CN103087192B - 抗-kdr抗体和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供抗-KDR单克隆抗体和相关的组合物，可将其用在用于治疗各种癌症、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病和与畸变的VEGF或KDR表达和/或活性相关的其他疾病的各种治疗方法的任一种中。

Description

抗-KDR抗体和使用方法

相关申请的引用

本申请要求于2011年11月2日提交的美国临时申请系列第61/554,758号的权益，在此以引用的方式将其全文并入本文。

序列表

本申请附有纸版和计算机可读形式的序列表，其精确反应了本文所述的相关序列。

技术领域

本发明通常涉及抗-VEGF受体2(VEGFR2；又称为含激酶插入区受体、或KDR)抗体、组合物、及其使用方法。这些抗体可用于例如治疗和抑制各种疾患的方法中，所述疾患包括年龄-相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病、和缺血性视网膜病变、类风湿性关节炎、银屑病、和各种肿瘤疾病(包括肾细胞癌、转移性胃或胃食管连接部腺癌、乳癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、黑素瘤、和复发性多形性成胶质细胞瘤、白血病和实体瘤)。

背景技术

VEGFR2/KDR是原发性血管生成受体，以及结合VEGF亚型A、C、D和E，并且对于内皮细胞分化、以及VEGF的促丝裂作用、血管生成作用和渗透性-增强(渗透性-增强)作用VEGFR2/KDR为重要的。抗-KDR抗体可预防所有已知VEGF亚型与VEGFR2/KDR结合和开始信号传递。此外，因为肿瘤分泌更多VEGF的分子，而受体的数目仍然相对恒定，即使在非常高水平的VEGF亚型的存在下，靶向受体增加完全抑制信号的可能性。

血管生成

血管生成(从现存的脉管系统中新血管的形成)是严格控制的事件，并且对于正常生理(例如胚胎发育、卵泡发育、伤口复原、以及诸如肿瘤生长和进展(1，2)的病理病症)起着重要作用。

原发性肿瘤的生长和新陈代谢取决于新血管的形成。在没有新血管形成的情况下，肿瘤会坏死或细胞凋亡和/或不能生长超过2-3mm³的尺寸(3)。肿瘤血管生成包括多个过程，包括内皮细胞激活、增殖、迁移、和被特定的血管生长因子触发的从先前存在血管中组织渗透，所述血管生长因子通过肿瘤细胞和周围基质(1-4)产生。

VEGF和VEGF受体

已经鉴定几种生长因子为可能的血管生长的调节剂(5)。在这些因子中，血管内皮生长因子(VEGF)及其受体已经显示对于肿瘤血管生成(6-9)起着重要作用。

VEGF是具有强有利的血管生成的、促有丝分裂的、和血管渗透-增强活性(10，11)的均二聚的34-42kDa肝素-结合糖蛋白。VEGF调节在成年人生命(12，13)的胚胎发育和血管生成的过程中血管生成。VEGF家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、和VEGF-E。通过VEGF受体(VEGFR)VEGF结合和介导活性。有3种VEGFR，包括VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(Flk-1/KDR)和VEGFR3(14-16)。

在基因敲除实验(17-18)中已经清晰地证实在血管形成中VEGF和VEGF受体的生理重要性。VEGFR1酪氨酸激酶具有对于激酶活性所需要的保守的基序。然而，对VEGF-A应答的VEGFR1的磷酸化的水平是低的(37，38)。VEGFR-1的功能未较好定义，它可作用虚拟/诱饵受体(dummy/decoy receptor)以从VEGFR-2结合中螯合VEGF和调节VEGFR-2信号。已经显示VEGFR-3可介导应答VEGF-C和VEGF-D的淋巴管生成。VEGFR2/KDR是原发性血管生成受体，以及结合VEGF亚型A、C、D和E，并且对于内皮细胞分化和有丝分裂发生它是重要的。

KDR的结构和生物学

VEGFR是受体酪氨酸激酶，并且属于作为PDGF和成纤维细胞生长因子(FGF)的受体的相同家族。VEGFR2/KDR是在胞外结构域、跨膜结构域、和通过激酶插入分成两个细胞内酪氨酸激酶结构域中由个免疫球蛋白样的环组成的200kDa糖蛋白。第二和第三免疫球蛋白样的环是对于VEGF的高-亲合力配体-结合结构域，然而第一和第四免疫球蛋白样的环分别调节配体结合和受体二聚化。与对于VEGFR1的25pM的Kd相比，VEGF使用75-250pM的Kd来结合KDR。

KDR主要表达在血管内皮细胞的细胞表面。还在造血细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)、和一些恶性细胞的细胞表面上发现KDR。

KDR是在发展的血管生成和血细胞生成中主要受体，和是VEGF的促有丝分裂的、血管生成的和渗透性-增强作用的主要的介体。VEGFR2-/-敲除小鼠显示在E8.5-9.5下具有缺陷性血-岛形成和血管生成的胚胎致死率(41)。生理上，VEGF与KDR的结合导致内皮细胞激活、增殖、迁移、侵袭和存活。一旦与VEGF结合时，KDR受体二聚化，这导致激酶结构域的激活和KDR受体信号传递的转导。类似许多其他受体酪氨酸激酶，导致血管生成的主要的细胞内信号传递途径包括MAPK和PI3激酶激活。

作为分子靶用于抗体治疗的KDR

VEGFR2/VEGF轴是在肿瘤血管生成中主要途径。多个研究已经显示：VEGF和KDR的过表达与在人恶性肿瘤(6)中侵袭和转移强烈相关。VEGF受体与发生在许多人实体瘤(包括膀胱(21)、乳房(22、23)、直肠(24、25)、胃肠(26)、神经胶质瘤(12、27)、肾脏(28)、黑素瘤(29)、和成神经细胞瘤(30))中血管生成相关。

在肿瘤血管生成中KDR的重要作用直接证实在研究中，其中显性-阴性KDR受体的表达导致在无胸腺小鼠(31)中减少的内皮细胞有丝分裂发生和皮下神经胶质瘤肿瘤的生长抑制。其他研究使用中和可溶性VEGF受体以及使用包括小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)和KDR-特异性抗体的KDR抑制剂来证实该作用。

除了它对于肿瘤血管生成的作用外，在诸如白血病细胞的一些肿瘤细胞上还发现KDR，并且通过刺激白血病生长(42，43)的自分泌环KDR可直接介导肿瘤发生。

KDR信号传递的抑制能够减少血管生成和延迟肿瘤生长(35，36)。靶向KDR的大多数目前治疗是小-分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。TKI干扰ATP或其他底物与酪氨酸激酶的结合，以及破坏激酶催化活性。所有迄今开发的TKI(类似舒尼替尼)与KDR激酶结构域的ATP结合部位可逆地结合。

在各种类型的肿瘤(12，19)中VEGF在高水平下表达，以及新近发育的毛细血管被聚集在VEGF-产生肿瘤细胞(12)周围。在含氧量低的条件(与快速生长的肿瘤(20)相关的那些条件)下强烈上调VEGF表达。通过诸如Avastin(33，34)的抗体中和VEGF是临床批准的治疗，从而抑制癌症或诸如AMD的其他血管生成疾病。然而，甚至当联合化学治疗给予时已经发现对VEGF阻断的抵抗。该抵抗可以与重塑的脉管系统和其他生成血管因子的增加的表达相关。就其本身而论，本领域保留需求对于用于抑制癌症和与血管生成相关的其他疾病的改善的组合物和方法。

尽管TKI和抗-KDR抗体能够抑制KDR-介导的血管生成，但是抗体途径的优势超过TKI。相对于TKI，抗-KDR抗体是更加特异的KDR靶向剂(即，它不会抑制其他的VEGF受体)。因为它的高特异性，抗-KDR抗体能够限制和/或避免通过更低特异性TKI(44)导致的脱靶效应(off-targeteffect)和毒性。

在各种类型的肿瘤(12，19)中VEGF在高水平下表达，以及新近发育的毛细血管被聚集在VEGF-产生肿瘤细胞(12)周围。在含氧量低的条件(与快速生长的肿瘤(20)相关的那些条件)下强烈上调VEGF表达。通过诸如Avastin(33，34)的抗体中和VEGF是临床批准的治疗，从而抑制癌症或诸如AMD的其他血管生成疾病。然而，甚至当联合化学治疗给予时已经发现对VEGF阻断的抗性。该抗性可以与重塑的脉管系统和其他生成血管因子的增加的表达相关。

相对于仅结合配体之一(VEGF-A)的Avastin，预期抗-KDR抗体预防所有已知的VEGF与VEGFR2/KDR的结合。相比与仅阻断VEGF-A，这可具有对于肿瘤血管生成的更意义深远的抑制作用。可能的是，在Avastin抗性的情况下使用抗-KDR抗体的治疗可以为有效的。靶向KDR超过VEGF的潜在优势概述在表1中。

表1.靶向KDR的抗体治疗超过VEGF的优势

因此，靶向KDR和阻断KDR信号传递的抗体可具有更高的特异性和更完全的靶抑制，因此可具有在实体瘤和液体瘤中广泛的应用，以及具有克服Avastin抗性的潜能。

在开发Ramucirumab(IMC-1121B)中抗-KDR治疗性抗体

由ImClone Systems/Eli Lilly开发的Ramucirumab是结合人KDR(KD≈50pM)的完全人(fully human)IgG1 mAb，以及Ramucirumab阻断VEGF结合，从而抑制血管生成。因为Ramucirumab不会与鼠KDR交叉反应，所以产生替代抗-鼠KDR抗体(DC-101)，并且将替代抗-鼠KDR抗体(DC-101)用于POC临床前研究。

在具有晚期癌症的患者的I期临床试验中，Ramucirumab较好耐受周给药方案。机制相关的剂量限制性毒性是高血压和深部静脉血栓形成。最近报道(39)在具有转移性肾细胞癌的患者中在KDR酪氨酸激酶抑制剂之后作为单一疗法的II期试验数据。将具有进行性疾病或对索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼、或两者的不耐受性的患者两周一次静脉注射(IV)施用8mg/kg Ramucirumab。每六周进行肿瘤评估。登记总计40个患者，并且治疗39个。19个患者(49％)具有持续大于5个月的稳定的疾病；初步中位无进展存活是6个月。在黑素瘤中联合氮烯唑胺、在具有前列腺癌的患者中联合米托蒽醌/强的松、在具有NSCLC的患者中联合碳铂/紫杉醇、以及在具有结肠直肠癌的患者中联合奥沙利铂/亚叶酸/5-氟尿嘧啶的更多的II期试验正在进行中。

最近在评估Ramucirumab在具有胃癌、胃食管连接部腺癌、和肝细胞癌的患者中3个III期研究。在转移性胃腺癌中、在第二系的转移性结肠直肠癌中和在第二系的非小细胞肺癌中使用或未使用紫杉醇的Ramucirumab的三个另外的3期研究正在进行中。

33C3

由AstraZeneca开发的33C3是使用XenoMouse^TM技术产生的完全人抗-KDR抗体。33C3结合KDR的Ig结构域4-7，因此对VEGF-A与KDR的结合不具有影响。它不竞争在配体结合部位相互作用的抗体。33C3具有对于KDR的高亲合力(KD＜1nM)，并且抑制KDR的VEGF-A诱导的磷酸化。在体外，33C3强效抑制在2D血管生成分析中管长与分支点的数目和在3D分析中内皮管形成。在体内，33C3是在人内皮血管生成分析和人皮肤嵌合体模型(40)中非常有效的血管生成的抑制剂。33C3现在为开发的早期临床前阶段。由于缺乏对鼠KDR的交叉反应性，在体内肿瘤模型中尚未测试33C3。

TTAC-0001

通过PharmAbcine开发的TTAC-0001(通过噬菌体展示产生的完全人抗-KDR抗体)现在为临床前阶段。抗体显示对抗各种癌症鼠模型(45)的强效抗-血管生成的功效。

发明概述

本公开的一方面提供结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段，包含：(i)包含SEQ ID NO：3或11表示的VHCDR1区、SEQ ID NO：4或12表示的VHCDR2区、和SEQ ID NO：5表示的VHCDR3区的重链可变区；以及(ii)包含SEQ ID NO：6表示的VLCDR1区、SEQ ID NO：7表示的VLCDR2区、和SEQ ID NO：8表示的VLCDR3区的轻链可变区；或所述抗体的变体、或其抗原-结合片段，包含重链和轻链可变区，除了在所述CDR区中高达8种氨基酸取代外，所述重链和轻链可变区与(i)和(ii)的所述重链和轻链可变区相同。在一个实施方案中，如本文所公开的分离的抗体、或其抗原-结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列。在另一实施方案中，如本文所公开的分离的抗体，或其抗原-结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列。在一个实施方案中，本文所公开的抗-KDR抗体结合人KDR，并且与鼠或猴KDR交叉反应。

本公开的另一方面提供结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段，所述分离的抗体、或其抗原-结合片段包含：(i)包含如图11所示抗体的VHCDR1、VHCDR2、和VHCDR3的重链可变区；以及(ii)包含如图11所示抗体的VLCDR1、VLCDR2、和VLCDR3的对应的轻链可变区；或所述抗体的变体、或其抗原-结合片段包含重链和轻链可变区，除了在所述CDR区中高达8种氨基酸取代外，所述重链和轻链可变区与(i)和(ii)的所述重链和轻链可变区相同。在一个实施方案中，分离的抗体、或其抗原-结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：17-42表示的氨基酸序列的任意一种。在另一实施方案中，分离的抗体、或其抗原-结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：43-68表示的氨基酸序列的任意一种。

本公开的另一方面提供结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段，所述结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列，以及分离的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列。在一个实施方案中，这种抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列。

本公开的又一方面提供结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段，所述结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，以及结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列。

在本公开的某些实施方案中，本文所述的抗-KDR抗体为人源化的。如本文所述的结合KDR的人源化抗体的示意性VH和VL区表示在SEQ IDNO：9和10中。

在本文所述的抗-KDR抗体的另一实施方案中，抗体可包含单链抗体、ScFv、缺乏铰链区的单价抗体、微型抗体、Fab、Fab’片段、F(ab’)₂片段、或整个抗体。

在某些实施方案中，本文所述的分离的抗体包含人IgG恒定结构域。在这点上，IgG恒定结构域可包含IgG1 CH1结构域，例如如SEQ ID NO：16表示的IgG1 CH1结构域氨基酸序列。在某些实施方案中，本文所述的抗体包含IgG恒定结构域，所述IgG恒定结构域包含IgG1 Fc区。

本公开的另一方面提供与如本文所述的抗-KDR抗体竞争与人KDR的结合的分离的抗体、或其抗原-结合片段。

本公开的又一方面提供以高亲合力(例如5.3x10^-11M或更低的KD的亲合力)结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段。在这点上，如本文所公开的抗-KDR抗体的亲合力可以为约3.5，4，4.5，5，或5.5X10^-11M。在某些实施方案中，本公开的分离的抗体与鼠KDR或非人灵长类KDR交叉反应。

本公开的另一方面提供分离的抗体、或其抗原-结合片段，其中分离的抗体或其抗原-结合片段阻断VEGF与KDR的结合；抑制KDR信号传递；抑制内皮细胞增殖；抑制肿瘤血管生成；抑制肿瘤细胞生长；或前述功能的任一项或多项的组合。在一个实施方案中，分离的抗体或其抗原-结合片段阻断VEGF与KDR的结合；抑制KDR信号传递；抑制内皮细胞增殖；抑制肿瘤血管生成；和抑制肿瘤细胞生长。

在本发明的一个方面中，分离的抗体或其抗原-结合片段直接抑制肿瘤生长。

本公开还提供编码如本文所述的抗-KDR抗体的分离的多核苷酸、和包含这种分离的多核苷酸的表达载体、和包含这种载体的分离的宿主细胞。

本公开的另一方面提供包含生理上可接受的媒介物和药学上有效量的如本文所述的分离的抗体或其抗原-结合片段的组合物。

本公开的又一方面提供用于治疗具有与畸变的VEGF或KDR表达或活性相关的癌症的患者的方法，包括向患者施用包含生理上可接受的媒介物和药学上有效量的如本文所述的分离的抗体或其抗原-结合片段的组合物，从而治疗与畸变的VEGF或KDR表达或活性相关的癌症。在这点上，本文所述的抗体可用于治疗癌症，包括但不限于：血管肉瘤、肾细胞癌、胃肠癌、转移性胃或胃食管连接部腺癌、乳癌、膀胱癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、成神经细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、复发性多形性成胶质细胞瘤、和白血病。

本发明的另一方面提供用于治疗患有炎性疾病的患者的方法，包括向患者施用药学上包含本文所公开的抗体的任一种或多种的有效量的组合物，从而治疗患有炎性疾病的患者。

本公开的另一方面提供用于治疗具有类风湿性关节炎的患者的方法，包括向患者施用包含生理上可接受的媒介物和药学上有效量的如本文所述的分离的抗体或其抗原-结合片段的组合物，从而治疗具有类风湿性关节炎的患者。

本公开的另一方面提供用于治疗具有银屑病的患者的方法，包括向患者施用包含生理上可接受的媒介物和药学上有效量的如本文所述的分离的抗体或其抗原-结合片段的组合物，从而治疗具有银屑病的患者。

本公开的进一步的方面提供用于治疗患有血管生成介导的疾病的患者的方法，包括向患者施用药学上包含本文所公开的抗体的任一种或多种的有效量的组合物，从而治疗患有血管生成介导的疾病的患者。在这点上，在某些实施方案中，患者患有年龄相关的黄斑变性。

