JPH04120025A

JPH04120025A - インターロイキン―６の作用増強剤

Info

Publication number: JPH04120025A
Application number: JP2235872A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Mihara; 昌彦三原; Yasuo Koishihara; 保夫小石原; Hiroyasu Fukui; 福井　博泰
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Tosoh Corp
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Tosoh Corp
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1990-09-07
Publication date: 1992-04-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はインターロイキン−６（・以下ｒＩＬ−６４と
略す）の作用増強剤に関するものである。

〔従来の技術〕

ＩＬ−６は、活性化Ｂ細胞に対して、増殖を促すことな
く抗体産生細胞への分化を誘導する液性因子として見出
された（Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ、＾、ら、Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　１６７、３３２．１９８８　）　、このＩＬ
−６は、１８４個のアミノ酸残基から構成されているポ
リペプチドであることが明らかにされている０！１ｒａ
ｎｏ、　Ｔ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４．７３．１９８
６）。

そして、このＩＬ−６は、様々な細胞から産生され、多
彩な生理活性を有していることが報告されている。その
代表的例として外来抗原に対する免疫反応を増強するこ
と（Ｔａｋａｔｓｕｋｉ、　Ｆ、ら、Ｔ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、。

１４１、３０７２．１９８８　）が報告されており、様
々な疾患の治療の可能性が知られている。

一方、このＩＬ−６に対して特異性を示す抗ＩＬ−６抗
体についての報告もなされており（例えば、特開平？−
４８８号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＣｏｌＩｎｌ１
ｕｎｉｃａｔｉｏｎ、　１６５＋７２８７３４、１９８
９等）、検査用試薬、分離精製用として、またはいくつ
かの疾病治療への利用が期待されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これ迄に報告されている研究成果はいず
れも試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での研究にとどまっ
ており、ＩＬ−６の様々な作用に関し、抗−ＩＬ−６抗
体の生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）における影響についての
報告は少ない。本発明者は、ＩＬ−６の作用に対し、抗
−ＩＬ−６抗体の注射が及ぼす影響を検討した結果、あ
る種の抗−ＩＬ−６抗体がＩＬ−６の作用を増強させる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

従って、本発明はＩＬ−６の作用の増強剤を提供しよう
とするものである。

〔発明の詳細な説明］すなわち本発明は、抗−ＩＬ−６抗体を有効成分として
含有するＩＬ−６の作用増強剤に関するものであり、Ｉ
Ｌ−６を生体に投与する際、ある種の抗ＩＬ−６抗体を
投与することによってＩＬ−６の生理活性を発現し、又
は更に増強することができるとの知見に基づくものであ
る。ある種の抗−ＩＬ６抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験
において、ＩＬ−６活性、例えばＩＬ−６に依存して生
育するハイプリドーマＭＨ６０の３Ｈ−チミジンの取り
込みを抑制するが、ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の結
合に対する抑制作用は不完全であり、またあるものは当
該抑制作用を示さない。この様な特性を有する抗−ＩＬ
−６抗体が、本発明に好適に用いられるものと考えられ
る。その作用増強機構は必ずしも明らかではないが、抗
−ＩＬ−６抗体が、生体におけるＩＬ−６の血中半減期
を延長させることに起因しているとも思われる。

本発明における抗−ＩＬ−６抗体は、ＩＬ、−６を特異
的に認識するものであり、これにはポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体が含まれる。即ち、本発明の抗
−ＩＬ−６抗体としては、例えば同種動物間又は異種動
物間で免疫して得られたポリクローナル抗体、さらには
ハイブリドーマ技術に従って得られたモノクローナル抗
体を用いることができる。ヒトに対して臨床的に用いる
場合は、抗原性、抗体の免疫活性からみてヒト由来の抗
体が好ましいが、ヒト以外の動物由来の抗体のＦｃ部分
をヒト抗体のＦｃにより置き換えたり、ＣＤＲ（相補性
決定領域）以外の部分を全てヒト由来の抗体に置き換え
ることによりヒトへの抗原性を少なくしたいわゆるキメ
ラ抗体や、遺伝子組換え技術により生産されるヒト型化
抗体を用いることも可能である。

ポリクローナル抗体の作製は、常法に従って、例えばＩ
Ｌ−６によりマウス、ウサギ、ヒツジ又はヤギ等を免疫
感作することによって行うことができる。免疫原のＩＬ
−６としては、大腸菌等で生産した遺伝子組換によるも
の、あるいはヒト扁桃腺単核球、ヒト末梢血単核球、ま
たはヒトＴリンホーマ等のヒト腫瘍細胞またはハイブリ
ドーマ由来のものを用いることが可能である。

