A375	WI38
1. kísérlet	16	83		25
4	62		30
1	46		46
	A375	HTB10	WI26
2. kísérlet	27	nem teszteltük	28	46
9	87	22	36
3	76	11	52
	A375	A549
3. kísérlet	75	89	30
25	85	22
8	71	16
	A375	SK-MEL28
4. kísérlet	20	87	44
5	75	25
1	59	11

Az eredményeket a ³H-timidin tumorsejtekbe (A375, HTB10, A549 és SK-MEL28) való beépülésének gátlási %-ában, illetve normális fibroblasztokba (WI26 és WI38) történő beépülésének stimulálási %ában adtuk meg. Az 1 GIA egységet az 1. táblázat lábjegyzetében definiáltuk, és azt az Oncostatin-M mennyiséget jelenti, amely a ³H-timidin A375 sejtekbe történő beépülését 50%-kal gátolja.

A ³H-timidin tumorsejtekbe, illetve normális emberi fibroblasztokba történő különböző beépülésén túlmenően, az Oncostatin-M-mel történő 3 napos kezelés után a két sejttípus morfológiájában és a sejtek számában is különbségek észlelhetők, mint azt a 2. ábra mutatja.

Az alkalmazott Oncostatin-M a C18³ HPLC tisztításánál nyert, az A375 sejtek proliferizálódását legjobban gátló frakciókból származott. A 2. ábrán fénymikroszkópos felvételek sorozata látható; az (A) felvétel a kezeletlen A375 melanoma sejteket, a (B) felvétel az 5 GIA-egységnyi, a (C) felvétel a 100 GIA-egységnyi Oncostatin-M-mel kezelt A375 sejteket mutatja. A (D) felvételen a kezeletlen, az (E) felvételen az 5 GIA-egységnyi és az (F) felvételen a 100 GIA-egységnyi Oncostatin-M-mel kezelt WI38 fibroblasztok láthatók. A sejteket 0,5%-os metanolos kristályibolyával festettük meg, a nagyítás 63-szoros.

fii) Az Oncostatin-M nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gélelektroforézise

A tisztított Oncostatin-M nátrium-dodecil-szulfátpoliakrilamid-gélelektroforézisét redukáló körülmények között végezve, a 3. ábrán látható 28 kD-os lát9

HU 210 694 B szólagos molekulasúlyt kaptuk. Standardként a következő fehérjéket használtuk, és az (A)-sávban feltüntetett adatokat kaptuk: ovalbumin (43 kD), kimotripszinogén a (25,7 kD), laktoglobulin β (18,4 kD), lizozim (14,2 kD), borjú tripszininhibitor (6,2 kD), inzulin A-, illetve B-lánc (2,3 kD, illetve 3,4 kD). Az OncostatinM-re a (B)-sáv vonatkozik.

Az Oncostatin-M poliakrilamid-gélelektroforézisét nem-redukálő körülmények között végezve 28 kD látszólagos molekulasúlyt kaptunk és a sávból elektroeluált fehérje az A375 sejtek proliferációját gátolta.

2. példa

Az Oncostatin-M egy szintetikus peptidfragmensére specifikus antitest reagál a ¹²⁵1-jelzett Oncostatin-M-mel radioimmunprecipitációs reakcióban

a) A kérdéses peptid szintézise

A peptid az Oncostatin-M protein 6-19 aminosavmaradékainak felel meg. Szintézisét szilárd fázisú módszerrel automatizált Beckman készülékben Gentry és munkatársai módszerével [J. Bioi. Chem., 258., 11 219. (1983)] végeztük. A peptidet a gyantáról az úgynevezett „low-high” hidrogénfluoridos módszerrel [Tam és munkatársai: J. Am. Chem. Sco., 705., 64426445. (1983)] hasítottuk le. Az anyag tisztítását preparatív HPLC-módszerrel végeztük.

