JPH05317084A - 抗体産生ヒト由来リンパ球及びヒトモノクローナル抗体の製造方法並びに該方法により作製されたヒトモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
抗体産生ヒト由来リンパ球及びヒトモノクローナル抗体の製造方法並びに該方法により作製されたヒトモノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPH05317084A JPH05317084A JP4284052A JP28405292A JPH05317084A JP H05317084 A JPH05317084 A JP H05317084A JP 4284052 A JP4284052 A JP 4284052A JP 28405292 A JP28405292 A JP 28405292A JP H05317084 A JPH05317084 A JP H05317084A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- monoclonal antibody
- antibody
- producing
- animal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【目的】 所望の抗原に対する抗体、とりわけ、Ｉｇ
Ｇ抗体及びＩｇＡ抗体を産生するヒト由来リンパ球を製
造する方法並びに該ヒト由来リンパ球を利用してヒトモ
ノクローナル抗体を製造する方法を提供すること並びに
該方法により、癌遺伝子産物に特異的なモノクローナル
抗体を提供すること。 【構成】 ヒトリンパ球を免疫不全症動物に移植して
生着させ、次いで該動物を所望の抗原で免疫し、該抗原
に対する抗体を産生するヒト由来リンパ球を生成せしめ
た後、該リンパ球を採取することから成る抗体産生ヒト
由来リンパ球の製造方法を提供した。また、該抗体産生
ヒト由来リンパ球を不死化処理し、得られた不死化抗体
産生ヒト由来リンパ球をクローン化し、これから前記抗
原に対するモノクローナル抗体を採取することから成る
ヒトモノクローナル抗体の製造方法を提供した。さら
に、上記本発明のヒトモノクローナル抗体の製造方法に
より、ｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細胞外ドメインに
対して特異的なモノクローナル抗体を提供した。
Ｇ抗体及びＩｇＡ抗体を産生するヒト由来リンパ球を製
造する方法並びに該ヒト由来リンパ球を利用してヒトモ
ノクローナル抗体を製造する方法を提供すること並びに
該方法により、癌遺伝子産物に特異的なモノクローナル
抗体を提供すること。 【構成】 ヒトリンパ球を免疫不全症動物に移植して
生着させ、次いで該動物を所望の抗原で免疫し、該抗原
に対する抗体を産生するヒト由来リンパ球を生成せしめ
た後、該リンパ球を採取することから成る抗体産生ヒト
由来リンパ球の製造方法を提供した。また、該抗体産生
ヒト由来リンパ球を不死化処理し、得られた不死化抗体
産生ヒト由来リンパ球をクローン化し、これから前記抗
原に対するモノクローナル抗体を採取することから成る
ヒトモノクローナル抗体の製造方法を提供した。さら
に、上記本発明のヒトモノクローナル抗体の製造方法に
より、ｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細胞外ドメインに
対して特異的なモノクローナル抗体を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗体産生ヒト由来リン
パ球及びヒトモノクローナル抗体の製造方法並びに該方
法により作製されるモノクローナル抗体に関する。本発
明は各種疾病の診断や治療に有用である。
パ球及びヒトモノクローナル抗体の製造方法並びに該方
法により作製されるモノクローナル抗体に関する。本発
明は各種疾病の診断や治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】従来より、抗体を各種疾病の治療や診断
の目的でヒトに投与することは広く行なわれている。従
来の抗体は主としてマウスのような動物から調製されて
いる。しかしながら、動物由来の抗体を診断、治療の目
的でヒトに投与すると、体内で抗抗体が生産されるた
め、半減期が短く、繰り返し投与で高い効果が得られな
い等の問題があった。この問題を回避するため、人体か
ら直接リンパ球を採取することが考えられるが、目的と
する抗原と反応する抗体を産生するヒトリンパ球を採取
することは計画的に行なうことができないので、工業的
ではない。さらに、所望の抗原でヒトを免疫することは
一般的に許されることではないので、目的とする抗体を
産生するリンパ球を得ることは困難である。また、仮に
人体に抗原を投与できる場合であっても長時間に亙って
免疫することはできず、十分な抗体産生を誘起すること
は困難である。
の目的でヒトに投与することは広く行なわれている。従
来の抗体は主としてマウスのような動物から調製されて
いる。しかしながら、動物由来の抗体を診断、治療の目
的でヒトに投与すると、体内で抗抗体が生産されるた
め、半減期が短く、繰り返し投与で高い効果が得られな
い等の問題があった。この問題を回避するため、人体か
ら直接リンパ球を採取することが考えられるが、目的と
する抗原と反応する抗体を産生するヒトリンパ球を採取
することは計画的に行なうことができないので、工業的
ではない。さらに、所望の抗原でヒトを免疫することは
一般的に許されることではないので、目的とする抗体を
産生するリンパ球を得ることは困難である。また、仮に
人体に抗原を投与できる場合であっても長時間に亙って
免疫することはできず、十分な抗体産生を誘起すること
は困難である。
【０００３】上記問題を解決するため、エプスタイン・
バールウイルス（ＥＢＶ）を用いるトランスフォーム法
（Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，１２１ １４０（１９８６）やｉｎ
ｖｉｔｒｏ感作法（Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ
ら、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３６ ３７１
０（１９８６））が試みられている。しかし、いずれの
方法によっても製造される抗体の多くはＩｇＭである。
ＩｇＭは精製が困難で安定性が悪い。また、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ感作法では、リンパ球を抗原と共に培養するた
め、感作できる期間が短く、十分な抗体産生を誘起する
ことが困難である。このため、ヒト抗体でも特に抗原に
特異的なモノクローナル抗体、とりわけヒトＩｇＧを容
易に製造する技術が望まれている。
バールウイルス（ＥＢＶ）を用いるトランスフォーム法
（Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，１２１ １４０（１９８６）やｉｎ
ｖｉｔｒｏ感作法（Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ
ら、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３６ ３７１
０（１９８６））が試みられている。しかし、いずれの
方法によっても製造される抗体の多くはＩｇＭである。
ＩｇＭは精製が困難で安定性が悪い。また、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ感作法では、リンパ球を抗原と共に培養するた
め、感作できる期間が短く、十分な抗体産生を誘起する
ことが困難である。このため、ヒト抗体でも特に抗原に
特異的なモノクローナル抗体、とりわけヒトＩｇＧを容
易に製造する技術が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、所望の抗原に対する抗体、とりわけ、ＩｇＧ抗体を
産生するヒト由来リンパ球を製造する方法を提供するこ
とである。さらに、本発明の目的は、本発明の方法によ
り製造されたリンパ球を用いてヒトモノクローナル抗体
を製造する方法を提供することである。さらに、本発明
の目的は、上記本発明の方法により、癌の診断及び治療
に有用なヒトモノクローナル抗体を提供することであ
る。
は、所望の抗原に対する抗体、とりわけ、ＩｇＧ抗体を
産生するヒト由来リンパ球を製造する方法を提供するこ
とである。さらに、本発明の目的は、本発明の方法によ
り製造されたリンパ球を用いてヒトモノクローナル抗体
を製造する方法を提供することである。さらに、本発明
の目的は、上記本発明の方法により、癌の診断及び治療
に有用なヒトモノクローナル抗体を提供することであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者は、鋭意研究
の結果、ヒトリンパ球を免疫不全症動物に生着させ、該
動物を所望の抗原で免疫し、ヒト由来リンパ球を採取す
ることにより所望の抗原に対する主としてＩｇＧ抗体及
びＩｇＡ抗体を産生するヒト由来リンパ球を得ることが
できることを見出し本発明を完成した。
の結果、ヒトリンパ球を免疫不全症動物に生着させ、該
動物を所望の抗原で免疫し、ヒト由来リンパ球を採取す
ることにより所望の抗原に対する主としてＩｇＧ抗体及
びＩｇＡ抗体を産生するヒト由来リンパ球を得ることが
できることを見出し本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、ヒトリンパ球を免疫
不全症動物に移植して生着させ、次いで該動物を所望の
抗原で免疫し、該抗原に対する抗体を産生するヒト由来
リンパ球を生成せしめた後、該リンパ球を採取すること
から成る抗体産生ヒト由来リンパ球の製造方法を提供す
る。
不全症動物に移植して生着させ、次いで該動物を所望の
抗原で免疫し、該抗原に対する抗体を産生するヒト由来
リンパ球を生成せしめた後、該リンパ球を採取すること
から成る抗体産生ヒト由来リンパ球の製造方法を提供す
る。
【０００７】さらにまた、本発明は、上記本発明の方法
により製造した抗体産生ヒト由来リンパ球を不死化処理
し、得られた不死化抗体産生ヒト由来リンパ球をクロー
ン化し、これから前記抗原に対するモノクローナル抗体
を採取することから成るヒトモノクローナル抗体の製造
方法を提供する。
により製造した抗体産生ヒト由来リンパ球を不死化処理
し、得られた不死化抗体産生ヒト由来リンパ球をクロー
ン化し、これから前記抗原に対するモノクローナル抗体
を採取することから成るヒトモノクローナル抗体の製造
方法を提供する。
【０００８】さらに本発明は、上記本発明のヒトモノク
ローナル抗体の製造方法により、ｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝
子産物の細胞外ドメインに対して特異的なヒトモノクロ
ーナル抗体を提供した。
ローナル抗体の製造方法により、ｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝
子産物の細胞外ドメインに対して特異的なヒトモノクロ
ーナル抗体を提供した。
【０００９】本発明で用いる免疫不全症動物は、ヒトリ
ンパ球を移植した時、拒絶反応を起こさない動物であ
る。このような動物は物理的、化学的又は生物的な処理
により人為的に作製し得る。免疫不全症動物は広く知ら
れており、医薬品の研究等で広く用いられている。免疫
不全症動物であれば、いずれのものをも用いることがで
きるが、入手容易性の点からＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓ
ｃｉｄマウス（Ｇ．Ｃ．Ｂｏｓｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，
