SK288054B6

SK288054B6 - Antibody to IL-1 beta, IL-1 beta binding molecule, its use and process for production, first DNA construct, expression vector and pharmaceutical composition

Info

Publication number: SK288054B6
Application number: SK1035-2002A
Authority: SK
Inventors: Hermann Gram; Padova Franco E. Di
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2013-03-01
Also published as: DE60124863T3; CN1395581A; GB0001448D0; HK1050013A1; PL356297A1; CZ20022531A3; HUP0204156A3; IL150551A0; SK10352002A3; CZ302738B6; DE60124863D1; WO2001053353A2; PL207642B1; AR027253A1; JP3978338B2; ES2274865T5; EP1248804A2; ES2274865T3; CN1395581B; MY155269A

Abstract

It is described an IL-1 beta binding molecule, an antibody to human IL-1 beta, especially a human antibody to human IL-1 beta, wherein the CDRs of the heavy and light chains have amino acid sequences as defined in description. The molecule is useful for use in the treatment of an IL-1 mediated disease or disorder, e.g. osteoarthritis, osteroporosis and other inflammatory arthritides.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka protilátok proti humánnemu interleukínu I beta (IL-Ιβ) a použitia takýchto protilátok na liečenie ochorení a porúch sprostredkovaných IL-1.

Doterajší stav techniky

Interleukín 1 (IL-1) je aktivita produkovaná bunkami imunitného systému, ktorá pôsobí ako mediátor akútnej fázy zápalovej reakcie. Nevhodná alebo nadmerná tvorba IL-1, najmä potom IL-Ιβ, je patologický stav, ktorý vedie k rôznym ochoreniam a poruchám, ako je napr. septikémia, septický alebo endotoxický šok, alergia, astma, strata kostnej hmoty, ischémia, infarkt, reumatoidná artritída a ďalšie zápalové ochorenia. Protilátky proti IL-Ιβ už boli navrhnuté na použitie pri liečení IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch, pozri napr. WO 95/01997 a diskusia v úvode uvedeného dokumentu.

Pôvodcovia predkladaného vynálezu pripravili zlepšené protilátky proti humánnemu IL-Ιβ na použitie na liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje protilátku IL-Ιβ, ktorá má vlastnosti, ako sa nárokuje v nároku 1.

Predkladaný vynález poskytuje molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá obsahuje väzbové miesto pre antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H), ktorá obsahuje v sekvencii hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, ako sú znázornené v SEQ ID NO: 1, t. j. CDR1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, a pričom molekula viažuca IL-β obsahuje väzbové miesto pre antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulínu (V_L), v ktorej obsahuje v sekvencii hypervariabilné úseky CDRľ, CDR2' a CDR3', ako je znázornené na SEQ ID NO: 2, t. j. CDRľ, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, CDR2', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a CDR3', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu GlnGln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro.

Vynález poskytuje molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá obsahuje variabilné domény tak ťažkého (V_H) ako ľahkého (V_L) reťazca, kde molekula viažuca IL-Ιβ obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahujúci:

a) variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H), ktorá v sekvencii obsahuje hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, pričom CDR1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-lle, a

b) variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulínu (V_L), ktorá obsahuje v sekvencii hypervariabilné úseky CDRľ, CDR2' a CDR3', pričom CDRľ, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, CDR2', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro.

Pokiaľ nie je vyslovene uvedené inak, každý polypeptidový reťazec je v tomto texte opísaný ako sekvencia začínajúca N-koncovým úsekom a končiaca C-koncovým úsekom. Keď väzbové miesto pre antigén obsahuje obe V_H a V_L domény, tieto domény môžu byť lokalizované na rovnakej molekule polypeptidu, alebo výhodne každá doména môže byť na inom reťazci, pričom doména V_H je časťou ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jeho fragmentu a V_L je časťou ľahkého reťazca imunoglobulínu alebo jeho fragmentu.

Termín „molekula viažuca IL-^a“ označuje v predkladanom opise akúkoľvek molekulu schopnú väzby na antigén IL-Ιβ, buď samotnému, alebo asociovanému s ďalšími molekulami. Väzbová reakcia môže byť dokázaná pomocou štandardných metód (kvalitatívnych testov), ako je napríklad biologický test (bioassay) na stanovenie inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor alebo akýkoľvek iný test väzby, vždy vzhľadom na test s negatívnou kontrolou, keď sa použije protilátka s nepríbuznou špecificitou, ale rovnakým izotypom, napr. protilátka anti-CD25. Výhodne môže byť väzba molekuly viažuca IL-Ιβγ podľa vynálezu na IL-Ιβ demonštrovaná použitím kompetitívneho väzbového testu.

Príklady molekúl viažucich antigén sú protilátky tvorené B bunkami alebo hybridómamia chimérické, „vštepené“ CDR („CDR-grafted“) alebo humánne protilátky, alebo akékoľvek ich fragmenty, napr. fragmenty F(ab')2 a Fab.

Jednoreťazcová protilátka pozostáva z variabilnej domény ťažkého a ľahkého reťazca protilátky kovalentne spojených pomocou peptidovej spojky („linker“), ktorú tvorí obvykle 10 až 30 aminokyselín, výhodne 15 až 25 aminokyselín. Teda taká štruktúra neobsahuje konštantné úseky ťažkého a ľahkého reťazca a verí

SK 288054 Β6 sa, že malý spojovací peptidový úsek by mal byť menej antigénny než celý konštantný úsek protilátky.

Termín „chimérická protilátka“ v opise označuje protilátku, v ktorej konštantné úseky ťažkého alebo ľahkého reťazca alebo oboch sú humánneho pôvodu, zatiaľ čo variabilné domény tak ťažkého ako ľahkého reťazca sú iného než humánneho pôvodu (non-humánne), napr. myšieho, alebo sú humánneho pôvodu, ale pochádzajú z odlišnej humánnej protilátky.

Termín „CDR-vštepená protilátka“ označuje protilátku, v ktorej hypervariabilné úseky (CDR) pochádzajú z donorovej (darcovskej) protilátky, ako je napríklad non-humánna (napr. myšia) protilátka alebo odlišná humánna protilátka, zatiaľ čo všetky alebo v podstate všetky ďalšie časti imunoglobulínu, napr. konštantné úseky a vysoko konzervatívne úseky variabilnej domény, t. j. úseky definujúce rámec protilátky („framework“), pochádzajú z akceptorovej (príjemcovej) protilátky, napr. protilátky humánneho pôvodu. „CDRvštepená protilátka“ môže však obsahovať niekoľko aminokyselín donorovej sekvencie v úseku rámca, napríklad v úsekoch rámca susediacich s hypervariabilnými úsekmi.

Termín „humánna protilátka“ označuje protilátku, v ktorej konštantné a variabilné úseky ťažkého a ľahkého reťazca sú všetky humánneho pôvodu alebo majú sekvencie v podstate identické so sekvenciami humánneho pôvodu, nie je podmienkou, aby boli z rovnakej protilátky, a patria sem aj protilátky produkované v myšiach, v ktorých boli gény pre variabilné a konštantné časti imunoglobulínu nahradené ich humánnymi náprotivkami, napr. ako je opísané všeobecne v dokumentoch EP 054 6073 BI, US Patent 5545806, US Patent 5569825, US Patent 5625126, US Patent 5633425, US Patent 5661016. US Patent 5770429, EP 0 438474 BI a EPO 463151 BI.

Zvlášť výhodné molekulu viažuce IL-Ιβ podľa vynálezu sú humánne protilátky, obzvlášť protilátka AAL160, ktorá je ďalej opísaná v príkladoch.

Teda vo výhodných chimérických protilátkach sú variabilné domény tak ťažkého ako aj ľahkého reťazca humánneho pôvodu, napríklad také, aké sú v protilátke AAL 160 a sú v zozname sekvencií uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a sekvencia SEQ ID NO: 2. Domény konštantného úseku výhodne tiež obsahujú vhodné humánne domény konštantného úseku, napríklad ako sú opísané v „Sequences of Proteines of Immunological Interest“, Kabat E. A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Inštitúte of Health.

Hypervariabilné úseky môžu byť asociované s akýmikoľvek úsekmi rámca protilátky, ale výhodne humánneho pôvodu. Vhodné úseky rámca protilátok sú opísané v Kabat E. A. et al., ib. Výhodný rámec ťažkého reťazca je humánny rámec ťažkého reťazca, napríklad protilátky AAL160, uvedený v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1. Táto sekvencia pozostáva z úsekov FR1, FR2, FR3 a FR4. Podobne sekvencia SEQ ID NO: 2 ukazuje výhodný rámec ľahkého reťazca protilátky AAL 160, ktorého sekvencia pozostáva z úsekov FRľ, FR2', FR3'a FR4'.

