CN102753580A - 抗egfr抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对EGFR的抗体和所述抗体例如用于治疗与EGFR的活性和/或过度产生相关的疾病的用途。

Description

抗EGFR抗体及其用途

相关申请案的交叉参考

本申请案主张2009年10月28日申请的美国临时申请案第61/255,632号的权益，所述临时申请案的内容以全文引用的方式并入本文中。

序列表

本申请案含有序列表，其已经以ASCII格式提交且以全文引用的方式并入本文中。在2010年10月26日创建的所述ASCII复本名为38149322.txt且大小为113,333字节。

技术领域

本发明涉及抗EGFR抗体、包含抗EGFR抗体的医药组合物和所述抗体的治疗性用途。

背景技术

单克隆抗体疗法为使用工程改造为针对肿瘤特异性抗原的抗体靶向并破坏肿瘤提供了一个机会。一般说来，单克隆抗体疗法刺激患者的免疫系统以通过阻断或抑制特定细胞受体来攻击恶性肿瘤细胞或防止肿瘤生长。治疗需要鉴别细胞表面分子上的肿瘤特异性抗原。临床试验中所靶向的代表性细胞表面分子包括来源于各种淋巴瘤/白血病(例如T细胞和/或B细胞淋巴瘤/白血病)和实体肿瘤(例如乳房、结肠和肺上皮肿瘤)的细胞表面分子。据报导，在用人源化单克隆抗体治疗转移性结肠直肠癌和头颈癌中，尤其在靶向表皮生长因子受体(EGFR、EGF受体)(一种正常控制细胞分裂的信号传导蛋白)的治疗中取得了满意效果。

EGFR(在人类中也称为ErbB-1和HER1)是细胞外蛋白质配体的表皮生长因子家族(EGF家族)成员的细胞表面受体(赫伯斯特(Herbst),2004,国际放射肿瘤学、生物学、物理学杂志(Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.)59(增刊2):21-6)。表皮生长因子受体是ErbB受体家族的一员，所述ErbB受体家族为由4种密切相关的蛋白质构成的亚家族：EGFR(ErbB-1)、HER2/neu(ErbB-2)、HER3(ErbB-3)和HER4(ErbB-4)。影响EGFR表达或活性的突变会导致癌症。实际上，EGF受体在大部分上皮恶性疾病(包括结肠和直肠上皮恶性疾病)中过度表达。EGFR在许多正常上皮组织(包括皮肤和毛囊)中组成性表达。

基于发现EGF受体在某些癌症病源学中的作用来研发单克隆抗体疗法首先涉及研发基于鼠类的抗体。用表达高水平EGFR的人类A431表皮样癌细胞使小鼠免疫产生特异性结合于EGFR的细胞外部分的抗体(艾尔-盖里(El-Gewely),2006,生物技术年度综述(Biotechnology Annual Review)(阿姆斯特丹(Amsterdam),爱思唯尔出版社(Elsevier)),第177页)。称为MAb225的单克隆抗体以等同于其配体的亲和力特异性结合于人类EGFR，与配体竞争结合，并阻断受体酪氨酸激酶的活化(古德斯坦(Goldstein)等人,1995,临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)1:1311-1318)。

鼠类抗体可能在患者中产生不希望有的免疫原性应答。因此，鼠类抗体225与人类IgG1嵌合而产生称为C225的重组人类/小鼠嵌合单克隆抗体，其具有源于人类IgG1κ的恒定区和特异性结合于人类表皮生长因子受体(EGFR)的细胞外结构域的鼠类可变区。相信C225主要通过阻断EGF结合于EGFR，借此使肿瘤“缺乏”所需生长因子来起作用。C225也特异性结合于正常细胞上的EGFR，并竞争性抑制EGF和其它配体(例如转化生长因子α)的结合。结合导致阻断受体相关性激酶的磷酸化和活化，从而抑制细胞生长、诱导细胞凋亡，并减少基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子(VEGF)产生。

C225在市面上称为Erbitux(西妥昔单抗(cetuximab))且在美国由英克隆公司(ImClone)和百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)出售，而在别处由默克公司(MerckKgaA)出售。Erbitux在2006年3月被FDA批准与放射疗法组合用于治疗头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)或作为单一药剂用于先前已接受基于铂的疗法的患者。Erbitux也适用于与DNA拓扑异构酶阻断剂伊立替康(irinotecan)(Camptosar)组合用于治疗转移性结肠癌。

最近已显示，克尔斯汀(Kirsten)大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)突变状态可预示在结肠直肠癌中对西妥昔单抗疗法的应答(范卡特斯姆(Van Cutsem)等人,2008,临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol)26(5月20日增刊):摘要2)。KRAS是在许多信号转导路径起作用的GTP酶。在超过25%的结肠直肠癌中存在的编码KRAS的基因的突变可预示EGFR抑制药物的成功性。突变KRAS基因的表达会减弱对EGFR抑制剂疗法的应答。KRAS突变可用市售实验室诊断剂来检测。

Erbitux

在约5%患者中引起免疫应答。此种免疫应答可引起免疫复合物介导自循环中清除抗体或片段，并使重复投药不适用于疗法，由此降低对患者的治疗益处且限制所述抗体的再投予。此外，Erbitux抗体在90%患者中引起痤疮样皮疹，且在多达10%的药物接受者中发现使人衰弱的皮疹(debilitating rash)。其它显著副作用包括粘膜表面问题、不适、恶心、发烧、胃肠问题和头痛(查伯纳(Chabner)等人,2008,哈里森肿瘤学手册(Harrison′s Manual of Oncology)(纽约(New York):麦格劳-希尔医学出版社(McGraw-Hill Medical)),第117-118页)。最后，与使用例如Erbitux

等肿瘤特异性或肿瘤选择性单克隆抗体作为治疗剂相关的其它问题包括肿瘤的抗原变异、在结合单克隆抗体后杀死细胞的效率低、抗体穿透到肿块中的效率低和可溶性目标抗原对抗体的清除(mopping up)。

因此，需要提供干扰EGFR受体信号传导的改良型单克隆抗体，其能克服一个或一个以上所述问题，例如通过产生亲和力高于Erbitux

且可按较低剂量投药(且因此投药产生低于Erbitux

的免疫原性)的变体或具有相比Erbitux

较低的免疫原性和较少的其它副作用的变体。

在本申请案此部分或任何其它部分中对任何参考文献的引用或标识都不应解释为承认所述参考文献可用作本发明的现有技术。

发明内容

本发明涉及抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段。

本发明的抗EGFR抗体和结合片段具有以下一、二或三个特性：

(1)抗EGFR抗体和结合片段具有序列与重链(V_H)序列对应于SEQ ID NO:9且轻链(V_L)序列对应于SEQ ID NO:10的抗体的CDR(所述CDR分别对应于SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8)相关的CDR，例如与V_H氨基酸序列对应于SEQ ID NO:9且V_L氨基酸序列对应于SEQ ID NO:10的所述抗体的CDR具有总体至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%或至少98%序列一致性的CDR，例如与对应于SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8的CDR相比较，抗EGFR抗体和结合片段的CDR在6个CDR中具有至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个氨基酸取代；

(2)抗EGFR抗体和结合片段具有序列与重链(V_H)序列对应于SEQ ID NO:1且轻链(V_L)序列对应于SEQ ID NO:2的抗体的CDR(所述CDR分别对应于SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8)相关的CDR，例如与V_H氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1且V_L氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2的所述抗体的CDR具有总体至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%或至少98%序列一致性的CDR，例如与对应于SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8的CDR相比较，抗EGFR抗体和结合片段的CDR在6个CDR中具有至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个氨基酸取代；

(3)抗EGFR抗体和结合片段具有序列与相比分别对应于SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8的CDR具有表14-1和表14-2中所标识的取代中一者和/或具有表14-3中所标识的取代的组合的CDR相关的CDR，例如，CDR-L1具有取代G30Y，所述CDR与相比对应于SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8的CDR具有表14-1和表14-2中所标识的取代中一者和/或具有表14-3中所标识的取代的组合的CDR具有例如总体至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%或至少98%序列一致性，所述CDR任选包括表14-1和表14-2中所标识的所述一个或一个以上取代和/或表14-3中所标识的取代的组合；

(4)抗EGFR抗体和结合片段具有序列与对应于SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8的CDR相比相差至少1个氨基酸且至多17个、至多16个、至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个氨基酸的CDR；

(5)与具有V_H氨基酸序列对应于SEQ ID NO：9且V_L氨基酸序列对应于SEQ IDNO:10的抗体的CDR的抗体相比较，和/或与具有V_H氨基酸序列对应于SEQ ID NO:9且V_L氨基酸序列对应于SEQ ID NO:10的抗体的CDR的抗体相比较，抗EGFR抗体和结合片段具有改良的对EGFR的亲和力；

(6)抗EGFR抗体和结合片段具有相比V_H氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1且V_L氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2的抗体降低的免疫原性。

本发明的抗体可具有以上特性(1)、(2)、(3)和(4)中的至少一个(且任选为多个)特征，且任选进一步具有特性(5)和(6)中的至少一个(且任选为多个)特征。

本发明的抗体当作治疗性使用时，由于其固有地具有较低免疫原性或由于其具有改良的结合亲和力而需要较低剂量，故可产生减少的免疫原性反应(例如T细胞和/或人类抗小鼠抗体(HAMA)反应)的应答。另外，由于结合亲和力改良或由于免疫原性的降低使得可安全地投予较大剂量或多次重复剂量，因此治疗功效得以提高。

一般说来，本发明的抗体在结构和/或功能特性方面与西妥昔单抗相关，西妥昔单抗包含：序列对应于SEQ ID NO:1的重链(V_H)；对应于SEQ ID NO:2的轻链(V_L)；本文中(按氨基末端到羧基末端的顺序)称为CDR-H1(SEQ ID NO:3)、CDR-H2(SEQ ID NO:4)和CDR-H3(SEQ ID NO:5)的3个重链互补决定区(CDR)；以及本文中(按氨基末端到羧基末端的顺序)称为CDR-L1(SEQ ID NO:6)、CDR-L2(SEQ ID NO:7)和CDR-L3(SEQ ID NO:8)的3个轻链CDR。西妥昔单抗CDR的序列显示于图1A和1C中，且其编号陈述于表1(重链CDR)和表2(轻链CDR)中。西妥昔单抗是一种嵌合抗体，其亲本鼠类抗体称为“MAb225”且其含有免疫原性表位。

本发明的抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段可包含序列与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的V_H，和序列与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的V_L。

在某一实施例中，本发明提供一种抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其包含氨基酸序列对应于SEQ ID NO:9的V_H和氨基酸序列对应于SEQ ID NO:10的V_L。此抗EGFR抗体或结合片段对应于MAb225的人源化型式，且在本文中也称为hu225。hu225具有3个重链CDR，在本文中(按氨基末端到羧基末端的顺序)称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且具有3个轻链CDR，在本文中(按氨基末端到羧基末端的顺序)称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。hu225CDR的序列显示于图1B和1C中，且其编号陈述于表1(重链CDR)和表2(轻链CDR)中。西妥昔单抗与hu225的CDR具有一致氨基酸序列。hu225与西妥昔单抗相比免疫原性有所降低。

本发明也涉及与hu225和/或西妥昔单抗相比对EGR具有改良亲和力的抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段。所述抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段可包含氨基酸序列与抗体hu225和/或西妥昔单抗的CDR具有总体至少70%序列一致性的6个CDR。在某些实施例中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段包含氨基酸序列与抗体hu225和/或西妥昔单抗的CDR具有总体至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%序列一致性的6个CDR。

与西妥昔单抗和/或hu225相比较，本发明的抗EGF抗体和抗EGF结合片段可在其CDR中具有至多17个氨基酸取代。举例来说，与西妥昔单抗和/或hu225的相应CDR相比较，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段可在6个CDR中具有总共至多17个、至多16个、至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个氨基酸取代。

在一些方面中，与抗体西妥昔单抗的相应CDR序列相比较，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段在任何个别CDR中具有不超过4个、不超过3个或不超过2个氨基酸取代。

与西妥昔单抗或hu225相比较，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段可在重链CDR中具有至少一个取代，和/或与西妥昔单抗或hu225相比较，所述抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段在轻链CDR中具有至少一个取代。在某些方面中，所述抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段具有以下一、二、三、四、五或所有六个特征：

