RU2264413C2

RU2264413C2 - РЕКОМБИНАНТНОЕ АНТИТЕЛО К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ИНТЕРЛЕЙКИНУ 1β

Info

Publication number: RU2264413C2
Application number: RU2002121649/13A
Authority: RU
Inventors: Герман ГРАМ (DE); Герман ГРАМ; Франко Э. ДИ-ПАДОВА (CH); Франко Э. ДИ-ПАДОВА
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2005-11-20
Also published as: JP3978338B2; IL150551A0; GB0001448D0; ATE346868T1; SI1248804T2; ES2274865T5; DE60124863T3; CZ302738B6; DE60124863D1; HK1050013A1; NZ519936A; US7491392B2; KR20020073178A; IL150551A; DK1248804T4; ES2274865T3; DE60124863T2; BR0107661A; JP2007097598A; PT1248804E

Abstract

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в медицине для лечения опосредованных IL-1 заболеваний и нарушений. В изобретении раскрывается связывающая IL-1β молекула, в частности антитело к человеческому IL-1β, особенно человеческое антитело к человеческому IL-1β, где гипервариабельные участки CDRs тяжелой и легкой цепей имеют определенные аминокислотные последовательности. Показано применение антитела в лечении опосредованного IL-1 заболевания или нарушения, например остеоартрита, остеопороза и других воспалительных поражений кости ревматического или подагрического происхождения. Представлены конструкции ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи или их фрагменты, а также экспрессионные векторы, способные реплицироваться в клетках, включающие конструкции ДНК. Описан способ получения связывающей IL-1β молекулы с помощью трансформированной вектором клетки. Изобретение позволяет получать и использовать улучшенные по эффективности связывающие IL-1β молекулы (антитела) для применения их как профилактического, так и лечебного средства. 9 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

Description

Данное изобретение относится к антителам к человеческому интерлейкину 1β (IL-1β) и к применению таких антител для лечения опосредованных IL-1 заболеваний и нарушений.

Интерлейкин 1 (IL-1) активно вырабатывается клетками иммунной системы, которая действует в качестве медиатора ответной реакции на острую фазу воспаления. Несоответствующая или избыточная выработка IL-1, в частности IL-1β, ассоциирована с патологией различных заболеваний и нарушений, таких как септицемия, септический или эндотоксический шок, аллергии, астма, остеопороз, ишемия, внезапный приступ, ревматоидный артрит и другие воспалительные нарушения. Предложено использовать антитела к IL-1β в лечении опосредованных IL-1 заболеваний и нарушений; смотри, например, WO 95/011997 и обсуждение во введении к нему.

Заявители в настоящее время получили улучшенные антитела к человеческому IL-1β для применения в лечении опосредованных IL-1 заболеваний и нарушений.

Соответственно изобретение обеспечивает связывающую IL-1β молекулу, которая включает антигенсвязывающий сайт, содержащий по меньшей мере один вариабильный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), который содержит в последовательности гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, причем упомянутый CDR1 имеет аминокислотную последовательность Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, упомянутый CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gtn-Giy, и упомянутый CDR3 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile; и их прямые эквиваленты.

В первом аспекте изобретение обеспечивает однодоменные молекулы, связывающие IL-1β, содержащие выделенную тяжелую цепь иммуноглобулина, включающую вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), как описано выше.

Во втором аспекте изобретение обеспечивает также связывающую IL-1β молекулу, содержащую вариабельные домены как тяжелой (V_H), так и легкой цепи (V_L), в котором упомянутая связывающая IL-1β молекула содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, включающий:

(а) вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), который содержит в последовательности гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, причем упомянутый CDR1 имеет аминокислотную последовательность Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, упомянутый CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly, и упомянутый CDR3 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ata-Phe-Asp-IIe, и

(б) вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (V_L), который содержит гипервариабельный участок CDR3', имеющий аминокислотную последовательность Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro; и их прямые эквиваленты.

В особых вариантах воплощения второго аспекта изобретение обеспечивает связывающую IL-1β молекулу, содержащую вариабельные домены как тяжелой (V_H), так и легкой цепи (V_L), где упомянутая связывающая IL-1β молекула содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, включающий:

(а) вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), который содержит в последовательности гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, причем упомянутый CDR1 имеет аминокислотную последовательность Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, упомянутый CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly, и упомянутый CDR3 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, и

(б) вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (V_L), который содержит в последовательности гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', причем упомянутый CDR1' имеет аминокислотную последовательность Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, упомянутый CDR2' имеет аминокислотную последовательность Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr, и упомянутый CDR3' имеет аминокислотную последовательность GIn-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro; и их прямые эквиваленты.

Если не указано иначе, любая полипептидная цепь, описанная в контексте, имеет последовательность, начинающуюся с N-конца и заканчивающуюся С-концом. Если антигенсвязывающий сайт включает как домены V_H, так и V_L, они могут быть расположены на одной и той же цепи полипептида или предпочтительно каждый домен может находиться на отдельной цепи, причем домен V_H является частью тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента, а домен V_L является частью легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента.

Под "связывающей IL-1β молекулой" подразумевают любую молекулу, способную к соединению с антигеном IL-1β, или одну, или связанную с другими молекулами. Реакция связывания может быть продемонстрирована стандартными способами (качественные анализы), включая, например, биоанализ для определения подавления связывания IL-1β с его рецептором, или любой тип анализов связывания со ссылкой на отрицательный контрольный тест, в котором используется антитело неродственной специфичности, но такого же изотипа, например антитело к CD25. Привязка связывающих IL-1β молекул по изобретению к IL-1β может быть выгодно продемонстрирована в анализе конкурентного связывания.

Примеры связывающих антиген молекул включают антитела, которые продуцированы В-клетками или гибридомами, и химерные, CDR-трансплантированные или человеческие антитела или любой их фрагмент, например фрагменты F(ab')₂ и Fab, а также одноцепочечные или однодоменные антитела.

Одноцепочечные антитела состоят из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела, ковалентно связанных пептидным линкером, обычно состоящим из 10-30 аминокислот, предпочтительно из 15-25 аминокислот. Следовательно, такая структура не включает константную часть тяжелой и легкой цепей и считается, что небольшой пептидный спейсер должен быть менее антигенным, чем вся константная часть. Под термином "химерное антитело" подразумевают антитело, в котором константные участки тяжелой или легкой цепей или оба имеют человеческое происхождение, тогда как вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей имеют нечеловеческое (например, мышиное) происхождение, или человеческое происхождение, но получены от разных человеческих антител. Термин "CDR-трансплантированное антитело" означает антитело, в котором гипервариабельные участки (CDRs) происходят от донорного антитела, такого как нечеловеческое (например, мышиное) антитело или от различных человеческих антител, тогда как все или по существу все другие части иммуноглобулина, например константные участки и высоко консервативные части вариабельных доменов, т.е. каркасные участки, происходят от акцепторного антитела, например антитела человеческого происхождения. Однако CDR-трансплантированное антитело может содержать в каркасных участках несколько аминокислот донорной последовательности, например в частях каркасных участков, смежных с гипервариабельными областями. Термин "человеческое антитело" означает антитело, в котором константный и вариабельный участки как тяжелой, так и легкой цепей все имеют человеческое происхождение или фактически идентичны последовательностям человеческого происхождения, необязательно от одного и того же антитела, и включает антитела, вырабатываемые мышью, в которых вариабельная и константная часть генов мышиного иммуноглобулина заменена их человеческими копиями, например, как описано в общем виде в ЕР 0546073 В1, USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, ЕР 0438474 В1 и ЕР 0463151 В1.