本公开的另一方面提供本文所述结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段或本文所述的组合物在制备用于治疗患者的癌症的药物的用途。

本公开的另一方面提供本文所述结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段或本文所述的组合物在制备用于治疗患者的具有与畸变的VEGF或KDR表达或活性相关的癌症的药物的用途。优选地所述癌症选自：血管肉瘤、肾细胞癌、胃肠癌、转移性胃或胃食管连接部腺癌、乳癌、膀胱癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、成神经细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、复发性多形性成胶质细胞瘤、和白血病。

本公开的另一方面提供本文所述结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段或本文所述的组合物在制备用于治疗患者的炎性疾病的药物的用途。

本公开的另一方面提供本文所述结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段或本文所述的组合物在制备治疗患者的类风湿性关节炎的药物的用途。

本公开的另一方面提供本文所述结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段或本文所述的组合物在制备治疗患者的银屑病的药物的用途。

本公开的另一方面提供本文所述结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段或本文所述的组合物在制备治疗患者的血管生成-介导的疾病的药物中的用途。优选地，其中所述患者患有年龄-相关的黄斑变性。

附图简述

图1：显示对于阻断KDR与VEGF的结合的大部分强效抗体的筛选结果的曲线图。

图2：对抑制KDR的磷酸化的抗体的筛选。(A)在酶联免疫吸附试验(ELISA assay)中KDR磷酸化的抑制；(B)在蛋白印迹中KDR磷酸化的抑制。Ab9530是来自Abcam(Cambridge，MA，USA)的对照KDR中和抗体。

图3：APX004选择性结合人和鼠KDR，但不结合其他人VEGFR家族蛋白或VEGF。

图4：APX004以2.6nM的IC50强效阻断KDR与VEGF的结合。

图5：APX004抑制通过VEGF诱导的KDR磷酸化。

图6：APX004以剂量-依赖性方式抑制HUVEC增殖，

图7：至体内研究的终止(41天)，与Avastin(69％抑制)相比，APX004表现出更强效抗-肿瘤活性(77％抑制)。

图8：APX004示出在2.5mg/kg下在H460肿瘤模型中显著(p＜0.01)抗-肿瘤活性。

图9：在3mg/kg下APX004显著抑制A375肿瘤生长。体积＝(宽)²x长/2。符号和棒表示平均值+标准偏差。

图10：在5mg/kg和10mg/kg下APX004显著抑制HT29肿瘤生长。根据下面等式来计算肿瘤体积：体积＝(宽)²x长/2。符号和棒表示平均值+标准偏差。

图11是实施例1所鉴定的抗-KDR抗体的VH和VL区的比对。图11A1显示VH区的氨基酸1-100。图11A2显示VH的剩余的氨基酸。图11B1显示VL区的氨基酸1-70的比对。图11B2显示VL区的剩余的氨基酸的比对。如概述在以下章节“序列简述”和表3中，提供SEQ ID NO：1和17-42的显示在比对中VH区的SEQ ID No；提供SEQ ID NO：2和43-68的显示在比对中VL区的SEQ ID No。CDR为下划线部分。

序列简述

SEQ ID NO：1是克隆36兔抗-KDR抗体的VH区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是克隆36兔抗-KDR抗体的VL区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是克隆36兔抗-KDR抗体的VHCDR1区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是克隆36兔抗-KDR抗体的VHCDR2区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是克隆36兔抗-KDR抗体的VHCDR3区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是克隆36兔抗-KDR抗体的VLCDR1区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是克隆36兔抗-KDR抗体的VLCDR2区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是克隆36兔抗-KDR抗体的VLCDR3区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是克隆36兔抗-KDR抗体的VH区的人源化序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是克隆36兔抗-KDR抗体的VL区的人源化序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是人源化克隆36抗-KDR抗体(APX004)的VHCDR1区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是人源化克隆36抗-KDR抗体(APX004)的VHCDR2区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是编码人CK区的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：14是人CK的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是编码人IgG1 CH1区的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：16是人IgG1 CH1区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17-42是如概述在表3中兔抗-KDR抗体克隆的VH的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43-68是如概述在表3中兔抗-KDR抗体克隆的VL的氨基酸序列。

SEQ ID NO：69-95是如显示在图11中用于兔抗-KDR抗体克隆的VHCDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：96-122是如显示在图11中用于兔抗-KDR抗体克隆的VHCDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：123-149是如显示在图11中用于兔抗-KDR抗体克隆的VHCDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：150-176是如显示在图11中用于兔抗-KDR抗体克隆的VLCDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：177-203是如显示在图11中用于兔抗-KDR抗体克隆的VLCDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：204-230是如显示在图11中用于兔抗-KDR抗体克隆的VLCDR3的氨基酸序列。

发明详述

本文所述的抗-KDR抗体对于KDR具有高结合亲合力(53pM)和选择性。本文所述的抗体阻断KDR与VEGF的相互作用，以及阻断VEGF-诱导的KDR磷酸化和内皮细胞增殖。在某些实施方案中，本文所述的抗体与鼠KDR交叉反应，使得在不需要替代抗体(surrogate antibody)下能够在体内动物模型中测试抗体。本文所述的抗体证实在人肿瘤异种移植模型中抑制肿瘤生长的强效活性。因为交叉-反应性，依据PK、PD、生物标志物发展、甚至在将它在非-人灵长类和人中测试前的临床前鼠模型中潜在毒性，能够体内完全评价和特征化本文所述的抗-KDR抗体。

本公开涉及特异性结合KDR的抗体及其抗原-结合片段，尤其具有特异的表位特异性和功能性质的是抗体。本发明的一个实施方案涵盖特异性人源化抗体及其片段，所述特异性人源化抗体及其片段能够结合KDR；阻断KDR与VEGF的结合；和抑制VEGF诱导的下游细胞信号传递和生物作用。在本发明的更具体的实施方案中，本文所述的抗体以约5.3X10^-11M的亲合力特异地结合KDR和阻断KDR与VEGF结合。

在进一步的实施方案中，本文所述的抗体直接抑制肿瘤生长。在这点上，某些肿瘤表达KDR，以及可使用作为自分泌环的VEGF-KDR途径以生长。因此，在某些实施方案中，通过本文所述的抗体介导的抗-肿瘤作用可包括：(i)抗-血管生成和/或(ii)直接抑制肿瘤生长。

本发明的实施方案涉及抗-KDR抗体或其抗原-结合片段用于与VEGF或其畸变的表达相关的疾病和疾患的诊断、评估和治疗的用途。在与VEGF或KDR表达和/或活性相关的疾患的治疗或预防中使用题述抗体，所述疾患包括但不限于：类风湿性关节炎、糖尿病、和缺血性视网膜病变、年龄-相关的黄斑变性、银屑病、和与蛋白尿相关的肾小球肥大、和各种肿瘤疾病(包括血管肉瘤、肾细胞癌、胃肠癌、转移性胃或胃食管连接部腺癌、乳癌、膀胱癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、成神经细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、和复发性多形性成胶质细胞瘤、白血病、和实体瘤)、以及其他疾病。

除非特别指出相反，本发明的操作采用在本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学、和重组DNA技术的常规方法，为了说明以下描述许多常规方法。在文献中完全地解释这些技术。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology或Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.(2009)；Ausubel et al.，Short Protocols inMolecular Biology，3^rd ed.，Wiley & Sons，1995；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第三版，2001)；Maniatis et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning：A PracticalApproach，vol.I & II(D.Glover，ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins，eds.，1985)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins，eds.，1984)；AnimalCell Culture(R.Freshney，ed.，1986)；Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)以及其他类似参考文献。

除非文本中明确另有说明外，如在该说明书和所附的权利要求中所使用，单数形式“a”、“an”、和“the”包括复数形式。

贯穿该说明书，除非文本另有需要，应将词语″包含(comprise)″、或诸如″包含(comprises)″或″使包含(comprising)″的变化形式理解为所述元素或整体、或者元素或整体的组的内含物，但未排除任何其他的元素或整体、或者元素或整体的组。

除非另有明确说明，在该说明书中将各实施方案加以必要的变更应用至所有其他实施方案。

可将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成、和组织培养、和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。根据生产商的说明书、或如在本领域中常规完成、或如本文所述可进行酶促反应和纯化技术。根据本领域众所周知的常规方法和如在各种通常与贯穿本说明书所引用和讨论的更具体的参考文献中所述通常可进行这些以及相关的技术和工序。除非提供具体的定义，相关使用的命名法和本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学、和医用和药物化学的实验室工序和技术都是本领域众所周知和常规使用的那些。可将标准技术用于重组技术；分子生物；微生物；化学合成；化学分析；药物制备、配方、和递送；和患者的治疗。

本发明的实施方案涉及结合KDR的抗体。尤其，本文所述的抗体以出人意料地高的亲合力特异地结合KDR；阻断VEGF与KDR的结合；阻断VEGF活性；和具有用于治疗与畸变的表达或VEGF的活性相关的疾病的治疗功用。本文所述的抗体还具有诸如抑制各种VEGF/KDR-介导的生物作用(例如，KDR的磷酸化、血管生成、内皮细胞增殖、和本领域技术人员已知的其他VEGF/KDR-介导的作用)的能力的有利性质。本文所述的抗体还可具有对于KDR受体内化的作用。

SEQ ID NO：1-12和17-230表示示意性抗体、或抗原-结合片段、或其互补决定区(CDR)的序列。

如本领域众所周知，抗体是通过至少一种位于免疫球蛋白分子的可变区中表位识别部位能够特异性结合靶(例如糖类、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所使用，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，还涵盖其片段(例如dAb、Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体、包含具有所需的特异性、人源化抗体、嵌合抗体、和免疫球蛋白分子(包含所需的特异性的抗原-结合部位或片段(表位识别部位))的任何其他修饰构型的抗原-结合片段的抗体部分的融合蛋白。通过基因融合构建的″二体″、多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993)也是本文所涵盖的抗体的特殊形式。包含与CH3结构域相连的scFv的微型抗体也包括在本文中(S.Hu et al.，Cancer Res.，56，3055-3061，1996)。例如，参见Ward，E.S.et al.，Nature 341，544-546(1989)；Bird et al.，Science，242，423-426，1988；Huston et al.，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448，1993；Y.Reiter et al.，Nature Biotech，14，1239-1245，1996；S.Hu et al.，CancerRes.，56，3055-3061，1996。

如本文所使用的术语″抗原-结合片段″是指含有结合目标抗原(尤其为KDR)的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段。在这点上，本文所述抗体的抗原-结合片段可包含来自结合KDR的抗体的本文所示的VH和VL序列的1、2、3、4、5、或所有6个CDR。本文所述的KDR-特异性抗体的抗原-结合片段能够结合KDR。在某些实施方案中，抗原-结合片段或包含抗原-结合片段的抗体预防或抑制VEGF与KDR的结合和后续信号传递事件。在某些实施方案中，抗原-结合片段特异地结合和/或抑制、或调节人KDR的生物活性。

术语″抗原″是指能够被诸如抗体的选择性结合剂结合的分子或分子的部分，所述分子或分子部分还能够用于动物中以产生能够结合抗原的表位的抗体。抗原可具有一个或多个表位。

术语″表位″包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇，优选多肽决定簇。表位是通过抗体结合的抗原的区域。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，而且在某些实施方案中，可具有特异性三维结构特征和/或特异性电荷特征。在某些实施方案中。当抗体在蛋白和/或大分子的复合混合物中优先识别其靶抗原时，则可以说它特异性结合抗原。当平衡离解常数≤10^-7或10^-8M时，则可以说抗体特异性结合抗原。在一些实施方案中，平衡离解常数可以为≤10^-9M或≤10^-10M。

在某些实施方案中，如本文所述的抗体及其抗原-结合片段包括重链和轻链CDR集(set)，分别位于重链和轻链的框架区(FR)集之间，FR集提供对CDR的支持作用而且界定了CDR相互之间的空间关系。如本文使用的术语“CDR集”是指重链或轻链V区中的高变区。从重链或轻链的N-端起，这些区段分别命名为″CDR1″、″CDR2″，和″CDR3″。因此，抗原-结合部位包含六个CDR，包括重链和轻链各自V区的CDR区。含有单一CDR(例如CDR1、CDR2、或CDR3)的多肽在本文中是指″分子识别单位″。大量的抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证实：CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成了广泛的接触，其中接触最多的是重链的CDR3。因此，分子识别单位是主要负责抗原-结合部位的特异性。

如本文所使用的术语″FR集″指重链或轻链V区的CDR集中构成CDR两侧的四条氨基酸序列。某些FR残基可与结合的抗原接触；然而，FR主要负责V区的折叠以形成抗原-结合部位，特别是直接邻接CDR的FR残基。FR内，某些氨基酸残基和某些结构特征是高度保守的。在这点上，所有的V区序列含有大约90个氨基酸残基的内部二硫环。当将V区折叠成结合-部位时，CDR显示出形成抗原结合表面的突出的环基序。通常认为影响CDR环折叠成某些“规范”结构的形状的是FR的保守结构区而不是精确的CDR氨基酸序列。而且，已知某些FR残基参与了结构域间的非共价接触，所述非共价接触稳定了抗体重链和轻链间的相互作用。

参照Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第四版.US Department of Health and Human Services.1987及其更新(现在因特网上可获得(immuno.bme.nwu.edu))，可测定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置。

″单克隆抗体″是指均一抗体群体，其中单克隆抗体由参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在的或非天然存在的)组成。单克隆抗体是高度特异的，被导向抗单个表位。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整单克隆抗体和全-长单克隆抗体，还涵盖其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv)、单链(ScFv)、其变体、含有抗原-结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆拉抗体、和包含所需特异性的抗原-结合片段(表位识别部位)和结合表位的能力的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。该发明不用于限制抗体的来源或者其被产生的方式(例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)。该术语包括在″抗体″的定义下整个免疫球蛋白以及上述的片段等。

木瓜蛋白水解酶优选分裂IgG分子，从而产生若干片段，其中两个片段(F(ab)片段)各含有包括完整抗原结合部位的共价异二聚体。胃蛋白酶能分裂IgG分子，从而提供若干个片段，包括含有两个抗原结合部位的F(ab′)₂片段。通过优选的蛋白水解酶分裂IgM能够产生根据本发明的某些实施方案使用的Fv片段，少数情况下分裂IgG或IgA免疫球蛋白分子。然而，使用本领域熟知的重组技术获得Fv片段更常见。Fv片段包括含有抗原结合部位的非共价VH::VL异二聚体，所述抗原结合部位很大程度保留了天然抗体分子的抗原识别和结合能力。Inbar et al.(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69：2659-2662；Hochman et al.(1976)Biochem 15：2706-2710；以及Ehrlich et al.(1980)Biochem 19：4091-4096。

在某些实施方案中，涵盖单链Fv或scFV抗体。例如，按照关于具有期望的特异性的选择性受体的本申请的学说使用标准分子生物学技术可制备κ体(III et al.，Prot.Eng.10：949-57(1997)；微型抗体(Martin et al.，EMBO J 13：5305-9(1994)；二体(Holliger et al.，PNAS 90：6444-8(1993)、或Janusins(Traunecker et al.，EMBO J 10：3655-59(1991)、和Traunecker et al.，Int.J.Cancer Suppl.7：51-52(1992)。在又一其他的实施方案中，可制备涵盖本本开的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可包含来自不同抗体的CDR和框架区，同时可产生特异性结合KDR(通过一个结合结构域)以及结合第二分子(通过第二结合结构域)的双特异性抗体。通过重组分子生物技术可制备这些抗体，或可将这些抗体物理缀合在一起。

单链Fv(sFv)多肽与从包括V_H-和V_L-编码基因的基因融合表达的V_H::V_L异二聚体共价连接，所述V_H-和V_L-编码基因通过肽-编码接头连接。Huston et al.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16)：5879-5883。已经描述大量方法以识别用于从抗体V区将天然聚合的-但是化学分离的-轻和重多肽链转化为sFv分子的化学结构，所述sFv分子会最终折叠成类似于抗原-结合部位的结构的三维结构。例如，参见Huston et al的美国专利No.5,091,513和5,132,405；和Ladner et al的美国专利No.4,946,778。

在某些实施方案中，如本文所述的KDR结合抗体是以二体的形式。二体是多肽的高分子，各多肽包含第一结构域，所述第一结构域包含免疫球蛋白轻链和第二结构域的结合区，所述第二结构域包含免疫球蛋白重链的结合区，两个结构域被连接(例如通过肽接头)，但是不能彼此缔合以形成抗原结合部位：通过在高分子内一种多肽的第一结构域与在高分子内另一多肽的第二结构域的缔合来形成抗原结合部位(WO94/13804)。

抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward，E.S.et al.，Nature 341，544-546(1989))。

使用双特异性抗体处，可以为常规的双特异性抗体，能够以各种方式制备所述双特异性抗体(Holliger，P.和Winter G Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))，例如化学制备或从杂交瘤制备，或可以为上述双特异性抗体片段的任意一种。仅使用可变区能构建无Fc区域的二体和scFv，这可能降低抗个体基因型反应的作用。

相对于完整的双特异性抗体，双特异性二体也是特别有用的，因为它们可在大肠杆菌(E.coli.)中容易地构建和表达。使用噬菌体展示(W094/13804)能容易地从文库中筛选具有适当的结合特异性的二体(和许多其他多肽，例如抗体片段)。例如，如果二体的一个臂能保持恒定的定向抗抗原X的特异性，那么能制备其中另一臂变化的文库并选择具有合适特异性的抗体。可用突起进入孔洞(knobs-into-hole)工程技术来制备双特异性完整抗体(J.B.B.Ridgeway et al.，Protein Eng.，9，616-621，1996)。