·与西妥昔单抗或hu225的CDR-H1相比较，在CDR-H1中有至少一个取代；

·与西妥昔单抗或hu225的CDR-H2相比较，在CDR-H2中有至少一个取代；

·与西妥昔单抗或hu225的CDR-H3相比较，在CDR-H3中有至少一个取代；

·与西妥昔单抗或hu225的CDR-L1相比较，在CDR-L1中有至少一个取代；

·与西妥昔单抗或hu225的CDR-L2相比较，在CDR-L2中有至少一个取代；和/或

·与西妥昔单抗或hu225的CDR-L3相比较，在CDR-L3中有至少一个取代。

在某些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H1相比具有以下CDR-H1取代中至少一者：N31V、Y32R、V34L和V34N。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H1相比具有以下CDR-H1取代中至少一者：N31D、N31I、V34E和V34Q。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H1相比具有以下CDR-H1取代中至少一者：Y32W、G33A、G33D和G33E，且任选其中抗EGFR抗体CDR-H3中的3位不为天冬氨酸。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H2相比具有以下CDR-H2取代中一者或一者以上：V50L、V50Q、I51G、I51M、I51S、I51Q、W52G、W52T、S53Q、S53T、G55D、N56G、T57A、T57D、T57G、T57S、Y59A、Y59C、Y59E、Y59F、Y59G、Y59S、Y59W、N60D和T64E。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225相比至少具有以下CDR-H2取代：Y59H。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H2相比具有以下CDR-H2取代中至少一者：V50E、V50I、I51A、I51C、S53N、G55A、G55E、G55H、T57E、Y59P和Y59Q。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H2相比至少具有以下CDR-H2取代：T57P，且任选其中抗EGFR抗体CDR-H3中的3位不为天冬氨酸。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H2相比具有以下CDR-H2取代：F63V，且任选其中抗EGFR抗体CDR-H2中的13位不为丝氨酸，和/或抗EGFR抗体CDR-H2中的15位不为赖氨酸，和/或抗EGFR抗体CDR-H2中的16位不为甘氨酸。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H2相比至少具有以下CDR-H2取代：N56A，且任选其中抗EGFR抗体CDR-H2中的12位不为谷氨酸。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H2相比至少具有以下CDR-H2取代：T61E，且任选其中抗EGFR抗体CDR-H2中的7位不为丙氨酸。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H3相比至少具有以下CDR-H3取代：Y98W。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H3相比至少具有以下CDR-H3取代：T97D，且任选其中抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段的CDR-H3序列不由表11中所列举的CDR-H3组成。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-H3相比至少具有以下CDR-H3取代：F100cY，且任选其中抗EGFR抗体CDR-H3中的3位不为天冬氨酸。

在某些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L1相比具有以下CDR-L1取代中至少一者：A25V、A25S和G30Y。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L1相比具有以下CDR-L1取代中至少一者：A25I、A25P、A25T、A25Y、G30C、G30H、G30K、G30Q和G30R。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L1相比具有以下CDR-L1取代中至少一者：R24P、A25C、A25F、A25M、A25L、Q27W、S28R、G30W、G30F、G30T、G30M、G30S、T31V、T31E和N32H。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L1相比具有以下CDR-L1取代中至少一者：Q27E和Q27F，任选其中所述抗EGFR抗体CDR-L3中的9位不为丝氨酸。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L1相比至少具有以下CDR-L1取代：Q27Y，任选其中所述抗EGFR抗体CDR-L3中的5位不为天冬氨酸或谷氨酰胺和/或所述抗EGFR抗体CDR-L3中的9位不为丝氨酸。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L1相比具有以下CDR-L1取代中至少一者：S26D和T31D，任选其中所述抗EGFR抗体CDR-L3中的5位不为丙氨酸。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L3相比具有以下CDR-L3取代中至少一者：N91L、N92L、N92R、T97A、T97D、T97E和T97P。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L3相比具有以下CDR-L3取代中至少一者：N92K、N92M、T97C、T97K、T97N和T97Q。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L3相比具有以下CDR-L3取代中至少一者：T97I、T97G、T97L、T97H和T97R。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L3相比具有以下CDR-L3取代中至少一者：T96L。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L3相比具有以下CDR-L3取代中至少一者：N93D和N93E，任选其中所述抗EGFR抗体CDR-L3中的9位不为丝氨酸和/或所述抗EGFR抗体CDR-L3中的4位不为酪氨酸或组氨酸。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L3相比至少具有以下CDR-L3取代：N93A，任选其中所述抗EGFR抗体CDR-L3中的8位不为谷氨酸。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的CDR-L3相比至少具有以下CDR-L3取代：T97S，任选其中所述抗EGFR抗体CDR-L3中的5位不为天冬氨酸、谷氨酸或赖氨酸，和/或所述抗EGFR抗体CDR-L3中的4位不为谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段包含突变的组合，包括不同CDR中的突变的组合，例如上文所揭示的突变。

举例来说，在一个方面中，抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的相应CDR相比具有以下CDR取代：CDR-H2中的I51G、CDR-H3中的Y98W、CDR-L1中的G30Y和CDR-L3中的N92L。在另一方面中，抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段与西妥昔单抗或hu225的相应CDR相比具有以下CDR取代：CDR-H1中的N31V、CDR-H2中的V50L、CDR-L1中的A25V和CDR-L3中的N91L。

在某些实施例中，抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段进一步具有不会破坏所述抗体或结合片段结合EGFR的能力的一个或一个以上CDR突变或CDR突变的组合，例如，如表9和10中所揭示的突变，和/或已知突变，例如表11、12和13中所揭示的突变。在其它实施例中，抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段进一步具有选自表3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13中一者或一者以上的一个或一个以上CDR突变或CDR突变的组合。在其它实施例中，抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段进一步具有选自表3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14中一者或一者以上的一个或一个以上CDR突变或CDR突变的组合。

在某些实施例中，除一个或一个以上前述CDR取代或突变以外，抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段具有对应于SEQ ID NO:1的V_H序列和对应于SEQ ID NO:2的V_L序列。在其它实施例中，除所述一个或一个以上前述CDR取代或突变以外，抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段具有对应于SEQ ID NO:9的V_H序列和对应于SEQ ID NO:10的V_L序列。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段具有相比西妥昔单抗和/或hu225增加的对EGFR的亲和力，优选通过荧光活化细胞分选术(“FACS”)测定。如通过FACS所测定，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段的亲和力可为西妥昔单抗和/或hu225的亲和力的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。在其它方面中，如通过FACS所测定，抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段的亲和力可为西妥昔单抗和/或hu225的亲和力的多达10倍、多达15倍、多达20倍、多达25倍、多达30倍、多达40倍、多达50倍或多达100倍。含有一个或一个以上CDR取代的本发明抗体相对于西妥昔单抗或hu225的CDR的结合亲和力优选用除所述一个或一个以上CDR取代外在序列上一致的参考抗体来评估。

在其它方面中，抗EGFR抗体或抗EGFR抗体的亲和力可为V_H序列对应于SEQ IDNO:1且V_L序列对应于SEQ ID NO:2的抗体的亲和力的2到1000倍、10到100倍、1.5到50倍或2到30倍。在其它方面中，抗EGFR抗体或抗EGFR抗体的亲和力可为V_H序列对应于SEQ ID NO：9且V_L序列对应于SEQ ID NO:10的抗体的亲和力的4到400倍、10到100倍、1.5到50倍或2到30倍。

在某些方面中，本发明抗体的V_H和V_L序列与西妥昔单抗或hu225的V_H和V_L序列具有至少80%序列一致性(且在某些实施例中，具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性)，且与西妥昔单抗或hu225相比在至少一个CDR中包括至少一个氨基酸取代。在特定实施例中，所述重链和轻链与西妥昔单抗或hu225的V_H和V_L序列相比的序列一致性百分比独立地选自至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性。在某些方面中，本发明抗体的V_H和/或V_L序列与hu225的V_H和/或V_L序列具有至少95%、至少98%或至少99%序列一致性。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段分别为单克隆抗体或单克隆抗体的抗EGFR结合片段。在某些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段分别为人类或人源化抗体或者人类或人源化抗体的抗EGFR结合片段。本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段可为IgG，包括IgG₁或IgG₂。本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段可未经岩藻糖基化。

此外，抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段可在Fc区中包括一个或一个以上突变，其会增加或降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)。抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段可在Fc区中包括增加与FcγR或FcRn的结合的一个或一个以上突变。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段具有相比抗体西妥昔单抗降低的免疫原性。在一个方面中，本发明提供一种抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其包含对应于SEQ ID NO:9的V_H序列和对应于SEQ ID NO:10的V_L序列。

在一些方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段经纯化。在其它方面中，抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段经纯化到至少85%、至少90%、至少95%或至少98%均质性。

在另一方面中，本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段是以抗体-药物偶联物形式提供。

在其它方面中，抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段是与医药学上可接受的载剂一起以医药组合物形式提供。在另一方面中，本发明提供医药组合物，其包含具有相比西妥昔单抗或hu225增加的对EGFR的亲和力和/或相比西妥昔单抗降低的免疫原性的经修饰抗EGFR抗体。

本文也提供包含编码本发明的抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段的核苷酸序列的核酸，以及包含核酸的载体。另外，本文中提供经包含编码本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段的核苷酸序列的载体转化的原核和真核宿主细胞，以及经工程改造成表达所述核苷酸序列的真核(例如哺乳动物)宿主细胞。也提供通过培养宿主细胞来产生抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段的方法。

本发明的抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段适用于治疗例如上皮癌和蒙尼柴尔病(Menetrier′s disease)等疾病。详细说来，抗EGFR抗体适用于治疗上皮癌，例如乳癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食管癌、阴道癌、子宫颈癌、脾癌、睾丸癌和胸腺癌。因此，抗EGFR抗体和抗EGFR结合片段适用于治疗癌症，包括头颈部鳞状细胞癌和结肠直肠癌。

在一个方面中，提供一种治疗癌症的方法，其包含投予有需要的人类治疗有效量的本发明的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段、本发明的抗体-药物偶联物或本发明的医药组合物。

应注意，除非上下文另外清楚规定，否则本申请案中使用的不定冠词“一”和定冠词“所述”如专利申请案中所常见，意谓一个(种)或一个(种)以上。此外，本申请案中使用的术语“或”如专利申请案中所常见，意谓区分连词“或”或连接词“和”。

本说明书中所提到的所有出版物都以引用的方式并入本文中。本说明书中包括的对文件、动作、材料、装置、物品或其类似内容的任何论述仅仅用于提供本发明内容的目的。由于任何或所有这些内容在本申请案的优先权日期之前就已广泛存在，故不应视为承认其形成现有技术基础的一部分或为本发明相关领域内常见的一般知识。

根据本发明实施例的以下详细描述，本发明的特征和优势将变得更显而易知。

表格及附图说明

表1显示西妥昔单抗和hu225的重链CDR中的氨基酸编号。

表2显示西妥昔单抗和hu225的轻链CDR中的氨基酸编号。

表3显示西妥昔单抗和hu225重链CDR中由初步结合研究指示增加对EGFR的亲和力的突变。

表4显示西妥昔单抗和hu225轻链CDR中由初步结合研究指示增加对EGFR的亲和力的突变。

表5显示西妥昔单抗和hu225重链CDR中增加对EGFR的亲和力的候选突变。

表6显示西妥昔单抗和hu225轻链CDR中增加对EGFR的亲和力的候选突变。

表7显示西妥昔单抗和hu225重链CDR中增加对EGFR的亲和力的其它候选突变。

表8显示西妥昔单抗和hu225轻链CDR中增加对EGFR的亲和力的其它候选突变。

表9显示西妥昔单抗和hu225重链CDR中实质上不影响EGFR结合且可并入本发明抗体中的突变。

表10显示西妥昔单抗和hu225轻链CDR中实质上不影响EGFR结合且可并入本发明抗体中的突变。

表11-1到11-2显示西妥昔单抗和hu225重链CDR中可并入本发明抗体中的已知突变。

表12显示西妥昔单抗和hu225轻链CDR中可并入本发明抗体中的已知突变。

表13显示单链Fv抗体的重链和轻链CDR中可并入本发明抗体中的已知突变。

表14-1到14-3显示如通过荧光活化细胞分选术(FACS)、酶联结免疫吸附剂检测(ELISA)、AlphaLISA

分析、BIAcore分析和/或动力学排除检测(KinExA)分析所评估的示范性本发明变体相比hu225的相对结合亲和力。表14-1和14-2显示对EGFR的亲和力增加的单取代变体的相对结合。表14-3显示对EGFR的亲和力增加的两个多取代变体的相对结合。

图1A到1C。图1A显示西妥昔单抗重链和轻链可变区的氨基酸序列，分别为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2，其中CDR区为粗体、加下划线的文字。图1B显示hu225重链和轻链可变区的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，其中CDR区为粗体、加下划线的文字。图1C显示西妥昔单抗和hu225的CDR序列和相应序列标识符。