Особо предпочтительными связывающими IL-1β молекулами по изобретению являются человеческие антитела, особенно антитело AAL 160, как описано в дальнейшем в примерах.

Так, в предпочтительных химерных антителах вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей имеют человеческое происхождение, например, те цепи антитела AAL 160, которые приведены в последовательности с идентификационным №1 (SEQ. ID. №1) и последовательности с идентификационным №2 (SEQ. ID. №2). Домены константного участка предпочтительно также содержат соответствующие человеческие домены константного участка, например, как описано в "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.A. и др., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health.

Гипервариабельные участки могут быть связаны с любым типом каркасных участков, хотя предпочтительными являются участки человеческого происхождения. Соответствующие каркасные участки описаны Kabat E.A. и др., там же. Предпочтительным каркасным участком тяжелой цепи является каркасный участок человеческой тяжелой цепи, например, участок антитела AAL 160, который показан в SEQ. ID. №1. Он состоит из последовательности участков FR1, FR2, FR3 и FR4. Подобным образом SEQ. ID. №2 демонстрирует предпочтительный каркасный участок легкой цепи антитела AAL 160, который состоит из последовательности участков FR1', FR2', FR3' и FR4'.

Соответственно изобретение обеспечивает также связывающую IL-1β молекулу, которая содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, включающий или первый домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу идентичную той, которая приведена в SEQ. ID. №1, начиная с аминокислоты в положении 1 и кончая аминокислотой в положении 118, или первый домен, который описан выше, и второй домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу идентичную той, которая приведена в SEQ. ID. №2, начиная с аминокислоты в положении 1 и кончая аминокислотой в положении 107.

Моноклональные антитела, возникающие против белка, естественно обнаруженного у всех людей, обычно создают в нечеловеческом организме, например в мышином. Как прямое последствие этого ксеногенное антитело, которое продуцировано гибридомой, при введении человеку вызывает нежелательный иммунный ответ, который в преобладающем большинстве случаев опосредован константной частью ксеногенного иммуноглобулина. Это четко ограничивает применение таких антител, поскольку они не могут вводиться в течение продолжительного периода времени. Поэтому особенно предпочтительно применять одноцепочечные, однодоменные, химерные, CDR-трансплантированные или, главным образом, человеческие антитела, которые при введении человеку необязательно вызывают существенный аллогенный ответ.

Ввиду вышеупомянутого более предпочтительную связывающую IL-1β молекулу по изобретению выбирают из человеческого антитела против IL-1β, которое содержит по меньшей мере

(а) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, который включает (i) вариабельный домен, содержащий в последовательности гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, и (ii) константную часть человеческой тяжелой цепи или ее фрагмент; причем упомянутый CDR1 имеет аминокислотную последовательность Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, упомянутый CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asr-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly, и упомянутый CDR3 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-AIa-Phe-Asp-Ile и

(б) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, который включает (i) вариабельный домен, содержащий гипервариабельный участок CDR3' и необязательно также гипервариабельные участки CDR1', CDR2', и (iii) константную часть человеческой легкой цепи или ее фрагмент, причем упомянутый CDR1' имеет аминокислотную последовательность Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, упомянутый CDR2' имеет аминокислотную последовательность Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr, и упомянутый CDR3' имеет аминокислотную последовательность GIn-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro; и их прямые эквиваленты.

Альтернативно связывающая IL-1β молекула по изобретению может быть выбрана из одноцепочечной связывающей молекулы, которая включает антигенсвязывающий сайт, содержащий

(а) первый домен, содержащий в последовательности гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, причем упомянутые гипервариабельные участки имеют аминокислотные последовательности, как показано в SEQ. ID. №1,

(6) второй домен, содержащий гипервариабельные участки CDR3' и необязательно CDR1' и CDR2', причем упомянутые гипервариабельные участки имеют аминокислотные последовательности, как показано в SEQ. ID. №2, и

(в) пептидный линкер, который связан или с N-концом первого домена и с С-концом второго домена, или с С-концом первого домена и с N-концом второго домена; и их прямые эквиваленты.

Как хорошо известно, небольшие изменения в аминокислотной последовательности, такие как утрата, добавление или замена одной, немногих или даже некоторого количества аминокислот может привести к аллельной форме исходного белка, который по существу имеет идентичные свойства.

Так, термин "их прямые эквиваленты" означает также любую однодоменную связывающую IL-1β молекулу (молекулу X),

(i) в которой гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, рассматриваемые в целом, являются по меньшей мере на 80% гомологичными, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологичными, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичными к гипервариабельным участкам, которые показаны в SEQ. ID. №1, и

(ii) которая способна ингибировать связывание IL-1β с его рецепторами фактически в такой же степени, как эталонная молекула, имеющая каркасные участки, идентичные таковым в молекуле X, но имеющая гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, идентичные участкам, показанным в SEQ. ID. №1, или любую связывающую IL-1β молекулу, имеющую по меньшей мере два домена на сайт связывания (молекула X'),

(i) в которой гипервариабельные участки CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' и необязательно CDR1' и CDR2', рассматриваемые в целом, являются по меньшей мере на 80% гомологичными, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологичными, более предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологичными к гипервариабельным участкам, как показано в SEQ. ID. №1 и 2, и

(ii) которая способна игибировать связывание IL-1β с его рецепторами фактически в той же мере, как эталонное соединение, имеющее каркасные участки и константные части, идентичные молекуле X', но имеющая гипервариабельные участки CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' и необязательно CDR1' и CDR2', идентичные участкам, показанным в SEQ. ID. №1 и 2.

В настоящем описании аминокислотные последовательности являются по меньшей мере на 80% гомологичными одна к другой, если они содержат по меньшей мере 80% идентичных аминокислотных остатков в одинаковом положении, когда последовательность оптимально выравнена в линию, причем пропуски или вставки в аминокислотных последовательностях рассматриваются как неидентичные остатки.

Ингибирование связывания IL-1β с его рецептором можно удобно исследовать в различных анализах, включая такие анализы, как описанные далее в тексте. Используемый рецептор IL-1β представляет собой предпочтительно тип 1 рецептора IL-1β. Термин "в такой же степени" означает, что эталонная и эквивалентная молекулы на статистическом уровне имеют фактически идентичные кривые связывания IL-1β в одном из анализов, упомянутых выше.

Например, может быть применен анализ конкурентного ингибирования связывания IL-1β рецепторами растворимого IL-1 и связывающими IL-1β молекулами по изобретению.