在某些实施方案中，可以的形式提供本文所述的抗体。是具有去除的铰链区的IgG4抗体(参见GenMab Utrecht，TheNetherlands；例如，还参见US20090226421)。专利的抗体技术产生稳定的、具有期望的更长的(与目前小的抗体形式相比)治疗窗的更小的抗体形式(antibody format)。IgG4抗体被认定为惰性的，因此其不会与免疫系统反应。可修饰完全人IgG4抗体，通过消除抗体的铰链区可改性完全人IgG4抗体，从而获得相对于对应的完整的IgG4(GenMab，Utrecht)具有不同稳定性质的半-分子片段。将IgG4分子二等分仅保留在上一个区域，所述能够结合关联抗原(例如，疾病靶)，因此在靶细胞上仅共价结合一个部位。对于某些癌细胞表面抗原，该单价的结合可以不刺激癌细胞以生长，如可看到使用具有相同的抗原特异性的二价的抗体，因此技术可给予对于使用常规抗体可能难以治疗的一些类型的癌症的治疗选择。当治疗癌症的一些形式时，的小尺寸能够是大的益处，这允许超过更大的实体瘤的分子的更好的分布和潜在性增加的功效。

在某些实施方案中，本公开的抗体可采取纳米体的形式。通过单一基因来编码纳米体，以及有效产生于几乎所有原核和真核宿主中，例如大肠杆菌(例如，参见美国专利No.6,765,087)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))、和酵母(例如酵母属、Kluyvermyces、汉森氏酵母属(Hansenula)、或毕赤酵母属(Pichia))(例如，参见美国专利No.6,838,254)。生产工序是可量的，并且已经生产出多-千克数量的纳米体。可将纳米体配方为具有长保质期的随时可用的溶液。

基于B-细胞的自动化的高-通量选择，纳米克隆方法(例如，参见WO06/079372)是用于产生抗期望的靶的纳米体的专利方法。

在某些实施方案中，如本文所公开的抗-KDR抗体或其抗原-结合片段为人源化的。这是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，所述嵌合分子具有由来自非-人种类免疫球蛋白衍生的抗原-结合部位和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余的免疫球蛋白结构。抗原-结合部位可包含融合在恒定结构域上的完全的可变结构域或仅包含嫁接在可变结构域中恰当的框架区上的CDR。表位结合部位可以为野生型或通过一种或多种氨基酸取代来修饰表位结合部位。这消除在人个体中作为免疫原的恒定区，但是仍然可能免疫应答外源可变区(LoBuglio，A.F.et al.，(1989)Proc NatlAcad Sci USA 86：4220-4224；Queen et al.，PNAS(1988)86：10029-10033；Riechmann et al.，Nature(1988)332：323-327)。用于本文所公开的抗-KDR抗体的人源化的示意性方法包括在美国专利no.7,462,697所述的方法。根据本发明的某些实施方案，示意性人源化抗体包含SEQ ID NO：9，10，19和20提供的人源化序列。

另一方法不仅关注提供人-衍生的恒定区，还修饰恒定区以便将它们尽可能改造为人形式。已知重链和轻链的可变区含有三个互补-决定区(CDR)，应答所述表位时所述互补-决定区会变化，并且被四个框架区(FR)侧面相接的所述互补-决定区决定结合能力，在给定的种类中所述框架区是相对保守的，并且推定所述框架区提供CDR的骨架(scaffolding)。当制备关于特定表位的非人抗体时，通过将衍生于非人抗体的CDR嫁接在存在于待改性的人抗体中FR上能将可变区″重新改造(reshape)″或″人源化″。通过Sato，K.，et al.，(1993)Cancer Res 53：851-856.Riechmann，L.，et al.，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen，M.，et al.，(1988)Science 239：1534-1536；Kettleborough，C.A.，et al.，(1991)Protein Engineering 4：773-3783；Maeda，H.，et al.，(1991)Human Antibodies Hybridoma 2：124-134；Gorman，S.D.，etal.，(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88：4181-4185；Tempest，P.R.，et al.，(1991)Bio/Technology 9：266-271；Co，M.S.，et al.，(1991)Proc Natl Acad Sci USA88：2869-2873；Carter，P.，et al.，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-4289；和Co，M.S.et al.，(1992)J Immunol 148：1149-1154，已经报道该方法对于各种抗体的应用。在一些实施方案中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自鼠抗体的所有六个CDR的人源化鼠抗体)。在其他的实施方案中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一、二、三、四、五、六)，依据原始抗体这会变化，可将所述人源化抗体称为来自原始抗体的一个或多个CDR“衍生的”一个或多个CDR。

在某些实施方案中，本公开的抗体可以为嵌合抗体。在这点上，嵌合抗体是由抗-KDR抗体的抗原-结合片段组成，所述抗-KDR抗体可操作地连接或否则为融合不同抗体的异源性Fc部分。在某些实施方案中，异源性Fc结构域具有人源。在其他的实施方案中，异源性Fc结构域可来自不同的Ig类(来自亲本抗体)，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)、和IgM。在进一步的实施方案中，异源性Fc结构域可以由来自一种或多种不同的Ig类的CH2和CH3结构域组成。关于人源化抗体如上所示，嵌合抗体的抗-KDR抗原-结合片段可包含仅一种或多种本文所述的抗体的CDR(例如，本文所述抗体的1、2、3、4、5、或6个CDR)，或可包含整个可变结构域(VL、VH、或两者)。

在某些实施方案中，KDR-结合抗体包含一种或多种本文所述的抗体的CDR。在这点上，在一些情况下，已经显示：能进行抗体的仅VHCDR3的转移，然而还保留期望的特异性结合(Barbas et al.，PNAS(1995)92：2529-2533)。还参见McLane et al.，PNAS(1995)92：5214-5218，Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.(1994)116：2161-2162。

Marks et al(Bio/Technology，1992，10：779-783)描述制备抗体可变结构域的库(repertoire)的方法，其中定向或邻接可变结构域区域的5′末端的共有引物用于联合至人VH基因的第三框架区的共有引物，从而提供缺失CDR3的VH可变结构域的库。Marks et al进一步描述如何将该库与特定的抗体的CDR3合并。使用类似的技术，可改组(shuffle)目前所述抗体的CDR3-衍生的序列(使用缺乏CDR3的VH或VL结构域的库)，而且改组的完整VH或VI结构域结合同源VL或VH区来提供结合KDR的抗体或其抗原-结合片段。然后可将库展示在合适的宿主系统，例如W092/01047的噬菌体展示系统中，以便可选择合适的其抗体或抗原-结合片段。库可由至少约10⁴单个成员和多于若干数量级(例如，约10⁶至10⁸或10¹⁰、或更多)的成员组成。Stemmer(Nature，1994，370：389-391)也公开类似的改组或组合的技术，Stemmer描述关于β-内酰胺酶基因的技术，但是观察到该方法可用于抗体的产生。

进一步可选择的是使用一个或多个选择的VH和/或VL基因的随机的突变来产生新型VH或VL区(所述新型VH或VL区携带本文所示的发明实施方案的一种或多种CDR-衍生的序列)，从而产生在整个可变结构域内的突变。Gram et al(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：3576-3580)描述该技术，其使用易错PCR(error-prone PCR)。可使用的另一种方法是对VH或VL基因的CDR区进行定点突变。Barbas et al.，(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：3809-3813)和Schier et al(1996，J.Mol.Biol.263：551-567)公开该技术。

在某些实施方案中，可将本文所述的抗体的特异性VH和/或VL用于筛选互补可变结构域的文库，从而鉴定具有期望的性质(例如对于KDR增加的亲合力)的抗体。这些方法描述在例如Portolano et al.，J.Immunol.(1993)150：880-887；Clarkson et al.，Nature(1991)352：624-628。

可使用其他的方法以混合和匹配CDR，从而鉴定具有期望的结合活性(例如结合KDR)的抗体。例如：Klimka etal.，British Journal of Cancer(2000)83：252-260描述使用鼠VL和具有从鼠VH中保留的CDR3和FR4的人VH文库的筛选方法。在获得抗体后，抗人VL文库来筛选VH，从而得到结合抗原的抗体。Beiboer et al.，J.Mol.Biol.(2000)296：833-849描述使用整个鼠重链和人轻链文库的筛选方法。在获得抗体后，一个VL与具有保留的鼠CDR3的人VH文库合并。获得能够结合抗原的抗体。Rader et al.，PNAS(1998)95：8910-8915描述类似上述Beiboer et al的方法。

这些上述技术本身是本领域已知的。然而，根据本文所述的本发明的几个实施方案，利用本领域中常规方法，本领域技术人员能够使用这些技术以获得抗体或其抗原-结合片段。

本文还公开的是用于获得对于KDR抗原特异的抗体抗原结合结构域的方法，所述方法包括经过在本文所述VH结构域的氨基酸序列中一种或多种氨基酸的添加、缺失、取代、或插入来提供为VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域；任选地结合VH结构域从而提供一个或多个VL结构域；以及测试VH结构域或一种或多种VH/VL组合，从而鉴定特异性结合成员、或对于KDR特异的与任选具有一种或多种期望性质的抗体抗原结合结构域。VL结构域可具有基本上如本文所述的氨基酸序列。可采用类似的方法，其中一个或多个本文所公开的VL结构域的序列变体联合一个或多个VH结构域。

″特异性结合″或″优选地结合″(本文可交换使用)抗体或多肽的的表位是本领域充分理解的术语，并且测定这种特异性或优选结合的方法也是本领域众所周知的。与可选择的细胞或物质相比，如果分子反应或缔合更频繁、更快、具有更久的持续时间和/或与特定细胞或物质具有更大的亲合力，分子被认为表现出″特异性结合″或″优选的结合″。与抗体结合其他物质相比，如果抗体结合具有更大的亲合力、亲和力、更加容易、和/或具有更长的持续时间，抗体″特异性结合″或″优选地结合″靶。例如，特异性或优选地结合KDR表位的抗体是结合一种KDR表位的抗体，与抗体结合其他KDR表位或非-KDR表位相比，所述结合具有更高的亲合力、亲和力、更加容易、和/或具有更长的持续时间。通过阅读该定义还应当理解，例如，特异性或优选地结合第一靶的抗体(或部分或表位)可或可不特异性或优选地结合第二靶。就其本身而论，″特异性结合″或″优选的结合″不是必要(尽管它能够包括)排外的结合。通常，但不是必要，参照的结合意思是优选的结合。

免疫结合通常是指类型的非-共价相互作用，所述类型出现在免疫球蛋白分子和抗原之间，对于所述抗原免疫球蛋白是特异的，例如通过说明但非限制性的方式，由于静电的、离子的、亲水的和/或疏水的吸引力或排斥力、位阻力(steric force)、氢键、范德华力(van der Waals forces)、和其他相互作用。依据相互作用的离解常数(K_d)能够表示免疫结合相互作用的强度、或亲合力，其中更小的K_d表示更高的亲合力。使用本领域众所周知的方法能够定量选择的多肽的免疫结合性质。一种这种方法需要测量抗原-结合部位/抗原复合物形成和离解的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲合力、和同等地影响在两方向中速率的几何参数。因此，通过计算缔合和离解的浓度和实际速率能够测定″结合速率常数″(K_on)和″离解速率常数″(K_off)。K_off/K_on的比率能够抵消与亲合力无关的所有参数，因此等于离解常数K_d。通常，参见Davies et al.(1990)Annual Rev.Biochem.59：439-473。

在某些实施方案中，本文所述的抗-KDR抗体具有约100，150，155，160，170，175，180，185，190，191，192，193，194，195，196，197，198或199皮摩尔的亲合力，以及在一些实施方案中，对于KDR抗体可具有甚至更高的亲合力。

关于表位的术语″免疫活性″或″剩余的免疫活性″是指在不同的条件下(例如，在使表位经过还原和变性条件后)抗体(例如，抗-KDR抗体)结合表位的的能力。

根据本申请的某些优选的实施方案的抗体或其抗原-结合片段可以为与任意本文所述的抗体竞争结合KDR的一种，其为(i)特异性结合抗原，以及(ii)包含本文所公开的VH和/或VL结构域、或包含本文所公开的VHCDR3、或任意这些的变体。例如使用ELISA和/或通过将特异性报道分子标记至一种抗体(在其他未标记的抗体的存在下，能够检测所述抗体)，可容易地体内分析抗体之间的竞争，从而能够鉴定结合相同表位或重叠的表位的特异性抗体。因此，本文中提供特异性抗体或其抗原-结合片段，所述抗体或其抗原-结合片段包含与本文所述的抗体竞争结合KDR的人抗体抗原-结合部位。

在这点上，如本文所使用，术语“竞争”、″抑制结合″、和″阻断结合″(例如，涉及VEGF与KDR的结合的抑制/阻断或涉及抗-KDR抗体与KDR的结合的抑制/阻断)可交换地使用，以及涵盖部分和完全抑制/阻断。VEGF结合与KDR的抑制/阻断优选地减少或改变在没有抑制或阻断下当VEGF结合KDR时发生的细胞信号传递的正常水平或类型。抑制和阻断还旨在包括当接触如本文所公开的抗-KDR抗体时在VEGF与KDR的结合中相比于未接触抗-KDR抗体的配体的任何可测量的减少，例如，VEGF与KDR的阻断减少了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。

与可变区相比，免疫球蛋白的恒定区显示更少的序列多样性，并且负责结合大量天然蛋白，从而引发重要的生化反应。在人中，有五种不同种类的抗体，包括IgA(其包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括亚类IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)、和IgM。在这些抗体种类之间的显著特征是它们的恒定区，尽管微妙的差别可能存在于V区。

抗体的Fc区与大量Fc受体和配体相互作用，这赋予一系列重要的功能性能力，称为效应器功能。对于IgG，Fc区包含Ig结构域CH2和CH3以及引入CH2的N-末端铰链。对于IgG类的Fc受体的重要家族是Fcγ受体(FcγRs)。这些受体介导抗体间的通信和免疫系统的细胞的臂(cellular arm)(Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ravetch et al.，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290)。在人中，该蛋白家族包括FcγRI(CD64)(包括亚型FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc)；FcγRII(CD32)(包括亚型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc)；和FcγRIII(CD16)(包括亚型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2))(Jefferis et al.，2002，Immunol Lett 82：57-65)。这些受体典型地具有介导结合Fc的细胞外结构域、跨膜结构域、和可在细胞内介导一些信号传递事件的细胞内结构域。这些受体表达在各种免疫细胞中，包括单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、树突细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗氏细胞、天然杀伤(NK)细胞、和T细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应器细胞吸收至结合的抗原的部位，这典型地导致在细胞内信号传递事件和重要的后续免疫应答，例如炎症介质的释放、B细胞激活、胞吞、吞噬、和细胞毒素攻击。

介导细胞毒素的和吞噬细胞的效应器功能的能力是潜在的机制，通过该机制抗体破坏靶向的细胞。细胞-介导的反应(其中表达FcγRs的非特异性细胞毒素的细胞在靶细胞上识别出结合的抗体以及最终导致靶细胞的溶胞)被称作抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ghetie et al.，2000，Annu RevImmunol 18：739-766；Ravetch et al.，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290)。细胞-介导的反应(其中表达FcγRs的非特异性细胞毒素的细胞识别出在靶细胞上结合的抗体以及最终导致靶细胞的吞噬)被称作抗体依赖性细胞-介导的吞噬(ADCP)。所有FcγRs在Fc上结合相同的区域，在Cg2(CH2)结构域和前述铰链的N-终端下。该相互作用在结构上充分特征化(Sondermann et al.，2001，J Mol Biol 309：737-749)，以及已经解决结合人FcγRIIIb的细胞外的结构域的人Fc的一些结构(pdb登记码1E4K)(Sondermann et al.，2000，Nature 406：267-273)(pdb登记码1IIS和1IIX)(Radaev et al.，2001，J Biol Chem 276：16469-16477)。

对于FcγRs，不同IgG亚类具有不同的亲合力，IgG1和IgG3与受体的典型结合几乎优于IgG2和IgG4(Jefferis et al.，2002，Immunol Lett82：57-65)。在IgG Fc上所有FcγRs结合相同的区域，但是具有不同的亲和力：对于IgG1，高亲合力粘结剂(binder)FcγRI具有10^-8M^-1的Kd，然而低亲合力受体FcγRII和FcγRIII通常分别结合在10^-6和10^-5下。FcγRIIIa和FcγRIIIb的胞外结构域是96％一致的，然而FcγRIIIb没有细胞内信号传递结构域。而且，然而FcγRI、FcγRIIa/c、和FcγRIIIa是免疫复合物-触发的激活的正调节物，其特征在于具有细胞内结构域，所述细胞内结构域具有免疫受体络氨酸-基激活基序(ITAM)，FcγRIIb具有免疫受体络氨酸-基抑制基序(ITIM)，因此它是抑制的。因此，前者被称为激活受体，以及FcγRIIb被称为抑制受体。受体还在表达模式和在不同免疫细胞上表达水平上不同。复杂度的又一水平是在人蛋白组中大量FcγR多态现象的存在。具有临床意义的特别相关的多态现象是V158/F158FcγRIIIa。与F158同种异型相比，人IgG1以更大的亲合力结合V158同种异型。已经显示在亲合力中差别和推测其对ADCC和/或ADCP的作用为抗-CD20抗体利妥昔(rituximab)(IDEC Pharmaceuticals Corporation的注册商标)的功效的重要的决定因素。具有V158同种异型的患者较好地应答利妥昔治疗；然而，具有更低的亲合力F158同种异型的患者应答较差(Cartron et al.，2002，Blood 99：754-758)。大约10-20％的人是V158/V158纯合的；45％是V158/F158杂合的；以及35-45％的人是F158/F158纯合的(Lehmbecher et al.，1999，Blood 94：4220-4232；Cartron et al.，2002，Blood 99：754-758)。因此，80-90％的人是差的应答者(responder)，那是他们具有F158FcγRIIIa的至少一种等位基因。

