PT1248804E - Anticorpos contra il-1b humana - Google Patents

Description

ΡΕ1248804 1 DESCRIÇÃO "ANTICORPOS CONTRA IL-Ιβ HUMANA"

Este invento está relacionado com anticorpos contra interleucina 1 beta (IL-Ιβ) humana e com a utilização de tais anticorpos para o tratamento de doenças ou alterações mediadas por IL-1. A interleucina 1 (IL-1) é uma actividade prouzida pelas células do sistema imune que actua como um mediador da resposta inflamatória da fase aguda. A produção inadequada ou excessiva de IL-1, em particular IL-Ιβ, está associada com a patologia de várias doenças ou alterações, tais como septicemia, choque séptico ou endotóxico, alergias, asma, perda de osso, isquemia, acidente vascular cerebral, artrite reumatóide e outras alterações inflamatórias. Os anticorpos contra IL-Ιβ têm sido propostos para usar no tratamento de doenças mediadas por IL-1; ver por exemplo, WO 95/01997 e a discussão na sua introdução.

Preparámos agora anticorpos melhorados contra IL-Ιβ humana para usar no tratamento de doenças e alterações mediadas por IL-1. 0 invento proporciona um anticorpo contra IL-Ιβ que tem as propriedades conforme reivindicadas na reivindicação 1. 2 ΡΕ1248804

Assim, o invento proporciona uma molécula que se liga a IL-Ιβ, a qual compreende um local de ligação ao antigénio compreendendo pelo menos um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos Ser-Tir-Trp-Ile-Gli, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos Ile-Ile-Tir-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Tre-Arg-Tir-Ser-Pro-Ser-Fen-Gln-Gli e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos Tir-Tre-Asn-Trp-Asp-Ala-Fen-Asp-Ile; e seus equivalentes directos.

Num primeiro aspecto, o invento proporciona uma molécula que se liga a IL-Ιβ compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina isolada possuindo um domínio variável da cadeia pesada (VH) como definido atrás.

Num segundo aspecto o invento também proporciona uma molécula que se liga a IL- ip compreendendo os domínios variáveis da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) , em que a referida molécula que se liga a IL-Ιβ compreende pelo menos um local de ligação a antigénio compreendendo: a) um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos Ser-Tir-Trp-Ile-Gli, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos Ile-Ile-Tir- 3 ΡΕ1248804

Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Tre-Arg-Tir-Ser-Pro-Ser-Fen-Gln-Gli e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos Tir-Tre-Asn-Trp-Asp-Ala-Fen-Asp-Ile; e b) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) gue compreende uma região hipervariável CDR3' tendo a sequência de aminoácidos Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Fen-Pro.

Em realizações particulares do segundo aspecto do invento, o invento proporciona uma molécula que se liga a IL-Ιβ compreendendo os domínios variáveis da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) , em que a referida molécula de ligação a IL- ip possui pelo menos um local de ligaçao a antigénio compreendendo: a) um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos Ser-Tir-Trp-Ile-Gli, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos Ile-Ile-Tir-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Tre-Arg-Tir-Ser-Pro-Ser-Fen-Gln-Gli e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos Tir-Tre-Asn-Trp-Asp-Ala-Fen-Asp-Ile; e b) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1', CDR2' e CDR3', a referida CDR1' tendo a sequência de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gln-Ser- 4 ΡΕ1248804

Val-Ser-Val-Ser-Ser-Tir-Leu-Ala, a referida CDR2' tendo a sequência de aminoácidos Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Tre e a referida CDR3' tendo a sequência Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Fen-Pro. A menos que de outra forma seja indicado, qualquer cadeia polipeptídica é aqui descrita como tendo uma sequência de aminoácidos começando na extremidade N-terminal e terminando na extremidade C-terminal. Quando o local de ligação ao antigénio compreende ambos os domínios VH e VL, estes podem estar situados na mesma molécula polipeptídica ou, de preferência, cada um dos domínios pode estar numa cadeia diferente, o domínio VH sendo parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento e a região VL sendo parte de uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu fragmento.

Por "molécula que se liga a IL-Ιβ" pretende-se significar qualquer molécula capaz de se ligar ao antigénio IL-Ιβ, sozinho ou associado a outras moléculas. A reacção de ligação pode ser demonstrada por métodos convencionais (ensaios qualitativos) incluindo, por exemplo, um bioensaio para determinação da inibição da ligação de IL-Ιβ ao seu receptor ou quaisquer tipos de ensaios de ligação, com referência a um ensaio com controlo negativo em que é usado um anticorpo de especificidade não relacionada mas do mesmo isotipo, e.g. um anticorpo anti-CD25. Com vantagem, a ligação das moléculas de ligação a IL-Ιβ do invento à IL-Ιβ pode ser demonstrada num ensaio de ligação competitivo. 5 ΡΕ1248804

Exemplos de moléculas de ligação a antigénios incluem anticorpos, como produzidos pelas células B ou hibridomas, anticorpos com inserções de CDRs ou humanos ou qualquer fragmento dos mesmos, e.g. fragmentos F(ab')2 e Fab, assim como anticorpos de domínios simples da cadeia pesada.

Um anticorpo de cadeia simples consiste nos domínios variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo, covalentemente ligados por um adaptador peptídico geralmente consistindo em 10 a 30 aminoácidos, de preferência entre 15 e 25 aminoácidos. Assim, tal estrutura não inclui a parte constante das cadeias pesada e leve e pensa-se que o pequeno peptídeo espaçador seja menos antigénico do que uma parte constante completa. Por "anticorpo quimérico" pretende-se significar um anticorpo em que as regiões constantes das cadeias pesada ou leve ou ambas são de origem humana enquanto que os domínios variáveis das cadeias pesada e leve são de origem não humana (e.g. murina) ou de origem humana mas derivada de um anticorpo humano diferente. Por "anticorpo com inserções de CDR" pretende-se significar um anticorpo em que as regiões variáveis (CDRs) derivam de um anticorpo dador, como seja um anticorpo não humano (e.g. murino) ou um anticorpo humano diferente, enquanto que a totalidade ou substancialmente a totalidade das outras partes da imunoglobulina e.g. as regiões constantes e as partes altamente conservadas dos domínios variáveis, i.e. as regiões estruturais, 6 ΡΕ1248804 derivam de um anticorpo aceitador, e.g. um anticorpo de origem humana. Um anticorpo com inserções de CDR pode, no entanto, conter alguns aminoácidos da sequência dadora nas regiões estruturais, por exemplo nas partes das regiões estruturais adjacentes às regiões hipervariáveis. Por "anticorpo humano" pretende-se significar um anticorpo em que as regiões constantes e variáveis das cadeias pesada e leve são todas de origem humana, ou substancialmente idênticas a sequências de origem humana, não necessariamente do mesmo anticorpo e inclui anticorpos produzidos por ratinhos em que os genes das partes constante e variável foram substituídos pelas suas contrapartes humanas, e.g. como descrito em termos gerais em EP 0546073B1, USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, EP 0438474 BI e EP 0463151 BI.

Moléculas que se ligam a IL-Ιβ particularmente preferidas do invento são anticorpos humanos, especialmente o anticorpo AAL 160 como aqui descrito mais à frente nos Exemplos.

Assim, nos anticorpos quiméricos preferidos os domínios variáveis das cadeias pesada e leve são de origem humana, por exemplo os do anticorpo AAL 160 que estão apresentados em Seq. Id. No. 1 e Seq. Id. No. 2. Os domínios da região constante, de preferência também compreendem domínios adequados da região constante humana, por exemplo como descrito em "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.A. et al., US Department 7 ΡΕ1248804 of Health and Human Services, Public Health Service, national Institute of Health.

As regiões hipervariáveis podem ser associadas a qualquer tipo de regiões estruturais, sendo de preferência de origem humana. As regiões estruturais adequadas estão descritas em Kabat E.A. et al., ibid. A região estrutural da cadeia pesada preferida é uma região estrutural da cadeia pesada humana, por exemplo a do anticorpo AAL 160 que está apresentada em Seq. Id. No. 1. Consiste sequenciadamente nas regiões FR1, FR2, FR3 e FR4. De forma semelhante, Seq Id. No. 2 mostra a região estrutural da cadeia leve de AAL 160 preferida que consiste, sequenciadamente, nas regiões FR1', FR2', FR3' e FR4'.

Desta forma, o invento também proporciona uma molécula que se liga a IL-Ιβ, a qual compreende pelo menos um local de ligação ao antigénio compreendendo um primeiro domínio tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em Seq. Id. No. 1, começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 118, ou um primeiro domínio como descrito atrás e um segundo domínio tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à apresentada em Seq. Id. No. 2, começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 107.

