CN1395581B - 重组人白细胞介素-1β抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了IL-1β结合分子，尤其提供了抗人IL-1β抗体，特别是抗人IL-1β人抗体，其中重链和轻链的CDR具有如所定义的氨基酸序列，用于治疗IL-1介导的疾病或病症，例如骨关节炎、骨质疏松症和其它炎性关节炎。

Description

重组人白细胞介素-1β抗体
本发明涉及人白细胞介素Iβ(IL-1β)抗体并涉及这种抗体用于治疗IL-1介导的疾病和病症的用途。
白细胞介素1(IL-1)是一种由免疫系统的细胞产生的活性物质，它充当急性期炎性反应的介质。IL-1特别是IL-1β的不适当或过度产生与不同疾病和病症如败血症、脓毒性或内毒素休克、变态反应、哮喘、骨丢失、局部缺血、中风、类风湿性关节炎和其它炎性病症的病理学相关联。抗IL-1β抗体已被建议用于治疗IL-1介导的疾病和病症；参见例如WO 95/01997和其引言中的讨论。
我们现已制备了用于治疗IL-1介导的疾病和病症的改进的抗人IL-1β抗体。
本发明提供了IL-1β结合分子，它包含一个抗原结合位点，该位点含有至少一个免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，该结构域顺次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly，所述CDR2具有氨基酸序列Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile；以及其直接等同物。
第一方面，本发明提供了单结构域IL-1β结合分子，它包含含有一个如上面所定义的重链可变结构域(VH)的分离的免疫球蛋白重链。
第二方面，本发明也提供了这样的IL-1β结合分子，其包含重(VH)和轻链(VL)两者的可变结构域，其中所述IL-1β结合分子包含至少一个抗原结合位点，该位点包含：
a)一个免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，该结构域顺次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly，所述CDR2具有氨基酸序列Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile，以及
b)一个免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，该结构域包含具有氨基酸序列Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro的CDR3’高变区；
以及它们的直接等同物。
在第二方面的具体实施方案中，本发明提供了这样的IL-1β结合分子，其包含重链(VH)和轻链(VL)两者的可变结构域，其中所述IL-1β结合分子包含至少一个抗原结合位点，该位点包含：
a)一个免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，该结构域顺次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly，所述CDR2具有氨基酸序列Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile，以及
b)一个免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，该结构域顺次包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro；
以及它们的直接等同物。
除非另外指明，此中任何多肽链均被描述为具有起始于N-末端和终止于C-末端的氨基酸序列。当抗原结合位点包含VH和VL两者的结构域时，这些结构域可被定位在同一多肽分子上，或优选地每一结构域可被定位在不同的链上，其中VH结构域为免疫球蛋白重链或其片段的一部分而其中VL为免疫球蛋白轻链或其片段的一部分。
“IL-1β结合分子”意指可单独或与其它分子联合结合于IL-1β抗原的任何分子。结合反应可通过以阴性对照试验为参照的标准方法(定性测定法)显示，它包括例如对IL-1β与其受体结合的抑制作用进行测定的生物测定法或者任何种类的结合测定法，其中所述阴性对照试验中使用了无相关特异性但同种型相同的抗体如抗-CD25抗体。本发明的IL-1β结合分子与IL-1β的结合可方便地用竞争结合测定法显示。
抗原结合分子的实例包括B-细胞或杂交瘤产生的抗体和嵌合的、CDR-嫁接的或人抗体或它们的任何片段(如F(ab’)2和Fab片段)，以及单链或单结构域抗体。
单链抗体由抗体的重链和轻链的可变结构域组成，其中重链和轻链可变区通过肽接头共价连接，所述肽接头通常由10至30个氨基酸、优选15至25个氨基酸组成。因此此类结构不包括重链和轻链的恒定部分且认为小肽隔离物的抗原性应该比整个恒定部分的小。“嵌合抗体”意指这样一种抗体，其重链或轻链或两者的恒定区为人源的而其重链和轻链两者的可变结构域为非人(如鼠)源的，或者为人源的但是由不同的人抗体衍生而来。“CDR-嫁接抗体”意指这样一种抗体，其高变区(CDR)由供体抗体如非人(如鼠)抗体或不同的人抗体衍生而来，而免疫球蛋白的所有或几乎所有的其它部分例如恒定区和高度保守的可变结构域部分即构架区是由受体抗体如人源抗体衍生而来。然而CDR-嫁接抗体可在构架区中例如在构架区与高变区毗邻的区域中包含几个供体序列的氨基酸。“人抗体”意指这样一种抗体，其重链和轻链两者的恒定和可变区都为人源的，或与人源序列几乎等同，其中重链和轻链未必来自同一抗体，“人抗体”还包括由小鼠产生的抗体，其中鼠免疫球蛋白可变和恒定部分的基因已被它们的人类对应部分取代，例如正如EP 0546073B1、USP 5545806、USP 5569825、USP 5625126、USP 5633425、USP 5661016、USP 5770429、EP 0 438474 B1和EP 0 463151 B1中所概括描述的那样。
本发明尤其优选的IL-1β结合分子为人抗体，特别是此后在实施例中所描述的AAL 160抗体。
这样在优选的嵌合抗体中，重链和轻链两者的可变结构域为人源的，例如在Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2中所示的AAL 160抗体的那些可变结构域。恒定区结构域也优选地包含合适的人恒定区结构域，例如正如“具有免疫重要性的蛋白质序列”(“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，Kabat E.A.等，US Department of Health andHuman Services，Public Health Service，National Institute of Health)中所述的结构域。
高变区可与任何种类的构架区相关联，虽然其中所述构架区优选为人源的。Kabat E.A.等描述了合适的构架区，出处同上。优选的重链构架为人重链构架，例如在Seq.Id.No.1中所示的AAL 160抗体的重链构架。它依次由FR1、FR2、FR3和FR4区构成。Seq.Id.No.2以类似方式显示了优选的AAL 160轻链构架，它依次由FR1’、FR2’、FR3’和FR4’区构成。
