CN103328511B - 抗-IL-1β抗体及其使用方法 - Google Patents

抗-IL-1β抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗-IL-1β单克隆抗体及相关的组合物,其可用于治疗炎症及其他疾病的多种治疗方法中的任何一种。

Description

抗-IL-1β抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e),本申请要求申请日为2010年9月10日的美国临时专利申请号61/381,883的优先权,其全部内容通过引用并入本申请。
关于序列表的声明
本申请附带的序列表以文本格式代替纸质副本,其通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称为APEX_011_01WO_ST25.txt。该文本文件于2011年9月9日创建,大小为8KB,通过EFS-Web以电子形式提交。
背景
技术领域
通常地,本发明涉及抗-IL-1β抗体及其组合物和使用方法。更特别地,本发明涉及抗-IL-1β抗体及其制备方法和用途。此类抗体可用于,例如,治疗多种炎性疾病的任何一种的方法中。
相关技术的描述
IL-1基因家族包括细胞因子激动剂IL-1α和IL-1β、天然IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)、以及直接调控IL-1活性的多种不同蛋白。IL-1α和IL-1β均被合成为细胞质前体。虽然IL-1α仍在细胞内,但是能够有效地加工和分泌IL-1β,使其成为治疗性抗体有吸引力的靶点。
IL-1β主要是单核细胞/巨噬细胞在经细菌产物和免疫复合物刺激后产生的细胞因子。此外,IL-1β是炎症应答的重要介质,其涉及多种细胞活动,包括通过NF-kB和c-Jun信号通路的细胞增殖、分化和凋亡。IL-1β激活促炎性细胞因子的释放,如TNF和IL-6,并在细胞适应性应答中诱导Th17偏倚。IL-1β的过度释放与自身免疫和炎症综合征相关,其特征为关节的无菌性炎症、浆膜炎、发热、和皮肤损伤的发作。
A.IL-1β和类风湿性关节炎(RA)
RA是一种关节的慢性炎性疾病,其与软骨和骨破坏相关。除了具有局部破坏性以外,其还具有明显的全身性炎症反应,表现为发热、头痛和疲劳,甚至可能影响其他器官,如皮肤、肝脏、脾脏和淋巴结。
IL-1β是作用于自身免疫过程中的促炎性细胞因子。己在临床前动物模型和人RA患者中确证了促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-1的作用(Dinarello2002)。IL-1β在驱动RA中的关节炎症和破坏中起关键作用。例如,在RA患者中,IL-1β在发炎的滑膜组织,特别是衬里层和衬里下层细胞中过表达。IL-1β在受影响的关节的引流淋巴结中表达增加(Dayer2003)。此外,与正常软骨相比,RA患者软骨中的IL-1βmRNA上调。而且,己发现滑液中IL-1β水平的增加与RA的组织学特性相关。进一步地,IL-1Ra(Anakinra,Amgen)治疗可以改善RA关节的病理变化(Cunnane2001),并延缓关节损伤的进展(Bresnihan2003)。该产品己被批准用于治疗中度至重度类风湿性关节炎患者,这些患者对常规改善病情的抗风湿药物(DMARD)治疗反应不良。向甲氨蝶呤耐药患者给药IL-1β抗体(Canakinumab,Novatis),结果在ACR20评分方面得到了临床改善。
B.IL-1β和糖尿病
1型糖尿病是一种形式的糖尿病,其是由胰腺中胰岛素生产β细胞的自身免疫性破坏引起的。随后的胰岛素缺乏使血糖和尿糖升高。IL-1β是作用于1型糖尿病自身免疫过程中的促炎性细胞因子。例如,IL-1β通过活化转录因子NF-κB抑制β细胞功能和促进Fas触发的β细胞凋亡(Pickersgill2009)。
2型糖尿病是一种代谢疾病,其特征为在胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏背景下的血糖升高。长期血糖升高(高血糖症)通过上调Fas诱导胰腺β细胞凋亡(Maedler2001)。其进一步损伤β细胞的功能,导致糖毒性(Marshak1999)。IL-1β与II型糖尿病的发病机制有关。例如,高葡萄糖水平导致IL-1β的产生和释放增加,从而导致NF-κB活化、Fas上调、DNA断裂,和β细胞功能损伤(Maedler2002)。在2型糖尿病的饮食诱导肥胖模型中,IL-1Ra(Anakinra,Amgen)治疗己显示出通过改善葡萄糖耐受和胰岛素分泌来预防高血糖症(Sauter2008)。
C.IL-1β和痛风
痛风由嘌呤代谢异常引起,并与单钠尿酸盐(MSU)结晶在关节和关节周围组织的沉积有关。类似地,由于未知原因,二羟焦磷酸钙结晶的沉积产生假痛风。IL-1β与痛风相关的支持性证据包括,例如,MSU和二羟焦磷酸钙结晶激活NALP3炎性体,其导致活化的IL-1β的产生(Martinon2006)。此外,在小鼠模型中,阻断IL-1β使MSU-结晶诱导的炎症减轻。而且,对标准抗炎治疗无应答的痛风患者对100mg/日Anakinra的治疗产生良好的应答。最后,在患有非甾体抗炎药难治性痛风性关节炎的患者急性发作时,与曲安奈德相比,IL-1β抗体能够更好的缓解疼痛,并且起效更快(So2007)。
D.IL-1β和隐热蛋白相关周期综合征(CAPS)
CAPS包括一系列严重程度增加的、明显不同的、罕见的、遗传性炎性疾病,包括家族冷自主炎症综合征、穆-韦二氏综合征、和新生儿发病的多系统炎性疾病。这些疾病中的大部分由NALP3/CIAS1基因的NACHT结构域错义突变导致,是IL-1β异常加工和分泌的主要例子。
尽管己知IL-1β与这些和其他疾病状况有关,但是仍迫切需要更有效的人源化单克隆抗体,其可以中和IL-1β活性,并抑制IL-1β下游信号,从而防止产生IL-1β相关的细胞因子,并预防炎性疾病。本发明满足了这些需求,并提供了其他相关的益处。
发明概述
本申请一方面提供了一种分离的抗体,或其抗原结合片段,其与IL-1β结合,包括(i)重链可变区,包括如SEQIDNO:3所示的VHCDR1区、如SEQIDNO:4所示的VHCDR2区、和如SEQIDNO:5所示的VHCDR3区;以及(ii)轻链可变区,包括如SEQIDNO:6所示的VLCDR1区、如SEQIDNO:7所示的VLCDR2区、和如SEQIDNO:8所示的VLCDR3区;或者所述抗体的变体,或其抗原结合片段,其包括与(i)和(ii)所述重链和轻链可变区相同的重链和轻链可变区,但是在所述CDR区有至多8个氨基酸替换。在本申请公开的抗体的一个实施方式中,所述重链可变区包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中,所述轻链可变区包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
本申请另一方面提供了一种分离的抗体,或其抗原结合片段,其与IL-1β结合,包括重链可变区,其包含如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。在该方面的一个实施方式中,所述分离的抗体,或其抗原结合片段,包括轻链可变区,其包含与如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在该方面的又一个实施方式中,所述分离的抗体,或其抗原结合片段,包括轻链可变区,其包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
本申请的又一个方面提供了一种分离的抗体,或其抗原结合片段,其与IL-1β结合,包括轻链可变区,其包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在该方面的一个实施方式中,所述分离的抗体,或其抗原结合片段,包括重链可变区,其包含与如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中,本申请公开的所述分离的抗体是人源化的。示例性的人源化抗体的可变区为如SEQIDNO:9所示的VH区氨基酸序列和如SEQIDNO:10所示的VL区氨基酸序列。
在一个实施方式中,本申请公开的所述分离的抗体可以是单链抗体、ScFv、缺乏铰链区的单价抗体、微抗体、Fab、Fab’片段、或F(ab’)2片段。在一些实施方式中,本申请中的抗体是完整的抗体。
在另一个实施方式中,本申请所述的分离的抗体包括人IgG恒定结构域,例如但不限于,IgG1CH1结构域或IgG1Fc区域。
本申请的又一个实施方式提供了一种分离的抗体,或其抗原结合片段,其与本申请所述的抗-IL-1β抗体竞争结合IL-1β。
在本申请的一个实施方式中,所述分离的抗体,或其抗原结合片段,其与IL-1β结合,结合的KD为0.199nM或更低。
本申请还提供了一种分离的多核苷酸,其编码本申请公开的分离的抗体,或其抗原结合片段。在另一个实施方式中,本申请提供了表达载体,其包含分离的多核苷酸,其编码本申请公开的分离的抗体,或其抗原结合片段,并提供了包含此类载体的分离的宿主细胞。
本申请还提供了组合物,其包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的本申请所述的抗-IL-1β抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方式中,本申请提供了治疗患有与IL-1β表达异常相关疾病的患者的方法,包括给予患者组合物,其包含生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗-IL-1β抗体或其抗原结合片段,从而治疗与IL-1β表达异常相关的疾病。在这一点上,与IL-1β表达异常相关的疾病包括但不限于,类风湿性关节炎、糖尿病、隐热蛋白相关周期综合征、痛风、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化和血管炎。
本发明提供了抗-IL-1β抗体的氨基酸序列,以及编码此抗体的多核苷酸和包含其的组合物。鉴定出编码抗-IL-1β抗体的DNA序列和此抗体的氨基酸序列,可以以较高的收率生产有效的重组抗-IL-1β抗体,用于治疗多种炎性疾病。
因此,根据一些实施方式,本发明提供了一种分离的多肽,其能够与人IL-1β特异性结合,包括选自下组的氨基酸序列:
(a)如图1所示的抗-IL-1β抗体序列;
(b)与如图1所示的抗-IL-1β抗体序列具有至少90%同一性的序列;
(c)如图1所示的抗-IL-1β抗体序列的FR结构域;
(d)如图1所示的抗-IL-1β抗体序列的CDR结构域;以及
(e)由如图1所示的抗-IL-1β抗体序列可变区的至少5个连续的残基组成的序列。
在另一方面,本发明提供了分离的多核苷酸,其编码上文列出和/或本申请所述的多肽,并提供了含有上述多核苷酸的表达载体和宿主细胞。
在一些更特定的实施方式中,本发明提供了一种分离的单克隆抗体,其包括本申请所述的IL-1β抗体序列的至少一部分,如图1所示的IL-1β抗体序列,其中所述的分离的单克隆抗体与IL-1β特异性结合。当然,可以理解本发明的抗体可以是人源化抗体或其结合片段或变体。
在另一个特定实施方式中,本发明提供了一种分离的抗体,其与IL-1β特异性结合,并且至少包括如图1所示的抗-IL-1β抗体序列的CDR区。
在又一个实施方式中,本发明提供了一种分离的单链可变片段抗体,其与IL-1β特异性结合,并且至少包括如图1所示的抗-IL-1β抗体序列的CDR区。
根据本发明的另一方面,其提供了一种治疗IL-1β介导的疾病的方法,包括给予所需对象治疗有效量的本申请所述的IL-1β结合多肽或抗体序列。在一些实施方式中,利用本方法治疗的疾病是炎性疾病或心血管疾病。在一些更特定的实施方式中,疾病选自下组:类风湿性关节炎、糖尿病、痛风、隐热蛋白相关周期综合征、慢性阻塞性肺病和多种心血管疾病,如动脉粥样硬化和血管炎。
附图若干视图的简要说明
图1显示了示例性人源化抗IL-1β抗体的重链和轻链可变区(分别为SEQIDNO:1和2),已标明CDR序列。人源化的重链和轻链可变区序列以粗体表示(分别为SEQIDNO:9和10)。人种系的VH和VL序列分别如SEQIDNO:13和14所示。
图2显示了抗IL-1-β抗体对IL-1-β-诱导的TF-1细胞增殖的剂量依赖性抑制。
图3显示了IL-1-β1-诱导的NF-kB核转位的抑制。
图4显示了人源化Q26抗体对IL-1β刺激的TF-1细胞的剂量依赖性抑制。
图5显示了猴和小鼠IL-1β的交叉反应性结果。
序列的简要说明
SEQIDNO:1是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VH区的氨基酸序列。
SEQIDNO:2是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VL区的氨基酸序列。
SEQIDNO:3是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VHCDR1区的氨基酸序列。
SEQIDNO:4是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VHCDR2区的氨基酸序列。
SEQIDNO:5是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VHCDR3区的氨基酸序列。
SEQIDNO:6是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VLCDR1区的氨基酸序列。
SEQIDNO:7是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VLCDR2区的氨基酸序列。
SEQIDNO:8是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VLCDR3区的氨基酸序列。
SEQIDNO:9是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VH区人源化序列的氨基酸序列。
SEQIDNO:10是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VL区人源化序列的氨基酸序列。
SEQIDNO:11是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VHCDR1区的人源化序列。
SEQIDNO:12是克隆Q26家兔抗IL-1β抗体VLCDR3区的人源化序列。
SEQIDNO:13是用于将Q26家兔抗IL-1β抗体克隆人源化的VH人种系序列。
SEQIDNO:14是用于将Q26家兔抗IL-1β抗体克隆人源化的VL人种系序列。
发明详述
本申请涉及与IL-1β特异性结合的抗体及其抗原结合片段,特别是具有特异性表位专属性和功能性质的抗体。本发明的一个实施方式包括特异性人源化抗体及其片段,其能够与IL-1β结合,阻断IL-1β与IL-1β受体结合,并抑制IL-1β诱导的下游细胞信号和生物学效应。在本发明更特定的实施方式中,本申请所述的抗体高亲和性地与IL-1β特异性结合,并阻断IL-1β与其受体结合。
本发明的实施方式涉及抗IL-1β抗体或其抗原结合片段在诊断、评估和治疗与IL-1β、IL-1β受体或其异常表达相关的疾病和病症中的用途。对象抗体用于治疗或预防炎性和自身免疫性疾病,包括类风湿性关节炎、糖尿病、痛风、隐热蛋白相关周期综合征(CAPS)和慢性阻塞性肺病(COPD)以及其他疾病。
除了有明确的相反说明以外,本发明的方法涉及本领域技术人员公知的常规病毒学、免疫学、微生物学、和分子生物学方法以及DNA重组技术,出于说明目的,在下文中对其中的多数进行描述。在文献中对此类技术进行了详细的解释。参见,例如,CurrentProtocolsinMolecularBiologyorCurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.(2009);Ausubeletal.,ShortProtocolsinMolecularBiology,3rded.,Wiley&Sons,1995;SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual(第3版,2001);Maniatisetal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(1982);DNACloning:APracticalApproach,vol.I&II(D.Glover,ed.);OligonucleotideSynthesis(N.Gait,ed.,1984);NucleicAcidHybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985);TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);AnimalCellCulture(R.Freshney,ed.,1986);Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)和其他类似文献。
如本说明书和所附权利要求中所使用的,除了另有明示以外,单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。
在本说明书中,除了另有要求以外,可以理解词语“包含”,或其变体如“包括”或“含有”是指包括所述的元素或整数,或者元素或整数的组,但不排除任意其他的元素或整数,或者元素或整数的组。
除了另有明示以外,本说明书的各实施方式在细节上做必要的修改可适用于其他各实施方式。
可以将标准技术用于DNA重组、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如,电穿孔,脂质转染)。可以根据生产厂商的说明书、或根据本领域的常规方法、或根据本申请中的描述进行酶反应和纯化技术。通常,可以根据本领域公知的常规方法和根据本说明书中引用和讨论的多种一般和更特定的文献中的描述执行这些以及相关的技术和程序。除了有特别的定义以外,本申请所描述的术语以及实验程序和分子生物学、分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学技术均是本领域公知和常用的那些。可以将标准技术用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学分析、药物制备、制剂、和递送,以及患者治疗。
本发明的实施方式涉及与IL-1β结合的抗体。特别地,本申请所述的抗体以意想不到的高亲和性与IL-1β特异性结合,阻断受体与IL-1β结合,阻断受体活性并具有用于治疗与IL-1β或IL-1β受体异常表达相关疾病的治疗用途。本申请所述的抗体还具有有益性质,如具有抑制多种IL-1β介导的生物学效应(例如,NF-kB和c-Jun信号通路介导的细胞增殖、分化,促炎性细胞因子(如TNF和IL-6)的释放,以及凋亡),和本领域技术人员公知的其他IL-1β-介导的效应的能力。本申请所述的抗体还具有影响IL-1β受体内化的作用。