Fc区也包括在补体串联的激活中。在精典的补体途径中，C1将它的C1q亚单位结合IgG或IgM的Fc片段，这已经形成具有抗原的复合物。在本发明的某些实施方案中，Fc区的修饰包含改变(增加或减少)如本文所述的KDR-特异性抗体的能力的修饰，从而激活补体系统(例如，参见美国专利7,740,847)。为了评估补体激活，可进行补体依赖性细胞毒性(CDC)分析(例如，参见Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods，202：163(1996))。

因此，在某些实施方案中，本发明提供具有修饰的Fc区的抗-KDR抗体，所述修饰的Fc区具有改变的功能性质，例如降低的或增强的CDC、ADCC、或ADCP活性；或对于特异性FcγR的增强的结合亲合力；或增加的血浆半衰期。本文涵盖的其他修饰的Fc区描述，例如，在发表的美国专利7,317,091；7,657,380；7,662,925；6,538,124；6,528,624；7,297,775；7,364,731；公开的美国专利US2009092599；US20080131435；US20080138344；和公开的国际申请WO2006/105338；WO2004/063351；WO2006/088494；WO2007/024249中。

因此，在某些实施方案中，使具有期望的结合特异性的抗体可变结构域融合免疫球蛋白恒定结构域序列。在某些实施方案中，融合使用Ig重链恒定结构域，所述Ig重链恒定结构域包含至少一部分的铰链、C_H2、和C_H3区。优选具有含有存在于至少一种融合中的轻链结合必要的部位的第一重-链恒定区(C_H1)。将编码免疫球蛋白重链融合的DNA和如果需要的免疫球蛋白轻链插入单独的表达载体，并且将其共同-转染至合适的宿主细胞内。当在结构中使用的三个多肽链的不相等的比率提供期望的双特异性抗体的最佳产率时，在调节实施方案中三个多肽片段的共同性质中这提供更大的灵活性。然而，当以相等比率至少两个多肽链的表达导致高产率时，或当比率对于期望链组合的产率不具有重要影响时，可能将对于两个或所有三个多肽链编码序列插入单一表达载体内。

还可将本发明的抗体(和抗原-结合片段及其变体)修饰以包括表位标签或标记，例如，用于纯化或诊断应用中。有许多本领域已知的连接基团用于制备抗体缀合物，包括例如公开在美国专利No.5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1，和Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)的那些。连接基团包括如在上述专利中所公开的二硫基、硫醚基、酸性不稳定基团、对光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，优选二硫化物和硫醚基。

在另一涵盖的实施方案中，可使如本文所述的KDR-特异性抗体缀合或可操作地连接至另一治疗化合物，本文称为缀合物。缀合物可以为细胞毒素剂、化疗剂、细胞因子、抗-血管生成的剂、酪氨酸激酶抑制剂、毒素、放射性同位素、或其他治疗活性剂。化疗剂、细胞因子、抗-血管生成的剂、酪氨酸激酶抑制剂、和其他治疗剂已经描述如上，并且所有这些前述治疗剂可发现用作抗体缀合物。

在可交替的实施方案中，使抗体与毒素(包括但不限于小分子毒素和细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体)缀合或可操作地连接。小分子毒素包括但不限于皂草素(saporin)(Kuroda K，etal.，The Prostate 70：1286-1294(2010)；Lip，WL.et al.，2007 MolecularPharmaceutics 4：241-251；Quadros EV.，et al.，2010 Mol Cancer Ther；9(11)；3033-40；Polito L.，et al.2009British Journal of Haematology，147，710-718)、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美国专利No.5,208,020)、单端孢霉烯毒素(trichothene)、和CC1065。毒素包括但不限于：RNase，白树毒素(gelonin)、炔二烯、蓖麻毒、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素(PE40)、迟钝志贺氏菌、产气荚膜梭菌毒素、和美洲商陆抗病毒蛋白。

在一个实施方案中，使本公开的抗体或其抗原-结合片段缀合至美登木素分子。美登木素是通过抑制微管蛋白聚合来作用的有丝分裂的抑制剂。美登木素首先从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)(美国专利No.3,896,111)中分离。最终，发现某些细菌也产生美登木素，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物公开，例如在美国专利No.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533。含有美登木素的免疫缀合物和它们的治疗用途公开在例如美国专利No.5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP 0425235B1.Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述包含命名为DM1的美登木素的免疫缀合物，所述DM1连接单克隆抗体C242，将单克隆抗体C242定向对抗人结肠直肠癌。对于培养的直肠癌细胞发现缀合物为高细胞毒素的，并且在体内肿瘤生长分析中缀合物显示抗肿瘤活性。

在没有显著降低抗体或美登木素分子的生物活性下，通过化学连接抗体与美登木素分子来制备抗体-美登木素缀合物。在没有消极影响抗体的功能或溶解性下，3-4个缀合的美登木素分子的平均值/抗体分子已经显示在靶细胞的增强的细胞毒性中功效，尽管在使用裸抗体(naked antibody)期间，甚至预期一分子的毒素/抗体增强细胞毒性。美登木素是本领域众所周知的，并且通过已知的技术能够合成或从植物来源来分离。合适的美登木素公开在例如美国专利No.5,208,020和在参照本文上述的其他专利和非专利公开中。优选的美登木素是美登醇和在芳香环中修饰的美登醇类似物、或美登醇分子的其他位置处，例如各种美登醇酯。

另一目标缀合物包含缀合至一个或多个卡奇霉素分子的抗体。抗体的卡奇霉素家族能够在亚-皮摩尔(sub-picomolar)浓度下产生双链的DNA断裂。还可使用的卡奇霉素的结构类似物(Hinman et al.，1993，CancerResearch 53：3336-3342；Lode et al.，1998，Cancer Research 58：2925-2928)(美国专利No.5,714,586；美国专利No.5,712,374；美国专利No.5,264,586；美国专利No.5,773,001)。诸如auristatin E(AE)和monomethylauristatin E(MMAE)的多拉司他汀(Dolastatin)10类似物可发现用作最近公开的抗体、或其变体的缀合物(Doronina et al.，2003，Nat Biotechnol 21(7)：778-84；Francisco et al.，2003Blood 102(4)：1458-65)。有用的酶活性毒素包括但不限于：白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、垂序商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、依诺霉素、和单端孢霉菌烯醇(tricothecene)。例如，参见PCT WO 93/21232。本公开进一步涵盖其中在如本文所述的KDR-特异性抗体和具有核溶解活性的化合物之间形成缀合物或融合的实施方案，例如核糖核酸酶或诸如脱氧核糖核酸酶(DNase)的DNA核酸内切酶。

在可交替的实施方案中，可将本文-所公开的抗体缀合或可操作地连接放射性同位素，从而形成放射性缀合物。可获得各种放射性同位素用于制备放射性缀合物抗体。例子包括但不限于⁹⁰Y、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At和²¹²Bi。

在某些其他的实施方案中，可使本文所述的抗体缀合至治疗部分，例如细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性元素(α-辐射源、γ-辐射源等)。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害的任何药剂。例子包括紫杉醇/紫杉醇(paclitaxol)、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺红菌素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素及其类似物或同系物。一种优选的示例性细胞毒素是皂草素(从Advanced Targeting Systems，San Diego，CA可获得)。治疗剂包括但不限于：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)；烷化剂(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)、和环己亚硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、和顺式二氯二氨合铂(II)(DDP)顺氯氨铂)、蒽环霉素(例如道诺红菌素(原来为daunomycin)和阿霉素)，抗生素(例如更生霉素(原来为actinomycin)，争光霉素，光神霉素和氨茴霉素(AMC)以及抗-有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。

而且，在某些实施方案中，KDR-特异性抗体(包括本文提供的其功能片段，例如抗原-结合片段)可缀合治疗部分，例如用于缀合放射金属离子的放射性材料或大环螯合剂。在某些实施方案中，大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子附接抗体。这种接头分子是本领域熟知的，并且描述于Denardo et al.，1998，ClinCancer Res.4：2483-90；Peterson et al.，1999，Bioconjug.Chem.10：553；和Zimmerman et al.，1999，Nucl.Med.Biol.26：943-50。

在又一实施方案中，抗体可缀合″受体″(例如链酶亲和素)以用于肿瘤的预定位，其中抗体-受体缀合物施用至患者，然后使用清除剂从循环系统中除去未结合的缀合物，接着施用为缀合细胞毒素剂(例如放射性核苷酸)的″配体″(例如抗生物素蛋白)。在可交替的实施方案中，抗体缀合或可操作地连接酶以应用抗体依赖性酶介导的前药疗法(ADEPT)。ADEPT可以通过下列方式来使用：使抗体缀合或可操作地连接至激活前药的酶，该酶使前药(例如肽基化疗剂，参见PCT WO 81/01145)转化为活性抗癌药物。例如参见PCT WO 88/07378和美国专利No.4,975,278。用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包括能够以这样的方式作用于前药的任何酶，该方式为使其转化为更加活性细胞毒素形式。用于这些方法和相关实施方案的酶包括但不限于：用于将含有磷酸酯的前药转化为游离药物的碱性磷酸酯酶；用于将含有硫酸酯的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将非毒性5-氟胞嘧碇转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧碇脱氨酶；用于将含有肽的前药转化为游离药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)；用于转化含有D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰基羧基肽酶；用于将糖基化前药转化为游离药物的糖类-裂解酶，例如-半乳糖苷酶和神经氨糖酸苷酶；用于将使用-内酰胺衍生化的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；以及用于将在它们的胺的氮处分别使用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生化的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗体，在本领域中也称为″抗体酶″，可用于将前药转化为游离活性药物(例如参见Massey，1987，Nature 328：457-458)。抗体-抗体酶缀合物可以制备以用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。

免疫缀合物可以使用各种双功能性蛋白偶联剂来制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯的双功能性衍生物(例如己二亚氨二盐酸二甲酯)，活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(例如戊二醛)，双-叠氮基化合物(例如双(p-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(例如双-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。特定偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基巯基)戊酸酯(SPP)以提高二硫化物连接。接头可以是促进一种或多种可裂解的组分释放的“可裂解的接头”。例如，可以使用酸-不稳定性接头(Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

本文还涵盖本发明的抗体(和多肽)的其他修饰。例如，抗体可以连接至各种非蛋白高分子中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化亚烷基、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体还可以包封在微囊中，其例如通过在胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊)或大乳(macroemulsion)中凝聚技术或界面聚合(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)。这些技术公开于Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)。

如本文所使用的，“媒介物”包括在使用的剂量和浓度下对暴露的细胞或哺乳动物是非毒性的药学上可接受的媒介物、赋形剂或稳定剂。通常生理上可接受的媒介物是水性pH缓冲溶液。生理上可接受的媒介物包括缓冲盐，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性高分子例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯20(TWEEN^TM)聚乙二醇(PEG)和泊洛沙姆(PLURONICS^TM)等。

抗-KDR抗体的期望功能性能可以使用熟练技术人员已知的各种方法来评价：亲合力/结合测定(例如表面等离子共振、竞争性抑制测定)；细胞毒性测定、细胞活力测定、响应于VEGF的细胞增殖或分化测定(例如磷酸化测定)、使用体外或体内模型抑制癌细胞和/或肿瘤生长。其他测定可以测试本文所述的抗体阻断正常VEGF/KDR-介导的应答的活性，例如但不限于KDR的磷酸化、血管生成和内皮细胞增殖。本文所述的抗体也可以被测试以对于KDR受体内化、体外和体内效果等的作用。在进一步的实施方案中，本文抗体可使用合适的动物模型体内测试。本文所述的抗体可体外或体内测试它们抑制肿瘤生长的能力。这些测定可以使用熟练技术人员已知的良好建立的方案来进行(例如参见Current Protocols in MolecularBiology(Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY)；Current Protocols in Immunology(Edited by：John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，Warren Strober 2001 JohnWiley & Sons，NY，NY)；或市售试剂盒。

在某些实施方案中，本发明还提供编码如本文所述的抗体或其抗原-结合片段的分离的核酸，例如编码如本文所述的CDR或者VH或VL结构域的核酸。核酸包括DNA和RNA。这些和相关的实施方案可包括编码结合如本文所述的KDR的抗体的多核苷酸。如本文所使用的，术语″分离的多核苷酸″意思为基因组、cDNA或合成源或一些其组合的多核苷酸，通过其源，分离的多核苷酸(1)不关联于其中天然发现分离的多核苷酸的多核苷酸的所有或一部分，(2)连接至多核苷酸，所述多核苷酸天然是未连接的，或(3)在天然下不作为更大序列的一部分而产生。

术语″可操作地连接″是指该术语应用的组分处于这样的关系，其使它们在合适的条件下实施它们内在的功能。例如，″可操作地连接″至蛋白编码序列的转录控制序列与其绑扎，使得蛋白编码序列的表达在和控制序列的转录活性相容的条件下实现。

如本文所使用的，术语″控制序列″是指多核苷酸序列，其可以影响它们绑扎或可操作地连接的编码序列的表达、加工或细胞内定位。这些控制序列的性质可取决于宿主微生物。在特定的实施方案中，用于原核生物的转录控制序列可以包括启动子、核糖体结合部位和转录终止序列。在其他特定的实施方案中，用于真核生物的转录控制序列可以包括启动子，包含用于转录因子、转录增强子序列、转录终止序列和聚腺苷酸化序列的一个或多个识别部位。在某些实施方案中，″控制序列″可以包括前导区序列和/或融合配偶序列。

本文涉及的术语″多核苷酸″是指单链或双链的核酸高分子。在某些实施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、或者核苷酸任一类型的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰例如溴尿核苷、核糖修饰例如阿拉伯糖苷和2′，3′-二脱氧核糖、以及内核苷酸连接修饰例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，phosphoroselenoate，phosphorodiselenoate，phosphoroanilothioate，phoshoraniladate和氨基磷酸酯。术语″多核苷酸″特别包括单链和双链形式的DNA。

术语″天然存在的核苷酸″包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语″修饰的核苷酸″包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。术语″寡核苷酸连接″包括寡核苷酸连接，例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，phosphoroselenoate，phosphorodiselenoate，phosphoroanilothioate，phoshoraniladate，氨基磷酸酯等。例如参见LaPlanche et al.，1986，Nucl.Acids Res.，14：9081；Stec et al.，1984，J.Am.Chem.Soc.，106：6077；Stein etal.，1988，Nucl.Acids Res.，16：3209；Zon et al.，1991，Anti-Cancer DrugDesign，6：539；Zon et al.，1991，OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES：A PRACTICAL APPROACH，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.)，Oxford UniversityPress，Oxford England；Stec et al.，美国专利No.5,151,510；Uhlmann andPeyman，1990，Chemical Reviews，90：543，出于任何目的，其公开通过引用的方式并入此处。寡核苷酸可包括可检测的标记以能够检测寡核苷酸或其杂交。

术语″载体″用于是指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。术语″表达载体″是指这样的载体，其适于转化宿主细胞，并且含有指导和/或控制插入的异源性核酸序列的表达的核酸序列。表达包括但不限于加工，例如转录、翻译和RNA剪接(如果存在内含子)。

如本领域技术人员理解的是，多核苷酸可包括基因组序列、外-基因组和质粒-编码的序列、以及更小的工程化的基因区段(其表达或可适于表达蛋白、多肽、肽等)。这些区段可以是天然分离的，或被熟练技术人员合成修饰的。

本领域技术人员还认识到的是，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子可包括：HnRNA分子，其含有内含子并且以单对单方式对应于DNA分子；和mRNA分子，其不含内含子。另外编码或非编码序列可以但非必需存在于根据本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但非必需连接其他分子和/或负载材料。多核苷酸可以包含天然序列或可以包含编码这种序列的变体或衍生物的序列。

因此，根据这些和相关的实施方案，本公开还提供编码本文所述的抗-KDR抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，提供包含编码如本文所述的抗体的多核苷酸序列中的一些和全部的多核苷酸、以及这种多核苷酸的组分。

在其他相关的实施方案中，多核苷酸变体可以和编码本文所述的抗-KDR抗体的多核苷酸序列具有基本上的一致性。例如，使用本文所述的方法(例如如下面所述，使用标准参数的BLAST分析)，多核苷酸可以是多核苷酸，包含相比于参比多核苷酸序列(例如编码本文所述的抗体的序列)具有至少70％序列一致性，优选至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％或更高的序列一致性。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子退化、氨基酸类似性、阅读框定位等，这些数值可以合适的调节以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的对应的一致性。

典型地，多核苷酸变体将含有一种或多种取代、增加、缺失和/或插入，优选使得相对于由本文特异性阐述的多核苷酸序列编码的抗体，由变体多核苷酸编码的抗体的结合亲合力并未实质上减弱。

