JPH05503098A - セプシスの処理のためのサイトカイン抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セブシスの几　のためのサイトカイン 本発明は、免疫学／生化学の領域にあり、そしてセプシスの予防的または治療的 処置のためのサイトカイン抗体、好ましくはインターロイキン６　（ＩＬ−６） およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）抗体の単独または組み合 わせを提供する。抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはそれ らから誘導された断片、またはこのような抗体の結合活性を有する組み換え構成 成分であることができる。

米国のみにおいて、病院の菌属症は約１９４．０００人であり、そしてこのうち 約７５，０００人が死亡する。Ｍａｋｉ、Ｄ。

Ｇ、＋　１９８１．　Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ　Ｉｎｆｅｃｔ、、　（Ｄｉｃｋｓ ｏｎ、Ｒ，Ｅ、、Ｗ）、　ｐ、１８３゜Ｙｒｋｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ 、米国。これらの死亡の大部分は６つの主要なグラム陰性バクテリアに起因し、 そしてこれらは緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　耗匹■匣…）、大腸菌（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、（Ｓｅｒｒａｔｉａ）である。菌属症の現在の 処置は抗生物質の投与であり、これらの抗生物質は、不都合なことには、菌属症 の精確な病理学は完全には解明されないが、バクテリアの内毒素、リボ多Ｆ（Ｌ ＰＳ）は王な原因となる因子であると信しられる。ＬＰＳは少なくとも３種の有 意の抗原性領域、脂質Ａ、コア多糖、およびＯ特異的多糖から成る。後者は、ま た、０特異的鎖または単にＯ抗原と呼ばれる。０特異的鎖の領域は反復多糖単位 から構成された長鎖多糖である。多糖単位の数は異なるバクテリア種の間で異な り、そして６または７多糖単位に多くまで互いに変化することがある。０特異的 鎖は異なるグラム陰性バクテリアの間で変化し、脂質Ａおよびコア多糖は同一で はないにしても類似する。

ＬＰＳはセプシスにおいて重要な役割を演するので、種々のアプローチがその活 性を中和するために追及されてきている。現在、ＬＰＳに対する抗体が標準の抗 体の治療に対して価値ある臨床的付加物とすぐになるであろうことを示唆するか なりの研究が存在する。

ＬＰＳは、究極的に患者の死を引き起こす生化学的事象のカスケードを開始する 。第２事象は、ＬＰＳの導入後、マクロファージ細胞のＬＰＳ刺激の結果として 、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のパーキンソン病であると、広く、信じられている。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、細胞溶解および細胞増殖抑制の抗腫瘍活性を有する ことが知られているサイトカインである。Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌら、１９７５．　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７２　：　３６６６３６７ ０　；　Ｗｉ　ｌ　ｌ　ｉａａ＋ｓｏｎら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＪＳＡ、　８０：５３９７−５４０１゜さらに、最近、そ れは免疫炎症のカスケードにおける仲介因子であり、そしてセブシスにおいて重 要な役割を演することが示された。Ｂｅｕｔｌｅｒら、１９８５．５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２２９：８６９が報告しているように、ネズミのモデルにおいて、内毒素 の致死的作用はポリクローナルウサギ抗体ネズミＴＮＦ抗体により減少すること ができる。ＴＮＦに対する抗体は価値ある応用を有する可能性がある。Ｔｒａｃ ｅｙら、１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ。

ｙ辺＝６６２゜ ＴＮＦに加えて、セプシス患者において増加する他のサイトカインはインターロ イキン−６（ＩＬ−６）である、ＩＬ−６は、また、ハイブリドーマ成長因子、 インターフェロンβ、Ｂ細胞刺激因子２．２６−Ｋｄタンパク質および肝細胞刺 激因子と呼ばれる。この分子は多面発現作用を有し、感染の作用相の間に肝タン パク質合成を明らかに刺激し、そして内因性発熱因子として作用する。

Ｈａｃｋら、１９８９．　Ｂｌｏｏｄ、　７４　：　１７０４は、セブシスの患 者の有意の数が１Ｌ−６の増加した血漿レベルを示し、そしてＩＬ−６の量がシ ョックの症候および臨床的予後と相関関係をもつことを示した。その報告に示さ れているセブシスの患者において、血清Ｉ　Ｌ−６は１，０ＯＯＵ／ｍｌ程度で あった。

天然！Ｌ−６は１９〜３０ｋＤの分子量を有し、そして６０〜７０ｋＤの免疫反 応性種が、また、報告された（参照、Ｋｅｌｆ−ｇｏｔｔら、１９８９．　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２　：　９８４およびＪａｂｌｏｎら、１９８９゜Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２　：　１５４２）　、ヒトＩＬ−６ポリペプチドをコ ードする遺伝子は、次の欧州特許出願によりクローニングされそして発現された ：欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第０２２０５７４号、１９８７年５月６日発行、Ｒ ｅｖｅｌ　、　Ｍ、ら、発明の名称「ヒトインターフェロンβ２Ａおよびインタ ーフェロンβ２Ｂ、前記インターフェロンをコードするベクター、それを産生ず る細胞系および製剤として前記インターフェロンの使用」　；欧州特許出願（Ｅ Ｐ−Ａ）第０２５４３９９号、１９８８年１月２７日発行、Ｃｌｅｖｅｎｇｅｒ 、ＩＡ、ら、発明の名称「Ｂ細胞刺激因子に欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第０２５ ７４０６号、１９８８年３月２日発行、Ｋ１５ｈｉｎ＋ｏｔｏ、Ｔ、ら、発明の 名称「組み換えＢ細胞分化因子」；欧州特許出＠（ＥＰ−Ａ）第０２６１６２５ 号、１９８８年３月３０日発行、Ｈｏｎｊｏ、　Ｔ、ら、発明の名称「ヒトＢ細 胞分化因子および前記因子を産生ずる方法」　；欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第０ ２６７７７９号、１９８８年３月１８日発行、発明の名称「ヒト多面発現性免疫 因子およびその突然変異」；およびＰＣＴ　ＷＯ３８１００２０６，１９８８年 １月１４日発行、Ｃ１ａｒｋら、発明の名称ｒＩＬ−６の産生および使用」。

Ｉ　Ｌ−６に対する抗体は、Ｉ　Ｌ−６を示す前述の特許出願のあるもの（参照 、例えば、欧州特許（ＥＰ）第２５７，４０６号）および科学文献の両者におい て記載された。

従来セブシスに関係することが疑われていない他の分子は、マクロファージコロ ニー刺激因子因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）であり、またＣ３Ｆ−１として知られている。

この分子はマクロファージの選択的分化および増殖を引き起こし、そしである数 の源から精製されてきている。５ｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、Ｒ，ら、１９７７、　Ｊ 、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅａ＋、、　２５２　：　４３０５は、約ｌＸｌ０”単位／ｒｓｇ（Ｄ比活 性ヲモツネズミのＬ９２９細胞からの精製を記載している。［ｌａｓ、Ｓ、Ｊ。

ら、１９８２．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、、　２５７　：　１３６７９は、 ヒト尿のＭ−ＣＳＦが５Ｘ１０’単位／ｒｉｇの比活性を有し、そして主として マクロファージ細胞を生体内で発生することを報告した。５ｔａｎｌｅｙ＋Ｅ、 Ｒ，およびＧ１１ｂｅｒｔ、Ｌ、Ｊ、、　１９８１．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏ　ｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、　４２　：　２５３は、また、 Ｍ−Ｃ３Ｆを低い収率で精製する方法を記載している。Ｄａｓ、Ｓ、に、ら、１ ９８Ｌ　Ｂｌｏｏｄ、　５８　：　６３０は、ヒト尿のＭ−Ｃ３Ｆの部分的精製 を記載している。−ｕ、Ｎ。

ら、１９７９．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５４　：　６２２６は、主と してマクロファージの形成を刺激するＣ３Ｆの精製を記載している。より最近、 Ｍ−Ｃ３Ｆは出発物質として１０．０００リツトルのヒト尿を使用してミリグラ ムの量で精製された。

Ｍ−Ｃ３Ｆをクローニングし、そしである数の宿主細胞の中で発現し、そして結 局、組み換えＭ−Ｃ３Ｆ　（ｒＭ　−Ｃ３Ｆ）は抗体を誘発するための免疫原と しての使用に入手可能である。事実、今日まで、３つの異なる長さを有するヒ） ｒＭ−Ｃ３Ｆ　（ｈｒＭ−Ｃ３Ｆ）ｃＤＮＡのクローンが同定され、ここでα、 βおよびＴと呼ふ。（参照、Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、１９８８゜Ｍｏ１．ｆｍｕｎ ｏｌ、、　２５　：　７６１）。それらは単一のＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を発現する細 胞から分離された。α、βおよびＴのクローンは、それぞれ、２２４，５２２お よび４３８を有する非処理タンパク質をエンコードするＭ−Ｃ３Ｆ　ＤＮＡ配列 を含有する。

組み換えＭ−Ｃ３Ｆは活性の形態で発現され、こうしてこれらの分子を使用して 適当なモノクローナル抗体を発生させることができる。好ましいｒＭ−Ｃ３Ｆは 、米国特許第４．８４７，２０１号、Ｋａｗａｓａｋｉら、１９８９年７月１１ 日発行に記載されているものである。その中に、α形態のＭ−Ｃ３Ｆの、原核生 物および真核生物の両者の中の、発現が示されている。

それらの生物学的活性により定義されることに加えて、Ｍ−Ｃ３ＦおよびＩ　Ｌ −６は、また、それらの化学的構造により定義することができる。Ｉ　Ｌ−６の ＤＮＡおよびアミノ酸配列は知られている。対照的に、自然に産生されるＭ−Ｃ ３Ｆの正確な構造は科学文献を読んで明瞭には明らかではない。