３０１ ５２７（１９８３））が好ましい。
ンパ球を移植した時、拒絶反応を起こさない動物であ
る。このような動物は物理的、化学的又は生物的な処理
により人為的に作製し得る。免疫不全症動物は広く知ら
れており、医薬品の研究等で広く用いられている。免疫
不全症動物であれば、いずれのものをも用いることがで
きるが、入手容易性の点からＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓ
ｃｉｄマウス（Ｇ．Ｃ．Ｂｏｓｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，
３０１ ５２７（１９８３））が好ましい。
【００１０】本発明で用いられるヒトリンパ球は、末梢
血、脾臓、リンパ節、扁桃等由来のものを利用すること
ができる。
血、脾臓、リンパ節、扁桃等由来のものを利用すること
ができる。
【００１１】ヒトリンパ球を免疫不全症動物に生着させ
る方法は、単にヒトリンパ球を該動物に投与することに
より行なうことができる。投与経路は皮下、静脈内、腹
腔内等、特に限定されない。また、ヒトリンパ球の投与
量も特に限定されないが、通常１０6 個ないし１０8 個
程度である。
る方法は、単にヒトリンパ球を該動物に投与することに
より行なうことができる。投与経路は皮下、静脈内、腹
腔内等、特に限定されない。また、ヒトリンパ球の投与
量も特に限定されないが、通常１０6 個ないし１０8 個
程度である。
【００１２】次いで、免疫不全症動物を所望の抗原で免
疫する。免疫方法自体は、モノクローナル抗体の分野に
おいて周知の方法により行なうことができ、例えば「富
山朔二・安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル
講談社サイエンティフィック（１９８７））に記載され
た方法を用いることができる。
疫する。免疫方法自体は、モノクローナル抗体の分野に
おいて周知の方法により行なうことができ、例えば「富
山朔二・安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル
講談社サイエンティフィック（１９８７））に記載され
た方法を用いることができる。
【００１３】免疫終了後、動物の血液、脾臓、リンパ球
又はその他のリンパ球組織よりヒトリンパ球を回収す
る。先ず、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（比重１．０
７７）遠心法により単核球を分離し、さらにｐｌａｓｔ
ｉｃ ｄｉｓｈ付着法等で単球を除去する。混入する動
物由来細胞の除去は、この動物細胞に特異的な抗血清を
用いることにより行なうことができる。この抗血清は、
例えば、その動物の脾細胞を抗原として他の動物に免疫
し、免疫した動物から血清を分離することにより得るこ
とができる。この抗血清による処理は、リンパ球分離の
どの過程で行なっても差し支えない。また、細胞表面に
発現しているヒト免疫グロブリンをマーカーにした免疫
学的な手法によってもヒトリンパ球を分離することが可
能である。上記方法により、所望の抗原に対する主とし
てＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体を産生するヒト由来リンパ
球を得ることができる。
又はその他のリンパ球組織よりヒトリンパ球を回収す
る。先ず、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（比重１．０
７７）遠心法により単核球を分離し、さらにｐｌａｓｔ
ｉｃ ｄｉｓｈ付着法等で単球を除去する。混入する動
物由来細胞の除去は、この動物細胞に特異的な抗血清を
用いることにより行なうことができる。この抗血清は、
例えば、その動物の脾細胞を抗原として他の動物に免疫
し、免疫した動物から血清を分離することにより得るこ
とができる。この抗血清による処理は、リンパ球分離の
どの過程で行なっても差し支えない。また、細胞表面に
発現しているヒト免疫グロブリンをマーカーにした免疫
学的な手法によってもヒトリンパ球を分離することが可
能である。上記方法により、所望の抗原に対する主とし
てＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体を産生するヒト由来リンパ
球を得ることができる。
【００１４】得られた抗体産生ヒト由来リンパ球からヒ
トモノクローナル抗体を得る場合には、先ず、該ヒト由
来リンパ球を不死化する。不死化の方法自体は公知であ
り、例えば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）
を用いたトランスフォーム法（Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、上
掲）により、若しくはモノクローナル抗体の作製におい
て常用されている細胞融合法（Ｔ．Ｋｕｄｏら、Ｔｏｈ
ｏｋｕ Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４，３４５（１９８
８））により、又はこれらの組合せにより行なうことが
できる。あるいは、免疫終了後に、免疫不全症動物に直
接ＥＢＶを接種し、トランスフォームされたヒト由来リ
ンパ球を体内から分離することも可能であり、この態様
も請求項１の範囲に含まれるものである。
トモノクローナル抗体を得る場合には、先ず、該ヒト由
来リンパ球を不死化する。不死化の方法自体は公知であ
り、例えば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）
を用いたトランスフォーム法（Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、上
掲）により、若しくはモノクローナル抗体の作製におい
て常用されている細胞融合法（Ｔ．Ｋｕｄｏら、Ｔｏｈ