Os anticorpos monoclonais induzidos contra uma proteína naturalmente encontrada em todos os humanos são ΡΕ1248804 tipicamente desenvolvidos num sistema não humano e.g. em ratinhos. Como consequência directa disto, um anticorpo xenogeneico tal como produzido por um hibridoma, quando administrado a humanos, induz uma resposta imune indeseável que é predominantemente mediada pela parte constante da imunoglobulina xenogeneica. Isto claramente limita a utilização de tais anticorpos, uma vez que eles não podem ser administrados durante um período de tempo prolongado. Assim, é particularmente preferido usar anticorpos de cadeia simples, com domínios simples, quiméricos, com inserções de CDR ou especialmente anticorpos humanos que têm pouca probabilidade de induzir uma resposta alogeneica substancial quando administrados a humanos.

Face ao que foi dito, uma molécula de ligação a IL-Ιβ mais preferida do invento é seleccionada de um anticorpo anti-IL-Ιβ humana que compreende pelo menos a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende (i) um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) , que possui sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e (ii) a parte constante, ou seu fragmento, de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos Ser-Tir-Trp-Ile-Gli, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos Ile-Ile-Tir-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Tre-Arg-Tir-Ser-Pro-Ser-Fen-Gln-Gli e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos Tir-Tre-Asn-Trp-Asp-Ala-Fen-Asp-Ile; e 9 ΡΕ1248804 b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende (i) um domínio variável compreendendo a região hipervariável CDR3' e, facultativamente, também as regiões hipervariáveis CDR1' e CDR2' e (ii) a parte constante, ou seu fragmento, de uma cadeia leve humana, a referida CDR1' tendo a sequência de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Val-Ser-Ser-Tir-Leu-Ala, tendo a referida CDR2' a sequência de aminoácidos Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Tre e a referida CDR3' tendo a sequência Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Fen-Pro e seus equivalentes directos.

Como alternativa, uma molécula de ligaçao a IL- ip do invento pode ser seleccionada a partir de uma molécula de ligação de cadeia simples que compreende um local de ligação a antigénio compreendendo a) um primeiro domínio possuindo sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, as referidas regiões hipervariáveis tendo as sequências de aminoácidos como se mostra em Seq. Id. No. 1, b) um segundo domínio compreendendo as regiões hipervariáveis CDR3' e facultativamente CDR1' e CDR2', as referidas regiões hipervariáveis tendo as sequências de aminoácidos como se mostra em Seq. Id. No. 2 e c) um adaptador peptídico que é ligado à extremidade N-terminal do primeiro domínio e à extremidade 10 ΡΕ1248804 C-terminal do segundo domínio ou à extremidade C-terminal do primeiro domínio e à extremidade N-terminal do segundo domínio; e seus equivalentes directos.

Como é do conhecimento geral, alterações pequenas numa sequência de aminoácidos tais como deleção, adição ou substituição de um, alguns ou mesmo vários aminoácidos pode conduzir a uma forma alélica da proteína original que tem propriedades substancialmente idênticas.

Assim, pelo termo "seus equivalentes directos" pretende-se significar qualquer molécula de domínio simples que se liga a IL-Ιβ (molécula X), (i) em que as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 consideradas em conjunto são pelo menos 80% homólogas, de preferência pelo menos 90% homólogos, mais de preferência pelo menos 95% homólogas das regiões hipervariáveis como se mostra em Seq. Id. N° 1 e, (ii) que é capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ aos seus receptores substancialmente no mesmo nível da molécula de referência, tendo regiões estruturais idênticas às da molécula X, mas tendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às apresentadas em Seq. Id. No. 1 ou qualquer molécula de ligação a IL-Ιβ tendo pelo menos dois domínios por local de ligação (molécula X') 11 ΡΕ1248804 (i) em que as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' e facultativamente CDR1' e CDR2' consideradas em conjunto são pelo menos 80% homólogas, de preferência pelo menos 90% homólogas, mais de preferência pelo menos 95% homólogas, com as regiões hipervariáveis como se mostra em Seq. Id. No. 1 e 2 e (ii) que é capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ aos seus receptores substancialmente no mesmo grau da molécula de referência, tendo regiões estruturais e partes constantes idênticas às da molécula X', mas tendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2, CDR3 e CDR3' e facultativamente CDR1' e CDR2' idênticas às apresentadas em Seq. Id. No. 1 e 2.

Na presente descrição, as sequências de amino-ácidos são pelo menos 80% homólogas de uma outra se tiverem pelo menos 80% de resíduos de aminoácidos idênticos numa posição equivalente quando as sequências têm um alinhamento óptimo, os intervalos ou inserções nas sequências de aminoácidos sendo contados como resíduos não idênticos. A inibição da ligação de IL- ip ao seu receptor pode ser convenientemente testada usando vários ensaios, incluindo os ensaios descritos à frente no texto. O receptor de IL-Ιβ usado é de preferência o receptor de IL-iP tipo 1. Pelo termo "no mesmo grau" pretende significar que a referência e as moléculas equivalentes apresentam, numa base estatística, curvas de inibição da ligação à IL-Ιβ essencialmente idênticos num dos ensaios referidos atrás. 12 ΡΕ1248804

Por exemplo, o ensaio usado pode ser um ensaio de inibição competitiva da ligação de IL- 1β por receptores de IL-1 solúveis e pelas moléculas de ligação a IL-Ιβ do invento.

Mais de preferência, o anticorpos anti-IL- ιβ humana compreende pelo menos a) uma cadeia pesada que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à apresentada em Seq. Id. No. 1, começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 118, e a parte constante de uma cadeia pesada; e b) uma cadeia leve que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em Seq. Id. No. 2, começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 107, e a parte constante de uma cadeia leve humana. A parte constante de uma cadeia pesada humana pode ser do tipo Ji, J2, Is, γ4, M' r ai f &2 9 δ, ou s, de preferência do tipo γ, mais de preferência do tipo γι, enquanto a parte constante de uma cadeia leve humana pode ser do tipo κ ou λ (que inclui os subtipos λι, %2 e λ3> mas é de preferência do tipo κ. As sequências de aminoácidos de todas as partes constantes estão apresentadas em Kabat et al., ibid. 13 ΡΕ1248804

Uma molécula de ligação a IL-Ιβ do invento pode ser produzida por técnicas de DNA recombinante. Face a isto, uma ou mais moléculas de DNA codificadoras da molécula de ligação devem ser construídas, colocadas sob o controlo de sequências adequadas e transferidas para um organismo hospedeiro adequado para expressão.

De forma muito geral, são proporcionadas (i) moléculas de DNA codificadoras de uma molécula de cadeia simples de ligação a IL-Ιβ, do invento, uma molécula de cadeia simples de ligação a IL- ip do invento, uma cadeia pesada ou leve de uma molécula de ligação a IL-Ιβ do invento e (ii) a utilização das moléculas de DNA do invento para a produção de uma molécula de ligação a IL-Ιβ do invento por meios recombinantes. 0 presente estado da técnica é tal que os familiarizados com a matéria são capazes de sintetizar as sequências das regiões hipervariáveis e as sequências de DNA que as codificam. Um método para a construção de um gene do domínio variável está, por exemplo, descrita em EPA 239 400 e pode ser resumidamente descrito como se segue. Um gene codificador de um domínio variável de um Mab de qualquer especificidade é clonado. Os segmentos de DNA codificadores das regiões estruturais e hipervariáveis são 14 ΡΕ1248804 determinados e os segmentos de DNA codificadores das regiões hipervariáveis são removidos de forma a que os segmentos de DNA codificadores das regiões estruturais sejam fundidas com locais de restrição adequados nas junções. Os locais de restrição podem ser gerados nas posições adequadas por mutagénese da molécula de DNA por procedimentos convencionais. As cassetes CDR sintéticas de cadeia dupla são preparadas por sintese de DNA de acordo com as sequências apresentadas em Seq. Id. No. 1 ou 2. Estas cassetes são proporcionadas com extremos coesivos de forma a poderem ser ligadas nas junções das regiões estruturais

Ainda, não é necessário ter acesso ao mRNA de uma linha celular produtora de hibridoma de forma a obter uma construção de DNA codificadora das moléculas de ligação a IL-Ιβ do invento. Assim o pedido de patente WO 90/07861 dá instruções completas para a produção de um anticorpo por técnicas de DNA recombinante, dando apenas informação escrita relativa à sequência de nucleótidos do gene. O método compreende a síntese de uma série de oligonu-cleótidos, a sua amplificação pelo método de PCR e o seu processamento para dar as sequências de DNA pretendidas.

Vectores de expressão compreendendo um promotor adequado ou genes codificadores das partes constantes das cadeias pesada e leve estão publicamente disponíveis. Assim, uma vez preparada uma molécula de DNA do invento, ela pode ser convenientemente transferida para um vector de 15 ΡΕ1248804 expressão adequado. As moléculas de DNA codificadoras de anticorpos de cadeia simples podem também ser preparadas por métodos convencionais, por exemplo, como descrito em WO 88/1649 .