例えば、尿から精製したヒトＭ−Ｃ３Ｆは、２５〜３５キロ塩基の見掛けの分子 量をもつ２つの本質的に同一のサブユニットから成ると考えられる。膵臓癌細胞 系から精製したＭ−ＣＳＦ、ＭＩＡ　ＰａＣａ−２は２つのサブニー’−７トか ら成ると報告されているが、約２３〜１００キロダルトンの見掛けの分子量をも つ。これらの差はグリコジル化の差であるか、あるいは、前述したように、Ｍ− Ｃ３Ｆ　ｍＲＮＡの転写の交互のスプライシングの結果として生ずることがある 。参照、また、５ｔｒａｄｌｅら、１９８９．　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　 ４０　：　９１゜βクローンからのＭ−Ｃ３Ｆの前駆体は、７０〜９０キロダル トンの糖タンパク質を生ずると考えられ、３５〜４５キロダルトンのサブユニッ トをもち、多分約２２３−２２４アミノ酸を有する二量体であると信じられる。

より小さい前駆体は４０〜５０キロダルトンの糖タンパク譬を生じ、これはまた 約２０〜２５キロダルトンのサブユニットの分子量をもち、そして多分約１５８ アミノ酸をもつ二量体からなる。参照、Ｈａｌｅｎ−ｂｅｃＫ、Ｒ，ら、１９８ ８．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　Ｊ、、８　：４５゜こうして、明らかなように 、Ｍ−Ｃ３Ｆの構造の定義内に、変化する分子量の関係するタンパク質の組が存 在する。さらに、前述の説明から明らかなように、Ｍ−Ｃ３Ｆの定義は前述の分 子量をもつタンパク質に限定されない。Ｍ−Ｃ３Ｆをコードする多数のｍＲＮＡ の存在に照らして予測されるように、前述のものと異なる分子量をもつタンパク 質は発見され、こうしてＭ−Ｃ３Ｆの定義内に入ることが意図される。

さらに、Ｍ−Ｃ５ＦまたはＩ　Ｌ−６に関すると、それらの正確な構造はある数 の因子に依存することが予測されるであろう。すべてのタンパク質はイオン化可 能なアミノ基およびカルボキシル基を含有するので、もちろん、それらは酸性ま たは塩基性の形態で、あるいは中性の形態で得ることができることは明らかであ る。さらに、アミノ酸配列は糖モノクローナルを使用する誘導化（グリコジル化 ）によるか、あるいは共有結合またはイオンの結合を含有する他の化学的誘導化 、例えば、脂質、ホスフェート、アセチル塩などの結合、しばしはサツカリドと の会合を通して起こる、により増大することができることが明らかである。これ らの修飾は試験管内または生体内で起こることができ、後者は翻訳後のプロセシ ング系を通して宿主細胞により実施される。理解されるように、このような修飾 は、それらが起こる方法に無関係に、タンパク質の活性が、前に定義したように 、破壊されないかぎり、Ｍ−Ｃ３ＦおよびＩ　Ｌ−６の定義内に入ることを意図 する。

もちろん、このような修飾はその分子の生物学的活性を定量的または定性的に増 加または減少することができ、そしてこのような化学的に修飾された分子は、ま た、これらの分子が医学的に有用な抗体を誘発するので、Ｍ−Ｃ３ＦおよびＩＬ −６の定義の範囲内に入ることを意図することを期待すべきである。

本発明の第１目的は、セブシスの予防または治療的処置のためのサイトカイン抗 体、好ましくはＩ　Ｌ−６および／またはＭ−Ｃ３Ｆ抗体の記述である。

本発明の第２目的は、抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または このような抗体または抗体断片の結合活性を有する組み換え構成体である、セブ シスの予防または治療的処置のためのＩ　Ｌ−６および／またはＭ−Ｃ５Ｆ抗体 、または抗体断片の記述である。

本発明の第３目的は、Ｉ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆ抗体、それらから誘導された 抗体断片、このような抗体または抗体断片の結合活性を有する組み換え構成体か ら成る、セブシスの予防または治療的処置のための抗体の混合物の記述である。

本発明の他の目的は、セプシスの予防または治療的処置のためのＩＬ−６および ／またはＭ−ＣＳＦ抗体を投与する方法の記述である。

本発明のこれら、および他の目的は、本発明の以下の記述を考慮した後、より完 全に理解されるであろう。

第１図は、Ｅ、ｃｏｌｉの致死または致死下の投与後のヒト血漿中のＩ　Ｌ−６ のレベルを示す。

第２図は、Ｉ　Ｌ−６モノクローナル抗体がＥ、ｃｏｌｔの致死投与量を投与し たヒトの寿命をかなり延長することを示す。

第３図は、ヒトが致死投与量のＥ、ｃｏｌｉを投与される前の種々の生理学的パ ラメーターに対する、Ｉ　Ｌ−６モノクローナル抗体、８Ｍ７０、の投与のヒト への投与の効果を示す。

第４図は、致死投与量のＥ、ｃｏｌｉを投与したヒヒにおけるＭ−Ｃ３Ｆレベル の増加を示す。

本発明は、セブシスの予防または治療的処置のためのサイトカイン抗体、好まし くはＩ　Ｌ−６および／またはＭ−ＣＳＦ抗体の産生および利用に関する。本発 明を実現するために使用する物質および方法の種々の面を論考する、いくつかの 特許／特許出願および科学文献について言及する。本発明はこれらの物質および 方法を利用するので、こうして参考文献のすべてを、その全体において、ここに 引用によって加える。

本発明をより明瞭に定義するために、ここにおいて特定の用語はこの分野におい てそれらの使用と一般に一致する次の定義に従い使用する。

「セブシス」は、ここにおいて、バクテリアの内毒素のリポ多＄１　（ＬＰＳ） のためのバクテリアの感染から生ずる病気を意味すると定義する。それは少な（ とも６つの主要なグラム陰性バクテリアにより誘発されことができ、そしてこれ らは緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　且■直匹且）　、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ ｉ−田圏　並置）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅ ｂｓｉｅｌｌａ）　、エンテロバクタ−属（Ｅｎ　ｔｅｒｏｂａｃ　ｔａｒ）お よびセラチア属（Ｓｅｒｒａ　ｔｉａ）である。グラム陰性有機体により誘発さ れたセプシスは、また、ここに記載するアプローチにより有益に処置することが できることが期待される。

「モノクローナル抗体」は、単一の抗体産生細胞から有糸分裂を通して誘導され るクローナル集団（またはクローン）により産生される抗体の組成物を呼ぶ。モ ノクローナル抗体の組成物は、それがクローナル集団からの細胞により産生され ない抗体を実質的に含有しないとき、「他の抗体を実質的にを含有しない」。用 語「実質的にを含有しない」は、組成物の中にほぼ５％（ｗ／ｗ）またはそれよ り少ない汚染性抗体を意味する。また、その有効性を増加する抗体に対する修飾 はこの定義の範囲内に入ることを意図する。好ましい修飾は、水溶性ポリマーの 接合を包含する。好ましくは、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール、また は機能的に関係する分子、例えば、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、 ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールである。このよう な水溶性ポリマーによる抗体の誘導化は、その生体内の半減期を増加し、その免 疫原性を減少し、そしてタンパク質の凝集を減少または排除し、そしてそれを生 体内に導入したとき起こる得る免疫原性または凝集を減少することができる。水 溶性ポリマー、例えば、前述のものを使用する、一般的な、または抗体特異的な 、タンパク質の誘導化は、次の文献に記載されている：米国特許第４．１７９． ３３７号、１９７９年１２月１８日発行、Ｄａｖｉｓら、発明の名称「非免疫原 性ポリペプチド」；および米国特許第４，７３２，８６３号、１９８８年３月２ ２日発行、Ｔｏｓ＋ａｓ　ｉら、発明の名称「細胞表面レセプタのための親和性 が減少したＰＥＧ修飾抗体」。

「抗体産生細胞系」は、多数の世代のために生体内で安定に成長することができ る、単一の抗体産生細胞の有糸分裂を通して誘導されたクローナル集団またはク ローンである。

「腫瘍壊死因子」またはｒＴＮＦ、は、ここで使用するとき、この既知の哺乳動 物・のサイトカインの自然および組み換えの両者の形態を呼ぶ。ＴＮＦは、文献 において、「カチェクチン（Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ）　」および’ＴＮＦ−ａ：」 を包含する他の名称で呼ばれてきている。「組み換えＴＮＦ、または’　ｒＴＮ Ｆ　Ｊは、自然ＴＮＦ　（またはその一部分）と同一であるか、あるいは実質的 に同一のアミノ酸配列を有し、そし°てＴＮＦの試験管内および生体内の両者の 活性を保持する組み換えＤＮＡの発現により産生される、ムティンを包含するタ ンパク質を呼ぶ。ヒ）ＴＮＦを包含する自然および組み換え哺乳動物ＴＮＦの両 者の分離および産生は、この分野において知られている。参照、例えば、Ｃａｒ ｓｗｅｌｌら、１９７５＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７２　：　３６６６−３６７０　；　Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、８０　：　５３９７−５４０１　；　Ｈａｎｇら、 　１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ、２２８：１４９−１５４　；　Ｂｅｕｔｌｅｒら 、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９　：　８６９　；　Ｂｅｕｔｌｅｒら、 １９８５．　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６　：　５５２　；　Ｐｅｎｎ１ｃｉａら、 １９８４．　Ｎａｔｕｒｅ。

３１２　：　７２４　；　Ａｇｇａｒｗａｌら、１９８５．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、、　２６０　：　２３４５゜「組み換え抗体」は、重鎮および軽鎖のア ミノ酸配列の各々の１つの部分が特定の種から誘導された抗体における対応する 配列に対して相同性であるか、あるいは特定のクラスに属するが、鎖の残りのセ グメントが他における対応する配列に対して相同性である、抗体を呼ぶ。最も普 通には、組み換え抗体において、軽鎖およびＭｌの両者の種々の領域は哺乳動物 の１つの種からの抗体の種々の領域を反映するが、一定領域は他から誘導された 配列に対して相同性である。しかしながら、これは必ずしも常に当てはまらない ；例えば、Ｗａｒｄら、１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ、　３４１　：　５４４は、 種々の鎖単独が有意の抗原結合活性をもつバクテリアにおいて発現可能であるこ とを示した。