Teda vynález tiež poskytuje molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahujúci buď prvú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúcu aminokyselinou v polohe 1 a končiacu aminokyselinou v polohe 118, alebo prvú doménu už opísanú a druhú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 2, začínajúcu aminokyselinou v polohe 1 a končiacu aminokyselinou v polohe 107.

Monoklonálne protilátky namierené proti proteínom prirodzene sa vyskytujúcim u všetkých ľudí sú typicky produkované v non-humánnych systémoch, napr. v myši. Priamym dôsledkom týchto skutočností je to, že xenogénna protilátka produkovaná pomocou hybridómu, keď je podávaná človeku, vyvoláva nežiaducu imunitnú reakciu, ktorá je predovšetkým sprostredkovaná konštantnou časťou xenogénneho imunoglobulínu. To jasne obmedzuje použitie takých protilátok, pretože nemôžu byť podávané dlhšie obdobie. Teda je zvlášť výhodné použitie jednoreťazcových, chimérických, CDR-vštepených alebo najmä humánnych protilátok, ktoré po podaní človeku s veľkou pravdepodobnosťou nevyvolajú významnú alogénnu reakciu.

Vzhľadom na uvedené skutočnosti, výhodnejšia molekula viažuca IL-Ιβ podľa predkladaného vynálezu je molekula vybraná zo skupiny humánnych protilátok anti-IL-Ιβ, ktoré obsahujú aspoň

a) ťažký reťazec imunoglobulínu alebo jeho fragment, ktorý obsahuje (i) variabilnú doménu obsahujúcu v sekvencií hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 a (ii) konštantný úsek alebo jeho fragment z humánneho ťažkého reťazca a to CDR1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, a

b) ľahký reťazec imunoglobulínu alebo jeho fragment, ktorý obsahuje (i) variabilnú doménu, ktorá obsahuje hypervariabilný úsek CDR3' a tiež hypervariabilné úseky CDRľ, CDR2' a (ii) konštantný úsek alebo jeho fragment z humánneho ľahkého reťazca a to CDRľ, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, CDR2', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a CDR3', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro.

Alternatívne molekula, ktorá viaže IL-^a podľa vynálezu, je molekula vybraná zo skupiny jednoreťazcových viažucich molekúl, ktoré obsahujú väzbové miesto pre antigén obsahujúci

SK 288054 Β6

a) prvú doménu obsahujúcu v sekvencií hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, pričom tieto hypervariabilné úseky majú aminokyselinové sekvencie uvedené v sekvencií SEQ ID NO: 1,

b) druhú doménu obsahujúcu hypervariabilný úsek CDR3' a CDRľ a CDR2', pričom tieto hypervariabilné úseky majú aminokyselinové sekvencie uvedené v sekvencií SEQ ID NO: 2 a

c) peptidový linker, ktorý je naviazaný buď na N-koniec prvej domény a na C-koniec druhej domény, alebo na C-koniec prvej domény na N-konci druhej domény.

Ako je odborníkovi známe, malé zmeny v aminokyselinovej sekvencií, ako je napríklad delécia, adícia alebo substitúcia jednej, niekoľkých alebo dokonca aj viac aminokyselín, môžu poskytnúť alelickú formu pôvodného proteínu, ktorá má v podstate identické vlastnosti.

Teda termín Jej priamy ekvivalent“ označuje v predkladanom opise buď jednodoménovú molekulu viažucu IL-1 β (molekula X), (i) v ktorej hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 ako celok sú aspoň z 80 % homologické, výhodne aspoň z 90 % homologické, výhodnejšie aspoň z 95 % homologické s hypervariabilnými úsekmi v sekvencíi SEQIDNO: 1, a (ii) ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako referenčná molekula, ktorá má úseky protilátkového rámca identické so zodpovedajúcimi úsekmi molekuly X, ale má hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 identické so zodpovedajúcimi úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo akúkoľvek molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá má aspoň dve domény na každé väzbové miesto (molekula X'), (i) v ktorej hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' a voliteľne tiež CDRľ a CDR2' ako celok, sú aspoň z 80 % homologické, výhodne aspoň z 90 % homologické, výhodnejšie aspoň z 95 % homologické s hypervariabilnými úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1 a sekvencie SEQ ID NO: 2, a (ii) ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako referenčná molekula, ktorá má úseky protilátkového rámca a konštantné úseky identické so zodpovedajúcimi úsekmi molekuly X', ale má hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3 a CDR3', a voliteľne tiež CDRľ a CDR2', identické so zodpovedajúcimi úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1 a sekvencie SEQ ID NO: 2.

V kontexte predkladaného opisu vynálezu je aminokyselinová sekvencia aspoň z 80 % homologická s druhou sekvenciou, ak tieto sekvencie majú aspoň 80 % identických aminokyselinových zvyškov v rovnakej polohe, keď sú sekvencie optimálne priradené (porovnané), pričom medzery alebo inzercie v aminokyselinovej sekvencíi sú počítané za neidentické zvyšky.

Inhibícia väzby IL-Ιβ na receptor môže byť ľahko testovaná pomocou rôznych testov, ako sú napr. testy opísané v texte. Použitý IL-Ιβ receptor je výhodne receptor IL-Ιβ typu 1.

Výraz „v rovnakom rozsahu“ alebo „v rovnakej miere“ znamená v kontexte predkladaného opisu, že referenčná a s ňou ekvivalentná molekula majú, štatisticky vzaté, v podstate identickú funkčnú závislosť inhibície IL-Ιβ väzby podľa jedného zo zmienených testov.

Napríklad použitý test môže byť test kompetitívnej inhibície väzby IL-Ιβ uskutočňovaný pomocou rozpustných IL-1 receptorov a IL-Ιβ viažucich molekúl podľa vynálezu.

Najvýhodnejšia humánna IL-Ιβ protilátka obsahuje aspoň

a) jeden ťažký reťazec, ktorý obsahuje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu identickú so sekvenciou SEQ ID NO: 1, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 118 a konštantný úsek humánneho ťažkého reťazca a

b) jeden ľahký reťazec, ktorý obsahuje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu identickú so sekvenciou SEQ ID. č. 2, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 107 a konštantný úsek humánneho ľahkého reťazca.

Konštantný úsek humánneho ťažkého reťazca môže byť typu γΐ, γ2, γ3 a γ4, μ, αΐ, α2, δ alebo ε, výhodne typu γ, a výhodnejšie typu γΐ, zatiaľ čo konštantný úsek humánneho ľahkého reťazca môže byť typu κ alebo λ (ktorý zahŕňa subtypy λΐ, λ2, λ3, ale výhodne je typu k). Aminokyselinové sekvencie všetkých týchto konštantných úsekov sú uvedené v publikácii Kabát et al., ib.

Molekula viažuca IL-Ιβ podľa vynálezu sa môže pripraviť metódami rekombinantnej DNA. Na tento účel sa musí skonštruovať jedna alebo viac DNA molekúl kódujúcich viažucu molekulu, umiestniť s vhodnou kontrolnou sekvenciou a preniesť do vhodného hostiteľského organizmu, kde sa potom exprimuje.

Vo všeobecnom zmysle tak vynález poskytuje:

(i) DNA molekuly kódujúce jednoreťazcovú molekulu viažucu IL-Ιβ podľa vynálezu, ťažký a ľahký reťazec alebo ich fragmenty z molekuly viažuce IL-1 β podľa vynálezu a (ii) použitie DNA molekuly podľa vynálezu na produkciu IL-Ιβ viažucich molekúl podľa vynálezu pomocou rekombinantnej technológie.

Doterajší stav techniky je taký, že odborník je schopný ľahko syntetizovať DNA molekuly podľa predkladaného vynálezu na základe informácií uvedených v tomto opise, t. j. aminokyselinových sekvencií hypervariabilných úsekov a DNA sekvencií, ktoré ju kódujú. Spôsob konštrukcie génu pre variabilnú doménu bol napríklad opísaný v Európskej patentovej prihláške č. 239 400 a môže byť stručne zhrnutý nasledovne:

Klonuje sa gén kódujúci variabilnú doménu MAb (monoklonálnej protilátky) s ľubovoľnou špecificitou. DNA segmenty kódujúce rámec protilátky a hypervariabilné úseky sa určia a DNA segmenty kódujúce hypervariabilné úseky sa odstránia, takže DNA segmenty kódujúce rámcové úseky sú vzájomne spojené pomocou vhodných reštrikčných miest v mieste spojenia. Reštrikčné miesta môžu byť vytvorené vo vhodných polohách mutagenézou DNA molekúl pomocou štandardných postupov odborníkovi známych. Dvojreťazcové syntetické CDR kazety sú pripravené pomocou DNA syntézy podľa sekvencie uvedenej ako sekvencia SEQ ID NO: 1 alebo sekvencia SEQ ID NO: 2. Tieto kazety sú vybavené „lepivými“ („sticky“) koncami, takže môžu byť ligované do spojov (reštrikčných miest) rámcových úsekov.