Наиболее предпочтительно антитело к человеческому IL-1β содержит по меньшей мере

(а) одну тяжелую цепь, которая включает вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную той, которая показана в SEQ. ID. №1, начиная с аминокислоты в положении 1 и кончая аминокислотой в положении 118, и константную часть человеческой тяжелой цепи; и

(б) одну легкую цепь, которая включает вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, фактически идентичную той, которая показана в SEQ. ID. №2, начиная с аминокислот в положении 1 и кончая аминокислотой в положении 107, и константную часть человеческой легкой цепи.

Константная часть человеческой тяжелой цепи может быть типа γ₁, γ₂, γ₃, γ₄, μ, α₁, α₂, δ или ε, предпочтительно типа γ, более предпочтительно типа γ₁, тогда как константная часть человеческой легкой цепи может быть типа κ или типа λ (который включает подтипы λ₁, λ₂ и λ₃), но предпочтительно типа κ. Аминокислотные последовательности всех этих константных частей даны у Kabat и др., там же.

Связывающая IL-1β молекула по изобретению может быть получена по методикам рекомбинантной ДНК. С учетом этого одна или несколько молекул ДНК, кодирующих связывающую молекулу, должны быть сконструированы и под контролем соответствующих контрольных последовательностей перенесены в соответствующий организм хозяина для экспрессии.

В самом общем смысле соответственно предусматриваются:

(i) молекулы ДНК, кодирующие однодоменную связывающую IL-1β молекулу по изобретению, одноцепочечную связывающую IL-1β молекулу по изобретению, тяжелую или легкую цепь или их фрагменты связывающей IL-1β молекулы по изобретению, и

(ii) применение молекул ДНК по изобретению для получения связывающей IL-1β молекулы по изобретению рекомбинантными способами.

Настоящее состояние уровня техники таково, что специалист в этой области способен синтезировать молекулы ДНК по изобретению с учетом информации, предоставленной в контексте, т.е. аминокислотных последовательностей гипервариабельных участков и кодирующих их последовательностей ДНК. Способ создания гена с вариабельным доменом описан, например, в ЕРА 239400 и может быть кратко суммирован следующим образом: клонируют ген, кодирующий вариабельный домен Mab какой-либо специфичности. Определяют сегменты ДНК, кодирующие каркасный и гипервариабельный участки, и сегменты ДНК, кодирующие гипервариабельные участки, удаляют так, что сегменты ДНК, кодирующие каркасные участки, соединяются на стыках с соответствующими сайтами рестрикции. Сайты рестрикции могут быть образованы в соответствующих положениях с помощью мутагенеза молекулы ДНК стандартными способами. Двухцепочечные синтетические CDR-кассеты получают синтезом ДНК в соответствии с последовательностями, приведенными в SEQ. ID. №1 или 2. Эти кассеты обеспечиваются липкими концами так, что они могут быть лигированы на стыках каркаса.

Более того, нет необходимости иметь доступ к мРНК от продуцирующей гибридомной клеточной линии для того, чтобы получить конструкцию ДНК, кодирующую связывающие IL-1β молекулы по изобретению. Так, подпадающая под РСТ заявка WO 90/07861 дает подробные инструкции для получения антитела по методикам рекомбинантной ДНК с учетом только письменной информации, касающейся нуклеотидной последовательности гена. Способ включает синтез некоторого количества олигонуклеотидов, их амплификации методом полимеразной цепной реакции (PCR) и их сплайсинга с образованием требуемой последовательности ДНК.

Экспрессионные векторы, включающие соответствующий промотор или гены, кодирующие константные части тяжелой и легкой цепей, являются доступными. Так, однажды полученную молекулу ДНК по изобретению можно удобно перенести в соответствующий экспрессионный вектор. Молекулы ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела, также могут быть получены стандартными способами, например, как описано в WO 88/1649.

Ввиду вышеупомянутого не требуется никакого вклада гибридомы или линии клеток, чтобы удовлетворить критерий достаточности описания.

В специальном варианте воплощения изобретение включает первую и вторую конструкции ДНК для получения связывающей IL-1β молекулы, как описано ниже.

Первая конструкция ДНК кодирует тяжелую цепь или ее фрагмент и включает

(а) первую часть, которая кодирует вариабельный домен, содержащий альтернативно каркасный и гипервариабельные участки, причем упомянутые гипервариабельные участки находятся в последовательном ряду CDR1, CDR2 и CDR3, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ. ID. №1; эта первая часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и

(б) вторую часть, кодирующую константную часть тяжелой цепи или ее фрагмент, который начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной части тяжелой цепи, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной части или ее фрагмента, за которым следует терминирующий кодон.

Предпочтительно эта первая часть кодирует вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, фактически идентичную аминокислотной последовательности, которая приведена в SEQ. ID. №1, начиная с аминокислоты в положении 1 и кончая аминокислотой в положении 118. Более предпочтительно первая часть имеет нуклеотидную последовательность, которая приведена в SEQ. ID. №1, начиная с нуклеотида в положении 1 и кончая нуклеотидом в положении 354. Предпочтительно также вторая часть кодирует константную часть человеческой тяжелой цепи, более предпочтительно константную часть человеческой цепи γ₁. Эта вторая часть может быть фрагментом ДНК геномного происхождения (включая интроны) или фрагментом кДНК (без интронов).

Вторая конструкция ДНК кодирует легкую цепь или ее фрагмент и включает

(а) первую часть, которая кодирует вариабельный домен, включая альтернативно каркасный и гипервариабельные участки; причем упомянутыми гипервариабельными участками являются CDR3' и необязательно CDR1' и CDR2', аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ. ID. №2; эта первая часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и

(б) вторую часть, кодирующую константную часть легкой цепи или ее фрагмент, который начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной части легкой цепи, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной части или ее фрагмент, за которым следует терминирующий кодон.

Предпочтительно первая часть кодирует вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, фактически идентичную той, которая показана в SEQ. ID. №2, начиная с аминокислоты в положении 1 и оканчивая аминокислотой в положении 107. Более предпочтительно первая часть имеет нуклеотидную последовательность, которая показана в SEQ. ID. №2, начиная с нуклеотида в положении 1 и оканчивая нуклеотидом в положении 321. Предпочтительно также вторая часть кодирует константную часть человеческой легкой цепи, более предпочтительно константную часть человеческой цепи κ.

Изобретение включает также связывающие IL-1β молекулы, в которых один или несколько остатков CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' или CDR3' заменяются остатками, приведенными в SEQ. ID. №1 и SEQ. ID. №2; к примеру, с помощью мутации, например, сайт-направленным мутагенезом соответствующих последовательностей ДНК. Изобретение включает последовательности ДНК, кодирующие такие измененные связывающие IL-1β молекулы. В частности, изобретение включает связывающие IL-1β молекулы, в которых один или несколько остатков CDR1' или CDR2' были заменены остатками, показанными в SEQ. ID. №2.

В первой и во второй конструкциях ДНК первая и вторая части могут быть разделены интроном, и энхансер может быть удобно расположен в интроне между первой и второй частями. Присутствие такого энхансера, который транскрибируется, но не транслируется, может способствовать эффективной транскрипции. В специальном варианте воплощения изобретения первая и вторая конструкции ДНК включают энхансер гена тяжелой цепи преимущественно человеческого происхождения.