２つの抗体は、各抗体が結合阻害アッセイにおいて他の抗体の結合を効果的にブ ロンキングするとき、「交差ブロッキング」であるか、あるいは「エピトープを 共有する」。こうして、抗体ＡおよびＢが交差ブロッキングである場合、抗体Ａ は、抗原が約Ｂと前以てインキュベーションされていたとき、その抗原に結合せ ず、そして抗体Ｂは、抗原が約Ａと前以てインキュベーションされていたとき、 その抗原に結合しないであろう。

抗体のそのエピトープに対する用語「結合親和性］または’ＫａＪは、ここで使 用するとき、式Ｋａ＝８／３（Ｉｔ−Ｔｔ）により標準の方法に従い計算した結 合親和性を呼び、ここでＩｔは５０％のトレーサーを吸収する阻害因子の合計の モル濃度であり、そしてＴｔはトレーサーの合計のモル濃度である。参照、Ｍｕ ｌ夏ｅｒ＋　１９８０．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ。

狗び　３４５−３５２゜ ここで使用するとき、用語「インキュベーション」は、抗原／抗体の複合体の形 成を可能とする条件（例えば、適切なｐＨ１温度、時間、培地など）下に抗体お よび抗原を接触することを意味する。また、ここで使用するとき、「分離」は組 成物を試験支持体または固定化された抗体から分離し、こうして組成物中の非結 合の抗原または抗体を除去し、そして支持体上の抗原／抗体の複合体を無傷のま まにする任意の方法、通常洗浄を呼ぶ。適当なインキュベーションおよび分離の 技術の選択は当業者の技量の範囲内である。

１、ＴＬ−６Ｍ−ＣＳＦ 本発明の好ましい実施態様において、Ｉ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆ抗体を産生ず る免疫原性細胞をＩ　Ｌ−６および／またはＭ−Ｃ３Ｆで免疫化した哺乳動物か ら分離し、そして永久分裂能を与えて抗体分泌細胞系、例えば、ハイブリドーマ 、トリオーマなどを産生ずる。培養上澄み液を抗体の活性についてアッセイする ことによって、所望の抗体を分泌する細胞系を同定することができる。こうして 、本発明は３つの節に分割することができ、そして各節を別々に論考する。すな わち、免疫化手順、細胞の永久分裂能化手順、およびＩ　Ｌ−６および／または Ｍ−Ｃ３Ｆ抗体の同定。

Ａ、ＩＬ−６Ｍ−Ｃ３Ｆを　る Ｉ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆは、単独でまたは組み合わせで、適当な宿主動物の 免疫化に使用することができる。好ましくは、宿主動物は、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ 　ｆら、１９８７．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＩｆｆＩＩｕｎｏ一旦■、■＋　 ４１１６、または欧州特許（ＥＰ）第２５７．４０６号に記載されているように Ｉ　Ｌ−６によるか、あるいは米国特許第４．８４７，２０１号に記載されてい るようにＭ−Ｃ３Ｆにより免疫化する。適当なアジュバントを使用して免疫応答 を増強することができる。種々の区別可能な免疫化のプロトコルを使用すること ができ、そして予備的静脈内、皮下または腹腔内の免疫化および１または２以上 の促進から成ることができる。

正確な免疫化のスケジュールは一般に臨界的ではなく、そしてどの手順を使用す るかの決定は、下に記載する適当なアッセイにより測定した宿主動物中のＭ−Ｃ ３ＦまたはＩ　Ｌ−６の存在である。

あるいは、リンパ球を生体内で免疫化することができる。

例えば、末梢血球の免疫化は、Ｂｏｓｓ、厘肋優り刃」伽Ｗ吸国■・月は（１） 、および欧州特許出願（ＥＰＡ）第８６１０６７９．６号に記載されているよう に達成することができる。とくにネズミまたはヒトのモノクローナルの産生に使 用することができる生体内の免疫化技術に注意すべきである（細胞の形質転換の 手順、ｆ）、１８　３２．１４０　１７４．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚ　 ｗ６１ｏｚ　、　Ｖｏｌ、１２１゜部１）。このような技術は、また、Ｌｕｂｅ ｎ、Ｒ，およびＭｏｈｌｅｒｌｎ、＋　１９８０．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏ　＋　１７：６３５＋　Ｒｅａｄｉｎｇ、Ｃ，。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　＋　１２１　（部１）：１８．また はＶｏｓｓ、Ｂ、＋１９８６、ム馳優工±１１佳吐匡■１月！１　：　２１．あ る数の試験管内免疫系はヒトＢ細胞の免疫化に有効であることが示された。

Ｒｅａｄｉｎｇ、Ｃ，Ｊ、ｏｆ　Ｉｓｍｕｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５３　：　２ ６１　ｍ当業者に明らかなように、個体をＩ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆで直接免 疫化する代わりに、菌属症の発作を経験しているか、あるいは経験した個体から 分離しリンパ球を分離することができる。これらのリンパ球の分個をこれらの分 子に対して怒作し、そして永久的な抗体分泌ハイブリッド細胞系を産生ずるため に使用することができる。例えば、免疫無防備化ヒト患者、とくに種々の悪性疾 患、広範な熱傷などに悩む患者は一般にバクテリアの感染に感受性であり、そし てそれらから分離したリンパ球は抗体分泌細胞源であることができる。

Ｉ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆを免疫原として使用する代わりに、別のアプローチ はＩＬ−６またはＭ−Ｃ３Ｆペプチドを合成し、そしてこれらを免疫原として使 用することである。

例えば、Ｉ　Ｌ−６に結合する抗体の産生とくに有用なペプチドは日本国特許出 願第６２１０２１５７号に記載されている。ペプチドに対する抗体をつくる方法 はこの分野においてよく知られており、そして一般にペプチドを適当な担体分子 、例えば、血清アルブミンにカップリングすることを必要とする。ペプチドはこ の分野においてよく知られている技術、例えば、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２　： 　３４１　３４７（１９８５）に記載されているメリフィールドの固相法により つくることができる。この手順は商業的に入手可能な合成装置、例えば、バイオ サーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）９５００自動化ペプチド装置を使用することがで き、ブロッキングされたアミノ酸の切断はフッ化水素で達成され、そしてペプチ ドは調製用ＨＰＬＣによりウォーターズ・デルタ・ブレプ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅ ｌｔａ　Ｐｒｅｐ）　３０００計器を使用して、１５〜２０μｍのＶｙｄａｃ　 Ｃ４Ｐｒｅｐ　ＰＡＫカラムで精製する。いったん抗ペプチド抗体を分泌するク ローンが同定されると、抗体を結合およびＩ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆに対する 活性の中和についてスクリーニングすることができる。

Ｂ、ＩＬ−６Ｍ−Ｃ３Ｆ Ｉ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆに対する抗体は、ポリクローナル、モノクローナル 、またはそれから誘導された断片であることができる。抗体は好ましくはヒトま たはヒト化されたものであるが、ヒト以外の抗体は満足に機能するであろう。さ らに、Ｉ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆに対する抗体の抗体結合特異性を有する組み 換え構成体を産生ずることができる。

高い力価の中和甘いポリクローナル抗体の調製は、種々の種を免疫化し、そして いくつかの異なる免疫化の方法の１つを使用することによって実現することがで きる。本発明の好ましい方法は、完全フロインドアジュバント中で調製したＩ　 Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆで軸のリンパ節の中に注射することによって免疫化する ことである。引き続いて、動物を約２１日の間隔で不完全フロインドアジュバン ト中の多数の促進（もとの量の約１／２のＩ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆを含有す る）にかける。各２１日の間隔後約１０日に、２０〜３０ｍ１の血液を取り出し 、血清を分離し、そしてそれから抗体を分離する。この手順は数カ月の期間の間 実施することができる。

モノクローナル抗体は、前述したようにＩＬ−６，Ｍ−Ｃ３Ｆまたはこれらの分 子のペプチド／ペプチド接合体を使用して、そしてＫｏｈｌｅｒ、Ｇ、およびＭ ｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ。

２５６　：　４９５に記載されている手順、またはこの分野において知られてい るその変法を使用して産生ずることができる。下に記載するスクリーニングアッ セイを使用すると、産生ずる特異性を認識することができる。

前述のＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの初期の研究は、ネズミリンパ球お よび薬物選択性プラズマ細胞腫を融合してハイブリドーマを産生ずることを包含 した。引き続いて、この技術はヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド 細胞系の産生に応用されてきた。後者の手順は、一般に、Ａｂｒａｎ＋ｓ、　Ｐ 　＋　＋　１９８６＋Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　＋　皿：　１ ０７に記載されているが、地変法は当業者に知られている。ネズミまたはヒト抗 体のいずれを産生ずるかに無関係に、抗体を分泌する細胞を融合相手と組み合わ せ、そして細胞を適当な融合因子、好ましくはポリエチレングリコール、より好 ましくはポリエチレングリコール１０００と融合する。後者は抗体分泌細胞およ び少量の融合相手を含有する細胞ベレットに短い時間にわたっておだやかに撹拌 しながら添加する。融合因子の添加後、細胞混合物を洗浄して融合因子および細 胞破片を除去し、融合細胞および非融合細胞から成る細胞混合物を選択的成長培 地を含有する適当な細胞培養チャンバーの中に接種する。敗退の期間後、ハイプ リント細胞は明らかであり、そして抗体産生に関して同定し、そしてサブクロー ニングして、安定な細胞系の入手可能性を保証することができる。

好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体であり、これは生体内または試験管内で １６／Ｍ−Ｃ３Ｆで怒作したリンパ球から抗体産生ハイブリッド細胞系の永久分 裂能化により、これにより前述の細胞融合技術を使用して所望の抗体の永久的源 を入手可能とすることによって調製することができる。あるいは、怒作されたリ ンパ球は２つの技術、すなわち、ウィルスの形質転換および細胞融合の組み合わ せにより永久分裂能化することができる。好ましい組み合わせは、抗体分泌細胞 をニスバインバールウィルスで形質転換し、引き続いて形質転換された細胞を適 当な融合相手に融合することから成る。