ハイブリドーマの作製も常法に従って行うことができる
。例えば、前記の免疫原により、マウス等の哺乳類を免
疫し、この動物から肺臓細胞を得て、これを樹立された
ミエローマ細胞と融合させる。次いで目的とする反応性
を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドーマ
をクローニングすることができる。

モノクローナル抗体を製造するには、前記のようにして
クローニングされたハイプリドーマを培養し、培養上清
からモノクローナル抗体を採取する。あるいは、前記ハ
イプリドーマを動物の腹腔内に接種し、腹水を得て、こ
れからモノクローナル抗体を単離することもできる。ハ
イブリドーマ細胞上清中の抗体又は腹水中の抗体は、常
法に従って、例えば硫酸アンモニウム塩析により濃縮す
ることかでき、さらにアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製することができる。

上記のポリクローナル抗体の製造方法、ハイブリドーマ
の作製方法、モノクローナル抗体の調製方法、抗体の回
収、精製方法は、いずれもそれ自体当業者によりよく知
られている方法により行うことができる。

特開平２−４８８号明細書には、抗−ＩＬ−６抗体を産
生ずるハイプリドーマとして、ヒトＩＬ−６で免疫した
マウスリンパ節細胞と、マウス骨髄腫細胞との間のハイ
ブリドーマである、ハブリドーマＭＨ１６６株等が記載
されている。本発明において用いることのできる抗−Ｉ
Ｌ−６抗体の好ましい具体例としては、ハイブリドーマ
ＭＨ１６６株（ＦＥＲＭ　Ｐ９６５６）に由来する抗−
ＩＬ−６抗体（以下ＭＨ　１６６抗体と呼ぶ）が挙げら
れる。

本発明の増強剤の投与は、ＩＬ−６と同時若しくはＩＬ
−６の投与とは間隔をおいて行うことができる。また本
発明の増強剤とＩＬ−６とを混合物として投与すること
もできる。

ＩＬ−６の生理活性については種々の報告がなされてい
るが、本発明は、ＩＬ−６の生理活性を利用した治療薬
、例えば免疫賦活剤等の作用を更に増強させ、治療効果
を向上させることが可能となる。

本発明の増強剤は、皮下注射又は静脈注射により投与す
ることが好ましい。

投与量は、被検体に投与されるＩＬ−６の量、使用する
抗体の種類、ＩＬ−６の活性阻害の程度若しくはクラス
等及び対象となる疾患によって適宜定められるが、Ｍｆ
ｆ　１６６抗体の場合、成人−人当たり０．１〜１００
ｍｇ／日である。

本発明の増強剤は、抗−ＩＬ−６抗体を常用の注射用キ
ャリアー、例えば生理食塩溶液、と混合した後、濾過滅
菌し、所望により凍結乾燥することにより製造できる。

本発明の免疫賦活剤についても、投与方法、投与量及び
製剤化は、前記の増強剤とほぼ同様に行うことが出来る
。

〔実施例〕

１、ＭＨ１６６のｆ′１ＭＨ１６６抗体は、特開平２−４８８号公報の記載に基
づき大量調製したものを使用した。即ち、ＭＨ１６６細
胞を、プリスタン（２、６，１０，１４−テトラメタル
デカン酸）で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投
与し、増殖させ、腹水中に産生されたＩｇＧ分画を硫安
沈殿させた後ＤＥＡＥセルロースを用いて精製した。こ
れをＰＢＳで適当に希釈して以下の実施例に用いた。

２、　　−ＤＮＰＣ３Ｈ／ＨｅＪ系雌性マウスに、抗原としてＤＮＰＫＬ
Ｈ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅ＋ｍｏｃｙａ
ｎｉｎ）を投与し、更にＭＨ１６６抗体及びＩＬ−６を
投与した。即ち、１０ｇのＤＮＰ　−ＫＬＨ溶液を静脈
注射し、２４時間後、実施例１で得たＭＨ１６６抗体溶
液０．５　ｍを腹腔内に投与した。この抗体の投与量（
ｔａｒ／マウス）を第１表に示す、遺伝子工学的手法に
より大腸菌で生産したＡｌａ−ヒト−ＩＬ−６（特開昭
６３−１５７９９６号公報参照）をＰＢＳを含む１０％
マウス血清に溶解して、抗体投与の１時間後及び２４時
間後に、第１表に記載の投与量を皮下に投与した。抗原
投与後７日目に血清を採取し、抗−ＤＮＰ抗体量を以下
に記載のＥＬＩＳＡ法に従って測定した。なお、参照と
して、ＩＬ−６の代りにヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）
を投与した場合についても同様の実験を行った。