ｏｋｕ Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４，３４５（１９８
８））により、又はこれらの組合せにより行なうことが
できる。あるいは、免疫終了後に、免疫不全症動物に直
接ＥＢＶを接種し、トランスフォームされたヒト由来リ
ンパ球を体内から分離することも可能であり、この態様
も請求項１の範囲に含まれるものである。
【００１５】不死化細胞からモノクローナル抗体を回収
する方法は、モノクローナル抗体の作製において常用さ
れている周知の方法により行なうことができる。すなわ
ち、不死化したリンパ球を限界希釈法等でクローン化
し、所望の抗体を産生するものを選択し、それを培地中
又は動物の腹腔内で培養して増殖させ、その培養上清又
は腹水中から所望のモノクローナル抗体を採取すること
ができる。
する方法は、モノクローナル抗体の作製において常用さ
れている周知の方法により行なうことができる。すなわ
ち、不死化したリンパ球を限界希釈法等でクローン化
し、所望の抗体を産生するものを選択し、それを培地中
又は動物の腹腔内で培養して増殖させ、その培養上清又
は腹水中から所望のモノクローナル抗体を採取すること
ができる。
【００１６】上記した、本発明のモノクローナル抗体の
製造方法により、ヒトｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細
胞外ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体が得
られた。その詳細は下記実施例３に記載されている。こ
のモノクローナル抗体は、癌、特に胃癌の診断及び治療
に用いることができると考えられる。
製造方法により、ヒトｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細
胞外ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体が得
られた。その詳細は下記実施例３に記載されている。こ
のモノクローナル抗体は、癌、特に胃癌の診断及び治療
に用いることができると考えられる。
【００１７】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１８】実施例１ ＫＬＨ(Keyhole lympet hemocyanin) に対するヒトモノ
クローナル抗体 リンパ球の移植及び動物の免疫 ６週令のC.B-17/Icr-scid マウス（雌）を使用し、１匹
当たりヒト末梢血リンパ球を 4×107 個、腹腔内に移植
した。なお、末梢リンパ球の分離はFicoll-Hypaque (比
重1.077)遠心法により行った。免疫方法は、0.1mgのKHL
を0.2ml のダルベコーリン酸緩衝食塩水(PBS) に溶解
後、同量のFreundの完全アジュバントでエマルジョンと
し、マウスの腹腔内に投与した。
クローナル抗体 リンパ球の移植及び動物の免疫 ６週令のC.B-17/Icr-scid マウス（雌）を使用し、１匹
当たりヒト末梢血リンパ球を 4×107 個、腹腔内に移植
した。なお、末梢リンパ球の分離はFicoll-Hypaque (比
重1.077)遠心法により行った。免疫方法は、0.1mgのKHL
を0.2ml のダルベコーリン酸緩衝食塩水(PBS) に溶解
後、同量のFreundの完全アジュバントでエマルジョンと
し、マウスの腹腔内に投与した。
【００１９】なお、２回目以降の免疫にはFreundの不完
全アジュバントを使用し、２カ月にわたり計６回の免疫
を行った。免疫動物血清中のＫＬＨに対するヒト型Ｉｇ
Ｇ値の上昇の様子を図１に示した。なお、図１に示すデ
ータはＫＬＨでコートしたマイクロプレートに免疫マウ
ス血清を加え、反応、水洗後、二次抗体としてパーオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧ、
Ｍ、Ａを使用したＥＬＩＳＡ法（ＯＤ492 ）により測定
した。
全アジュバントを使用し、２カ月にわたり計６回の免疫
を行った。免疫動物血清中のＫＬＨに対するヒト型Ｉｇ
Ｇ値の上昇の様子を図１に示した。なお、図１に示すデ
ータはＫＬＨでコートしたマイクロプレートに免疫マウ
ス血清を加え、反応、水洗後、二次抗体としてパーオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧ、
Ｍ、Ａを使用したＥＬＩＳＡ法（ＯＤ492 ）により測定
した。
【００２０】免疫マウスよりヒトリンパ球の回収とト
ランスフォーム 免疫終了後、あらかじめ作製しておいた抗血清をマウス
腹腔内に投与し、９時間後、開腹し脾臓を摘出した。な
お、ここで用いた抗血清は、ウサギ（日本白色種）に抗
原としてC.B-17/Icr-scid マウス脾細胞を２週おき計４
回静脈内に投与し、免疫終了時に採血、血清分離、33%
硫安塩析して得たものである。脾細胞を分散し（富山朔
二・安東民衛／編 単クローン抗体実験マニュアル 講
談社サイエンティフィック42(1987))、Ficoll-Hypaque
(比重1.077)遠心法によりヒトリンパ球を分離回収し
た。さらにリンパ球は、EBV トランスフォーム（T.kudo
等 Tohoku J.exp. Med.,154 . 345(1988))によりトラン
スフォーム細胞（Ｂリンパ芽球様細胞）株を得た。この
細胞株の染色体数を測定した結果、図２に示すようにヒ
ト由来の性質を有していた。
ランスフォーム 免疫終了後、あらかじめ作製しておいた抗血清をマウス
腹腔内に投与し、９時間後、開腹し脾臓を摘出した。な
お、ここで用いた抗血清は、ウサギ（日本白色種）に抗
原としてC.B-17/Icr-scid マウス脾細胞を２週おき計４
回静脈内に投与し、免疫終了時に採血、血清分離、33%
硫安塩析して得たものである。脾細胞を分散し（富山朔
二・安東民衛／編 単クローン抗体実験マニュアル 講
談社サイエンティフィック42(1987))、Ficoll-Hypaque