このような融合相手はこの分野において知られており、そして相手の例はマウス 骨髄腫細胞系、異種骨髄種系、またはヒト骨髄腫系、または他の永久分裂能化細 胞系であることができる。ＰＣＴ特許出願第８１１００９５７号；　５ｃｈｌｏ ｎ＋ら、１９８０゜ＰＮＡＳ　［ＩＳＡ、　７７　：　６８４１　；　Ｃｒｏｃ ｅら、１９８０．　Ｎａｔｕｒｅ、　２８８　：　４８８゜好ましい融合相手は マウス−ヒト異種ハイブリッドであり、そしてＦ３Ｂ６と表示する細胞系はより 好ましい。この細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈ ｅＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受 け入れ番号）１８８７８５で受託された。それは１９８５年４月１８日に受託さ れた。

Ｆ３Ｂ６を発生する手順は欧州特許出願公開第１７４，２０４号に記載されてい る。

ニスパインバールウィルスの形質転換の使用および永久分裂能の抗体分泌細胞系 の産生に応用可能な技術は、Ｒｏｄｅｒ、　Ｊ。

ら、１９８６．取劫郵ｌ山ｕ１佳−扱■１月は：１４０に記載されている。基本 的には、この手順は適当な源、一般に感染した細胞系からニスパインバールウィ ルスを分離し、そして標的抗体を分泌する細胞をそのウィルスを含有する上澄み 液に暴露することから成る。細胞を洗浄し、そして適当な細胞培地の中で培養す る。引き続いて、細胞培養物の中に存在するウィルスで形質転換された細胞をニ スバインバールウィルスの核抗原の存在により同定することができ、そして形質 転換された抗体を分泌する細胞はこの分野において知られている標準の方法を使 用して同定することができる。

当業者にとって明らかなように、そして前述したように、本発明の好ましい実施 態様は【Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆを、単独でまたは組み合わせで、中和すること であり、そしてｌまたは２以上の抗体を変更することができ、そしてこれらの抗 体はなお生物学的活性に止まるすることができる。こうして、種々の大きさの断 片、例えば、Ｆ　（ａ　ｂ’　）ｚ、Ｆａ　ｂ。

Ｆｖなどに小さくすることによって修飾した抗体は本発明の範囲内に包含される 。また、抗体を産生ずるハイブリッド細胞系は所望の抗体をエンコードするＤＮ Ａ源であると考えるすることができ、このＤＮＡは既知の遺伝学的技術により細 胞に転移して、遺伝子操作された抗体を産生ずることができる。後者の１つの例 は、ここに記載するハイブリドーマの抗体結合部位を有する一本鎖の抗体の産生 であろう。一本積の抗体は米国特許第４，７０４，６９２号に記載されている。

遺伝子操作した抗体の第２の例は、組み換え、またはキメラ抗体である。組み換 え抗体を産生ずる方法は、米国特許第４、８１５．５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙら ；日本国特許出願第８４１６９３７０号、１９８４年８１５日提出、英国特許出 願第８４２２２３８号、１９８４年９３日提出；および日本国特許出願第８５２ ３９５４３号、１９８５年１０月２７日提出、に示されている。また、英国特許 出願第８６７６７９号、１９８６年３月２７日提出、は、変更された抗体を産生 ずる方法を記載しており、ここにおいて軽鎖または重鎮の可変ドメインにおける 相補的決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部分は異なる特異性の抗体からのＣＤ Ｒの類似の部分で置換されている。その中に記載されている手順を使用すると、 置換されたそのＣＤＲを有する第２種からの抗体上にグラフトされた１つの種の ＣＤ　ＲＮ域を有する組み換え抗体を構成することができる。

抗体、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの型に無関係に、抗体 をこの分野において知られているように、あるいはＳｐｒｉｎｇｅｒ、　１９８ ０．　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　１９４（Ｋｅｎｎｅ ｔｔ、　Ｔ、ＭｃＫｅａｒｎおよびに、Ｂｅｃｈｔｏｌｗｌ、Ｐｌｅｎｕｓ　Ｐ ｒｅｓｓ、　−１−ニーヨーク、に記載されているように、標準の技術により精 製することが望ましい。一般に、これは５０％の硫酸アンモニウム溶液を使用し て抗体を少なくとも１回硫酸アンモニウム沈澱させることから成る。抗体親和性 カラムを、また、使用することができる。

好ましいＩ　Ｌ−６抗体を８Ｍ７０と表示し、そしてそれを得る方法を実施例の 節において下に記載する。

Ｃ，ＩＬ−６Ｍ−Ｃ３Ｆ　のスクリーニングＩ　Ｌ−６またはＭ−ＣＳＦ抗体を 分泌する細胞系は、培養上澄み液、腹水などを抗体についてアッセイすることに よって同定できる。好ましいスクリーニング手順は２つの順次の工程から成る。

第１に、抗体を分泌するハイブリドーマを同定する；そして第２に、抗体を非対 称して、それが中和活性を示すかどうかを決定する。

培養上澄み液に適用するとき、初期のスクリーニング工程は好ましくはＲＩＡま たはＥＬ　Ｉ　ＳＡアンセイにより実施する。両者のアッセイはこの分野におい て知られており、そしてＩ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆを固体のマトリックスに結 合し、そして第２の標識した抗体により明らかにされるように、これらの分子に 結合する抗体についてアッセイすることから成る。ＥＬＩＳＡアッセイ法の記述 については、参照：　Ｌａｎｇｏｎｅ。

Ｊ、およびＶａｎ　Ｖｉｎａｋｉ＋ｌ’１．．１９８３＋　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏ ｆ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、　９２＋ｍｌ、およびＲＩＡアッセイについては、参 照、Ｍｉ　１１ｅｒら、１９８３、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ 　、　１２１　：　４３３部１．ペプチドを免疫原として使用する場合、初期の スクリーニング工程は固体のマトリックスに結合した接合体に抗体が結合かどう かを決定する。

Ｉ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ５Ｆ抗体についての追加のアッセイは、溶液からＩ　Ｌ −６またはＭ−Ｃ３Ｆを免疫沈澱させる抗体についてスクリーニングすることで ある。例えば、抗体の存在について試験している上澄み液を標識したｒ　Ｌ−６ またはＭ−Ｃ３Ｆとともに適当な時間の間インキュベーションして、抗原／抗体 複合体を形成させることができる。複合体を洗浄して未反応の試薬を除去し、そ して次に抗体の複合体をスクリーニングしているモノクローナル抗体に対して特 異性の抗ゼノタイプまたは抗アイソタイプの抗体とインキュベーションすること ができる。これらの抗ゼノタイブまたは抗アイソタイプ抗体を、例えば、プラス チンクビーズ上に固定化することができる。こうして、スクリーニングしている モノクローナル抗体が１　＞６抗体である場合、標識したＩＬ−６はビーズに間 接的に結合し、これにより免疫沈澱するであろう。次いで、ＩＬ−６抗体は、使 用した標識の性質に依存してこの分野において知られている適当な検出法により 定量することができる。また、’ｓｉを標準の技術によりビーズから解離し、そ してこの分野において知られているように、ゲル電気泳動により同定することが できる。

好ましい電気泳動の手順は、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　１９８１．　Ａｎａｌ、Ｂｉ ｏ。

Ｃｈｅｍ、、　１１２　：　１９５に記載されているようなウェスターンプロッ トゲル分析である。ウェスターンプロットをブロッキングし、洗浄し、そして好 ましくは１５０ミリモルの塩化ナトリウムを含有するＩＯミリモルのリン酸ナト リウム緩衝液（ｐＨ７，４）中で０．１％のウシ血清アルブミン（Ｗ／Ｖ）およ び０．１％のオハルプミン（Ｗ／Ｖ）でブロービングする。

さらに、洗浄剤、例えば、ツイーン（Ｔ匈ｅｅｎ）２０を約０．　１％の濃度で 使用する。アジ化ナトリウムを、また、溶液の中に０．０２％の濃度で含めるこ とができる。プロットは好ましくはまずハイブリドーマの培養上澄み液、または ＩＬ−６またはＭ−Ｃ３Ｆ抗体を含有する希腹水でブロービングし、洗浄し、次 いで抗体の結合をＩｔＪプロティンＡで約３０〜６０分開明らかにする。プロッ トを洗浄し、そしてＸ線フィルムを使用するオートラジオグラフィーにかける。

Ｉ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆ抗体のアッセイに要する時間を促進するために、い くつかの培養上澄み液を一緒にし、そして同時にアッセイすることができる。混 合物が陽性である場合、各ウェルからの培地を引き続いて独立にアッセイして抗 体の存在を確証することができる。

Ｉｌ、イムノアッセイ 他の実験において、本発明はセブシスの患者の予後を示すＩ　Ｌ−６および／ま たはＭ−Ｃ３Ｆのレベルを検出するために使用できるイムノアッセイに関する。

検出可能な濃度はｉｎｇ／ｍｌより小から約１μ／ｍｌのいずれらの分子の範囲 である。

本発明のイムノアッセイは、好ましくは、ここに記載する抗体を使用するサンド インチアッセイであるが、この分野において知られている他のアッセイのフォー マットを、また、使用することができる。

本発明のイムノアッセイの実施において、標識したＩＬ−６またはＭ−Ｃ３Ｆ抗 体を、未知濃度のこれらの分子を含有する患者からの流体試験試料とインキュベ ーションする。適当なインキュベーション期間を経過させて抗原−抗体の複合体 を形成させた後、この混合物を洗浄し、そしてＩＬ−６および／またはＭ−Ｃ３ Ｆ抗体と結合する抗体を結合させた固体のマトリックスを含有するインジケータ 溶液とインキュベーションし、そしてこのような抗体はモノクローナルまたはポ リクローナルであることができる。この第２抗体は、標識した抗体および／Ｉ　 Ｌ−６および／またはＭ−Ｃ３Ｆの間で抗原−抗体の複合体を形成させるために 十分な期間の間インキュベーションする。このインキュベーション後、固定化さ れた複合体を結合しない反応成分から分離し、そして固定化された抗体に結合し た標識の量を測定する。（参照、例えば、５ｈａｄｌｅら、１９８９．　Ｅｘ　 、Ｈｅｍａｔｏｌ、＋　１７　：　１５４）。