相应地，本发明也提供一种IL-1β结合分子，它包含至少一个抗原结合位点，该抗原结合位点包含与在Seq.Id.No.1中所示的、起始于第1位氨基酸和终止于第118位氨基酸的一段氨基酸序列几乎相同的第一结构域，或包含上述的第一结构域和具有与在Seq.Id.No.2中所示的、起始于第1位氨基酸和终止于第107位氨基酸的一段氨基酸序列几乎相同的第二结构域。
在所有人类中发现的天然产生的抗蛋白质的单克隆抗体一般在非人体系如在小鼠中产生。作为其直接结果，如通过杂交瘤产生的异种抗体，当施用于人类时，引起主要由异种免疫球蛋白的恒定部分介导的不希望的免疫反应。这显然限制了这种抗体的用途，因为它们不能被长时期地施用。所以尤其优选使用单链、单结构域、嵌合、CDR-嫁接或尤其是人抗体，当它们被施用于人类时不可能引起大的同种异型反应。
鉴于前面所述，本发明更优选的IL-1β结合分子选自人抗IL-1β抗体，它包含至少
a)一条免疫球蛋白重链或其片段，其中含有(i)一个顺次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的可变结构域，和(ii)人重链的恒定部分或其片段；所述CDR1具有氨基酸序列Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly，所述CDR2具有氨基酸序列Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile和
b)一条免疫球蛋白轻链或其片段，其中含有(i)一个包含CDR3’高变区和任选地也包含CDR1’或CDR2’高变区的可变结构域，和(ii)人轻链的恒定部分或其片段，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro；
以及它们的直接等同物。
另外，本发明的IL-1β结合分子可选自包含抗原结合位点的单链结合分子，其中抗原结合位点包含
a)顺次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3序列的第一结构域，所述高变区具有在Seq.Id.No.1中所示的氨基酸序列，
b)包含高变区CDR3’和任选地包含CDR1’和CDR2’的第二结构域，所述高变区具有在Seq.Id.No.2中所示的氨基酸序列，以及
c)一个肽接头，它结合于第一结构域的N-末端和第二结构域的C-末端，或结合于第一结构域的C-末端和第二结构域的N-末端；
以及它们的直接等同物。
如众所周知的那样，在氨基酸序列上的小的改变如一个或少数几个或甚至数个氨基酸的删除、添加或替换可产生具有几乎同样特性的、原始蛋白的等位型。
这样，术语“其直接等同物”意指任何单结构域的IL-1β结合分子(分子X)，
(i)其中的高变区CDR1、CDR2和CDR3作为一个整体至少80％同源于，优选至少90％同源于，更优选至少95％同源于在Seq.Id.No.1中所示的高变区，且
(ii)它能抑制IL-1β与其受体的结合，抑制程度基本上与参照分子相同，其中所述参照分子的构架区等同于分子X的构架区、但参照分子的高变区CDR1、CDR2和CDR3等同于Seq.Id.No.1中所示的那些高变区。
术语“其直接等同物”或者意指每个结合点有至少两个结构域的任何IL-1β结合分子(分子X’)
(i)其中的高变区CDR1、CDR2、CDR3、CDR3’和任选地CDR1’和CDR2’作为一个整体至少80％同源于，优选至少90％同源于，更优选至少95％同源于在Seq.Id.No.1和2中所示的高变区，且
(ii)它能抑制IL-1β与其受体的结合，抑制程度基本上与参照分子相同，其中所述参照分子的构架区和恒定部分等同于分子X’、但是参照分子的高变区CDR1、CDR2、CDR3和CDR3’和任选地CDR1’和CDR2’等同于那些于Seq.Id.No.1和2中所示的高变区。
在本描述中氨基酸序列彼此间至少80％同源是指当序列被最佳排列时它们有至少80％相同的氨基酸残基位于相似的位置，将氨基酸序列中的缺口或插入统计为不相同的残基。
可方便地用多种测定法测定对IL-1β与其受体结合的抑制作用，所述测定法包括在下面的正文中描述的测定法。所用的IL-1β受体优选IL-1β1型受体。术语“达到相同程度”意指参照和等同物分子用上面所指的测定法之一测定时在统计基础上呈现基本上相同的IL-1β结合抑制曲线。
例如，所用的测定法可以是IL-1β与可溶性IL-1受体和本发明IL-1β结合分子的结合的竞争性抑制测定法。
最优选地，人IL-1β抗体包含至少
a)一条重链，它包含具有氨基酸序列几乎等同于Seq.Id.No.1中所示的、起始于第1位氨基酸和终止于第118位氨基酸的可变结构域和人重链的恒定部分；和
b)一条轻链，它包含具有氨基酸序列几乎等同于Seq.Id.No.2中所示的、始于第1位氨基酸和终止于第107位氨基酸的可变结构域和人轻链的恒定部分。
人重链的恒定部分可为γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ或ε型，优选具有γ型，更优选地具有γ1型，而人轻链的恒定部分可为κ或λ型(其中包括λ1、λ2和λ3亚型)，但优选κ型。Kabat等给出了所有这些恒定部分的氨基酸序列(出处同上)。
本发明的IL-1β结合分子可通过重组DNA技术产生。鉴于此，必须构建一种或多种编码结合分子的DNA分子，置于合适的控制序列下并转移入合适的宿主生物中表达。
以一种非常通用的方式相应地提供了
(i)DNA分子，其编码本发明的单结构域IL-1β结合分子、本发明的单链IL-1β结合分子、本发明的IL-1β结合分子的重链或轻链或其片段，以及
(ii)本发明的DNA分子的用途，其用于通过重组方法产生本发明的IL-1β结合分子。
本领域目前的状况是：如果给本领域技术人员提供此处的信息，即高变区的氨基酸序列和编码它们的DNA序列，他们就可合成本发明的DNA分子。用于构建可变结构域基因的方法例如在EPA 239 400中有述并可简单地概括如下：克隆编码某种特异性Mab的可变结构域的基因。确定编码构架区和高变区的DNA片段并去掉编码高变区的DNA片段，以便将编码构架区的DNA片段通过连接处的合适的限制性位点融合在一起。可在适当的位置用标准程序、通过DNA分子的诱变产生限制性位点。根据在Seq.Id.No.1或2中给出的序列、通过DNA合成制备双链合成CDR盒。这些盒被提供有粘性末端以便它们能够在构架连接处被连接。
此外，为获得编码本发明IL-1β结合分子的DNA构建体，从产生杂交瘤的细胞系中获得mRNA不是必需的。因此PCT申请WO 90/07861提供了通过重组DNA技术产生抗体的详细说明，其中只提供了关于基因核苷酸序列的书面信息。该方法包含一系列寡核苷酸的合成、用PCR方法对它们进行扩增以及拼接它们以得到目标DNA序列。
含有合适启动子的表达载体或含有编码重链和轻链恒定部分的基因可公开获得。这样，一旦本发明的DNA分子被制备，它就可被方便地转移入适当的表达载体。也可用标准方法例如在WO 88/1649中所描述的方法制备编码单链抗体的DNA分子。
根据上面所述，没有必要为满足充分公开的要求而保藏杂交瘤或细胞系。
本发明的一个具体实施方案中包括第一和第二DNA构建体，用于产生如下所述的IL-1β结合分子：
该第一DNA构建体编码重链或其片段并包含