Face ao que foi dito não é necessário nenhum hibridoma ou linha celular é necessário para cumprir os critérios de suficiência da descrição.

Numa realização particular o invento inclui uma primeira e segunda construções de DNA para a produção de uma molécula de ligação a IL-Ιβ como descrito abaixo: A primeira construção de DNA codifica uma cadeia pesada ou seu fragmento e compreende a) uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo regiões alternativas estruturais e hipervariáveis, as referidas regiões hipervariáveis sendo sequenciadamente CDR1, CDR2 e CDR3, as sequências de aminoácidos das quais estão apresentadas em Seq. Id. No. 1; esta primeira parte começa com um codão codificador do primeiro aminoácido do domínio variável e termina num codão codificador do último aminoácido do domínio variável e b) uma segunda parte codifica uma parte constante da cadeia pesada ou seu fragmento que começa com um codão codificador do primeiro aminoácido da parte constante da cadeia pesada e termina com um codão codificador do último 16 ΡΕ1248804 aminoácido da parte constante, seguido de um codao de paragem.

De preferência, esta primeira parte codifica um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à sequência de aminoácidos como se mostra em Seq. Id. No. 1, começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 118. Mais de preferência a primeira parte tem a sequência de nucleótidos apresentada em Seq. Id. No. 1, começando com o nucleótido na posição 1 e terminando com o nucleótido na posição 354. Igualmente de preferência, a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia pesada humana, mais de preferência a parte constante da cadeia γΐ. Esta segunda parte pode ser um fragmento de DNA de origem genómica (compreendendo intrões) ou um fragmento de cDNA (sem intrões). A segunda construção de DNA codifica uma cadeia leve ou seu fragmento e compreende a) uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo regiões alternativas estruturais e hipervariáveis; as referidas regiões hipervariáveis sendo CDR3' e facultativamente CDR1' e CDR2'; as sequências de aminoácidos das quais estão apresentadas em Seq. Id. No. 2; esta primeira parte começa com um codão codificador do primeiro aminoácido do domínio variável e termina com um codão codificador do último aminoácido do domínio variável, e 17 ΡΕ1248804 b) uma segunda parte codifica uma parte constante da cadeia leve ou seu fragmento que começa com um codão codificador do primeiro aminoácido da parte constante da cadeia leve e termina com um codão codificador do último aminoácido da parte constante, seguido de um codão de paragem.

De preferência, esta primeira parte codifica um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à sequência de aminoácidos como se mostra em Seq. Id. No. 2 começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 107. Mais de preferência, a primeira parte tem a sequência de nucleótidos apresentada em Seq. Id. No. 2, começando com o nucleótido na posição 1 e terminando com o nucleótido na posição 321. Igualmente de preferência, a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia leve humana, mais de preferência a parte constante da cadeia k. O invento também inclui moléculas que se ligam a IL- ip em que um ou mais dos resíduos de CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' ou CDR3' estão alterados relativamente aos resíduos mostrados em Seq Id No. 1 e Seq. Id. No. 2; por exemplo através de mutação e.g., mutagénese dirigida das sequências de DNA correspondentes. O invento inclui as sequências de DNA codificadoras de tais moléculas de ligação a IL-Ιβ alteradas. Em particular, o invento inclui moléculas de ligação a IL-Ιβ em que um ou mais resíduos de 18 ΡΕ1248804 CDR1' ou CDR2' foram alteradas relativamente aos resíduos em Seq. Id. No. 2.

Nas primeira e segunda construções de DNA, as primeira e segunda partes podem ser separadas por um intrão e um estimulador pode ser adequadamente situado no intrão entre as primeira e segunda partes. A presença de tal estimulador, que é transcrito mas não traduzido, pode contribuir para uma transcrição eficiente. Em realizações particulares as primeira e segunda construções de DNA compreendem o estimulador de um gene da cadeia pesada vantajosamente de origem humana.

Cada uma das construções de DNA é colocada sob o controlo de sequências de controlo adequadas, em particular sob o controlo de um promotor adequado. Pode ser usado qualquer tipo de promotor, desde que esteja adaptado ao organismo hospedeiro em que as construções de DNA serão transferidas para expressão. No entanto, se a expressão tiver lugar numa célula de mamífero, é particularmente preferido usar o promotor de um gene de imunoglobulina, ou um promotor de citomegalovírus, e.g. um promotor de CMV humano (CMV). 0 anticorpo preferido pode ser produzido numa cultura celular ou num animal transgénico. Um animal transgénico adequado pode ser obtido de acordo com métodos convencionais que incluem microinjecção de ovos, com as primeira e segunda construções de DNA colocadas sob o 19 ΡΕ1248804 controlo de sequências de controlo adequadas, transferência dos ovos assim preparados para fêmeas pseudográvidas adequadas e selecção de descendência expressando o anticorpo pretendido.

Quando as cadeias de anticorpo são produzidas numa cultura celular, as construções de DNA devem primeiro ser inseridas num vector de expressão único ou em dois vectores de expressão separados mas compatíveis, a última possibilidade sendo preferida.

Assim, o invento também proporciona um vector de expressão, capaz de se replicar numa linha celular procariótica ou eucariótica, que compreende pelo menos uma das construções de DNA atrás descrita.

Cada um dos vectores de expressão contendo uma construção de DNA foram separadamente inseridos em dois vectores de expressão, pode ser transferido separadamente, i.e. um tipo de vector por célula, ou cotransferidos, esta última possibilidade sendo preferida. Um organismo hospedeiro adequado pode ser uma bactéria, uma levedura ou uma linha celular de mamífero, sendo esta última preferida. Mais de preferência, a linha celular de mamífero é de origem linfóide, e.g. um mieloma, hibridoma ou uma célula B normal imortalizada, que convenientemente não expressa qualquer cadeia pesada ou leve de anticorpo endógeno.

Para expressão em células de mamífero prefere-se 20 ΡΕ1248804 que a sequência codificadora da molécula de ligação a IL-Ιβ seja integrada no DNA da célula hospedeira dentro de um locus que permite ou favorece um nivel elevado de expressão da molécula de ligação a IL-Ιβ. As células em que a sequência codificadora da molécula de ligação a IL-Ιβ está integrada em tais loci favoráveis podem ser identificadas e seleccionadas com base nos níveis da molécula de ligação a IL- 1β que expressam. Qualquer marca seleccionável adequada pode ser usada para a preparação das células hospedeiras contendo a sequência codificadora da molécula de ligação a IL-Ιβ; por exemplo, pode ser usado um sistema de selecção gene dhfr/metotrexato ou equivalente. Sistemas preferidos para a expressão de moléculas de ligação a IL-Ιβ do invento incluem sistemas de amplificação/selecção baseados em GS, tais como os descritos em EP 0256055 B, EP 0323997 B e publicação de patente Europeia EP0338841-B1. De preferência, também o vector pode conter outras sequências conforme pretendido para facilitar a expressão, processamento e exportação da proteína expressa; por exemplo, o vector pode tipicamente conter uma sequência líder associada à sequência codificadora.

Num outro aspecto do invento é proporcionado um processo para o produto de uma molécula de ligação a IL- 1β que compreende (i) cultura de um organismo que é transformado com um vector de expressão como definido atrás e (ii) recuperação da molécula de ligação a IL-Ιβ da cultura. 21 ΡΕ1248804

De acordo com o presente invento encontrou-se que o anticorpo AAL160 tem especificidade de ligação para o epitopo antigénico de IL- 1β humana que inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 de IL-Ιβ humana madura. (Os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 de IL-Ιβ humana madura corresponde aos resíduos 138, 139, 140 e 141 respectivamente do precursor de IL-Ιβ humana). Este epitopo parece estar fora do local de reconhecimento do receptor de IL-1 e é portanto mais surpreendente que os anticorpos contra este epitopo, e.g. o anticorpo AAL160, sejam capazes de inibir a ligação de IL-Ιβ ao seu receptor. Os anticorpos, em particular anticorpos quiméricos e com insertos de CDR particulares, e especialmente anticorpos humanos, que possuem especificidade de ligação ao epitopo antigénico de IL-Ιβ humana madura incluem os resíduos compreendendo a ansa, Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 e que são capazes de inibir a ligação de IL-Ιβ ao seu receptor; e utilização de tais anticorpos no tratamento de doenças ou alterações mediadas por IL-1, são novos e estão incluídos dentro do âmbito do presente invento.