当業者は理解するように、Ｉ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆは異なる試料のアリコー トにおいて独立に測定することができるが、それらは、また、同一の流体におい て同時に測定することができる。それらを同時に測定する場合、前述と同一の一 般手順に従うことができ、そしてＩＬ−６およびＭ−Ｃ３Ｆの濃度を区別するこ とができる手段をさらに紐み込むことができる。このような手段はこの分野にお いてよく知られており、そしてＩ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆ抗体示差的に標識す ることから成る。

本発明において使用する抗体は、任意の適当な固体の試験支持体上に、任意の任 意の技術により固定化することができる。固体の試験支持体は抗体の結合および イムノアッセイのための任意の適当な不溶性担体物質であることができる。多数 のこのような物質はこの分野において知られており、次のものを包含するが、こ れらに限定されない：ニトロセルロースのシートまたはフィルター；アガロース 、樹脂、プラスチック（例えば、ＰＶＣまたはポリスチレン）ラテックス、また は金属ビーズ；プラスチック容器など、抗体を固定化する多数の方法はこの分野 において知られている。参照、例えば、Ｓｉｌｍａｎら、　１９６６、八ｎｎ、 Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　３５　：　８７３　；　Ｍｅｌｒｏｓｅ＋１９７ Ｌ　Ｒｅｖ、Ｐｕｒｅ　＆　Ａ　、Ｃｈｅｍ、＋　２１　：　８３　；Ｃｕａｔ ｒｅｃａａｓら、１９７１゜厘…」＝ル、　＋　２２゜このような方法は、共有 結合、直接吸着、物理的捕捉、およびタンパク質コーティングした表面への取り 付けを包含する。後者の方法において、表面をまず水不溶性タンパク質、例えば 、ゼイン、コラーゲン、フィブリノゲン、ケラチン、グルテリンなどでコーティ ングする。タンパク質コーティングした表面を抗体の水溶液と単に接触させ、そ してそれを乾燥させることによって、抗体を表面に取り付ける。

抗体を免疫反応性にままにし、しかも抗体を十分に固定化し、こうして抗体が洗 浄の間に結合した抗原を保持することができる、支持体および結合技術の任意の 組み合わせは本発明において使用することができる。好ましい固体の試験支持体 はプラスチックのビーズである。

前述したように、本発明のアッセイは標識した抗体を使用する。標識は、支持体 に結合したとき、抗体の検出を可能とする任意の型であることができる。一般に 、標識は、測定可能でありかつ試料の中に存在する標識の量に関係づけられるシ グナルを、直接または間接に生ずる。例えば、直接測定可能な生ワクチンは放射 線標識（例えば、１２５１，３５Ｓ。

１４Ｃなど）を包含する。好ましい直接に測定可能な生ワクチンは、抗体に接合 した酵素であり、これは適当な基質（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ １０−フェニレンジアミン）の存在下に色の反応を生成する。間接的に測定可能 な生ワクチンの１つの例は、ビオチニル化された抗体である。

この標識の存在は、それを標識したアビジン複合体を含有する溶液と接触させる ことによって測定され、ここでアビジンはビオチニル化抗体に結合するようにな る。次いで、アビジンとアソシエーションした標識を測定する。間接的標識の好 ましい例は、アビジンに接合した酵素を使用し、酵素が前述したように色の反応 を生成する、アビジン／ビオチン系である。

どの標識を選択しても、標識は測定することができかつ試料中の標識の量に関係 づけられるシグナルを生ずる。普通のシグナルは放射線のレベル（放射性同位元 素を使用するとき）、光学密度（例えば、酵素の色の反応を使用する）および蛍 光（蛍光性化合物を使用するとき）である。非放射性シグナル、例えば、酵素反 応により生成した光学密度（または色強度）を使用することは好ましい。適当な シグナルを生成することができる、多数の酵素／基質の組み合わせはイムノアッ セイ分野において知られている。参照、米国特許第４，３２３，６４７号および 米国特許第４，１９０，４９６号、それらの開示をここに引用によって加える。

ＩＩｌ、文１之工幻処１ ここに記載するＩ　Ｌ−６またはＭ−Ｃ３Ｆ抗体は、単独であるいは組み合わせ で、菌属症またはセプシスに悩むか、あるいはバクテリアの感染に関して危険な 状態にある宿主有機体を受動的に免疫化するために使用することができる。抗Ｉ Ｌ−６単独、抗Ｍ−Ｃ３Ｆ単独、あるいは好ましくは抗Ｉ　Ｌ−６および抗Ｍ− Ｃ３Ｆを投与する。処１は、一般に、抗体を非経口的に、好ましくは静脈内に投 与することから成る。投与量および投与の養生法は、抗体が治療的にまたは予防 的に投与されるかどうか、および患者の医学的履歴の関数であろう。典型的には 、投与される抗体の量／投与量は約０．１〜２５１１ｇ／ｋｇ体重の範囲であり 、好ましい投与量は約０．１〜１０　ｍｇ　／　ｋｇ患者体重である。非経口的 投与のために、抗体は製剤学的に許容されうる非経口的賦形剤と組み合わせた注 射可能な形態で配合されるであろう。このような賦形剤はこの分野においてよく 知られており、そして例あ水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液 、および少量のヒト血清アルブミンから成る溶液を包含する。賦形剤は等生性お よび抗体の安定性を維持する添加剤を少量でを含有することができる。このよう な溶液の調製は当業者の技量の範囲内である。典型的には、抗体はこのような賦 形剤中で約２〜８、Ｑｍｇ／ｍ１〜約１００Ｂ／ｍｌの濃縮で配合されるであろ う。

セプシスにおける主題のＩ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆ抗体の有効性は、いくつか の動物モデル系の１つにおいて実証することができる。好ましい動物モデル系は ヒヒであり、そしてＴａｙｌｏｒら、１９８７．　Ｊ、ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ 　Ｉｎｖ、＋　７９　：　９１８およびＴａｙｌｏｒら、１９８８．■基剣遅ｍ ｌｊ匝叱、並：２２７に記載されている。

簡単に述べると、これは致死投与量のＥ、ｃｏｌｉを注入することから成り、約 ４Ｘ１０１０有機体／ｋｇ体重を２時間の期間にわたって投与する。これは１６ 〜３２時間の範囲の期間に試験動物の１００％を殺すために十分である。動物を 経皮カテーテルを通して撓側皮静脈中でナトリウムベンドパルビタールで麻酔す る。動物は、また、経口的に挿管しそして右側を加熱パッド上にして配置する。

血液試料を後ろ足に無菌的にカニユーレ挿入して大腿静脈から取り出す。経皮カ テーテルを使用してＥ、ｃｏｌｉ有機体を注入する。血液試料を所望の時間間隔 で取り、そして白血球のへマドクリット、血小板レベル、およびフィブリノゲン についてアッセイする。さらに、平均の前身の動脈圧力（Ｍ　Ｓ　Ａ　Ｐ　）を トランスデユーサ−（Ｓｔｒａ−ｔｈａｍ　Ｐ２３０６＋　Ｐｏｒｔｅｒ）圧力 計でモニターすることができる。

これらのパラメーターの変化は致死投与量のバクテリアへの暴露に耐える患者の 能力の予後を示すことができる。

発明であると信じられるものを記述したが、次の実施例によって、本発明を説明 するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定しない。例えば、抗体の源、型、 または産生方法の変更；更なる標識および／またはシグナル；異なる材料および 形状の試験支持体；異なる固定化法を本発明の範囲を逸脱しないで使用すること ができる。

実施炎上 土上二６１’ｖ針づＬ辷ｐｚ遡生土上二６に牡」Ｅ辷しΣ乙九ｔ９逸Ｊ■Ｌ因１ 敦 Ａ、上山：」−コ←二慢Σ旦 Ｉ　Ｌ−６は、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、１９８Ｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ ｎ＋ｍｕｎｏｌｏ　。

１３９　：　４１１６に記載されているようにして調製した。別法はＥＰＣ特許 出願公開第２６Ｌ６２５号およびＰＣＴ特許出願国際公開第同８８１００２０６ 号に示されている。組み換えＭ−ＣＳＦは米国特許第４，８４７，２０１号に記 載されているように産生じた。

後者の特許はモノマーのＭ−Ｃ３Ｆの発現を記載しており、このＭ−Ｃ３Ｆは、 示されている哺乳動物の発現系において、自発的に組み換えかつリフオルディン グして、生物学的活性なＭ−Ｃ３Ｆ二量体を生ずる。好ましくは、自発的にリフ オルディングしたＭ−Ｃ３Ｆを使用する代わりに、モノマーをＰＣＴ特許出願国 際公開第一０８８１０８０３号に記載されているよにリフオルディングすること ができる。さらに、Ｍ−Ｃ３Ｆは米国特許第４．８６８．１１９号および米国特 許第４，８７９，２２７号に記載されている方法を使用して産生ずることができ る。

Ｂ、ごブｌ」メ１４１生 Ｉ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆの既知のアミノ酸配列に基づいて、ペプチドを合成 し、そして免疫原活性、Ｉ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆへの結合、およびこれらの 分子の生物学的活性の中和について試験する。ペプチドはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ 　Ｒ，Ｂ、＋　１９８５＋鎖ム９％３２　：　３４１−３４７に詳細に記載され ている、固相法を使用して、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）　９５００自 動化ペプチド装置で合成し、フッ化水素で切断し、そして調製用ＨＰＬＣにより ウォーターズ・デルタ・ブレブ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐｒｅｐ）３００ ０計器を使用して１５〜２０μｍのＶｙｄａｃ　Ｃ４ＰｒｅｐＰＡＫカラムで精 製することができる。Ｉ　Ｌ−６に対する抗体を産生ずる好ましいペプチドは、 日本国特許第６２１０２１５７号に記載されており、そしてアミノ酸配列：　Ｐ ｒｏ　−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒ。