b) Az antitestek termelése

A peptidet Gentry és Lawton módszerével [Virology, 752., 421-431. (1986)] γ-globulinhoz kapcsoltuk. Jóllakott újzélandi fehér nyulakat ötször szubkután beoltottuk négy különböző helyen a Gentry és Lawton [Virology, 752., 421-431. (1986)] által leírt módon. Az ötödik kezelés után 2 héttel az állatoktól antiszérumot vettünk.

c) Az Oncostatin-M jelölése jóddal

Részlegesen tisztított Oncostatin-M-et Linsley és munkatársai módszerével [PNAS 82., 356-360. (1986)] radioaktív ¹²⁵I-vei jelöltük. A jelzett preparátum egy 100 000 szcintilláció/perc aktivitású alikvot részét az Oncostatin-M N-terminális 17 aminosavja ellen hatásos nyúl-antiszérumhoz kevertük (véghígítás: 1:20) az Oncostatin-M N-terminális 17 aminosavjából álló peptid jelenlétében (2 pg), illetve annak jelenléte nélkül, majd a preparátumot Linsley és munkatársai immunprecipitációs módszerével [Biochemistry, 25., 2978-2986. (1986)] elemeztük.

Nevezetesen, a csövenként 5 pl preparátumot 2 pg N-terminális-peptidet és 0,1% borjúszérumalbumint tartalmazó 10 ml TNEN-oldattal (20 mmol trisz, pH 7,5; 5 mmol etilén-diamin-tetraecetsav; 150 mmol nátrium-klorid és 0,05% Nonidet P-40) 30 percig 4 ’Con előinkubáljuk, majd 0,1% borjúszérumalbumint, 40 mmol ditio-treitolt (DIT) és a ¹²⁵I-jelzett Oncostatin-M-et tartalmazó 85 pl TNEN-oldatot adunk a tenyészetekhez. 7 próbacsövet, mindegyikben 5 pl antiszérummal és a 0,1% borjúszérumalbumint, 40 mmol DTT-t és a ¹²⁵I-jelzett Oncostatin-M-et tartalmazó 85 pl TNEN-oldattal, 30 percig 4 ’C-on inkubálunk, majd 50 pl, 10%-os formáimnál fixált Staphylococcus aureus tenyészetet (Pansorbin, Calbiochem) adunk a csövekhez.

A tenyészeteket további 30 percig 4 ’C-on inkubáljuk, a csöveket mikrocentrifugáljuk, a kapott pelleteket négyszer 1 ml TNEN-oldattal mossuk, majd poliakrilamid-gélelektroforézissel elemezzük. Az immunprecipitátumok SDS-poliakrilamid-gélelektroforézises elemzése után egy 32 kD mólsúlyú diffúz sáv volt megfigyelhető. Ennek a speciesnek a kicsapódása az Oncostatin-M N-terminális 17 aminosávjának megfelelő jelzetlen peptid fölöslegével gátolható volt, jelezve, hogy a kicsapódott fragmens erre a pepiidre specifikus.

Az Oncostatin-M szénhidrát összetételét glikozidáz-érzékenység tesztelése segítségével vizsgáltuk. A c) pont szerint preparált immunprecipitátumokat Linsley és munkatársai az előbbiekben már említett cikke szerint egy pufferrel, és endoglikozidáz H vagy neuraminidáz enzimmel kezeltük. A nitrogénhez kötött nagy mannóztartalmú oligoszacharidokra specifikus endoglikozidáz H enzimmel történő kezeléskor egy alacsonyabb móltömegű (24 kD) fragmentum megjelenése volt megfigyelhető. A radioaktív izotóppal jelzett anyagnak csak egy része volt érzékeny erre az enzimre, ami arra utal, hogy nem minden molekula tartalmaz vagy mannóztartalmú oligoszacharidokat. A neuraminidázzal történő kezelés során egy 27 kD-os sáv jelent meg, ami annak a jele, hogy a kezeletlen ¹²⁵I-jelzett Oncostatin-M molekulamértékének heterogenitása a glikoprotein mag sziálsavval való helyettesítettségében fennálló heterogenitásának következménye. Az eredmények azt mutatják, hogy az Oncostatin-M hatásos preparátumai nagy mannóztartalmú és komplex, nitrogénhez kötött oligoszacharidot tartalmazó oldalláncok keverékét tartalmazzák.