Assim, num outro aspecto o invento inclui um anticorpo contra IL-Ιβ que tem especificidade de ligação a antigénio para um epitopo antigénico de IL-Ιβ humana que inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 de IL-Ιβ humana madura e que é capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ ao seu receptor. 22 ΡΕ1248804

Noutros aspectos, o invento inclui ainda: i) utilização de um anticorpo contra IL-Ιβ, o qual possui especificidade de ligação ao antigénio para um epitopo antigénico de IL-Ιβ humana madura que inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 e que é capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ ao seu receptor, para o tratamento de doenças ou alterações mediadas por IL-1; ii) um método para o tratamento de uma doença ou alteração mediada por IL-1 num doente, que compreende a administração ao doente de uma quantidade eficaz de um anticorpo contra IL-Ιβ, que possui especificidade de ligação a antigénio para um epitopo antigénico de IL- 1β humana madura que inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 e que é capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ ao seu receptor; iii) uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo contra IL-Ιβ, que tem especificidade de ligação a antigénio para um epitopo antigénico de IL-Ιβ humana madura que inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 e que é capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ ao seu receptor, em combinação com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável; e iv) utilização de um anticorpo contra IL-Ιβ, o qual tem especificidade de ligação a antigénio para um 23 ΡΕ1248804 epitopo antigénico de IL-Ιβ humana madura que inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 e que é capaz de inibir a ligação de IL- 1β ao seu receptor, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou alteração mediada por IL-1.

Para fins da presente descrição, um anticorpo é "capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ" se o anticorpo for capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ ao seu receptor substancialmente no mesmo grau do anticorpo AAL160, em que "no mesmo grau" tem o significado atribuído atrás.

Na presente descrição a frase "doença mediada por IL-1" abrange todas as doenças e condições clínicas em que IL-1 desempenha um papel, directa ou indirectamente, na doença ou condição clínica, incluindo causa, desenvolvimento, progresso, persistência ou patologia da doença ou condição.

Na presente descrição os termos "tratamento" ou "tratar" referem-se a tratamento profilático ou preventivo, assim como curativo ou tratamento modificador da doença, incluindo tratamento de doentes em risco de contraírem a doença ou suspeitos de ter contraído a doença, assim como doentes que estejam doentes ou que tenham sido diagnosticados como sofrendo de uma doença ou condição clínica e inclui a supressão de recorrência clínica.

Anticorpos que possuem especificidade para o ΡΕ1248804 - 24 - epitopo antigénico de IL-Ιβ humana madura, o qual inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 e que são capazes de inibir a ligação de IL-Ιβ ao seu receptor, são daqui em diante referidos como Anticorpos do Invento. De preferência, os Anticorpos do Invento são anticorpos que têm especificidade de ligação a este epitopo de IL-Ιβ humana quando a IL- ip humana está em condições nativas, e.g., em condições fisiológicas normais, não em condições desnaturadas, e.g. nem na presença de um agente desnaturante como seja SDS. Os Anticorpos do Invento podem dar reacção cruzada com IL-^s não humanas, as quais possuem epitopos antigénicos que incluem Gli no resíduo 22, Pro no resíduo 23, Tir no resíduo 24 e Glu no resíduo 25 e que estão estreitamente relacionados com o epitopo humano correspondente. Por exemplo, os Anticorpos do Invento podem dar reacção cruzada com as IL- 1β3 de primatas, tais como IL-1 de macaco Rhesus, macaco caranguejeiro (Macaca fascicularis) ou saguins.

De preferência, os Anticorpos do Invento são moléculas de ligação a IL-Ιβ de acordo com os primeiro e segundo aspecto do invento. Com vantagem os Anticorpos do Invento são anticorpos humanos, mais de preferência o anticorpo AAL160 ou o seu equivalente directo.

Os Anticorpos do Invento bloqueiam os efeitos de IL- ip nas suas células alvo e assim são indicados para usar no tratamento de doenças ou alterações mediadas por IL-1. Estas e outras actividades farmacológicas dos Anticorpos do 25 ΡΕ1248804

Invento podem ser demonstradas por métodos de ensaios convencionais, por exemplo como descrito abaixo: 1. Neutralização da activação do promotor de IL-8 mediada por IL-Ιβ humana. O potencial para neutralizar a sinalização celular dependente de IL-Ιβ é determinada num ensaio de gene repórter. A linha celular de melanoma humano G361 é estavelmente transfectada com uma construção do gene repórter da luciferase baseada no promotor da IL-8 humana. A expressão do gene repórter e a actividade está dependente de IL-Ιβ ou de TNF-α nesta linha celular. As células são estimuladas com 300 pg/ml de IL-Ιβ humana recombinante ou o equivalente a 100 pg/ml em meio condicionado, na presença de várias concentrações de Anticorpo do Invento ou de antagonista do receptor de IL-1 variando entre 6 e 18000 pM. O anticorpo quimérico Simulect® ("basiliximab") é usado como um controlo do isotipo correspondente. A actividade de luciferase é quantificada num ensaio quimioluminescente. Os anticorpos do Invento tipicamente possuem IC50 de aproximadamente 1 nM (e.g. entre cerca de 0,2 e cerca de 5 nM) quando testado neste ensaio. 2. Neutralização da produção de PGE2 e interleu-cina-6 dependente de IL- ip por fibroblastos humanos primários. 26 ΡΕ1248804 A produção de PGE2 e IL-6 em fibroblastos dérmicos humanos primários está dependente de IL-Ιβ. TNF-a por si só não pode eficazmente induzir estes mediadores inflamatórios, mas apresenta sinergia com IL-1. Os fibroblastos dérmicos primários são usados como modelo de activação celular induzida por IL-1.

Os fibroblastos humanos primários são estimulados com IL- ip humana recombinante ou meio condicionado obtido a partir de PBMCs humanos estimulados com LPS na presença de várias concentrações de Anticorpo do Invento ou IL-1 RA variando entre 6 e 18000 pM. O anticorpo quimérico anti-CD25 Simulect® ("basiliximab") é usado como um controlo do isotipo correspondente. 0 sobrenadante foi removido após 16 h de estimulação e testado relativamente a IL-6 por ELISA ou a PGE2 por RIA. Os Anticorpos do Invento tipicamente possuem CI50s para a inibição da produção de IL-6 de cerca de 1 nM ou menos (e.g. entre cerca de 0,1 e cerca de 1 nM) e para a inibição da produção de PGE2 de aproximadamente 1 nM (e.g. entre cerca de 0,1 e cerca de 1 nM) quando testados como atrás.

Conforme indicado nos ensaios atrás referidos, os Anticorpos do Invento bloqueiam potencialmente os efeitos de IL-Ιβ. Assim, os Anticorpos do Invento possuem utilidade farmacêutica como se segue:

Os Anticorpos do Invento são úteis para a 27 ΡΕ1248804 profilaxia e tratamento de doenças ou condições clinicas mediadas por IL-1, e.g. condições inflamatórias, alergias e condições alérgicas, reacções de hipersensibilidade, doenças auto-imunes, infecções graves e rejeição de transplantes de órgãos ou tecidos.

Por exemplo, os Anticorpos do Invento podem ser usados para o tratamento de recipientes de transplantes de coração, pulmão, coração-pulmão combinado, fígado, rim, pâncreas, pele ou córnea e para a prevenção de doença de enxerto-versus-hospedeiro, como acontece após transplante de medula óssea.

Os Anticorpos do Invento são particularmente úteis para o tratamento, prevenção ou alivio de doença auto-imune e de condições inflamatórias, em particular condições inflamatórias com uma etiologia incluindo uma componente auto-imune, como seja artrite (por exemplo artrite reumatóide, artrite crónica progressiva e artrite degenerativa) e doenças reumáticas, incluindo condições inflamatórias e doenças reumatóides envolvendo perda óssea, dor inflamatória, hipersensibilidade (incluindo hipersensibilidade das vias respiratórias e hipersensibilidade dérmica) e alergias. Doenças auto-imunes específicas para as quais os Anticorpos do invento podem ser empregues incluem alterações hematológicas auto-imunes (incluindo e.g., anemia hemolitica, anemia aplástica, anemia dos eritrócitos puros e trombocitopenia idiopática), lúpus sistémico eritematoso, policondrite, esclerodoma, granuloma- 28 ΡΕ1248804 tose de Wegener, dermatomiosite, hepatite crónica activa, miastenia grave, psoriase, síndrome de Steven-Johson, psi-lose idiopática, colite inflamatória auto-imune (incluindo e.g. colite ulcerativa, doença de Crohn e Síndrome do intestino irritável), oftalmopatia endócrina, doença de Graves, sarcoidose, esclerose múltipla, cirrose biliar primária, diabetes juvenil (diabetes melitus tipo I), uveite (anterior e posterior), queratoconjuntivite seca (síndrome do olho seco) e queratoconjuntivite vernal, fibrose intersticial do pulmão, artrite psoríática e glomerulonefrite (com e sem síndrome nefrótica, e.g. incluindo síndrome nefrótica idiopática ou nefropatia de alteração mínima).

Os Anticorpos do Invento são também úteis para o tratamento, prevenção ou alívio de asma, bronquite, pneu-moconiose, enfisema pulmonar e outras doenças obstrutivas ou inflamatórias das vias respiratórias.