Каждая из конструкций ДНК находится под контролем соответствующих контрольных последовательностей, в частности под контролем соответствующего промотора. Можно использовать любой тип промотора при условии, что он адаптирован к организму хозяина, в который конструкции ДНК будут перенесены для экспрессии. Однако, если экспрессия должна проходить в клетке млекопитающего, особенно предпочтительно использовать промотор гена иммуноглобулина или промотор цитомегаловируса (CMV), например промотор человеческого CMV.

Требуемое антитело может быть продуцировано в клеточной культуре или в трансгенном животном. Подходящих трансгенных животных можно получить в соответствии со стандартными способами, которые включают микроинъекции в яйцеклетки первой и второй конструкций ДНК, находящихся под контролем соответствующих последовательностей, перенос подготовленных таким образом яйцеклеток псевдобеременным самкам и отбор потомства, экспрессирующего требуемое антитело.

Когда цепи антитела продуцируются в клеточной культуре, конструкции ДНК сначала должны быть встроены или в один экспрессионный вектор, или в два отдельных, но совместимых экспрессионных вектора, причем последняя возможность является предпочтительной.

Соответственно изобретение обеспечивает также экспрессионный вектор, способный реплицировать в прокариотической или эукариотической клеточной линии, которая содержит по меньшей мере одну из конструкций ДНК, описанных выше.

Каждый экспрессионный вектор, содержащий конструкцию ДНК, затем переносится в соответствующий хозяйский организм. Если конструкции ДНК встроены по отдельности в два экспрессионных вектора, они могут быть перенесены раздельно, т.е. один тип вектора на клетку, или перенесены вместе, причем эта последняя возможность является предпочтительной. Подходящим хозяйским организмом могут быть бактерия, дрожжи или клеточная линия млекопитающего, причем эта последняя является предпочтительной. Более предпочтительна линия клеток млекопитающего, имеющих лимфоидное происхождение, например миеломные, гибридомные или нормальные иммортализованные В-клетки, которые удобны тем, что не экспрессируют никакой тяжелой или легкой цепи эндогенного антитела.

Для экспрессии в клетках млекопитающего предпочтительно, чтобы кодирующая последовательность связывающей IL-1β молекулы была интегрирована в ДНК клетки хозяина внутри локуса, который допускает или поддерживает высокий уровень экспрессии связывающей IL-1β молекулы. Клетки, в которых кодирующая последовательность связывающей IL-1β молекулы интегрирована в такие благоприятные локусы, могут быть идентифицированы и отобраны на основании уровней связывающей IL-1β молекулы, которую они экспрессируют. Любой подходящий селектируемый маркер может применяться для получения хозяйских клеток, содержащих кодирующую последовательность связывающей IL-1β молекулы; например, можно использовать ген dhfr (дигидрофолатредуктазы)/метотрексат или эквивалентную систему селекции. Предпочтительные системы для экспрессии связывающих IL-1β молекул по изобретению включают основанные на кодирующей последовательности GS системы амплификации/отбора, как те, которые описаны в ЕР 0256055 В, ЕР 0323997 В и в европейской заявке на патент 89303964.4. Предпочтительно также вектор может содержать другие последовательности, требуемые для содействия экспрессии, процессингу и экспорту экспрессированного белка; например, обычно вектор может содержать лидерную последовательность, ассоциированную с кодирующей последовательностью.

В дополнительном аспекте изобретение обеспечивает способ получения связывающей IL-1β молекулы, который включает (i) культивирование организма, который трансформируют с экспрессионным вектором, как описано выше, и (ii) выделение связывающей IL-1β молекулы из культуры.

По настоящему изобретению найдено, что антитело AAL160 обладает антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа человеческого IL-1β, который включает петлю, содержащую остатки Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25 зрелого человеческого IL-1β. (Остатки Gly 22, Pro 23, Tyr 24, и Glu 25 зрелого человеческого IL-1β соответствуют остаткам 138, 139, 140 и 141 соответственно предшественника человеческого IL-1β.) Этот эпитоп, по-видимому, находится за пределами сайта рекогниции рецептора IL-1, и поэтому самое удивительное, что антитела к этому эпитопу, например антитело AAL160, способны ингибировать связывание IL-1β с его рецептором. Антитела, в частности химерные и CDR-трансплантированные, и особенно человеческие антитела, которые обладают антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа зрелого человеческого IL-1β, включающего петлю, содержащую остатки Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25, и которые способны ингибировать связывание IL-1β с его рецептором, и применение таких антител для лечения опосредованных IL-1 заболеваний и нарушений являются новыми и включены в объем настоящего изобретения.

Таким образом, в дальнейшем аспекте изобретение включает антитело к IL-1β, которое обладает антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа человеческого IL-1β, который включает петлю, содержащую остатки Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25 зрелого человеческого IL-1β, и которое способно ингибировать связывание IL-1β с его рецептором.

Кроме того, в дальнейших аспектах изобретение включает:

(i) применение антитела к IL-1β, которое обладает антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа зрелого человеческого IL-1β, который включает петлю, содержащую остатки Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25, и которое способно ингибировать связывание IL-1β с его рецептором, для лечения опосредованного IL-1 заболевания или нарушения;

(ii) способ лечения опосредованного IL-1 заболевания или нарушений у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества антитела к IL-1β, которое обладает антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа зрелого человеческого IL-1β, который включает петлю, состоящую из остатков Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25, и которое способно ингибировать связывание IL-1β с его рецептором;

(iii) фармацевтическую композицию, включающую антитело к IL-1β, которое обладает антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа зрелого человеческого IL-1R, который включает петлю, состоящую из остатков Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25, и которое способно ингибировать связывание IL-1β с его рецептором, в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, разбавителем или носителем; и

(iv) применение антитела к IL-1β, которое обладает антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа зрелого человеческого IL-1β, который включает петлю, состоящую из остатков Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25, и которое способно ингибировать связывание IL-1β с его рецептором, с целью получения лекарственного средства для лечения опосредованного IL-1 заболевания или нарушения.

Для целей настоящего описания антитело "способно ингибировать связывание IL-1β", если антитело способно ингибировать связывание IL-1β с его рецептором по существу в той же мере, что и антитело AAL160, где термин "в той же мере" имеет значение, которое определено выше.

В настоящем описании термин "опосредованное IL-1 заболевание" охватывает все заболевания и состояния лекарственного лечения, при которых IL-1 непосредственно или косвенно участвует в заболевании или состоянии лекарственного лечения, включая этиологию, развитие, прогресс, устойчивость или патологию заболевания или состояния.

В настоящем описании термины "лечение" или "лечить" оба относятся к профилактическому или превентивному лечению, а также к целебному или изменяющему ход заболевания лечению, включая терапию пациента при опасности заражения или подозреваемого в заражении болезнью так же, как пациентов, которые больны, или пациентов с установленным диагнозом в качестве страдающих от заболевания или подлежащего лечению состояния, и включают подавление клинического рецидива.