(比重1.077)遠心法によりヒトリンパ球を分離回収し
た。さらにリンパ球は、EBV トランスフォーム（T.kudo
等 Tohoku J.exp. Med.,154 . 345(1988))によりトラン
スフォーム細胞（Ｂリンパ芽球様細胞）株を得た。この
細胞株の染色体数を測定した結果、図２に示すようにヒ
ト由来の性質を有していた。
【００２１】得られたトランスフォーム細胞１８株につ
いて、それぞれの培養上清液中のＫＬＨ特異抗体の分析
を行なった。ＫＬＨをコートしたマイクロプレートに、
各培養上清液を加え、反応、水洗後、パーオキシダーゼ
標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭを二次抗体と
するＥＬＩＳＡ法により測定した結果を図３に示した。
その結果、トランスフォーム細胞１８株は、いずれもＫ
ＬＨ特異抗体を産生することが判明した。
いて、それぞれの培養上清液中のＫＬＨ特異抗体の分析
を行なった。ＫＬＨをコートしたマイクロプレートに、
各培養上清液を加え、反応、水洗後、パーオキシダーゼ
標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭを二次抗体と
するＥＬＩＳＡ法により測定した結果を図３に示した。
その結果、トランスフォーム細胞１８株は、いずれもＫ
ＬＨ特異抗体を産生することが判明した。
【００２２】トランスフォーム細胞が、ＫＬＨ特異抗体
を生産することをさらに明確にするため、トランスフォ
ーム細胞の１株（ＬＣＬ８−９）の培養上清液について
ＫＬＨとの吸収反応を行ない、生産抗体がＫＬＨ特異的
であることを示した（図４）。
を生産することをさらに明確にするため、トランスフォ
ーム細胞の１株（ＬＣＬ８−９）の培養上清液について
ＫＬＨとの吸収反応を行ない、生産抗体がＫＬＨ特異的
であることを示した（図４）。
【００２３】トランスフォーム細胞の細胞融合とモノ
クローナル抗体の製造 トランスフォーム細胞を親株（SHM-D33)（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ−１６６８）と細胞融合し(T.Kudo 等 Tohoku J. e
xp. Med.,154 , 345(1988))、抗ＫＨＬ抗体産生ハイブリ
ドーマ１３株を樹立した。
クローナル抗体の製造 トランスフォーム細胞を親株（SHM-D33)（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ−１６６８）と細胞融合し(T.Kudo 等 Tohoku J. e
xp. Med.,154 , 345(1988))、抗ＫＨＬ抗体産生ハイブリ
ドーマ１３株を樹立した。
【００２４】これらＫＬＨ特異抗体を生産するハイブリ
ドーマ１３株について、生産抗体のクラス分析を行なっ
た。その結果を表１に示した。１３株の内訳は、ＩｇＡ
８株、ＩｇＧ４株、ＩｇＭ１株であった。
ドーマ１３株について、生産抗体のクラス分析を行なっ
た。その結果を表１に示した。１３株の内訳は、ＩｇＡ
８株、ＩｇＧ４株、ＩｇＭ１株であった。
【００２５】
【表１】
【００２６】実施例２ ＡＦＰ( α-fetoprotein) に対するヒトモノクローナル
抗体 リンパ球の移植及び動物の免疫 ６週令のC.B-17/Icr-scid マウス（雌）を使用し、１匹
当たりヒト末梢血リンパ球を 5×107 個、腹腔内に移植
した。なお、末梢血リンパ球の分離はFicoll-Hypaque
(比重1.077)遠心法により行った。免疫方法は、0.1mgのA
FP を0.2ml のダルベコーリン酸緩衝食塩水(PBS) に溶
解後、同量のFreundの不完全アジュバントでエマルジョ
ンとし、マウスの腹腔内に投与した。１週及び３週間後
にそれぞれ２回目と３回目の免疫を同様の方法で実施し
た。
抗体 リンパ球の移植及び動物の免疫 ６週令のC.B-17/Icr-scid マウス（雌）を使用し、１匹
当たりヒト末梢血リンパ球を 5×107 個、腹腔内に移植
した。なお、末梢血リンパ球の分離はFicoll-Hypaque
(比重1.077)遠心法により行った。免疫方法は、0.1mgのA
FP を0.2ml のダルベコーリン酸緩衝食塩水(PBS) に溶
解後、同量のFreundの不完全アジュバントでエマルジョ
ンとし、マウスの腹腔内に投与した。１週及び３週間後
にそれぞれ２回目と３回目の免疫を同様の方法で実施し
た。
【００２７】ＥＢウィルスによるトランスフォーム ３回目の免疫終了１週後にB95-8 培養上清液 1mlをマウ
ス腹腔内に投与した。マウスはさらに３週間飼育後屠殺
し、末梢血、脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節などを摘出し
た。細胞は１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ1640培地に分
散し、９５％空気−５％炭酸ガス（３７℃）環境下で培
養を行った。増殖が認められる細胞をさらに継代培養
し、クローニング後トランスフォーム細胞を得た。トラ
ンスフォーム細胞培養上清液には、抗 AFP抗体（ヒト型
ＩｇＧ、ＩｇＡあるいはＩｇＭ）が認められた。
ス腹腔内に投与した。マウスはさらに３週間飼育後屠殺
し、末梢血、脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節などを摘出し
た。細胞は１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ1640培地に分
散し、９５％空気−５％炭酸ガス（３７℃）環境下で培
養を行った。増殖が認められる細胞をさらに継代培養
し、クローニング後トランスフォーム細胞を得た。トラ
ンスフォーム細胞培養上清液には、抗 AFP抗体（ヒト型
ＩｇＧ、ＩｇＡあるいはＩｇＭ）が認められた。