示例性抗体,或其抗原结合片段或其互补决定区(CDR)的序列如SEQIDNO:1-12所示(亦见图1)。
如本领域公知的,抗体是一种免疫球蛋白分子,其能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个表位识别位点与靶点如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特异性结合。如本申请所使用的,该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体,还包括其片段(如dAb、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然产生的变体、包括与特异性所需的抗原结合片段结合抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、以及包括抗原结合位点和特异性所需片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任意其他修饰构型。“双体”,通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804;P.Holligeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,1993)也是本申请中抗体的特殊形式。包含连接至CH3结构域的scFv的微抗体也包括在本申请中(S.Hu等,CancerRes.,56,3055-3061,1996)。参见,例如Ward,E.S.etal.,Nature341,544-546(1989);Birdetal.,Science,242,423-426,1988;Hustonetal.,PNASUSA,85,5879-5883,1988;PCT/US92/09965;WO94/13804;P.Holligeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,1993;Y.Reiteretal.,NatureBiotech,14,1239-1245,1996;S.Huetal.,CancerRes.,56,3055-3061,1996。
如本申请所使用的,术语“抗原结合片段”指多肽片段,其含有免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR,所述免疫球蛋白与感兴趣的抗原特别是IL-1β结合。在这一点上,本申请所述抗体的抗原结合片段可以含有本申请所示与IL-1β结合抗体VH和VL序列的1、2、3、4、5、或全部6个CDR。本申请所述的IL-1β-特异性抗体的抗原结合片段能够与IL-1β结合。在一些实施方式中,抗原结合片段或包含抗原结合片段的抗体阻止或抑制IL-1β与其受体结合以及随后的信号事件。在一些实施方式中,抗原结合片段与人IL-1β特异性结合,和/或抑制或调节人IL-1β的生物学活性。
术语“抗原”指能够与选择性结合剂(如抗体)结合的分子或分子的一部分,并且还能够将其用于动物来生产能够与该抗原表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。
术语“表位”包括任意决定簇,优选多肽决定簇,其能够与免疫球蛋白或T-细胞受体特异性结合。表位是与抗体结合的抗原区域。在一些实施方式中,表位决定簇包括分子的化学活性表面簇,如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基,以及可能在一些实施方式中具有特异性的三维结构特性,和/或特异性的电荷特性。在一些实施方式中,当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时,将抗体称为与抗原特异性结合。当平衡解离常数≤10-7或10-8M时,将抗体称为与抗原特异性结合。在某些实施方式中,平衡解离常数可以是≤10-9M或≤10-10M。
在一些实施方式中,本申请所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链CDR集合,其分别嵌入重链和轻链框架区(FR)集合之间,框架区对CDR提供支持并决定CDR彼此之间的空间关系。如本申请所使用的,术语“CDR集合”指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N-末端开始,将这些区域分别表示为″CDR1″、″CDR2″、和″CDR3″。因此,抗原结合位点包括六个CDR,其包含位于各重链和轻链V区的CDR。在本申请中将包含单一CDR(例如,CDR1、CDR2或CDR3)的多肽称为“分子识别单位”。对若干抗原-抗体复合物的结晶学分析证明,CDR的氨基酸残基与结合的抗原广泛接触,其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3的接触。因此,分子识别单位主要负责抗原结合位点的特异性。
如本申请所使用的,术语“FR集合”指四个翼侧氨基酸序列,其构成重链或轻链V区的CDR集合中CDR的框架。某些FR残基可以与结合的抗原接触;但是,FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点,特别是那些与CDR直接相邻的FR残基。在FR内,一些氨基残基和一些结构特征是高度保守的。在这一点上,所有V区序列均含有约90个氨基酸残基的内部二硫键环。当V区折叠成结合位点时,CDR展示出为突出的环基序,其形成抗原结合表位。普遍认为,FR的保守结构区将CDR环的折叠形状引导成某些“规范”的结构——不管CDR具有何种精确的氨基酸序列。而且,己知一些FR残基参与非共价的结构域内接触,从而稳定抗体重链和轻链的相互作用。
可以通过参考Kabat,E.A.etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.4thEdition.USDepartmentofHealthandHumanServices.1987以及即时从网上(immuno.bme.nwu.edu)获得的更新版本确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置。
“单克隆抗体”指同质性的抗体群,其中单克隆抗体包括与表位选择性结合有关的氨基酸(天然存在的或非天然存在的)。单克隆抗体具有较高的特异性,其直接针对单一表位。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体,还包括其片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包括抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、以及包括具有所需特异性和与表位结合能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任意其他修饰构型。本申请并非旨在对抗体的来源或其制备方法(例如,杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等等)进行限定。本术语包括上文在“抗体”的定义下所述的完整免疫球蛋白及其片段等。
木瓜蛋白酶优选地裂解IgG分子以产生若干片段,其中(F(ab)片段)的两个均包含含有完整的抗原结合位点的共价异源二聚体。胃蛋白酶能够裂解IgG分子,以提供若干片段,其包括包含两个抗原结合位点的F(ab′)2片段。根据本发明的一些实施方式,可以优选通过蛋白裂解IgM,以及在少数情况下通过裂解IgG或IgA免疫球蛋白分子生产供使用的Fv片段。但是,更通常地使用本领域公知的重组技术制备Fv片段。Fv片段包括非共价的VH::VL异源二聚体,其包含抗原识别位点,这些抗原识别位点保留了天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力。Inbaretal.,(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA69:2659-2662;Hochmanetal.,(1976)Biochem15:2706-2710;和Ehrlichetal.,(1980)Biochem19:4091-4096。
在一些实施方式中,涉及单链Fv或scFV抗体。例如,κ体(Illetal.,Prot.Eng.10:949-57(1997));微抗体(Martinetal.,EMBOJ13:5305-9(1994));双体(Holligeretal.,PNAS90:6444-8(1993));或Janusin抗体(Trauneckeretal.,EMBOJ10:3655-59(1991)和Trauneckeretal.,Int.J.CancerSuppl.7:51-52(1992)),其可以在本申请关于选择具有所需特异性的抗体的教导下采用标准分子生物学技术制备。在又一个实施方式中,可以制备包括本申请所述配体的双特异性或嵌合抗体。例如,嵌合抗体可以包括来自不同抗体的CDR和框架区,而双特异性抗体可以通过一个结合结构域与IL-1β特异性结合,并通过另一个结合结构域与第二个分子结合。可以通过重组分子生物学技术制备这些抗体,或者可以将这些抗体物理偶联在一起。
单链Fv(sFv)多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体,其由融合基因表达,融合基因包括VH-和VL-编码基因,通过编码肽的连接子连接。Hustonetal.,(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA85(16):5879-5883。已有多种方法描述了化学结构的识别方法,用于从抗体V区将天然聚集的(但化学分离的)轻链和重链多肽链转化成sFV分子,使其折叠成基本上与抗原结合位点的结构类似的三维结构。参见,例如美国专利号5,091,513和5,132,405,Hustonetal.;和美国专利号4,946,778,Ladneretal.。
在一些实施方式中,本申请所述的IL-1β结合抗体是双体形式。双体是多肽的多聚体,各多肽均包括包含免疫球蛋白轻链结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链结合区的第二结构域,这两个结构域是连接的(例如,通过肽接头),但彼此间不能结合以形成抗原结合位点:通过使多聚体内的一个多肽的第一结构域与多聚体内的另一个多肽的第二结构域相结合以形成抗原结合位点(WO94/13804)。
抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward,E.S.etal.,Nature341,544-546(1989))。
当使用双特异性抗体时,可以是常规的双特异性抗体,其能够通过多种方法制备(Holliger,P.andWinterG.CurrentOpinionBiotechnol.4,446-449(1993)),例如,化学制备或来自杂交瘤,或可以是上文提及的任意双特异性抗体片段。双体和scFv的构建可以不用Fc区、而仅仅使用可变结构域,这样可以有助于降低抗独特型反应的效应。
相对于双特异性完整抗体而言,双特异性双体还可能特别有用,因为其易于在大肠杆菌中构建和表达。使用噬菌体展示(WO94/13804)能够容易地将具有适宜的结合特异性的双体(和多种其他的多肽如抗体片段)从文库中筛选出来。如果双体的一个臂保持恒定,例如,其对抗原X具有特异性,则可以制备另一臂变化的文库,并选择具有适宜特异性的抗体。可以通过凹凸匹配(knobs-into-holes)技术制备双特异性完整抗体(J.B.B.Ridgewayetal.,ProteinEng.,9,616-621,1996)。
在一些实施方式中,本申请所述的抗体可以是形式。是除去铰链区的IgG4抗体(参见GenMabUtrecht,TheNetherlands;亦可参见,例如US20090226421)。该专利抗体技术能够制备出稳定的、更小的抗体形式,其与目前的小抗体形式相比具有更长的治疗窗。认为IgG4抗体是惰性的,因而其不与免疫系统发生相互作用。可以通过除去抗体的铰链区对完整的人IgG4抗体进行修饰,以获得与相应的完整IgG4(GenMab,Utrecht)相比具有明显稳定性性质的半-分子片段。将IgG4分子一分为二仅在上留下一个可以与同源抗原(例如,疾病靶点)结合的区域,因此仅与靶细胞上的一个位点单价结合。对于某些癌细胞表面抗原而言,该单价结合可能不会刺激癌细胞生长,而在使用具有相同抗原特异性的二价抗体时可能出现这种情况,因此,技术可能为常规抗体难以治疗的某些类型的癌症提供了治疗选择。当治疗某些类型的癌症时,的小尺寸可能非常有益,其使得分子在更大的实体瘤上具有更好的分布,并且可能增加疗效。
在一些实施方式中,本申请的抗体可以是纳米抗体形式。纳米抗体由单基因编码,其可以在几乎所有的原核和真核宿主中有效生产,例如大肠杆菌(参见,例如美国专利号6,765,087)、霉菌(例如曲霉属真菌(Aspergillus)或木霉属真菌(Trichoderma))和酵母(例如酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyvermyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia))(参见,例如美国专利号6,838,254)。生产工艺是可扩展的,己生产出几千克量级的纳米抗体。可以将纳米抗体制成具有较长有效期的即用型溶液。用于生产针对所需靶点的纳米抗体的纳米克隆方法是一种专利方法(参见,例如WO06/079372),其基于B-细胞的自动化高通量筛选。
在一些实施方式中,本申请所述的抗-IL-1β抗体或其抗原结合片段是人源化的。其指一般采用重组技术制备的嵌合分子,具有衍生自非人种属的免疫球蛋白的抗原结合位点,并且该分子的其余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包括融合至恒定结构域的完整的可变结构域,或者仅是移植至可变结构域适宜框架区的CDR。表位结合位点可以是野生型的,或通过一个或多个氨基酸替换修饰。其消除了恒定区对在人个体中的免疫原性,但是仍保留针对外源性可变区产生免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.etal.,(1989)ProcNatlAcadSciUSA86:4220-4224;Queenetal.,PNAS(1988)86:10029-10033;Riechmannetal.,Nature(1988)332:323-327)。将本申请公开的抗-IL-1β抗体人源化的示例性方法包括美国专利号7,462,697中所描述的方法。根据本发明的一些实施方式的示例性人源化抗体包括SEQIDNOs:9、10、19和20中的人源化序列。
另一种方法不仅着重于提供来自于人的恒定区,还着重于修饰可变区,以便对其进行改造使其尽可能的接近于人的形式。己知重链和轻链可变区均含有三个互补决定区(CDR),其对关注的表位的应答有所不同,并决定结合能力。CDR侧接有四个框架区(FR),其在给定的种属中相对保守,并且推测其为CDR提供支架。当针对特定表位制备非人抗体时,可以通过将来自非人抗体的CDR移植到待修饰的人抗体的FR,从而对可变区进行“整形”或“人源化”。Sato,K.etal.,(1993)CancerRes53:851-856己报道了该方法在制备不同抗体中的应用。Riechmann,L.etal.,(1988)Nature332:323-327;Verhoeyen,M.etal.,(1988)Science239:1534-1536;Kettleborough,C.A.etal.,(1991)ProteinEngineering4:773-3783;Maeda,H.etal.,(1991)HumanAntibodiesHybridoma2:124-134;Gorman,S.D.etal.,(1991)ProcNatlAcadSciUSA88:4181-4185;Tempest,P.R.etal.,(1991)Bio/Technology9:266-271;Co,M.S.etal.,(1991)ProcNatlAcadSciUSA88:2869-2873;Carter,P.etal.,(1992)ProcNatlAcadSciUSA89:4285-4289;和Co,M.S.etal.,(1992)JImmunol148:1149-1154。在某些实施方式中,人源化的抗体保留了所有的CDR序列(例如,人源化的小鼠抗体,其含有来自小鼠抗体的全部六个CDR)。在其他实施方式中,人源化抗体含有的一个或多个(一个、两个、三个、四个、五个、六个)CDR与原始抗体相比进行过改造,也将其称为“衍生自”原始抗体一个或多个CDR的一个或多个CDR。
在一些实施方式中,本申请的抗体可以是嵌合抗体。在这一点上,嵌合抗体包含抗-IL-1β抗体的抗原结合片段,其可操作地连接至或融合至不同抗体的异源性Fc部分。在一些实施方式中,异源性Fc结构域是人源的。在其他实施方式中,异源性Fc结构域可以来自母体抗体的不同Ig类型,包括IgA(包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4亚类)、和IgM。在进一步的实施方式中,异源性的Fc结构域可以包括来自一个或多个不同Ig类的CH2和CH3结构域。如上文所述的人源化的抗体,嵌合抗体的抗-IL-1β抗原结合片段可以仅包含一个或多个本申请所述的抗体的CDR(例如,本申请所述抗体的1个、2个、3个、4个、5个、或6个CDR),或可以包括完整的可变结构域(VL、VH或二者)。
在一些实施方式中,IL-1β结合抗体包括本申请所述抗体的一个或多个CDR。在这一点上,在某些例子中己显示,可以仅转移抗体的VHCDR3,同时仍保留所需的特异性结合(Barbasetal.,PNAS(1995)92:2529-2533)。还可参见,McLaneetal.,PNAS(1995)92:5214-5218,Barbas等,J.Am.Chem.Soc.(1994)116:2161-2162。
Marks等(Bio/Technology,1992,10:779-783)描述了抗体可变结构域的储库的生产方法,其中将位于或邻近可变结构域区域5′末端的通用引物与人VH基因第三框架区的通用引物联合使用,以提供缺乏CDR3的VH可变结构域的储库。Marks等进一步描述了该储库是如何与特定抗体的CDR3组合的。使用类似技术,可以利用缺乏CDR3的VH或VL结构域的储库与本申请所述抗体的CDR3衍生的序列重新排列,并将重新排列的完整的VH或VL结构域与同源的VL或VH结构域组合,以提供与IL-1β结合的抗体或其抗原结合片段。然后可以将储库在适宜的宿主系统中展示,如WO92/01047中的噬菌体展示系统,这样可以选择出适宜的抗体或其抗原结合片段。储库可以由至少约104个成员以及若干数量级以上组成,例如,约从106至108或1010或更多成员。Stemmer也公开了类似的重新排列或组合技术(Nature,1994,370:389-391),其描述了该技术与β-内酰胺酶基因之间的关系,但观察到该方法可以用于产生抗体。