Антитела, обладающие антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа зрелого человеческого IL-1β, который включает петлю, содержащую остатки Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25, и которые способны ингибировать связывание IL-1β с его рецептором, в данном контексте относятся к антителам по изобретению. Предпочтительно антителами по изобретению являются антитела, которые обладают антигенсвязывающей специфичностью этого эпитопа человеческого IL-1β, если человеческий IL-1β находится в условиях нативного, например, нормального физиологического состояния, а не в условиях денатурации, например не в присутствии денатурирующего агента, такого как SDS (додецилсульфат натрия). Антитела по изобретению могут перекрестно реагировать с нечеловеческими интерлейкинами 1β, которые содержат антигенные эпитопы, включающие остаток Gly в положении 22, остаток Pro в положении 23, остаток Tyr в положении 24 и остаток Glu в положении 25, и которые близки по своему подобию, соответствующему человеческому эпитопу. Например, антитела по изобретению могут перекрестно реагировать с интерлейкинами 1β приматов, такими как IL-1 макака резус, IL-1 яванского макака (Macaca fascicularis) или IL-1 мартышки.

Предпочтительно антителами по изобретению являются связывающие IL-1β молекулы в соответствии с первым и вторым аспектами изобретения. Благоприятно, когда антителами по изобретению являются человеческие антитела, наиболее предпочтительно антитело AAL 160 или его прямой эквивалент.

Антитела по изобретению блокируют действие IL-1β на клетки-мишени и поэтому показаны для применения в лечении опосредованных IL-1 заболеваний и нарушений. Эти и другие виды фармакологической активности антител по изобретению можно продемонстрировать стандартными способами тестирования, например такими, которые описаны ниже.

1. Нейтрализация опосредованной IL-1β активации промотора IL-8

Способность нейтрализовать зависимую от IL-1β передачу клеточного сигнала определяли в анализе репортерного гена.

Линию клеток меланомы человека G361 устойчиво трансфицировали конструкцией репортерного гена люциферазы, основанной на промоторе человеческого IL-8. В данной линии клеток экспрессия репортерного гена и активность зависят от IL-1β или TNFα (фактора некроза опухолей α). Клетки стимулировали с 300 пг/мл рекомбинантного человеческого IL-1β или 100 пг/мл эквивалента в кондиционированной среде в присутствии различных концентраций антитела по изобретению или антагониста рецептора IL-1, изменяющихся между 6 и 18000 пМ. Использовали химерное антитело Simulect® (basiliximab) в качестве согласованного изотипического контроля. Активность люциферазы оценивали количественно хемилюминесцентным анализом. При тестировании в этом анализе антитела по изобретению обычно имеют значение IC₅₀ (50 %-ной ингибирующей концентрации) примерно 1 нМ (например, от примерно 0,2 до примерно 5 нМ).

2. Нейтрализация зависимого от IL-1β продуцирования PGE₂ и интерлейкина-6 первичными человеческими фибробластами

Продуцирование простагландина Е₂ (PGE₂) и IL-6 в первичных человеческих кожных фибробластах зависит от IL-1β. Один TNF-α не может эффективно индуцировать медиаторы воспаления, но является синергистом IL-1. Первичные кожные фибробласты применяют в качестве заменяющей модели для индуцированной IL-1 активации клеток.

Первичные человеческие фибробласты стимулировали с рекомбинантным IL-1β или кондиционированной средой, полученной из стимулированных LPS (липополисахаридом) человеческих PBMCs (моноцитов периферической крови) в присутствии различных концентраций антитела по изобретению, изменяющихся от 6 до 18000 пМ. Химерное антитело Simulect® (basiliximab) против CD25 использовали в качестве согласованного изотипического контроля. После стимуляции в течение 16 ч супернатант отделяли и анализировали содержание IL-6 методом ELISA или содержание PGR₂ с помощью RIA. В описанном выше тесте антитела по изобретению при подавлении продуцирования IL-6 обычно имеют значение IC₅₀ примерно 1 нМ или меньше (например, от примерно 0,1 до примерно 1 нМ) и при подавлении продуцирования PGR₂ примерно 1 нМ (например, от примерно 0,1 до примерно 1 нМ).

Как отмечено выше в анализах, антитела по изобретению эффективно блокируют воздействия IL-1β. Соответственно антитела по изобретению имеют следующее фармацевтическое применение.

Антитела по изобретению применимы для профилактики и лечения опосредованных IL-1 заболеваний или терапевтических состояний, например воспалительных состояний, аллергий и аллергических состояний, реакций гиперчувствительности, аутоиммунных заболеваний, острых инфекций и отторжения органных либо тканевых трансплантатов.

Например, антитела по изобретению могут применяться для терапии реципиентов трансплантата сердца, легкого, комбинированного трансплантата сердце-легкое, печени, почки, поджелудочной железы, кожи или корнеальных транплантатов и для предотвращения гомологичной болезни, такой как сопутствующая пересадке костного мозга.

Антитела по изобретению особенно полезны для лечения, предупреждения или ослабления аутоиммунного заболевания и воспалительных состояний, в частности воспалительных состояний с этиологией, включающей аутоиммунный компонент, такой как артрит (например, ревматоидный артрит, хронический прогрессирующий артрит и деформирующий артрит), и ревматические болезни, включающие воспалительные состояния, и ревматические болезни, включающие утрату костной ткани, воспалительную боль, гиперчувствительность (включая как гиперчувствительность дыхательных путей, так и кожную гиперчувствительность) и аллергии. Специфические аутоиммунные заболевания, при которых могут быть применены антитела по изобретению, включают аутоиммунные гематологические нарушения (включающие, например, гемолитическую анемию, апластическую анемию, чистую эритроцитарную анемию и идиопатическую тромбоцитопению), системную эритематозную волчанку, полихондрит, отечную склеродермию, грануломатоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, миастению беременных, псориаз, синдром Стивена-Джонсона, идиопатический синдром мальабсорбции, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника (включая, например, язвенный колит, болезнь Крона и синдром раздраженной толстой кишки), эндокринную офтальмопатию, болезнь Грейвса, саркоидоз, множественный склероз, первичный билиарный цирроз, юношеский диабет (сахарный диабет типа I), увеит (передней и задней сосудистой оболочки), сухой кератоконъюнктивит и весенний конъюнктивит, интерстициальный фиброз легкого, псориатический артрит и гломерулонефрит (с нефротическим синдромом и без него, например, включающий идиопатический нефротический синдром или слабо выраженную нефропатию).

Антитела по изобретению применимы также для лечения, предупреждения или ослабления астмы, бронхита, пневмокониоза, легочной эмфиземы и других обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей.

Антитела по изобретению применимы для лечения нежелательных острых и сверхострых воспалительных реакций, которые опосредованы IL-1 или включают выработку IL-1, особенно IL-1β, или стимуляцию высвобождения TNF с помощью IL-1, например острых инфекций, к примеру септического шока (например, эндотоксического шока и респираторного дистресс-синдрома у взрослых), менингита, пневмонии; и тяжелых ожогов; и для лечения кахексии или синдрома истощения, ассоциированного с патологическим высвобождением TNF, являющимся результатом инфекции, рака или дисфункции органов, особенно связанной со СПИД кахексии, например ассоциированной или логически вытекающей из заражения ВИЧ.