Os Anticorpos do Invento são úteis no tratamento de reacções inflamatórias agudas e hiperagudas indesejáveis, que são mediadas por IL-1 ou envolvem a produção de IL-1, especialmente IL-Ιβ, ou a promoção da produção de TNF por IL-1, e.g., infecções agudas, por exemplo choque séptico (e.g., choque endotóxico e síndrome da distrofia respiratória adulta), meningite, pneumonia; e queimaduras graves; e para o tratamento de caquexia ou síndrome da perda de peso associada à produção de TNF mórbida, subsequente à infecção, cancro ou disfunções de órgãos, espe- 29 ΡΕ1248804 cialmente caquexia relacionada com SIDA, e.g., associada com ou subsequente à infecção por HIV.

Os Anticorpos do invento são particularmente úteis para o tratamento de doenças de metabolismo ósseo incluindo osteoartrite, osteoporose e outras artrites inflamatórias e perda de osso em geral, incluindo perda de osso relacionada com a idade e, em particular, doença periodontal.

Os Anticorpos do Invento podem ser usados ara o tratamento de cancros, em particular tumores dependentes de IL-1 .

Para estas indicações, a dosagem apropriada certamente variará, por exemplo, com o Anticorpo do Invento particular a ser empregue, o hospedeiro, o modo de administração e a natureza e gravidade da condição a ser tratada. No entanto, na utilização profilática, os resultados satisfatórios são geralmente indicados para serem obtidos em dosagens diárias entre cerca de 0,1 mg e cerca de 5 mg por quilograma de peso de corpo. O Anticorpo do Invento é convenientemente administrado por via paren-térica, intravenosa, e.g., na veia antecubical ou outra veia periférica, intramuscular ou subcutânea. Um tratamento profilático tipicamente compreende a administração da molécula do invento uma vez por dia durante 2 a 4 semanas.

As composições farmacêuticas do invento podem ser 30 ΡΕ1248804 produzidas de forma convencional. Uma composição de acordo com o invento é de preferência proporcionada na forma liofilizada. Para a administração imediata é dissolvida num veiculo aquoso adequado, por exemplo água estéril para injecção ou soro fisiológico tamponado estéril. Considera-se desejável preparar uma solução com um volume maior para administração por infusão, e.g. infusão iv, em vez de uma injecção de bolus, e.g. uma injecção de bolus sc, é vantajoso incorporar albumina sérica humana ou o próprio sangue do doente heparinizado em soro fisiológico na altura da formulação. A presença de um excesso de tal proteína fisiologicamente inerte evita a perda de anticorpo através da adsorção às paredes do recipiente e tubagem usados com a solução de infusão. Caso se use albumina, uma concentração adequada é entre 0,5 e 4,5% por peso de soro fisiológico. O invento é ainda descrito, apenas com fins ilustrativos, nos Exemplos que seguem e que se referem às Figuras juntas:

Figura 1 é um gráfico que mostra a inibição competitiva da ligação de AAL160 a IL-Ιβ por receptores de IL-1 solúveis tipo I e tipo II;

Figura 2 é um gráfico que mostra a inibição de febre induzida por IL-Ιβ num modelo de rato por AAL160 e

Figura 3 é um gráfico que mostra a duração da acção de AAL160 sobre febre induzida por IL-Ιβ em rato. ΡΕ1248804 31

EXEMPLOS

Ratinhos transgénicos manipulados de forma a expressarem o repertório de IgG/κ humano em vez do repertório de imunoglobulina de ratinho (Fishwild et ai., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851) foram usados para gerar anticorpos contra IL-Ιβ humana. As células B derivadas destes ratinhos foram imortalizadas através de tecnologia de hibridomas convencional e obtidas células de hibridoma de ratinho que secretam o anticorpo IgG/κ humano AAL160.

Exemplo 1: Produção de hibridoma e purificação do anticorpo. 0 ratinho 66 manipulado geneticamente (Medarex Inc. Annadale, NJ) foi imunizado com IL- ip humana recombinante (50 μg) s.c. em vários locais, em adjuvante. O ratinho recebeu reforços mais cinco vezes, sendo a última injecção três vezes antes da fusão. No dia da fusão o ratinho 66 foi morto por inalação de CO2 e as células do baço (4,1 x 107) foram fundidas por um método de rotina usando PEG 4000 com um número igual de células PAI-O, uma linha celular de mieloma de ratinho. As células fundidas foram semeadas em placas de 624 alvéolos (1 ml/alvéolo) contendo uma camada de suporte de células peritoneais de ratinho (ratinhos Balb C) , em RPMI 1640 suplementado com HAT, 10% de soro fetal inactivado 5 x 10~5 M de β-mercaptoetanol. Os sobrenadantes foram colhidos e testados em ELISA e testados relativamente a anticorpos monoclonais 32 ΡΕ1248804 reactivos com IL-Ιβ. Foram identificados cinco anticorpos monoclonais da subclasse IgG/κ. A clonagem foi feita usando placas de microtitulação de 4 x 96 alvéolos, semeando 0,5 células por alvéolo. Após duas semanas, os alvéolos foram analisados ao microscópio invertido. O sobrenadante foi colhido dos alvéolos positivos para o crescimento e produção de anticorpos monoclonais anti-IL- ip foi avaliada por ELISA. 1-2 1 do sobrenadante condicionado de quatro subclones do hibridoma originalmente identificado #476 foram preparados e os anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade numa coluna de proteína A.

Pureza e sequências parciais de aminoácidos das cadeias pesada e leve

Sequenciação de aminoácidos

As cadeias leve e pesada do anticorpo AAL160 purificado foram separadas por SDS-PAGE e os aminoácidos amino-terminais determinados por degradação de Edman. A pureza do anticorpo usado nestes estudos é >90% por sequenciação. As sequências de cDNA codificadoras dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve foram obtidas por amplificação de PCR do cDNA obtido a partir de mRNA das células de hibridoma clonado e totalmente sequenciadas. As sequências do extremo amina dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve e as correspondentes sequências de DNA estão apresentadas abaixo, em que as CDRs estão apresentadas a negrito. 33 ΡΕ1248804

Seq, Id no. 1 30 Si GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GÇSA GCA GAG GTG Aàà AAC CCC gog gag TCT CTG AAG ATC Glu Vai Cl» Leu Vai Gin ser Gly· Ala Glu Val Lys Lys gro Gly Gla Ser Leu Lys 11e 10 20 ao CPA* 120 TCC TGT AAG GGT TCT GCA TAC AGC TTT ACC AGC tae TGG ATC e»C TGG GTG CGC CAG ATG Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser The Thr S*r Tyr Trp Ile Oly Trp Val Aro Gin Met 30 40 150 CDR2 ISO CCC GGG AAA GGC CTG G»G TGG ATO GGG ATC ATC TA* cc* AG* GAC TC* GA* ACC AGA TAC Oro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Tle lie Pre Ser AGP Ser Aep Thr Ar* Tyr 50 €0 210 240 A0C CCG TCC TTC CAA CCC CAG CTC ACC ATC TCA GCC GAC AAG TÇÇ ATC AGC ACC GCC TAC Ser s*e Ser Phe Gla Oly Gin val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser 11« Ser Thr Ala Tyr 70 SO 27« 300 CTG CAG TGG A«C ASC CTG AAB GCC TCG GAC ACC CCC ATG TAT TAC TGT GCQ AGA TA* ACC Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Aeg» Thr Ala Mefc Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Thr 50 100 CBR3 330 AAC TCC GA* «C* *** CAT A*C TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTÇ ACC GTC TCT TCA Aan τχρ A«p Ala the Aep 11« Trp Gly Gin Gly Thr tíet vai Thr Val Ser Ser Seq. Id no. 2 30 00 ÇAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC AÇÇ CTG TCT TTG TCT CCA OGG GAA AGA GCC ACC Glw 11» Val Leu Thr Gin Sèr Ara Ala Thr Lâti Ser Lê» Ser Pro Gly Glu Argr Ala Thr 10 20 csaa 90 120 CTC TCC TGC ACM GCC AG* CAG AOT GTT AGC AGC TAC TTA GCC TGG TAC CAA CAG AAA CCT Leu Ser cya Ar* Ala Ser Gin. ser V«1 Ser Ser Tyr Le» Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 30 40

150 C»R2 ISO

GGC CftS GCT CCC AOG CTC CTC ATC TAT GAT OCA TOC AAC AGO OCC AC* GGC ATC CCA GCC 34 ΡΕ1248804

Oly Sln Ala Pro Arg Lsu Lísu Ile Tyr Aep Ala S-ôjet Aen Ar a Ala Tiw Oly lie Pr 3 Ala 5P 65 310 £40 ASÔ TTC AGT CGC AGT GGG TCT GGG AÇA GAC TTC ACT CTC ÀCC ATC AGC AGC CTT GAG CC? Arg Ph« Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phs Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 70 $0 270 CDS3 300

GAA GA1? TT7 GcA e*TT TÃT TAÇ fGT CAG CAG CBS AGÇ *AÇ TG» ATS TXÇ CCT TTT GGC CAG

Glu Asp Pha Ala Vai Tyr Tyr Cya Gla Gla Ars Sar Ae» Trp «et Pha Pr© Phe Gly Gin

90 ISO S3S ACC AAG CTG GAG ATC ΑΛΑ Gly Thr Lys Leu Glu Xie Lys

As sequências de DNA codificadoras dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve e as sequências de aminoácidos correspondentes de AAL160 estão também apresentadas na listagem de sequências junta como Seq. Id. Nos. 1 a 4.