a)编码可变结构域的第一部分，其包含其它的构架和高变区，所述高变区顺次为CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列如Seq.Id.No.1所示；该第一部分起始于编码可变结构域第一个氨基酸的密码子且终止于编码可变结构域最后一个氨基酸的密码子，以及
b)编码重链恒定部分或其片段的第二部分，它起始于编码重链恒定部分第一个氨基酸的密码子并终止于编码恒定部分或其片段最后一个氨基酸的密码子，其后为终止密码子。
优选地，该第一部分编码具有这样氨基酸序列的可变结构域，其氨基酸序列基本上等同于在Seq.Id.No.1中所示的起始于第1位氨基酸并终止于第118位氨基酸的一段氨基酸序列。更优选地，第一部分具有Seq.Id.No.1中所示的、起始于第1位核苷酸和终止于第354位核苷酸的核苷酸序列。也优选第二部分编码人重链的恒定部分，更优选地编码人γl链的恒定部分。该第二部分可以是一段源自基因组(包含内含子)的DNA片段或是一段cDNA片段(无内含子)。
该第二DNA构建体编码轻链或其片段并包含
a)编码可变结构域的第一部分，其包含其它的构架和高变区；所述高变区为CDR3’和任选地CDR1’和CDR2’，其氨基酸序列为在Seq.Id.No.2中所示；该第一部分起始于编码可变结构域第一个氨基酸的密码子且终止于编码可变结构域最后氨基酸的密码子，以及
b)编码轻链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码轻链恒定部分第一个氨基酸的密码子并终止于编码恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，其后为终止密码子。
优选地，该第一部分编码具有这样氨基酸序列的可变结构域，其氨基酸序列基本等同于在Seq.Id.No.2中所示的起始于第1位氨基酸并终止于第107位氨基酸的一段氨基酸序列。更优选地，第一部分具有在Seq.Id.No.2中所示的、起始于第1位核苷酸并终止于第321位核苷酸的核苷酸序列。也优选第二部分编码人轻链的恒定部分，更优选地编码人κ链的恒定部分。
本发明也包括这样的IL-1β结合分子，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’或CDR3’的一个或多个残基是由在Seq Id No.1和Seq.Id.No.2中所示的残基改变而来，例如通过诸如对应DNA序列的定点诱变的突变。本发明包括编码这种被改变的IL-1β结合分子的DNA序列。本发明尤其包括这样的IL-1β结合分子，其中CDR1’或CDR2’的一个或多个残基已从由显示在Seq.Id.No.2的残基改变而来。
在第一和第二DNA构建体中，第一和第二部分可被内含子分开，且可方便地将增强子定位在第一和第二部分之间的内含子。这种被转录但不被翻译的增强子的存在有利于进行高效转录。在具体的实施方案中，第一和第二DNA构建体便利地包含人源的重链基因增强子。
将每一DNA构建体置于合适控制序列的控制之下，尤其是置于合适启动子的控制之下。可使用任何种类的启动子，只要它对DNA构建体将被转移到其中表达的宿主生物是适应的。但如果表达是在哺乳动物细胞中进行时，尤其优选使用免疫球蛋白基因启动子、或巨细胞病毒(CMV)启动子例如人CMV启动子。
可在细胞培养物中或在转基因动物中产生目标抗体。合适的转基因动物可根据标准方法获得，该方法包括将置于合适的控制序列下的第一和第二DNA构建体显微注射到卵中、将如此制备的卵转移入合适的假孕雌体并筛选表达目标抗体的后代。
当在细胞培养中产生抗体链时，必须首先将DNA构建体插入到一个单表达载体或插入到两个独立但相容的表达载体，可优选后者。
因此，本发明也提供了能够在原核细胞系或真核细胞系中复制、包含至少一种上面描述的DNA构建体的表达载体。
然后将每一含有DNA构建体的表达载体转移入合适的宿主生物。当DNA构建体被分别地插入到两个表达载体时，可分别转移它们(即每个细胞存在一种载体类型)或可共转移它们，可优选后者。合适的宿主生物可以是细菌、酵母菌或哺乳动物细胞系，优选后者。更优选地，哺乳动物细胞系具有淋巴样起源，例如骨髓瘤、杂交瘤或正常永生性B-细胞，它们可方便地不表达任何内源抗体的重链或轻链。
对于在哺乳动物细胞中的表达，优选将IL-1β结合分子编码序列整合到宿主细胞DNA中的一个基因座内，它允许或有助于IL-1β结合分子的高水平表达。IL-1β结合分子编码序列整合入这种有利的基因座的细胞可根据它们表达IL-1β结合分子的水平而鉴定和筛选。可用任何合适的选择性标记制备含有IL-1β结合分子编码序列的宿主细胞；例如，可使用dhfr基因/氨甲蝶呤或相当的选择系统。优选的用于表达本发明IL-1β结合分子的系统包括诸如那些被描述于EP 0256055B、EP 0323997B和欧洲专利申请89303964.4中的基于GS的扩增/选择系统。优选地，载体也可包含其它所期望的序列，以促进被表达蛋白的表达、加工和输出；例如载体一般可包含与编码序列相联的一段前导序列。
在本发明的另一个方面，提供了用于产生IL-1β结合分子的方法，其包含(i)培养转化了如上所定义的表达载体的生物，以及(ii)从培养物中回收IL-1β结合分子。
根据本发明，已发现AAL160抗体对人IL-1β的抗原表位具有结合特异性，其中所述抗原表位包含含有成熟的人IL-1β的Gly 22、Pro 23、Tyr24和Glu 25残基的环状结构。(成熟的人IL-1β的Gly 22、Pro 23、Tyr24和Glu 25残基分别对应于人IL-1β前体的138、139、140和141位残基)。该抗原表位看起来似乎在IL-1受体的识别位点的外部，因此针对该表位的抗体(例如AAL160抗体)能够抑制IL-1β与其受体的结合令人们感到很吃惊。对成熟的人IL-1β抗原表位具结合特异性并能抑制IL-1β与其受体结合的抗体特别是嵌合和CDR-嫁接抗体且尤其是人抗体，以及此类抗体用于治疗IL-1介导的疾病和病症的用途是新颖的并包括在本发明的范围之内，其中所述抗原表位包含含有残基Gly 22、Pro 23、Tyr 24和Glu 25的环状结构。
这样在另一方面本发明包括这样的抗IL-1β抗体，其对成熟的人IL-1β的包含含有残基Gly 22、Pro 23、Tyr 24和Glu 25的环状结构的抗原表位具有抗原结合特异性并能抑制IL-1β与其受体的结合。
在另一方面本发明包括：
i)抗IL-1β抗体的用途，其用于治疗IL-1介导的疾病或病症，所述抗体对成熟的人IL-1β的包含含有残基Gly 22、Pro 23、Tyr 24和Glu 25的环状结构的抗原表位具有抗原结合特异性并能抑制IL-1β与其受体的结合；
ii)用于治疗患者的IL-1介导的疾病或病症的方法，它包含将有效量的抗IL-1β抗体施与患者，其中所述抗体对成熟的人IL-1β的包含含有残基Gly 22、Pro 23、Tyr 24和Glu 25的环状结构的抗原表位具有抗原结合特异性并能抑制IL-1β与其受体的结合；
iii)药物组合物，它包含抗IL-1β抗体与可药用的赋形剂、稀释剂或载体的组合，其中所述抗体对成熟的人IL-1β的包含含有残基Gly 22、Pro 23、Tyr 24和Glu 25的环状结构的抗原表位具有抗原结合特异性并能抑制IL-1β与其受体的结合；以及
iv)抗IL-1β抗体的用途，其用于制备治疗IL-1介导的疾病或病症的药物，其中所述抗体对成熟的人IL-1β的包含含有残基Gly 22、Pro 23、Tyr 24和Glu 25的环状结构的抗原表位具有抗原结合特异性并能抑制IL-1β与其受体的结合。