【００２８】実施例３ ｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物に対するヒトモノクローナ
ル抗体 (1) 抗原の調製 ヒトｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細胞外ドメイン部の
Ｎ末端、Ｎｏ．４９５よりＮｏ．５０９のペプチド（そ
のアミノ酸配列は、His Thr Ala Asn Arg ProGlu Asp G
lu Cys Val Gly Glu Gly Leu ）を合成し、Ｃ１８−逆
相ＨＰＬＣにより精製を行った。次に、hapten-conjuga
tion kit (PIERCE社製）を使用し、合成ペプチドをＫＬ
Ｈと結合させ、抗原とした。
ル抗体 (1) 抗原の調製 ヒトｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細胞外ドメイン部の
Ｎ末端、Ｎｏ．４９５よりＮｏ．５０９のペプチド（そ
のアミノ酸配列は、His Thr Ala Asn Arg ProGlu Asp G
lu Cys Val Gly Glu Gly Leu ）を合成し、Ｃ１８−逆
相ＨＰＬＣにより精製を行った。次に、hapten-conjuga
tion kit (PIERCE社製）を使用し、合成ペプチドをＫＬ
Ｈと結合させ、抗原とした。
【００２９】(2) リンパ球の移植及び動物の免疫 ８週令のC.B-17/Icr-scid マウス（雌）を使用し、１匹
当たりヒト末梢血リンパ球５ｘ１０7 個を腹腔内に移植
した。また、同時に抗原６０μｇを腹腔内に、５０μｇ
を皮下に投与した。さらに１週間の間隔で合計３回腹腔
内に抗原を投与した。
当たりヒト末梢血リンパ球５ｘ１０7 個を腹腔内に移植
した。また、同時に抗原６０μｇを腹腔内に、５０μｇ
を皮下に投与した。さらに１週間の間隔で合計３回腹腔
内に抗原を投与した。
【００３０】(3) 細胞融合とヒトモノクローナル抗体の
作製 最終免疫３日後にマウス脾臓を摘出し、溶血剤（0.125%
の塩化アンモニウムを含むトリス塩酸バッファ溶液）処
理により赤血球を溶血させ、ＲＰＭＩ−１６４０培地で
よく洗浄後、親株（マウスｘヒト）ヘテロミエローマ細
胞SHM-D33、 ATCC CRL-1668) と常法により細胞融合し
た。オブアルブミンに結合した上記抗原を抗原として用
いたＥＬＩＳＡ法により、融合細胞のスクリーニングを
行い、c-erbB2 に特異的なヒトモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを樹立した。このうちの１株ＴＫＧ４１
株（微工研菌寄第１２８１６号）の生産するヒトモノク
ローナル抗体はＩｇＭタイプで、胃癌由来細胞Ｋａｔｏ
III の細胞膜に反応することをセルエライザ法により確
認した。
作製 最終免疫３日後にマウス脾臓を摘出し、溶血剤（0.125%
の塩化アンモニウムを含むトリス塩酸バッファ溶液）処
理により赤血球を溶血させ、ＲＰＭＩ−１６４０培地で
よく洗浄後、親株（マウスｘヒト）ヘテロミエローマ細
胞SHM-D33、 ATCC CRL-1668) と常法により細胞融合し
た。オブアルブミンに結合した上記抗原を抗原として用
いたＥＬＩＳＡ法により、融合細胞のスクリーニングを
行い、c-erbB2 に特異的なヒトモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを樹立した。このうちの１株ＴＫＧ４１
株（微工研菌寄第１２８１６号）の生産するヒトモノク
ローナル抗体はＩｇＭタイプで、胃癌由来細胞Ｋａｔｏ
III の細胞膜に反応することをセルエライザ法により確
認した。
【００３１】
【発明の効果】本発明により、所望の抗体を産生するヒ
ト由来リンパ球及び該ヒト由来リンパ球を用いたヒトモ
ノクローナル抗体の製造方法が提供された。本発明の方
法では、免疫を動物に対して行なうので、抗原の種類に
かかわらず所望の抗原に対する抗体を工業的に得ること
が可能である。また、免疫の期間を長くとれるので、十
分に抗体産生を誘起することができる。さらに、本発明
の方法によると、生産される抗体が主としてＩｇＧ及び
ＩｇＡであるので、抗体の精製が容易であり、また、得
られた抗体が安定である。また、本発明により、ヒトｃ
−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細胞外ドメインに対して特
異的なモノクローナル抗体が提供された。このモノクロ
ーナル抗体は癌の診断及び治療に有用である。
ト由来リンパ球及び該ヒト由来リンパ球を用いたヒトモ
ノクローナル抗体の製造方法が提供された。本発明の方
法では、免疫を動物に対して行なうので、抗原の種類に
かかわらず所望の抗原に対する抗体を工業的に得ること
が可能である。また、免疫の期間を長くとれるので、十
分に抗体産生を誘起することができる。さらに、本発明
の方法によると、生産される抗体が主としてＩｇＧ及び
ＩｇＡであるので、抗体の精製が容易であり、また、得
られた抗体が安定である。また、本発明により、ヒトｃ
−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細胞外ドメインに対して特
異的なモノクローナル抗体が提供された。このモノクロ
ーナル抗体は癌の診断及び治療に有用である。
【図１】ヒト末梢血リンパ球を投与した免疫不全症マウ
スの血清中の抗ＫＬＨＩｇＧ抗体価を示す図。
スの血清中の抗ＫＬＨＩｇＧ抗体価を示す図。
【図２】抗体産生リンパ球をＥＢＶでトランスフォーム
した細胞の染色体数の分布を示す図。
した細胞の染色体数の分布を示す図。
【図３】トランスフォーム細胞培養上清液中のＫＬＨ特
異抗体の分析結果を示す図。
異抗体の分析結果を示す図。
【図４】トランスフォーム細胞（ＬＣＬ ８−９株）培
養上清液とＫＬＨとの吸収試験の結果を示す図。