Construção de vectores de expressão para a cadeia pesada e leve

As sequências codificadoras clonadas VL e VH foram amplificadas por PCR e inseridas através de locais de restrição adequados em vectores cassete possuindo o promotor da imunoglobulina, as sequências líder derivadas do anticorpo RFT2 (Heinrich et al. (1989) J. Immunol. 143, 3589-97), parte dos segmentos J e um local dador de "splicing". A cassete da cadeia leve contendo a totalidade da região VL, promotor e sequência líder para secreção foi transferida para um vector de expressão contendo o gene Ck 35 ΡΕ1248804 humano, o estimulador da cadeia pesada de imunoglobulina e o cDNA dhfr modificado de ratinho para selecção por metotrexato (MTX). A cassete da cadeia pesada foi assim transferida para um vector de expressão codificador do gene IgGl humano, tendo o estimulador da cadeia pesada de imunoglobulina e o gene de resistência à neomicina para selecção.

As cadeias leve e pesada estão numa configuração nos vectores de expressão que se assemelha à configuração genómica dos genes de imunoglobulina rearranjados que se pensa ser crucial para um nível elevado de expressão.

Para a produção de anticorpos os vectores atrás referidos são cotransfectados numa linha de células hospedeiras adequadas, e.g. a linha celular SP2/0, células contendo as sequências do vector são seleccionadas por selecção com metotrexato e as linhas celulares seleccionadas são cultivadas para expressarem o anticorpo AAL160. Como alternativa, pode ser usado um sistema de amplificação/selecção baseado em GS, como seja o descrito em EP 0256055 B, EP 0323997 B ou publicação de patente Europeia EP0338841-B1, em que a marca seleccionável dhfr é substituída por uma sequência codificadora de GS. 36 ΡΕ1248804

Exemplo 2: Dados Bioquímicos e biológicos

Encontrou-se que o anticorpo monoclonal AAL160 neutraliza a actividade de interleucina-ΐβ in vitro. 0 anticorpo monoclonal é ainda caracterizado pela análise da sua ligação a IL-Ιβ humana recombinante Biacore. O modo de neutralização foi avaliado por estudos de ligação competitiva com receptores solúveis de IL-1. A actividade biológica do anticorpo AAL160 relativamente a IL- 1β recombinante e natural foi determinada em células humanas primárias (Exemplo 3), que respondem à estimulação por IL-Ιβ. 2.1 Determinação da constante de equilíbrio de dissociação A constante de velocidade de associação e dissociação para a ligação de IL-Ιβ humana recombinante a AAL160 foi determinada por análise BIAcore. AAL160 é imobilizado e a ligação de IL-Ιβ recombinante numa gama de concentração entre 0,5 e 12 nM foi medida através da ressonância de plasmões de superfície. 0 formato escolhido permite o tratamento da ligação de IL-Ιβ a AAL-160 de acordo com uma estequiometria de 1:1. A análise de dados foi realizada usando o programa BIAevaluation.

Constante de velocidade de (n=15) (3,91 ± 0,14)xlO5 Média ± DP associação [M_1s_1] Constante de dissociação [s 1 ] (n=15) (1,53 ±0,05) xl0~4 Média ± DP Constante de equilíbrio de (n=15) (396,6 ± 19,5) xl0~12 Média ± DP dissociação KD [M] 37 ΡΕ1248804 AAL160 liga-se a IL- ip humana recombinante com uma elevada afinidade. 2.2. Inibição competitiva de ligação a receptores solúveis de IL-1

Estudo de competição da ligação com receptores solúveis de IL-1 tipo I e tipo II A competição entre AAL160 e receptores solúveis de IL-1 tipo I e tipo II é medida por Biacore. AAL160 está imobilizada na superfície de uma microplaca e IL-Ιβ humana recombinante (8 nM) é injectada para ligação a AAL160 na ausência ou presença de concentrações crescentes de re-ceptor solúvel humano recombinante I (0-10 nM) ou receptor II (0.80 nM) . Os resultados obtidos estão apresentados na Figura 1. A ligação de NVP AAL160 NX-1 a IL-Ιβ é competitiva com o receptor de IL-1 tipo I e tipo II. 2.3. Perfil de reactividade com IL-Ια humana, IL-1RA humana e IL-Ιβ de espécies de roedores e de macacos 0 perfil de reactividade de AAL160 com IL-la, IL-1RA e IL-Ιβ de ratinho, rato, coelho e macaco caran-guejeiro foi determinado por análise Biacore. AAL160 está imobilizada e as citocinas examinadas são aplicadas numa concentração de 8 nM (ou 20 nM no caso de IL-Ιβ). 38 ΡΕ1248804

Percentagem de ligação total ± DP IL-Ιβ humana 100 IL-Ια humana 0,7 ± 0,7 (n=3) IL—IRA humana 1,2 ± 1,2 (n=3) IL-Ιβ de catinho 2,8 ± 1,5 (n=3) IL-Ιβ de rato 3,0 ± 2,5 (n=3) IL-Ιβ macaco 96,4 ±6,8 (n=3) IL-Ιβ de coelho 12,1 ±2,3 (n=4) AAL160 não dá reacção cruzada significativa com IL-Ια humana, IL-1RA humana ou IL-Ιβ de ratinho, rato ou coelho. A reactividade com IL- 1β de macaco caranguejeiro é virtualmente idêntica à da citocina humana.

Exemplo 3: Neutralização da produção de PGE2 e de interleucina-6 dependente de IL-Ιβ por fibroblastos humanos primários. A produção de PGE2 e IL-6 em fibroblastos dérmicos humanos primários está dependente de IL-Ιβ. TNF-a sozinho não pode induzir eficazmente estes mediadores inflamatórios, mas antes em sinergia com IL-1. Fibroblastos dérmicos primários foram usados como modelo de activação celular induzida por IL-1.

Fibroblastos humanos primários foram estimulados com IL-Ιβ recombinante ou meio condicionado obtido a partir de PBMCs humanos estimulados com LPS na presença de várias concentrações de AAL160 ou IL-1RA variando entre 6 e 18000 pM. O anticorpo anti-CD25 quimérico Simulect® 39 ΡΕ1248804 ("basiliximab") foi usado como controlo do isotipo correspondente. 0 sobrenadante foi colhido 16 horas após estimulação e foi testada relativamente a IL-6 por ELISA ou PGE2 por RIA. AAL160 IL—IRA CI50 ± DP (n>3) CI50 ± DP (n>3) Secreção de IL-6 recombinante 0,34 ± 0,037 nM n.d. Meio cond. de secreção de IL-6 0,6 ± 0,09 nM 0,03 ± 0,001 nM Meio condicionado de produção de PGE2 0,79 ± 0,17 nM n.d. AAL160 bloqueia eficazmente a produção de IL-β e PGE2 em fibroblastos dérmicos humanos com uma CI50 semelhante para IL-Ιβ recombinante e natural.

Exemplo 4: Eficácia in vivo e duração da actuação de AAL160

Eficácia: A eficácia in vivo de um anticorpo anti-huIL- 1β, AAL160 foi testada num modelo de rato em que a febre é induzida por uma injecção i.v. de huIL-Ιβ (100 ng/rato). 0 anticorpo causa uma inibição relacionada com a dose da resposta de febre relativamente à gama de dosagem de 1, 3 e 10 μg/Kg i.v. (n=6 ratos) - ver Figura 2. CHI 621 (Simulect®, "basiliximab") é usado como o anticorpo controlo. 40 ΡΕ1248804

Duração da actuagão: A duração da actuação de AAL-160 foi estudada no modelo de febre induzida por IL-Ιβ, em rato, como se segue: O anticorpo foi injectado i.v. 24 horas ou 30 minutos (protocolo convencional) antes da indução de febre por injecção i.v. de IL- ip humana e a temperatura do corpo medida 2 e 4 horas mais tarde. Um grau semelhante de inibição da resposta de febre é observada em ambos os tempos (ver Figura 3). Conforme esperado, o anticorpo controlo CHI 621 (Simulect®, "basiliximab") é ineficaz em ambos pontos de tempo. Este resultado indica que o anticorpo AAL160 humano está presente numa forma activa durante pelo menos 24 horas no rato e não é metabolizado, excretado ou ligado aos tecidos durante este tempo.