−Ｇｌｙ　−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ　−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ　−Ｖａｌ　− Ａｌａ　−Ａｌａを有する。

使用できるＭ−Ｃ５Ｆペプチドは、成熟分子のアミノ酸４−１５０から取ったも のである。すなわち、リーダー配列を欠如するＭ−Ｃ３Ｆ、ペプチドの例は次の ものを包含する：Ｔｈｒ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ　−Ａｌａ　−Ａｌａ　 −Ｇｌｙ　−Ａｒｇ　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ、およびＭｅｔ 　−１１ｅ　−Ｇｌｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ　−Ｈｌｓ　−Ｌｅｕ　−Ｃ１ｎ　 −Ｓｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｎ−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ−１１ｅ　−Ａｓｐ　−Ｓｅ ｒ。

ペプチドを使用して抗体をつくる前に、それらを適当な担体分子に接合して、抗 体の応答を誘発する。これらの手順は米国特許第４，７６２，７０６号、ＭｃＣ ｏｒｍｉｃｋら、に記載されている。

適当な担体はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）である。この接合は、必要に応じてペプチドのアミノまたはカ ルボキシル末端に付加したシスティン残基を経て達成される。ヘテロ２官能性架 橋試薬、１−ヒドロキシ−２−ニトロ−ベンゼン−４−スルホン酸ナトリウム塩 のＮ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステルを、次の手順を使用して調製 する。

１モル当１　（２，２４ｇ）の４−ヒドロキシ−３−ニトロ−ベンゼン−４−ス ルホン酸ナトリウム塩（ＨＮＳＡ）を、２５ｍ１のジメチルホルムアミド（ＤＭ Ｆ）中の１モル当量（２，０６ｇ）のジシクロへキシルカーポジイミドおよび１ モル当量（２，ｌ　Ｏｇ）のＮ−マレイミド−６−アミノカプロン酸と室温にお いて一夜一緒に混合する。ジシクロヘキシル尿素の重量沈澱が形成する。沈澱を 濾過し、そして３００ｍ１のジエチルエーテルを母液に添加する。約１０分〜４ 時間後、母液から沈澱したガム状固体が形成する。この固体は５８％の活性ＨＮ ＳＡエステルおよび４２％の遊離ＨＮＳＡを含有する。

この分析は少量の沈澱をリン酸塩緩衝液ｐＨ７，０中に溶解し、そして４０６ｎ ｍにおける吸収を測定することから成る；この読みはＨＮＳＡエステルの調製物 の中の汚染物質である未反応の遊ＭＨＮＳＡの量を提供する。非常に少量の濃強 塩基（例えば、５ＮのＮａ０Ｈ）を添加すると、形成したエステルは瞬間的に加 水分解し、そして第２の読みを取る。第１の読みを第２の読みから減すると、も との物質中のエステルの量が生ずる。次いで、固体をＤＭＦ中に溶解し、そして ＬＨ２０セファデンクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム上に配置し、そしてＤＭＦ で溶離し、こうして汚染する遊＃ＨＮＳＡからエステルを分離する。精製の進行 を薄層クロマトグラフィーによ／）モ：−ターＬ、クロロホルム、アセトンおよ び酢酸（６：３：１）の溶離溶媒を使用する。産生物はｍａ　ｌ−ｓ　ａ　ｃＨ ＮＳＡとしてアミンとのその反応性により積極的に同定される。純粋なエステル の収率は理論値のほぼ３０％であると推定される；精製した物質は９９％のエス テルから成る。

こうして得られるエステルは水の中に完全に溶解することが発見され、そして親 核物質を添加しないかぎり、数時間水の中で安定である。ＩＮアモニアの中に入 れると、エステルは一部分が遊離酸に加水分解した対応するアミドを生成する。

精製したエステルは、乾燥して貯蔵するとき、延長した期間の間安定であること が発見された。

約０．５ｍｇの精製したｍａ　ｌ−ｓ　ａ　ｃＨＮＳＡエステルを１ｍｌの蒸留 水中に溶解する。この溶液の１０μｌのアリコートを１ｍｌの１０ミリモルのリ ン酸塩緩衝液ｐＨ７，０の中に希釈する。４０６０…における吸収を前述したよ うに使用して、遊離ＨＮＳＡの濃度を計算する。５０μｌの４．８Ｎ水酸化ナト リウム溶液をエステルの希釈したアリコートに添加しそして混合すると、４０６ ｒ＋ｍにおけるこの溶液の吸収は有意に増加し、水酸化物の親核物質はエステル を急速に成分の酸および遊離ＨＮＳＡアニオンに加水分解することを示す。

後の塩基および初期の遊離ＨＮＳＡの濃度の間の差はエステルの濃度を表す。エ ステルおよびタンパク質のアミノ基の実際の濃度から、所望の程度の置換を達成 するためにタンパク質溶液に添加するエステルの量を計算することができる。

次いで、精製されたＨＮＳＡエステルをＢＳＡと次のようにして反応させる（Ｋ ＬＨとの反応はこの手順に類似する）二合計２２ｍｇ（２０μモル）のＢＳＡ（ 分子量６６．２９６）を２．０ｍｌの０．１モルのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５中 に溶解して、１．０Ｘ１０−”モル／ｌの合計アミン濃度を生成する（５９リジ ン／ＢＳＡ分子を仮定する）。計算量（ｌ１ｍｇ。

２．３５Ｘ１０−５モル）の粉末の形態の上で調製したｍａｌ−ｓ　ａ　ｃＨＮ ｓＡエステル（９７，７％）を２．０ｍｌのＢＳＡ溶液中に溶解する。この反応 は室温において実施する。１０μｌのアリコートを溶液からタイミングした間隔 で取り出し、そして各々を１．０ｍｌの０．０１モルのリン酸塩緩衝液ｐＨ７， ０の中に希釈する。各希釈したアリコートのスペクトルをヘラレット−バーカー ド（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）分光光度計で記録し、そして４０６ｎｍ における吸収を測定する。次いで合計５０μｌの４．８ＮのＮａＯＨを各アリコ ートに添加し、各アリコートを混合し、そしてそのスペクトルを再び取り、そし て４０６ｎｍにおける吸収を測定する。

塩基の添加の前後の４０６ｎｍにおける吸収から、残のエステルの濃度および反 応するエステルの％を反応混合物について決定する。結果は反応速度が１５分の 期間にわたって本質的に直線であることを示す。

１５分の反応時間後、０．１モルのリン酸塩緩衝液ＰＨ６，０と平衡化したＰＤ ＩＯ脱塩セファデックスＧ−２５カラム（Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ、　Ｉｎｃ、） に反応混合物を適用することによって、反応を停止させる。２．６Ｘ１０−”モ ル／ｌのエステルが反応し、こうしてＢＳＡの５９ニブシロン−アミノ基の２５ ．９％が多分置換されたことが発見された。こうして、生成物は１６ｍａ　１− ｓ　ａ　ｃ基／分子を含有する。

第１反応の生成物、ｍａ　ｌ−ｓ　ａ　ｃ−ＢＳＡ　（またはｍａｌ−ｓａｃ− ＫＬＨ）は、０．１モルのリン酸塩緩衝液ｐｕｓ、。

と平衡化したＰＤ１０脱塩セファデックスＧ−２５カラムに反応混合物を通用す ることによって分離する。このカラムを０．１モルのリン酸塩緩衝液で１．０１ 分画で溶離する。吸収スペクトルをモニターすることによってカラムの溶離を追 跡し、そしてｍａ　１−ｓ　ａ　ｃＢＳＡを含有するピークの分画をプールする 。

前述したように合成したペプチドを添加し、そしてプールした混合物を室温にお いて一夜撹拌する。接合体を蒸留水に対して広範に透析し、凍結乾燥し、そしで ある場合において、アミノ酸組成の変化について分析する。これらのペプチド接 合体は、動物を免疫化するために使用するか、あるいは試験管内で凍結乾燥して 所望の抗体を産生ずることができる。

災施炎旦 ＴＬ−６Ｍ−Ｃ３Ｆまたはペプチドの　、の　ヒおよびハイブリドーマの　生 Ａ、ネズミのモノクローナル 免疫化したリンパ球を分離しそしてネズミのハイブリドーマを産生ずることを目 的として、Ｍ−Ｃ３Ｆをマウスを免疫化することを下に記載する。この手順は、 また、Ｉ　Ｌ−６に対する抗体の発生に適用可能である。さらに理解されるよう に、前述したように、この手順を使用してＭ−Ｃ３Ｆ、またはＩ　Ｌ−６、また はＭ−Ｃ３Ｆペプチドに対する抗体を産生じ、合成し、そして接合することがで きる。

−ｉに、次の参考文献に記載されている手順をハイブリドーマの発生に使用する 。Ｓｈｕｌｍａｎら、１９７８．　Ｎａｔｕｒｅ、　２７６　：２６９　；　Ｏ ｉら、シカ二匡虹据田曖鉦」１工蛙ガ力顛」斐可刀Ａ訂・ｐ。

３５ＨＭｉｓｃｈｅｌｌ　＆　Ｓｃｈｌｉｇｉｉ、１９８０）。　Ｆｏｕｎｇら 、１９８３．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９　：　７４８４゜さらに参考文献 は、次のものを包含する：　Ｇｅｒｈａｒｄら、１９７８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

７５　：　１５１０　；　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（Ｒ ，Ｋｅｎｎｅｔｔ、　Ｔ、ＭｃＫｅａｒｎ。