为了本描述的目的，如果抗体能基本上达到与AAL160抗体同样程度地抑制IL-1β与其受体的结合，则该抗体为“可抑制IL-1β的结合”，其中“达到同样程度”具有如上面所定义的意思。
在本描述中，用语“IL-1介导的疾病”包含IL-1在疾病或医学病状的起因、发展、进展、持久性或病理学起直接或间接作用的所有的疾病和医学病状。
在本描述中术语“治疗”意指预防的或预防性的治疗以及治愈性或改变病情的治疗，包括对有感染疾病的危险或怀疑已感染疾病的患者以及已患病或已被诊断患有一种疾病或医学病状的患者的治疗，并包括对临床复发的抑制。
对成熟的人IL-1β的包含含有残基Gly 22、Pro 23、Tyr 24和Glu 25的环状结构的抗原表位具有抗原结合特异性且能抑制IL-1β与其受体结合的抗体在下文中称为本发明的抗体。优选地，本发明的抗体为当人IL-1β处于天然状态例如正常的生理状况下、而非处于变性状态，例如不存在变性剂(如SDS)时，对人IL-1β的该表位具有结合特异性的抗体。本发明的抗体可与非人IL-1β交叉反应，其中所述非人IL-1β具有包括Gly在第22位残基，Pro在第23位残基，Tyr在第24位残基和Glu在第25位残基的抗原表位且该表位密切类似于对应的人表位。例如，本发明的抗体可与诸如猕猴、食蟹猴IL-1或绒猴IL-1等灵长类IL-1β交叉反应。
优选地，本发明的抗体是根据本发明的第一和第二方面的IL-1β结合分子。本发明的抗体有利地是人抗体，最优选地为AAL160抗体或其直接等同物。
本发明的抗体阻断IL-1β对其靶细胞的作用，因而被指明用于治疗IL-1介导的疾病和病症。本发明的抗体的这些和其它药学活性可用例如下面描述的标准试验方法显示：
1.中和人IL-1β-介导的IL-8启动子的激活
用报道基因测定法测定中和IL-1β-依赖的细胞信号的潜能。
用基于人IL-8启动子的荧光素酶报道基因构建体稳定转染人黑素瘤细胞系G361。报道基因的表达和活性取决于在这个细胞系中的IL-1β或TNFα。在存在不同浓度的本发明的抗体或6至18,000pM范围之间的IL-1受体拮抗剂的条件培养基中用300pg/ml的重组人IL-1β或100pg/ml的等同物刺激细胞。嵌合抗体(basiliximab)被用作配对的同种型对照。用化学发光测定法定量测定荧光素酶活性。当用这种测定法测定时，本发明的抗体一般具有的IC50约1nM(例如从大约0.2至大约5nM)。
2.通过初级人成纤维细胞产生的IL-1β依赖的PGE2和白细胞介素-6的中和作用
在初级人皮成纤维细胞中PGE2和IL-6的产生依赖于IL-1β。单独的TNF-α不能有效诱导这些炎性介质，但是可与IL-1协同。初级皮肤成纤维细胞被用作IL-1-诱导的细胞激活的替代模型。
在存在不同浓度的本发明的抗体或在存在6至18,000pM范围的IL-1RA下用重组IL-1β或用从LPS-激发的人PBMC获得的条件培养液刺激初级人成纤维细胞。嵌合抗-CD25抗体
Figure B018039529D00132
(basiliximab)被用作配对的同种型对照。在经16h刺激后取出上清液并用ELISA测定IL-6或用RIA测定PGE2。当用上面的方法测定时，本发明的抗体对抑制IL-6产生一般具有的IC50为大约1nM或更低(例如从大约0.1至大约1nM)而对抑制PGE2产生的IC50为大约1nM(例如从大约0.1至大约1nM)。
如在上面的测定法所指出本发明的抗体可强有力地阻断IL-1β的作用。因此，本发明的抗体具有如下药学用途：
本发明的抗体可用于预防和治疗IL-1介导的疾病或医学病状，例如炎性疾病、变态反应和变应性疾病、超敏反应、自身免疫疾病、严重感染和器官或组织移植排斥。
例如，本发明的抗体可用于治疗心脏、肺、心肺联合、肝脏、肾脏、胰脏、皮肤或角膜移植的接受者和用于预防诸如骨髓移植之后的移植物抗宿主疾病。
本发明的抗体特别适用于自身免疫疾病和炎性疾病的治疗、预防或改善，其中特别是对具有包括自身免疫成分病因学的炎性疾病的治疗、预防或改善，比如关节炎(例如类风湿关节炎、慢性进行性关节炎和变形性关节炎)和风湿性疾病，其中风湿性疾病包括涉及到骨丢失、炎性疼痛、超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)和变态反应的炎性疾病和风湿性疾病。可用本发明的抗体治疗的特异的自身免疫疾病包括自身免疫血液病症(包括例如溶血性贫血、再生障碍贫血、纯红细胞贫血和自发性血小板减少症)、系统性红斑狼疮、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肤肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、牛皮癣、史蒂芬强森综合征、自发性口炎性腹泻、自身免疫炎性肠疾病(包括例如溃疡性结肠炎、克隆氏疾病和应激性肠综合征)、内分泌眼病、格雷夫斯疾病、肉样瘤病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬变、青少年糖尿病(I型糖尿病)、眼色素层炎(前眼色素层炎和后眼色素层炎)、干性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎、间隙肺纤维变性、关节炎性牛皮癣和肾小球性肾(具和不具肾病综合征例如包括自发性肾病综合征或微小病变性肾病)。
本发明的抗体也适用于对哮喘、支气管炎、肺尘埃沉着病、肺气肿和呼吸道的其它阻塞性或炎性疾病的治疗、预防或改善。
本发明的抗体适用于治疗不希望的、由IL-1介导或涉及IL-1尤其是IL-1β产生或由IL-1促进的TNF释放的急性和超急性炎性反应，如急性感染，例如脓毒性休克(例如内毒素休克和成年人呼吸痛苦综合征)、脑膜炎、肺炎；和严重烧伤；适用于治疗与病理TNF释放有关的、由于感染、癌症、或器官机能障碍而发生的恶病质或消耗综合征，尤其是例如与HIV感染有关或由于HIV感染而发生的AIDS-相关恶病质。
本发明的抗体特别适用于治疗包括骨关节炎、骨质疏松症和其它炎性关节炎，以及全身骨丢失包括与年龄有关的骨丢失，特别是牙周疾病的骨代谢疾病。
本发明的抗体可用于治疗癌，特别是IL-1-依赖性肿瘤。
对于这些适应症，合适的剂量当然取决于例如所使用的具体的本发明的抗体、宿主、施用方式和被治疗的疾病的性质和严重性。然而，在预防用途中，以每日剂量从大约0.1mg至大约5mg每公斤体重用药通常显示能获得满意的结果。本发明的抗体可方便地肠胃外施用、静脉内施用入例如肘前的或其它外周静脉、肌内施用或皮下施用。预防性治疗一般包括每日一次至每周一次施用本发明的分子，共治疗2至4周。
本发明的药物组合物可以常规方式生产。本发明的组合物优选以冷冻干燥剂型提供。供直接施用时，将它溶解于一合适的含水载体，例如用于注射的无菌水或无菌缓冲生理盐水。当希望制备较大体积的溶液通过输液施用如静脉内输注而不是通过弹丸注射如皮下弹丸注射施用时，在制剂时将人血清白蛋白或患者自身的肝素化血液掺入盐水中是有利的。这种生理惰性蛋白质的过量存在可防止抗体因吸附在容器壁上和输注溶液时装管的损失。如果使用白蛋白时，合适的浓度是从0.5至4.5％的盐水溶液重量。
本发明被进一步通过以参照附图的下列实施例中例证的方式加以描述：
图1是显示可溶性IL-1I型和II型受体竞争性抑制AAL160与IL-1β结合的图形；