亦或通过将一个或多个选定的VH和/或VL基因随机突变以使整个可变结构域内产生突变的方法产生新的VH或VL区,这些VH或VL区携带本发明实施方式中描述的一个或多个CDR衍生的序列。Gram等对此技术进行了描述(1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3576-3580),其使用了易错配PCR。还可以使用另一种方法将VH或VL基因的CDR区直接诱变。Barbas等(1994,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:3809-3813)和Schier等(1996,J.Mol.Biol.263:551-567)公开了此技术。
在一些实施方式中,可以使用本申请所述抗体的特定VH和/或VL筛选互补可变结构域文库,以鉴定具有所需性质的抗体,如对IL-1β亲和性增加的抗体。此类方法己在例如Portolanoetal.,J.Immunol.(1993)150:880-887;Clarksonetal.,Nature(1991)352:624-628中进行了描述。
还可以使用其他方法混合和匹配CDR,以鉴定具有所需结合活性的抗体,如与IL-1β结合的抗体。例如:Klimkaetal.,BritishJournalofCancer(2000)83:252-260,其描述的筛选方法使用小鼠VL和人VH文库,但CDR3和FR4仍然来自小鼠VH。获得抗体后,针对人VL文库对VH进行筛选以获得结合抗原的抗体。Beiboeretal.,J.Mol.Biol.(2000)296:833-849描述了使用完整小鼠重链和人轻链文库的筛选方法。获得抗体后,将一个VL与保留了小鼠CDR3的人VH文库组合。获得了能够与抗原结合的抗体。Raderetal.,PNAS(1998)95:8910-8915描述了一种与上述Beiboer等类似的方法。
这些刚刚所述的技术均是本领域公知的。但是,本领域技术人员将能够使用此类技术,根据本申请所述的本发明的若干实施方式,通过本领域的常规方法获得抗体或其抗原结合片段。
本申请还公开了一种获得对IL-1β抗原具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法,该方法包括通过在本申请所示的VH结构域的氨基酸序列中增加、删除、替换或插入一个或多个氨基酸,形成VH结构域的氨基酸序列变体,任选地将由此得到的VH结构域与一个或多个VL结构域组合,并检测VH结构域或VH/VL的组合以识别特定的结合成员,或对IL-1β具有特异性的抗体抗原结合结构域,且任选地还具有一个或多个所需的性质。VL结构域可以具有基本上如本申请所列出的氨基酸序列。可以使用类似方法将本申请所公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
与抗体或多肽“特异性结合”或“优先结合”(在本申请中可以互换使用)的表位是本领域公知的术语,并且确定此类特异性或优先结合的方法也是本领域公知的。如果与其他细胞或底物相比,所述分子与特定细胞或底物反应或结合时的频率更高、速度更快、持续时间更长和/或亲和性更高,则认为显示出“特异性结合”或“优先结合”。如果与同其他底物结合相比,抗体结合的亲和性、亲合力更高、更容易,和/或持续时间更长,则认为抗体“特异性结合”或“优先结合”至靶点。例如,特异性或优先结合至IL-1β表位的抗体是指,与结合至其他IL-1β表位或非-IL-1β表位相比,与一个IL-1β表位结合的亲和性、亲合力更高、更容易,和/或持续时间更长的抗体。通过阅读该定义还可以理解,例如,与第一个靶点特异性或优先结合的抗体(或部分或表位)可以与或可以不与第二个靶点特异性或优先结合。正因如此,“特异性结合”或“优先结合”不是必然要求排他结合(虽然可以将其包括在内)。通常,但非必然地,提到结合时是指优先结合。
免疫结合通常是指免疫球蛋白分子与对免疫球蛋白具有特异性的抗原之间发生非共价类型的相互作用,例如用于解释而非限制,其为静电、离子、亲水和/或疏水性吸引或排斥、空间力、氢键、范德华力、以及其他相互作用。可以用相互作用的解离常数(Kd)来表述免疫结合相互作用的力、或亲和性,其中Kd越小表示亲和性越高。可以使用本领域公知的方法对选定多肽的免疫结合性质进行定量。一个此类方法涉及测定抗原-结合位点/抗原复合物形成和解离的速率,其中该速率依赖于复合物各部分的浓度、相互作用的亲和性、以及同样影响两个方向速率的几何参数。因此,可以通过计算浓度以及聚合和解离的实际速率确定“开速率常数”(Kon)和“关速率常数”(Koff)。Koff/Kon的比率能够删去与亲和性无关的所有参数,这样其相当于解离常数Kd。参见,一般地,Daviesetal.,(1990)AnnualRev.Biochem.59:439-473。
在一些实施方式中,本申请所述的抗-IL-1β抗体具有的亲和性为约100、150、155、160、170、175、180、185、190、191、192、193、194、195、196、197、198或199皮摩,以及在某些实施方式中,抗体对IL-1β可能具有甚至更高的亲和性。
术语“免疫活性”,当用在具有或“保留免疫活性”的表位中时,指在不同条件下抗体(例如,抗-IL-1β抗体)与表位结合的能力,例如表位经还原或变性条件处理后。
根据本申请的某些优选实施方式,抗体或其抗原结合片段可以是与本申请所述的任意抗体竞争结合的IL-1β,其(i)与抗原特异性结合,并且(ii)包含本申请所公开的VH和/或VL结构域,或包含本申请所公开的VHCDR3、或任意这些的变体。可以容易地在体外对抗体间的竞争进行检测,例如使用ELISA和/或在一个抗体上标记特异性的报告分子,其能够在存在其他非标记抗体时被检测到,以使得能够识别与相同表位或重叠表位结合的特异性抗体。因此,本申请提供了一种特异性抗体或其抗原结合片段,包括人抗体的抗原结合位点,其与本申请所述的抗体竞争结合IL-1β。
在这一点上,如本申请所使用的,术语“与......竞争”、“抑制结合”和“阻止结合”(例如,指抑制/或阻断IL-1β与其受体结合,或指抑制/阻断抗-IL-1β抗体与IL-1β结合)在本申请中可以互换使用,包括部分和完全抑制/阻断。抑制/阻断IL-1β与其受体的结合,可优选地降低或改变当IL-1β结合至其受体、且不存在抑制或阻断时,细胞信号的正常水平或类型。抑制和阻断还旨在包括当与本申请所公开的抗-IL-1β抗体接触时,与配体不接触抗-IL-1β抗体相比,任意可检测的IL-1β与其受体结合的降低,例如阻止受体与IL-1β结合至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%。
与可变区相比,免疫球蛋白恒定区的序列多样性较低,其负责与多种天然蛋白结合以激发重要的生化事件。在人类中,有五种不同类型的抗体,包括IgA(包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4亚类)、和IgM。这些抗体类型之间的区别特征为其恒定区,尽管其V区可能存在细微差别。
抗体的Fc区与多数Fc受体和配体之间发生相互作用,以传递一系列重要的功能性能力,称为效应器功能。对于IgG而言,Fc区包括Ig结构域CH2和CH3,且N-末端铰链与CH2连接。针对IgG类型的Fc受体的重要家族为Fcγ受体(FcγRs)。这些受体介导抗体与免疫系统细胞臂之间的联系(Raghavanetal.,1996,AnnuRevCellDevBiol12:181-220;Ravetchetal.,2001,AnnuRevImmunol19:275-290)。在人类中,该蛋白家族包括FcγRI(CD64),其包括亚型FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc;FcγRII(CD32),其包括亚型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc;以及FcγRIII(CD16),包括亚型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferisetal.,2002,ImmunolLett82:57-65)。典型地,这些受体具有介导结合至Fc的细胞外结构域、跨膜区、和可能介导某些细胞内信号事件的细胞内结构域。这些受体在多种免疫细胞中表达,包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格罕氏细胞、自然杀伤(NK)细胞、和T细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应器细胞募集至结合抗原的位点,典型地导致细胞内的信号事件以及重要的随后免疫应答,如炎性介质释放、B细胞活化、胞吞作用、吞噬作用、和细胞毒攻击。
介导细胞毒性和吞噬性效应器功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体,并且随后导致靶细胞裂解,这种细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavanetal.,1996,AnnuRevCellDevBiol12:181-220;Ghetieetal.,2000,AnnuRevImmunol18:739-766;Ravetchetal.,2001,AnnuRevImmunol19:275-290)。表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体,并且随后导致靶细胞吞噬,这种细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。所有的FcγR结合Fc上的相同区域,在Cg2(CH2)结构域和前面铰链的N-末端。该相互作用在结构上己被很好地鉴定(Sondermannetal.,2001,JMolBiol309:737-749),并且结合至人FcγRIIIb细胞外结构域的人Fc的若干结构己被解析(pdb登记代码1E4K)(Sondermannetal.,2000,Nature406:267-273.)(pdb登记代码1IIS和1IIX)(Radaevetal.,2001,JBiolChem276:16469-16477.)
不同的IgG亚类对FcγR具有不同的亲和性,典型地IgG1和IgG3与受体的结合基本上优于IgG2和IgG4(Jefferisetal.,2002,ImmunolLett82:57-65)。所有的FcγR与IgGFc上的相同区域结合,但是其亲和性不同:高亲和性结合子FcγRI与IgG1的Kd为10-8M-1,而低亲和性受体FcγRII和FcγRIII通常分别在10-6和10-5结合。FcγRIIIa和FcγRIIIb的细胞外结构域具有96%的同一性,而FcγRIIIb不具有细胞内信号结构域。而且,FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa反而是免疫复合物触发活化的正向调节子,其特征为具有细胞内结构域,其具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM),FcγRIIb具有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM),因而其是抑制的。因此,将前者称为激活受体,将FcγRIIb称为抑制受体。受体在不同免疫细胞中的表达类型和水平也不同。还有另一层面的复杂性,即在人蛋白质组中存在多种FcγR的多态性。具有临床意义的特别相关的多态性为V158/F158FcγRIIIa。与F158同种异型相比,人IgG1与V158同种异型的结合亲和性更高。己表明,在亲和性上的这种差异,以及可能地其对ADCC和/或ADCP的影响,是抗-CD20抗体利妥昔单抗(IDECPharmaceuticalsCorporation的注册商标)效能的显著的决定因素。具有V158同种异型的患者对利妥昔单抗治疗的应答有利;然而,具有低亲和性F158同种异型的患者的应答较差(Cartronetal.,2002,Blood99:754-758)。约有10-20%的人是V158/V158纯合的,45%是V158/F158杂合的,以及35-45%的人是F158/F158纯合的(Lehrnbecheretal.,1999,Blood94:4220-4232;Cartronetal.,2002,Blood99:754-758)。因此,80-90%的人是较差的应答者,其具有至少一个F158FcγRIIIa等位基因。
Fc区也与补体级联的活化相关。在经典的补体途径中,C1与其C1q亚基结合至IgG或IgM的Fc片段,其与抗原形成复合物。在本发明的一些实施方式中,对Fc区的修饰作用包括改变(增强或减弱)本申请所述的IL-1β-特异性抗体的能力以活化补体系统的修饰作用(参见,例如美国专利7,740,847)。为评估补体的活化,可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)检测(参见,例如Gazzano-Santoroetal.,J.Immunol.Methods,202:163(1996))。
因此,在一些实施方式中,本发明提供了一种具有修饰的Fc区的抗-IL-1β抗体,其具有改变的功能性质,如CDC、ADCC、或ADCP活性减弱或增强,或对特定的FcγR的结合亲和性增强或血清半衰期增加。本申请中涉及的其他修饰的Fc区己在下述文献中描述,例如己授权的美国专利7,317,091;7,657,380;7,662,925;6,538,124;6,528,624;7,297,775;7,364,731;公开的美国专利申请US2009092599;US20080131435;US20080138344;和公开的国际申请WO2006/105338;WO2004/063351;WO2006/088494;WO2007/024249。
因此,在一些实施方式中,将具有所需结合特异性的抗体可变结构域融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。在一些实施方式中,与Ig重链恒定结构域融合,包括至少部分铰链、CH2、和CH3区。优选在至少一个融合中存在含有轻链结合必须位点的第一重链恒定区(CH1)。在单独的表达载体中插入编码免疫球蛋白重链融合的DNA,以及如有需要的话,免疫球蛋白轻链,并共转染至适宜的宿主细胞。这样能够更灵活地调整三种多肽片段的各自比例,在某些实施方式中,需要在构建中使用比例不相等的三种多肽链以便为所需的双特异性抗体提供理想的收率。然而,当相等比例的至少两种多肽链表达的收率较高,或者当比例对所需链组合的收率不具有显著影响时,将两种或全部三种多肽链的编码序列插入一个表达载体也是有可能的。
还可以对本发明的抗体(及其抗原结合片段和变体)进行修饰以包括表位标签或标记,例如,用于纯化或诊断应用。本领域公知有多种用于制备抗体偶联物的连接基团,包括例如美国专利号5,208,020或EP专利0425235B1,以及Charietal.,CancerResearch52:127-131(1992)中公开的那些。连接基团包括二硫键基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团,如上述的专利所公开的,优选二硫键和硫醚基团。
在另一个实施方式中,本申请所述的IL-1β-特异性抗体可以偶联,或可操作地连接至另一个治疗化合物,在本申请中称为偶联物。偶联物可以是细胞毒剂、化疗剂、细胞因子、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、毒素、放射性同位素、或其他治疗活性剂。化疗剂、细胞因子、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、和上文所述的其他治疗剂、以及所有这些前述的治疗剂均可以用作抗体偶联剂。
在一个替代实施方式中,抗体偶联或可操作地连接至毒素,包括但不限于细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素和酶活性毒素,包括其片段和/或变体。小分子毒素包括但不限于皂素(KurodaKetal.,TheProstate70:1286-1294(2010);Lip,WLetal.,2007MolecularPharmaceutics4:241-251;QuadrosEVetal.,2010MolCancerTher;9(11);3033-40;PolitoLetal.,2009BritishJournalofHaematology,147,710-718)、刺孢霉素、美登素(美国专利号5,208,020)、单端孢霉烯、和CC1065。毒素包括但不限于RNase、白树毒素、烯二炔、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素(PE40)、志贺杆菌毒素、产气荚膜梭状芽胞杆菌毒素、和商陆抗病毒蛋白。
在一个实施方式中,本申请的抗体及其抗原结合片段偶联至一种或多种美登素分子。美登素是通过抑制微管蛋白聚合发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素首次从东非灌木齿叶美登木中分离得到(美国专利号3,896,111)。随后,发现某些微生物也产生美登素,如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物己在如下文献中公开:例如美国专利号4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;和4,371,533。包含美登素的免疫偶联物及其治疗用途己在例如美国专利号5,208,020,5,416,064和欧洲专利EP0425235B1中公开。Liuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)中描述了免疫偶联物,其包含命名为DM1的美登素,DM1连接至针对人结直肠癌的单克隆抗体C242。己发现该偶联物对培养的结肠癌细胞具有较高的细胞毒性,且在体内肿瘤生长检测中显示出抗肿瘤活性。
通过将抗体与美登素分子化学连接制备抗体-美登素偶联物,抗体或美登素分子的生物学活性均未出现显著降低。每个抗体分子偶联平均3-4个美登素分子显示出有效增加靶分子的细胞毒性,且不会对抗体的功能或溶解度带来负面影响,尽管与使用裸抗体相比,预计即使是一分子的毒素/抗体也将会增强细胞毒性。美登素是本领域公知的,其可以通过己知技术合成或从天然来源分离。适宜的美登素己在例如美国专利号5,208,020和上文所述的其他专利和非专利出版物中公开。优选的美登素是美登醇以及在美登醇分子的芳香环或其他位置修饰的美登醇类似物,如不同的美登醇酯。