图2A到2B显示如在FACS竞争检测中用生物素标记的西妥昔单抗所测量(如图2A中所示)的西妥昔单抗和hu225对EGFR的结合亲和力(IC₅₀)(图2B)。

图3显示本发明某些变体的结合亲和力的FACS分析结果。从左到右，迹线来自于(i)野生型hu225(试验1)、(ii)野生型hu225(试验2)、(iii)hu225变体Y59E和(iv)hu225变体I51G。

图4-1到4-2显示测试为潜在CD4⁺表位的西妥昔单抗的所有VH和VL肽的氨基酸序列。

图5-1到5-2显示测试为潜在CD4⁺表位的hu225的所有VH和VL肽的氨基酸序列。

图6A到6B。图6A显示测试为潜在CD4⁺表位的西妥昔单抗的所有V_H和V_L肽的经计算平均刺激指数。图6B显示测试为潜在CD4⁺表位的hu225的所有V_H和V_L肽的经计算平均刺激指数。

具体实施方式

1.抗EGFR抗体

本发明提供抗EGFR抗体。除非另外指出，否则术语“抗体”(Ab)是指特异性结合特定抗原或与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子，且包括多克隆抗体、单克隆抗体、遗传工程改造的抗体和抗体的其它经修饰形式，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异源偶联抗体(例如双特异性抗体、微型双功能抗体(diabody)、三功能抗体和四功能抗体)，和抗体的抗原结合片段，包括例如Fab′、F(ab′)₂、Fab、Fv、rIgG和scFv片段。此外，除非另外指出，否则术语“单克隆抗体(mAb)”意图包括能够特异性结合蛋白质的完整分子以及抗体片段(例如Fab和F(ab′)₂片段)。Fab和F(ab′)₂片段缺乏完整抗体的Fc片段，可较为迅速地从动物循环系统中清除，且可具有低于完整抗体的非特异性组织结合(瓦尔(Wahl)等人,1983,核医学杂志(J Nucl.Med.)24:316)。

术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中来自传统抗体的重链和轻链的可变结构域已经接合形成一条链。

提到的“VH”是指抗体免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv或Fab的重链。提到的“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特性的糖蛋白。虽然抗体对特定目标展现结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体与缺乏目标特异性的其它抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白通常是由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白。各重链在氨基末端具有可变结构域(V_H)，接着为多个恒定结构域。各轻链在氨基末端具有可变结构域(V_L)且在羧基末端具有恒定结构域。

“西妥昔单抗”是指称为Erbitux

的嵌合人类/小鼠抗体。

“hu225”是指MAb225的人源化型式，其为嵌合抗体C225(也称为西妥昔单抗或Erbitux)的亲本抗体。

本发明的抗EGFR抗体结合于人类EGFR并抑制其在细胞中的活性。

本发明的抗EGFR抗体含有在序列上与抗体西妥昔单抗和抗体hu225的CDR相关的互补决定区(CDR)。

CDR也被称为轻链和重链可变结构域中的高变区。可变结构域的较为高度保守的部分称为框架(FR)。如此项技术中已知，界定抗体高变区的氨基酸位置/边界可视此项技术中已知的情形和各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可视作杂合型高变位置，因为根据一套标准可认为这些位置处于高变区内，而根据一套不同的标准可认为其处于高变区以外。也可在扩展的高变区中发现一个或一个以上所述位置。本发明提供在这些杂合型高变位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，主要呈现β折叠构型，由3个CDR连接，所述CDR形成连接β折叠结构的环，且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的CDR通过FR区以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序紧密接近地固持在一起，且其中来自另一链的CDR有助于形成抗体的目标结合位点(参看卡贝特(Kabat)等人,免疫相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(美国国立卫生研究院(NationalInstitute ofHealth),马里兰州贝塞斯塔(Bethesda,Md.)1987))。除非另外指出，否则如本文中所用，免疫球蛋白氨基酸残基是根据卡贝特等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。

西妥昔单抗的重链和轻链可变区序列分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2表示。所述重链和轻链可变区序列也描绘于图1A中。西妥昔单抗的CDR序列和其相应标识符提供于图1C中。编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的任何核苷酸序列都可用于本发明的组合物和方法中。

hu225的重链和轻链可变区序列分别由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10表示。所述重链和轻链可变区序列也描绘于图1B中。与西妥昔单抗的CDR序列一致的hu225的CDR序列和其序列标识符提供于图1C中。编码SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的任何核苷酸序列都可用于本发明的组合物和方法中。

本发明进一步提供抗EGFR抗体片段，其包含与西妥昔单抗和hu225的CDR序列相关的CDR序列。术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，一般为目标结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段。“Fv”片段是含有完整目标识别位点和结合位点的最小抗体片段。此区域由一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域紧密非共价缔合而成的二聚体(V_H-V_L二聚体)组成。在此构型中，各可变结构域的3个CDR相互作用而在V_H-V_L二聚体的表面上界定目标结合位点。通常6个CDR赋予抗体目标结合特异性。然而，在一些情形中，甚至单一可变结构域(或仅包含3个目标特异性CDR的半个Fv)也能够识别并结合目标。“单链Fv”或“scFv”抗体片段在单一多肽链中包含抗体的V_H和V_L结构域。一般说来，Fv多肽在V_H与V_L结构域之间另外包含多肽连接子，所述多肽连接子使scFv能够形成目标结合所需的结构。“单结构域抗体”由对目标展现足够亲和力的单一V_H或V_L结构域构成。在一个特定实施例中，单结构域抗体为骆驼抗体(参看例如瑞奇曼(Riechmann),1999,免疫方法杂志(Journal ofImmunological Methods)231:25-38)。

Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH₁)。Fab′片段因在重链CH₁结构域的羧基末端添加数个残基(包括一个或一个以上来自抗体铰链区的半胱氨酸)而与Fab片段不同。通过使F(ab′)₂胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸的二硫键裂解来产生F(ab′)片段。抗体片段的其它化学偶合为所属领域技术人员所知。

在某些实施例中，本发明的抗EGFR抗体为单克隆抗体。如本文中所使用的术语“单 克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单一克隆(包括任何真核克隆、原核克隆或噬菌体克隆)而不是产生单克隆抗体的方法的抗体。可结合本发明使用的单克隆抗体可使用此项技术已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体呈现技术或其组合。本发明的抗EGFR抗体包括嵌合抗体、灵长类化抗体、人源化抗体或人类抗体。

本发明的抗EGFR抗体可为嵌合抗体。如本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有来源于非人类免疫球蛋白(例如，大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人类免疫球蛋白模板的人类免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是此项技术中已知的。参看例如莫里森(Morrison),1985,科学(Science)229(4719):1202-7；大井(Oi)等人,1986,生物技术(BioTechniques)4:214-221；吉利斯(Gillies)等人,1985,免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)125:191-202；美国专利第5,807,715号、第4,816,567号和第4,816,397号，所述文献以全文引用的方式并入本文中。

本发明的抗EGFR抗体可经人源化。非人类(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其它目标结合子结构域)。一般说来，人源化抗体将包含实质上全部的至少一个且通常两个可变结构域，其中全部或实质上全部的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区且全部或实质上全部的FR区为人类免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人类免疫球蛋白共同序列的免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。抗体人源化的方法是此项技术中已知的。参看例如瑞奇曼等人,1988,自然(Nature)332:323-7；颁予奎恩(Queen)等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号和第6,180,370号；EP239400；PCT公开案WO 91/09967；美国专利第5,225,539号；EP592106；EP519596；帕德兰(Padlan),1991,分子免疫学(Mol.Immunol.),28:489-498；斯达迪尼卡(Studnicka)等人,1994,蛋白质工程(Prot.Eng.)7:805-814；罗古斯卡(Roguska)等人,1994,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)91:969-973；和美国专利第5,565,332号，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中。

本发明的抗EGFR抗体可为人类抗体。完全“人类”抗EGFR抗体对于治疗性治疗人类患者来说可为期望的。如本文所使用，“人类抗体”包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体且包括自人类免疫球蛋白库或自不表达内源免疫球蛋白的针对一种或一种以上人类免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体。可通过此项技术中已知的各种方法产生人类抗体，包括使用来源于人类免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体呈现法。参看美国专利第4,444,887号和第4,716,111号；以及PCT公开案WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中。也可使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人类抗体。参看例如PCT公开案WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、第5,885,793号、第5,916,771号和第5,939,598号，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中。另外，可聘请例如梅德雷克斯公司(Medarex)(新泽西州普林斯顿(Princeton，NJ))、阿斯特拉制药公司(Astellas Pharma)(伊利诺伊州迪菲尔德(Deerfield，IL))、艾恩杰公司(Amgen)(加利福尼亚州千橡城(Thousand Oaks，CA))和雷杰纳荣公司(Regeneron)(纽约州塔里敦(Tarrytown，NY))等公司使用类似于上文所述的技术提供针对所选抗原的人类抗体。可使用称为“导向选择(guided selection)”的技术来产生识别所选表位的完全人类抗体。在此方法中，使用所选非人类单克隆抗体(例如，小鼠抗体)来导向识别同一表位的完全人类抗体的选择(杰斯普斯(Jespers)等人,1988,生物技术(Biotechnology)12:899-903)。

本发明的抗EGFR抗体可经灵长类化。术语“灵长类化抗体”是指包含猴类可变区和人类恒定区的抗体。用于产生灵长类化抗体的方法是此项技术已知的。参看例如美国专利第5,658,570号、第5,681,722号和第5,693,780号，所述专利以全文引用的方式并入本文中。

本发明的抗EGFR抗体可为双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，通常为人类或人源化抗体。在本发明中，一个结合特异性可针对EGFR，另一结合特异性可针对任何其它抗原，例如针对细胞表面蛋白质、受体、受体次单元、组织特异性抗原、病毒源性蛋白质、病毒编码的包膜蛋白、细菌源性蛋白质或细菌表面蛋白质等。

本发明的抗EGFR抗体包括衍生化抗体。举例来说(但不限于)，通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/阻隔基进行的衍生化、蛋白水解裂解、键联到细胞配体或其它蛋白质(参看具体实施方式第4部分关于抗体偶联物的论述)等来修饰衍生化抗体。可通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素(tunicamycin)的代谢合成等。另外，衍生物可含有一个或一个以上非天然氨基酸，例如使用安必斯(ambrx)技术(参看例如沃夫森(Wolfson),2006,化学生物学(Chem.Biol.)13(10):1011-2)。

在本发明又一实施例中，抗EGFR抗体或其片段可为序列已经修饰以相对于相应野生型序列改变至少一种恒定区介导的生物效应功能的抗体或抗体片段。

举例来说，在一些实施例中，本发明的抗EGFR抗体可经修饰以相对于未经修饰的抗体降低至少一种恒定区介导的生物效应功能，例如，减少与Fc受体(FcγR)的结合。可通过使抗体免疫球蛋白恒定区区段在FcγR相互作用所需的特定区域突变来减少FcγR结合(参看例如坎菲尔德(Canfield)和莫里森,1991,实验医学杂志(J.Exp.Med.)173:1483-1491；和路德(Lund)等人,1991,免疫学杂志(J.Immunol.)147:2657-2662)。抗体的FcγR结合能力降低也可降低依靠FcγR相互作用的其它效应功能，例如调理作用和噬菌作用以及抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)。

在其它实施例中，本发明的抗EGFR抗体可经修饰以相对于未经修饰的抗体获得或改良至少一种恒定区介导的生物效应功能，例如增强FcγR相互作用(参看例如US2006/0134709)。举例来说，本发明的抗EGFR抗体可具有以高于相应野生型恒定区的亲和力结合FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的恒定区。

因此，本发明的抗体可改变生物活性从而增加或减弱调理作用、吞噬作用或ADCC。所述改变是此项技术中已知的。举例来说，降低ADCC活性的抗体修饰描述于美国专利第5,834,597号中。示范性ADCC降低变体对应于美国专利第5,834,597号的图3中所示的“突变体3”，其中残基236缺失且残基234、235和237(使用EU编号)经丙氨酸取代。

在一些实施例中，本发明的抗EGFR抗体具有低岩藻糖含量或缺乏岩藻糖。缺乏岩藻糖的抗体与ADCC活性增强相关，尤其在低剂量抗体情况下。参看谢尔德(Shields)等人,2002,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277:26733-26740；新川(Shinkawa)等人,2003,生物化学杂志,278:3466-73。制备低岩藻糖抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中生长。YB2/0细胞表达较低量的FUT8mRNA，所述FUT8mRNA编码多肽岩藻糖基化所必需的酶α-1,6-岩藻糖基转移酶。