Okrem toho nie je potrebné mať prístup k mRNA z produkčnej hybridómovej bunkovej línie, aby bolo možné získať DNA konštrukt kódujúci molekulu viažucu IL-Ιβγ podľa vynálezu. Tak napr. PCT prihláška publikovaná ako WO 90/07861 poskytuje úplné inštrukcie na produkciu protilátky pomocou techniky rekombinantnej DNA, pričom východiskovou informáciou je iba nukleotidová sekvencia génu. Opísaný spôsob zahŕňa syntézu radov oligonukleotidov ich amplifikáciu pomocou PCR (polymerázovej reťazovej reakcie) a nakoniec ich zostrih a spojenie („splicing“), čím vznikne požadovaná DNA sekvencia.

Expresné vektory, ktoré obsahujú vhodný promótor alebo gény kódujúce konštantné úseky ťažkého a ľahkého reťazca, sú verejne k dispozícii. Teda hneď ako je DNA molekula podľa vynálezu pripravená, môže byť ľahko prenesená vo vhodnom expresnom vektore. DNA molekuly kódujúce jednoreťazcové protilátky môžu tiež byť pripravené pomocou štandardného postupu, napríklad ako bol opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške WO 88/1649.

Vzhľadom na uvedené skutočnosti nie je nutné ukladať ani hybridómy ani bunkové línie, aby bola splnená požiadavka dostatočnosti opisu vynálezu.

V konkrétnom uskutočnení vynález obsahuje prvý a druhý DNA konštrukt na produkciu molekuly viažucej IL-Ιβ, ako je opísané ďalej:

Prvý DNA konštrukt kóduje ťažký reťazec alebo jeho fragment a obsahuje

a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo rámec a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú CDR1, CDR2 a CDR3 s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a táto prvá časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom, ktorý kóduje aminokyselinu variabilnej domény a

b) druhú časť kódujúcu konštantný úsek ťažkého reťazca alebo jeho fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ťažkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.

Výhodne, prvá časť kóduje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je uvedená v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 118. Výhodnejšie prvá časť má nukleotidovú sekvenciu ako sekvencia SEQ ID NO: 1, ktorá začína nukleotidom v polohe 1 a končí nukleotidom v polohe 354. Výhodne druhá časť kóduje konštantnú časť humánneho ťažkého reťazca, výhodnejšie konštantnú časť humánneho reťazca γΐ. Táto druhá časť môže byť DNA fragment genómového pôvodu (obsahujúci intróny) alebo cDNA fragment (bez intrónov).

Druhý DNA konštrukt kóduje ľahký reťazec alebo jeho fragment a obsahuje

a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu, ktorá obsahuje striedavo úseky, rámca a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú CDR3' a voliteľné CDRľ a CDR2', ktorých aminokyselinové sekvencie sú v zozname sekvencii uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 2, pričom táto časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény a

b) druhú časť kódujúcu konštantnú časť ľahkého reťazca alebo jej fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ľahkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.

Výhodne táto prvá časť kóduje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 2, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 107. Výhodnejšie, prvá časť má nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 2, ktorá začína nukleotidom v polohe 1 a končí nukleotidom v polohe 321. Výhodne druhá časť kóduje konštantnú časť humánneho ľahkého reťazca, výhodnejšie konštantnú časť humánneho reťazca k.

Opis tiež zahŕňa molekulu viažucu IL-Ιβ, v ktorých je jeden alebo viac zvyškov v CDR1, CDR2, CDR3, CDRľ, CDR2' alebo CDR3' zmenených oproti zvyškom v sekvencii SEQ ID NO: 1 a sekvencii SEQ ID NO: 2, napríklad mutáciou, napr. miestne cielenou mutagenézou príslušnej DNA sekvencie. Opis tiež zahŕňa DNA sekvencie kódujúce takto zmenené molekuly viažuce IL-Ιβ. Najmä opis zahŕňa molekuly viažuce IL-1β, v ktorých jeden alebo viac zvyškov v CDRľ alebo CDR2' bolo zmenených oproti zvyškom v sekvencii SEQ ID NO: 2.

V prvom a druhom DNA konštrukte môže byť prvá a druhá časť oddelená intrónom a v intróne medzi pr5

SK 288054 Β6 vou a druhou časťou môže byť výhodne lokalizovaný enhancer (zosilňovací element). Prítomnosť takého enhanceru, ktorý je transkribovaný, ale nie je translatovaný, môže napomôcť účinnosti transkripcie. Vo zvláštnom uskutočnení prvý a druhý DNA konštrukt obsahujú enhancer génu ťažkého reťazca výhodne humánneho pôvodu.

Každý z DNA konštruktov je vložený pod kontrolu vhodných kontrolných sekvencii, najmä vhodného promótora. Môže byť použitý akýkoľvek typ promótora, za predpokladu, že je adaptovaný na hostiteľský organizmus, do ktorého budú DNA konštrukty prenesené na expresiu. Ale pokiaľ má dôjsť k expresii v cicavčích bunkách, zvlášť výhodné je použitie promótora imunoglobulínového génu alebo promótora cytomegalovírusu (CMV), napr. promótor humánneho CMV.

Požadovaná protilátka môže byť produkovaná v bunkovej kultúre alebo v transgénnom zvierati. Vhodné transgénne zviera môže byť pripravené štandardným spôsobom, ktorý je odborníkom známy a ktorý zahŕňa mikroinjekcie prvého a druhého DNA konštruktu s vhodnými kontrolnými sekvenciami do vajíčka a potom prenesenie takto pripraveného vajíčka do vhodnej pseudopregnantnej samice a nakoniec selekcia potomstva exprimujúceho požadovanú protilátku.

Keď sú reťazce protilátky produkované v bunkovej kultúre, DNA konštrukty musia byť najskôr vložené buď do jedného expresného vektora, alebo do dvoch oddelených, ale pritom kompatibilných expresných vektorov, čo je považované za výhodnejšiu možnosť.

Takže predkladaný vynález tiež poskytuje expresný vektor, ktorý je schopný replikácie v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunkovej línii, ktorá obsahuje opísané DNA konštrukty.

Expresný vektor obsahujúci DNA konštrukt je potom prenesený do vhodného hostiteľského organizmu. Keď sú DNA konštrukty oddelene vložené do dvoch expresných vektorov, môžu byť prenesené oddelene, t. j. jeden typ vektora do jednej bunky, alebo môžu byť prenesené spoločne (ko-transfer), čo je považované za výhodnejšiu možnosť. Vhodným hostiteľským organizmom sú baktérie, kvasinky alebo cicavčie bunkové línie, pričom výhodná je táto tretia možnosť. Výhodnejšie, cicavčia bunková línia je lymfoidného pôvodu, napr. myelóm, hybridom alebo normálne imortalizované B-lymfocyty, ktoré neexprimujú endogénne žiadne ťažké ani ľahké reťazce protilátky.

Na expresiu v cicavčích bunkách je výhodné, keď sekvencia kódujúca molekulu viažucu IL-Ιβ je integrovaná do DNA hostiteľskej bunky do lokusu, ktorý dovoľuje alebo podporuje vysoký stupeň expresie IL-Ιβ viažucich molekúl. Bunky, v ktorých je sekvencia kódujúca molekulu viažucu IL-Ιβ integrovaná do takých výhodných lokusov, môžu byť identifikované a selektované na základe hladín molekuly viažucich IL-Ιβ, ktorú exprimujú. Akýkoľvek vhodný selekčný marker môže byť použitý na prípravu hostiteľských buniek obsahujúcich kódujúcu sekvenciu pre molekulu viažucu IL-Ιβ, napr. gén dhfŕ/metotrexát alebo ekvivalentný selekčný systém. Výhodné systémy na expresiu molekuly viažuce IL-Ιβ podľa vynálezu sú napr. systémy založené na GS-amplifikácii/selekcii, opísané v EP 0256055 B, EP 0323997 B a európskej patentovej prihláške 89303964.4. Výhodne vektor obsahuje aj ďalšie sekvencie nielen požadované a to na uľahčenie expresie, opracovanie a transport exprimovaného proteínu, napr. vektor typicky obsahuje vedúcu („leader“) sekvenciu asociovanú s kódujúcou sekvenciou.