图2是显示在AAL160抑制大鼠模型中IL-1β-诱导的发热的图形，以及
图3是显示在大鼠IL-1β-诱导的发热中AAL160作用的持续时间的图形。
实施例
所设计的表达人IgG/κ库而非鼠免疫球蛋白库的转基因小鼠(Fishwild等，1996，自然生物技术(Nat Biotechnol.)，14卷，845-851页)被用于产生抗人IL-1β抗体。用标准杂交瘤技术将来自这些小鼠的B细胞永生化，且获得了分泌人IgG1/κ抗体AAL160的鼠杂交瘤细胞。
实施例1：杂交瘤的产生和抗体的纯化
用在佐剂中的重组人IL-1β(50μg)皮下多点免疫基因工程小鼠66(Medarex Inc.Annadale，NJ)。小鼠另外加强五次，且最后一次注射是在融合前三天。在融合当天小鼠66通过CO2吸入处死且通过常规方法使用PEG 4000将脾细胞(4.1 x 107)与相同数量的PAI-O细胞(一种小鼠骨髓瘤细胞系)融合。将融合细胞置于含有小鼠腹膜细胞(Balb C小鼠)饲养层的624孔板中(1毫升/孔)，培养基为补充有RPMI 1640、10％热灭活胎牛血清、5 x 10-5M β-巯基乙醇的HAT。收集上清液并用ELISA测定且筛选针对IL-1β的活性单克隆抗体。鉴定出五种IgG/κ的单克隆抗体亚类。用4 x 96孔微量滴定板、每孔接种0.5个细胞进行克隆。两周后用倒置显微镜检查孔。从呈阳性生长孔中收集上清液并用ELISA评估抗-IL-1β单克隆抗体的产生。制备1至2升来自最初鉴定的杂交#476的四个亚克隆中的条件上清液并在蛋白A柱上通过亲和层折纯化抗体。
重链和轻链的纯度和部分氨基酸序列
氨基酸序列测定
用SDS-PAGE分离纯化抗体AAL160的轻链和重链并用Edman降解法测定氨基末端氨基酸。经序列测定，在这些研究中使用的抗体的纯度≥90％。从克隆的杂交瘤细胞的mRNA获得的cDNA通过PCR扩增获得编码重链和轻链可变结构域的cDNA序列且全部进行了测序。以下给出了重链和轻链可变结构域的氨基末端序列和对应的DNA序列，其中CDR以粗体显示。
Seq.Id no.1
                                      30                                      60
GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG AAG ATC
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile
                                     10                                      20
                                     90      CDR1                           120
TCC TGT AAG GGT TCT GGA TAC AGC TTT ACC AGC TAC TGG ATC GGC TGG GTG CGC CAG ATG
Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met
                                     30                                      40
                                    150    CDR2                             180
CCC GGG AAA GGC CTG GAG TGG ATG GGG ATC ATC TAT CCT AGT GAC TCT GAT ACC AGA TAC
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
                                     50                                      60
                                    210                                     240
AGC CCG TCC TTC CAA GGC CAG GTC ACC ATC TCA GCC GAC AAG TCC ATC AGC ACC GCC TAC
Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
                                     70                                      80
                                    270                                     300
CTG CAG TGG AGC AGC CTG AAG GCC TCG GAC ACC GCC ATG TAT TAC TGT GCG AGA TAT ACC
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Thr
                                     90                                     100
      CDR3                          330
AAC TGG GAT GCT TTT GAT ATC TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCT TCA
Asn Trp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
Seq.Id no.2
                                      30                                      60
GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
                                     10                                      20
                           CDR1      90                                     120
CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC TAC TTA GCC TGG TAC CAA CAG AAA CCT
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
                                     30                                      40
                                    150  CDR2                               180
GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GAT GCA TCC AAC AGG GCC ACT GGC ATC CCA GCC
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
                                     50                                      60
                                    210                                     240
AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTT GAG CCT
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
                                     70                                      80
                                    270      CDR3                           300
GAA GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG CGT AGC AAC TGG ATG TTC CCT TTT GGC CAG
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Phe Pro Phe Gly Gln 
                                     90                                     100
GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
也在附加的序列表中以Seq.Id nos.1至4给出了编码AAL160重链和轻链可变结构域的DNA序列和对应的氨基酸序列。
构建重链和轻链的表达载体
用PCR扩增克隆的VL和VH编码序列并通过适当的限制位点插入提供免疫球蛋白启动子、来自RFT2抗体的前导序列(Heinrich等(1989年)，免疫学杂志(J.Immunol.)143卷，3589-97页)、部分J-区段和一个剪接供体位点的盒式载体。将包含有整个VL区、启动子和作分泌用的前导序列的轻链盒转移入含有人Ck基因、免疫球蛋白重链增强子和改进的用作氨甲蝶呤(MTX)筛选用的鼠dhfr cDNA的表达载体。
将重链盒相应地转移入编码人IgG1基因、免疫球蛋白重链增强子和作筛选用的新霉素抗性基因的表达载体。
重链和轻链两者在表达载体中的构型呈现类似被认为对高水平表达是关键性的重排免疫球蛋白基因的基因组构型。
为产生抗体上述载体被共转染入适当的宿主细胞系如SP2/0细胞系，用氨甲蝶呤选择筛选含有载体序列的细胞，且培养所筛选的细胞系以表达AAL160抗体。另外可使用诸如在EP 0256055B、EP 0323997B或欧洲专利申请89303964.4中描述的基于GS的扩增/选择系统，在这种情况下用一段GS编码序列替换dhfr选择性标记。
实施例2：生物化学和生物学数据
在体外发现单克隆抗体AAL160可中和白细胞介素-1β的活性。另外Biacore分析表明单克隆抗体具有结合到重组人IL-1β的特征。通过与可溶性IL-1受体的竞争性结合研究评估中和作用的方式。用初级人细胞(实施例3)对IL-1β刺激的应答来测定抗体AAL160对重组和天然产生的IL-1β的生物学活性。
2.1解离平衡常数的测定
用BIAcore分析测定重组人IL-1β与AAL160结合的缔合和解离率常数。AAL160被固定化，通过表面胞质共振测定浓度范围从0.5至12nM的重组IL-1β的结合。所选择的格式允许根据1∶1化学计量处理IL-1β与AAL160的结合事件。用BIAevaluation软件进行数据分析。
  缔合率常数[M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>]   (n＝15)   (3.91±0.14)x 10<sup>5</sup>   平均值±SEM
  解离率常数[s<sup>-1</sup>]   (n＝15)   (1.53±0.05)x 10<sup>-4</sup>   平均值±SEM
  解离平衡常数K<sub>D</sub>[M]   (n＝15)   (396.6±19.5)x 10<sup>-12</sup>   平均值±SEM
AAL160以高亲和力结合于重组人IL-1β。
2.2.结合于可溶性IL-1受体的竞争性抑制
与可溶性IL-1I型和II型受体的结合竞争研究
用Biacore测定AAL160与可溶性人IL-1I型和II型受体之间的竞争。将AAL160固定化于小片表面，且在不存在或存在提高浓度的重组人可溶性受体I(0-10nM)或受体II(0-80nM)时注射重组人IL-1β(8nM)以结合AAL160。获得的结果如图1所示。NVP AAL160NX-1与IL-1β的结合和与IL-1I型和II型受体两者的结合是竞争性的。
2.3.对人IL-1α、人IL-1RA和来自啮齿类动物和猴类的IL-1β的反应性概况
用Biacore分析测定AAL160对人IL-1α、IL-1RA和鼠、大鼠、兔和食蟹猴IL-1β的反应性概况。固定化AAL160且经检查的细胞因子的使用浓度为8nM(或在用IL-1β时为20nM)。
  总结合百分率±SEM
人IL-1β   100
人IL-1α   0.7±0.7(n＝3)
人IL-1Ra   1.2±1.2(n＝3)
小鼠IL-1β   2.8±1.5(n＝3)
大鼠IL-1β   3.0±2.5(n＝3)
食蟹猴IL-1β   96.4±6.8(n＝3)
兔IL-1β   12.1±2.3(n＝4)
AAL160与人IL-1α、人IL-1Ra，或鼠、大鼠或兔IL-1β无明显的交叉反应。对食蟹猴IL-1β的反应性与对人细胞因子的反应性几乎是相同的。
实施例3：对初级人成纤维细胞的IL-1β依赖性PGE2和白细胞介素-6产生的中和作用
在初级人皮肤成纤维细胞中PGE2和IL-6的产生取决于IL-1β。TNF-α不能单独高效诱导这些炎性介质，但可与IL-1协同。将初级皮肤成纤维细胞用作对IL-1诱导的细胞激活的替代模型。
初级人成纤维细胞用重组IL-1β或用在存在从6至18,000pM不同浓度的AAL160或IL-1RA时受LPS-刺激的人PBMC中获得的条件培养液刺激。用嵌合抗-CD25抗体(basiliximab)作为配对同种型对照。在刺激16小时以后取上清液并用ELISA测定IL-6或用RIA测定PGE2。
Figure B018039529D00202
在人皮肤成纤维细胞中，AAL160有效地阻止IL-6和PGE2的产生，对重组子和天然IL-1β两者的IC50相类似。
实施例4：AAL160在体内作用的效能和持续时间
效能：
为获得抗-huIL-1β抗体在体内的效能，在通过静脉内注射huIL-1β(100纳克/大鼠)而诱导发热的大鼠模型中测定AAL 160。抗体在剂量范围1、3和10μg/kg静脉内注射(n＝6只大鼠)时产生剂量相关的发热反应抑制--参见图2。用CHI 621(