およびに、Ｂｅｃｈｔｏｌｍ、１９８０）　；　５ｃｈｒｅｉｅｒら、１９８０ ．　ｎ函士反Ｅｎ軌虹基競；ム皿虱匹国」坦ぷ優力±ｌ佳ユ副蛙り旺ヒＵ竺妊（ Ｇ、）ｌａｍｍｅｒｌｉｎｇ、　Ｕ、ＨａＩＩ＋ｍｅｒｌｉｎｇ、およびＪ、に ｅｒｎｅｙＷ、１９８１）　；Ｋｏｚｂｏｒら、１９８２．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９　：　６６５１　；　Ｊｏｎａｋら、１ ９８３＋　ｂオ山垣駐＋　２　：　１２４　；　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　（Ｒ， Ｋｅｎｎｅｔｔ、　Ｋ、Ｂｅｃｈｔｏｌ＋　およびＴ、ＭｃＫｅａｒｎＷａ、１ ９８３）　；　Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　Ｔｏｄａ　。

土：　７２−７９　；　Ｓｈｕｌｍａｎら、１９８２．　Ｎａｔｕｒｅ、　２７ ６　：　２６９−２７０　；Ｏｌら、頌士狙印士五鮭担蔗とＩ」≧且且Ｊａｒセ ｌ並剋旦Ｕ、　ｐ、３５１−３７１（Ｂ、Ｍｉｓｃｈｅｌｌ　＆　Ｓ、Ｓｃｈｉ ｉｇｉｇ、１９８０）　。　Ｆｏｕｎｇら、１９８３゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９　：　７４８４−７４８８゜Ｂａ１ｂ／ｃマウ スを組み換えＭ−Ｃ３Ｆ　（ｒＭ−Ｃ３Ｆ）で免疫化した。免疫化は完全フロイ ンドアジュバント中の４０μｇのｒ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆの予備的腹腔内免疫化、次 いで各々２０μｇのｒＭ−Ｃ３Ｆから成る、完全フロインドアジュバントを使用 しない、２回の引き続く腹腔内注射から成る。

２０μｇから成る最初の免疫化を予備的免疫化後約３週に添加し、そして第２０ μｇの促進剤を約１週後に投与した。第２の２０ｕｇの促進後約５．５週後、１ ０ｕｇのｒＭ−ＣＳＦの静脈内投与から成る最後の免疫化を実施した。３日後、 免疫化したマウスからの肺臓を取り出し、そして肺臓細胞ネズミ骨髄腫細胞系に 対して融合した。

使用した融合手順は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５．Ｎａｔ ｕｒｅ。

２５６　：　４９５に記載され、Ｆｅｎｄｌｙら、ｎ烟山泣懸、６　：　３５９ （１９８７）により変更された手順である。簡単に述べると、マウスを殺し、肺 臓細胞を免疫化された肺臓から砕片にし、そして血清不含ダルベツコ変性イーグ ル培地中で洗浄した。同様に、ＳＰ”／○Ａｇ１４骨髄腫細胞を洗浄し、そして ５：１の肺臓細胞／骨髄腫細胞の比で牌Ｗ＆細胞と組み合わせた。細胞混合物を 沈澱し、培地を取り出し、そして室温において６０秒にわたって滴々添加するこ とによってポリエチレングリコール１５００の４０％（Ｖ／Ｖ）の１．　０ｍｌ を添加し、次いで３７°Ｃにおいて６０秒間インキュベーションすることによっ て、融合を実施した。細胞懸濁液におだやかに撹拌しながら、９１のダルベツコ 変性イーグル培地を５分かけて添加した。

混合物中の細胞の塊をおだやかに再懸濁し、細胞を洗浄して残留するＰＥＧを除 去し、そして２０％の胎児仔ウシ血清を補充したダルベツコ変性イーグル培地中 で２Ｘ１０５細胞／ウエルでプレイティングした。２４時間後、細胞にハイポキ サンチンおよびアザセリン選択培地の２×溶液を供給した。

細胞を１４日８ウエルに相当する合計１５．５マイクロタイタープレート中でプ レイティングした。約２．４週後、６８４ウエルはす（れた細胞の成長を示し、 そしてこれらをＭ−Ｃ３Ｆに対する抗体についてスクリーニングした。いくつか の中和性抗体、例えば、ハイブリドーマ３８２−５Ｈ４゜３８２−３Ｆ１、およ び３Ｂ２−４８５またはそれらのサブクローンが同定された。これらの抗体は標 準の方法を使用して精製し、そしてセプシスの処置のために下で使用することが できる。

好ましいＩ　Ｌ−６抗体、８Ｍ７０、は、次の差をもっＭ−Ｃ３Ｆ抗体を発生す る手順を本質的に使用して発生させた。

組み換えＩ　Ｌ−６抗体を免疫原として使用し、そしてそれをＢｒａｋｅｎｈｏ ｆ　ｆら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆユ〃胡」旦江、　１９８７＋　νｏ１．１３９ ．　ｐ−４１１６に記載されている手順を使用して産生した。８つの別々の融合 を実施し、次いでＲＩＡスクリーニング技術を使用して抗体を同定した。標準の 生化学的方法を使用して、それは約１０−”のＫｄを有することが決定された。

ハイブリドーマ細胞系、８Ｍ７０、また、ＣＬＢ−Ｉ　Ｌ−６−８と呼ぶ、を、 ２％の胎児仔ウシ血清、５０μモルの２−メルカプトエタノール、およびペニシ リンおよびストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ中で１リツトルのローラーび ん内で培養した。細胞を約１０８／■ｌの密度に成長させ、そして１週後、上澄 み液を集め、そして中空繊維の装置を使用して濃縮した。プロティンＡのカラム （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製するために、固体のＮａＣ１を濃縮物に３モルの 最終濃度に添加した。この溶液を３モルのＮａＣ１および１．５モルのグリシン から成る溶液で１：１に希釈した。プロティンＡのカラムを後者の緩衝液と平衡 化し、そして濃縮物をカラムに添加し、カラムを洗浄し、そして抗体をカラムで １００ミリモルのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，０で溶離した。抗体を含有 するピークをプールし、リン酸塩緩衝化生理食塩水に対して透析し、そして使用 するまで貯蔵した。

Ｂ、ヒトハイプリドーマ　ヒトモノクローナル末梢血液リンパ球をセブシスの患 者から分離し、次いでニスパインバールウィルスを感染させ、そして感染したリ ンパ球を選択可能な骨髄腫細胞系への融合により永久分裂能をもたせ、そしてそ のように発生したハイブリッド細胞系を分離し、そして抗体産生に関して特性決 定する。さらに詳しくは、単核細胞をフィコール−ハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ− ｈｙｐａｑｕｅ）　（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ）で分離し、そしてプラスチックへ の付着により単核細胞を消耗させる。標準の実験室の技術を使用してこれらの手 順を実施する。次に、付着しない細胞を抗原特異的パニング（ｐａｎｎｉｎｇ） により抗体量生体について濃縮する。パニングは−ｇにこの分野において知られ ている技術であり、そして適当な抗原、この場合においてＩＬ−６，Ｍ−Ｃ３Ｆ またはこれらの分子から誘導され、そして実施例■に記載されているように産生 じた、ペプチドの免疫原でコーティングしたプラスチック表面上で抗体分泌細胞 の集団のインキュベーションを包含する。それらの表面上で抗体を発現する細胞 を抗原を結合し、結局プラスチック表面に付着するが、細胞表面の抗体を発現し ない細胞は付着せず、そして洗浄により除去することができる。こうして、特定 の抗体分泌細胞はこの技術により濃縮される。

さらに詳しくは、６ウエルのプレート（Ｃｏｓ　ｔａｒ）をリン酸塩緩衝液中の １〜２０μｇのＩＬ−６，Ｍ−Ｃ３Ｆまたはペプチドの免疫原／ウェルで４°Ｃ において一夜コーティングする。

−夜のインキュベーション期間後、１％のウシ血清アルブミンを含有するリン酸 塩緩衝液でウェルを４°Ｃにおいて少なくとも１時間ブロッキングし、引き続い てリン酸塩緩衝液／ＢＳＡで洗浄する。次に、１ｍｌのリン酸塩緩衝液／ＢＳＡ 中の１０７リンパ球を６ウエルのプレートの各ウェルに添加する。リンパ球をプ レート上で７０分間インキュベーションし、次いで非付着物を吸引により除去す る。付着性細胞を１０％の胎児仔ウシ血清を含有する細胞培地（ＩＭＤＭ、　Ｓ ｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、ミゾリー州セントルイス）とインキュベー ションする。

付着性細胞は、成長するニスパインバールウィルス感染したキヌザルの細胞系、 Ｂ９５−８、または同様な細胞から得られ、こうしてそのウィルスを含有する、 培地の等しい量を、付着性細胞のを含有する培地に、添加することによって、ニ スパインバールウィルスで形質転換する。細胞をこの環境において３７°Ｃで３ 時間培養し、このようにして、付着性細胞の集団中のリンパ球をニスパインバー ルで感染させる。感染期間後、細胞を洗浄し、そして９６ウエルのマイクロタイ タープレート上に１０％の胎児仔ウシ血清および２０％のコンディショニングし た培地を有するＩＭＤＭ培地中で約１０４〜１０５細胞／ウエルの密度にプレイ ティングする。後者はリンパ芽球細胞系、好ましくはＪＷ５、から誘導する。こ の培地は、また、５Ｘ１０−’モルの２−メルカプトエタノール、５０１ｇ／ｍ ｌのゲンタマイシンサルフェート（Ｓｉｇｎ＋ａ）および６００ｎｇ／１Ｉｌｌ のシクロスポリンＡ　（ＳａｎｄｉＩＩＩｍｕｎｅ、　５ａｎｄｏｚ、スイス国 ハーゼル）を含有する。

約１４〜２１日間インキユヘーシゴンした後、細胞培養の上澄み液を一緒にし、 そして後述するように所望の抗体結合活性についてスクリーニングする。陽性の ハイブリドーマを　゛低い密度で継代培養し、活性について再試験し、そして成 長させ、そしてポリエチレングリコールおよびこの分野において知られているプ レート融合技術を使用して、細胞系Ｆ３Ｂ６に融合する。後者の技術は、Ｌａｒ ｒｉｃｋ、Ｊ、Ｗ、、　１９８５．　ｄｒｉｄｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｅ、Ｇ、Ｅｎｇｌｅ＋＋ａｎ、　Ｓ、に、 Ｈ。