V ďalšom aspekte sa poskytuje spôsob produkcie IL-Ιβ viažucich molekúl, tento spôsob zahŕňa kroky (i) kultivácie organizmu, ktorý je transformovaný expresným vektorom už definovaným a (ii) izoláciu molekulu viažucu IL-Ιβ z kultúry.

V súlade s predkladaným vynálezom bolo zistené, že protilátka AAL160 má väzbovú špecificitu na antigénny epitop humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku, ktorá obsahuje zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zo zrelého humánneho IL-Ιβ (tieto zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zo zrelého humánneho IL-Ιβ zodpovedajú zvyškom 138, 139, 140 a 141, v uvedenom poradí, prekurzora humánneho IL-Ιβ). Tento epitop je lokalizovaný vnútri rozpoznávajúceho miesta receptora IL-1 a je preto nanajvýš prekvapujúce, že protilátky proti tomuto epitopu, t. j. napr. protilátka AAL160, sú schopné inhibovať väzbu IL-Ιβ na receptor. Opisujú sa protilátky, najmä chimérické protilátky a CDR-vštepené protilátky a najmä humánne protilátky, ktoré majú väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý obsahuje slučku, ktorá obsahuje zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 a ktoré sú schopné inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor a tiež použitie týchto protilátok pri liečení ochorení a porúch sprostredkovaných IL-1.

V ďalšom aspekte opis zahrnuje protilátku proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop humánneho IL-Ιβ, ktorý obsahuje slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zrelého humánneho IL-Ιβ a ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor.

V ešte ďalšom aspekte opis zahŕňa:

i) použitie protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, pri liečení IL-1 sprostredkovaných ochorení alebo porúch, ii) liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch u pacientov, ktoré spočíva v tom, že sa pacientovi podáva účinné množstvo protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je

SK 288054 Β6 schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, iii) farmaceutickú kompozíciu, ktorá obsahuje protilátku proti IL-Ιβ, ktorá má antigénmi väzbovú špecifickú na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, v kombinácii s farmaceutický prijateľným vehikulom, riedidlom alebo nosičom a iv) použitie protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecifickú na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, na výrobu lieku, na liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch.

V kontexte predkladaného opisu výraz, že protilátka je „schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ“, znamená, že protilátka je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako protilátka AAL160, pričom výraz „v rovnakom rozsahu“, ktorý už bol definovaný.

V kontexte predkladaného opisu výraz „IL-1 sprostredkované ochorenie“ zahŕňa všetky ochorenia a zdravotné stavy, v ktorých má nejakú úlohu IL-1, či už priamo alebo nepriamo pri ochorení alebo stave, vrátane príčiny ochorení, rozvoji a progresie ochorenia, perzistencie alebo patológie ochorenia alebo stavu.

V kontexte predkladaného opisu sa termíny „liečenie“ alebo „liečiť“ týkajú tak profylaktickej starostlivosti ako aj kuratívnej starostlivosti alebo starostlivosti, ktorá vedie k modifikácii ochorenia, vrátane starostlivosti o pacientov, ktorí sú v riziku získania ochorenia alebo majú podozrenie, že ochorenie získali a tiež pacientov, ktorí ochorením už trpia alebo boli diagnostikovaní ako trpiaci ochorením a ďalej sa týkajú aj potlačenia klinického relapsu.

Protilátky podľa vynálezu, ktoré majú väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku, ktorá obsahuje zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktoré sú schopné inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor.

Výhodne majú protilátky podľa vynálezu väzbovú špecificitu na tento epitop humánneho IL-Ιβ, keď humánny IL-Ιβ je v natívnom stave, ako sú napr. normálne fyziologické podmienky a v žiadnom prípade nie v denaturovanom stave, ako je tomu napr. v prítomnosti denaturujúcich činidiel, ako je napríklad SDS. Protilátky podľa vynálezu môžu skrížené reagovať s non-humánnymi IL-Ιβ, ktoré majú antigénne epitopy obsahujúce Gly ako zvyšok v polohe 22, Pro ako zvyšok v polohe 23, Tyr ako zvyšok v polohe 24 a Glu ako zvyšok v polohe 25, a ktoré sú si blízko podobné zodpovedajúcemu humánnemu epitopu. Napríklad protilátky podľa vynálezu môžu skrížené reagovať s IL-Ιβ primátov, ako sú napríklad makak rhesus, makak cynomolgus IL-1 alebo makak marmoset IL-1. Výhodne sú protilátky podľa vynálezu humánne protilátky, najvýhodnejšie je to protilátka AAL160 alebo jej priamy ekvivalent.

Protilátky podľa vynálezu blokujú účinky IL-Ιβ na jeho cieľové bunky a sú teda určené na použitie pri liečení IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch. Tieto a ďalšie farmakologické účinky protilátok podľa vynálezu môžu byť dokázané použitím štandardných testovacích metód, napr. uvedených ďalej:

1. Neutralizácia aktivácie promótora IL-8 sprostredkovaná humánnym IL-Ιβ

Potenciálna neutralizácia bunkovej signalizácie závislej od IL-Ιβ sa môže stanoviť pomocou testu s reportérovým génom

Humánna melanómová bunková línia G361 je stabilne transfekovaná konštruktom založeným na humánnom IL-8 promótore s luciferázovým reportérovým génom. Expresia a aktivita reportérového génu je závislá v tejto bunkovej línii od IL-Ιβ alebo TNFa. Bunky sa stimulujú 300pg/ml rekombinantného humánneho IL-1β alebo ekvivalentom 100 pg/ml v kondiciovanom médiu v prítomnosti rôznych koncentrácií protilátky podľa vynálezu alebo antagonistu IL-1 receptora v rozmedzí 6 až 18 000 pM. Chimérická protilátka Stimulect® (basiliximab) sa používa ako kontrola so zhodným izotypom. Luciferázová aktivita sa kvantifikuje použitím chemiluminiscenčného testu. Protilátky podľa vynálezu majú pri testovaní v tomto teste typicky hodnotu 1C_5O približne 1 nM (napr. 0,2 až 5 nM).

2. Neutralizácia IL-Ιβ dependentej tvorby PGE₂ a interleukínu-6 v primárnych humánnych fibroblastoch

Tvorba PGF₂ a IL-6 v primárnych humánnych dermálnych fibroblastoch je závislá od IL-Ιβ. Samotný TNF-α nemôže účinne indukovať zápalové mediátory, ale pôsobí synergicky s IL-1. Primáme dermálne fibroblasty sa používajú ako náhradný model na IL-1-indukovanú bunkovú aktiváciu.

Primáme humánne fibroblasty sa stimulujú rekombinantným IL-Ιβ alebo kondicionovaným médiom získaným z LPS-stimulovaných humánnych PBCM v prítomnosti rôznych koncentrácií protilátky podľa vynálezu alebo IL-1RA v rozsahu 6 až 18 000 pM. Chimérická protilátka Simulect® (basiliximab) sa používa ako kontrola so zhodným izotypom. Supernatant sa odoberá po 16 hodinách stimulácie a testuje sa na prítomnosť IL-6 testom ELISA alebo na prítomnosť PGE₂ testom RIA. Protilátky podľa vynálezu majú pri testovaní v týchto testoch typicky hodnotu IC₅₀ na inhibíciu produkcie IL-6 približne 1 nM alebo nižšiu (napr. 0,1 až 1 nM) a na inhibíciu produkcie PGE₂ približne lnM (napr. 0,1 až 1 nM).

Ako sa ukázalo, protilátky podľa vynálezu silne blokujú účinok IL-Ιβ. Teda sú protilátky podľa vynálezu farmaceutický využiteľné a to nasledujúcimi spôsobmi:

Protilátky podľa vynálezu sú užitočné na profylaxiu a liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení a stavov, ako je napr. zápal, alergia a alergický stav, hypersenzitívna reakcia, autoimunitná choroba, silná infekcia a rejekcia orgánového alebo tkanivového transplantátu.

Tak napríklad protilátky podľa vynálezu môžu byť použité pri liečení príjemcov transplantátov srdca, pľúc, bloku srdce-pľúca, obličiek, pankreasu, kože alebo rohovky a tiež pri prevencii reakcie štepu proti hostiteľovi („graft versus host diseases“), napr. po transplantácii kostnej drene.