Антитела по изобретению особенно полезны для лечения нарушений костного метаболизма, включая остеоартриты, остеопороз и другие воспалительные поражения кости ревматического или подагрического происхождения и утрату костной ткани в целом, включающую связанную с возрастом утрату костной ткани и, в частности, поражение периодонта.

Антитела по изобретению могут применяться в терапии злокачественных опухолей, в частности IL-1-зависимых опухолей.

Для этих показаний соответствующий дозовый режим будет, конечно, меняться в зависимости от, например, особенности антитела по изобретению, которое должно применяться, от хозяина, способа введения, природы и тяжести подвергаемого лечению состояния. Однако при профилактическом применении, как правило, отмечают, что удовлетворительные результаты получаются при дневных дозах от примерно 0,1-5 мг/кг массы тела. Антитело по изобретению удобно вводить парентерально, внутривенно, например, в находящуюся перед локтевым суставом вену или другую периферическую вену, внутримышечно или подкожно. Профилактическая терапия обычно включает введение молекулы по изобретению однократно в день до однократно в неделю в течение 2-4 недель.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть получены общеизвестными способами. Композиция по изобретению предпочтительно обеспечивается в лиофилизированной форме. Для немедленного введения ее растворяют в соответствующем водном носителе, например в стерильной воде для инъекций или стерильном забуференном физиологическом растворе. Если учитывается требование приготовить больший объем раствора для введения путем инфузии, например внутривенной инфузии, а не болюсным вливанием, например подкожным болюсным вливанием, полезно включить в физиологический раствор человеческий сывороточный альбумин или собственную обработанную гепарином кровь пациента во время составления смеси. Присутствие избытка такого физиологически инертного белка предотвращает потерю антитела за счет абсорбции на стенках стеклянного сосуда и системы трубок, используемых с инфузионным раствором. При использовании альбумина соответствующая концентрация составляет 0,5-4,5% массовых от физиологического раствора.

Далее изобретение описывается только иллюстративным способом в следующих примерах, которые ссылаются на сопутствующие чертежи.

Фиг. 1 представляет собой графическое изображение конкурентного ингибирования связывания AAL160 с IL-1β растворимыми рецепторами IL-1 типа I и типа II.

Фиг. 2 представляет собой графическое изображение подавления антителом AAL160 лихорадки, индуцированной IL-1β на крысиной модели.

Фиг. 3 представляет собой графическое изображение продолжительности действия AAL160 на индуцированную IL-1β лихорадку у крыс.

Примеры

Трансгенных мышей, созданных для экспрессии человеческого набора IgG/κ вместо мышиного набора иммуноглобулинов (Fishwild и др., Nat. Biotechnol., 14, 845-851), использовали для того, чтобы вызывать образование антител к человеческому IL-1β. В-клетки этих мышей иммортализовали с помощью стандартной гибридомной методики и получали мышиные гибридомные клетки, которые секретировали антитело AAL160 к человеческому IgGl/κ.

Пример 1: образование гибриломы и очистка антитела

Мышь линии 66, полученной с применением генной инженерии (Medarex Inc., Annadale, NJ), иммунизировали с рекомбинантным человеческим IL-1β (50 мкг) в адъюванте подкожно в нескольких участках. Мышь ревакцинировали дополнительно пять раз с последней инъекцией за три дня до гибридизации. В день гибридизации мышь линии 66 умерщвляли вдыханием CO₂ и клетки селезенки (4,1×10⁷) гибридизовали рутинным способом, используя PEG 4000 с равным количеством клеток PAI-О, мышиной миеломной клеточной линии. Гибридные клетки культивировали в 624 лунках (1 мл/лунку), содержащих питательный слой из мышиных перитонеальных клеток (мышей линии Balb) в среде HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) с добавлением среды RPMI 1640, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, инактивированной нагреванием, 5×10^-5 М β-меркаптоэтанола. Супернатанты собирали, тестировали методом ELISA и скринировали на реагирующие с IL-1β моноклональные антитела. Идентифицировали пять моноклональных антител подкласса IgG/κ. Клонирование проводили, используя четыре 96-луночных планшета для микротитрования, помещая 0,5 мл/лунку. Через две недели клетки просматривали в инвертированном микроскопе. Супернатант собирали из ячеек с положительным показателем роста и продуцирование моноклональных антител против IL-1β оценивали с помощью ELISA. Готовили 1-2 л кондиционированного супернатанта от четырех субклонов первоначально идентифицированной гибридомы # 476 и антитела очищали аффинной хроматографией на колонке с белком А.

Чистота и частичные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи

Секвенирование белков

Легкую и тяжелую цепи антитела AAL 160 разделяли с помощью SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и N-концевые аминокислоты определяли деградацией по Эдману. Чистота антитела, использованного в этих исследованиях, составляет ≥90% по методу секвенирования. Последовательности кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, получали амплификацией кДНК с помощью PCR, полученной из мРНК, выделенной из клонированных гибридомных клеток и полностью секвенированной. Ниже приведены N-концевые последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи и соответствующие последовательности ДНК, в которых все CDR выделены жирным шрифтом.

Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, и соответствующие аминокислотные последовательности антитела AAL 160 также приведены в сопутствующем списке последовательностей, как SEQ. ID. №1-4.

Создание экспрессионных векторов для тяжелой и легкой цепи

Клонированные кодирующие последовательности V_L и V_H амплифицировали с помощью PCR и внедряли через соответствующие сайты рестрикции в кассетные векторы, обеспечивая иммуноглобулиновый промотор, лидерные последовательности из антитела RFT2 (Heinrich и др., (1989) J. Immunol. 143, 3589-97), часть J-сегментов и сплайсинговый донорный сайт. Кассету легкой цепи, содержащую весь участок V_L, промотор и лидерную последовательность для секреции, переносили в экспрессионный вектор, содержащий человеческий ген Ck, энхансер тяжелой цепи иммуноглобулина и модифицированный мышиный ген dhfr кДНК для селекции с помощью метотрексата (МТХ).

Кассету тяжелой цепи соответственно переносили в экспрессионный вектор, кодирующий ген человеческого IgG1, энхансер тяжелой цепи иммуноглобулина и устойчивый к неомицину ген для селекции.

Как тяжелая, так и легкая цепь в экспрессионных векторах имеют конфигурацию, которая напоминает геномную конфигурацию перестроенных иммуноглобулиновых генов, которая считается определяющей для высокого уровня экспрессии.

Для продуцирования антител описанные выше векторы котрансфицировали в соответствующую линию клеток хозяина, например линию клеток SP2/0, клетки, содержащие векторные последовательности, отбирали с помощью метотрексата и отобранные клеточные линии культивировали для экспрессии антитела AAL 160. Альтернативно можно использовать основанную на последовательности GS систему амплификации/селекции, такую как описанная в ЕР 0256055 В, ЕР 0323997 В или в заявке на европейский патент №89303964.4, в каковом случае селектируемый маркер dhfr заменяют на кодирующую GS-последовательность.