感兴趣的另一种偶联物包括偶联至一个或多个卡里奇霉素分子的抗体。卡里奇霉素家族的抗生素在皮摩尔以下的浓度下就能够使双链DNA断裂。也可以使用卡里奇霉素的结构类似物(Hinmanetal.,1993,CancerResearch53:3336-3342;Lodeetal.,1998,CancerResearch58:2925-2928)(美国专利号5,714,586;美国专利号5,712,374;美国专利号5,264,586;美国专利号5,773,001)。尾海兔素10类似物,如奥里斯他汀E(auristatinE(AE))和单甲基奥里斯他汀E(MMAE),可以用作本申请公开的抗体或其变体的偶联物(Doroninaetal.,2003,NatBiotechnol21(7):778-84;Franciscoetal.,2003Blood102(4):1458-65)。有用的酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素无结合活性的片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、有丝分裂毒素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。参见例如PCTWO93/21232。本申请进一步涉及这样的实施方式,在这些实施方式中,本申请所述的IL-1β-特异性抗体与具有核溶解活性的化合物,例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶如脱氧核糖核酸酶(DNase),之间形成偶联或融合。
在一个替代实施方式中,本申请公开的抗体可以偶联或可操作地连接至放射性同位素以形成放射性偶联物。可以利用多种具有放射活性的同位素生产放射性偶联物抗体。例子包括但不限于90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At、和212Bi。
在某些其他实施方式中,本申请所述的抗体可以偶联至治疗性基团,如细胞毒素(例如,细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性元素(例如,α-发射体、γ-发射体等)。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任意试剂。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。有个优选的示例性细胞毒素为皂草素(来自AdvancedTargetingSystems,SanDiego,CA)。治疗剂包括但不限于,抗代谢药(例如,甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如,氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如,柔红霉素(曾用名道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如,放线菌素(曾用名更生霉素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如,长春新碱和长春花碱)。
此外,在一些实施方式中,IL-1β-特异性抗体(如本申请所述包括其功能片段,如抗原结合片段)可以偶联至治疗性基团,如放射性材料或大环螯合剂用于偶联放射金属离子。在一些实施方式中,大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸(DOTA),可以通过接头分子将其连接至抗体。此类接头分子是本领域公知的,且在Denardoetal.,1998,ClinCancerRes.4:2483-90;Petersonetal.,1999,Bioconjug.Chem.10:553;和Zimmermanetal.,1999,Nucl.Med.Biol.26:943-50中进行了描述。
在又一个实施方式中,可以将抗体偶联至“受体”(如链霉亲和素)用于在肿瘤中预定位,其中将抗体-受体偶联物给予患者,随后使用清除剂将未结合的偶联物从循环中除去,然后再给予“配体”(例如亲和素),其偶联至细胞毒剂(例如,放射性核苷酸)。在一个替代实施方式中,抗体偶联或可操作地连接至酶,以引入抗体依赖性酶介导的前药治疗(ADEPT)。可以通过将抗体偶联或可操作地连接至前药活化酶来使用ADEPT,前药活化酶可以将前药(例如,肽酰化疗剂,参见PCTWO81/01145)转化为活性抗癌药物。参见,例如PCTWO88/07378和美国专利号4,975,278。用于ADEPT的免疫偶联物的酶成分包括能够以使其转化为活性更高的细胞毒形式的方式作用于前药的任意酶。用于这些方法和相关实施方式的酶包括但不限于,用于将含有磷酸盐的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶;用于将含有硫酸盐的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶;用于将无毒性的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶;蛋白酶,如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L),其用于将含有肽的前药转化为游离药物;D-丙氨酰羧肽酶,其用于转化含有D-氨基酸取代的前药;碳水化合物裂解酶,如半乳糖苷酶和胞嘧啶脱氨酶,其用于将糖基化的前药转化为游离药物;β-内酰胺酶,其用于将β-内酰胺衍生化的药物转化为游离药物;以及青霉素酰胺酶,如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶,其分别用于将胺基上的氮被苯氧乙酰基或苯乙酰基基团衍生化的药物转化为游离药物。或者,可以使用具有酶活性的抗体,在本领域亦称为“抗体酶”,将前药转化为游离的活性药物(参见,例如Massey,1987,Nature328:457-458)。可以制备用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群的抗体-抗体酶偶联物。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备免疫偶联物,如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环己烷-1-羧酸、亚胺基四氢噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基二亚酰胺盐酸盐)、活性酯(如二琥珀酰亚胺辛二酸)、醛(如戊二醛)、双-叠氮基化合物(如双(p-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(p-二重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)、以及双-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特定的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)(Carlssonetal.,Biochem.J.173:723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶硫代)戊酸(SPP)以提供二硫键。接头可以是易于释放一个或多个可裂解组分的“可裂解的接头”。例如,可以使用酸不稳定接头(CancerResearch52:127-131(1992);美国专利号5,208,020)。
本申请还涉及本发明抗体(和多肽)的其他修饰。例如,抗体可以连接至多种非蛋白性聚合物之一,例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。还可以通过例如凝聚技术或通过界面聚合(例如,分别为羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微囊)将抗体包埋于微囊、胶体药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒子和纳米胶囊)、或粗乳。此类技术己在Remington′sPharmaceuticalSciences,第16版,Oslo,A.,Ed.,(1980)中公开。
本申请所使用的“载剂”包括药学上可接受的载剂、赋形剂、或稳定剂,其在所使用的剂量和浓度下,对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒性。通常生理学上可接受的载剂是水性pH缓冲溶液。生理学上可接受载剂的例子包括缓冲液,如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸;低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白,如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白;亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖、和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合剂,如EDTA;糖醇,如甘露醇或山梨醇;成盐的抗衡离子,如钠;和/或非离子表面活性剂,如聚山梨醇酯20(吐温TM)、聚乙二醇(PEG)、和泊洛沙姆(PLURONICSTM)等。
可以采用多种本领域技术人员公知的方法评估抗-IL-1β抗体所需的功能性性质,如亲和性/结合检测(例如,表面等离子体共振,竞争性抑制检测);使用体外或体内模型的炎症或自身免疫应答抑制;对IL-1β应答的细胞毒性检测、细胞活力检测、细胞增殖或分化检测。在一些实施方式中,通过检测例如IL-1β-诱导的TF-1细胞增殖或NF-kB核转位来对本申请所述的抗体进行评估。通过其他检测可以测定本申请所述的抗体阻断正常受体/IL-1β-介导应答的能力,如通过NF-kB和c-Jun通路信号的细胞增殖、分化、凋亡,释放促炎性细胞因子如TNF和IL-6,以及在细胞适应性应答中的Th17偏倚。还可以检测本申请所述的抗体对IL-1β受体内化的作用,体外和体内效能等。可以采用本领域技术人员公知的己建立的方案(参见,例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenePubl.Assoc.Inc.&JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY);CurrentProtocolsinImmunology(Editedby:JohnE.Coligan,AdaM.Kruisbeek,DavidH.Margulies,EthanM.Shevach,WarrenStrober2001JohnWiley&Sons,NY,NY)或商品化的试剂盒进行此类检测。
在一些实施方式中,本发明进一步包括分离的核酸,其编码本申请所述的抗体或其抗原结合片段,例如编码本申请所述的CDR或VH或VL结构域的核酸。核酸包括DNA和RNA。如本申请所述的这些和相关实施方式可以包括多核苷酸,其编码与IL-1β结合的抗体。如本申请所使用的,术语“分离的多核苷酸”指基因组、cDNA、或合成来源的多核苷酸或其组合,凭借其来源分离的多核苷酸(1)与在自然界中发现的分离的多核苷酸中的全部或部分多核苷酸无关,(2)连接至在自然界中并不与之连接的多核苷酸,或(3)在自然界中并未作为更长序列的一部分存在。
术语“可操作地连接”指应用该术语的组分所处的关系,即允许其在适宜条件下实施其固有功能。例如,转录控制序列“可操作地连接”至蛋白编码序列,这样在与控制序列的转录活性兼容的条件下实现蛋白编码序列的表达。
如本申请所使用的,术语“控制序列”指能够影响与之连接或可操作地连接的编码序列表达、加工或细胞内定位的多核苷酸序列。这样的控制序列的性质可能取决于宿主生物体。在特定实施方式中,原核生物的转录控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点、和转录终止序列。在其他特定实施方式中,真核生物的转录控制序列可以包括包含一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列、转录终止序列和多聚腺苷酸化序列。在一些实施方式中,“控制序列”可以包括前导序列和/或融合伴侣序列。
如本申请所使用的,术语“多核苷酸”指单链或双链核酸聚合物。在一些实施方式中,包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者这两种核苷酸类型之一的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰如溴尿核苷,核糖修饰如阿糖胞苷和2′,3′-二脱氧核糖以及核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、缩苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、缩苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。术语“多核苷酸”特别地包括单链和双链形式的DNA。
术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包括糖基等被修饰或取代的核苷酸。术语“寡核苷酸键”包括例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、缩苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、缩苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)、氨基磷酸酯等寡核苷酸键。参见,例如LaPlancheetal.,1986,Nucl.AcidsRes.,14:9081;Stecetal.,1984,J.Am.Chem.Soc.,106:6077;Steinetal.,1988,Nucl.AcidsRes.,16:3209;Zonetal.,1991,Anti-CancerDrugDesign,6:539;Zonetal.,1991,OLIGONUCLEOTIDESANDANALOGUES:APRACTICALAPPROACH,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.),OxfordUniversityPress,OxfordEngland;Stecetal.,美国专利号5,151,510;UhlmannandPeyman,1990,ChemicalReviews,90:543,出于任何目的公开的内容在此通过引用并入。寡核苷酸可以包括能够检测寡核苷酸或其杂交的可检测标记。
使用的术语“载体”指用于将编码信息转移至宿主细胞的任意分子(例如,核酸、质粒、或病毒)。术语“表达载体”指适宜宿主细胞的转化并且含有指引和/或控制插入异源核酸序列表达的核酸序列的载体。表达包括但不限于,方法如转录、翻译、和RNA剪接,如果存在内含子。
本领域技术人员应当理解,多核苷酸可以包括表达或可能适于表达蛋白、多肽、肽等的基因组序列、额外的基因组和质粒编码序列以及较小的设计基因片段。此类片段可以是天然分离的,或由本领域技术人员合成修饰的。
本领域技术人员还知晓,多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的,并可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包括HnRNA分子,其含有内含子且以一一对应的方式对应于DNA分子,以及不含内含子的mRNA分子。本申请的多核苷酸中可以含有,但不是必须含有,附加的编码或非编码序列,以及多核苷酸可以,但不是必须,连接至其他分子和/或支持材料。多核苷酸可以包括天然序列,或可以包括编码此类序列的变体或衍生物的序列。
因此,根据这些和相关的实施方式,本申请还提供了编码本申请所述的抗-IL-1β抗体的多核苷酸。在一些实施方式中,所提供的多核苷酸包括编码本申请所述的抗体和此类多核苷酸补体的某些或全部多核苷酸序列。
在其他相关实施方式中,多核苷酸变体可能与编码本申请所述的抗-IL-1β抗体的多核苷酸序列基本上具有同一性。例如,使用本申请所述的方法(例如,使用标准参数的BLAST分析,如下文所述),与参比多核苷酸序列如编码本申请所述抗体的序列相比,多核苷酸可以是包含至少70%序列同一性,优选至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性的多核苷酸。本领域技术人员将认识到,考虑到密码子的简并性、氨基酸的相似性、阅读框架位置等,可以对这些值进行适当调整,以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白相应的同一性。
通常,多核苷酸变体将含有一个或多个替换、添加、删除和/或插入,优选地变体多核苷酸编码的抗体的结合亲和性基本上不低于本申请所示的特定多核苷酸序列编码的抗体。
在一些其他相关实施方式中,多核苷酸片段可以包含或基本上由不同长度连续的序列组成,所述序列与本申请所述的编码抗体的序列相同或互补。例如,所提供的多核苷酸包含或基本上由至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500或1000个或更多连续的核苷酸序列组成,所述序列编码本申请所公开的抗体或其抗原结合片段以及其间的所有中间长度。容易理解,“中间长度”在本申请中指所述值之间的任意长度,如50、51、52、53等;100、101、102、103等;150、151、152、153等;包括200-500、500-1,000等之间的所有整数。可以在一个或两个末端通过加入天然序列中不存在的核苷酸对本申请所述的核苷酸序列延长。该附加序列可能由编码本申请所述抗体的多核苷酸一个末端或编码本申请所述抗体多核苷酸两个末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个核苷酸组成。
在另一个实施方式中,所提供的多核苷酸序列能够在中度至高度严格条件下与本申请提供的编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列、或其片段、或其互补序列杂交。杂交技术是分子生物学领域所公知的。出于说明的目的,用于检测本申请所提供的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的适宜中度严格条件包括,在5XSSC、0.5%SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)溶液中预洗;在50℃-60℃、5XSSC杂交过夜;随后使用含0.1%SDS的2X、0.5X和0.2XSSC,在65℃下洗涤两次,每次20分钟。本领域技术人员将理解,杂交的严格性可以很容易地操作,如通过改变杂交溶液的盐含量和/或杂交进行的温度。例如,在另一个实施方式中,适宜的高度严格杂交条件包括上文所描述的那些条件,但是杂交温度增至例如60℃-65℃或65℃-70℃。