在又一方面中，抗EGFR抗体或其片段可为已例如通过使免疫球蛋白恒定区区段在涉及FcRn相互作用的特定区域突变进行修饰以增加或降低其对胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的抗体或抗体片段(参看例如WO 2005/123780)。在特定实施例中，IgG类别的抗EGFR抗体经突变使得重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中至少一者单独或以其任何组合经取代，例如在位置250和428处，或在位置250和314处，或在位置314和428处，或在位置250、314和428处，其中位置250和428为特定组合。对于位置250，取代的氨基酸残基可为除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314，取代的氨基酸残基可为除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428，取代的氨基酸残基可为除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。适合氨基酸取代的特定组合标识于美国专利第7,217,797号的表1中，所述表以全文引用的方式并入本文中。所述突变增加抗体与FcRn的结合，所述结合保护抗体免于降解并增加其半衰期。

在其它方面中，抗EGFR抗体具有一个或一个以上氨基酸插入一个或一个以上其高变区中，例如，如以下文献中所述：张(Jung)和普鲁克坦(Plückthun),1997,蛋白质工程(Protein Engineering)10(9):959-966；矢崎(Yazaki)等人,2004,蛋白质工程设计和选择(Protein Eng Des.Sel.)17(5):481-9.电子版(Epub)2004年8月17日；和US 2007/0280931。

在各种实施例中，抗EGFR抗体或其片段可为已经修饰以增加在异源宿主中的表达的抗体或抗体片段。在某些实施例中，抗EGFR抗体或其片段可为已经修饰以增加异源宿主细胞中的表达和/或自异源宿主细胞的分泌的抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗EGFR抗体或其片段经修饰以增加在例如大肠杆菌(E.coli)等细菌中的表达。在其它实施例中，抗EGFR抗体或其片段经修饰以增加在酵母中的表达(凯克(Kieke)等人,1999,美国国家科学院院刊(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA)96:5651-5656)。在其它实施例中，抗EGFR抗体或其片段经修饰以增加在昆虫细胞中的表达。在其它实施例中，抗EGFR抗体或其片段经修饰以增加在哺乳动物细胞中的表达，例如CHO细胞。

在某些实施例中，抗EGFR抗体或其片段可为已经修饰以增加抗体在产生期间的稳定性的抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗体或其片段可经修饰以将一个或一个以上易发生无酶催化脱酰胺的氨基酸(例如天冬酰胺或谷氨酰胺)置换成不进行脱酰胺的氨基酸(黄(Huang)等人,2005,分析化学(Anal.Chem.)77:1432-1439)。在其它实施例中，抗体或其片段可经修饰以将一个或一个以上易发生氧化的氨基酸(例如甲硫氨酸、半胱氨酸或色氨酸)置换成不易氧化的氨基酸。在其它实施例中，抗体或其片段可经修饰以将一个或一个以上易发生环化的氨基酸(例如天冬酰胺或谷氨酸)置换成不易环化的氨基酸。

2.核酸和表达系统

本发明涵盖编码本发明的抗EGFR抗体的核酸分子和宿主细胞。

本发明的抗EGFR抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，以带有编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一个或一个以上重组表达载体转染宿主细胞，以使所述轻链和重链表达于宿主细胞中并且任选分泌到培养所述宿主细胞的培养基中，可自所述培养基中回收所述抗体。使用标准重组DNA方法来获得抗体重链和轻链基因，将这些基因并入重组表达载体中并将载体引入宿主细胞中，例如描述于以下文献中的方法：分子克隆实验手册(MolecularCloning;A Laboratory Manual),第2版(萨姆布鲁克(Sambrook),弗雷特奇(Fritsch)和马尼提斯(Maniatis)(编),纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.),1989)；现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)(奥斯贝尔F.M.(Ausubel,F.M.)等人编,格里尼出版协会(Greene Publishing Associates),1989；和美国专利第4,816,397号。

在一个实施例中，抗EGFR抗体除了一个或一个以上CDR变化外与西妥昔单抗相似(本文中称为具有“与西妥昔单抗相关”的序列)。在另一实施例中，抗EGFR抗体除了一个或一个以上CDR变化外与hu225相似(本文中称为具有“与hu225相关”的序列)。为了产生编码所述抗EGFR抗体的核酸，首先获得编码轻链和重链可变区的DNA片段。可使用例如聚合酶链反应(PCR)通过扩增和修饰编码轻链和重链可变序列的生殖系DNA或cDNA来获得这些DNA。人类重链和轻链可变区基因的生殖系DNA序列是此项技术中已知的(参看例如“VBASE”人类生殖系序列数据库；也参看卡贝特E.A.(Kabat,E.A.)等人,1991,免疫相关蛋白质的序列,第5版,美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版第91-3242号；汤姆林森(Tomlinson)等人,1992,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)22T:116-198；和科克斯(Cox)等人,1994,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24:827-836；各文献的内容以引用的方式并入本文中)。可合成编码西妥昔单抗或hu225的重链或轻链可变区的DNA片段，并将其用作诱变模板以使用常规诱变技术产生如本文所述的变体；或者，可直接合成编码变体的DNA片段。

一旦获得编码西妥昔单抗或与西妥昔单抗相关的V_H和V_L区段或者hu225或与hu225相关的V_H和V_L区段的DNA片段，就可通过标准重组DNA技术进一步处理这些DNA片段，以例如将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scfv基因。在这些处理中，将编码V_L或V_H的DNA片段可操作地连接到编码另一蛋白质的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性连接子。此上下文中使用的术语“可操作地连接”意图意谓将两个DNA片段接合以便使由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。

编码V_H区的分离的DNA可通过将编码V_H的DNA可操作地连接到编码重链恒定区(CH₁、CH₂、CH₃和任选存在的CH₄)的另一DNA分子而转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因序列是此项技术中已知的(参看例如卡贝特E.A.等人,1991,免疫相关蛋白质的序列,第5版,美国卫生和公众服务部,NIH出版第91-3242号)且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可为IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在某些实施例中为IgG₁或IgG₄恒定区。对于Fab片段重链基因，可将编码V_H的DNA可操作地连接到仅编码重链CH₁恒定区的另一DNA分子。

可通过将编码V_L的DNA可操作地连接到编码轻链恒定区C_L的另一DNA分子来将编码V_L区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是此项技术中已知的(参看例如卡贝特E.A.等人,1991,免疫相关蛋白质的序列,第5版(美国卫生和公众服务部,NIH出版第91-3242号))，且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但在某些实施例中为κ恒定区。为产生scFv基因，将编码V_H和V_L的DNA片段可操作地连接到编码柔性连接子(例如编码氨基酸序列(Gly₄～Ser)₃)的另一片段，以使所述V_H和V_L序列可表达为相邻单链蛋白质，其中所述V_L和V_H区经由所述柔性连接子接合(参看例如博德(Bird)等人,1988,科学,242:423-426；休斯顿(Huston)等人,1988,美国国家科学院院刊,85:5879-5883；麦克卡福提(McCafferty)等人,1990,自然,348:552-554)。

为了表达本发明的抗EGFR抗体，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，以使所述基因可操作地连接到转录和翻译控制序列。在此情形中，术语“可操作地连接”意图意谓将抗体基因连接到载体中以使所述载体内的转录和翻译控制序列提供其调节抗体基因的转录和翻译的预定功能。选择表达载体和表达控制序列应与所使用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独载体中，或更通常地，将两种基因插入同一表达载体中。

通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制位点，或如果不存在限制性位点，就通过钝端连接)将抗体基因插入表达载体中。在插入西妥昔单抗或与西妥昔单抗相关的轻链或重链序列或者hu225或与hu225相关的轻链或重链序列之前，表达载体可已带有抗体恒定区序列。举例来说，将V_H和V_L序列转化为全长抗体基因的一种方法是将其分别插入已编码重链恒定区与轻链恒定区的表达载体中，以使V_H区段可操作地连接到载体内的C_H区段，且使V_L区段可操作地连接到载体内的C_L区段。或者或另外，重组表达载体可编码促进宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中以使信号肽同框连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因外，本发明的重组表达载体带有控制抗体链基因于宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。所述调节序列描述于例如乔德尔(Goeddel),基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology:Methods inEnzymology)185(学术出版社(Academic Press),加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)1990)中。所属领域技术人员应了解，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。哺乳动物宿主细胞表达的适合调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平表达蛋白质的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件和其序列的进一步描述，参看例如斯汀斯奇(Stinski)的美国专利第5,168,062号、贝尔(Bell)等人的美国专利第4,510,245号和斯查夫纳(Schaffner)等人的美国专利第4,968,615号。

除抗体链基因和调节序列以外，本发明的重组表达载体也可带有其它序列，例如调节所述载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参看例如美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号，都由艾克西(Axel)等人发明)。举例来说，可选择标记基因通常赋予已引入载体的宿主细胞对例如G418、嘌呤霉素(puromycin)、杀稻瘟菌素(blasticidin)、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤(methotrexate)等药物的抗性。适合的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于借助甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。为表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意图涵盖将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种常用技术，例如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。

有可能将在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。在某些实施例中，在真核细胞，例如在哺乳动物宿主细胞中表达抗体以便最佳地分泌经适当折叠且具免疫活性的抗体。用于表达本发明的重组抗体的示范性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括奥拉波(Urlaub)和查辛(Chasin),1980,美国国家科学院院刊,77:4216-4220中所描述的DHFR-CHO细胞，其与DHFR可选择标记物一起使用，例如，如考夫曼(Kaufman)和夏普(Sharp),1982,分子生物学(Mol.Biol.)159:601-621中所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、293细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段足以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时间来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化法自培养基回收抗体。也可使用宿主细胞产生完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。应了解以上程序的变化在本发明范围内。举例来说，可能需要用编码本发明抗EGFR抗体的轻链或重链(但非两者)的DNA转染宿主细胞。

也可使用重组DNA技术移除编码非结合于EGFR所需的轻链和重链中任一者或二者的DNA的一些或全部。本发明抗体也涵盖由所述截短的DNA分子所表达的分子。

另外，可通过用标准化学交联法使本发明抗体与第二抗体交联来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链为本发明的抗体且另一条重链和轻链对除EGFR以外的抗原有特异性。也可通过表达经工程改造以编码双功能抗体的核酸来产生双功能抗体。

在某些实施例中，可通过使轻链和/或重链CDR中的氨基酸残基突变来产生双重特异性抗体，即，使用同一结合位点结合EGFR和无关抗原的抗体。在各种实施例中，可通过使抗原结合位点周围的氨基酸残基突变来产生结合两个抗原(例如EGFR和HER2)的双重特异性抗体(博斯托姆(Bostrom)等人,2009,科学,323:1610-1614)。可通过表达经工程改造以编码双重特异性抗体的核酸来产生双重功能抗体。

为了重组表达本发明的抗EGFR抗体，可用两种本发明的表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码来源于重链的多肽，且第二载体编码来源于轻链的多肽。两种载体通常各自含有单独的可选择标记物。或者，可使用编码重链和轻链多肽的单一载体。

一旦产生编码西妥昔单抗、hu225或者CDR序列与西妥昔单抗或hu225的CDR序列相关的抗EGFR抗体的一个或一个以上部分的核酸后，就可向编码序列中引入其它改变或突变，例如用于产生编码具有不同CDR序列的抗体、具有较低Fc受体亲和力的抗体或属于不同亚类的抗体的核酸。

也可通过化学合成(例如，通过固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis),第2版,1984,皮尔斯化学品公司(The Pierce Chemical Co.),伊利诺伊州罗克福德(Rockford,Ill)中所述的方法)来产生本发明的抗EGFR抗体。也可使用无细胞平台产生变体抗体(参看例如朱(Chu)等人,生物化学(Biochemia)第2期,2001(罗氏分子生物制品公司(RocheMolecular Biologicals))。

一旦已通过重组表达产生本发明的抗EGFR抗体，就可利用此项技术中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通过色谱法(例如离子交换色谱法；亲和色谱法，尤其通过用于蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L选择的亲和色谱法；和尺寸筛分柱色谱法(sizing column chromatography))、离心法、差别溶解法或用于纯化蛋白质的任何其它标准技术将其纯化。此外，本发明的抗EGFR抗体或其片段可与本文所述或此项技术中另外已知的异源多肽序列融合以有助于纯化。

一旦分离，必要时可例如通过高效液相色谱(参看例如费舍尔(Fisher),生物化学与分子生物学实验技术(Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology)(沃克(Work)和波顿(Burdon)编，爱思唯尔出版社(Elsevier)，1980))或通过在Superdex^TM 75柱(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech AB)，瑞士乌普萨拉(Uppsala，Sweden))上进行凝胶过滤色谱来进一步纯化抗EGFR抗体。