Figure B018039529D00211
，basiliximab)作为对照抗体。
作用的持续时间：
在大鼠IL-1β-诱导的发热中，如下探究了AAL-160的作用持续时间：在经静脉内注射人IL-1β诱导发热前24小时或30分钟(标准方案)时，静脉内注射抗体，且在2和4小时后测定体温。在两个时间点均可观察到对发热反应的类似抑制程度(参见图3)。如所预料的那样，对照抗体CHI 621(，basiliximab)在两个时间点均无效。这个发现表明AAL160人抗体以活性形式在大鼠中存在了至少24小时，且在这段时间内未被代谢、排泄或结合于组织中。
实施例5：AAL160Fab和它与IL-1β的复合体的X-射线研究
在分辨率为2.0时对AAL160Fab的结构测定：
从通过用悬滴技术在pH 9.550％PEG 200、0.1MCHES中蒸发扩散而长成的Fab晶体收集到一系列质量很好的2.0
Figure B018039529D00214
分辨率数据(Rsym＝0,051，完全度＝99.9％，丰度＝8.2)。晶体呈现空间群P212121，其单晶胞尺寸a＝62.17
Figure B018039529D00215
b＝89.83
Figure B018039529D00216
c＝123.73和每对称单位一个Fab分子(Matthews系数：3.6 3/Da，估计的溶剂含量：66％)。用分子置换测定结构并精确到最终晶体学R-因子为0.209(自由R因子＝0.261)。最终模型包括轻链的1-213位残基、重链的1-131位和138-218位残基，387个水分子和1个PEG分子。充分确定了轻链的除Trp 94(CDR3)外的所有CDR残基的最终电子密度。至今为止所检验的两种晶体型中该残基的侧链位置都未能明确，这提示在缺乏结合抗原时它是高度流动的。
Fab与IL-1β复合体的结晶和该复合体的初步实验模型：从在2.0M硫酸铵、0.1M Tris pH 8.5中的76毫克/毫升1∶1复合体储存溶液中获得AAL160Fab与抗原IL-1β的复合体的一些晶体。在数周时间内晶体的生长很慢。它们在主光源上微弱地衍射为3.2
Figure B018039529D00221
。收集了一组初步数据且尝试使用游离Fab和人IL-1β的高分辨率结构(J.P.Priestle等，EMBO J.第7卷，339页(1988年))作为起始模型进行分子置换。当Fab的Fv和Fc部分被用作单独的模数(相关性67.1％，在AMORE FITTING步骤后的R-因子0.354，使用在8.0和3.5
Figure B018039529D00222
间的数据)时计算得到一个很清楚和明确的解决方案。Fab的游离和结合型的后续比较显示在两结构中肘角有很大不同。分子置换计算结果提供了抗原IL-1β和单克隆抗体AAL160之间相互作用的第一分子模型。对这些相互作用初步分析指示出1)IL-1β与重链的所有三个CDR以及与轻链的CDR3产生紧密相互作用。相比之下，几乎没有任何涉及与轻链CDR1和CDR2的相互作用。2)成熟的IL-1β的包含残基Gly 22、Pro 23、Tyr 24和Glu 25的环状结构结合在抗原结合位点的中心，因此似乎是关键的表位成分。非常有趣的是，这种环状结构不位于与小鼠IL-1β差异最大的分子区。Pro 23、Tyr 24和Glu 25是保守的，但在人IL-1β中22位残基是Gly而在小鼠IL-1β中是Asp。人IL-1β(PDBentry 2i1b)和小鼠IL-1β(PDB entry 8i1b)的晶体结构的比较显示这个点突变导致在Pro 23附近产生很不相同的主链构象。这种局部结构的不同与观察到的AAL160缺乏与小鼠细胞因子的交叉反应是相一致的。
序列表
<110>诺瓦提斯公司
<120>抗人IL-1β抗体
<130>4-31289A
<160>4
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>354
<212>DNA
<213>小家鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(354)
<400>1
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag        48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agc tac        96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg       144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
ggg atc atc tat cct agt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc       192
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac       240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt       288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
gcg aga tat acc aac tgg gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca       336
Ala Arg Tyr Thr Asn Trp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
atg gtc acc gtc tct tca                                               354
Met Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>2
<211>118
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Tyr Thr Asn Trp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>3
<211>321
<212>DNA
<213>小家鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>3
gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg         48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc tac         96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc        144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc        192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctt gag cct        240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac tgg atg ttc        288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ash Trp Met Phe