在某些其他相关的实施方案中，多核苷酸片段可以包含或者基本上由下列构成：各种长度的连续序列延续，其等同于或互补于编码如本文所述的抗体的序列。例如，提供多核苷酸，包含或者基本上由下列构成：至少约5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，200，300，400，500或1000或更多个连续核苷酸序列，其编码本文所公开的抗体或其抗原-结合片段以及它们之间的所有的中间长度。在上下文中，容易理解″中间长度″是指引用数值之间的任何长度，例如50，51，52，53等；100，101，102，103等；150，151，152，153等；包括200-500之间的所有整数；500-1,000等。本文所述多核苷酸序列可以在一端或两端通过天然序列中未发现的另外核苷酸而延伸。该另外序列可以由下列构成：在编码本文所述的抗体的多核苷酸的任一端处或者编码本文所述的抗体的多核苷酸的两端处的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个核苷酸。

在另一实施方案中，提供多核苷酸，其能够在中度至高度严格条件下杂交编码本文提供的抗体或其抗原-结合片段的多核苷酸序列、或其片段、或其互补序列。杂交技术是分子生物学领域熟知的。为了描述，用于测试本文提供的多核苷酸和其他多核苷酸杂交的合适的中度严格条件包括在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-60℃，5X SSC下杂交过夜；接着在65℃下分别使用含有0.1％SDS的2X，0.5X和0.2X SSC洗涤两次20分钟。本领域技术人员将理解，杂交的严格程度可以容易地操纵，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一实施方案中，合适的高度严格的杂交条件包括上述那些，除了杂交温度升高至例如60℃-65℃或65℃-70℃。

在某些实施方案中，上述多核苷酸，例如多核苷酸变体、片段和杂交序列、结合KDR的编码抗体或其抗原-结合片段。在其他实施方案中，这些编码抗体或抗原-结合片段或其CDR的多核苷酸结合KDR至少约50％、至少约70％，并且在某些实施方案中，至少约90％、以及本文具体阐述的抗体序列。在进一步的实施方案中，这些编码抗体或抗原-结合片段或其CDR的多核苷酸以比本文阐述的抗体更大的亲合力结合KDR，例如，以至少约105％，106％，107％，108％，109％或110％、以及本文具体阐述的抗体序列定量地结合。

如本文其他部分所述，代表性多肽(例如，本文提供的变体KDR-特异性抗体，例如具有本文提供的抗原-结合片段的抗体蛋白)的三维结构的确定可以通过常规方法来确定，使得一种或多种氨基酸取代、增加、缺失或插入选择的天然或非天然氨基酸可以事实上建模，以为了确定是否这样衍生的结构变体保留目前公开的物种的空间充填性能。熟练技术人员已知各种计算机程序来确定抗体内合适的氨基酸取代(或编码氨基酸序列的合适的多核苷酸)，使得例如保持亲合力或实现更佳亲合力。

本文所述的多核苷酸或其片段，无论编码序列本身的长度，可以联合其他DNA序列，例如启动子、聚腺苷酸化信号、另外限制性内切酶位点、多克隆位点、其他编码区段等，使得它们的总长度可以较大的改变。因此涵盖，可以使用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选被制备的容易性和在预期重组DNA方案中的用途限定。例如，涵盖总长度约10,000，约5000，约3000，约2,000，约1,000，约500，约200，约100，约50个碱基对长度等(包括所有中间长度)的示意性多核苷酸区段是有用的。

当比较多核苷酸序列时，如下面所述当比对最大相应时，如果两种序列中的核苷酸序列是相同的，则两种序列据称是“相同的”。两种序列之间的比较典型地通过下列方式进行：相对于比较窗比较序列，以鉴定和比较序列类似的局部区域。如本文所使用，“比较窗”是指至少约20个、30至约75、40至约50个连续位置的区段，其中在两种序列最佳比对后，序列可以比较相同数量的连续位置的参比序列。

为了比较，序列的最佳比对可以使用bioinformatics软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Lasergene suite中的Megalign程序、利用缺省参数来进行。该程序实现下列参考文献中所述的数种比对图：Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distantrelationships.In Dayhoff，M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，pp.345-358；Hein J.，Unified Approach to Alignment and Phylogenes，pp.626-645(1990)；Methods in Enzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G and Sharp，P.M.，CABIOS 5：151-153(1989)；Myers，E.W.andMuller W.，CABIOS4：11-17(1988)；Robinson，E.D.，Comb.Theor 11：105(1971)；Santou，N.Nes，M.，Mol.Biol.Evol.4：406-425(1987)；Sneath，P.H.A.and Sokal，R.R.，Numerical Taxonomy-the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA(1973)；Wilbur，W.J.and Lipman，D.J.，Proc.Natl.Acad.，Sci.USA 80：726-730(1983)。

或者，为了比较，序列的最佳比对可以通过下列方式来进行：Smith andWaterman，Add.APL.Math 2：482(1981)的局部一致性算法、Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的一致性比对算法、Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的类似方法的查询、这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA)或通过检查。

适于确定序列一致性和序列类似性百分比的一种算法的优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.，Nucl.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。BLAST和BLAST 2.0例如可以使用本文所述的参数以确定两种或多种多核苷酸之间的序列一致性百分比。进行BLAST分析的软件通过NationalCenter for Biotechnology Information公共可得。在一个示意性例子中，对于核苷酸序列，累积得分可以使用参数M(对于一对匹配残基奖励分数；一直＞0)和N(对于失配残基惩罚分数；一直＜0)来计算。当累计比对评分从其达到的最大值下降数量X时；当累计评分由于累积一个或多个负分残基比对而下降到零或以下时；当达到二序列之一的未端时；停止各方向命中词的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定了该算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值词长(W)为11，期望值(E)为10，BLOSUM 62评分矩阵(见Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对，B为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并比较两条链。

在某些实施方案中，对于两个序列最佳比对，“序列一致性百分比”的测定宜通过比较最佳比对的两序列的至少20个位置的比较窗口，该比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分与参比序列(不含有添加或缺失)相比可含有20％或不到、通常5-15％或10-12％的添加或缺失(即空格)。计算此百分比通过测定核酸碱基相同的位置数目，产生匹配位置的数目，将该匹配位置数目除以参比序列的位置总数(即窗口大小)，再乘以100，得出序列一致性百分比。

本领域技术人员意识到的是，由于基因编码的退化，存在多种编码如本文所述的抗体的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些具有和编码结合KDR的抗体的天然或初始多核苷酸序列的核苷酸序列的最小的序列一致性。然而，本公开明确地涵盖由于密码子用途的差别而改变的多核苷酸。在某些实施方案中，特异性涵盖密码子优化以用于哺乳动物表达的序列。

因此，在本发明的另一实施方案中，突变方案例如定点突变可以用于制备本文所述的抗体的变体和/或衍生物。通过该方案，多肽序列中的特异性修饰可以通过构成它们的潜在多核苷酸的突变而进行。这些技术提供简单方案以制备和测试序列变体，例如，通过将一个或多个核苷酸序列改变引入多核苷酸而并入一种或多种上述考虑。

定点突变通过利用特定寡核苷酸序列产生突变体，该突变体编码具有所需突变的DNA序列，足够数目的毗邻核苷酸提供足够大小和序列复杂性的引物序列，以形成横跨缺失连接区两侧的稳定双链体。利用所选多核苷酸序列中的突变提高、改变、降低、修饰或改变该多核苷酸本身的性能和/或改变其编码多肽的性能、活性、组成、稳定性或一级序列。

在某些实施方案中，本发明涵盖编码本文所公开的抗体或其抗原-结合片段的多核苷酸序列的突变，以改变编码的多肽的一种或多种性能，例如抗体或其抗原-结合片段的结合亲合力、或特定Fc区的功能、或特定FcγR的Fc区的亲合力。定点突变技术是本领域熟知的，并且广泛用于产生多肽和多核苷酸的变体。例如，定点突变通常用于改变DNA分子的特异性部分。在这些实施方案中，使用典型地包含约14至约25个核苷酸或这样长度的引物，在序列交点的两侧上约5至约10个残基改变。

本领域技术人员意识到的是，定点突变技术常采用单链和双链形式的噬菌体载体。用于定点突变的典型载体包括载体例如M13噬菌体。这些噬菌体是容易市售获得的，其用途一般为本领域技术人员熟知。定向的突变也常规采用双链质粒来取消将目标基因从质粒转移到噬菌体的步骤。

通常，进行上述定点突变的第一步是获得单链载体或使双链载体的两条链解离分开(在其序列内含有编码所需肽的DNA序列)。制备携带有所需突变复序列的寡核苷酸引物(用合成法)。然后使该引物与单链载体退火结合，经DNA聚合酶例如E.coli聚合酶I Klenow片段作用，完成含突变链的合成。因此，形成的异质双链体中一条链编码初始非突变序列，第二条链含有所需的突变。然后用此异质双链体载体转化合适的细胞如大肠杆菌细胞，并选择含有携带突变序列重组载体的克隆。

用定点突变法制备所选肽编码DNA区段的序列变体提供一种产生可能有用序列的方法，但不意味着限于用这些方法来获得肽的序列变体及其编码DNA序列。例如可用突变剂如羟胺处理编码所需肽序列的重组载体以获得序列变体。关于这些方法和方案的具体细节见Maloy et al.，1994；Segal，1976；Prokop and Bajpai，1991；Kuby，1994；和Maniatis et al.，1982的教导，处于各种目的，其通过引用的方式并入。

如本文所使用，术语“寡核苷酸定向的突变过程”是指模板依赖过程和载体介导的增殖将导致特异性核酸分子的浓度比其初始浓度升高，或可检测信号如扩增物的浓度升高。如本文所使用，术语“寡核苷酸定向的突变过程”是指模板依赖的引物分子延伸过程。术语模板依赖分子指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链序列由熟知的互补性碱基配对规律所决定(例如参见，Watson，1987)。典型地，载体介导的方法涉及将核酸片段导入DNA或RNA载体中，克隆扩增此载体，回收扩增的核酸片段。这些方法的例子由美国专利No.4,237,224提供，其通过引用的方式全部特异地并入本文。

在制备多肽变体的另外方案中，可以使用美国专利No.5,837,458中所述的递归序列重组。在该方案中，进行重组和筛选或选择的迭代循环以“进化”具有例如增强的结合亲合力的单独多核苷酸变体。某些实施方案还提供质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含如本文所述的至少一种多核苷酸。

在许多实施方案中，编码题述单克隆抗体的核酸直接引入宿主细胞，并且在足以诱导编码的抗体表达的条件下将细胞孵育。该公开的抗体使用本领域技术人员熟知的标准技术联合本文提供的多肽和核酸序列来制备。多肽序列可用于确定编码本文公开的特定抗体的合适的核酸序列。根据本领域技术人员熟知的标准方法，核酸序列可以优化以反映各种表达系统的特定密码子″偏好″。

根据某些相关的实施方案，提供重组宿主细胞，其包含如本文所述的一种或多种构建体；编码任何抗体，CDR，VH或VL结构域、或其抗原-结合片段的核酸；和制备编码的产物的方法，该方法包括将其编码的核酸进行表达。可以通过在合适条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来便利地实现表达。在表达制备后，抗体或其抗原-结合片段可以使用任何合适的技术分离和/或纯化，然后根据需要使用。

本文提供的抗体或其抗原-结合片段、和编码核酸分子与载体可以例如从它们天然环境以基本上纯或同源形式分离和/或纯化，或在核酸的情况下不含或基本上不含除了编码具有期望功能的多肽的序列的核酸或源基因。核酸可以包含DNA或RNA并且可以全部或部分是合成的。涉及本文阐述的核苷酸序列时包括具有特定序列的DNA分子，并且包括具有特定序列的RNA分子，其中U取代T，除非另外需要说明。

多肽在各种不同宿主细胞中克隆和表达的系统是熟知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。用于表达异源性多肽的哺乳动物细胞系是本领域可得的，包括中国仓鼠卵细胞、HeLa细胞、幼地鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞和多种其他者。通常优选的细菌宿主是E.coli。

抗体和抗原-结合片段在原核细胞例如E.coli中的表达是本领域熟知的。为了综述，例如参见Pluckthun，A.Bio/Technology 9：545-551(1991)。本领域技术人员也可得在培养基中的真核细胞中表达作为抗体或其抗原-结合片段的制备的选择，参见近年来综述，例如Ref，M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4：573-576；Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。

合适的载体可被选择或构建，含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标志物基因和其他序列(如果需要)。载体可以是质粒、病毒例如噬菌体、或噬菌粒(如果需要)。为了进一步细节，例如参见Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition，Sambrook et al.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于操纵核酸的多种已知技术和方案，例如在核酸构建体制备中、突变、测序、将DNA引入细胞和基因表达、以及蛋白分析详细描述于Molecular Biology，SecondEdition，Ausubel et al.eds.，John Wiley & Sons，1992中目前方案中或随后更新中。

术语″宿主细胞″用于表示其中已经引入或能够引入编码一种或多种本文所述抗体的核酸序列的细胞，其进一步表达或能够表达选择的目标基因，例如编码任何本文所述抗体的基因。该术语包括亲本细胞的后代，无论是否该后代在形态学上或基因构成上相同于初始亲本，只要选择的基因存在即可。因此，还涵盖包括将这些核酸引入宿主细胞的方法。该引用可使用任何可得技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖，电穿孔，使用逆转录酶病毒或其他病毒(例如牛痘)的脂质体-介导的转染和转导，对于昆虫细胞为杆状病毒。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化，电穿孔和使用噬菌体的转染。引入后面是引起或允许核酸表达，例如在用于基因表达的条件下培养宿主细胞。在一个实施方案中，核酸引入宿主细胞的基因组(例如染色体)中。依照标准方法，通过包括促进和基因组重组的序列来促进引入。

在某些实施方案中，本发明还提供这样的方法，其包括在表达系统中使用上述构建体以表达特定多肽，例如如本文所述的KDR-特异性抗体。术语″转导″用于表示将基因从一种细菌转移至另一种，通常通过噬菌体。″转导″还是指通过逆转录酶病毒来获取和转移真核细胞序列。术语″转染″用于表示外部或外源性DNA被细胞的摄取，并且当外源性DNA引入到膜内时细胞被″转染″。多种转染技术是本领域熟知的，并且是本文所公开的。例如，参见Graham et al.，1973，Virology 52：456；Sambrook et al.，2001，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring HarborLaboratories；Davis et al.，1986，BASIC METHODS 1N MOLECULARBIOLOGY，Elsevier；和Chu et al.，1981，Gene 13：197。这些技术可用于将一种或多种外源性DNA部分引入合适的宿主细胞中。

如本文所使用的，术语″转化″是指细胞的基因特性的变化，并且当其被修饰以含有新DNA时，细胞已经转化。例如，如果其被从其天然状态基因修饰，细胞被转化。在转染或转导后，转化DNA可以通过物理引入到细胞的染色体中而和其细胞的DNA重组，或者可临时保持为游离基因元件而不会被复制，或者可作为质粒独立地复制。当DNA被细胞的部分复制时，细胞被认为已经被稳定地转化。当结合生物材料(如核酸分子、多肽、宿主细胞等)使用时术语″天然存在的″或″天然″是指在天然中发现和不被人操纵的材料。类似地，如本文所使用的，″非天然存在的″或″非天然″是指材料未在天然中发现或已经被人结构修饰或合成。

术语″多肽″、″蛋白″和″肽″以及″糖蛋白″互换地使用，并且是指不限定任何特定长度的氨基酸高分子。术语不排除修饰，例如十四烷基化、硫酸化、糖基化、磷酸化以及信号序列的增加或缺失。术语″多肽″或″蛋白″是指一个或多个氨基酸链，其中各链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白可包括非共价和/或通过肽键共价连接多个链，其具有天然蛋白序列，即蛋白通过天然存在和特异地非重组细胞、或基因工程化或重组细胞产生，并且包含具有天然蛋白的氨基酸序列的分子、或缺失、增加和/或取代一个或多个天然序列氨基酸的分子。术语″多肽″和″蛋白″特定地包括结合本公开的KDR的抗体，或缺失、增加和/或取代一个或多个抗-KDR抗体的氨基酸的序列。因此，″多肽″或″蛋白″可以包含一个(称为″单体″)或多个(称为″高分子″)氨基酸链。

本文涉及的术语″分离的蛋白″是指题述蛋白(1)不含至少一些其他典型地在天然中发现的蛋白，(2)基本上不含来自相同源的其他蛋白，例如来自相同物种的蛋白，(3)通过来自不同物种的细胞表达，(4)从其本质上相关联的至少约50％的多核苷酸、脂质、糖类或其他材料中分离，(5)不相关联(共价或非共价相互作用)一部分蛋白(″分离的蛋白″本质上相关联)，(6)可操作地关联(共价或非共价相互作用)本质上不关联的多肽，或(7)天然不会产生。这种分离的蛋白可以由基因组DNA，cDNA，mRNA或其他RNA编码，其可以是合成源或任何组合。在某些实施方案中，分离的蛋白基本上不含在其天然环境中发现的蛋白或多肽或其他污染物，其将干扰使用(治疗、诊断、预防、研究或其他)。

术语″多肽片段″是指可以是单体或高分子的多肽，其氨基-末端缺失，羧基-末端缺失，和/或内部缺失或取代天然存在的或重组制备的多肽。在某些实施方案中，多肽片段可包含至少5至约500个氨基酸长度的氨基酸链。在某些实施方案中，将意识到的是，片段至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，150，200，250，300，350，400或450个氨基酸长度。特定有用的多肽片段包括功能结构域，包括抗体的抗原-结合结构域或片段。在抗-KDR抗体的情况下，有用的片段包括但不限于：CDR区，特别是重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变区；一部分抗体链或仅仅其可变区(包括两个CDR)等。