在一些实施方式中,上文所描述的多核苷酸,例如多核苷酸变体、片段和杂交序列,编码结合IL-1β的抗体或其抗原结合片段。在其他实施方式中,此类多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段,或其CDR,其与IL-1β的结合能力与本申请所示特定的抗体序列至少约50%、至少约70%,和在一些实施方式中,至少约90%相同。在进一步的实施方式中,此类多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段或其CDR结合至IL-1β的亲和性高于本申请所示的抗体,例如其结合力在数量上是本申请所示特定的抗体序列的至少约105%、106%、107%、108%、109%、或110%。
如本申请其他地方描述的,可以通过常规方法,例如用选定的天然或非天然氨基酸替换、添加、删除或插入一种或多种氨基酸,制得示例多肽(例如,如本申请所提供的变体IL-1β-特异性抗体,如具有本申请所提供的抗原结合片段的抗体蛋白),其三维结构可以通过计算机模拟进行测定,以确定这样衍生的结构变体保留了在此公开的种类的空间填充性质。本领域技术人员公知有多种计算机程序,可用于确定在抗体内适宜的氨基酸取代(或编码氨基酸序列的适宜多核苷酸),从而例如维持亲和性或获得更好的亲和性。
本申请所描述的多核苷酸,或其片段,无论其编码序列自身的长度如何,均可以与其他DNA序列组合,如启动子、多腺苷酸化信号、附加限制性酶位点、多克隆位点、其他编码片段等等,这样其全长可能有很大变化。因此,预计可以采用几乎任意长度的核酸片段,优选将其总长度限制在易于在计划的重组DNA方案中制备和使用。例如,预计使用的示例性多核苷酸片段的总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有中间长度)。
当对多核苷酸序列进行比较时,当两个序列按下文所述进行比对以达到最大对应时,如果核苷酸序列相同,则将两个序列称为是“同一的”。一般通过在比较窗口内比较序列,以识别和比较序列的局部区域的相似性,从而进行两个序列之间的比较。如本申请所使用,“比较窗口”指至少约20个连续位置的片段,通常为30至约75、40至约50,在这个片段中,在两个序列优化比对后,将一个序列与具有相同数量连续位置的参比序列进行比较。
可以使用Lasergene生物信息学软件套装(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中的Megalign程序,采用默认参数进行用于比较的序列优化比对。该程序体现了下述参考文献中描述的几个比对方案:Dayhoff,M.O.(1978)Amodelofevolutionarychangeinproteins-Matricesfordetectingdistantrelationships.InDayhoff,M.O.(ed.)AtlasofProteinSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonDCVol.5,Suppl.3,pp.345-358;HeinJ.,UnifiedApproachtoAlignmentandPhylogenes,pp.626-645(1990);MethodsinEnzymologyvol.183,AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA;Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,CABIOS5:151-153(1989);Myers,E.W.和MullerW.,CABIOS4:11-17(1988);Robinson,E.D.,Comb.Theor11:105(1971);Santou,N.Nes,M.,Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987);Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,NumericalTaxonomy-thePrinciplesandPracticeofNumericalTaxonomy,FreemanPress,SanFrancisco,CA(1973);Wilbur,W.J.andLipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA80:726-730(1983)。
或者,可以通过SmithandWaterman,Add.APL.Math2:482(1981)的局部同一性算法、通过NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性比对算法、通过PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性方法探索、通过这些算法(威斯康辛遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA,GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr.,Madison,WI)的计算机执行、或通过检视进行用于比较的序列优化比对。
适于确定序列同一性和序列相似性百分率的算法的一个优选的例子为BLAST和BLAST2.0算法,己分别在Altschuletal.,Nucl.AcidsRes.25:3389-3402(1977),和Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中对其进行了描述。BLAST和BLAST2.0可以使用例如本申请所描述的参数,以确定两个或多个多核苷酸之间的序列同一性百分率。美国国家生物技术信息中心公开提供了用于进行BLAST分析的软件。在一个说明性的例子中,可以使用参数M(匹配残基对的奖励分数;始终>0)和N(错配残基的罚分;始终<0)计算核苷酸序列的累积得分。在下列情况下停止在各方向上对字码采样的延伸:累积比对得分从其达到的最大值下降数量X;由于一个或多个负分残基比对的累积,使累积得分达到零或以下;或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的缺省值为:字长(W)11,和期望(E)10,以及BLOSUM62评分矩阵(参见HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))算法(B)50,期望(E)10,M=5,N=-4和对两条链进行比较。
在一些实施方式中,通过在至少20个位置的比较窗内对两个优化比对的序列进行比较,以确定“序列同一性百分率”,其中为达到两个序列的优化比对,多核苷酸序列在比较窗中的部分与参比序列(不包含添加或删除)相比,可以包括20%或以下的添加或删除(即,间隙),通常5至15%,或10至12%。所述百分率如下计算,确定在两个序列中均出现相同核酸的位置数,得到匹配的位置数,将匹配位置数除以在参比序列中的总位置数(即,窗尺寸),并将得到的结果乘以100,从而得到序列同一性百分率。
本领域的普通技术人员将理解,由于遗传密码简并性,有多个编码本申请所述抗体的核苷酸序列。这些多核苷酸中的某些与编码结合IL-1β的抗体的天然或原始多核苷酸序列具有最小的序列同一性。尽管如此,因使用不同密码子导致的多核苷酸改变是本公开可以明确预期的。在一些实施方式中,特别关注了己经过密码子优化的用于哺乳动物表达的序列。
因此,在本发明的另一个实施方式中,可以使用诱变方法如位点特异性诱变制备本申请所述抗体的变体和/或衍生物。通过该方法,可以通过对编码其的多核苷酸诱变,以制备在多肽序列中的特异性修饰。这些技术提供了制备和检测序列变体的直接方法,例如通过在多核苷酸中引入一个或多个核苷酸序列的改变,从而引入一个或多个前述考虑因素。
位点特异性诱变通过使用编码所需突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列,以及足够数量的邻近核苷酸,以提供具有足够大小和序列复杂性的引物序列,以便越过被删除的接点在其两侧形成稳定双螺旋,从而产生突变体。可以在选定的多核苷酸序列中引入突变,以使多核苷酸本身改善、改变、减少、修饰或改变其性质,和/或改变编码的多肽的性质、活性、组分、稳定性、或主要序列。
在一些实施方式中,发明人关注了编码本申请公开的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的诱变,以改变所编码的多肽的一种或多种性质,如抗体或其抗原结合片段的结合亲和性,或特定Fc区的功能,或针对特定FcγR的Fc区的亲和性。位点特异性诱变技术是本领域公知的,己广泛用于产生多肽和多核苷酸的变体。例如,位点特异性诱变经常用于改变DNA分子的特定部分。在此类实施方式中,一般使用含有约14至约25个核苷酸或其左右的长度的引物,在被改变序列的接点处的两侧具有约5至约10个残基。
本领域技术人员将理解,位点特异性诱变技术经常采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。在位点定向诱变中使用的典型载体包括如M13噬菌体的载体。这些噬菌体易于购买获得,并且其使用是本领域技术人员所公知的。双链噬菌体也常规地用于位点定向诱变,其减少了将感兴趣的基因从质粒转移至噬菌体的步骤。
在通常情况下,按照本申请进行的位点定向诱变通过首先获得单链载体或两条链熔化分开的双链载体进行,所述载体的序列包括编码所需肽的DNA序列。一般通过合成制备产生具有所需突变序列的寡核苷酸引物。然后用单链载体对该引物进行退火,并加入DNA聚合酶如大肠杆菌聚合酶IKlenow片段,以完成突变链的合成。因此,形成异源双链,其中一条链编码原始非突变的序列,另一条链带有所需突变。然后使用该异源双链载体转化适宜细胞,如大肠杆菌细胞,并选择包括携带突变序列排布的重组载体的克隆。
使用位点定向突变制备选定肽编码DNA片段的序列变体提供了一种生产可能有用的种类的方法,但并不意味着限制,因为还有其他方法可以获得肽序列变体和编码其的DNA序列。例如,可以使用诱变剂,如羟胺,处理编码所需肽序列的重组载体以获得序列变体。关于这些方法和方案的具体细节参见Maloyetal.,1994;Segal,1976;ProkopandBajpai,1991;Kuby,1994;以及Maniatisetal.,1982的教导,其均通过引用并入本申请,用于该目的。
如本申请所使用的,术语“寡核苷酸定向诱变操作”指模板依赖性过程和载体介导的繁殖,其导致特定核酸分子的浓度相对于其初始浓度增加,或可检测信号的浓度增加,如扩增。如本申请所使用的,术语“寡核苷酸定向诱变操作”是用来指涉及引物分子的模板依赖性延伸的过程。术语模板依赖性过程指RNA或DNA分子的核酸合成,其中新合成核酸链的序列是由公知的碱基互补配对规则决定的(参见,例如Watson,1987)。通常,载体介导的方法涉及将核酸片段引入DNA或RNA载体、载体的克隆扩增、和扩增核酸片段的恢复。这种方法的例子参见美国专利号4,237,224,其全部内容通过引用特别地并入本申请。
在用于生产多肽变体的另一种方法中,可以采用如美国专利号5,837,458中所描述的递归序列重组。在该方法中,进行重组和筛选或选择的迭代循环,以“进化”出例如结合亲和性增加的个体多核苷酸变体。一些实施方式还以质粒、载体、转录或表达盒的形式提供了构建体,其包括至少一个如本申请所述的多核苷酸。
在多个实施方式中,将编码对象单克隆抗体的核酸直接引入宿主细胞,并在足以诱导编码抗体表达的条件下孵育所述细胞。结合本申请所提供的多肽和核酸序列,使用本领域技术人员公知的标准技术制备本申请的抗体。可以使用多肽序列确定编码所公开的特定抗体的适宜核酸序列。根据本领域技术人员公知的方法,可以对核酸序列进行优化以反映针对不同表达系统的特定密码子“偏好”。
根据一些相关的实施方式,提供了一种重组的宿主细胞,其包括一种或多种本申请所描述的构建体;一种核酸,其编码任意抗体、CDR、VH或VL结构域,或其抗原结合片段;以及编码产物的生产方法,该方法包括从编码的核酸表达。通过在适宜条件下培养含有核酸的重组宿主细胞方便地实现表达。通过表达生产后,可以采用任意适宜的技术分离和/或纯化抗体或其抗原结合片段,然后根据需要使用。
如本申请提供的抗体或其抗原结合片段,以及编码核酸分子和载体,可以是基本上纯净或均质的形式,例如从其自然环境中被分离和/或纯化,或者就核酸而言,不含或基本不含除编码具有所需功能多肽的序列以外来源的核酸或基因。核酸可以包括DNA或RNA,并且可以是全部或部分合成的。除非上下文另有要求,否则本申请所示的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子,并且包括具有特定序列的RNA分子,所述特定序列中U被替换为T。
在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是公知的。适宜的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域用于表达异源性多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞和多种其他细胞。通常优选的细菌宿主是大肠杆菌。
抗体和抗原结合片段在原核细胞如大肠杆菌中的表达己在本领域中成功建立。综述参见,例如Pluckthun,A.Bio/Technology9:545-551(1991)。本领域技术人员也可以利用在培养的真核细胞中的表达作为生产抗体或其抗原结合片段的选择,参见最新综述,例如Ref,M.E.(1993)Curr.OpinionBiotech.4:573-576;TrillJ.J.etal.,(1995)Curr.OpinionBiotech6:553-560。
可以选择或构建含有适当调节序列的适宜载体,包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记物基因和其他适当的序列。载体可以是质粒、病毒例如噬菌体、或嗜菌粒,视情况而定。有关进一步的详细情况,参见例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:2ndedition,Sambrooketal.,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress。针对核酸的操作有多种己知的技术和方法,例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因的表达、以及蛋白分析,其在CurrentProtocolsinMolecularBiology,第二版,Ausubel等编著,JohnWiley&Sons,1992,或随后的更新版中对其进行了详细的描述。
术语“宿主细胞”用于指被引入,或能够引入编码本申请所述的一种或多种抗体的核酸序列的细胞,并且其进一步表达或能够表达感兴趣的选定基因,如编码任意本申请所述抗体的基因。该术语包括亲代细胞的子代,无论其在形态学或遗传组成上是否与亲代相同,只要存在选定基因即可。因此,还涉及一种包括将此类核酸引入宿主细胞的方法。该引入可以使用任何可用的技术。对于真核细胞而言,适宜的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用逆转录病毒或其他病毒的转导,例如牛痘,对于昆虫细胞,使用杆状病毒。对于细菌细胞而言,适宜的技术包括氯化钙转染、电穿孔和使用细菌噬菌体的转染。例如通过在使基因表达的条件下培养宿主细胞,在引入之后引起或允许核酸的表达。在一个实施方式中,将核酸整合至宿主细胞的基因组(例如,染色体)。按照标准技术,通过包含促进与基因组重组的序列可以促进整合。
在一些实施方式中,本发明还提供了一种方法,其包括在表达系统中使用上文所述的构建体以表达特定多肽,如本申请所描述的IL-1β-特异性抗体。术语“转导”用于指将基因从一个细菌中传递至另一个,通常使用噬菌体。“转导”也指通过逆转录病毒获得和转移真核细胞序列。术语“转染”用于指细胞携带外来的或外源性DNA,当外源性DNA被引入细胞膜内时,细胞被“转染”。多种转染技术均是本领域所公知的,并且在本申请中公开。参见例如,Grahametal.,1973,Virology52:456;Sambrooketal.,2001,MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratories;Davisetal.,1986,BASICMETHODS1NMOLECULARBIOLOGY,Elsevier;和Chuetal.,1981,Gene13:197。可以使用此类技术将一种或多种外源性的DNA部分引入适宜的宿主细胞。
如本申请所使用的,术语“转化”指细胞遗传特性的改变,当其被修饰以含有新的DNA时细胞被转化。例如,当从其天然状态被遗传修饰后,细胞被转化。转染或转导后,转化DNA可以通过物理地整合至细胞的染色体与细胞重组,或者可以作为不复制的附加体元件瞬时保持,或者可以作为质粒独立地复制。当DNA随着细胞的分裂而复制时,则认为细胞己被稳定转化。当术语“天然存在的”或“天然的”与生物学材料如核酸分子、多肽、宿主细胞等联用时,指在自然界中发现且未经过人为处理的材料。类似地,如本申请所使用的“非天然存在的”或“非天然的”指在自然界中不存在或己被人为地进行结构修饰或合成的材料。
术语“多肽”、“蛋白”、“肽”和“糖蛋白”可以互换使用,指并不限定任何特定长度的氨基酸的聚合物。该术语并未排除修饰,如十四烷基化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信号序列的添加或删除。术语“多肽”或“蛋白”指一条或多条氨基酸链,其中每条链均包含通过肽键共价连接的氨基酸,并且其中所述多肽或蛋白可以包括非共价和/或通过肽键共价连接在一起的多条链,具有天然蛋白的序列,即蛋白是通过天然存在的且特别是非重组的细胞生产的,或通过遗传工程化或重组的细胞生产的序列,并且包括具有天然蛋白氨基酸序列的分子,或者天然序列的一个或多个氨基酸被删除、添加和/或替换的分子。术语“多肽”和“蛋白”特别地包括本申请的与IL-1β结合的抗体,或抗IL-1β抗体的一个或多个氨基酸被删除、添加、和/或替换的序列。因此,“多肽”或“蛋白”可以包括一条(称为“单体”)或多条(称为“多聚体”)氨基酸链。
术语“分离的蛋白”在本申请中指对象蛋白(1)不含至少某些在自然界中常见的其他蛋白,(2)基本不含其他来自相同来源的蛋白,例如来自相同物种,(3)被来自不同物种的细胞表达,(4)己从至少约50%的多核苷酸、脂质、碳水化合物、或在自然界与其相关的其他材料中分离,(5)与同“分离的蛋白”在自然界相关联的蛋白的部分不相关联(通过共价或非共价相关作用),(6)与在自然界同其不相关联的多肽可操作地相关联(通过共价或非共价相关作用),或者(7)在自然界中不存在。此类分离的蛋白可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA编码,可以是合成来源的,或其任意组合。在一些实施方式中,分离的蛋白基本上不含存在于自然环境中干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其他用途)的蛋白或多肽或其他污染物。