3. példa

Normális emberi perifériás vérlimfocitákból (PBL) izolált Oncostatin-M. Daganatsejt-növekedést gátló vegyület előállítása PBL-ekből

A vérbanktól kapott, PBL-tartalmú leukofrakciókat foszfáttal pufferolt só-oldattal (PBS, pH 7,4) 1:1 arányban hígítottuk. 35 ml hígított vér alá 10 ml 9%-os Ficoll reagenst rétegzünk (20 térfogat%-os nátrium-3,5diacetamido-2,4,6-trijód-benzoátot tartalmazó reagens; fajsúly: 1,080). 20 percig szobahőmérsékleten 850xg értéken gradiens-centrifugálást végzünk. A sejteket a gradiens határfelületről összegyűjtjük, PBS-oldattal mossuk. A vörösvérsejteket 3-4 perces 10-20 ml 0,8% ammónium-kloridot és 0,1% tetranátrium-etilén-diamin-tetraacetátot tartalmazó oldattal rázva sejtlízisnek tesszük ki.

A vörösvérsejt líziskor kapott oldatból 10 perces 600xg értéken végzett centrifugálással a sejtes elemeket kigyűjtjük, 5% boqúembrió-szérumot tartalmazó 10 ml RPMI 1640 tápoldattal újra szuszpendáljuk és a szuszpenzióhoz 0,5 egység/ml végkoncentrációban trombint adunk. A sejtszuszpenziót 5 percig 37 ’C-on erőteljesen keveqük és a vérlemezke aggregátumot 5 percig kiülepedni hagyjuk. A szuszpenzióban lévő sejteket új csövek10

HU 210 694 B be visszük át, centrifugálással elkülönítjük, majd 1 ml borjúembrió-szérumban újraszuszpendáljuk és 0,5 g bolyhosított és előnedvesített 100-as típusú nylongyapottal töltött (Fenwal) oszlopra visszük.

A nylongyapottal töltött oszlopot 60 percig 37 ’Con inkubáljuk, hogy a monociták és a B-limfociták megtapadjanak. Ezután az oszlopot 37 °C-os 5% borjúembrió-szérumot tartalmazó, háromszoros térfogatmennyiségű RPMI 1640 tápoldattal mossuk és a meg nem tapadt sejteket (PBL) eluáljuk és összegyűjtjük.

A PBL sejteket (2xl0⁶ sejt/ml) 37 ’C-on 5% széndioxidot tartalmazó levegő-atmoszférában 96 órán át 10,4 g/liter koncentrációjú, különböző adalékokat tartalmazó RPMI 1640 tápoldatban tenyésztjük. A tápoldatban lévő adalékok a következők: 1 mg/liter vas(II)szulfátx7H₂O; 2 mg/liter cinkszulfátx7H₂O; 0,017 mg/liter nátrium(I)-szelemitx5H₂O (Na₂SeO₃x5H₂O); 1 mg/liter 1-amino-etanol; 5 mg/liter humán transzferin; 200 mg/liter boíjú-szérumalbumin-linolénsav konjugátum (Sigma); 300 mg/liter L-glutamin; 100 000 egység/liter penicillin/sztreptomicin; és 2 mg/liter fitohemagglutinin-P (Wellcome). Az egyesített felülúszóból a sejteket centrifugálással eltávolítjuk, ultraszűréssel betöményítjük (Amicon YM10 Diaflo membrán, 10 kD-os frakció) és 0,1 mólos ecetsavval szemben dializáljuk (Spektrapore 3 dialíziscső). A visszamaradó tisztított anyagot liofilizáljuk.

a) Gélkromatográfiás tisztítás

A fentiek szerint kapott nyers frakciót 10 ml 1 mólos ecetsavban oldjuk (50 mg/ml), és 1 mólos ecetsavval ekvillibrált 2,6x88 cm-es BioGel P-100 oszlopon kromatografáljuk. Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc. 12 frakciót szedünk és mindegyiknek 1-1 alikvot részét háromszoros parallelben A375 sejtek növekedését gátló hatásra (GIA) vizsgáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, liofilizáljuk és 600x21,5 mm-es BioSil TSK-250-es oszlopon már ismertetett módon rekromatografáljuk.