多肽可以在蛋白的N-终端包含信号(或前导区)序列，其共翻译地或后翻译地定向转移蛋白。多肽还可以框内融合或缀合接头或其他序列以易于合成、纯化或鉴别多肽(例如聚-His)，或增强多肽和固体载体的结合。

肽接头/间隔物序列还可用于通过足以确保各多肽折叠为其二级和/或三级结果(如果需要)的距离来分离多种多肽组分。这种肽接头序列可以使用本领域熟知的标准技术来引入融合多肽中。

某些肽间隔物序列可以例如基于下列来选择：(1)采用灵活延伸的构象的能力；(2)采用可以和第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构的它们的能力；和/或(3)缺少可以和多肽功能性表位反应的疏水性或带电残基。

在一个示意性实施方案中，肽间隔物序列含有例如Gly，Asn和Ser残基。其他邻近中性氨基酸例如Thr和Ala也可以包括在间隔物序列中。

可以有用地用作间隔物的其他氨基酸序列包括Maratea et al.，Gene40：39 46(1985)；Murphy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258 8262(1986)；美国专利No.4,935,233和美国专利No.4,751,180中公开的那些。

其他示意性间隔物可以包括例如Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(Chaudhary et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(Bird et al.，1988，Science 242：423-426)。

在一些实施方案中，当第一和第二多肽具有非必需N-末端氨基酸区域(可用于分离功能结构域和防止位阻影响)时，不需要间隔物序列。两种编码序列可以直接融合而没有任何间隔物或使用挠性聚接头(例如由重复1至3次的五聚体Gly-Gly-Gly-Gly-Ser构成)。这种间隔物用于通过下列方式来构建单链抗体(scFv)：插入在VH和VL之间(Bird et al.，1988，Science242：423-426；Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5979-5883)。

在某些实施方案中，肽间隔物被设计为能够在形成单链抗体的可变区的两个β-片之间进行正确的相互作用。

在某些示意性实施方案中，肽间隔物为1至5个氨基酸、5至10个氨基酸、5至25个氨基酸、5至50个氨基酸、10至25个氨基酸、10至50个氨基酸、10至100个氨基酸、或任何干扰范围的氨基酸。

在其他示意性实施方案中，肽间隔物包含约1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50或更长氨基酸的长度。

涵盖本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可以期望改善抗体的结合亲合力和/或其他生物学性能。例如，抗体的氨基酸序列变体可通过下列方式来制备：将合适的核苷酸变化引入编码抗体或其A链的多核苷酸，或肽合成。这种修饰包括例如在抗体的氨基酸序列内缺失和/或插入和/或取代残基。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终的抗体，条件是最终构建体具有期望特性(例如和KDR的高亲合力结合)。氨基酸变化还可以改变抗体的后翻译过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。用于本发明多肽的上述任何变化和修饰可包括在本发明的抗体中。

本公开提供本文所公开的抗体的变体。在某些实施方案中，这些变体抗体或抗原-结合片段、或其CDR结合KDR至少约50％，至少约70％，并且在某些实施方案中，至少约90％、以及本文具体阐述的抗体序列。在进一步的实施方案中，这些变体抗体或抗原-结合片段、或其CDR以比本文阐述的抗体更大的亲合力结合KDR，例如以至少约105％，106％，107％，108％，109％或110％、以及本文具体阐述的抗体序列定量地结合。

在特定的实施方案中，题述抗体可具有：a)氨基酸序列和本文所述的抗-KDR抗体的重链可变区具有至少80％一致性，至少95％一致性，至少90％，至少95％或至少98％或99％一致性的重链可变区；和b)氨基酸序列和本文所述的抗-KDR抗体的轻链可变区具有至少80％一致性，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％或99％一致性的轻链可变区。示意性重链和轻链区域的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO：1，2，9和10。

在特定的实施方案中，抗体可包含：a)重链可变区包含：i.氨基酸序列和本文所述的选择的抗体的重链CDR1区相同的CDR1区；ii氨基酸序列和选择的抗体的重链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列和选择的抗体的重链CDR3区相同的CDR3区；以及b)轻链可变结构域，包含：i.氨基酸序列和选择的抗体的轻链CDR1区相同的CDR1区；ii.氨基酸序列和选择的抗体的轻链CDR2区相同的CDR2区；和iii.氨基酸序列和选择的抗体的轻链CDR3区相同的CDR3区；其中抗体特异性结合选择的靶(例如KDR)。在进一步实施方案中，抗体或其抗原-结合片段是变体，抗体，其中变体包含除了VH和VL区的CDR区中的至多8，9，10，11，12，13，14，15或更多个氨基酸取代和选择的抗体相同的重链和轻链。在这点上，在选择的抗体的CDR区中可以是1，2，3，4，5，6，7，8个，或者在某些实施方案中9，10，11，12，13，14，15更多个氨基酸取代。VH和/或VL区的CDR中可进行取代(例如参见Muller，1998，Structure 6：1153-1167)。

代表性多肽(例如，本文提供的变体KDR-特异性抗体、本文提供的具有抗原-结合片段的抗体蛋白)的三维结构的确定可以通过常规方法来确定，使得一种或多种氨基酸取代、增加、缺失或插入选择的天然或非天然氨基酸可以事实上建模，以为了确定是否这样衍生的结构变体保留目前公开的物种的空间充填性能。例如参见Donate et al.，1994Prot.Sci.3：2378；Bradley et al.，Science 309：1868-1871(2005)；Schueler-Furman et al.，Science310：638(2005)；Dietz et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103：1244(2006)；Dodson et al.，Nature 450：176(2007)；Qian et al.，Nature 450：259(2007)；Raman et al.Science 327：1014-1018(2010)。可用于这些和相关实施方案的一些另外和非限制性计算机算法的例子，例如用于本文提供的KDR-特异性抗体抗原-结合结构域的合理设计，包括：VMD，其是使用3-D图像和构建脚本来展示、修建和分析较大生物分析体系的分子可视化程序(参见Theoretical and Computational Biophysics Group，University of Illinois atUrbana-Champagne的网站ks.uiuc.edu/Research/vmd/。多种其他计算机程序是本领域已知的，并且为熟练技术人员可得，其允许从能量最小化构象的空间填充模型(范德华半径)来确定原子尺寸；GRID，其寻求确定不同化学基团的高亲合力区域，从而增强结合；Monte Carlo检索，其计算数学比对；以及CHARMM(Brooks et al.(1983)J.Comput.Chem.4：187-217)和AMBER(Weiner et al(1981)J.Comput.Chem.106：765)，其评价力场计算和分析(还参见Eisenfield et al.(1991)Am.J.Physiol.261：C376-386；Lybrand(1991)J.Pharm.Belg.46：49-54；Froimowitz(1990)Biotechniques 8：640-644；Burbam et al.(1990)Proteins 7：99-111；Pedersen(1985)Environ.HealthPerspect.61：185-190；和Kini et al.(1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9：475-488)。各种合适的计算性计算机程序也是市售可得的，例如来自(Munich，Germany)。

在本发明的另一实施方案中，抗-KDR抗体及其人源化版本源自兔单克隆抗体，并且特别地使用技术产生。这些抗体是有利的，因为它们要求最小序列修饰，从而促进在使用突变家系引导(MLG)的人源化技术(例如参见美国专利No.7,462,697)人源化之后保持功能性能。因此，制备本公开的抗-KDR抗体的示意性方法包括兔单克隆抗体技术，例如描述于美国专利5,675,063和7,429,487。在这点上，在某些实施方案中，本公开的抗-KDR抗体在兔中产生。在特定的实施方案中，能够融合兔脾细胞的兔-源永生B-淋巴细胞用于产生杂交细胞(其制备抗体)。永生B-淋巴细胞不会可检测地表达内源性免疫球蛋白重链，并且在某些实施方案中可含有改变的免疫球蛋白重链-编码基因。

组合物和使用方法

本公开提供包含KDR-特异性抗体或其抗原-结合片段的组合物、和在各种治疗环境中这种组合物的施用。

纯的形式或在合适的药物组合物中的本文所述的KDR-特异性抗体的施用可以通过服务类似应用的药剂施用的任何接受的方式来实施。药物组合物可以通过联合抗体或含抗体的组合物和合适的生理上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂而制备，并且可配制为固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、油膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球和气雾剂。此外，其他药物活性成分(包括本文别处所述的其他抗癌剂)和/或合适的赋形剂(例如盐、缓冲剂和稳定剂)可以存在(但非必需)于组合物内。通过多种不同途径可以实现施用，包括口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、真皮下、皮下或局部。优选的施用方式取决于待治疗或预防的病症的性质。在施用后降低、抑制、预防或延迟癌症的发展和/或转移的量被认为是有效的。

在某些实施方案中，施加量足以导致肿瘤蜕变，通过活瘤的量的统计学上显著地减少(例如肿瘤质量降低至少50％)或改变(例如统计学上显著地减少)扫描尺寸来指示。在其他实施方案中，施加量足以导致和VEGF或KDR表达和/或活性相关的病患症状的临床相关的减少，包括但不限于各种肿瘤疾病、炎性疾病和血管生成相关疾病中的任一种。因此，药学上有效量的一种或多种本文所述的抗体被施用以导致病患症状的临床相关的减少，包括但不限于类风湿性关节炎，糖尿病和缺血性视网膜病变，年龄-相关的黄斑变性，银屑病和与蛋白尿相关的肾小球肥大、以及各种肿瘤疾病，包括血管肉瘤，肾细胞癌，胃肠癌，转移性胃或胃食管连接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝细胞癌，结肠直肠癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，成神经细胞瘤，卵巢癌，黑素瘤和复发性多形性成胶质细胞瘤，白血病以及实体瘤。这些临床相关症状是熟练医师已知的，并且取决于待治疗的疾病而改变。

治疗的精确剂量和持续时间是治疗的疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案或通过测试本领域已知的模型体系中的组成并从其外推来经验性地确定。还可以进行控制的临床试验。随着待减缓的病症的严重性，剂量也可以改变。药物组合物通常被配制和施用以发挥治疗上有效的效果，同时使不期望的副作用最小化。组合物可以施用一次，或者可分为多次更小剂量在间断时间来施用。对于任何特定受试者，根据个体需要，特定剂量方案可以随着时间而调节。

含有KDR-特异性抗体的组合物可以单独或联合其他已知癌症治疗来施用，例如放射疗法、化疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。组合物还可以联合抗生素施用。

因此，这些和相关药物组合物的典型施用途径包括但不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、面颊、直肠、阴道和鼻内。如本文所使用的，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。根据本发明的某些实施方案的药物组合物被配制以使其中含有的活性成分在将组合物施用至患者时生物可利用。将施用至受试者或患者的组合物可以采用一种或多种剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单剂量单位，并且本文所述气雾剂形式的KDR-特异性抗体的容器可保持多剂量单位。制备这些剂型的实际方法是本领域技术人员已知或明显的；例如参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition(PhiladelphiaCollege of Pharmacy and Science，2000)。在任何情况下，待施用的组合物含有药学上有效量的本公开的抗体以依照本文教导来治疗目标疾病或病症。

药物组合物可以为固体或液体的形式。在一个实施方案中，媒介物为颗粒，使得组合物为例如片剂或粉末形式。媒介物可以是液体，其中组合物例如是口服油、可注射液体或气雾剂，其可用于例如吸入施用。当期望口服施用时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、混悬和凝胶形式包括在本文考虑形式中作为固体或液体。

作为口服的固体组合物，药物组合物可以被配制为粉末、颗粒、压片、丸剂、胶囊、咀嚼胶、薄片等。这种固体组合物将典型地含有一种或多种惰性稀释剂或可食用媒介物。此外，可以存在下列中的一种或多种：粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄耆胶或明胶；赋形剂例如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂例如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或桔味调味剂；和着色剂。当药物组合物为胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除了上述类型的材料，其可含有液体媒介物例如聚乙二醇或油。

药物组合物可以为液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或混悬剂。作为两个例子，液体可以用于口服或注射递送。当期望口服时，除了本化合物，优选组合物含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂、和增味剂中的一种或多种。在期望注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、混悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

如果它们是溶液、混悬液等形式，液体药物组合物可包括下列助剂中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液优选生理盐水、Ringer’s溶液、等渗氯化钠、不挥发性油例如合成单或二甘油酯(可用作溶剂或混悬介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂例如苄基醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及用于调节毒性的药剂例如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以包封在安瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是优选的助剂。可注射的药物组合物优选是灭菌的。

期望肠胃外或口服的液体药物组合物应该含有本文公开的量的KDR-特异性抗体，使得获得合适的剂量。典型地，该量为组合物中抗体的至少0.01％。当期望口服时，该量可以改变为组合物重量的0.1至约70％。某些口服药物组合物含有约4％至约75％的抗体。在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物和制剂被制备为使得在稀释之前肠胃外剂量单位含有0.01至10重量％的抗体。

药物组合物可期望用于局部施用，在这样的情况下媒介物可以合适地包括溶液、乳剂、油膏或凝胶基质。所述基质例如可以包括下列中的一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂例如水和醇、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可存在于药物组合物中以用于局部施用。如果期望用于透皮施用，所述组合物可包含透皮贴剂或离子电渗装置。药物组合物可期望用于直肠施用，其为例如栓剂的形式，将在直肠中熔融并且释放药物。用于直肠施用的组合物可含有油性基质作为合适的非刺激性赋形剂。这些基质包括但不限于羊毛脂、可可油和聚乙二醇。

药物组合物可包括多种材料，其修饰固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可包括围绕活性成分形成包衣外壳的材料。形成包衣外壳的材料典型地是惰性的，并且可选自例如砂糖、虫胶和其他肠溶包衣试剂。或者，活性成分可包封在明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可包括结合本发明抗体的药剂，从而辅助化合物的递送。可以在该容积中发挥作用的合适药剂包括其他单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白或脂质体。药物组合物可以基本上由剂量单位构成，所述剂量单位可以作为气雾剂来施用。术语气雾剂用于表示从胶态性质至由加压包装构成的体系的各种体系。递送可以通过液化或加压气体或配送活性成分的合适的泵系统来进行。气雾剂可以在单相、双相或三相系统中递送以递送活性成分。气雾剂的递送包括需要的容器、促进剂、阀、子容器等，其在一起可形成试剂盒。本领域技术人员无需进行试验可确定优选的气雾剂。

药物组合物可以通过药学领域熟知的方法来制备。例如，期望通过注射施用的药物组合物可以通过下列方式来制备：联合包含如本文所述的KDR-特异性抗体的组合物和任选的一种或多种盐、缓冲剂和/或稳定剂、以及无菌稀释水来形成溶液。可加入表面活性剂以促进形成均质溶液或混悬液。表面活性剂是这样的化合物，其和抗体组合物非共价地相互作用以促进抗体在水性递送体系中溶出或均质混悬。

组合物可以以治疗有效量来施用，其将取决于多种因素来改变，包括使用的特异化合物(例如KDR-特异性抗体)的活性；化合物作用的代谢稳定性和长度；患者的年龄、体重、大概健康、性别和饮食；施用方式和时间；排泄率；药物联合；特定疾患或病症的严重性；和提述进行疗法。通常，治疗有效每日剂量为(70kg哺乳动物)约0.001mg/kg(即0.07mg)至约100mg/kg(即7.0g)；优选的治疗有效剂量为(70kg哺乳动物)约0.01mg/kg(即0.7mg)至约50mg/kg(即3.5g)；更优选的治疗有效剂量为(70kg哺乳动物)约1mg/kg(即70mg)至约25mg/kg(即1.75g)。在某些实施方案中，熟练技术人员将认识到，可优选使用以毫克/平方米(即mg/m²)表示的剂量。例如，为了在任何给定物质中将mg/kg剂量表示为等同mg/m²剂量，使剂量乘以合适的km因子。在成人中，100mg/kg等同100mg/kgx37kg/m²＝3700mg/m²。例如参见FDA guidelines for Industry and Reviewers；还参见Freireich，EJ，et al.Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents inmouse，rat，dog，monkey and man.Cancer ChemotherRep.1966；50(4)：219-244。

包含本公开的KDR-特异性抗体的组合物还可在一种或多种其他治疗剂的施用的同时、之前或之后施用。这种联合治疗可包括单药物剂量制剂的施用，去含有本发明化合物和一种或多种另外的活性药剂，以及包含本发明抗体和均在其自身单独药物剂量制剂中的活性药物的组合物的施用。例如，如本文所述的抗体和其他活性药剂可以联合单口服剂量组合物(例如片剂或胶囊剂)施用至患者，或者以单独口服剂量制剂施用的各药剂。类似地，如本文所述的抗体和其他活性药剂可以联合在单肠胃外剂量组合物中施用至患者，例如在盐水溶液或其他生理可接受的溶液，或者以单独肠胃外剂量制剂施用的各药剂。如果使用单独剂量制剂，包含抗体和一种或多种另外的活性药剂的组合物可以在基本上同时(即同时)、或在单独较差时间(即依次和任何次序)施用；联合治疗理解为包括所有这些方案。

因此，在某些实施方案中，还涵盖联合一种或多种其他治疗剂施用本公开的抗-KDR抗体组合物。这种治疗剂在本领域中可接受为标准治疗用于如本文所述的特定疾病，例如炎性疾病(例如类风湿性关节炎或其他炎性疾病)、各种肿瘤疾病和血管生成-介导的疾病(例如但不限于年龄-相关的黄斑变性)中的任一种。涵盖的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、消炎剂、化疗剂、放射治疗剂或其他活性药剂和助剂。