3.抗EGFR抗体的生物性质

在某些实施例中，本发明的抗EGFR抗体具有某些生物活性，例如与西妥昔单抗或hu225竞争结合于EGFR或中和EGFR活性。

因此，在某些实施例中，本发明的抗EGFR抗体与西妥昔单抗竞争结合于EGFR。在其它实施例中，本发明的抗EGFR抗体与hu225竞争。可使用竞争检测测试竞争结合于EGFR的能力。在竞争检测的一个实例中，通过使微孔板与EGFR溶液接触(例如在PBS中浓度为1μg/mL的溶液，在4℃下过夜)来使EGFR粘附到例如所述板的固体表面上。洗涤板(例如含0.1%吐温(Tween 20)的PBS)并阻断(例如在超级阻断缓冲液(Superblock)中；赛默科技公司(Thermo Scientific)，伊利诺伊州罗克福德)。将亚饱和量的经生物素标记的西妥昔单抗或hu225(80ng/mL)与未经标记的西妥昔单抗或hu225(“参考”抗体)或竞争性抗EGFR抗体(“测试”抗体)的连续稀释液(例如浓度为2.8μg/mL、8.3μg/mL或25μg/mL)于ELISA缓冲液(例如含1%BSA和0.1%吐温20的PBS)中的混合物添加到各孔中，并在温和振荡下培育板1小时。洗涤板，向各孔中添加于ELISA缓冲液中稀释的1μg/mL偶联HRP的抗生蛋白链菌素，并培育板1小时。洗涤板，并通过添加底物(例如TMB，拜耳夫斯实验公司(Biofx Laboratories Inc.)，马里兰州奥因斯米尔斯(Owings Mills，MD))来检测经结合抗体。通过添加终止缓冲液(stopbuffer)(例如拜耳菲克(Bio FX)终止试剂，拜耳夫斯实验公司，马里兰州奥因斯米尔斯)终止反应并使用微板读取器(例如维萨米斯(VERSAmax)，分子装置公司(MolecularDevices)，加利福尼亚州森尼维尔(Sunnyvale，CA))在650nm下测量吸光度。也可使用此竞争检测的变化方案测试本发明抗EGFR抗体与西妥昔单抗或hu225之间的竞争。举例来说，在某些方面中，使用抗EGFR抗体作为参考抗体且使用西妥昔单抗或hu225作为测试抗体。另外，在培养中可使用在细胞(例如哺乳动物细胞)表面上表达的膜结合型EGFR替代可溶性EGFR。其它竞争检测格式是此项技术中已知的且可加以使用。

在各种实施例中，当本发明的抗EGFR抗体是以0.08μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL浓度或在介于任何上述值之间范围内的浓度(例如在2μg/mL到10μg/mL范围内的浓度)使用时，所述抗EGFR抗体使经标记的hu225或经标记的西妥昔单抗的结合降低至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或在介于任何上述值之间范围内的百分比(例如本发明的抗EGFR抗体使经标记的hu225或经标记的西妥昔单抗的结合降低50%到70%)。

在各种实施例中，可使用萨普迪尼KINEXA(Sapidyne KINEXA)检测来测定本发明抗体与EGFR的结合。在此检测中，用抗原(每毫升珠粒50μg抗EGFR抗体)预涂布经NHS活化的快速流琼脂糖珠粒(GE医疗集团(GE Healthcare))，并在用含10mg/mL BSA的1M Tris-HCl(pH 8.0)阻断。接着，在室温下将2pM、4pM、40pM本发明抗体与含各种浓度(例如2.4pM到10nM，连续稀释液)的可溶性EGFR的操作缓冲液(PBS，0.005%(v/v)吐温-20和1mg/mL卵白蛋白)一起培育10小时。为了测定平衡时所存在的游离抗体，使各样本通过经可溶性EGFR涂布的珠粒。接着，通过使按1:4000于操作缓冲液中稀释的荧光(Cy5)标记的山羊抗人类Fc抗体(杰克森免疫研究公司(JacksonImmuno Research))的溶液通过所述珠粒来定量珠粒结合的抗体的量。所测量的荧光信号与平衡时游离抗体的浓度成比例。在某些实施例中，以一式两份测量可溶性EGFR的每一浓度。可使用多曲线单位点均质结合模型(multiple-curve,one-site homogeneous bindingmodel)(KINEXA软件)由竞争曲线的非线性回归获得平衡解离常数(K_D)。

也可使用萨普迪尼KINEXA检测来测定可溶性EGFR结合的缔合速率常数(k_on)。使用与前一段落中所述相同的条件混合2pM抗体与20pM可溶性EGFR。在不同时间，使用上述平衡结合条件探测样本的游离抗体，接着使用KINEXA软件拟合所得时间相关性以确定缔合速率(k_on)。使用表达式k_off=K_d×k_on计算解离速率常数(k_off)。

在其它方面中，本发明的抗EGFR抗体在例如细胞增殖、EGFR磷酸化和细胞凋亡等一系列体外检测中抑制(或中和)EGFR活性。举例来说，在一个实施例中，所检测的EGFR活性是对A431表皮癌细胞增殖的诱导作用(参看例如萨托(Sato)等人,“单克隆抗体对人类表皮生长因子受体的体外生物作用(Biological Effects in vitro of MonoclonalAntibodies to Human Epidermal Growth Factor Receptors)”,(1983),分子生物学与医学(Mol.Biol.Med.),1,511-529)。在此检测中，将A431细胞维持于DMEM加10%FBS中。第1天，将细胞放入PBS中20分钟，且胰蛋白酶处理5分钟，接着接种。使用穆提多谱384分液器(multidrop 384)，采用384孔格式，以15,000个细胞/孔的细胞密度，将细胞接种于经格林纳384TC(Greiner 384TC)处理的细胞培养板上。最终培养基体积为50μL。用透气胶带(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州瓦伦西亚(Valencia，CA))覆盖细胞培养板。使细胞粘附过夜。第2天，移除细胞培养基，并置换为50μL无酚红DMEM(无FBS)(“对照孔”)或DMEM与预期浓度为2.5μg/mL的抗EGFR抗体(“处理孔”)，一式两份。两个对照孔位于各处理孔相邻位置，总共192个对照孔。第3天，移除培养基并置换为含MTS细胞增殖试剂(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI)；1ml/10mL培养基)的无酚红DMEM。在15分钟和30分钟后记录在490nm下的吸光度。用所有一式两份的处理的平均值除以所有对照孔的平均值。

在某些实施例中，所检测的活性为EGFR酪氨酸激酶的磷酸化。所述活性检测可如下进行。使A431细胞在6孔板中生长到约70%汇合，并在DMEM 0.5%FBS中进行血清饥饿处理过夜。接着，将细胞与抗体稀释液在100nM EGF(优普泰特公司(Upstate))存在下一起培育1小时。用冷PBS洗涤细胞并用0.5mL溶解缓冲液溶解。(5O mM Tris-HClpH 7.4、1%IGEPGAL CA-630、0.25%去氧胆酸钠、150mM NaCl、1mM PMSF、1mM钒酸钠(NaVO₄)、1mM NaF、每10mL 1/2片蛋白酶混合物)。通过在10,000RPM下超速离心30分钟来移除不溶性物质。调整细胞溶解产物的蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE分离出等量的各提取物。通过蛋白质印迹法(Western blot)，用抗磷酸化EGFR抗体(优普泰特公司)显影来测定磷酸化EGFR的水平。

在其它实施例中，通过诱导A431细胞凋亡来检测抗EGFR抗体的活性。在此检测中，将以20000个细胞/孔处于24孔板中的A431细胞与1.0μg/mL抗EGFR抗体一起培育0、3、7、24或48小时。针对DNA断裂通过ELISA(罗氏公司(Roche))测量细胞凋亡。自平均值减去非特异性抗体的基线细胞凋亡。

其它EGFR中和检测格式是此项技术中已知的且可加以使用。

在各种实施例中，当本发明的抗EGFR抗体是以2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL浓度或在介于任何上述值之间范围内的浓度(例如在1μg/mL到5μg/mL范围内的浓度)使用时，所述抗EGFR抗体对EGFR的中和达到至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或在介于任何上述值之间的百分比(例如本发明的抗EGFR抗体对EGFR活性的中和达到50%到70%)。

在一些实施例中，本发明的抗EGFR抗体中和EGFR的功效是西妥昔单抗或hu225的至少0.7倍、0.8倍、至少0.9倍、至少1倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍，或相对于西妥昔单抗或hu225的中和EGFR的功效在介于任一对上述值之间的范围内(例如中和EGFR的功效是西妥昔单抗或hu225的0.9倍到5倍或者是西妥昔单抗或hu225的2倍到50倍)。

4.抗EGFR抗体的动力学性质

在某些实施例中，本发明的抗EGFR抗体对EGFR具有高结合亲和力。在特定实施例中，本发明的抗EGFR抗体具有特定缔合速率常数(k_on或k_a值)、解离速率常数(k_off或k_d值)、亲和力常数(K_A值)、解离常数(K_D值)和/或IC₅₀值。在某些方面中，所述值选自以下实施例。

在一些实施例中，本发明的抗EGFR抗体结合于EGFR的K_A(k_on/k_off)为至少10¹⁰M^-1、至少4×10¹¹M^-1、至少10¹¹M^-1、至少4×10¹²M^-1、至少10¹²M^-1、至少4×10¹³M^-1、至少10¹³M^-1、至少4×10¹⁴M^-1、至少10¹⁴M^-1、至少4×10¹⁵M^-1、至少10¹⁵M^-1，或K_A在介于任一对上述值之间的任何范围内(例如4×10¹¹M^-1到4×10¹³M^-1或4×10¹²M^-1到4×10¹⁵M^-1)。

在某些实施例中，本发明的抗EGFR抗体结合于EGFR的K_D(k_off/k_on)为10^-10M或10^-10M以下、4×10^-11M或4×10^-11M以下、10^-11M或10^-11M以下、4×10^-12M或4×10^-12M以下、10^-12M或10^-12M以下、4×10^-13M或4×10^-13M以下、10^-13M或10^-13M以下、4×10¹⁴M或4×10¹⁴M以下、10^-14M或10^-14M以下、4×10^-15M或4×10^-15M以下、10^-15M或10^-15M以下，或K_D在介于任一对上述值之间的任何范围内(例如4×10^-11M到4×10^-13M或4×10^-12M到4×10^-15M)。

在特定实施例中，通过此项技术中众所周知的检测(例如ELISA、等温滴定量热法(ITC)、荧光偏振检测，或任何其它生物传感器，例如BIAcore)来测定K_D(k_off/k_on)值。

在一些实施例中，本发明的抗EGFR抗体结合于EGFR，并抑制EGFR结合于其EGF配体，IC₅₀低于0.02nM、低于0.01nM、低于0.005nM、低于0.002nM、低于0.001nM、低于5×10^-4nM、低于2×10^-4nM、低于1×10^-4nM、低于5×10^-5nM、低于2×10^-5nM、低于1×10^-4nM、低于5×10^-6nM、低于2×10^-6nM、低于1×10^-6nM、低于5×10^-7nM、低于2×10^-7nM、低于1×10^-7nM，或IC₅₀在介于任一对上述值之间的任何范围内(例如0.02nM到2×10^-5nM，或5×10^-5nM到1×10^-7nM)。可根据此项技术中众所周知的方法(例如ELISA)测量IC₅₀。

在某些实施例中，在比较性检测中，本发明抗体的动力学性质可与西妥昔单抗或hu225相当，或相对于西妥昔单抗或hu225有所改良。举例来说，在某些实施例中，本发明的抗EGFR抗体结合于EGFR的k_on速率在西妥昔单抗或hu225的k_on的约0.5倍到1000倍范围内，例如，k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的0.75倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.1倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.2倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.3倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.4倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.5倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.6倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.6倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.7倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.8倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的1.9倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的2倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的2.25倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的2.5倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的2.75倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的3倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的4倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的5倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的6倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的7倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的8倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的9倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的10倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的15倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的20倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的50倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的75倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的100倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的150倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的200倍，或k_on在介于任一对上述值之间的范围内，例如k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的2倍到75倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的5倍到100倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的0.05倍到1000倍、k_on是西妥昔单抗或hu225的k_on的0.75倍到250倍等。

在各种实施例中，本发明的抗EGFR抗体结合于EGFR的k_off速率在西妥昔单抗或hu225的k_off的约0.001倍到约3倍范围内，例如，k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.002倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.003倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.004倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.005倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的0.006倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.0075倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的0.01倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.025倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.05倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.075倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.1倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.25倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.5倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.75倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的1倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的1.25倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的1.5倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的1.75倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的2倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的2.25倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的2.5倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的k_off的3倍，或k_off在介于任一对上述值之间的范围内，例如，k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.01倍到1.25倍、k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.05倍到2.5倍，或k_off是西妥昔单抗或hu225的k_off的0.006倍到0.1倍等。