b) A TSK-250-es frakciók tisztítása fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel A TSK-250-es aktív frakciókat a már ismertetett fordított fázisú HPLC módszerrel tisztítjuk. A PLBeredetű daganatgátló hatású vegyület a μBondapak C18 adszorbensről 40-41% acetonitril-tartalomnál, illetve 26,5% n-propanol-tartalomnál eluálódik.

c) Sejtnövekedést moduláló hatás vizsgálata ¹²⁵1jelzett jód-dezoxiuridin DNS-be történő beépülésének mérése útján

A vizsgálatokat laposfenekú 96 mélyedéses szövettenyésztő tálcában (Costar 3596) hajtottuk végre. Az egyes mélyedésekbe 4xl0³ A375 humán melanóma sejtet adtunk 50 μΐ teszt oldatban és a tenyészeteket 3 napon át 37 ’C-on inkubáltuk. A sejteket ¹²⁵I-jelzett jód-dezoxiuridinnel (0,05 gCi/mélyedés) 24 órán át jelöltük és további 24 órán át inkubáltuk. A sejteket háromszor mostuk, majd egy, a sok mélyedéses tálcához adaptálható sejt-összeszedővei összegyűjtöttük és a radioaktivitást γ-számlálóval megmértük.

d) Eredmények

Az egyik, PBL-eredetű daganatsejt növekedést gátló preparátumot ismételt automatikus Edman degradációnak vetettük alá. Az amino-terminálishoz kapcsolódó aminosav-szekvenciát az (la) általános képlet szemlélteti:

10 15

A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-QK (la) ebben a képletben X nem azonosított aminosavat jelent.

Összehasonlításul megadjuk az U937-eredetű faktor megfelelő szekvenciáját is {(Ib) általános képlet]:

10

PBL-faktor A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V15

L-X-X-Q-L-Q-K

U937-faktor A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-VL-L-G-Q-L-Q-K (Ib) az N-terminusok azonossága világosan látható.

4. példa

Oncostatin-M hatása sejtek replikációjára

A következő kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a PBL-eredetű Oncostatin-M milyen hatással van különböző sejtek replikációjára. Azt találtuk, hogy a PLBeredetu Oncostatin-M 1000 GIA-egység/ml felső koncentrációig nem befolyásolta az egér L929 sejteket. A WI26 humán fibroblasztok növekedését 1000 GIAegység/ml stimulálta. A normális emberi T-limfociták proliferációját a mitogenezist követő 72. órában a vegyület 500 GIA-egység/ml felső koncentrációig nem befolyásolta.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy az új polipeptid és a polipeptid-fragmentumok a sejtnövekedést modulálják. A vegyület hatása az alkalmazott sejtvonaltól függően változó, tehát önmagában, vagy más vegyületekkel együtt sejtnövekedés modulálására alkalmas lehet. A találmány szerinti polipeptidek tehát egy újabb polipeptiddel gazdagítják a már meglevő olyan vegyületek körét, amelyekkel a sejtkeverékekben lévő egy adott típusú sejt celluláris proliferációja szelektíven csökkenthető vagy fokozható akár in vivő, akár in vitro.

A faktor főként autológ csontvelő transzplantátumok sejtjeinek kezelésére használhatók. A faktor alkalmazásával a csontvelőben lévő daganatsejtek növekedése gátolható és a telepképzés elősegíthető. Az Oncostatin-M-mel az epiteliális sejtek növekedése is serkenthető, s ezáltal a sebgyógyulás elősegíthető. Ezen túlmenően az intakt polipeptid, illetve fragmentumai immunogén anyagként is alkalmazhatók antitestek termelődésének előidézésére. A termelt antitestekkel meghatározható a testfolyadékokban jelenlévő Oncostatin-M titere, vagy az antitesteknek a faktorhoz kötődésével változtatható a faktor aktivitása. Az antitestek

HU 210 694 B az Oncostatin-M-mel (vagy ennek fragmenseivel) együtt diagnosztikai kitekben alkalmazhatók adott esetben egyéb reagensek hozzáadásával, amely antitestek segítségével az Oncostatin-M kimutatható és mennyisége meghatározható.