Protilátky podľa vynálezu sú konkrétne použiteľné napr. pri liečení, prevencii alebo zmiernení autoimunitných ochorení a zápalových ochorení, najmä zápalových stavov s etiológiou zahŕňajúcou autoimunitnú zložku, ako je napríklad artritída (napr. reumatoidná artritída, artritída chronica progrediente a artritída deformans) a reumatických ochorení, vrátane zápalových stavov a reumatických ochorení zahŕňajúcich stratu kostnej hmoty, bolestivé zápaly a hypersenzitivity (vrátane hypersenzitivity dýchacích ciest aj kožnej hypersenzitivity) a alergií. K špecifickým autoimunitným chorobám, na ktoré môžu byť protilátky podľa vynálezu použité, patria autoimunitné hematologické poruchy (vrátane napr. hemolytickej anémie, aplastickej anémie, anémie iba červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie), systémový lupus erythematosus, polychondritída, skleroderma, Wegenerova granulomatóza, dermatomyozitída, chronická aktívna hepatitída, myasténia gravis, psoriáza, Steven-Johnsonov syndróm, idiopatická porucha vstrebávania v tenkom čreve (spme), autoimunitné zápalové ochorenie čriev (vrátane napr. ulceratívnej kolitídy, Crohnovho ochorenia a syndrómu dráždivého čreva), endokrinné oftalmopatie, Gevensove ochorenie, sarkoidóza, skleróza multiplex, primárna biliáma cirhóza, juvenilný diabetes (diabetes mellitus typu I), uveitída (anterior a posterior), suchá keratokonjunktivitída a vemálna keratokonjunktivitída, fibróza pľúcneho intersticia, psoriatická artritída a glomerulonefŕitída (tak bez, ako aj s nefrotickým syndrómom, napr. vrátane idiopatického nefrotického syndrómu alebo nefropatie s minimálnymi zmenami).

Protilátky podľa vynálezu sú tiež použiteľné pri liečení, prevencii alebo zmiernení ochorení, ako je astma, bronchitída, pneumokonióza, emfyzém pľúc a ďalšie obštruktívne alebo zápalové ochorenia dýchacích ciest.

Protilátky podľa vynálezu sú použiteľné tiež na liečenie nežiaducich akútnych a hyperakútnych zápalových reakcií, ktoré sú sprostredkované IL-1 alebo zahŕňajú tvorbu IL-1, zvlášť IL-Ιβ alebo podporu uvoľňovania TNF pomocou IL-1, napr. akútne infekcie, napr. septický šok (napr. endotoxický šok a syndróm respiračnej poruchy dospelých), meningitída, pneumónia, ťažké popáleniny a ďalej na liečenie kachexie alebo syndrómu chradnutia (wasting syndróm) spojeného s patologickým uvoľňovaním TNF v dôsledku infekcií, karcinómu alebo orgánových dysfúnkcií, obzvlášť kachexie súvisiacej s AIDS, napr. asociovanej alebo nasledujúcej po infekcii HIV.

Protilátky podľa vynálezu sú ďalej najmä použiteľné pri liečení ochorení metabolizmu kostí, ako je napr. osteoartritída, osteoporóza a ďalšie zápalové artritídy a straty kostnej hmoty všeobecne, vrátane straty kostnej hmoty, ktorá súvisí so starnutím a pri špecifických periodontálnych ochoreniach.

Protilátky podľa vynálezu môžu byť tiež použité pri liečení karcinómov, najmä IL-1 dependentných nádorov.

Na uvedené indikácie bude vhodná dávka, samozrejme, rôzna, a to v závislosti napríklad od konkrétnej použitej protilátky podľa vynálezu, príjemcu, spôsobu podávania a povahy a závažnosti ochorenia, ktoré sa má liečiť. Ale pri profylaktickom použití je všeobecne možné dosiahnuť uspokojivých výsledkov s dennými dávkami približne 0,1 mg až približne 5 mg na 1 kilogram telesnej hmotnosti. Protilátka podľa vynálezu sa obvykle podáva parenterálne, intravenózne, napr. do antekubitálnej alebo inej periférnej žily, intramuskulárne alebo subkutánne. Profylaktické liečenie typicky spočíva v podávaní molekúl podľa vynálezu jedenkrát denne až jedenkrát týždenne počas 2 až 4 týždňov.

Farmaceutické kompozície podľa predkladaného vynálezu sú vyrábané obvyklými spôsobmi, ktoré sú odborníkom známe. Kompozíciu podľa vynálezu je výhodné poskytnúť v lyofilizovanej forme. Na okamžité podanie je rozpustený vo vhodnom vodnom nosiči, ako je napríklad sterilná voda na injekcie alebo sterilný pufrovaný fyziologický roztok. Je vhodné pripraviť väčší objem takého roztoku na podávanie infúzií, napr. i. v. infúzií, namiesto bolusovej injekcie, napr. s. c. bolusovej injekcie. Pri formulácii takejto kompozície je výhodné do fyziologického roztoku pridať ľudský sérový albumín alebo priamo pacientovu vlastnú heparinizovanú krv. Prítomnosť nadbytku fyziologicky inertného proteínu zabraňuje strate protilátky v dôsledku adsorpcie na stenách kontajnera a hadičiek, ktoré sa používajú na infúzny roztok. Pokiaľ sa použije albumín, potom vhodná koncentrácia je 0,5 až 4,5 % (hmotn.) vzhľadom na fyziologický roztok.

Predkladaný vynález je ďalej opísaný pomocou príkladov, ktorých funkcia je ilustratívna, a ktoré sú doplnené nasledujúcimi obrázkami.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je graf, ktorý ukazuje kompetitívnu inhibíciu väzby AAL160 k IL-Ιβ pomocou rozpustného receptora IL-1 typu I a typu II.

SK 288054 Β6

Obrázok 2 je graf, ktorý ukazuje inhibíciu horúčky vyvolanej IL-Ιβ podaním AAL160 na modeli laboratórneho potkana.

Obrázok 3 je graf, ktorý ukazuje trvanie účinku AAL160 na horúčku vyvolanú IL-Ιβ na modeli laboratórneho potkana.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Transgénne myši exprimujúce humánny IgG/K repertoár namiesto vlastného imunoglobulínového repertoáru (Fishwild et al., 1996, Náture Biotechnol., 14, 845 - 851) sa použili na prípravu protilátky proti humánnemu IL-Ιβ. B lymfocyty z týchto myší sa imortalizovali použitím štandardnej hybridómovej technológie a tak sa získali myšie hybridómové bunky secemujúce humánnu IgGll/κ protilátku označenú AAL160.

Príklad 1

Vytvorenie hybridómu a purifikácia protilátky

Geneticky modifikovaná myš 66 (Medarex Inc. Annadale, NJ) sa imunizovala rekombinantným humánnym IL-Ιβ (50 pg) v adjuvans s. c. v niekoľkých miestach. Imunitná reakcia myši sa ďalej zosilnila piatimi ďalšími injekciami, posledná injekcia tri dni pred fúziou. V deň fúzie sa myš 66 usmrtila inhaláciou CO₂ a bunky zo sleziny (4,1 x 10⁷) sa fúzovali rutinným spôsobom použitím PEG 4000 s rovnakým počtom buniek PAI-O myší myelómovej bunkovej línie. Fúzované bunky sa preniesli do 624 jamiek (1 ml/jamka) obsahujúcich podpornú („feeder”) vrstvu myších peritoneálnych buniek (Balb C myší), v médiu RPMI 1640 s HAT, 10 % tepelne inaktivovaným fetálnym teľacím sérom a 5 x 10 ⁵ M β-merkaptoetanolom. Supematanty sa odoberali a testovali pomocou ELISA testu a uskutočnil sa skríning na IL-Ιβ reaktívnu monoklonálnu protilátku. Päť monoklonálnych protilátok podtriedy IgG/κ sa identifikovalo. Klonovanie sa uskutočnilo v 4 x 96 jamkovej mikrotitračnej doštičke, do každej jamky sa prenieslo 0,5 buniek. Po dvoch týždňoch sa jamky kontrolovali inverzným mikroskopom. Supematanty sa odoberali z jamiek s pozitívnym rastom a produkcia monoklonálnej protilátky anti-IL-Ιβ sa vyhodnocovala pomocou ELISA. 1 až 2 litre kondicionovaného supematantu zo štyroch subklonov pôvodne identifikovaného hybridómu #476 sa pripravili a protilátky sa purifikovali pomocou afinitnej chromatografie na kolóne s proteínom A.

Čistota a čiastočná aminokyselinová sekvencia ťažkého a ľahkého reťazca

Aminokyselinové sekvenovanie

Ľahké a ťažké reťazce purifikovanej protilátky AAL160 sa oddelili pomocou SDS-PAGE a aminokoncové aminokyseliny sa stanovili pomocou Edmanovej degradácie. Čistota protilátky použitej v tejto štúdii pomocou sekvenovania bola >90 %. cDNA sekvencie kódujúce variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca sa získali pomocou PCR amplifikácie z cDNA pripravenej z mRNA z klonovaných hybridómových buniek a úplného sekvenovania. Aminokoncové sekvencie variabilných domén ťažkého a ľahkého reťazca a zodpovedajúce DNA sekvencie sú uvedené ďalej, pričom hrubo sú vyznačené úseky CDR.