在其它实施例中，本发明的抗EGFR抗体结合于EGFR的K_A(k_on/k_off)在西妥昔单抗或hu225的K_A的约0.25倍到约1000倍范围内，例如，K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的0.5倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的0.75倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的1倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的2倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的3倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的4倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的5倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的10倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的15倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的20倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的30倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的40倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的50倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的75倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的100倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的200倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的250倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的300倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的350倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的400倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的500倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的750倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的100倍，或K_A在介于任一对上述值之间的范围内，例如，K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的0.75倍到100倍、K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的10倍到50倍，或K_A是西妥昔单抗或hu225的K_A的5倍到50倍等。

在其它实施例中，本发明的抗EGFR抗体结合于EGFR的K_D(k_off/k_on)在西妥昔单抗或hu225的K_D的约0.001倍到10倍范围内，例如，K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.001倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.002倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.003倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.004倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.005倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.0075倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.01倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.025倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.05倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.075倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.1倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.2倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.3倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.4倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.5倍、K_D是西妥昔单抗的K_D的0.75倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的1倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的1.5倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的2倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的3倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的4倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的5倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的7.5倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的10倍，或K_D在介于任一对上述值之间的范围内，例如，K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.001倍到0.5倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.1倍到4倍、K_D是西妥昔单抗或hu225的K_D的0.05到1倍等。

在某些实施例中，本发明的抗EGFR抗体结合于EGFR，并抑制EGFR结合于EGF或中和EGFR的活性，IC₅₀值在西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的约0.001倍到10倍范围内，例如，IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.01倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.05倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.1倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.2倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.3倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.4倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.5倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.6倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.7倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.8倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.9倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的1倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的1.5倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的2倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的3倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的4倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的5倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的7.5倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的10倍，或IC₅₀在介于任一对上述值之间的范围内，例如，IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.01到0.2倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.1到1.5倍、IC₅₀值是西妥昔单抗或hu225的IC₅₀的0.2到2倍等。在某些实施例中，单一CDR取代可引起相比西妥昔单抗或hu225的上述IC₅₀差异，而与西妥昔单抗或hu225相比较，本发明的抗EGFR抗体可包含所述取代和至多16个其它CDR取代。

5.抗体偶联物

本发明的抗EGFR抗体包括抗体偶联物，其例如通过将任何类型的分子共价连接到所述抗体以使共价连接不会干扰与EGFR的结合来进行修饰。

在某些方面中，本发明的抗EGFR抗体可偶联于效应部分或标记。如本文所使用的术语“效应部分”包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白质(例如酶、其它抗体或抗体片段)、合成或天然存在的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、放射性核素(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金属、纳米粒子，和报导基团，例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。

在一个实例中，抗EGFR抗体可偶联于效应部分，例如细胞毒性剂、放射性核素或药物部分，以改进指定生物应答。效应部分可为蛋白质或多肽，例如(但不限于)毒素(例如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素A、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或白喉毒素)、信号传导分子(例如α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源性生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化因子)、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如血管抑制素(angiostatin)或内皮抑制素(endostatin))或生物应答调节剂，例如细胞激素或生长因子(例如白细胞介素-1(IL-I)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或神经生长因子(NGF))。

在另一实例中，效应部分可为细胞毒素或细胞毒性剂。细胞毒素和细胞毒性剂实例包括紫杉酚(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、吐根素(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、佐柔比星(daunorabicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素及其类似物或同系物。

效应部分也包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环硫磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露糖醇、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C5和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(anthracycline)(例如佐柔比星(daunorubicin)(先前的道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin)(先前的放线菌素)、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素和安曲霉素(anthramycin)(AMC)、卡奇霉素(calicheamicins)或倍癌霉素(duocarmycins))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。

其它效应部分可包括放射性核素，例如(但不限于)¹¹¹In和⁹⁰Y、Lu¹⁷⁷、铋²¹³、锎²⁵²、铱¹⁹²和钨¹⁸⁸/铼¹⁸⁸，以及药物，例如(但不限于)烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷(taxoid)和苏拉明(suramin)。

用于使所述效应部分偶联于抗体的技术是此项技术中众所周知的(参看例如海尔斯托姆(Hellstrom)等人,控制性药物递送(Controlled Drug Delivery),第2版,第623-53页(罗宾森(Robinson)等人编,1987))；斯洛普(Thorpe)等人,1982,免疫学评论(Immunol.Rev.)62:119-58；和杜波奇克(Dubowchik)等人,1999,药理学与治疗学(Pharmacology andTherapeutics)83:67-123)。

在一个实例中，抗EGFR抗体或其片段经由共价键(例如肽键)通过抗体的N末端或C末端或者在内部与另一蛋白质(或其部分；例如所述蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列融合。抗体或其片段可在所述抗体恒定结构域的N末端连接到其它蛋白质。可使用重组DNA程序产生所述融合物，例如，如WO 86/01533和EP0392745中所述。在另一实例中，效应分子可增加体内半衰期和/或增强抗体穿过上皮屏障到达免疫系统的递送。适合的此类效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如WO 2005/117984中所述者。

在某些方面中，抗EGFR抗体偶联于小分子毒素。在某些示范性实施例中，本发明的抗EGFR抗体偶联于海兔毒素(dolostatin)或海兔毒素肽类似物或衍生物，例如阿瑞他汀(auristatin)(美国专利第5,635,483号和第5,780,588号)。海兔毒素或阿瑞他汀药物部分可经由抗体的N(氨基)末端、C(羧基)末端或在内部连接到抗体(WO 02/088172)。示范性阿瑞他汀实施例包括N末端连接的单甲基阿瑞他汀药物部分DE和DF，如美国专利第7,498,298号中所揭示，所述专利以全文引用的方式并入本文中(揭示例如连接子和制备偶联于连接子的例如MMAE和MMAF等单甲基缬氨酸化合物的方法)。

在其它示范性实施例中，小分子毒素包括但不限于卡奇霉素、美登素(maytansine)(美国专利第5,208,020号)、单端孢霉烯(trichothene)和CC1065。在本发明的一个实施例中，抗体偶联于一个或一个以上美登素分子(例如每个抗体分子约1到约10个美登素分子)。举例来说，可将美登素转化成May-SS-Me，May-SS-Me可还原成May-SH3并与抗体反应(查瑞(Chari)等人,1992,癌症研究(Cancer Research)52:127-131)，以产生类美登素(maytansinoid)-抗体或类美登素-Fc融合偶联物。还可使用的卡奇霉素结构类似物包括但不限于γ₁ ¹、γ₃ ¹、γ₃ ¹-N-乙酰基-γ₁ ¹、PSAG和θ₁ ¹(海因曼(Hinman)等人,1993,癌症研究,53:3336-3342；罗德(Lode)等人,1998,癌症研究,58:2925-2928；美国专利第5,714,586号；美国专利第5,712,374号；美国专利第5,264,586号；美国专利第5,773,001号)。

本发明抗体也可偶联于脂质体用于靶向递送(参看例如帕克(Park)等人,1997,药理学进展(Adv.Pharmacol.)40:399-435；马提(Marty)和斯查文登纳(Schwendener),2004,分子医学方法(Methods in Molecular Medicine)109:389-401)。

在一个实例中，本发明抗体可连接到聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个特定实例中，抗体是抗体片段且PEG部分可通过位于抗体片段中的任何可用氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇、羟基或羧基)连接。所述氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组DNA方法工程改造到所述片段中。参看例如美国专利第5,219,996号。多个位点可用于连接两个或两个以上PEG分子。PEG部分可通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基共价连接。在使用硫醇基作为连接点的情况下，可使用经适当活化的效应部分，例如硫醇选择性衍生物，例如顺丁烯二酰亚胺和半胱氨酸衍生物。

在一个特定实例中，抗EGFR抗体偶联物是经修饰的Fab′片段，所述片段例如根据EP0948544中所揭示的方法经聚乙二醇化，即与PEG(聚(乙二醇))共价连接。也参看聚(乙二醇)化学、生物技术和生物医学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical andBiomedical Applications),(J.米尔顿哈瑞丝(J.Milton Harris)(编),派拉蒙出版社(PlenumPress),纽约(New York),1992)；聚(乙二醇)化学与生物应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications),(J.米尔顿哈瑞丝和S.扎利浦斯基(S.Zalipsky)编,美国化学协会(American Chemical Society),华盛顿哥伦比亚特区(Washington D.C.),1997)；和生物偶联：生物医学科学的蛋白质偶合技术(Bioconjugation Protein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences),(M.艾斯兰(M.Aslam)和A.登特(A.Dent),编,格鲁夫出版社(Grove Publishers),纽约,1998)；以及查普曼(Chapman),2002,先进药物递送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)54:531-545。PEG可连接到铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，经PEG修饰的Fab′片段具有顺丁烯二酰亚胺基共价连接到经修饰铰链区中的单一硫醇基。赖氨酸残基可共价连接到顺丁烯二酰亚胺基，且分子量为约20,000Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物可连接到所述赖氨酸残基上的各胺基。因此，PEG连接到Fab′片段的总分子量可为约40,000Da。

“标记”一词当于本文中使用时是指可直接或间接偶联于本发明的抗EGFR抗体的可检测化合物或组合物。标记自身可为可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶标记情况下可催化底物化合物或组合物发生可检测的化学变化。适用的荧光部分包括但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红素等。适用的酶标记包括但不限于碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶等。

在以下的第5部分中描述特别适用于诊断目的的其它抗EGFR抗体偶联物。

6.抗EGFR抗体的诊断应用

本发明的抗EGFR抗体，包括已通过例如生物素标记、辣根过氧化酶或任何其它可检测部分(包括第4部分中所描述的可检测部分)修饰的抗体，可有利地用于诊断目的。

详细说来，可使用抗EGFR抗体以例如(但不限于)纯化或检测EGFR，包括体外和体内诊断方法。举例来说，所述抗体可用于免疫检测中以定性和定量地测量生物样本中的EGFR水平。参看例如哈罗(Harlow)等人,抗体实验手册(Antibodies:A LaboratoryManual),第2版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1988)，所述文献以全文引用的方式并入本文中。

本发明进一步涵盖偶联于诊断剂的抗EGFR抗体或其片段。举例来说，所述抗体可在诊断上用于检测特定细胞、组织或血清中相关目标的表达；或监控免疫应答的发生或发展作为临床测试程序的一部分以便例如确定指定治疗方案的功效。通过使抗体偶合到可检测物质可有助于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。可检测物质可直接或者使用此项技术中已知的技术经由中间物(例如此项技术中已知的连接子)间接偶合或偶联于抗体(或其片段)。酶标记的实例包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4,737,456号)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、例如辣根过氧化酶(HRPO)等过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化酶(lactoperoxidase)、微过氧化酶(microperoxidase)等。适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素/生物素；适合荧光物质的实例包括伞酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素(aequorin)；且适合放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹Tc。

本发明提供EGFR表达的检测，其包含使用一种或一种以上本发明的抗EGFR抗体(任选偶联于可检测部分)接触生物样本(个体的细胞、组织或体液)，和检测样本是否对于EGFR表达呈阳性，或样本的表达与对照样本相比是否已改变(例如降低或增加)。

可使用本发明方法诊断的疾病包括但不限于本文中所述的疾病。在某些实施例中，组织或体液为周边血液、周边血液白细胞、活检组织(例如乳房或淋巴结活检组织)和组织。

7.使用抗EGFR抗体的治疗方法

7.1临床效益

本发明的抗EGFR抗体可用于治疗各种赘瘤。在某些方面中，本发明的抗EGFR抗体可用于治疗蒙尼柴尔病。

本发明的抗体适用于治疗肿瘤，包括癌症和良性肿瘤。更具体说来，可适于用本发明抗体的治疗的癌症包括过度表达EGFR的癌症。在某些实施例中，可适于用本文所揭示的抗体的治疗的癌症包括上皮细胞癌。在特定实施例中，可适于用本发明的抗EGFR抗体的治疗的癌症包括乳癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食管癌、阴道癌、子宫颈癌、脾癌、睾丸癌和胸腺癌。在一些特定实施例中，使用本发明的抗EGFR抗体治疗人类患者的头颈癌。在其它实施例中，使用本发明的抗EGFR抗体治疗人类患者的结肠直肠癌。

因此，本发明提供治疗有需要的患者的任何上述疾病的方法，其包含：投予所述患者本发明的抗EGFR抗体。任选在例如1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月或3个月之后重复所述投药。可以相同剂量或不同剂量进行重复投药。投药可重复1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或10次以上。举例来说，根据某些给药方案，患者接受抗EGFR疗法一段较长时间，例如6个月、1年或1年以上。在某些实施例中，投予患者的抗EGFR抗体的量为治疗有效量。如本文所使用，EGFR抗体的“治疗有效”量可以单次剂量投予或经治疗方案的疗程投予，例如经1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月、1年或1年以上的疗程投予。示范性治疗方案描述于下文的第9部分中。