术语“多肽片段”指多肽,可以是单体或多聚体,其具有天然存在的或重组生产的多肽的氨基末端删除、羧基末端删除、和/或内部删除或替换。在一些实施方式中,多肽片段可以包括至少5至约500个氨基酸长度的氨基酸链。将理解在一些实施方式中,片段为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、或450个氨基酸长度。特别有用的多肽片段包括功能性结构域,包括抗体的抗原结合结构域或片段。在抗-IL-1β抗体中,有用的片段包括,但不限于:CDR区,特别是重链或轻链的CDR3区;重链或轻链的可变区;抗体链的一部分或仅仅是其包括两个CDR的可变区;等等(参见,例如图1和序列表中提供的序列)。
多肽可以包含位于蛋白N-末端的信号(或前导)序列,其为共翻译或翻译后蛋白的转移定向。多肽还可以融合于框架或与接头或其他序列偶联,以使多肽(例如,聚-His)易于合成、纯化或鉴定,或者增强多肽与固体支持物的结合。
如有必要,还可以引入肽接头/间隔区序列以通过足够的距离分隔多种多肽组分,以确保将各多肽折叠成其二级和/或三级结构。使用本领域公知的标准技术,可以将此类肽接头序列整合至融合多肽。
可以基于例如下述标准选择一些肽间隔区序列:(1)其能够采用柔性伸展构象;(2)其不能采用能够与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构;和/或(3)缺乏可能与多肽功能性表位反应的疏水性或带电荷的残基。
在一个说明性实施方式中,肽间隔区序列含有例如Gly、Asn和Ser残基。也可以将其他近似的中性氨基酸如Thr和Ala包括在间隔区序列中。
可以将可能有用的其他氨基酸序列引入作为间隔区,包括那些在Marateaetal.,Gene40:3946(1985);Murphyetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:82588262(1986);美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中描述的氨基酸序列。
其他示例性的间隔区可以包括,例如Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(Chaudharyetal.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(Birdetal.,1988,Science242:423-426)。
在某些实施方式中,当第一和第二多肽具有能够用于分隔功能性结构域和阻止立体干扰的非必需的N-末端氨基酸区域时,不需要间隔区序列。可以将两个编码序列直接融合,不需要任何间隔区,或通过使用例如由五聚体Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复1至3次组成的柔性聚合接头。通过将此类间隔区插入VH和VL之间构建单链抗体(scFv)(Birdetal.,1988,Science242:423-426;Hustonetal.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5979-5883)。
在一些实施方式中,设计肽间隔区以便能够在形成单链抗体可变区的两个β片层之间发生正确的相互作用。
在一些示例性的实施方式中,肽间隔区在1至5个氨基酸之间、在5至10个氨基酸之间、在5至25个氨基酸之间、在5至50个氨基酸之间、在10至25个氨基酸之间、在10至50个氨基酸之间、在10至100个氨基酸之间,或者氨基酸的任意插入范围。
在其他示例性的实施方式中,肽间隔区的长度包括约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸。
涉及本申请所描述抗体的氨基酸序列的修饰。例如,其可能是改善抗体的结合亲和性和/或其他生物学性质所需的。例如,可以通过将适宜的核苷酸改变引入编码抗体、或其链的多核苷酸,或通过肽合成制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括,例如在抗体的氨基酸序列内删除、和/或插入和/或替换残基。在最终的抗体中可以引入删除、插入、和替换的任意组合,只要最终的构建体具有所需特性(例如,与IL-1β的高结合亲和性)。氨基酸改变还可以改变抗体的翻译后过程,如改变糖基化位点的数量或位置。上文所描述的针对本发明多肽的任意变体和修饰均可以包括在本发明的抗体中。
本申请提供了本申请的抗体的变体。在一些实施方式中,此类变体抗体或抗原结合片段,或其CDR结合至IL-1β至少约50%、至少约70%,以及在一些实施方式中,至少约90%以及与本申请所示特定的抗体序列相同。在进一步的实施方式中,此类抗体变体或其抗原结合片段,或其CDR,与本申请所示的抗体相比,其以更高的亲和性结合至IL-1β,例如在数量上结合至少约105%、106%、107%、108%、109%、或110%以及与本申请所示特定的抗体序列相同。
在特定实施方式中,对象抗体可以具有:a)重链可变区,其具有的氨基酸序列与本申请所描述的抗-IL-1β抗体的重链可变区具有至少80%的同一性、至少95%的同一性、至少90%、至少95%或者至少98%或99%的同一性;和b)轻链可变区,其具有的氨基酸序列与本申请所描述的抗-IL-1β抗体的轻链可变区具有至少80%的同一性、至少85%、至少90%、至少95%或者至少98%或99%的同一性。示例性重链和轻链区的氨基酸序列如SEQIDNO:1-12所示。
在特定实施方式中,抗体可以包括:a)重链可变区,其包含:i.CDR1区,其与本申请所描述的选定抗体的重链CDR1区的氨基酸序列具有同一性;ii.CDR2区,其与选定抗体的重链CDR2区的氨基酸序列具有同一性;和iii.CDR3区,其与选定抗体的重链CDR3区的氨基酸序列具有同一性;以及b)轻链可变结构域,其包含:i.CDR1区,其与选定抗体的轻链CDR1区的氨基酸序列具有同一性;ii.CDR2区,其与选定抗体的轻链CDR2区的氨基酸序列具有同一性;和iii.CDR3区,其与选定抗体的轻链CDR3区的氨基酸序列具有同一性;其中抗体与选定靶点(例如,IL-1β)特异性结合。在进一步的实施方式中,抗体或其抗原结合片段是变体抗体,其中变体包含与选定抗体具有同一性的重链和轻链,除了在VH和VL区的CDR区有至多8、9、10、11、12、13、14、15个、或更多的氨基酸替换以外。在这一点上,在选定抗体的CDR区可能有1、2、3、4、5、6、7、8个,或者在一些实施方式中,有9、10、11、12、13、14、15个、或更多的氨基酸替换。替换可以在VH和/或VL区的CDR(参见例如Muller,1998,Structure6:1153-1167)。
可以通过常规方法,例如用选定的天然或非天然氨基酸替换、添加、删除或插入一种或多种氨基酸,制得示例多肽(例如,如本申请所提供的变体IL-1β-特异性抗体,如具有本申请所提供的抗原结合片段的抗体蛋白),其三维结构可以通过计算机模拟进行测定,以确定这样衍生的结构变体保留了在此公开的种类的空间填充性质。参见,例如Donateetal.,1994Prot.Sci.3:2378;Bradleyetal.,Science309:1868-1871(2005);Schueler-Furmanetal.,Science310:638(2005);Dietzetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA103:1244(2006);Dodsonetal.,Nature450:176(2007);Qianetal.,Nature450:259(2007);Ramanetal.,Science327:1014-1018(2010)。可以用于这些和相关的实施方式的计算机算法的一些附加的非限制性例子,如针对本申请提供的IL-1β-特异性抗体及其抗原结合结构域的合理设计,包括VMD,这是一个使用3-D图形和内置脚本用于显示、动画和分析较大的分子生物系统的分子可视化程序(参见TheoreticalandComputationalBiophysicsGroup的网站,UniversityofIllinoisatUrbana-Champagne,atks.uiuc.edu/Research/vmd/)。多种其他计算机程序均是本领域技术人员公知的和可用的,其可以用于通过能量最小化构象的空间填充模型(范德华半径)确定原子的尺寸;GRID,其用于确定不同化学基团的高亲和性区域,以增强结合,MonteCarlo检索,用于数学比对,以及CHARMM(Brooksetal.,(1983)J.Comput.Chem.4:187-217)和AMBER(Weineretal.,(1981)J.Comput.Chem.106:765),其评估力场计算结果和分析(亦参见,Eisenfieldetal.,(1991)Am.J.Physiol.261:C376-386;Lybrand(1991)J.Pharm.Belg.46:49-54;Froimowitz(1990)Biotechniques8:640-644;Burbametal.,(1990)Proteins7:99-111;Pedersen(1985)Environ.HealthPerspect.61:185-190;和Kinietal.,(1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9:475-488)。多种适宜的计算用计算机程序也可购买获得,如从(Munich,Germany)购买。
在本发明的另一个实施方式中,抗-IL-1β抗体及其人源化形式是衍生自家兔单克隆抗体,并且特别地使用技术产生。这些抗体是有利的,因为其需要最小的序列修饰,以利于在使用突变谱系引导(MLG)人源化技术(参见,例如美国专利号7,462,697)进行人源化后保留功能性质。因此,用于制备本申请的抗-IL-1β抗体的示例性方法包括,例如在美国专利5,675,063和7,429,487中己描述的家兔单克隆抗体技术。在这一点上,在一些实施方式中,本公开的抗-IL-1β抗体在家兔中生产。在特定实施方式中,将能够与家兔脾细胞融合的家兔来源的永生化B-淋巴细胞用于生产产生抗体的杂交细胞。永生化的B-淋巴细胞并不会可检测地表达内源性的免疫球蛋白重链,并且在某些实施方式中可能含有改变的免疫球蛋白重链编码基因。
组合物和使用方法
本申请提供了包含IL-1β-特异性抗体及其抗原结合片段的组合物,以及在多种治疗设置中给予此类组合物。
以纯化形式或适宜的药物组合物形式给予本申请所述的IL-1β-特异性抗体可以通过类似用途试剂的任意可接受给药模式实现。药物组合物可以通过将抗体或含有抗体的组合物与适宜的生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合制备,可以被制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂,如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、和气雾剂。此外,其他药物活性成分(包括如本申请其他地方所描述的其他抗癌剂)和/或适宜的赋形剂如盐、缓冲剂和稳定剂可以,但并非必须,存在于组合物中。可以通过多种不同途径实现给药,包括口服、胃肠外、鼻内、静脉、皮内、皮下或局部。优选的给药方式取决于待治疗或预防状况的性质。给药后,将降低、抑制、阻止或延迟癌症的进展和/或转移的量认为是有效的。
在一些实施方式中,给药量足以使医师己知的特定疾病适应证的炎症和自身免疫症状在临床上相对减轻。
精确的剂量和治疗持续时间是所治疗疾病的函数,可以根据经验使用本领域公知的检测方法确定,或通过在本领域己知的模型系统中测试组合物外推确定。也可以进行受控的临床试验。可以依据待缓解状况的严重程度改变剂量。通常将药物组合物制成制剂并给药,以发挥有用的治疗效果,同时使不需要的副作用最小化。组合物可以一次给予,或者可以分成多个更小的剂量在时间间隔下给予。对于任何特定对象而言,可以根据个体的需要随时间调整特定给药方案。
含有IL-1β-特异性抗体的组合物可以单独给药,或与其他己知的癌症疗法联合给药,如放疗、化疗、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力学疗法等。组合物还可以与抗生素联合给药。
因而,这些和相关的药物组合物的典型给药途径包括,但不限于,口服、局部、经皮、吸入、胃肠外、舌下、直肠、阴道、和鼻内。如本申请所使用的,术语胃肠外包括皮下注射、静脉、肌内、胸骨内注射或输注技术。根据本发明的一些实施方式,将药物组合物制成制剂,以使得将药物组合物给予患者后,其中含有的活性成分成为生物可利用的。将给予对象或患者的组合物可以是具有一种或多种剂量单位的形式,其中例如片剂可以是单一剂量单位,和本申请所描述的IL-1β-特异性抗体以气雾剂形式在其中的容器,其可以具有多个剂量单位。制备此类剂型的实际方法是己知的,或对于本领域技术人员而言是显而易见的;例如参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版(PhiladelphiaCollegeofPharmacyandScience,2000)。在任何情况下,待给予的组合物将含有本申请的治疗有效量的抗体,在本申请的教导下用于治疗感兴趣的疾病或状况。
药物组合物可以是固体或液体形式。在一个实施方式中,载剂是颗粒,以使得组合物是,例如,片剂或粉剂形式。载剂可以是液体,组合物是例如口服油、可注射液体或气雾剂,其用于例如吸入给药。当用于口服给药时,药物组合物优选固体或液体形式,半固体、半液体、混悬剂和凝胶形式包括在本申请所述的固体或液体形式内。
作为用于口服给药的固体组合物,可以将药物组合物制成粉剂、颗粒、压制片、丸剂、胶囊、口香糖、或薄片等。此类固体组合物将典型地含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载剂。此外,可以存在下述中的一种或多种:粘合剂如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、西黄耆胶或明胶;赋形剂如淀粉、乳糖或糊精;崩解剂如海藻酸、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠(Primogel)、玉米淀粉等;润滑剂如硬脂酸镁或氢化植物油(Sterotex);助流剂如胶体二氧化硅;甜味剂如蔗糖或糖精;调味剂如薄荷油、水杨酸甲酯或桔子调味剂;和着色剂。当药物组合物是胶囊形式时,例如明胶胶囊,除上述类型的材料以外,其还可能含有液体载剂,如聚乙烯乙二醇或油。
药物组合物可以是液体形式,例如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或混悬剂。作为两个例子,液体可以用于口服给药或用于通过注射递送。当用于口服给药时,除了本化合物以外,优选的组合物还含有一种或多种甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增香剂。在用于注射给药的组合物中,可以包括一种或多种表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、混悬剂、缓冲剂、稳定剂和等张剂。
液体药物组合物,无论其是溶液、混悬液或其他形式,其可以包括一种或多种下述辅剂:无菌稀释剂如注射用水、盐溶液,优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发性油如合成甘油单酯或二酯,其可以作为溶剂或混悬基质、聚乙烯乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂;抗菌剂如苯甲醇或尼泊金甲酯;抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂如乙二胺四乙酸;缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和调节张力的试剂,如氯化钠或右旋糖。可以将胃肠外制剂密封于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量药瓶中。生理盐水是优选的辅剂。可注射的药物组合物优选是无菌的。
用于胃肠外或口服给药的液体药物组合物应含有一定量的本申请公开的IL-1β-特异性抗体,以获得适宜的剂量。通常,该剂量为组合物中至少0.01%的抗体。当用于口服给药时,该剂量可以在组合物重量的0.1至约70%之间变化。一些口服药物组合物含有约4%至约75%的抗体。在一些实施方式中,根据本发明制备药物组合物和制备物,使得在稀释前胃肠外剂量单位中含有以重量计0.01至10%的抗体。
药物组合物可以用于局部给药,在这种情况下适宜的载剂可以包括溶液、乳剂、软膏或凝胶基质。基质,例如,可以包括下述中的一种或多种:凡士林油、羊毛脂、聚乙烯乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂,如水和醇、以及乳化剂和稳定剂。在用于局部给药的药物组合物中可以存在增稠剂。如果用于经皮给药,组合物可以包括经皮贴片或离子电渗疗法设备。药物组合物可以用于直肠给药,例如栓剂形式,其将在直肠内融化并释放药物。用于直肠给药的组合物可以含有油状基质作为适宜的非刺激性赋形剂。此类基质包括,但不限于,羊毛脂、可可豆脂和聚乙烯乙二醇。
药物组合物可以包括多种材料,其修饰固体或液体剂量单位的物理形式。例如,组合物可以包括在活性成分外形成衣壳的材料。形成衣壳的材料一般是惰性的,可以选自,例如糖、虫胶、和其他肠溶性包衣剂。或者,可以将活性成分包装在明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可以包括与本发明抗体结合的试剂,从而辅助化合物的递送。可以发挥该作用的适宜试剂包括其他单克隆或多克隆抗体,一种或多种蛋白或脂质体。药物组合物可以基本上由能够作为气雾剂给予的剂量单元组成。术语气雾剂用于表示多种系统,其范围为具有胶体性质的系统至由加压包装组成的系统。可以通过液化或压缩气体或通过使活性成分分散的适宜的泵系统递送。气雾剂可以在单相、二相、或三相系统中递送,以递送活性成分。气雾剂的递送包括必须的容器、活性剂、阀、内部容器等,其在一起可以形成试剂盒。在不需要过度实验的情况下,本领域普通技术人员就可以确定优选的气雾剂。
可以通过药物领域公知的方法制备药物组合物。例如,用于注射给药的药物组合物可以通过将包含本申请所述的IL-1β-特异性抗体的组合物与任选地一种或多种盐、缓冲剂和/或稳定剂组合,加入无菌蒸馏水以形成溶液。可以加入表面活性剂以便于形成均一的溶液或混悬液。表面活性剂是与抗体组合物发生非共价相互作用以便于抗体在水性递送系统中溶解或均匀混悬的化合物。