SEKVENCIA SEQ ID NO:

1

30

60

GAG

GTG

CAG

CTG

GTG

CAG

TCT

GGA

GCA

GAG

GTG

AAA AAG

ccc

GGG

GAG

TCT

CTG

AAG

ATC

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys Lys

Pro

Gly

Glu

Ser

Leu

Lys

íle

10

20

90

CDR1

120

T CC

TGT

AAG

GGT

TCT

GGA

TAC

AGC

TTT

ACC

AGC

TAC TGG

ATC

GGC

TGG

GTG

CGC

CAG

ATG

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Ser

Tyr Trp

íle

Gly

Trp

Val

Arg

Gin

Met

30

40

SK 288054 Β6

ccc Pro

GGG AAA

GGC Gly

150 CTG GAG TGG ATG GGG ATC

CDR2 ATC TAT CCT

180 AGT GAC TCT GAT ACC AGA TAC

Gly

Lys

Leu

Glu Trp

Met

Gly

íle 50

íle

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ser

Asp

Thr Arg Tyr 60

210

240

AGC

CCG

TCC

TTC

CAA

GGC

CAG

GTC

ACC

ATC

TCA

GCC

GAC

AAG

TCC

ATC

AGC

ACC

GCC

TAC

Ser

Pro

ser

Phe

Gin

Gly

Gin

Val

Thr

íle

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

íle

Ser

Thr

Ala

Tyr

70

80

270

300

CTG

CAG

TGG

AGC

CTG

AAG

GCC

TCG

GAC

ACC

GCC

ATG

TAT

TAC

TGT

GCG

AGA

TAT

ACC

Leu

Gin

Trp

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Cys

Ala

Arg

Tyr

Thr

90

ICO

CDR3

330

AAC

TGG

GAT

GCT

TTT

GAT

ATC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACA

ATG

GTC

ACC

GTC

TCT

TCA

Aan

Trp Asp

Ala

Phe

Asp

íle

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Met

val

Thr

Val

Ser

SEKVENCIA SEQ ID NO:

2

30

50

GAA

ATT

GTG

TTG

ACA

CAG

TCT

CCA

GCC

ACC

CTG

TCT

TTG

TCT

CCA

GGG

GAA

AGA

GCC

ACC

Glu

íle

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

10

20

CDR1

90

120

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGT

CAG

AGT

GTT

AGC

TAC

TTA

GCC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

40

150

CDR2

180

GGC

CAG

GCT

CCC

AGG

CTC

CTC ATC

TAT

GAT

GCA TCC

AAC

AGG

GCC

ACT

GGC

ATC

CCA

GCC

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu íle

Tyr

Asp

Ala Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Ala

60

210

240

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

CTT

GAG

cct

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Glu

Pro

70

80

270

CDR3

300

GAA

GAT

TTT

GCA

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CGT

AGC AAC

TGG

ATG

TTC

CCT

TTT

GGC

CAG

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gin

Arg

Ser Asn

Trp

Met

Phe

Pro

Phe

Gly

Gin

90

100

SK 288054 Β6

GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys

DNA sekvencia kódujúca variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia AAL160 sú tiež uvedené v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1 až sekvencia SEQ ID NO: 4.

Konštrukcia expresných vektorov pre ťažký a ľahký reťazec

Klonované sekvencie kódujúce V_L a V_H sa amplifikovali pomocou PCR a vložili prostredníctvom vhodného reštrikčného miesta do kazety vektorov obsahujúcich imunoglobulínový promótor vedúcej sekvencie z RFT2 protilátky (Heinrich et al. (1989) J. Immunol. 143, 3589 - 97), časť J-segmentov a zostrihové donorové miesto. Kazeta ľahkého reťazca obsahujúca celý V_L úsek, promótor a vedúcu sekvenciu na sekréciu sa preniesla do expresného vektora obsahujúceho humánny gén Ck, enhancer ťažkého reťazca imunoglobulínu a modifikovanú myšiu dhfr cDNA na selekciu pomocou metotrexátu (MTX).

Kazeta ťažkého reťazca sa preniesla do expresného vektora, ktorý kóduje humánny gén IgGl, enhancer ťažkého reťazca imunoglobulínu a gén rezistencie na neomycín na selekciu.

Tak ťažký, ako aj ľahký reťazec sú v expresných vektoroch v konfigurácii, ktorá pripomína genómovú konfiguráciu preskupených („rearranged“) imunoglobulínových génov, čo je považované za dôležitý faktor pre vysoký stupeň expresie.

Na produkciu protilátky podľa vynálezu sa opísali vektory kotransfekované do vhodnej hostiteľskej bunkovej línie, napr. bunkovej línie SP2/0, bunky obsahujúce vektorové sekvencie sa selektovali pomocou metotrexátovej selekcie a vyselektované bunkové línie sa kultivovali, aby exprimovali protilátku AAL160. Alternatívne sa môže použiť amplifikačný/selekčný systém založený na GS, aký bol napríklad opísaný v EP 0256055 B, EP 0323997 B alebo európskej patentovej prihláške 89303964.4, keď je selekčný marker dhfr nahradený GS kódujúcou sekvenciou.

Príklad 2

Biochemické a biologické dáta

Zistilo sa, že monoklonálna protilátka AAL160 neutralizuje in vitro aktivitu interleukínu-ΐβ. Monoklonálna protilátka bola ďalej charakterizovaná jej väzbou na rekombinantný humánny ILl-β analýzou Biacore. Spôsob neutralizácie sa hodnotil kompetitívnou väzbovou štúdiou s rozpustnými IL-1 receptormi. Biologická aktivita protilátky AAL160 proti rekombinantne pripravenému a prirodzene tvorenému IL-1 β sa stanovila na primárnych humánnych bunkách (pozri príklad 3), responzívnych na stimuláciu pomocou IL-1 β.

2.1 Stanovenie disociačnej rovnovážnej konštanty

Konštanty rýchlosti asociácie a disociácie väzby rekombinantného humánneho IL-1 β a AAL160 sa stanovili analýzou BIAcore. AAL160 sa imobilizovala a väzba rekombinantného IL-Ιβ v rozmedzí koncentrácií 0,5 až 12 nM sa merala pomocou povrchovej plazmónovej rezonancie. Vybratý formát analýzy umožnil zaobchádzať s väzbovou udalosťou IL-Ιβ na AAL160 podľa 1 : 1 stechiometrie. Analýza dát sa uskutočnila pomocou softvéru „BIAevaluation“.

Asociačná rýchl. konštanta (M 's¹)	(n =15)	(3,91 ±0,14) x 10⁵	Priemer ±str. chyba priemeru
Disociačná rýchl. konštanta (M 's¹)	(n =15)	(1,53 ±0,05) x 10'⁴	Priemer ±str. chyba priemeru
Disociačná rovnovážna Konštanta K_D (M)	(n =15)	(396,6 ±19,5) x 10'¹²	Priemer ±str. chyba priemeru

AAL160 sa viaže na rekombinantný humánny IL-Ιβ s vysokou afinitou.

2.2 Kompetitívna inhibícia väzby k rozpustným IL-1 receptorom

Štúdium kompetície väzby pomocou rozpustných receptorov IL-1 typu I a II

Kompetícia medzi AAL160 a rozpustným humánnym receptorom IL-1 typu I a typu II sa merala opäť pomocou zariadenia Biacore. AAL160 sa imobilizovala na povrchu čipu a rekombinantný humánny IL-Ιβ (8nM) sa injikoval, aby sa viazal na AAL160 za absencie alebo prítomnosti zvyšujúcej sa koncentrácie rekombinantného humánneho rozpustného receptora I (0 až 10 nM) alebo receptora II (0 až 80 nM). Získané výsledky sú ukázané na obrázku 1. Väzba NVP AAL160 NX-1 na IL-Ιβ je kompetitívna tak s receptorom IL-1 typ I ako aj s receptorom typu II.

2.3 Profil reaktivity s humánnym IL-Ια, humánnym IL-1RA a IL-Ιβ z niektorých druhov hlodavcov a primátov

Profily reaktivity AAL160 s humánnym IL-Ια, IL-1RA a IL-Ιβ z myši, laboratórneho potkana, králika a makaka „cynomolgus“ sa analyzovali opäť pomocou zariadenia Biacore. AAL160 sa mobilizovala a skúmané cytokíny sa použili v koncentrácii 8 nM (alebo 20 nM v prípade IL-Ιβ).