養上清液とＫＬＨとの吸収試験の結果を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｔ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ 9284−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒトリンパ球を免疫不全症動物に移植
して生着させ、次いで該動物を所望の抗原で免疫し、該
抗原に対する抗体を産生するヒト由来リンパ球を生成せ
しめた後、該リンパ球を採取することから成る抗体産生
ヒト由来リンパ球の製造方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法により製造した抗
体産生ヒト由来リンパ球を不死化処理し、得られた不死
化抗体産生ヒト由来リンパ球をクローン化し、これから
前記抗原に対するモノクローナル抗体を採取することか
ら成るヒトモノクローナル抗体の製造方法。 - 【請求項３】 ｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子産物の細胞外
ドメインに対して特異的なヒトモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 前記細胞外ドメインはｃ−ｅｒｂＢ２
癌遺伝子産物のＮｏ．４９５からＮｏ．５０９のアミノ
酸配列から成る請求項３記載のヒトモノクローナル抗
体。 - 【請求項５】 ＴＫＧ４１株（微工研菌寄第１２８１
６号）により生産されるモノクローナル抗体である請求
項４記載のヒトモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4284052A JPH05317084A (ja) | 1991-10-30 | 1992-09-28 | 抗体産生ヒト由来リンパ球及びヒトモノクローナル抗体の製造方法並びに該方法により作製されたヒトモノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31166591 | 1991-10-30 | ||
| JP3-311665 | 1991-10-30 | ||
| JP4284052A JPH05317084A (ja) | 1991-10-30 | 1992-09-28 | 抗体産生ヒト由来リンパ球及びヒトモノクローナル抗体の製造方法並びに該方法により作製されたヒトモノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317084A true JPH05317084A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=18020012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4284052A Pending JPH05317084A (ja) | 1991-10-30 | 1992-09-28 | 抗体産生ヒト由来リンパ球及びヒトモノクローナル抗体の製造方法並びに該方法により作製されたヒトモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05317084A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6627196B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-09-30 | Genentech, Inc. | Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies |
| EP1375520A1 (en) * | 1995-12-05 | 2004-01-02 | Amgen Inc. | Apoptosis induced by monoclonal antibody anti-Her2 |
| US7041292B1 (en) | 1999-06-25 | 2006-05-09 | Genentech, Inc. | Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies |
| US7371376B1 (en) | 1996-10-18 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | Anti-ErbB2 antibodies |
-
1992
- 1992-09-28 JP JP4284052A patent/JPH05317084A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1375520A1 (en) * | 1995-12-05 | 2004-01-02 | Amgen Inc. | Apoptosis induced by monoclonal antibody anti-Her2 |
| US7354583B2 (en) | 1995-12-05 | 2008-04-08 | Amgen, Inc. | Antibody-induced apoptosis |
| US7811566B2 (en) | 1995-12-05 | 2010-10-12 | Amgen, Inc. | Antibody-induced apoptosis |
| US8444990B2 (en) | 1995-12-05 | 2013-05-21 | Amgen Inc. | Antibody-induced apoptosis |
| US7371376B1 (en) | 1996-10-18 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | Anti-ErbB2 antibodies |
| US7041292B1 (en) | 1999-06-25 | 2006-05-09 | Genentech, Inc. | Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies |
| US6627196B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-09-30 | Genentech, Inc. | Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies |
| US7371379B2 (en) | 1999-08-27 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies |
| US10160811B2 (en) | 1999-08-27 | 2018-12-25 | Genentech, Inc. | Treatment with anti-ErbB2 antibodies |
| US10280228B2 (en) | 1999-08-27 | 2019-05-07 | Genentech, Inc. | Treatment with anti-ErbB2 antibodies |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5869268A (en) | Methods for producing human lymphocytes and human monoclonal antibodies, and human monoclonal antibodies produced thereby | |
| ES2305110T3 (es) | Anticuerpos contra la il-1 beta humana. | |
| TWI677507B (zh) | 新穎之ｖｉｓｔａ－ｉｇ構築體及ｖｉｓｔａ－ｉｇ用於治療自體免疫、過敏及發炎病症之用途 | |
| JP2640463B2 (ja) | ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法 | |
| US20040038293A1 (en) | Antibodies to human cd154 | |
| CN107955072A (zh) | Pd-1抗体 | |
| SK1152003A3 (en) | Dual specificity antibodies and methods of making and using | |
| PT1248804E (pt) | Anticorpos contra il-1b humana | |
| JPH09502969A (ja) | アレルゲンに対するホストの免疫応答を調節するための方法および組成物 | |
| CN106061999A (zh) | Il‑21抗体 | |
| Yamaguchi et al. | Human monoclonal antibody with dual GM2/GD2 specificity derived from an immunized melanoma patient. | |
| TW202115122A (zh) | 抗b7-h3抗體及其應用 | |
| RU2716101C2 (ru) | Антитело к склеростину, его антигенсвязывающий фрагмент и медицинское применение | |
| JP4768193B2 (ja) | ヒトｌｄｌ受容体に対するモノクローナル抗体、その産生および用途 | |
| CA2015888A1 (en) | Monoclonal antibodies specific for an immunoglobulin isotype | |
| JPH05317084A (ja) | 抗体産生ヒト由来リンパ球及びヒトモノクローナル抗体の製造方法並びに該方法により作製されたヒトモノクロ−ナル抗体 | |
| JP4381822B2 (ja) | 免疫グロブリン親水性ペプチド複合体 | |
| Campbell | Production and purification of antibodies | |
| AU636867B2 (en) | Rat monoclonal antibodies directed against human antigens and processes for preparation thereof | |
| JP2627076B2 (ja) | 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ | |
| RU2741802C2 (ru) | АНТИТЕЛО К Myl9 | |
| JP2006151880A (ja) | 抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体、その製造法および用途 | |
| Kayano et al. | Growth of rat-mouse hybridoma cells in immunosuppressed hamsters: An easy and effective method to prepare monoclonal antibodies from heterohybridoma cell lines | |
| Iribe et al. | Induction of an anti-human type II collagen response by monoclonal anti-idiotypic antibody. | |
| Hannestad et al. | Anti‐idiotypic immune responses against adjuvant‐free isologous IgM monoclonal antibodies and their augmentation by complex formation between IgM and albumin in bovine serum |