A találmány részleteit és a példákat illusztratív céllal és a jobb megértés érdekében írtuk le; az esetleges módosítások és változtatások azonban a mellékelt igénypontokba beleértendők.

Claims (16)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás Oncostatin-M polipeptid előállítására, mely gátolja a daganatos sejtek proliferációját, a normális fibroblasztok proliferációját serkenti, az emberi proliferatív és citotoxikus T-sejtes reakciókra, valamint a granulocitás és mielocitás csontvelő telepek sejtképzésére gátló hatása nincs, gél méretkizárásos kromatográfiával meghatározott molekulatömege 17-19 kD és nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gélelektroforézissel (SDS-PAGE) meghatározott molekulatömege közelítőleg 28 kD és 1 n savakra és bázisokra, valamint 56 °C hőmérsékletre legalább 1 órán át érzéketlen, azzal jellemezve, hogy

   - emlősökből leukocitákat izolálunk,

   - a leukocitákat egy indukálószerrel kezeljük, és

   - a polipeptidet izoláljuk a sejtanyagtól mentes aktivált leukocitáktól.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy leukocitaként hisztocita limfóma-sejteket izolálunk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy U937 sejteket izolálunk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy indukálószerként valamely ingenolt vagy forbolt alkalmazunk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy forbolként 12-0-tetradekanoil-forbol-13-acetátot használunk.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy leukocitaként normális emberi perifériás véreredetű limfocitákat izolálunk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy indukálószerként valamely mitogént alkalmazunk.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mitogénként fitohemagglutinin-P-t alkalmazunk.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az Oncostatin-M polipeptid legalább 10 GIA-egység/ng fehéqe fajlagos aktivitással történő előállítására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet megfelelő tisztaságban izoláljuk.
10. 10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az Oncostatin-M polipeptid legalább 100 GIA-egység/ng fehéije fajlagos aktivitással történő előállítására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet megfelelő tisztaságban izoláljuk.
11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet állítunk elő, mely az 1. ábrán feltüntetett aminosav-sorrendtől legfeljebb három aminsavban térhet el.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet állítunk elő, mely az 1. ábrán feltüntetett aminosav-sorrendtől legfeljebb egy aminosavban térhet el.
13. 13. Eljárás egy legfeljebb 8 aminosavból álló poli(aminosav) előállítására, mely Oncostatin-M-el ad immunológiai keresztreakciót, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán feltüntetett aminosav-sorrendnek vagy részének megfelelő aminosav-szekvenciát szintetizálunk, majd a keletkezett poli(aminosavat) elválasztjuk.
14. 14. Eljárás legalább 8 aminosavból álló poli(aminosav) előállítására, mely az 1. igénypont szerint előállított Oncostatin-M-el immunológiai keresztreakciót ad, azzal jellemezve, hogy

    - az 1. igénypont szerinti polipeptidet kódoló DNSszekvenciát tartalmazó expressziós rendszert és transzkripciós és transzlációs jelző szekvenciákkal rendelkező sejteket tenyésztünk, és

    - az így kifejeződött polipeptidet lényegében sejtanyagtól mentes formában izoláljuk.
15. 15. Eljárás az 1. igénypont szerinti polipeptidre specifikus antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy állatot az 1. igénypont szerinti polipeptiddel vagy a 13. vagy 14. igénypont szerinti poli(aminosavval) immunizálunk, és a képződött antitesteket kinyerjük.
16. 16. Eljárás tumorsejtek proliferációját gátló vagy sebgyógyulást elősegítő gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 9. vagy 10. igénypont szerint előállított polipeptidet a gyógyszerkészítésnél általánosan alkalmazott hordozóanyagokkal szokásos dózisformává alakítunk.