	Percento celkovo naviazaného ±stredná chyba priemeru
Humánny IL-Ιβ	100
Humánny IL-la	0,7 ±0,7 (n = 3)
Humánny IL-IRA	1,2 ±1,2 (n = 3)
Myší IL-Ιβ	2,8 ±1,5 (n = 3)
IL-Ιβ lab. potkana	3,0 ±2,5 (n = 3)
IL-Ιβ makaka „cynomolgus“	96,4 ±6,8 (n = 3)
Králičí IL-Ιβ	12,1 ±2,3 (n = 4)

AAL160 skrížené významne nereaguje s humánnym IL-Ιβ, humánnym IL-IRa alebo IL-Ιβ z myši, laboratórneho potkana alebo králika. Reaktivita proti IL-Ιβ z makaka „cynomolgus“ je v podstate zhodná s humánnym cytokínom.

Príklad 3

Neutralizácia od IL-Ιβ závislej produkcie PGE₂ a interleukínu-6 v primárnych humánnych fibroblastoch

Produkcia PGE₂ a IL-6 v primárnych humánnych dermálnych fibroblastoch je závislá od IL-Ιβ. Samotný TNF-α nemôže účinne indukovať zápalové mediátory, ale pôsobí synergicky s IL-1. Primáme dermálne fibroblasty sa používajú ako náhradný model na IL-1-indukovanú bunkovú aktiváciu.

Primáme humánne fibroblasty sa stimulujú rekombinantným IL-Ιβ alebo kondiciovaným médiom získaným z LPS-stimulovaných humánnych PBCM v prítomnosti rôznych koncentrácií protilátky podľa vynálezu alebo IL-IRA v rozsahu 6 až 18 000 pM. Chimerická anti-CD25 protilátka Simulect® (basiliximab) sa používa ako kontrola so zhodným izotypom. Supematant sa odoberá po 16 hodinách stimulácie a testuje sa na prítomnosť IL-6 testom ELISA alebo na prítomnosť PGE₂ testom RIA.

	AAL160 IC₅₀ ±str. chyba (n>3)	IL-1 Ra IC₅o ±str. chyba (n>3)
Sekrécia IL-6 Rekombinantná	0,34 ±0,037 nM	nestanovené
Sekrécia IL-6 Kond. Médium	0,6 ±0,09 nM	0,03 ±0,001 nM
Produkcia PGE₂ Kond. Médium	0,79±0,17nM	nestanovené

Výsledky ukázali, že AAL160 účinne blokuje produkciu IL-6 a PGE₂ v primárnych humánnych dermálnych fibroblastoch s hodnotou IC₅₀ podobnou pre rekombinantný a prírodný IL-Ιβ.

Príklad 4

Účinnosť a trvanie pôsobenia AAL160 in vivo

Účinnosť

In vivo účinnosť anti-huIL-Ιβ protilátky AAL160 sa testovala na modeli laboratórneho potkana, kde sa horúčka indukovala pomocou i. v. injekcie huIL-Ιβ (100 ng/potkan). Protilátka viedla k inhibícii horúčky spôsobom závislým od dávky pri dávkach v rozmedzí 1,3 a 10 pg/kg i. v. (n = 6 potkanov) - pozri tiež obrázok 2. CHI 621 (Simulect®, basiliximab) sa použila ako kontrolná protilátka.

Trvanie účinku

Trvanie účinku AAL160 sa skúmalo na laboratórnych potkanoch, pri ktorých sa pomocou IL-Ιβ indukovala horúčka, nasledujúcim spôsobom: protilátka sa injikovala i. v. buď 24 hodín, alebo 30 minút (štandardný protokol) pred indukciou horúčky pomocou i. v. injekcie humánneho IL-Ιβ a telesná teplota sa merala neskôr za 2 a 4 hodiny. V oboch časoch sa pozorovala približne rovnaká inhibícia horúčky (pozri obrázok 3). Ako sa dalo očakávať, kontrolná protilátka CHI 621 (Simulect®, basiliximab) bola neúčinná v oboch časových bodoch. Toto zistenie ukazuje na to, že humánna protilátka AAL160 je prítomná v potkanovi v aktívnej forme aspoň po 24 hodín a v priebehu tohto času nie je metabolizovaná, vylučovaná ani viazaná na tkanivo.

SK 288054 Β6

Príklad 5

Rôntgenorafické štúdie AAL160 Fab a jeho komplexu s IL-Ιβ

Stanovenie štruktúry AAL160 Fab s rozlíšením 2,0 Á

Súbor dát s rozlíšením 2,0 Á (2,0 x 10’¹⁰ m) veľmi dobrej kvality (R_SYM = 0,051, úplnosť = 99,9 %, redundancia = 8,2) sa získal na kryštáloch Fab pestovaných pomocou difúzie pary v metóde visiacej kvapky, pri pH 9,5 v 50 % PEG 200 a 0,lM CHES. Kryštál bol v priestorovej skupine P2i2[2i s rozmermi jednotkovej bunky a = 62,17 Á, b = 89,83 Á a c = 123,73 Á a jednou Fab molekulou na jednu symetrickú jednotku (Matthewsov koeficient: 3,6 Á³/Da, stanovený obsah rozpúšťadla: 66 %). Štruktúra sa určila pomocou molekulárneho nahradenia a bola zjemnená na konečný kryštalografický R-faktor 0,209 (voľný R-faktor = 0,261). Výsledný model zhŕňa aminokyselinové zvyšky 1 až 213 ľahkého reťazca, 1 až 131 a 138 až 218 ťažkého reťazca, 387 molekúl vody a 1 molekulu PEG. Výsledná elektrónová denzita je dobre definovaná pre všetky zvyšky CDR s výnimkou Trp94 (CDR3) ľahkého reťazca. Poloha postranného reťazca tohto zvyšku je chybne definovaná v dvoch kryštálových formách, ktoré boli doteraz preskúmané, takže je možné predpokladať, že je v neprítomnosti viazaného antigénu vysoko mobilná.

Kryštalizácia Fab komplexu s IL-1 β a predbežný experimentálny model komplexu:

Niekoľko kryštálov AAL160 Fab v komplexe s antigénom IL-Ιβ sa získalo zo zásobného roztoku 1 : 1 komplexu s koncentráciou 76 mg/ml v 2,0 M sírane amónnom, 0,lM Tris, pH 8,5. Kryštály rástli veľmi pomaly počas niekoľkých týždňov. Vykazovali slabú difrakciu približne do 3,2 Á na domácom zdroji. Súbor predbežných dát sa zistil pomocou molekulárneho nahradzovania využitím štruktúry voľného Fab a humánneho IL-Ιβ s vysokým rozlíšením (J. P. Priestle et al., EMBO J. 7, 339 (1988)) ako východiskových modelov. Výpočty poskytli veľmi jasný a nepochybný výsledok, keď sa časti F_v a F_c z Fab použili ako oddelené moduly (korelácia 67,1 %, R-faktor 0,354 po ďalšom aproximačnom kroku AMOREFITTING použitím dát medzi 8,0 Á a 3,5 Á). Následné porovnanie voľnej a viazanej formy Fab ukázalo, že uhol ohybu je pre tieto dve štruktúry veľmi odlišný. Výsledky výpočtov molekulárneho nahradzovania poskytli prvý molekulárny model interakcie medzi antigénom IL-Ιβ a monoklonálnou protilátkou AAL160. Predbežná analýza tejto interakcie ukázala, že (1) IL-Ιβ vstupuje do tesnej interakcie so všetkými tromi CDR ťažkého reťazca a s CDR ľahkého reťazca. Oproti tomu, CDR1 a CDR2 ľahkého reťazca sa zúčastňujú len niekoľko málo interakcií, pokiaľ vôbec a (2) kľučka obsahujúca zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zrelého IL-Ιβ sa viaže v strede antigén-kombinujúceho miesta, zdá sa teda byť kľúčovou zložkou epitopu. Je preto značne zaujímavé, že táto kľučka nie je lokalizovaná v úseku molekuly, ktorá sa najviac odlišuje od myšieho IL-Ιβ. Pro23, Tyr24 a Glu25 sú zachované, ale zvyšok v polohe 22 je Gly v humánnom IL-Ιβ, zatiaľ čo v myšom IL-Ιβ je to Asp. Porovnanie kryštálovej štruktúry humánneho (PDB č. 2ilb) a myšieho IL-Ιβ (PDB č. 8i 1 b) ukazuje, že táto bodová mutácia má za následok veľmi odlišnú konformáciu hlavného reťazca v okolí Pro23. Táto lokálna štruktúrna diferencia je v zhode súhlasná s pozorovaným nedostatkom skríženej reaktivity AAL160 s príslušným myším cytokínom.