根据本发明，治疗疾病涵盖治疗已经诊断患有处于任何临床阶段或呈任何表现的任何形式疾病的患者；延迟疾病症状或病征的发作或进展或加重或恶化；和/或预防疾病和/或降低疾病的严重程度。

本发明抗EGFR抗体所投予的“个体”或“患者”优选为哺乳动物，例如非灵长类动物(例如母牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴或人类)。在某些实施例中，个体或患者为人类。在某些方面中，人类为成年患者。在其它方面中，人类为儿科患者。

8.医药组合物和投药途径

本文中提供包含本发明的抗EGFR抗体和任选使用的一种或一种以上其它治疗剂(例如以下第8部分中所描述的组合治疗剂)的组合物。组合物通常将作为无菌医药组合物的一部分供应，所述无菌医药组合物通常将包括医药学上可接受的载剂。此组合物可呈任何适合形式(取决于将其投予患者的所需方法)。

本发明的抗EGFR抗体可通过各种途径投予患者，例如经口、透皮、经皮下、经鼻内、经静脉内、经肌肉内、经眼内、经局部、经鞘内和经脑室内。在任何指定情况下最适合的投药途径将取决于特定抗体、个体以及疾病的性质和严重程度及个体的身体状况。

为了治疗本文所述的适应症，本发明抗EGFR抗体的有效剂量可为每单次投药(例如推注(bolus))、多次投药或连续投药在约0.1到约500mg/m²范围内(即，对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般成年人，为约0.003到约13mg/kg)，或每单次投药(例如推注)、多次投药或连续投药达到0.01-5000μg/mL血清浓度的血清浓度，或其中的任何有效范围或值，视所治疗的病状、投药途径以及个体的年龄、体重和状况而定。在某些实施例中，例如，为了治疗癌症，各剂量可在每平方米体表面积约0.5毫克到约250毫克范围内，例如每平方米体表面积约1.0毫克到约100毫克，例如每平方米体表面积约5毫克到约50毫克。抗体可调配成水溶液并通过皮下注射来投药。

医药组合物宜以每剂含有预定量的本发明抗EGFR抗体的单位剂量形式存在。所述单位可含有例如(但不限于)0.1mg到5g，例如1mg到1g或10到50mg。适用于本发明的医药学上可接受的载剂可呈多种形式，视例如待治疗的病状或投药途径而定。

可通过混合具有所需纯度的本发明的抗EGFR抗体与通常用于此项技术中的任选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(在本文中都称为“载剂”，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等张剂(isotonifier)、非离子型清洁剂、抗氧化剂和其它多种多样的添加剂)，将本发明抗体的治疗性调配物制备为冻干调配物或水溶液形式以供储存。参看雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences),第16版(奥索(Osol)编，1980)。所述添加剂必须在所用剂量和浓度下对接受者无毒。

缓冲剂有助于将pH值维持在接近生理条件的范围内。其浓度可在约2mM到约50mM范围内。适用于本发明的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、丁二酸盐缓冲剂(例如，丁二酸丁二酸一钠混合物、丁二酸-氢氧化钠混合物、丁二酸-丁二酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、反丁烯二酸盐缓冲剂(例如，反丁烯二酸-反丁烯二酸一钠混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二钠混合物、反丁烯二酸一钠-反丁烯二酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐，例如Tris。

可添加防腐剂以阻止微生物生长，且其可以在0.2%-1%(w/v)范围内的量添加。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯甲烃铵卤化物(benzalconium halide)(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六烃季铵和对羟基苯甲酸烷基酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可添加等张剂(有时称为“稳定剂”)以确保本发明液体组合物的等张性，且其包括多羟基糖醇，例如三羟基或更多羟基糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指一大类赋形剂，其功能可在增积剂到使治疗剂溶解或有助于防止变性或粘着于容器壁的添加剂的范围内。典型稳定剂可为多羟基糖醇(上文列举)；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖、岩藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、内消旋肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括环醇(cyclitol)，例如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如具有10个或10个以下残基的肽)；蛋白质，例如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；双糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，例如棉子糖；以及多糖，例如葡聚糖。存在的稳定剂可在每重量份活性蛋白质0.1到10,000重量份范围内。

可添加非离子型表面活性剂或清洁剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免于发生搅动诱发的聚集，其也允许调配物暴露于承受应力的剪切面而不引起蛋白质变性。适合的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、普流尼克多元醇(Pluronic polyol)、聚氧化乙烯脱水山梨糖醇单醚(TWEEN-20、TWEEN

-80等)。存在的非离子型表面活性剂可在约0.05mg/mL到约1.0mg/mL的范围内，例如为约0.07mg/mL到约0.2mg/mL。

其它多种多样的赋形剂包括增积剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。

本文的调配物除本发明抗EGFR抗体以外也可含有组合治疗剂。适合的组合治疗剂的实例提供于以下第8部分中。

皮下投药的给药时程可在每6个月1次到每天1次间变化，此取决于许多临床因素，包括疾病类型、疾病严重程度和患者对抗EGFR抗体的敏感性。

本发明抗EGFR抗体的投药剂量将根据特定抗体、疾病类型、个体和疾病严重程度、个体的身体状况、治疗方案(例如是否使用组合治疗剂)和所选投药途径而变化；所属领域技术人员可容易地确定适当剂量。

所属领域技术人员应了解，本发明抗EGFR抗体的最佳量和个别剂量的间隔将由所治疗病状的性质和程度、投药形式、途径和部位，以及所治疗的特定个体的年龄和状况决定，且医师将最终确定将使用的适当剂量。每当适当时可重复此剂量。如果发生副作用，那么可根据常规临床实践来改变或降低剂量的量和/或频率。

9.组合疗法

下文描述可利用本发明抗EGFR抗体的组合方法。本发明的组合方法涉及投予患者至少两种药剂，其中第一种药剂为本发明的抗EGFR抗体，且第二种药剂为组合治疗剂。抗EGFR抗体与组合治疗剂可同时、依序或分开投予。

本发明的组合疗法可产生比相加效应大的效应，从而提供治疗效益，其中抗EGFR抗体与组合治疗剂都不以单独治疗有效的量投予。

在本发明方法中，本发明的抗EGFR抗体和组合治疗剂可并行(同时或依次)投予。如本文所使用，如果本发明的抗EGFR抗体和组合治疗剂在同一天(例如，在同一患者就诊期间)投予患者，那么就认为本发明的抗EGFR抗体和组合治疗剂为依次投予。依次投药可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小时进行。相比之下，如果本发明的抗EGFR抗体和组合治疗剂在不同日投予患者，例如，本发明的抗EGFR抗体和组合治疗剂可间隔1天、2天或3天、1周、2周或1个月投予，就认为其为分开投予。在本发明方法中，可在投予组合治疗剂之前或之后投予本发明的抗EGFR抗体。

作为一个非限制性实例，可在一段时间内并行投予本发明的抗EGFR抗体和组合治疗剂，接着在第二段时间内交替投予本发明的抗EGFR抗体和组合治疗剂。

由于投予本发明的抗EGFR抗体和组合治疗剂具有潜在的协同效应，故可以单独投予所述药剂中的一或两者时不具治疗有效性的量投予所述药剂。

在某些方面中，组合治疗剂为化疗剂、抗血管生成剂、抗风湿病药物、消炎剂、放射治疗剂、免疫抑制剂或细胞毒性药物。

预期当用于治疗各种疾病时，本发明的抗EGFR抗体可与适于相同或相似疾病的其它治疗剂组合。当用于治疗癌症时，本发明抗体可与常规癌症疗法(例如外科手术、放射疗法、化学疗法或其组合)组合使用。

在一些其它方面中，可与本发明抗体一起用于组合肿瘤疗法的其它治疗剂包括涉及肿瘤生长的其它因子(例如HER2、HER3、HER4、VEGF或TNF-α)的拮抗剂，例如抗体。

有时，为了治疗癌症，还投予患者一种或一种以上细胞激素可能有益。在一个优选实施例中，将抗EGFR抗体与生长抑制剂共投予。

生长抑制剂的适合剂量为目前所使用的剂量且可能因生长抑制剂与抗EGFR抗体的组合作用(协同作用)而有所降低。

为了治疗癌症，可适当地将消炎剂与本发明的抗EGFR抗体组合使用。消炎剂包括但不限于乙酰氨基酚、苯海拉明(diphenhydramine)、美吡利啶(meperidine)、地塞米松(dexamethasone)、颇得斯安(pentasa)、美沙拉嗪(mesalazine)、安肠克(asacol)、磷酸可待因(codeine phosphate)、贝诺酯(benorylate)、芬布芬(fenbufen)、萘普生(naprosyn)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)以及吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹灵(aspirin)和布洛芬(ibuprofen)。

为了治疗癌症，可适当地将化疗剂与本发明的抗EGFR抗体组合使用。化疗剂包括但不限于放射性分子、毒素(也称为细胞毒素或细胞毒性剂，其包括对细胞活力有害的任何药剂)、含有化学治疗化合物的药剂和脂质体或其它小泡(vesicle)。适合化学治疗剂的实例包括但不限于1-脱氢睾酮、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、放线菌素D、阿德力霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、抗α5β1整合素抗体、烷化剂、别嘌呤醇钠(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、安曲霉素(AMC)、抗有丝分裂剂、顺二氯二胺基铂(II)(DDP)顺铂、二氨基二氯铂、蒽环霉素、抗生素、抗代谢物、天冬酰胺酶、BCG活菌(膀胱内)、倍他米松磷酸钠(betamethasone sodium phosphate)和醋酸倍他米松、比卡鲁胺(bicalutamide)、硫酸博莱霉素、白消安、亚叶酸钙(calcium leucouorin)、卡奇霉素、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨(Cladribine)、秋水仙碱、偶联雌激素、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、环硫磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷、细胞松弛素B(cytochalasin B)、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪、放线菌素D、放线菌素D(先前的放线菌素)、盐酸佐柔比星、柠檬酸佐柔比星、地尼白介素毒素连接物(denileukin diftitox)、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴甘露糖醇、二羟基炭疽菌素二酮、多西他赛(Docetaxel)、甲磺酸多拉司琼(dolasetron mesylate)、盐酸多柔比星、屈大麻酚(dronabinol)、大肠杆菌L-天冬酰胺酶、依洛西单抗(eolociximab)、吐根素、依泊汀-α(epoetin-α)、伊文氏杆菌属L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)、酯化雌激素、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀(estramustine)磷酸钠、溴化乙锭、乙炔雌二醇、依替膦酸盐(etidronate)、依托泊苷嗜橙菌因子(etoposide citrororum factor)、磷酸依托泊苷、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟达拉宾(fludarabine phosphate)、氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、亚叶酸、盐酸吉西他滨(gemcitabine HCL)、糖皮质激素、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、短杆菌肽D、盐酸格拉司琼(granisetron HCL)、羟基脲、盐酸伊达比星(idarubicin HCL)、异环磷酰胺、干扰素α-2b、盐酸伊立替康、来曲唑(letrozole)、亚叶酸钙、乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)、盐酸左旋咪唑(levamisole HCL)、利多卡因、洛莫司汀、类美登素、盐酸氮芥、乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、盐酸美法仑、巯基嘌呤、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤、甲睾酮、光神霉素、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、尼鲁胺(nilutamide)、乙酸奥曲肽(octreotide acetate)、盐酸昂丹司琼(ondansetron HCL)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸二钠(pamidronate disodium)、喷司他汀(pentostatin)、盐酸毛果芸香碱(pilocarpineHCL)、吡利霉素(plimycin)、以聚苯丙生20为载体的卡莫司汀植入剂(polifeprosan 20 withcarmustine implant)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、普鲁卡因、盐酸丙卡巴肼(procarbazineHCL)、普萘洛尔、利妥昔单抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、链脲佐菌素、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉酚、替尼泊苷(teniposide)、替诺泊苷、睾内酯、四卡因、噻替派苯丁酸氮芥、硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、盐酸拓朴替康(topotecan HCL)、柠檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、伐柔比星(valrubicin)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱和酒石酸长春瑞宾(vinorelbine tartrate)。

任何抗血管生成剂都可与本发明的抗EGFR抗体联合使用，包括卡密雷特(Carmeliet)和杰恩(Jain),2000,自然,407:249-257所列出者。在某些实施例中，抗血管生成剂为VEGF拮抗剂或另一VEGF受体拮抗剂，例如VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制剂和其任何组合。或者，或另外，抗VEGF抗体可共投予患者。

在某些实施例中，例如，为了治疗蒙尼柴尔病，抗EGFR抗体可与TNF-α拮抗剂联合使用。所述TNF-α拮抗剂的实例包括但不限于可溶性TNF-α受体；依那西普(etanercept)(ENBRELTM；印木内克斯公司(Immunex))或其片段、衍生物或类似物；英利昔单抗(infliximab)(REMICADE