在某些实施方案中，本文所公开的抗-KDR抗体可联合任何数量化疗剂来施用。化疗剂的例子包括：烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸酯，例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，例如benzodopa，卡波醌，meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和三聚氰胺包括六甲蜜胺，曲他胺，trietylenephosphoramide，triethylenethiophosphaoramide和三甲基三聚氰胺；氮芥例如瘤可宁，萘氮芥，环磷酰氮芥，雌氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸甲氧氮芥，苯丙氨酸氮芥，新氮芥，胆甾醇对苯乙酸氮芥，泼尼氮芥，曲洛磷胺，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类例如亚硝脲氮芥，氯脲菌素，福替目丁，环己亚硝脲，嘧啶亚硝脲，雷诺氮芥；抗生素例如aclacinomysins，放射菌素，氨茴霉素，重氮丝氨酸，争光霉素，放线菌素C，卡奇霉素，carabicin，洋红霉素，嗜癌菌素，chromomycins，更生霉素，道诺红菌素，地托比星，6-二氮杂-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表柔比星，依索比星，去甲氧基柔红霉素，麻西罗霉素，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗-代谢物例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸，氨甲喋呤，蝶罗呤，曲美沙特；嘌呤类似物例如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷、5-FU；雄激素例如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂；抗-肾上腺素例如鲁米特、米托坦、曲洛斯坦；叶酸补充剂例如叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比山群；依达曲沙；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；乙酸elliptinium；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；nitracrine；喷司他丁；phenamet；吡柔比星；podophyllinic acid；2-乙基酰肼；肼；PSK.RTM；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；氮烯唑胺；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生；Gacytosine；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.)和紫杉萜(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；瘤可宁；gemcitabine；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物例如顺氯氨铂和碳铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；navelbine；诺消灵；表鬼臼毒噻吩糖苷；道诺霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物例如Targretin^TM(贝沙罗汀)，Panretin^TM(阿利维A酸)；ONTAK^TM(地尼白介素-毒素连接物)；埃斯波霉素；capecitabine；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义也包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、onapristone和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、bicalutamide、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

多种其他治疗剂可和本文所述的抗-KDR抗体联合使用。在一个实施方案中，抗体和消炎剂一起施用。消炎剂或药物包括但不限于类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松，布地缩松，地塞米松，醋酸氢化可的松，氢羟肾上腺皮质素，氢羟肾上腺皮质素，甲基波尼松龙，波尼松龙，强的松，氟羟氢化泼尼松)，非类固醇消炎药物(NSAIDS)包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、氨甲喋呤、硫氮磺胺吡啶，来氟米特、抗-TNF药物，环磷酰胺和麦考酚酯。

包含本文所述KDR-特异性抗体的组合物可施加至患有如本文所述的疾病的个体，包括但不限于和VEGF或KDR表达和/或活性相关的疾患，包括但不限于类风湿性关节炎，糖尿病和缺血性视网膜病变，年龄-相关的黄斑变性，银屑病和与蛋白尿相关的肾小球肥大、以及各种肿瘤疾病包括血管肉瘤，肾细胞癌，胃肠癌，转移性胃或胃食管连接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝细胞癌，结肠直肠癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，成神经细胞瘤，卵巢癌，黑素瘤，和复发性多形性成胶质细胞瘤，白血病与实体瘤。对于体内用于人疾病的治疗，本文所述的抗体通常在施用之前引入药物组合物中。药物组合物包含一种或多种本文所述的抗体并联合本文其他地方所述的生理上可接受的媒介物或赋形剂。为了制备药物组合物，有效量的一种或多种化合物混合本领域技术人员已知的任何药学媒介物或赋形剂，以适于特定的施用方式。药学媒介物可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮肤内、皮下或局部施用的溶液或混悬液可包括例如无菌稀释剂(例如水)、生理盐水、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂例如(苄基醇或对羟苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)和螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(例如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内施用，合适的媒介物包括生理盐水或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)、以及含有增稠剂和增溶剂(例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物)的溶液。

包含如本文所述的KDR-特异性抗体的组合物可以使用媒介物制备，所述媒介物保护抗体避免从机体快速消除，例如时间释放制剂或包衣。这些媒介物包括控释制剂，例如但不限于移植体和微囊递送系统和生物可降解、生物相容性高分子，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和本领域技术人员已知的其他物质。

本文提供使用结合KDR的抗体的治疗方法。在一个实施方案中，本发明抗体施用中具有涉及不合适的KDR表达的疾病的患者，在本公开的上下文中是指包括畸变的KDR表达或活性所表征的疾病和疾患，因为由于蛋白存在量、或存在突变蛋白、或两者的改变(例如统计学上显著性增加或降低)。由于任何原因可能过量，包括但不限于在分子水平过表达、在作用位点延长或积累的表现、或相对于正常可检测的活性，KDR活性增强(例如以统计学上显著性方式)。这种KDR的过量可相对于正常表达、表现或KDR信号传导事件的活性来测量，并且所述测量可以在本文所述的抗体的开发和/或设定中发挥重要作用。

尤其，本发明抗体用于治疗和KDR表达相关的各种。例如，本发明的一个实施方案提供通过向癌症患者施用药学上有效量的本文公开的KDR-特异性抗体来治疗癌症的方法，包括但不限于和VEGF或KDR表达和/或活性相关的疾患，包括但不限于各种肿瘤疾病，包括血管肉瘤，肾细胞癌，胃肠癌，转移性胃或胃食管连接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝细胞癌，结肠直肠癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，成神经细胞瘤，卵巢癌，黑素瘤，和复发性多形性成胶质细胞瘤，白血病和实体瘤。在施用后，以统计学上显著性方式(即相对于本领域技术人员已知的合适的对照)抑制、预防或延迟癌症的发展和/或转移的量被认为是有效的。

另外实施方案提供通过向癌症患者施用药学上有效量的本文公开的KDR-特异性抗体(例如，在施用后，以统计学上显著性方式(即相对于本领域技术人员已知的合适的对照)抑制、预防或延迟癌症的转移)来预防癌症转移的方法，包括但不限于癌症，包括但不限于各种肿瘤疾病，包括血管肉瘤，肾细胞癌，胃肠癌，转移性胃或胃食管连接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝细胞癌，结肠直肠癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，成神经细胞瘤，卵巢癌，黑素瘤和复发性多形性成胶质细胞瘤，白血病与实体瘤。

另外实施方案提供通过向癌症患者施用药学上有效量的本文公开的KDR-特异性抗体来预防癌症的方法，包括但不限于癌症，包括但不限于各种肿瘤疾病，包括血管肉瘤，肾细胞癌，胃肠癌，转移性胃或胃食管连接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝细胞癌，结肠直肠癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，成神经细胞瘤，卵巢癌，黑素瘤，和复发性多形性成胶质细胞瘤，白血病与实体瘤。

另外实施方案提供向患有这些疾病中的一种或多种的患者施用药学上有效量的本文公开的KDR-特异性抗体来治疗、抑制癌症的进展或预防的方法，包括但不限于各种肿瘤疾病，例如血管肉瘤，肾细胞癌，胃肠癌，转移性胃或胃食管连接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝细胞癌，结肠直肠癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，成神经细胞瘤，卵巢癌，黑素瘤，和复发性多形性成胶质细胞瘤，白血病和实体瘤，以及和VEGF或KDR表达和/或活性相关的其他疾患，包括但不限于类风湿性关节炎，糖尿病和缺血性视网膜病变，年龄-相关的黄斑变性，银屑病和与蛋白尿相关的肾小球肥大。

在进一步的实施方案中，本发明抗体用于治疗各种炎性疾病。例如，本发明的一个实施方案提供一种治疗炎性疾病的方法，包括但不限于和VEGF或KDR表达和/或活性相关的炎症，包括但不限于类风湿性关节炎，糖尿病，痛风，冷吡啉相关周期性综合征，慢性阻塞性肺疾病和各种心血管病例如动脉硬化和脉管炎。本发明抗体用于治疗炎性综合征，其特征在于关节的无菌炎症、浆膜炎、发烧和皮肤损害的攻击。炎性疾病包括但不限于克罗恩病、结肠炎、皮肤炎、银屑病、憩室炎、肝炎、肠道激惹综合征(IBS)、红斑狼疮、肾炎、帕金森氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化(MS)、阿尔茨海默氏病、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘和各种心血管病例如动脉硬化和脉管炎。在一个实施方案中，本公开提供通过向需要的患者施用药学上有效量的本文公开的组合物来治疗、降低严重性或预防炎症或炎性疾病的方法。

在另一实施方案中，本发明的抗-KDR抗体用于确定结合的抗原的结构，例如构象表位，然后例如通过化学建模和SAR方法，该结构可用于开发具有或模拟该结构的化合物。

本发明的各种其他实施方案部分涉及检测表达KDR的细胞或组织的存在的诊断应用。因此，本公开提供检测样品中KDR的方法，例如检测表达KDR的细胞或组织。这些方法可以各种已知的检测方式应用，包括但不限于免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、原位杂交(ISH)、结合整体原位杂交(WISH)、荧光DNA原位杂交(FISH)、流式细胞术、酶免疫测定(EIA)和酶联免疫测定(ELISA)。

ISH是一种杂交法，其使用标记的互补DNA或RNA链(即初级结合剂)以在细胞或组织的一部分或区段中定位特异DNA或RNA序列(原位)，或如果组织足够小，全部组织(结合整体)。本领域技术人员将意识到这不同于免疫组织化学，其使用抗体作为促进结合剂在组织区段中定位蛋白。DNA ISH用于基因组DNA以确定染色体的结构。荧光DNA ISH(FISH)可以例如用于医学诊断以评价染色体完整性。RNA ISH(杂交组织化学)用于在组织区段或结合整体内测量和定位mRNAs和其他转录体。

在多种实施方案中，本文所述的抗体缀合可以直接或间接检测的可检测的标记。在这点上，抗体″缀合物″是指共价连接可检测的标记的抗-KDR抗体。在本发明中，DNA探针、RNA探针、单克隆抗体、其抗原-结合片段、及其抗体衍生物(例如单链可变-片段抗体或表位标签的抗体)可全部共价连接可检测的标记。在“直接检测”中，仅使用一种可检测的抗体，即初级可检测的抗体。因此，直接检测是指缀合可检测的标记的抗体可自身检测，而无需增加第二抗体(次级抗体)。

″可检测的标记″是可产生可检测的(例如肉眼、电子或其他方式检测)信号的分子或材料，所述信号指示样品中标记的存在和/或浓度。当缀合抗体时，可检测的标记可用于定位和/或定量特异性抗体定向的靶。因而，样品中靶的存在和/或浓度可以通过检测由可检测的标记产生的信号而检测。可检测的标记可直接或间接检测，并且缀合不同特异性抗体的数种不同可检测的标记可联合使用以检测一种或多种靶。

可直接或间接检测的可检测的标记的例子包括荧光染料和放射性物质与金属颗粒。相反，间接检测需要在应用初级抗体后应用一种或多种另外抗体，即次级抗体。因此，通过检测次级抗体或结合剂与初级可检测的抗体的结合来进行所述检测。需要添加次级结合剂或抗体的初级可检测的结合剂或抗体的例子包括酶可检测的结合剂和半抗原可检测的结合剂或抗体。

在一些实施方案中，可检测的标记缀合包含第一结合剂的核酸高分子(例如在ISH、WISH或FISH方法中)。在其他实施方案中，可检测的标记缀合包含第一结合剂的抗体(例如在IHC方法中)。

可缀合本公开的方法中使用的抗体的可检测的标记的例子包括荧光标记、酶标记、放射性同位素、化学发光标记、电化学发光标记、生物荧光标记、高分子、高分子颗粒、金属颗粒、半抗原和染料。

荧光标记的例子包括5-(和6)-羧基荧光素，5-或6-羧基荧光素，6-(荧光素)-5-(和6)-羧基酰氨基己酸、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、四甲基罗丹明、和染料(例如Cy2、Cy3和Cy5)、任选地取代的香豆素包括AMCA，PerCP，藻胆蛋白包括R-藻红蛋白(RPE)和allophycoerythrin(APC)，德克萨斯红，普林斯顿红，绿色荧光蛋白(GFP)及其类似物，和R-藻红蛋白或allophycoerythrin的缀合物，无机荧光标记例如基于半导体材料的颗粒，例如包覆的CdSe纳米微晶。

高分子颗粒标记的例子包括聚苯乙烯、PMMA或二氧化硅的微粒或胶乳颗粒，其可以嵌合荧光染料或含有染料、酶或底物的高分子胶束或胶囊。

金属颗粒标记的例子包括金颗粒和涂覆的金颗粒，其可以通银染法来转化。半抗原的例子包括DNP、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、生物素和洋地黄毒苷。酶标记的例子包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(ALP或AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶、β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶和葡萄糖氧化酶(GO)。用于辣根过氧化物酶的通常使用的底物的例子包括3，3′-二氨基联苯胺(DAB)、镍增强的二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、联苯胺二盐酸盐(BDHC)、Hanker-Yates试剂(HYR)、Indophane蓝(IB)、四甲基联苯胺(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚派洛宁(α-NP)、o-联茴香胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四氮唑二甲(NBT)、2-(p-碘代苯基)-3-p-硝基苯-1-5-苯基氯化四唑(INT)、四硝基四氮唑蓝(TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲羟基-β-D-半乳糖苷/铁氰化亚铁(BCIG/FF)。

用于碱性磷酸酯酶的通常使用的底物的例子包括萘酚-AS-B 1-磷酸酯/固红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸酯/固红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸酯/-固红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸酯/固红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸酯/新品红(NABP/NF)、溴氯吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑(BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b--d-吡喃半乳糖苷(BCIG)。

发冷光标记的例子包括发光氨、异氨基苯二酰肼、吖啶酯、1，2-二氧杂环丁烷和吡啶并哒嗪。电化学发光标记的例子包括钌衍生物。放射性标记的例子包括碘、钴、硒、氚、碳、硫和磷的放射性同位素。

可检测的标记可连接本文所述的抗体或特异性结合目标生物标志物的任何其他分子，例如抗体、核酸探针或高分子。而且，本领域技术人员将意识到，可检测的标记也可缀合第二和/或第三和/或第四和/或第五结合剂或抗体等。而且，本领域技术人员将意识到，用于标识目标生物标志物的各另外结合剂或抗体可作为信号扩增步骤。生物标志物可以使用例如光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜(可检测的物质例如是染料、胶体金颗粒、发冷光试剂)来肉眼检测。结合生物标志物的肉眼可检测的物质还可以使用分光光度计来检测。如果可检测的物质是放射性同位素，检测可以通过自动射线照相术肉眼进行，或使用闪烁计数器非肉眼进行。例如参见Larsson，1988，Immunocytochemistry：Theory and Practice，(CRC Press，BocaRaton，Fla.)；Methods in Molecular Biology，vol.80 1998，John D.Pound(ed.)(Humana Press，Totowa，N.J.)。

本发明还提供在样品中检测KDR或表达KDR的细胞或组织的试剂盒，其中试剂盒含有：如本文所述的至少一种抗体、多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞。在某些实施方案中，试剂盒可含有缓冲剂、酶、标记、底物、珠或附接本发明的抗体的其他表面等；以及使用说明书。

实施例

实施例1

抗-KDR抗体的制备和人源化

抗-KDR抗体的产生

将新西兰白兔用重组KDR-兔Fc融合蛋白免疫。具有特异性结合人KDR的最高血清滴度的兔被选择用于杂交瘤产生。总共230种杂交瘤被鉴定为结合可溶性KDR-Fc阳性。在这些230中，通过使用KDR-转染子293细胞，100种克隆还发现结合细胞表面KDR阳性。双阳性杂交瘤被选择用于进一步功能性表征。

杂交瘤的功能筛选

阻断KDR与VEGF的结合的功能性抗体的筛选：评价结合可溶性KDR和细胞表面KDR的双阳性抗-KDR抗体(100个克隆)的抑制KDR与VEGF的结合的能力。在100种抗-KDR克隆中，41种发现表现出一致性并重组表达，以及纯化用于进一步表征。抑制KDR与VEGF的结合的最佳10种抗-KDR抗体的效果概述于下面表2，并且示于图1。

表2：抗-KDR抗体的IC50

抗体	IC50(nM)
		15	17.48
23	21.37
		24	19.83
27	5.95
		36	6.25
43	7.54
		71	9.94
81	4.56
		83	9.77
92	32.94

抑制KDR磷酸化的抗体筛选：基于配体受体结合测定而选择的最佳10种抗-KDR抗体使用HUVEC细胞在细胞基KDR磷酸化测定中进一步测试。将培养的HUVEC细胞使用抗-KDR抗体以5μg/ml(相对饱和剂量)在37℃下处理1小时，之后加入20ng/ml(最佳刺激剂量)的人VEGF(R&DSystem)。将收获的细胞裂解物通过蛋白浓度来定量化。KDR的磷酸化使用荧光体酶联免疫吸附试验来确定，该试验使用兔抗-KDR YK-5(非-功能性抗-KDR克隆)作为不会抗体和小鼠抗-磷酸化酪氨酸，P-Tyr-100(细胞信号传递技术)作为检测抗体。抑制KDR磷酸化的最佳6种克隆示于图2。在最佳6种克隆中，克隆36表现出VEGF-刺激的KDR磷酸化的最强抑制(图2A)。克隆36的荧光体ELISA结果使用抗-荧光体-KDRY996多克隆抗体(Epitomics，Burlingame，CA)通过蛋白印迹进一步证实(图2B)。