ZOZNAM SEKVENCII <110> Novartis AG <120> Protilátky na humánny IL-1 beta <130> 4-31289A <160> 4 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(354) <400> 1 gag gtg cag ctg gtg cag tct

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser

5 tct ctg aag atc tcc tgt aag

Ser Leu Lys íle Ser Cys Lys tgg atc ggc tgg gtg cgc cag Trp íle Gly Trp Val Arg Gin ggg atc atc tat cct agt gac Gly íle íle Tyr Pro Ser Asp

55 caa ggc cag gtc acc atc tca Gin Gly Gin Val Thr íle Ser 65 70 ctg cag tgg agc agc ctg aag Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys gcg aga tat acc aac tgg gat Ala Arg Tyr Thr Asn Trp Asp gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag

Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

15 ggt tct gga tac agc ttt acc agc tac

Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

30 atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg

Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

45 tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc

Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac

Ala Asp Lys Ser íle Ser Thr Ala Tyr

80 gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt

Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

95 get ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca

Ala Phe Asp íle Trp Gly Gin Gly Thr

144

192

240

288

336

100

105

110 atg gtc acc gtc tct tca 354

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210>	2
<211>	118
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	2

SK 288054 Β6

Glu 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

íle 20

Ser

Cys

Lys Gly

Ser 25

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

íle

Gly 35

Trp

Val

Arg

Gin Met 4D

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

íle 50

íle

Tyr

Pro

Ser

Asp Ser 55

Asp

Thr

Arg

Tyr 60

Ser

Pro

Ser

Phe

Gin 65

Gly

Gin

Val

Thr

íle 70

Ser Ala

A3p

Lys

Ser 75

íle

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Leu

Gin

Trp

Ser

Ser 85

Leu

Lys Ala

Ser

Aso so'

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Tyr

Thr 100

Asn

Trp

Asp Ala

Phe 105

Asp

íle

Trp

Gly

Gin 110

Gly

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

115 <2lO> 3 <211> 321 <212> DNA <213p Mus musculus <220>

<221> CDS <222> {1)..(3211 <400> 3 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg

Glu íle Val Leu Thr Gin Ser 1 5 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys tta gcc tgg tac caa cag aaa Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys tat gat gca tcc aac agg gcc Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala

55

Pro	Ala	Thr 10	Leu	Ser	Leu	Ser	Pro 15	Gly
agg	gcc	agt	cag	agt	gtt	age	age	tac
Arg	Ala 25	Ser	Gin	Ser	Val	Ser 30	Ser	Tyr
cct	ggc	cag	get	ccc	agg	ctc	ctc	atc
Pro 40	Gly	Gin	Ala	Pro	Arg 45	Leu	Leu	íle
act	ggc	atc	cca	gcc	agg	ttc	agt	ggc
Thr	Gly	íle	Pro	Ala 60	Arg	Phe	Ser	Gly

144

152

SK 288054 Bó

agc Ser	agc Ser	ctt Leu	gag Glu	cct Pro 80	240
agc	aac	tgg	atg	ttc	2B8
Ser	Asn	Trp	Met 95	Phe

321

agt Ser 65	ggg tct ggg aca gac	ttc act ctc acc atc
Gly Ser Gly Thr	Asp 70	Phe Thr	Leu	Thr	íle 75
gaa	gat ttt gca gtt	tat	tac tgt	cag	cag	cgt

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg

90

cct	ttt	ggc	cag	ggg	acc	aag	ctg	gag	atc	aaa
Pro	Phe	Gly	Gin	Gly	Thr	Lys	Leu	Glu	íle	Lys
			100					105

<210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400 4

Glu

íle

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gin

Arg

Ser

Asn

Trp

Met

Phe

85

90

95

Pro

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

100

105

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Protilátka proti IL-Ιβ, ktorá má antigénmi väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibovať naviazanie IL-Ιβ na jeho receptor, a pričom molekula viažuca IL-Ιβ obsahuje väzbové miesto pre antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H), ktorá obsahuje v sekven10 cii hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, ako sú znázornené v SEQ ID NO: 1, t. j. CDR1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, a pričom molekula viažuca IL-β obsahuje väzbové miesto pre antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulínu (V_L), v ktorej obsahuje

15 v sekvencii hypervariabilné úseky CDR1‘, CDR2‘ aCDR3‘, ako je znázornené na SEQ ID NO: 2, t. j.

SK 288054 Β6

CDR1‘, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, CDR2‘, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a CDR3‘, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro.
2. Molekula viažuca IL-β, podľa nároku 1, ktorá je humánnou protilátkou.
3. Molekula viažuca IL-1 β, podľa niektorého z nárokov 1 - 2 na použitie ako liečivo.
4. Použitie molekuly viažucej IL-1 β podľa niektorého z nárokov 1 - 2 na výrobu liečiva na prevenciu alebo liečenie IL-1 sprostredkovaného ochorenia alebo poruchy zvolených z akútnych a hyperakútnych zápalových reakcií, akútnych infekcií, septického šoku, endotoxického šoku, syndrómu respiračnej poruchy dospelých, meningitídy, pneumónie; a ťažkých popálenín; kachexie alebo syndrómu chradnutia, rakoviny, dysfunkcie orgánov, kachexie súvisiacej s AIDS; alebo na prevenciu alebo liečenie zápalových stavov, alergií a alergických stavov, hypersenzitívnych reakcií, autoimunitných ochorení, silných infekcií, odmietnutia orgánového alebo tkanivového transplantátu, autoimunitného ochorenia, artritídy, reumatoidnej artritídy, artritídy chronica progrediente, artritídy deformans, reumatických ochorení, zápalovej bolesti, hypersenzitivity, hypersenzitivity dýchacích ciest, kožnej hypersenzitivity, alergií, autoimunitných hematologických porúch, hemolytickej anémie, aplastickej anémie, anémie iba červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie, systémového lupus erythematosus, polychondritidy, sklerodermy, Wegenerovej granulomatózy, dermatomyozitídy, chronickej aktívnej hepatitídy, myasténie gravis, psoriázy, Steven-Johnsonov syndrómu, idiopatickej sprue, autoimunitného zápalového ochorenia čriev, ulceratívnej kolitídy, Crohnovho ochorenia, syndrómu dráždivého čreva, endokrinnej oftalmopatie, Gravesovho ochorenia, sarkoidózy, sklerózy multiplex, primárnej biliámej cirhózy, juvenilného diabetes, diabetes mellitus typu I, uveitídy anterior a posterior, suchej keratokonjunktivitídy, jarnej keratokonjunktivitídy, fibrózy pľúcneho interstícia, psoriatickej artritídy a glomerulonefritídy, idiopatického nefrotického syndrómu, nefŕopatie s minimálnymi zmenami, astmy, bronchitídy, pneumokoniózy, emfýzému pľúc, a ďalších obštrukčných alebo zápalových ochorení dýchacích ciest, ochorení metabolizmu kostí, osteoartritídy, osteoporózy, ďalších zápalových artritíd, straty kostnej hmoty všeobecne, straty kostnej hmoty súvisiacej vekom, periodontálneho ochorenia, rakovín a IL-1 dependentných tumorov.
5. Prvý DNA konštrukt kódujúci ťažký reťazec alebo jeho fragment, ktorý obsahuje

i) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo úseky rámca a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú v sekvencii CDR1, CDR2 a CDR3, ktorých aminokyselinové sekvencie sú uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 1; pričom táto prvá časť začína kodónom, ktorý kóduje prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a ii) druhú časť kódujúcu konštantný úsek ťažkého reťazca, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ťažkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti, po ktorom nasleduje stop kodón; a druhý DNA konštrukt kódujúci ľahký reťazec, ktorý obsahuje iii) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo úseky rámca a hypervariabilné úseky; pričom hypervariabilné úseky sú CDR3' a prípadne CDRľ a CDR2', ktorých aminokyselinové sekvencie sú uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 2; pričom táto prvá časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a iv) druhú časť kódujúcu konštantný úsek ľahkého reťazca, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ľahkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti, po ktorom nasleduje stop kodón.
6. Expresný vektor schopný replikácie v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunkovej línii, ktorý obsahuje DNA konštrukty podľa nároku 5.
7. Spôsob prípravy molekuly viažucej IL-Ιβ, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa (i) kultiváciu organizmu, ktorý je transformovaný expresným vektorom podľa nároku 6; a (ii) izoláciu molekuly viažucej IL-1 β z kultúry.
8. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje protilátku proti IL-1 β podľa nároku 1 v kombinácii s farmaceutický prijateľným excipientom, riedidlom alebo nosičom.