                85                  90                  95
cct ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa                            321
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Phe
                85                  90                  95
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105

Claims (10)

1.IL-1β结合分子，其针对成熟人IL-1β的抗原表位具有抗原结合特异性，其中所述成熟人IL-1β的抗原表位包括含有Gly22、Pro23、Tyr24和Glu25残基的环，所述IL-1β结合分子包含抗原结合位点，所述抗原结合位点含有至少一个顺次包含如SEQ ID NO：1中所示的高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域VH，即，所述CDR1的氨基酸序列为Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly，所述CDR2的氨基酸序列为Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly，且所述CDR3的氨基酸序列为Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile；和至少一个顺次包含如SEQ ID NO：2中所示的高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白轻链可变结构域VL，所述CDR1’的氨基酸序列为Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala，所述CDR2’的氨基酸序列为Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr，且所述CDR3’的氨基酸序列为Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro；能够抑制IL-1β与其受体的结合。
2.根据权利要求1的IL-1β结合分子，其为人抗体。
3.根据权利要求1或2的IL-1β结合分子，其包含至少一个抗原结合位点，其中所述IL-1β结合分子
(i)包含与在Seq.Id.No.1中所示的、起始于第1位氨基酸和终止于第118位氨基酸的一段氨基酸序列相同的第一结构域，和与在Seq.Id.No.2中所示的、起始于第1位氨基酸和终止于第107位氨基酸的一段氨基酸序列相同的氨基酸序列；或
(ii)包含
(a)含有可变结构域和人重链恒定部分的一条重链，所述可变结构域为与在Seq.Id.No.1中所示的、起始于第1位氨基酸和终止于第118位氨基酸的一段氨基酸序列相同的氨基酸序列；和
(b)含有可变结构域和人轻链恒定部分的一条轻链，所述可变结构域为与在Seq.Id.No.2中所示的、起始于第1位氨基酸和终止于第107位氨基酸的一段氨基酸序列相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任意一项的IL-1β结合分子的用途，用于制备预防或治疗炎性疾病、变态反应和变应性疾病、超敏反应、器官或组织移植排斥、自身免疫疾病、急性感染、严重烧伤、与病理TNF释放有关的、由于感染、癌症、或器官机能障碍而发生的恶病质或消耗综合征、骨代谢疾病、癌症的药物。
5.根据权利要求4的用途，其中所述炎性疾病是关节炎、多软骨炎、皮肤肌炎、慢性活动性肝炎、前眼色素层炎、后眼色素层炎、干性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、肾小球性肾炎、支气管炎、脑膜炎、肺炎；所述超敏反应是呼吸道超敏反应、皮肤超敏反应；所述自身免疫疾病是自身免疫血液病症、系统性红斑狼疮、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、重症肌无力、牛皮癣、史蒂芬强森综合征、自发性口炎性腹泻、自身免疫炎性肠疾病、内分泌眼病、格雷夫斯疾病、肉样瘤病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬变、I型糖尿病、间隙肺纤维变性、关节炎性牛皮癣、哮喘、肺尘埃沉着病、肺气肿；所述急性感染是脓毒性休克；所述恶病质或消耗综合征是AIDS-相关恶病质；所述骨代谢疾病是骨关节炎、骨质疏松症、全身骨丢失、与年龄有关的骨丢失、牙周疾病；所述癌症是IL-1-依赖性肿瘤。
6.根据权利要求5的用途，其中所述关节炎是类风湿关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎；所述肾小球性肾炎是自发性肾病综合征、微小病变性肾病；所述自身免疫血液病症是溶血性贫血、再生障碍贫血、纯红细胞贫血和自发性血小板减少症；所述自身免疫炎性肠疾病是溃疡性结肠炎、克隆氏疾病、应激性肠综合征；所述I型糖尿病是青少年糖尿病；所述脓毒性休克是内毒素休克、成年人呼吸窘迫综合征。
7.用于制备IL-1β结合分子的DNA组合构建体，由编码重链的第一DN A构建体和编码轻链的第二DNA构建体组成，其中编码重链的第一DNA构建体包含
i)编码可变结构域的第一部分，所述可变结构域交替地包含构架和高变区，所述高变区顺次为CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列如Seq.Id.No.1中所示；该第一部分起始于编码可变结构域第一个氨基酸的密码子且终止于编码可变结构域最后一个氨基酸的密码子，以及
ii)编码重链恒定部分的第二部分，它起始于编码重链恒定部分第一个氨基酸的密码子并终止于编码恒定部分最后一个氨基酸的密码子，其后为终止密码子；
编码轻链的第二DNA构建体包含
i)编码可变结构域的第一部分，所述可变结构域交替地包含构架和高变区；所述高变区为CDR1’、CDR2’和CDR3’，其氨基酸序列如Seq.Id.No.2中所示；该第一部分起始于编码可变结构域第一个氨基酸的密码子且终止于编码可变结构域最后氨基酸的密码子，以及
ii)编码轻链恒定部分的第二部分，其起始于编码轻链恒定部分第一个氨基酸的密码子并终止于编码恒定部分的最后一个氨基酸的密码子，其后为终止密码子。
8.能够在原核细胞或真核细胞系中复制的表述载体，其包含根据权利要求7的DNA组合构建体。
9.用于产生IL-1β结合分子的方法，其包括(i)培养用权利要求8的表达载体转化了的生物，以及(ii)从培养物中回收IL-1β结合分子。
10.包含根据权利要求1的IL-1β结合分子的药物组合物。
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