Пример 2: биохимические и биологические данные

Показано, что моноклональное антитело AAL 160 нейтрализует активность интерлейкина-1β in vitro. Моноклональное антитело дополнительно характеризуется своим связыванием с рекомбинантным IL-1β в анализе BIOcore. Тип нейтрализации оценивали с помощью исследований конкурентного связывания с растворимыми рецепторами IL-1. Биологическую активность антитела AAL 160 в отношении рекомбинантного и естественно продуцированного IL-1β определяли в первичных человеческих клетках (пример 3), легко реагирующих на стимуляцию с IL-1β.

2.1 Определение константы равновесия диссоциации

Константу скорости ассоциации и диссоциации для связывания рекомбинантного человеческого IL-1β c AAL160 определяли анализом BIAcore. Иммобилизовали AAL160 и связывание рекомбинантного IL-1β в диапазоне концентраций 0,5-12 нМ измеряли поверхностным плазменным резонансом. Выбранный формат допускает обработку события связывания IL-1β с AAL160 в соответствии со стехиометрией 1:1. Аналитические данные получали, используя программное обеспечение BIAevaluation.

Константа скорости ассоциации [М^-1с^-1]	(n=15)	(3,91±0,14)×10⁵	Среднее значение±SEM*
Константа скорости диссоциации [с^-1]	(n=15)	(1,53±0,05)×10^-4	Среднее значение±SEM
Константа равновесия диссоциации K_D [М]	(n=15)	(396,6±19,5)×10^-12	Среднее значение±SEM
* SEM - значение стандартной ошибки

Антитело AAL160 связывается с рекомбинантным человеческим IL-1β с высоким сродством.

2.2 Конкурентное ингибирование связывания с растворимыми рецепторами IL-1

Изучение конкурентного связывания с растворимыми рецепторами IL-1 типа I и типа II

Конкуренцию между AAL160 и растворимыми рецепторами IL-1 типа I и типа II измеряли с помощью анализа BIAcore. Антитело ALL 160 иммобилизовали на поверхности чипа и рекомбинантный человеческий IL-1β (8 нМ) впрыскивали для связывания AAL160 в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций рекомбинантного человеческого растворимого рецептора I (0-10 нМ) или рецептора II (0-80 нМ). Полученные результаты показаны на фиг. 1. Связывание антитела NVP AAL160 NX-1 с IL-1β является конкурентным как по отношению рецептора IL-1 типа I, так и типа II.

2.3 Параметры реакционной способности в отношении человеческого IL-1α, человеческого IL-1RA и IL-1β грызунов и обезьян

Параметры реакционной способности AAL160 в отношении человеческих IL-1α, IL-1RA и IL-1β мыши, крысы, кролика и яванского макака определяли с помощью анализа BIOcore. Антитело AAL160 иммобилизовали и исследуемые цитокины применяли в концентрации 8 нМ (или 20 нМ в случае IL-1β).

	Процент общего связывания ± SEM*
IL-1β человека	100
IL-1α человека	1,7±0,7 (n=3)
IL-1RA человека	1,2±1,2 (n=3)
IL-1β мыши	2,8±1,5 (n=3)
IL-1β крысы	3,0±2,5 (n=3)
IL-1β яванского макака	96,4±6,8 (n=3)
IL-1β кролика	12,1 ±2,3 (n=3)
*SEM - значение стандартной ошибки

Антитело AAL160 незначительно реагирует перекрестно с человеческим IL-1α, человеческим IL-1RA или мышиным, крысиным или кроличьим IL-1β. Реакционная способность в отношении IL-1β яванского макака фактически идентична таковой для человеческого цитокина.

Пример 3: нейтрализация зависимого от IL-1β продуцирования PGE₂ и интерлейкина-6 первичными человеческими фибробластами

Продуцирование PGR₂ и IL-6 в первичных человеческих кожных фибробластах зависит от IL-1β. Один TNF-α не может эффективно индуцировать эти медиаторы воспаления, но проявляет синергизм с IL-1. Первичные фибробласты кожи применяют в качестве заменяющей модели для индуцированной IL-1 активации клеток.

Первичные человеческие фибробласты стимулировали с рекомбинантным IL-1β или кондиционированной средой, полученной из стимулированных LPS человеческих PBMCs (моноцитов периферической крови) в присутствии различных концентраций AAL160 или IL-1RA, изменяющихся в диапазоне 6-18000 пМ. Химерное антитело к CD-25 Simulect® (basiliximab) использовали в качестве совместимого изотипического контроля. Супернатант собирали через 16 ч после стимуляции и анализировали на IL-6 с помощью ELISA или на PGE₂ с помощью RIA.

	AAL160 IC₅₀±SEM (n≥3)	IL-1 RA IC₅₀±SEM (n≥3)
Секреция IL-6 рекомбинантного	0,34±0,037 нМ	н/о*
Скреция IL-6, кондиционированная среда	0,6±0,009 нМ	0,03±0,001 нМ
Продуцирование PGR₂, кондиционированная среда	0,79±0,17 нМ	н/о
*Не определено

Антитело AAL160 эффективно блокирует Продуцирование IL-6 и PGE₂ в человеческих кожных фибробластах с IC₅₀ подобной таковой как для рекомбинантного, так и для природного IL-1β.

Пример 4: эффективность in vivo и продолжительность действия AAL160

Эффективность

Эффективность антитела AAL 160 против hulL-1β (человеческого IL-1β) испытывали на крысиной модели, где лихорадку вызывали путем внутривенной инъекции hulL-1β (100 нг/крысу). Антитело вызывало дозозависимое подавление чувствительности лихорадки выше диапазона доз 1, 3 и 10 мкг/кг внутривенно (n=6 крысам) - смотри фиг.2. В качестве контроля использовали антитело CHI 621 (Simulect®, basiliximab).

Продолжительность действия

Продолжительность действия AAL 160 исследовали на модели крысиной лихорадки, индуцированной IL-1β, следующим образом. Антитело вводили внутривенно или за 24 ч, или за 30 мин (стандартный протокол) до индукции лихорадки путем внутривенной инъекции человеческого IL-1β и позднее измеряли температуру тела через 2 и 4 ч. Одинаковая степень подавления лихорадки видна в обеих временных точках (смотри фиг.3). Как и ожидалось, контрольное антитело CHI 621 (Simulect®, basiliximab) неэффективно в обеих временных точках. Эти данные свидетельствуют о том, что человеческое антитело AAL 160 находится у крыс в активной форме, по меньшей мере, 24 ч и не метаболизируется, секретируется или связывается с тканями в течение этого времени.

Пример 5: рентгеноструктурные исследования AAL 160 Fab и его комплекса с IL-1β

Определение структуры AAL 160 Fab при разрешении 2,0 Å

Набор данных при разрешении 2,0 Å очень хорошего качества (R_сим=0,051, полнота =99,9%, избыточность =8,2) собирали от кристалла Fab, выращенного с помощью методики диффузии пара в висящую каплю, при рН 9,5 в 50% PEG 200, 0,1 M CHES (2-[N-циклогексиламино]этансульфоновой кислоте). Кристалл был в пространственной группе Р2₁2₁2₁ с размерами элементарной ячейки а=62,17 Å, b=89,83 Å, с=123,73 Å и одной молекулой Fab на симметричную единицу (коэффициент Мэтьюса: 3,6 Å³/Да, установленное содержание растворителя 66%). Структуру определяли молекулярным замещением и очищали до конечного кристаллографического фактора R=0,209 (свободный фактор R=0,261). Конечная модель включала остатки легкой цепи 1-213, тяжелой цепи 1-131 и 138-218, 387 молекул воды и 1 молекулу PEG. Конечная электронная плотность хорошо определяется для всех остатков CDR, кроме остатка Trp 94 (CDR3) легкой цепи. Положение этого остатка в боковой цепи плохо определяется в двух кристаллических формах, которые исследованы до настоящего времени, позволяя таким образом предположить, что он является чрезвычайно мобильным в отсутствие связанного антигена.