交叉物种抗-KDR抗体的筛选：为了在体内动物研究中评价阻断KDR疗法的效果，其中KDR仅在宿主的内皮细胞上表达，最佳6种抗-KDR抗体被筛选用于和小鼠KDR的交叉反应性。抗体#27，#36，#43，#68，#83发现和人与小鼠KDR都具有交叉反应性(数据未示出)。下面表3概述在筛选中鉴定的三组兔抗体：1)阻断KDR磷酸化并且也和小鼠KDR交叉反应的抗-人KDR抗体，包括克隆4，6，14，27，30，36，68，69，81，83，91和95；2)阻断KDR磷酸化但不和小鼠KDR交叉反应的抗-人KDR抗体，包括克隆5，13，15，17，23，24，25，43，71，77，92和93；3)和小鼠KDR交叉反应但不阻断KDR磷酸化的抗-人KDR抗体，包括克隆40，42和50。

表3：抗-KDR兔抗体概述

图11示出抗-KDR抗体的VH和VL区的比对。CDR标出下划线。VHCDR1氨基酸序列提供在SEQ ID NO：69-95；VHCDR2氨基酸序列提供在SEQ ID NO：96-122；VHCDR3氨基酸序列提供在SEQ ID NO：123-149；VLCDR1氨基酸序列提供在SEQ ID NO：150-176；VLCDR2氨基酸序列提供在SEQ ID NO：177-203；VLCDR3氨基酸序列提供在SEQ IDNO：204-230。

基于人KDR的抗-磷酸化的效果和与小鼠KDR的交叉反应性，克隆36被选择为第一候选抗-KDR抗体。

重组抗-KDR抗体克隆36

来自克隆36的兔IgG的L链的DNA片段和H链的可变区(VH)通过PCR扩增。L链的片段在Hind III和Not I位点克隆到pTT5载体中，并且在Hind III和Kpn I位点将VH片段克隆到pTT5载体中建立的H链的恒定区中。对于各杂交瘤，L或H链的三种DNA克隆被测序，并且具有共有序列的质粒被鉴定和用于重组表达。为了表达重组抗体。L和H链的质粒共转染到293-6E细胞(National Research Council Canada)中。5天后收获上清，并且使用酶联免疫吸附试验来定量以测量功能测定前IgG浓度。

人原化设计

突变连接引导的(MLG)人源化技术用于使前导克隆36人源化。首先，克隆36的重链(VH)和轻链(VK)可变区序列针对人种系VH和VK数据库分裂(blast)。最接近的人种系序列被鉴定为人源化模板。其次，框架区中的兔残基潜在地涉及CDR接触，或者链内接触基于来自人和兔抗体的知识而鉴定。被认为对于抗体的结构活性非关键的残基基于来自之前人源化兔抗体的知识而鉴定。

人源化36(APX004)的轻链和重链框架和人种系序列具有93％的一致性。除了框架的人源化，MLG法允许我们进一步人源化和人种系序列具有47％至58％同源性的重链的CDR1和CDR2。APX004与KDR的结合效果被发现类似于其亲本兔单克隆抗体36(参见图4)。克隆36的人源化VH和VL区的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO：9和10。人源化克隆36的VHCDR1和VHCDR2的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO：11和12。人源化克隆36抗-KDR抗体(APX004)的VHCDR3的氨基酸序列和SEQ ID NO：5中阐述的亲本VHCDR3相同。人源化克隆36抗-KDR抗体(APX004)的VLCDR1，VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列和SEQ ID NO：6-8中阐述的兔亲本VLCDR序列相同。

人源化克隆的表达

编码克隆R-36的人源化VK和VH的DNA通过MCLab(South SanFrancisco，CA，USA)合成。DNA片段包括信号肽和5’端的Kozak序列。为了表达克隆36的人源化版本，人源化VK片段在Hind III和Nhe I克隆到pTT5载体中构建的人CK中。人源化VH在Hind III和BsiW I位点克隆到pTT5载体中构建的人IgG1 CH1中。人CK的DNA和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：13和14)和IgG1 CH1(分别为SEQ ID NO：15和16)被选择用于恒定区。克隆36的人源化版本在293-6E细胞中表达，在针对PBS缓冲液透析后通过蛋白A柱纯化并通过UV280定量。

实施例2

APX004的结合选择性

APX004是针对KDR(VEGFR2)的人源化IgG1抗体。其高亲合力(Kd＝5.3x10^-11M)结合并且特异性结合人KDR。APX004和猴与小鼠KDR交叉反应。APX004阻断KDR与VEGF的结合，并且抑制KDR磷酸化，从而导致抑制KDR下游信号传递和生物功能，例如内皮细胞增殖和血管生成。

APX004的结合选择性通过将ELISA用于VEGFR家族蛋白而评价。总共1μg/ml的人KDR、小鼠KDR、人VEGFR1、人VEGFR3、人OX40L和人VEGF的兔Fc-融合蛋白包覆在ELISA板上，接着和1μg/ml的APX004孵育。结合的APX004使用山羊抗-人HRP-缀合的IgG来检测。

如图3中所示，APX004选择性结合人和小鼠KDR，但不结合其他人VEGFR家族蛋白或VEGF。因此，APX004可以在小鼠肿瘤模型中测试体内效果和PK研究。由于猴子KDR和人KDR在细胞外结构域中具有99.9％的序列一致性(仅在非配体结合结构域中具有保守氨基酸差别)，因此APX004应该能够识别猴子KDR。

实施例3

APX004阻断KDR与VEGF的结合

ELISA-基KDR-VEGF结合测定被开发和用于评价阻断KDR结合VEGF的APX004。总共2μg/ml VEGF包覆在ELISA板上。APX004，亲本兔抗体R-36或IgG1同种型对照抗体和5μg/ml重组人KDR一起预孵育，之后转移到VEGF-A包覆的ELISA板。结合固定的VEGF的KDR由小鼠抗-KDR单克隆抗体检测，接着添加缀合碱性磷酸酯酶的山羊抗-小鼠IgG(Fisher Scientific/Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。将ELISA板和p-硝基苯磷酸酯底物显影，并且记录在405nm处的吸光度。所有实验进行三次。

如图4中所示，APX004以IC502.6nM有效地阻断KDR与VEGF的结合。R-36的人源化没有影响其抑制KDR结合VEGF的效果。

实施例3

APX004抑制KDR磷酸化

为了评价APX004对于VEGF-诱导的KDR磷酸化的抑制作用，将各种浓度的抗体和培养的HUVEC细胞预孵育1h，之后增加5nM的人VEGF(R&D System)。KDR磷酸化通过蛋白印迹检测。来自含有等量的蛋白的处理的HUVEC细胞的细胞裂解物在4-20％SDS-PAGE凝胶上解析，并且将蛋白转移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)。将污点依次用抗-荧光体-KDR抗体、全部KDR抗体和抗-α-微管蛋白抗体(Epitomics)探测。初级抗体通过在使用另外初级抗体预探测之前在甘氨酸缓冲液中洗涤而剥除。在将污染的膜和合适的辣根过氧化物酶-缀合次级抗体(FisherScientific/Pierce Biotechnology)孵育、然后使用ECL试剂显影(GE HealthcareBio-Sciences)后，特定信号在X-射线膜上可视。如图5中所示，APX004抑制VEGF诱导的KDR磷酸化。

实施例4

APX004抑制HUVEC增殖

为了测定APX004对于VEGF-诱导的HUVEC增殖的抑制效果，将各种浓度的APX004以在96-孔板中4,000细胞/孔加入HUVEC培养基，并且孵育1小时，之后添加15ng/ml的VEGF(最终浓度)。HUVEC细胞进一步在37℃下孵育72小时，之后将10％加入各孔。在24小时孵育后，HUVEC细胞活力通过使用Wallac Victor V 1420 MultilabelHTS计数器(PerkinElmer)在530nm的激励和590nm处的发射下读取荧光强度来测量。所有测量都进行三次。如图6中所示，APX004以剂量-依赖性方式抑制HUVEC增殖。

实施例5

人肺癌H460模型中肿瘤生长的抑制

APX004相对于Ramucirumab的一个优点是APX004和小鼠KDR交叉反应。因此，APX004可以在小鼠中的人肿瘤异种移植物模型中直接评价。APX004的体内抗-血管生成和抗-肿瘤效果在多肿瘤异种移植物模型中显示。

为了评价APX004在人H460异种移植物模型中的体内效果，人NSCLC肿瘤H460(KDR阴性)异种移植物通过将人NSCLC细胞系H460皮下接种到雌性BALB/c裸鼠的脊背侧面而建立。当在22天肿瘤尺寸达到平均体积200mm³时，携带肿瘤的小鼠随机如所表示分为3个处理组(n＝8-10)。然后，随机组以3次/周接受ip注射5mg/kg/剂量的APX004或Avastin，总共8次剂量。根据下列等式来计算肿瘤体积和体重：体积＝(宽度)²x长度/2，每隔2至3天(图7A)。对使用抗-CD34mAb染色的免疫组织化学进行光学照相(x400)以描述微脉管系统递送(褐色)(图7B)。

在终止研究时(41天)，APX004表现出比Avastin(69％抑制率)更有效的抗-肿瘤活性(77％抑制率)。APX004处理导致肿瘤微脉管系统减少(CD34⁺EC染色)。APX004并未显示显著毒性(即相对于对照组体重没有变化)。

实施例6

人肺癌H460模型中的剂量应答抑制

为了在人H460异种移植物模型中确定APX004的有效剂量，人NSCLC肿瘤H460异种移植物通过将人NSCLC细胞系H460皮下接种到雌性BALB/c裸鼠的脊背侧面而建立。当肿瘤达到平均体积160mm³时，携带肿瘤的小鼠随机如所表示分为3个处理组(n＝8-10)。以2.5mg/kg或0.6mg/kg 3次/周腹腔内施用APX004，总共8次剂量。每隔2至3天记录肿瘤尺寸和体重。根据下列等式来计算肿瘤体积：体积＝(宽度)²x长度/2。如图8中所示，在H460肿瘤模型中在2.5mg/kg的剂量时APX004证实显著性抗-肿瘤活性(p＜0.01)。APX004未显示显著性毒性(相对于对照组体重无变化)。

实施例7

人黑素瘤A375模型中肿瘤生长的抑制

为了确定APX004在人A375异种移植物模型中对于肿瘤生长的作用，人黑素瘤肿瘤异种移植物通过将人A375细胞皮下接种到雌性BALB/c裸鼠的脊背侧面而建立。当肿瘤达到平均体积100mm³时，携带肿瘤的小鼠随机如所表示分为6个处理组。腹腔内施用各种剂量的APX004或3mg/kg的Avastin，每周两次，3周，总共6次剂量。每隔3天记录肿瘤尺寸和体重。使用Vernier游尺来测量肿瘤的垂直尺寸。根据下列等式来计算肿瘤体积：体积＝(宽度)²x长度/2。符号和棒值是平均值+标准偏差。如图9中所示，在3mg/kg APX004显著性抑制A375肿瘤生长。在该剂量，APX004显示类似Avastin的抗-肿瘤活性。数据表明A375模型较少依赖于VEGF-KDR途径。因此，没有观察到明显的剂量-依赖性抗-肿瘤作用。

实施例8

人直肠癌HT29模型中肿瘤生长的抑制

为了确定在人结肠直肠癌HT29异种移植物模型中APX004的剂量和效果的关系，人结肠直肠癌异种移植物通过将人HT29细胞皮下接种到雌性BALB/c裸鼠的脊背侧面而建立。当肿瘤达到平均体积100mm³时，携带肿瘤的小鼠随机如所表示分为4个处理组。3次/周腹腔内施用各种剂量的APX0043周。每隔3天记录肿瘤尺寸。使用Vernier游尺来测量肿瘤的垂直尺寸。根据下列等式来计算肿瘤体积：体积＝(宽度)²x长度/2。符号和棒值是平均值+标准偏差。如图10中所示，在5mg/kg和10mg/kgAPX004显著性抑制HT29肿瘤生长。在该肿瘤模型中观察到APX004的剂量-依赖性抗-肿瘤活性。

简言之，如上面实施例所示，APX004是具有高KDR结合亲合力的人源化IgG1抗体，其有效地抑制血管生成。在人源化过程中，框架和CDR人源化以最大程度地降低潜在的免疫原性。

APX004是中性抗体，其阻断KDR与其配体的结合并抑制VEGF-诱导的KDR磷酸化和内皮细胞增殖。因为APX004和小鼠KDR交叉反应，因此可以在人肿瘤异种移植物的体内小鼠模型中直接评价APX004，而无需产生替代抗体。APX004在多人肿瘤异种移植物中以类似于Avastin的抗-肿瘤作用抑制肿瘤-诱导的微脉管系统形成和肿瘤生长。APX004看起来在体内肿瘤模型中比ramucirumab的替代DC-101更加有效，其中需要更高剂量的DC-101(＞40mg)来抑制肿瘤生长。和TKI相反，APX004是更特异性KDR靶向剂(不抑制其他VEGF受体)。这样，预计APX004将具有更小的脱靶副作用。

和Avastin相反，Avastin仅结合VEGF家族配体中的一种(仅VEGF-A)，APX004潜在地阻断所有已知的VEGF结合KDR。相比于仅阻断VEGF-A，这可具有对于肿瘤血管生成更深刻的抑制作用，并且还可以能够有助于逆转由配体过量引起的Avastin抗性。因此，APX004潜在改善肿瘤患者的治疗(其在肿瘤环境中产生大量VEGF家族配体)并可以克服抗-VEGF疗法的抗性。

而且，上述研究中使用的三分之二的肿瘤模型(A375和HT-27)表达KDR，并且可以使用VEGF-KDR途径作为自分泌环来生长。因此，本文所述的抗体介导的抗-肿瘤作用可以包括至少2种作用方式：(i)抗-血管生成和(ii)直接抑制肿瘤生长(46，47)。

参考文献：

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上述各种实施方案可联合以提供进一步实施方案，在该说明书中涉及的和/或申请数据页中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利该文献都通过引用的方式全部并入本文。如果需要，实施方案的方面可以修改以利用各种专利、申请和公开文献的概念来提供另外的实施方案。

考虑到上述说明，可以对实施方案进行这些和其他改变。通常，在所附权利要求书中，使用的术语不应该理解为将权利要求限制为在说明书和权利要求书中公开的特定实施方案，而是应该理解为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所要求的等同形式的全部范围。因此，权利要求书不由公开内容限制。

Claims (23)

1.一种结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段，包含：(i)包含分别由SEQ ID NO:3和4表示的VHCDR1区和VHCDR2区、或分别由SEQ ID NO:11和12表示的VHCDR1区和VHCDR2区、和SEQ ID NO:5表示的VHCDR3区的重链可变区；以及(ii)包含SEQ ID NO:6表示的VLCDR1区、SEQ ID NO:7表示的VLCDR2区、和SEQ ID NO:8表示的VLCDR3区的轻链可变区。

2.权利要求1所述的分离的抗体、或其抗原-结合片段，其中所述重链可变区由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成。

3.权利要求1所述的分离的抗体、或其抗原-结合片段，其中所述轻链可变区由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列组成。

4.一种结合KDR的分离的抗体、或其抗原-结合片段，包含重链可变区，所述重链可变区由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成；和轻链可变区，所述轻链可变区由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列组成。

5.权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体为人源化的。

6.权利要求5所述的分离的抗体，其中VH区由SEQ IDNO:9表示的氨基酸序列组成，以及VL区由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列组成。

7.权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体选自ScFv、缺乏铰链区的单价抗体、和微型抗体。

8.权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体是Fab或Fab’片段。

9.权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体是F(ab’)2片段。

10.权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体是整个抗体。

11.权利要求1所述的分离的抗体，包含人IgG恒定结构域。

12.权利要求11所述的分离的抗体，其中所述IgG恒定结构域包含IgG1 CH1结构域。

13.权利要求11所述的分离的抗体，其中所述IgG恒定结构域包含IgG1 Fc区。

14.权利要求1所述的分离的抗体、或其抗原-结合片段，所述分离的抗体、或其抗原-结合片段以5.3x10^-11 M的KD结合KDR。

15.权利要求1所述的分离的抗体、或其抗原-结合片段，其中所述分离的抗体、或其抗原-结合片段：

a.阻断VEGF与KDR的结合；

b.抑制KDR信号传递；

c.抑制内皮细胞增殖；

d.抑制肿瘤血管生成；

e.抑制肿瘤细胞生长；

f.a.-e.中任一项或多项的组合。

16.权利要求15所述的分离的抗体或其抗原-结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原-结合片段阻断VEGF与KDR的结合；抑制KDR信号传递；抑制内皮细胞增殖；抑制肿瘤血管生成；和抑制肿瘤细胞生长。

17.权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体与鼠KDR或非人灵长类KDR交叉反应。

18.一种编码权利要求1或权利要求11所述分离的抗体、或其抗原-结合片段的分离的多核苷酸。

19.一种表达载体，包含权利要求18所述分离的多核苷酸。

20.一种分离的宿主细胞，包含权利要求19所述的载体。

21.一种组合物，包含生理上可接受的媒介物和药学上有效量的根据权利要求1或6中任一项所述分离的抗体或其抗原-结合片段。

22.权利要求21所述组合物在制备用于治疗患者的癌症的药物的用途，其中所述癌症选自下组：肾细胞癌、结肠直肠癌、肺癌、黑素瘤和转移性胃或胃食管连接部腺癌。

23.权利要求21所述组合物在制备用于治疗患者的具有与畸变的VEGF或KDR表达或活性相关的癌症的药物的用途，其中所述癌症选自下组：肾细胞癌、结肠直肠癌、肺癌、黑素瘤和转移性胃或胃食管连接部腺癌。