可以以治疗有效量给予组合物,治疗有效量取决于多种因素,包括所使用的特定化合物(例如,IL-1β-特异性抗体)的活性;化合物的代谢稳定性和作用长度;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别、和饮食;给药方式和时间;排泄速率;药物合用;特定疾病或状况的严重程度;以及接受治疗的对象。一般情况下,每日治疗有效量(针对70kg的哺乳动物)为约0.001mg/kg(即,0.07mg)至约100mg/kg(即,7.0g);优选地治疗有效量(针对70kg的哺乳动物)为约0.01mg/kg(即,0.7mg)至约50mg/kg(即,3.5g);更优选地,治疗有效量(针对70kg的哺乳动物)为约1mg/kg(即,70mg)至约25mg/kg(即,1.75g)。
包含本申请的IL-1β-特异性抗体的组合物还可以与一种或多种其他治疗剂同时、在其之前或之后给药。此类联合治疗可以包括给予单一药物剂型,其含有本发明的化合物和一种或多种附加活性剂,以及给予组合物,其包含本发明的抗体,并且各活性剂分别在其各自药物剂型中。例如,本申请所描述的抗体和另一种活性剂可以在单一口服剂型组合物如片剂或胶囊中一并给予患者,或各试剂分别在单独的口服剂型中给予。类似地,本申请所描述的抗体和另一种活性剂可以在单一胃肠外剂型组合物如溶液或其他生理学可接受的溶液中一并给予患者,或各试剂分别在单独的胃肠外剂型中给予。当使用单独剂型时,包含抗体和一种或多种附加活性剂的组合物可以基本上同时给予,即同时地,或在单独的交错时间,即连续地和以任何顺序给予;将联合治疗理解为包括所有这些方案。
因此,在一些实施方式中,还涉及将本公开的抗-IL-1β抗体组合物与一种或多种其他治疗剂联合给予。本领域可以接受此类治疗剂作为本申请所描述的特定疾病状态的标准治疗,如类风湿性关节炎、炎症或癌症。示例性的治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化疗剂、放疗剂、或其他活性和辅助试剂。
在一些实施方式中,本申请公开的抗-IL-1β抗体可以与任意量的放疗剂联合给予。放疗剂的例子包括:烷化剂,如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM);烷基磺酸盐,如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮丙啶类,如苯多巴(benzodopa)、卡巴醌、偏尿多巴(meturedopa)、和尿多巴(uredopa);乙撑亚胺和甲基蜜胺,包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基膦酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和三羟甲基蜜胺;氮芥类,如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀;亚硝基脲,如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀;抗生素,如阿克拉霉素、放线菌素、蒽霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡里奇霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星;抗代谢类,如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙;嘌呤类似物,如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物,如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟脲苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU;雄激素,如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯;抗肾上腺素剂,如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦;叶酸补充剂,如亚叶酸;醋葡醛内酯;醛磷酰胺糖苷;氨基乙酰丙酸;安吖啶;阿莫斯汀(bestrabucil);比生群;依达曲沙;地磷酰胺;地美可辛;地吖醌;艾弗咪辛(elformithine);依利醋铵;依托格鲁;硝酸镓;羟基脲;蘑菇多糖;氯尼达明;米托胍腙;米托蒽醌;莫哌达醇;硝基可润;喷司他丁;苯来美特;吡柔比星;鬼臼酸;2-乙基酰肼;丙卡巴肼;PSK.RTM.;雷佐生;西佐喃;锗螺胺;细交链孢菌酮酸;三亚胺醌;2,2′,2″-三氯三乙胺;乌拉坦;长春地辛;达卡巴嗪;甘露莫司汀;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;伽胞嘧啶(gacytosine);阿糖胞苷(″Ara-C″);环磷酰胺;塞替派;紫杉烷类,例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(Rhne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;吉西他滨;6-硫鸟嘌呤;巯嘌呤;甲氨蝶呤;铂类似物,如顺铂和卡铂;长春碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;丝裂霉素C;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨;诺维本;诺安托;替尼泊苷;柔红霉素;氨基蝶呤;希罗达;伊班膦酸盐;CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);维甲酸衍生物,如蓓萨罗丁TM(贝沙罗汀)、PanretinTM(阿利维甲酸);ONTAKTM(地尼白介素-毒素连接物);埃斯培拉霉素;卡培他滨;以及任意上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在该定义中还包括抗激素剂,其在肿瘤中调节或抑制激素的作用,如抗雌激素,其包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通);和抗雄激素,如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林、和戈舍瑞林;以及任意上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
多种其他治疗剂可以用于与本申请所描述的抗-IL-1β抗体联用。在一个实施方式中,抗体与抗炎剂联合给药。抗炎剂或药物包括,但不限于,甾体激素和糖皮质激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙)、非甾体抗炎药(NSAIDS),其包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特,抗-TNF药物、环磷酰胺,和霉酚酸酯。
示例性的NSAID选自下组:布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂如万络(罗非考昔)和西乐葆(塞来考昔)、以及水杨酸盐。示例性的镇痛药选自下组:扑热息痛、羟考酮、曲马多、和盐酸丙氧芬。示例性的糖皮质激素选自下组:可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、或泼尼松。示例性的生物应答调节剂包括针对细胞表面标记物的分子(例如,CD4、CD5等),细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂(例如,依那西普(恩利)、阿达木单抗(修美乐)和英夫利昔单抗(类克)),趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包括单克隆抗体和分子的重组形式。示例性的DMARD包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。
在一些实施方式中,本申请所描述的抗体与细胞因子联合给药。如本申请所使用的,“细胞因子”指针对一个细胞群释放作为细胞内调节剂作用于另一个细胞的蛋白的通用术语。此类细胞因子的例子为淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。包括在细胞因子内的为生长激素,如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松弛素;松弛素原;糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)、和促黄体激素(LH);肝生长因子;成纤维细胞生长因子;催乳素;胎盘催乳素;肿瘤坏死因子-α和-β;苗勒抑制物质;小鼠促性腺素相关肽;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;整合素;血小板生成素(TPO);神经生长因子如NGF-β;血小板生长因子;转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EPO);骨诱导性因子;干扰素,如干扰素-α、β、和-γ;集落刺激因子(CSF),如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);和粒细胞-CSF(G-CSF);白介素(IL),如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12;IL-15,肿瘤坏死因子,如TNF-α或TNF-β;以及其他多肽因子,包括LIF和试剂盒配体(KL)。如本申请所使用的,术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白,以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
可以将包括本申请所描述的IL-1β-特异性抗体的组合物给予罹患本申请所描述的疾病的个体,包括但不限于,炎症和自身免疫性疾病。特别地,本申请所描述的抗体用于治疗类风湿性关节炎、糖尿病、痛风、隐热蛋白相关周期综合征、慢性阻塞性肺病和多种心血管疾病,如动脉粥样硬化和血管炎。本抗体用于治疗自身免疫性和炎性综合征,其特征为关节的无菌性炎症、浆膜炎、发热、和皮肤损伤的发作。炎性疾病包括,但不限于,克隆氏病、结肠炎、皮炎、牛皮癣、憩室炎、肝炎、肠易激综合征(IBS)、红斑狼疮、肾炎、帕金森氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏症、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、和多种心血管疾病,如动脉粥样硬化和血管炎。在一个实施方式中,本申请提供了一种方法,其通过给予所需患者治疗有效量的本申请组合物来治疗、减轻严重程度或预防炎性疾病。包括抗-IL-1β抗体的本组合物用于治疗自身免疫性疾病,如关节炎(包括类风湿性关节炎、反应性关节炎)、系统性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣和炎性肠病(IBD)、脑脊髓炎、葡萄膜炎、重症肌无力、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病、爱迪生氏病、乳糜泻、慢性疲劳综合征、自身免疫性肝炎、自身免疫性脱发、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、克隆病、纤维肌痛、寻常型天疱疮、干燥综合征、川崎病、甲状腺功能亢进症/格雷夫斯病、甲状腺功能减退症/桥本氏病、子宫内膜异位症、硬皮病、恶性贫血、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、韦格纳氏症、肾小球肾炎、再生障碍性贫血(包括多次输血再生障碍性贫血患者)、阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、埃文氏综合征、因子VIII抑制剂综合征、系统性血管炎、皮肌炎、多发性肌炎和风湿热、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性大疱性类天疱疮、帕金森氏症、结节病、白癜风、原发性胆汁性肝硬化、和自身免疫性心肌炎。
在体内使用用于治疗人类疾病时,一般在给药前将本申请所描述的抗体混入药物组合物。药物组合物包含本申请所描述的一种或多种抗体联合本申请其他地方描述的生理学上可接受的载剂或赋形剂。为制备药物组合物,将有效量的一种或多种化合物与本领域技术人员公知的适于特定给药形式的任意药物载剂或赋形剂混合。药物载剂可以是液体、半液体或固体。用于胃肠外、皮内、皮下或局部应用的溶液或混悬液可以包括,例如无菌稀释剂(如水)、盐水溶液、不挥发性油、聚乙烯乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗微生物剂(如苯甲醇和尼泊金甲酯);抗氧剂(如抗坏血酸和酸性亚硫酸钠)和螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA));缓冲剂(如醋酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉给药,适宜的载剂包括生理盐水或磷酸缓冲盐(PBS),以及含有增稠剂和增溶剂的溶液,如葡萄糖、聚乙烯乙二醇、丙二醇及其混合物。
包含本申请所描述的IL-1β-特异性抗体的组合物可以由载剂制备,其保护抗体不从机体迅速消除,如缓释制剂和包衣。此类载剂包括控释制剂,例如但不限于,植入剂和微囊递送系统,以及生物可降解的、生物相容性的聚合物,如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和本领域普通技术人员公知的那些聚合物。
本申请提供了使用与IL-1β结合的抗体治疗的方法。在一个实施方式中,本发明的抗体给予患有与IL-1β的不适宜表达有关的疾病的患者,在本申请的上下文中的意思中包括,以IL-1β的表达或活化异常为特征的疾病和病症,由于例如蛋白存在量的改变(例如,统计学显著增加或减少)、或存在突变蛋白、或二者兼有导致。过量可能由任何原因导致,包括但不限于,分子水平的过表达、在作用位点的延迟或蓄积出现、或相对于正常可检测的IL-1β的活性增加(例如,以具有统计学意义的方法)。可以相对于正常表达、外观、或IL-1β信号事件的活性对此类IL-1β的过表达进行检测,并且所述检测在本申请所描述的抗体的开发和/或临床检测中发挥重要作用。
另一个实施方式提供了一种治疗、抑制进展或预防多种炎症或自身免疫性疾病中任意一种的方法,其通过给予患有一种或多种这些疾病的患者治疗有效量的本申请公开的IL-1β-特异性抗体来实施。
在另一个实施方式中,本发明的抗-IL-1β-抗体用于确定结合抗原的结构,例如构象表位,然后可以使用该结构通过例如化学建模和SAR方法开发具有或模拟该结构的化合物。
本发明的多种其他实施方式部分涉及诊断应用,其用于检测是否存在表达IL-1β的细胞或组织。由此,本申请提供了一种在样品中检测IL-1β的方法,如检测表达IL-1β的细胞或组织。此类方法可以应用于多种己知的检测形式,包括但不限于,免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、原位杂交(ISH)、整体原位杂交(WISH)、荧光DNA原位杂交(FISH)、流式细胞术、酶免疫法(EIA)、和酶联免疫检测(ELISA)。
ISH是一种杂交类型,其使用标记的互补DNA或RNA链(即,第一结合剂),以便在细胞或组织(原位)的一部分或切片上定位特定的DNA或RNA序列,或者如果组织足够小,则可以在整个组织上定位(整体ISH)。本领域普通技术人员将理解其与免疫组织化学不同,后者使用抗体作为第一结合剂在组织切片上定位蛋白。DNAISH可以用于基因组DNA以确定染色体的结构。荧光DNAISH(FISH)可以,例如,用于医疗诊断以评估染色体的完整性。RNAISH(杂交组织化学)用于在组织切片或全组织标本中检测和定位mRNA和其他转录物。
如本申请所使用的,术语“表位标签”指嵌合多肽,其包含融合至“标签多肽”的多肽,如本发明的抗体或片段。标签多肽具有足够的残基以提供针对能够制备抗体的表位,但其足够短以使其不会干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽还优选独特序列,这样抗体基本上不与其他表位发生交叉反应。通常适宜的标签多肽具有至少六个氨基酸残基,并且通常在约8个至50个氨基酸残基之间(优选地,在约10个至20个氨基酸残基之间)。在某些实施方式中,在本申请所描述的嵌合多肽中发现的表位标签可用于,例如鉴定和分离标签蛋白。
多种标签多肽及其各自的抗体是本领域公知的。例子包括聚-组氨酸(HIS6;聚-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(聚-his-gly)标签;fluHA标签多肽及其抗体12CA5(Fieldetal.,Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988));c-myc标签及8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evanetal.,MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985));以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborskyetal.,ProteinEngineering,3(6):547-553(1990))。另一个例子是FLAG-肽(Hoppetal.,BioTechnology,6:1204-1210(1988)),其被抗-FLAGM2单克隆抗体(Sigma,St.Louis,MO)识别。可以使用亲和基质,通过免疫亲和层析来纯化含有FLAG肽的蛋白,所述亲和基质包含共价连接至琼脂糖的抗-FLAGM2单克隆抗体(EastmanKodakCo.,NewHaven,CT)。其他标签多肽的例子包括KT3表位肽(Martinetal.,Science,255:192-194(1992));α-微管蛋白表位肽(Skinneretal.,J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991));和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuthetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990))。
在不同实施方式中,本申请所描述的抗体偶联至可以被直接或间接检测的可检测标记。在这一点上,抗体“偶联”指共价连接至可检测标记的抗-IL-1β抗体。在本发明中,DNA探针、RNA探针、单克隆抗体、及其抗原结合片段和其抗体衍生物,如单链可变片段抗体或表位标签抗体,均可以共价连接至可检测标记。在“直接检测”中,仅使用一个可检测抗体,即第一可检测抗体。因此,直接检测指偶联至可检测标记的抗体本身可以被检测,而不需要加入另一个抗体(二抗)。