Exemplo 5: Estudos de raios X de AAL160 Fab e o seu complexo com IL-Ιβ

Determinação da estrutura de AAL160 Fab na resolução a 2,0Â:

Uma série de dados de resolução a 2,0 À de muito boa qualidade (Rsym = 0,051, integralidade = 99,9%, redundância = 8,2) foi colhida a partir do cristal de Fab formado por difusão de vapor na técnica de gota pendente, a pH 9,5 em 50% PEG 200, CHES 0,1M. O cristal estava no grupo espacial P2i2i2i com dimensões de unidade celular a=62,17Ã 41 ΡΕ1248804 b=89,83Â c=123,73Â e uma molécula Fab por unidade simétrica (coeficiente Matthews: 3,6Â3/Da, teor de solvente estimado:66%). A estrutura foi determinada por substituição molecular e foi refinada para um factor R cristalográfico final de 0,209 (factor R livre = 0,261). 0 modelo final inclui os resíduos 1-213 da cadeia leve, 1-131 e 138-218 da cadeia pesada, 387 moléculas de água e 1 molécula de PEG. A densidade de electrões final está bem definida para todos os resíduos CDR excepto para Trp 94 (CDR3) da cadeia leve. A posição da cadeia lateral deste resíduo está mal definida nas duas formas de cristal que foram examinadas até agora, sugerindo assim que é altamente móvel na ausência de um antigénio ligado. A cristalização do complexo Fab com IL- 1β e o modelo experimental preliminar do complexo: alguns cristais de AAL160 Fab no complexo com o antigénio IL- 1β foram obtidos a partir de uma solução mãe de 76 mg/ml do complexo 1:1 em sulfato de amónio 2,0 M, Tris 0,1M pH 8,5. Os cristais cresceram muito lentamente ao longo de um período de várias semanas. Eles difractaram fracamente até cerca de 3,2 À na fonte original. Uma série de dados preliminares foi colhida e a substituição molecular foi tentada usando as estruturas de elevada resolução de Fab livre e IL-Ιβ humana (J.P. Priestle et al. , EMBO J. 7, 339 (1988)) como modelos de partida. Os cálculos deram uma solução muito clara e não ambígua quando as partes Fv e Fc do Fab foram 42 ΡΕ1248804 usadas como módulos separados (correlação 67,1%, factor R 0,354 após o passo AMORE FITTING, usando os dados entre 8,0 e 3,5Ã). A comparação subsequente das formas livres e ligadas do Fab mostraram que o ângulo de cotovelo é muito diferente nas duas estruturas. Os resultados dos cálculos de substituição molecular proporcionam um primeiro modelo molecular das interacções entre o antigénio IL-Ιβ e o anticorpo monoclonal AAL160. Uma análise preliminar destas interacções indica que 1) IL-Ιβ faz interacções estreitas com as três CDRs da cadeia pesada e com CDR3 da cadeia leve. Pelo contrário, poucas interacções ou nenhumas envolvem CDR1 e CDR2 da cadeia leve. 2) A ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 da IL-Ιβ madura ligam-se no centro do local de combinação com antigénio e assim parecem ser um componente chave do epitopo. É interessante que esta ansa não está situada na região da molécula que difere mais da IL- ip de ratinho. Pro 23, Tir 24 e Glu 25 são conservados, mas o resíduo 22 é uma Gli em IL- ip humana e uma Asp em IL- ip de ratinho. A comparação das estruturas do cristal de IL-Ιβ humano (entrada PDB 2ilb) e de ratinho (entrada PDB 8ilb) mostra que esta mutação pontual resulta numa conformação muito diferente da cadeia principal à volta de Pro 23. Esta diferença estrutural local é consistente com a ausência de reactividade cruzada observada do AAL160 relativamente à citocina de ratinho. 43 ΡΕ1248804

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Novartis AG <120> ANTICORPOS CONTRA IL-1 BETA HUMANA <130> 4-312893 <160> 4 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 354

<212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 1 ea* ggc eag gtc Gin Gly Gin Vai 65 ctg eag tgg age Leu Gin Trp Set gtg eag tct gga gea 3*9 Stg aaa aag ccc ggg gag 48 Vai 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Vai Lys Lys Pro Gly 15 Gl« tee tgt aag ggt tct gga tae age ttt acc age tae 96 Ser çys Lys Gly Ser 25 Gly TVr Ser Phe Thr 3ô Ser Tyr gtg ege cag atg ccc 0S9 aaa ggç ctg gag tgg atg 144 Vai arg Gin Hat Pre 40 Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Met eet agt gac tct gat acc aga tae age ceg tec ttc 192 Pro Ser Asp Ser Asp 55 24ar Arg Tyr 66 Ser Pro Ser Phe ace ate feca gee gac aag tee ate age acc gee tac 24 Õ Thr 11* ?0 Ser Ala Asp Lys Ser lie 75 Ser Thr Ala 80 age ctg aag gee teg gac acc gee atg tat tac tgt 288 Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Hat 7¾¾ Tyr Cys 65 90 95 gag gtg ewg ctg Givi Vai Gin Leu l tct ctg aag ate Ser Leu Lys 11* 20 tgg ate ggc fcgg Trp 11« Gly Trp 35 ggg ate ate t&t Gly 21* 21* 50 gcg aga tat acc Ala Arg Tyr Thr 100 aae tgg gat gee ctt gat ate egg ggc SOt *«» 336

Aan Trp Asp Ala Phs Asp Ile T*p Gly «i» Gly ^

105 HO atg gtc acc gfcc tct tea Met vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 2 <211> 118 <212> PRT 354 44 ΡΕ1248804 <213> Mus musculus <400> 2

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Alã Glu Vai Lys Lya Pro Gly Glu 2* S 10 15

Sar Leu Lya II a Ser Cya Lya Gly Ser Gly Tyr Ser PAe Tter Ser Tyr 20 25 30 T«p Ile Gly Trp Vai Arg Gin Hat Pro Gly Lya Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie Ile Tyr Pr© Ser Asp Ser Asp Thr Arg "Tyr Ser Pro Ser phe 50 55 m

Gin Gly Gin Vai Thr lie Ser Ala As» Lya Ser 11« Ser Thr Ala Tyr 65 tO 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lya Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cy® 85 50 95

Al» Arg Tyr Thr Asn Trp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Hat Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 3 gaa att ftg ttg aca eag tefc ©«« gce aec efef t«* fcfcO ggõ 40 45 ΡΕ1248804

Giu n« 1 Vai Leu Thr 5 Gin Ser pro Ala g&a aga Glu Arg gce Alá acc Thr 20 ctc Leu tcc S*r tgc agg Cys Arg gCc Ala 25 eta gce Leu Ala t«fO Trp 35 fcae Tyr caa Gin cag Gin aaa Lys cct Pro 40 ggc Gly tat gat Tyr ASp 50 gca Ala tcc Ser aae Asn agg Arg gse Ala 55 act Thr ggc Gly agt ggg Ser Gly 5$ tet Ser S9Sr Gly aea Thr gac Asp 7Q ttc Phe act Thr ctc Lfeu gaa gat Glu Asp ttt Phe gca Ala gfcfc Vai 85 tafc Tyr tac tgt Tyr Cys eag Gin cct ttt Pro Phe ggc Gly eag Gin 100 ggg Gly acc Thr aag Lys ctg Leu gag Glu 105 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 25 agt S«r cagr Gin agt Ser gtt Vai age Ser 30 age tac Ser Tyr 96 cag Gin gefe Ala ccc Pro Arg 45 ccc Leu. ctc ate Leu lie 144 etc Ile CCâ Pro gee Ala 60 agg Arg ttc Phe agfc ggc Ser Gly 192 acc. Thr ate lie 75 age Ser age Ser ect Leu gag ect Glu Pro 80 240 cag cgt Gin Arg 00 age Ser aac Asn tgg Trp atg ttc Met Phe 95 288 ate aaa He Lys 321

Olu li* Vai Leu Thr <51» S*r Fro Ala Thr Ser Le» Ser Fr* Gly 1 5 10 X5

Oiti Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 2ÍT 25 SÓ

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Axg Ala Thr Gly lie Pr o Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 50

Ser Gly Ser €5

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ila ser Ser Leu Glu pro 70 7$ te

Olu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin õi» Arg Ser As» Trp Met Phe ss m ss pro Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

Lisboa, 2 de Fevereiro de 2007

Claims (15)

1 ΡΕ1248804 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo contra IL-Ιβ que possui especificidade de ligação a antigénio para um epitopo antigénico de IL- ip humana madura, o qual inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25, e que é capaz de inibir a ligação de IL- ιβ ao seu receptor.