Кристаллизация комплекса Fab с IL-1β и предварительная экспериментальная модель комплекса: несколько кристаллов AAL 160 Fab в комплексе с антигеном IL-1β получали из исходного раствора комплекса 1:1 с концентрацией 76 мг/мл в 2,0 М сульфате аммония, 0,1 М трис-буфере, рН 8,5. Кристаллы росли очень медленно в течение периода нескольких недель. Они слабо дифрагировали до примерно 3,2 Å на исходном источнике. Предварительный набор данных собирали и пытались провести молекулярное замещение, используя структуры высокого разрешения свободного Fab и человеческого IL-1β (J.P.Priestle и др., EMBO J., 7, 339 (1988)) в качестве исходных моделей. Расчеты дали очень четкое и однозначное решение, когда в качестве отдельных модулей использовали части Fab-Fv и Fc (корреляция 67,1%, фактор R=0,354 после этапа AMORE FITTING, использующего данные между 8,0 и 3,5 Å). Последующее сравнение свободной и связанной форм Fab показало, что угловой профиль очень отличается в двух структурах. Результаты расчетов молекулярного замещения обеспечили первую молекулярную модель взаимодействий между антигеном IL-1β и моноклональным антителом AAL 160. Предварительный анализ этих взаимодействий указывает, что (1) IL-1β прочно взаимодействует со всеми тремя CDR тяжелой цепи и CDR3 легкой цепи. В противоположность этому, незначительные взаимодействия, если какие-либо и были, включают CDR1 и CDR2 легкой цепи. (2) Петля, содержащая остатки Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25 зрелого IL-1β, скрепляется в центре сайта, объединяющего антиген, и тем самым, по-видимому, является ключевым компонентом эпитопа. Достаточно интересно, что данная петля не расположена в области молекулы, которая наиболее отличается от мышиного IL-1β. Остатки Pro 23, Tyr 24 и Glu 25 являются консервативными, а остаток 22 является Gly в человеческом IL-1β и Asp в мышином IL-1β. Сравнение кристаллических структур человеческого (Банк данных белка (PDB), запись 2ilb) и мышиного IL-1β (PDB, запись 8ilb) показывает, что эта точечная мутация приводит к очень разной конформации основной цепи вокруг Pro 23. Это локальное структурное различие согласуется с наблюдаемой потерей перекрестной реакционной способности AAL 160 по отношению к мышиному цитокину.

Claims

1. Связывающая IL-1β молекула, включающая антигенсвязывающий сайт, содержащий по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), который содержит в последовательности гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, причем упомянутый CDR1 имеет аминокислотную последовательность Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, упомянутый CDR2 имеет аминокислотную последовательность Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly, и упомянутый CDR3 имеет аминокислотную последовательность Typ-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, и их прямые эквиваленты.

2. Связывающая IL-1β молекула по п.1, которая является человеческим антителом.

3. Связывающая IL-1β молекула по любому из пп.1 и 2 для применения в лечении опосредованного IL-1β заболевания или нарушения.

4. Связывающая IL-1β молекула, содержащая вариабельные домены тяжелой (V_H) и легкой цепи (V_L),где упомянутая связывающая IL-1β молекула содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, включающий:

(б) вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (V_L), который содержит гипервариабельный участок CDR3', имеющий аминокислотную последовательность GIn-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro, и их прямые эквиваленты.

5. Связывающая IL-1β молекула по п.4, в которой вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (V_L) дополнительно содержит в последовательности гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', причем упомянутый CDR1' имеет аминокислотную последовательность Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, a CDR2' имеет аминокислотную последовательность Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr, и упомянутый CDR3' имеет аминокислотную последовательность GIn-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro, и их прямые эквиваленты.

6. Связывающая IL-1β молекула по любому из п.4 или 5, которая является человеческим антителом.

7. Связывающая IL-1β молекула по любому из п.4-6 для применения в лечении опосредованного IL-1β заболевания или нарушения.

8. Связывающая IL-1β молекула, содержащая по меньшей мере один антиген-связывающий сайт, включающий первый домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу, идентичную последовательности, приведенной в SEQ. ID. No 1, начиная с аминокислотного остатка в положении 1 и кончая аминокислотным остатком в положении 118, или указанный первый домен и второй домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу, идентичную последовательности, приведенной в SEQ. ID. No 2, начиная с аминокислотного остатка в положении 1 и кончая аминокислотным остатком в положении 107.

9. Связывающая IL-1β молекула по п.8 для применения в лечении опосредованного IL-1β заболевания или нарушения.

10. Первая конструкция ДНК, кодирующая тяжелую цепь или ее фрагмент и включающая первую часть, кодирующую вариабельный домен, содержащий альтернативно каркасный и гипервариабельные участки, находящиеся в последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, аминокислотные последовательности которых приведены в SEQ. ID No 1, при этом указанная первая часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и вторую часть, кодирующую константную часть тяжелой цепи или ее фрагмент, который начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной части тяжелой цепи, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной части, или ее фрагмента, за которым следует терминирующий кодон.

11. Вторая конструкция ДНК, кодирующая легкую цепь или ее фрагмент, включающая первую часть, кодирующую вариабельный домен, включающая альтернативно каркасный и гипервариабельные участки, которыми являются CDR3' и необязательно CDR1' и CDR2', аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ. ID. No 2, при этом указанная первая часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и вторую часть, кодирующую константную часть легкой цепи или ее фрагмент, который начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной части легкой цепи, и оканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной части, или ее фрагмент, за которым следует терминирующий кодон.

12. Экспрессионный вектор, способный реплицироваться в прокариотических или эукариотических клетках и обеспечивать экспрессию в них тяжелой цепи или ее фрагмента, включающий по меньшей мере одну конструкцию ДНК по п.10.

13. Экспрессионный вектор, способный реплицироваться в прокариотических или эукариотических клетках и обеспечивать экспрессию в них легкой цепи или ее фрагмента, включающий по меньшей мере одну конструкцию ДНК по п.11.

14. Способ получения связывающей IL-1β молекулы, который включает культивирование организма, трансформированного экспрессионным вектором по п.12 или 13, и выделение связывающей IL-1β молекулы из культуры.

15. Антитело к IL-1β, которое обладает антигенсвязывающей специфичностью антигенного эпитопа зрелого человеческого IL-1β, включающее петлю, содержащую остатки Gly 22, Pro 23, Tyr 24 и Glu 25, и которое способно ингибировать связывание IL-1β с его рецептором.