まず、１００ＩのＤＮＰ−ＢＳＡ（５０ｇ／ａｔ）溶液
をＥＬＩＳＡ用のプレートに加えて４℃で２４時間反応
させ固定した。洗浄後、１％ＢＳ＾−ＰＢＳ溶液を１５
０Ｉ加えて、室温で２時間放置した。洗浄後、適度に希
釈した被験血清を１００１１１加えて室温で１時間反応
させたのち、再びプレートを洗い、アルカリホスファタ
ーゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体または抗マウスＩｇＭ
抗体を１００Ｉ１１加えて１時間反応させた。その後プ
レートを洗浄し、基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、１　ｌ
ａｇ／＋ｄ）を加え、各ウェルノ吸光度を４０５６００
ｒｖで測定した。その吸光度を、ＤＮＰで免疫してＢＳ
Ａを投与したマウスの血清のそれを１００ユニツト／ｄ
として、ユニット換算を行った。

また、それらのマウスの肺臓を摘出し、その重量を測定
した。

それらの結果は第１表に示される通りである。

第１表は、ＩＬ−６とＭＨ１６６抗体の併用投与により
、抗−ＤＮＰ抗体産生の増強および肺臓重量の増加に対
するＩＬ−６の効果が発現し又はＩＬ−６の効果が上昇
することを示している。

３、−５ＲＢＣ生免疫原として、ＤＮＰにかえて５ＲＢＣ（ヒツジ赤血球
）　１０”個を用い、実施例２と同様の方法に従ってＭ
Ｈ１６６抗体及びＩＬ−６を投与した。抗−５ＲＢＣ抗
体量を以下に記載のＥＬＩＳＡ法に従って測定した。

まず、１００１１１のＤＮＰ−ＳＲＢＣ（５０■／Ｍ１
）溶液をＥＬＩＳＡ用のプレートに加えて３７°Ｃで２
時間反応させた後、１％のｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄ
ｅ溶液を１００ｄ加えて、室温で３０分間放置して、５
ＲＢＣをプレートに固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、１
％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液を１００ｊ１１加えて、４°Ｃ
で２４時間反応させて非特異的結合物をブロックした。

洗浄後、適度に希釈した被験血清を１００Ｉｌ！加えて
室温で１時間反応させたのち、再びプレートを洗い、ア
ルカリホスファターゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体また
は抗マウスＩｇＭ抗体を１００！！！加えて１時間反応
させた。

その後プレートを洗浄し、基質溶液（Ｓｉｇｍａ　１０
４　。

１■／＋ｄ）を加え、各ウェルの吸光度を４０５−６０
０ｎｍで測定した。その吸光度を、５ＲＢＣで免疫して
ＩＳＡを投与したマウスの血清のそれを１００ユニツト
／ｄとして、ユニット換算を行った。

それらの結果は第２表に示される通りである。

第２表は、ＩＬ−６と抗−ＩＬ−６抗体の併用投与によ
り抗−５ＲＢＣ抗体産生の増強および肺臓重量の増加に
対するＩＬ−６の効果が発現し又は上昇することを示し
ている。

裏旌五１ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスに、ＩＬ−６及びＭＨ１６６抗体
を投与し、ＩＬ−６のみを投与したマウス群とその血中
のＩＬ−６の濃度変化を比較した。ＩＬ−６の血中濃度
の測定はドツトプロッティング法により行った。すなわ
ち、１（Ｌ−６及びＭＨ（１６６抗体を投与した後、１
日間口、６時間目及び２４４時間目血液サンプルを採取
し、これをＴＢＳで３００倍、９００倍及び２７００倍
に稀釈し、これらの稀釈したサンプルをニトロセルロー
スに固定し、家兎抗−ヒトＩＬ−６ポリクロ一ナル抗体
により検出した。この結果を第１図に示す。

第１図は、ＭＨ１６６抗体の併用により、投与されたＩ
Ｌ−６の血中濃度が持続することを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、血中のＩＬ−６濃度の、ドツトブロッティン
グ法による測定結果を示した図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、抗インターロイキン−６抗体を有効成分とするイン
ターロイキン−６の作用の発現又は増強剤。２、抗インターロイキン−６抗体がモノクローナル抗体
である、請求項１に記載の作用の発現又は増強剤。３、抗インターロイキン−６抗体がインターロイキン−
６とインターロイキン−６レセプターとの結合に対して
不完全な抑制作用を示すか又は当該抑制作用を示さない
抗体である請求項１に記載の作用の発現又は増強剤。４、抗インターロイキン−６抗体がＭＨ１６６由来のモ
ノクローナル抗体である、請求項２に記載の作用の発現
又は増強剤。５、抗インターロイキン−６抗体がキメラ抗体である、
請求項１に記載の作用の発現又は増強剤。６、インターロイキン−６及び抗−インターロイキン−
６抗体を有効成分として含有する免疫賦活剤。