Ｆｏｕｎｇ、　Ｊ、Ｗ、、Ｌａｒｒｉｃｋ、およびＡ、Ａ、Ｒａｕｂｉ　ｔｓｃ ｈｅｋ［、ＰｌｅｎｕｉＰｒｅｓｓ、　ニューヨーク、ｐ、４４６に記載されて いる。Ｆ３Ｂ６は、１００μモルのハイポキサンチン、５μｇ／ｍｌのアザセリ ンおよび５μモルのオウアバインを含有する培地中の成長に対する感受性である 異種骨髄腫細胞系である。それはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ）に受け入れ番号ＨＢ８７３５で受託されている。最後に、生ずるハイブリッ ドを再びスクリーニングして、それらが所望の抗体を産生ずることを確認する。

ヒトのセプシスのモデル系におけるＩ　Ｌ−６抗体、８Ｍ７０、の有効性を、本 質的にＴａｙｌｅｒら、１９８７．　Ｊ、ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖ、。

７９　：　９１８およびＴａｙｌｅｒら、１９８８＋　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｒ　 ５ｈｏｃｋ、　２６：２２７に記載されているように試験した。簡単、に述べる と、これは、第１に、致死投与量および致死下の投与量のＥ、ｃｏｌｉに応答す るヒト血漿中のＩＬ−６レベルを測定し、そして第２に、死亡を防止するか、あ るいはセプシスの動物の生存を延長することによってセブシスの処置において有 効であるＩＬ−６抗体を決定することから成っていた。Ｅ、ｃｏｌｔの致死投与 量および致死下の投与量は、それぞれ、はぼ４Ｘ１０’°および０．４Ｘ１０１ ０の有機体から成っていた。

第１図が示すように、致死投与量のＥ、ｃｏｌｉの投与後、ＩＬ−６レベルは１ 時間後増加し始め、そのときそれは約１　、５００μｇ／＋１であり、そして少 なくとも６時間まで約９．ＯＯＯｐｇ／ｍｌに増加し続ける。対照的に、第１図 が、また、が示すように、致死下の投与量のＥ、ｃｏｌｉの投与後、Ｉ　Ｌ−６ の感知しうる増加はほとんど存在しない。致死投与量のＥ、ｃｏｌｉを与えたヒ トは１６〜３２時間以内に必ず死亡する。７ａｙｌｅｒら、１９８７、　Ｊ、ｏ ｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖ、、　７９　：　９１８およびＴａｙｌｅｒら、 １９８８゜Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｒ　５ｈｏｃｋ、　２６　：　２２７゜ヒトの死 亡を防止するか、あるいはヒトの寿命を延長するときのＩ　Ｌ−６モノクローナ ル抗体、８Ｍ７０、の有効性を、２つの投与のルーチンを使用して試験し、ここ で抗体は生理的塩類溶液の形態で供給した。第１に、５．９ｍｇの抗体／ｋｇ体 重を３つの別々の投与で、バクテリアの致死対抗前の２４゜２２および２１時間 に、投与した。あるいは、５．０ｍｇの抗体／ｋｇ体重を単一の投与でバクテリ アの対抗と同時に投与した。第２図が示すように、両者の場合において、ＩＬ− ６モノクローナル抗体は、抗体の複数または単一の投与を受けたヒトの寿命をか なり延長し、そしてヒトは、それぞれ、４８および６０時間の間生存した。ここ で、致死投与量のＥ、ｃｏｌｉを与えられるヒトは１６〜３２時間以内に必ず死 亡することを思い起こすべきである。

第３図は、白血球（ＷＢＣ）へマドクリット（ＨＣＴ）、血小板（Ｆｌａｔ）お よびフィブリノゲン（Ｆｉｂｒ）のレベル、および平均の前身の動脈圧（ＭＳＡ Ｐ）を包含する種々の生理学的パラメーターへの、致死投与量のバクテリアと同 時に与えたＩ　Ｌ−６抗体の効果を示す。ＭＳＡＰの減少の程度は対照動物につ いて観測されたそれの約１／２であり、こうしてＩＬ−６抗体の寿命延長活性を 反映することができる。

ス１１汁肥 セフ゛シスの几１のためのＭ−Ｃ５Ｆ セブシスの処置のためのＭ−Ｃ３Ｆ抗体の作用は、第１に、致死投与量のＥ、ｃ ｏｌｉを投与したヒトにおけるＭ−Ｃ３Ｆのレベルを測定し、そして第２に、Ｍ −Ｃ３Ｆの増加をブロッキングまたは減少して、抗体が死亡を防止するか、ある いは動物の寿命を延長することを示すことによって、決定することができる。ヒ トの前の実施例に記載するようにＥ　ｃｏｌｉを投与し、そしてＭ−Ｃ３Ｆを米 国特許第４，８４７，２０１号またはＨａｌｅ−ｎｂｅｃｋ　ら、Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８Ｂ、　Ｖｏｌ、８＋　ｐ、４５ に記載されているようにＲＩＡアンセイを使用して測定した。

第４図は、致死投与量のＥ、ｃｏｌｉで処置したヒトにおけるＭ−Ｃ３Ｆのレベ ルを示す。Ｍ−Ｃ３Ｆは１．３時間後約２５ｎｇ／ｓｌであり、そして４時間復 仇体６０ｎｇ／ａ＋１に増加した。

■ｌに低下した。

Ｍ−Ｃ３Ｆ抗体の有効性は、前の実施例に記載されているように、バクテリアの 前にまたはそれと同時に抗体を投与することによって実証されるであろう。５． ０〜１５ｍｇ／ｋｇ。

好ましくは１５ｍｇ／ｋｇ動物体重の投与量は、バクテリアと同時に投与すると き、処置した動物の寿命の延長に有効であろう。しかしながら、理解されるよう に、完全に保護的な投与の養生法は当業者により実験的に決定することができ、 そして抗体の複数の投与から成ることができる。

実施１− Ｉ　Ｌ−６および　たはＭ−Ｃ５Ｆに・　る　るヒトにおけるセプシスの几Ｉ Ｉ　Ｌ−６およびＭ−Ｃ３Ｆ抗体に対する精製した８Ｍ７０抗体（すなわち、ハ イプリドーマ３８２−５Ｈ４，３８２−４８５またはそれらのサブクローンによ り分泌された抗体）を、単独で、組み合わせせ、または順次に、セプシスの治療 的または予防的処置のためにヒトの患者に投与する。予防的には、投与量は外科 の直前に与えられ、そしてそのご少な（とも１回反復されるであろう。治療的に は、投与量は、病気の緩解が明らかになるまで、２４〜４８時間毎に与えられる であろう。初期の治療的投与量は５〜１５ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、次いで５ 〜ｂ 上の種々の実施態様は、次の請求の範囲にに記載されている、本発明の範囲を逸 脱しないで、当業者とって明らかであろう。

ＩＬ６　（ＰＧ／ＭＬ） Ｃ４ 峙 基線の％ Ｍ−ＣＳＦ　（ｎｇ／ｍｌ） 要　約　書 抗体が単独で又は組合して投与される、ＩＬ−６及び／又はＭ−Ｃ３Ｆに対する 抗体から成るセブシスを予防的又は治療的に処理するための組成物及び方法。

手続補正書（方式） 平成４年１月７日

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．有効量のＩＬ−６抗体およびＭ−ＣＳＦ抗体からなる組成物を有機体に投与 することからなる、有機体におけるセプシスを処置する方法。
2. ２．前記ＩＬ−６に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、 一本鎖抗体、二重特異的抗体または組み換え抗体から成る群より選択される、請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記Ｍ−ＣＳＦに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体 、一本鎖抗体、二重特異的抗体または組み換え抗体から成る群より選択される、 請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記ＩＬ−６に対する抗体はモノクローナル抗体からなる、請求の範囲第２ 項記載の方法。
5. ５．前記Ｍ−ＣＳＦに対する抗体はモノクローナル抗体からなる、請求の範囲第 ３項記載の方法。
6. ６．前記ＩＬ−６抗体はヒトまたはヒト化抗体からなる、請求の範囲第４項記載 の方法。
7. ７．前記Ｍ−ＣＳＦ抗体はヒトまたはヒト化抗体からなる、請求の範囲第５項記 載の方法。
8. ８．有効量のＩＬ−６抗体を有機体に投与することからなる、有機体におけるセ プシスを処直する方法。
9. ９．前記ＩＬ−６に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、 一本鎖抗体、二重特異的抗体または組み換え抗体から成る群より選択される、請 求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．前記ＩＬ−６に対する抗体はモノクローナル抗体からなる、請求の範囲第 ９項記載の方法。
11. １１．前記１Ｌ−６抗体はヒトまたはヒト化抗体からなる、請求の範囲第１０項 記載の方法。
12. １２．有効量のＭ−ＣＳＦ抗体を有機体に投与することからなる、有機体におけ るセプシスを処置する方法。
13. １３．前記Ｍ−ＣＳＦに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗 体、一本鎖抗体、二重特異的抗体または組み換え抗体から成る群より選択される 、請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．前記Ｍ−ＣＳＦに対する抗体はモノクローナル抗体からなる、請求の範囲 第１３項記載の方法。
15. １５．前記Ｍ−ＣＳＦ抗体はヒトまたはヒト化抗体からなる、請求の範囲第１４ 項記載の方法。
16. １６．有効量のＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６に対する抗体からなる、セプシスの予 防的または治療的処置に有用な組成物。
17. １７．前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、二 重特異的抗体または組み換え抗体から成る群より選択される、請求の範囲第１６ 項記載の組成物。
18. １８．前記抗体はポリクローナル抗体からなる、請求の範囲第１７項記載の組成 物。
19. １９．前記抗体はモノクローナル抗体からなる、請求の範囲第１７項記載の組成 物。