2. A molécula de ligação a IL-Ιβ de acordo com a reivindicação 1, que compreende um local de ligação a antigénio, possuindo pelo menos um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 como se mostra em Seq. Id. No. 1, i.e. a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos Ser-Tir-Trp-Ile-Gli, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos Ile-Ile-Tir-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Tre-Arg-Tir-Ser-Pro-Ser-Fen-Gln-Gli e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos Tir-Tre-Asn-Trp-Asp-Ala-Fen-Asp-Ile.

3. A molécula de ligação a IL-Ιβ de acordo com a reivindicação 1 em que (i) (as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 consideradas em conjunto são pelo menos 80% homólogas, de preferência pelo menos 90% homólogos, mais de preferência pelo menos 95% homólogas das regiões hipervariáveis como se mostra em Seq. Id. N° 1 e, 2 ΡΕ1248804 (ii) que é capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ aos seus receptores substancialmente no mesmo grau da molécula de referência tendo regiões estruturais idênticas às da molécula X mas tendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às apresentadas em Seq. Id. No. 1

4. A molécula de ligação a IL-Ιβ de acordo com a reivindicação 1 compreendendo os domínios variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL), em que a referida molécula de ligação a IL-Ιβ compreende pelo menos um local de ligação a antigénio compreendendo (i) um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 como se mostra em Seq. Id. No. 1, i.e. a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos Ser-Tir-Trp-Ile-Gli, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos Ile-Ile-Tir-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Tre-Arg-Tir-Ser-Pro-Ser-Fen-Gln-Gli e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos Tir-Tre-Asn-Trp-Asp-Ala-Fen-Asp-Ile e (ii) um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende uma região hipervariável CDR3' tendo a sequência de aminoácidos Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Fen-Pro.

5. A molécula de ligação a IL-Ιβ de acordo com a reivindicação 1 3 ΡΕ1248804 (i) em que as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' e, facultativamente, CDR1' e CDR2' consideradas na totalidade são pelo menos 80% homólogos das regiões hipervariáveis como se mostra em Seq. Id. No. 2 e (ii) que é capaz de inibir a ligação de IL-Ιβ as seus receptores substancialmente no mesmo grau de uma molécula de referência tendo as regiões estruturais e partes constantes idênticas à molécula de ligação a IL- ip descrita em (i) desta reivindicação, mas tendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2, CDR3 e CDR3', e, facultativamente, CDR1' e CDR2', idênticas às apresentadas em Seq. Id. No. 1 e 2.

6. A molécula de ligação a IL-Ιβ de acordo com a reivindicação 4, em que o domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) compreende sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDR1', CDR2' e CDR3' como se mostra em Seq. Id. No. 2, i.e. a referida CDR1' tendo a sequência de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Val-Ser-Ser-Tir-Leu-Ala, a referida CDR2' tendo a sequência de aminoácidos Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Tre e a referida CDR3' tendo a sequência Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Fen-Pro.

7. A molécula de ligação a IL-Ιβ de acordo com a reivindicação 4, 5 ou 6 que é um anticorpo humano.

8. A molécula de ligação a IL-Ιβ que compreende pelo menos um local de ligação a antigénio 4 ΡΕ1248804 (i) compreendendo um primeiro domínio tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à apresentada em Seq. Id. No. 1, começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 118; ou (ii) compreendendo a) uma cadeia pesada que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica ao apresentado em Seq. Id. No. 1, começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 118, e a parte constante de uma cadeia pesada humana; e b) uma cadeia leve que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em Seq. Id. No. 2, começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 107, e a parte constante de uma cadeia leve humana.

9. Uma molécula de ligação a IL-Ιβ de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, para usar como medicamento.

10. A utilização de uma molécula de ligação a IL- ip de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 para a produção de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença ou alteração mediada por IL- iP; ou para a prevenção ou tratamento de condições inflamatórias, alergias e condições alérgicas, reacções de hipersensibi- 5 ΡΕ1248804 lidade, doenças auto-imunes, infecções graves, rejeição de transplantes de órgãos ou tecidos, doença auto-imune, artrite, artrite reumatóide, artrite crónica progressiva e artrite degenerativa, doenças reumáticas, dor inflamatória, hipersensibilidade, hipersensibilidade das vias respiratórias, hipersensibilidade dérmica, alergias, alterações hematológicas, anemia hemolítica, anemia aplástica, anemia dos eritrócitos puros e trombocitopenia idiopática, lúpus sistémico eritematoso, policondrite, esclerodoma, granulomatose de Wegener, dermatomiosite, hepatite crónica activa, miastenia grave, psoríase, sindrome de Steven-Johson, psilose idiopática, colite inflamatória auto-imune, colite ulcerativa, doença de Crohn e Sindrome do intestino irritável), oftalmopatia endócrina, doença de Graves, sarcoidose, esclerose múltipla, cirrose biliar primária, diabetes juvenil, diabetes melitus tipo I, uveite (anterior e posterior), queratoconjuntivite seca (sindrome do olho seco) e queratoconjuntivite vernal, fibrose intersticial pulmonar, artrite psoriática e glomerulonefrite, sindrome nefrótica idiopática, nefropatia de alteração mínima, asma, bronquite, pneumoconiose, enfisema pulmonar e outras doenças, obstrutivas ou inflamatórias das vias respiratórias, reacções inflamatórias agudas e hiperagudas, infecções agudas, choque séptico, choque endotóxico, sindrome da distrofia respiratória adulta, meningite, pneumonia; e queimaduras graves; caquexia ou sindrome da perda de peso, cancro ou disfunção de órgãos, caquexia relacionada com SIDA, doenças de metabolismo ósseo, osteoartrite, osteoporose, outras artrites inflamatórias, perda de osso 6 ΡΕ1248804 em geral, perda de osso relacionada com a idade, doença periodontal e tumores dependentes de IL-1.

11. Uma primeira construção de DNA codificadora de um fragmento da cadeia pesada ou seu fragmento que compreende (i) uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo regiões alternativas estruturais e hipervariáveis, as referidas regiões hipervariáveis sendo sequenciadamente CDR1, CDR2 e CDR3, as sequências de aminoácidos das quais estão apresentadas em Seq. Id. No. 1; esta primeira parte começa com um codão codificador do primeiro aminoácido do domínio variável e termina num codão codificador do último aminoácido do domínio variável e ii) uma segunda parte codifica uma parte constante da cadeia pesada, ou seu fragmento, que começa com um codão codificador do primeiro aminoácido da parte constante da cadeia pesada e termina com um codão codificador do último aminoácido da parte constante, seguido de um codão de paragem.

12. Uma primeira construção de DNA codificadora de uma cadeia pesada ou seu fragmento que compreende (i) uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo regiões alternativas estruturais e hipervariáveis, as referidas regiões hipervariáveis sendo sequenciadamente CDR1, CDR2 e CDR3, as sequências de 7 ΡΕ1248804 aminoácidos das quais estão apresentadas em Seq. Id. No. 1; esta primeira parte começa com um codão codificador do primeiro aminoácido do domínio variável e termina num codão codificador do último aminoácido do domínio variável e ii) uma segunda parte codifica uma parte constante da cadeia pesada, ou seu fragmento, que começa com um codão codificador do primeiro aminoácido da parte constante da cadeia pesada e termina com um codão codificador do último aminoácido da parte constante, seguido de um codão de paragem; e uma segunda construção de DNA codificadora de uma cadeia leve que compreende iii) uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo regiões alternativas estruturais e hipervariáveis; as referidas regiões hipervariáveis sendo CDR3' e, facultativamente, CDR1' e CDR2'; as sequências de aminoácidos das quais estão apresentadas em Seq. Id. No. 2; esta primeira parte começa com um codão codificador do primeiro aminoácido do domínio variável e termina com um codão codificador do último aminoácido do domínio variável, e iv) uma segunda parte codifica uma parte constante da cadeia leve ou seu fragmento que começa com um codão codificador do primeiro aminoácido da parte constante da cadeia leve e termina com um codão codificador do último aminoácido da parte constante, seguido de um codão de paragem. ΡΕ1248804

13. Um vector de expressão capaz de se replicar numa linha celular procariótica ou eucariótica que compreende pelo menos uma construção de DNA de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12.

14. Um processo para a produção de uma molécula de ligação a IL- 1β que compreende (i) cultura de um organismo que é transformado com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 13; e (ii) recuperação da molécula de ligaçao a IL-Ιβ a partir da cultura.

15. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo contra IL-Ιβ que possui especificidade de ligação a antigénio para um epitopo antigénico de IL-Ιβ humana madura que inclui a ansa compreendendo os resíduos Gli 22, Pro 23, Tir 24 e Glu 25 e que é capaz de inibir a ligação de IL- ιβ ao seu receptor, em combinação com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 2 de Fevereiro de 2007