“可检测标签”是能够产生可检测(如可见地、电子地或其他)信号的分子或材料,所述信号指示样品中存在标记和/或其浓度。当偶联至抗体时,可检测标记可以用于定位和/或定量特异性抗体指示的靶点。因此,可以通过检测可检测标记产生的信号来检测样品中靶点的存在情况和/或其浓度。可以直接或间接地检测可检测标记,可以使用偶联至不同特异性抗体的若干不同可检测标记联合检测一种或多种靶点。
可以被直接检测的可检测标记的例子包括,荧光染料和放射性物质以及金属粒子。而相反地,间接检测要求在使用一抗后使用一种或多种附加抗体,即二抗。因此,通过检测二抗或结合剂与第一检测抗体的结合进行该检测。需要加入第二结合剂或抗体的第一检测结合剂的例子包括,酶检测结合剂和半抗原检测结合剂或抗体。
在某些实施方式中,可检测标记偶联至核酸聚合物,其包含第一结合剂(例如,在ISH、WISH、或FISH过程中)。在其他实施方式中,可检测标记偶联至抗体,其包含第一结合剂(例如,在IHC过程中)。
可以偶联至本申请方法中使用的抗体的可检测标记的例子包括,荧光标记、酶标记、放射性同位素、化学发光标记、电化学发光标记、生物发光标记、聚合物、聚合物粒子、金属粒子、半抗原、和染料。
荧光标记的例子包括,5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-羧酰胺基己酸、异硫氰酸酯荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、和染料,如Cy2、Cy3、和Cy5,任选取代的香豆素,包括AMCA、PerCP,藻胆蛋白包括R-藻红蛋白(RPE)和别藻红蛋白(APC)、得克萨斯红、普林斯顿红、绿色荧光蛋白(GFP)及其类似物、和R-藻红蛋白或别藻红蛋白的偶联物,无机荧光标记如基于半导体材料如涂层CdSe纳米晶的粒子。
聚合物粒子标记的例子包括,聚苯乙烯微粒或胶乳粒子、PMMA或二氧化硅,其可以嵌入荧光染料,或者聚合物胶束或胶囊,其含有染料、酶或底物。
金属粒子标记的例子包括金粒子和涂层金粒子,其可以通过银染被转化。半抗原的例子包括DNP、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、生物素、和地高辛。酶标记的例子包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP或AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、蔗糖酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶和葡萄糖氧化酶(GO)。辣根过氧化物酶常用底物的例子包括,3,3′-二氨基联苯胺(DAB)、镍增强的二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、联苯胺二盐酸盐(BDHC)、Hanker-Yates试剂(HYR)、靛酚蓝(IB)、四甲基联苯胺(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚派洛宁(αt-NP)、邻联茴香胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)、硝基四氮唑蓝(NBT)、2-(p-碘苯基)-3-p-硝基苯基-1-5-苯基氯化四氮唑(INT)、四硝基四氮唑蓝(TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-半乳糖苷/铁-铁氰化钾(BCIG/FF)。
碱性磷酸酶常用底物的例子包括,萘酚-AS-B1-磷酸盐/快速红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸盐/快速红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸盐/-快速红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸盐/快速红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸盐/新品红(NABP/NF)、溴氯吲哚磷酸盐/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b--d-吡喃半乳糖苷(BCIG)。
发光标记的例子包括鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1,2-二氧戊环和吡啶并哒嗪。电化学发光标记的例子包括钌衍生物。放射性标记的例子包括碘、钴、硒、氚、碳、硫和磷的同位素。
可以将可检测标记连接至本申请所描述的抗体或与感兴趣的生物学标记物特异性结合的任意其他分子,例如抗体、核酸探针、或聚合物。而且,本领域的普通技术人员将理解,还能够将可检测标记偶联至第二、和/或第三、和/或第四、和/或第五结合剂或抗体等。此外,本领域技术人员将理解,用于表征感兴趣的生物学标记物的每个附加的结合剂或抗体可以用于信号放大步骤。当可检测底物是例如染料、胶体金粒子、发光剂时,可以使用例如光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜对生物学标记物进行目测检测。还可以使用质谱对连接至生物学标记物的目测检测底物进行检测。当可检测底物是放射性同位素时,可以通过放射自显影目测检测,或使用闪烁计数器非目测检测。参见例如,Larsson,1988,Immunocytochemistry:TheoryandPractice,(CRCPress,BocaRaton,Fla.);MethodsinMolecularBiology,vol.801998,JohnD.Pound(ed.)(HumanaPress,Totowa,N.J.)。
本发明进一步提供了用于检测样品中的IL-1β或者表达IL-1β的细胞或组织的试剂盒,其中所述试剂盒含有本申请所描述的至少一种抗体、多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞。在一些实施方式中,试剂盒可以含有缓冲剂、酶、标记、底物、小珠或供本发明的抗体附着的其他表面等等,以及使用说明。
实施例
实施例1
单克隆抗-IL-1β抗体的生产和人源化
1抗体生产
1.1免疫
使用在完全弗氏佐剂(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO)中的0.5mg重组人IL-1β皮下免疫三只新西兰白兔。初次免疫后,使用在不完全弗氏佐剂中的0.25mgIL-1β加强免疫动物5次,间隔3周。在用于细胞融合的脾切除术前,将具有最高血清滴度和IL-1β中和活性的家兔连续4天使用在PBS中的0.4mgIL-1β加强免疫。
1.2抗体产生
从免疫家兔中收获脾细胞,并使用PEG4000(SigmaChemical,St.Louis,MO)与家兔浆细胞瘤细胞240E-W2融合。在通过HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸腺嘧啶)选择后,将在原始96孔板中生长的杂交瘤克隆转移至更换培养基的新96孔板中。收集杂交瘤上清液并对特定抗原结合进行筛选。在ELISA结合检测中筛选出400个阳性克隆,对其进行功能性筛选。
1.3杂交瘤的功能性筛选
对于功能性筛选而言,对24孔板中己确证的400个阳性克隆的上清进行检测,测定其中和IL-1β-诱导的TF-1细胞(人前髓细胞系)增殖的活性。发现六十个克隆具有中和IL-1β的活性。进一步选择中和IL-1β活性最高的34个克隆进行分子克隆和重组表达,以用于进一步的功能鉴定。
1.4重组抗-IL-1β抗体
利用PCR扩增来自最高的34个克隆的家兔IgG的L链和H链可变区(VH)的DNA片段。将L链片段在HindIII和NotI位点克隆至pTT5载体,将VH片段在HindIII和KpnI位点克隆至pTT5载体H链的恒定区。对于各杂交瘤而言,将L或H链的三个DNA克隆测序,鉴定带有共有序列的质粒,并用于重组表达。为表达重组抗体,将L和H链质粒共转染至293-6E细胞(NationalResearchCouncilCanada)。5天后,收集上清液并使用ELISA检测进行定量,以在功能性检测之前测定IgG的浓度。
1.5重组抗-IL-1β抗体的功能性筛选
进行IL-1β-诱导的TF-1细胞增殖的中和,以便对重组抗体的效力进行排序。在存在400pg/mlIL-1β的条件下,使用滴定剂量的抗体处理培养于含10%FBS的RPMI1640中的TF-1细胞。3天后加入AlamarBlue以评估细胞的增殖情况。结果见下表(表1)。选择具有较高活性的高亮克隆,使用纯化的材料进行进一步排序。
表1:抗体对IL-1β-诱导的TF-1细胞增殖的中和活性
表示H链和L链具有相同的DNA序列。
1.6重组抗-IL-1β抗体的功能性排序
选择克隆Q6、16、26、32、33进行进一步的功能性分析,以评估其中和IL-1β活性的效力。将所有抗体在293-6E细胞中表达,通过蛋白A柱进行纯化,并在经PBS缓冲液透析后进行定量。图2显示了IL-1β-诱导的TF-1细胞增殖的剂量依赖性抑制。使用阿那白滞素作为阳性对照。还计算了各抗体的IC50。与阿那白滞素相比,所有克隆均显示出更强的IL-1β中和活性。克隆Q26显示出最高的中和效力。
1.7抗IL-1β抗体与IL-1β的结合亲和性
利用表面等离子体共振(SPR)对抗-IL-1β抗体的抗原结合亲和性进行检测。各抗体的Kd见表2。克隆Q26显示出与IL-1β具有最高的结合亲和性。
表2:抗IL-1β抗体的结合亲和性
1.8阻断IL-1β-诱导NFκB核转位
进行NF-kB核转位检测以评估克隆Q26阻断IL-1β-诱导的下游信号的活性。使用10ng/mlIL-1β处理CHO/dhfr细胞20分钟。然后将细胞固定,并使用小鼠抗-NF-kBp65(BDbioscience)和二抗山羊抗-小鼠HRP抗体(Immunovision)检测NF-kB的定位。图3为显示克隆Q26阻断IL-1β刺激的NF-kB核转位的代表性数据。
2.抗体人源化
2.1人源化设计
使用突变谱系引导(MLG)人源化的专利技术对克隆Q26进行人源化。首先,将克隆Q26的重链(VH)和轻链(VK)可变区序列与人生殖细胞VH和VK数据库进行比对。将鉴定得到的最接近的人生殖细胞序列VH3-66和VK-L19作为克隆Q26人源化的模板。其次,将克隆Q26谱系内的抗体序列进行比对。谱系克隆在CDR内具有相似序列,并且在可变区内含有相同数量的氨基酸残基。第三,基于所掌握的人和小鼠抗体的知识,对框架区内可能参与CDR内接触或链内接触的家兔残基进行鉴定。根据系统发育分析,将认为对抗体的结构活性不具有关键作用的残基进行人源化。在MLG工程化后,人源化的Q26框架与人生殖细胞框架具有93.5%的同一性。此外,MLG人源化技术可以在H链的CDR1和在L链的CDR3进行进一步的人源化,其均与母本家兔抗体有一个氨基酸的差异(参见图1以及SEQIDNO:11和12)。
2.2人源化Q26的表达
编码人源化Q26的VK和VH的DNA由MCLab(SouthSanFrancisco,CA,USA)合成。DNA片段包括信号肽和5’末端的Kozak序列。为表达人源化的Q26,将人源化的VK片段在HindIII和NheI位点克隆至构建于pTT5载体的人CK。将人源化的VH在HindIII和BsiWI位点克隆至构建于pTT5载体的人IgG1CH。将人CK和IgG1CH的DNA和氨基酸序列选择为恒定区。在293-6E细胞中表达人源化的Q26,通过蛋白A柱进行纯化,并在使用PBS缓冲液透析后利用UV280定量。
2.3人源化的Q26保留生物学活性
检查人源化的Q26抑制IL-1β-诱导的TF-1细胞增殖的能力。人源化的Q26对IL-1β-刺激的TF-1细胞生长显示出剂量依赖性抑制,并与其母本家兔Q26显示出相似的效力(图4)。因此,选择人源化的Q26进行进一步的临床前开发,并将其命名为APX002。
3.临床前开发
3.1APX002对IL-1β的体外中和活性
APX002是人源化的单克隆抗体,其最初从家兔杂交瘤克隆Q26中鉴定。之所以选择APX002作为先导物,是因为其能够在体外与人IL-1β特异性结合,并中和IL-1β的相关活性。其与IL-1β结合的亲和性为1.99x10-10M。在交叉物种反应性检测中,APX002显示出与猴IL-1β的交叉反应,其亲和性与人IL-1β接近,但并不与小鼠IL-1β发生交叉反应(图5)。
3.2APX002在体外模型中的生物效应
为进一步评估其生物活性,使用人外周血细胞对APX002进行体外检测。在该检测中,在存在APX002的条件下,使用表皮葡萄球菌刺激来自4名供体的人全血细胞。在与Toll样受体(TLR)结合后,表皮葡萄球菌触发IL-1β生产,然后IL-1β诱导下游生物效应,包括产生其他细胞因子,如IL-6和TNFα。因此,可以将IL-6的产生作为读数以测定APX002阻断IL-1β的能力。孵育24小时后,使用裂解血细胞,以提取用于检测的膜和细胞内的细胞因子。如表3所示,APX002强烈抑制由表皮葡萄球菌诱导的IL-6产生。在己检测的两个剂量中,APX002比Xoma-052的效力略高,后者为目前处于临床开发阶段的另一个抗-IL-1β抗体。
表3:在83pM(高)和166pM(低)下APX002对STAPH诱导的IL-6产生的抑制。IL-6通过ELISA试剂盒检测。使用Xoma-052(IL-1β抗体)作为阳性对照
在其他实验中,在培养的人全血细胞中,使用LPS(TLR配体)刺激IL-1β-诱导的细胞因子产生。高剂量和低剂量的APX002均抑制LPS诱导的TNFα和IL-6产生(表4)。在低剂量(83pM)下,证实APX002在抑制IL-6和TNFα产生上与Xoma-052相比基本上更有效。在高剂量(166pM)下,APX002与Xoma-052显示出相似的抑制活性。
表4:在83pM(高)和166pM(低)下APX002对LPS诱导的IL-6和TNFα产生的抑制。IL-6和TNFα通过ELISA试剂盒检测。使用Xoma-052作为阳性对照
使用人全血细胞培养物的这些体外数据进一步确证了APX002作为有效IL-1β拮抗剂的生物活性。
3.3APX002在疾病模型中的体内效力。
APX002不与小鼠IL-1β发生交叉反应,这一事实限定了使用小鼠模型评估其体内药理学作用。作为替代方案,使用两项动物研究评估APX002的体内效力。在人IL-1β诱导的小鼠关节炎症模型中,将NIH3T3成纤维细胞系产生的高水平的hIL-1β注射至DBA-1小鼠的右膝关节,以诱导hIL-1β依赖性关节炎。给予APX002,并在该模型中检测其治疗炎症的效力。此外,将尿酸钠(MSU)晶体注射至猴气囊中能够激发出与人痛风类似的急性炎症应答。给予APX002,并在该模型中检测其治疗痛风的效力。
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可以对上文所描述的不同实施方式进行组合以提供进一步的实施方式。本说明书中涉及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物其全部内容均通过引用并入本申请。如果有必要,采用不同专利、申请文件和公开文件的概念,可以对实施方式的方面进行修改,以提供进一步的实施方式。
在上述详细描述的教导下,可以对实施方式进行这些和其他改变。一般而言,在下述权利要求中,使用的术语不应被解释为将权利要求限制为说明书和权利要求所公开的特定实施方式,而是应该被解释为包括所有可能的实施方式,以及此类权利要求等同物的全部范围。因此,权利要求并不受本申请的限定。

Claims (19)

1.一种分离的抗体,或其抗原结合片段,其与IL-1β结合,包括
(i)重链可变区,包括如SEQIDNO:3所示的VHCDR1区、如SEQIDNO:4所示的VHCDR2区、和如SEQIDNO:5所示的VHCDR3区;以及(ii)轻链可变区,包括如SEQIDNO:6所示的VLCDR1区、如SEQIDNO:7所示的VLCDR2区、和如SEQIDNO:8所示的VLCDR3区;或者
(iii)重链可变区,包括如SEQIDNO:11所示的VHCDR1区、如SEQIDNO:4所示的VHCDR2区、和如SEQIDNO:5所示的VHCDR3区;以及(ii)轻链可变区,包括如SEQIDNO:6所示的VLCDR1区、如SEQIDNO:7所示的VLCDR2区、和如SEQIDNO:12所示的VLCDR3区。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变区包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段,包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体是人源化的。
6.根据权利要求5所述的分离的抗体,其中所述VH区包含如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列,并且所述VL区包含如SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体选自下组:单链抗体、ScFv、缺乏铰链区的单价抗体、和微抗体。
8.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体是Fab或Fab’片段。
9.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体是F(ab’)2片段。
10.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体是完整的抗体。
11.根据权利要求1所述的分离的抗体,其包括人IgG恒定结构域。
12.根据权利要求11所述的分离的抗体,其中所述IgG恒定结构域包括IgG1CH1结构域。
13.根据权利要求11所述的分离的抗体,其中所述IgG恒定结构域包括IgG1Fc区。
14.一种分离的多核苷酸,其编码根据权利要求1或权利要求6所述的分离的抗体,或其抗原结合片段。
15.一种表达载体,其包含如权利要求14所述的分离的多核苷酸。
16.一种分离的宿主细胞,其包含如权利要求15所述的载体。
17.一种组合物,其包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的根据权利要求1或权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
18.如权利要求17所述的组合物在制备用于治疗患有与IL-1β表达异常相关疾病的患者的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途,其中所述与IL-1β表达异常相关的疾病选自下组:类风湿性关节炎、糖尿病、隐热蛋白相关周期综合征、痛风、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化和血管炎。
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