森托克公司(Centacor))或其衍生物、类似物或抗原结合片段；IL-10，已知其经由干扰素-γ活化的巨噬细胞阻断TNF-α产生(奥斯沃德(Oswald)等人,1992,美国国家科学院院刊,89:8676-8680)；TNFR-IgG(阿什肯纳兹(Ashkenazi)等人,1991,美国国家科学院院刊,88:10535-10539)；鼠类制品TBP-1(雪兰诺(Serono)/烨达(Yeda)公司)；疫苗CytoTAb(普斯雷克公司(Protherics))；反义分子104838(艾斯公司(ISIS))；肽RDP-58(萨格斯塔公司(SangStat))；沙力度胺(thalidomide)(赛基公司(Celgene))；CDC-801(赛基公司)；DPC-333(杜邦公司(Dupont))；VX-745(伟特克公司(Vertex))；AGIX-4207(阿瑟罗公司(AtheroGenics))；ITF-2357(意大泛马克公司(Italfarmaco))；NPI-13021-31(尼尔斯公司(Nereus))；SCIO-469(斯西奥公司(Scios))；TACE目标剂(targeter)(印木内克斯公司/AHP公司)；CLX-120500(凯丽克斯公司(Calyx))；噻唑并嘧啶(Thiazolopyrim)(戴纳瓦斯公司(Dynavax))；金诺芬(auranofin)(瑞得(Ridaura))(史克必成制药公司(SmithKline Beecham Pharmaceuticals))；喹吖因(quinacrine)(二氯水合米帕林(mepacrine dichlorohydrate))；替尼达普(tenidap)(恩纳布斯(Enablex))；黑色素(Melanin)(大规模生物公司(Large Scale Biological))；和抗p38MAPK剂(乌里亚奇公司(Uriach))。在各种实施例中，TNF-α拮抗剂为抗体。

在一些方面中，抗EGFR抗体可与小分子蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制剂联合使用。在一些实施例中，PTK抑制剂对EGFR酪氨酸激酶具有特异性。在其它实施例中，PTK抑制剂结合于酪氨酸激酶HER家族的一个以上成员(例如EGFR、HER2和/或HER4)。在其它实施例中，PTK抑制剂结合于并抑制与一个或一个以上HER家族成员相互作用或受一个或一个以上HER家族成员调节的一种或一种以上蛋白质(例如与由一个或一个以上HER家族成员发起的一个或一个以上信号传导级联有关的蛋白质)的酪氨酸激酶。在其它实施例中，适用于本发明组合物和方法中的蛋白质酪氨酸激酶抑制剂包括PTK抑制剂，其不会选择性结合于受体酪氨酸激酶HER家族，而是还结合于其它蛋白质家族(例如VEGFR、PDGFR和/或Raf)的酪氨酸激酶结构域。

在一些实施例中，酪氨酸激酶为受体酪氨酸激酶，即具有细胞外配体结合结构域且通过结合一个或一个以上配体活化的较大蛋白质的细胞内结构域。在某些实施例中，蛋白质酪氨酸激酶为非受体酪氨酸激酶。用于本发明方法中的PTK抑制剂包括但不限于适用于本发明方法和组合物中的PTK抑制剂，包括但不限于吉非替尼(gefitinib)(ZD-1839，Iressa

)、埃罗替尼(erlotinib)(OSI-1774，Tarceva^TM)、卡奈替尼(canertinib)(CI-1033)、凡德他尼(vandetanib)(ZD6474，Zactima

)、替伏汀(tyrphostin)AG-825(CAS 149092-50-2)、拉帕替尼(lapatinib)(GW-572016)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006)、AG-494(CAS133550-35-3)、RG-13022(CAS 149286-90-8)、RG-14620(CAS 136831-49-7)、BIBW 2992(Tovok)、替伏汀9(CAS 136831-49-7)、替伏汀23(CAS 118409-57-7)、替伏汀25(CAS118409-58-8)、替伏汀46(CAS 122520-85-8)、替伏汀47(CAS 122520-86-9)、替伏汀53(CAS122520-90-5)、紫铆因(butein)(1-(2,4-二羟基苯基)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-丙烯-1-酮2′,3,4,4′-四羟基查耳酮(chalcone)；CAS 487-52-5)、姜黄素(curcumin)((E,E)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮；CAS 458-37-7)、N4-(1-苯甲基-1H-吲唑-5-基)-N6,N6-二甲基-吡啶并-[3,4-d]-嘧啶-4,6-二胺(202272-68-2)、AG-1478、AG-879、环丙烷甲酸-(3-(6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-苯基)-酰胺(CAS 879127-07-8)、N8-(3-氯-4-氟苯基)-N2-(1-甲基哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺·2HCl(CAS196612-93-8)、4-(4-苯甲基氧基苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉(CAS 179248-61-4)、N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基)2-丁炔酰胺(CAS 881001-19-0)、EKB-569、HKI-272和HKI-357。

在一个特定实施例中，本发明的抗EGFR抗体与放射疗法组合使用。此组合特别适于初步治疗患有局部或区域性晚期头颈部鳞状细胞癌的患者。

在另一特定实施例中，在基于铂的疗法失败后使用本发明的抗EGFR抗体作为单一药剂。此方案特别适于治疗患有复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌的患者。

在又一特定实施例中，在基于伊立替康和基于奥沙利铂(oxaliplatin)的疗法失败后使用本发明的抗EGFR抗体作为单一药剂。此方案特别适于治疗患有过度表达EGFR的转移性结肠直肠癌的患者。此方案也特别适于治疗患有过度表达EGFR的转移性结肠直肠癌且不能耐受基于伊立替康的疗法的患者。

在另一特定实施例中，本发明的抗EGFR抗体与伊立替康组合使用。此组合特别适于治疗患有过度表达EGFR的转移性结肠癌且用基于伊立替康的化学疗法难以治愈的患者。

10.治疗方案

本发明提供涉及投予本发明的抗EGFR抗体的治疗方案。治疗方案将视患者的年龄、体重和疾病病状而改变。治疗方案可持续2周到无限期。在特定实施例中，治疗方案持续2周到6个月、3个月到5年、6个月到1或2年、8个月到18个月等。治疗方案可为不变剂量的方案或多个可变剂量的方案。

对于下文所述的示范性剂量方案，抗EGFR抗体可以适于皮下投药的无菌无防腐剂溶液形式投予。

为了与放射疗法组合治疗局部或区域性晚期头颈部鳞状细胞癌，可在开始放射疗法前一周，以0.1到500mg/m²(例如对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般成年人而言，为0.003到13.3mg/kg)的初始剂量经静脉内投予本发明的抗EGFR抗体。在特定实施例中，初始剂量为0.1-400mg/m²、0.25-300mg/m²、0.5-250mg/m²、1-200mg/m²、1-150mg/m²、2-100mg/m²、5-75mg/m²、8-50mg/m²、10-350mg/m²、15-300mg/m²、20-250mg/m²、30-200mg/m²或40-100mg/m²。在初始剂量之后，可每周经静脉内投予0.1到300mg/m²(即，对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般人而言，为0.003到8mg/kg)剂量的本发明抗EGFR抗体，持续6到7周(即放射疗法的持续时间)。在特定实施例中，后续每周剂量为0.1到250mg/m²，例如0.5-200mg/m²、例如1-150mg/m²、例如2-100mg/m²、例如2.5-100mg/m²、例如5-75mg/m²、例如10-50mg/m²、例如15-150mg/m²、例如20-100mg/m²、例如30-125mg/m²、例如40-150mg/m²，或例如50-175mg/m²。

为了在先前基于铂的疗法治疗失败后治疗复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌，以0.1到500mg/m²(例如对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般成年人而言，为0.003到13.3mg/kg)的初始剂量经静脉内投予呈单一药剂形式的本发明抗EGFR抗体。在特定实施例中，初始剂量为0.1-400mg/m²、0.25-300mg/m²、0.5-250mg/m²、1-200mg/m²、1-150mg/m²、2-100mg/m²、5-75mg/m²、8-50mg/m²、10-350mg/m²、15-300mg/m²、20-250mg/m²、30-200mg/m²或40-100mg/m²。在初始剂量之后，可每周一次经静脉内投予0.1到300mg/m²(即，对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般成年人而言，为0.003到8mg/kg)剂量的本发明抗EGFR抗体。在特定实施例中，后续每周剂量为0.1到250mg/m²，例如0.5-200mg/m²，例如1-150mg/m²，例如2-100mg/m²，例如2.5-100mg/m²，例如5-75mg/m²，例如10-50mg/m²，例如15-150mg/m²，例如20-100mg/m²，例如30-125mg/m²，例如40-150mg/m²，例如50-175mg/m²。

为了在基于伊立替康和基于奥沙利铂的疗法治疗失败后治疗表达EGFR的结肠直肠癌或治疗不能耐受基于伊立替康的方案的患者的表达EGFR的结肠直肠癌，以0.1到500mg/m²(例如对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般成年人而言，为0.003到13.3mg/kg)的初始剂量经静脉内投予呈单一药剂形式的本发明抗EGFR抗体。在特定实施例中，初始剂量为0.1-400mg/m²、0.25-300mg/m²、0.5-250mg/m²、1-200mg/m²、1-150mg/m²、2-100mg/m²、5-75mg/m²、8-50mg/m²、10-350mg/m²、15-300mg/m²、20-250mg/m²、30-200mg/m²或40-100mg/m²。在初始剂量之后，可每周一次经静脉内投予0.1到300mg/m2(即，对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般成年人而言，为0.003到8mg/kg)剂量的本发明抗EGFR抗体。在特定实施例中，后续每周剂量为0.1到250mg/m²，例如0.5-200mg/m²，例如1-150mg/m²，例如2-100mg/m²，例如2.5-100mg/m²，例如5-75mg/m²，例如10-50mg/m²，例如15-150mg/m²，例如20-100mg/m²，例如30-125mg/m²，例如40-150mg/m²，例如50-175mg/m²。

为了治疗用基于伊立替康的化学疗法难以治愈的患者的表达EGFR的转移性结肠直肠癌，以0.1到500mg/m²(例如对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般成年人而言，为0.003到13.3mg/kg)的初始剂量经静脉内投予呈单一药剂形式的本发明抗EGFR抗体。在特定实施例中，初始剂量为0.1-400mg/m²、0.25-300mg/m²、0.5-250mg/m²、1-200mg/m²、1-150mg/m²、2-100mg/m²、5-75mg/m²、8-50mg/m²、10-350mg/m²、15-300mg/m²、20-250mg/m²、30-200mg/m²或40-100mg/m²。在初始剂量之后，每周一次经静脉内投予0.1到300mg/m²(即，对于体重为60kg且体表面积为1.6m²的一般成年人而言，为0.003到8mg/kg)剂量的本发明抗EGFR抗体。在特定实施例中，后续每周剂量为0.1到250mg/m²，例如0.5-200mg/m²，例如1-150mg/m²，例如2-100mg/m²，例如2.5-100mg/m²，例如5-75mg/m²，例如10-50mg/m²，例如5-150mg/m²，例如20-100mg/m²，例如30-125mg/m²，例如40-150mg/m²，例如50-175mg/m²。

11.诊断和医药试剂盒

本发明涵盖含有本发明抗EGFR抗体(包括抗体偶联物)的医药试剂盒。医药试剂盒为包含本发明抗EGFR抗体(例如呈冻干形式或呈水溶液形式)和以下各物中一者或一者以上的封装：

·组合治疗剂，例如，如上文的第8部分中所述；

·用于投予抗EGFR抗体的装置，例如笔、针和/或注射器；和

·在抗体呈冻干形式时用于再悬浮所述抗体的医药级水或缓冲液。

在某些方面中，抗EGFR抗体的各单位剂量是分开封装，且试剂盒可含有一个或一个以上单位剂量(例如两个单位剂量、三个单位剂量、四个单位剂量、五个单位剂量、八个单位剂量、十个单位剂量或十个以上单位剂量)。在一个特定实施例中，一个或一个以上单位剂量各自安置于注射器或笔中。

本文也涵盖含有本发明抗EGFR抗体(包括抗体偶联物)的诊断试剂盒。所述诊断试剂盒为包含本发明抗EGFR抗体(例如呈冻干形式或呈水溶液形式)和一种或一种以上适用于进行诊断检测的试剂的封装。在抗EGFR抗体经酶标记的情况下，所述试剂盒可包括所述酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或溶解缓冲液)等。在某些实施例中，将诊断试剂盒中所包括的抗EGFR抗体固定在固体表面上，或将上面可固定所述抗体的固体表面(例如载玻片)包括在所述试剂盒中。各种试剂的相对量可变化极大以便提供实质上优化检测灵敏度的试剂溶液浓度。在一个特定实施例中，抗体和一种或一种以上试剂可以通常经冻干的干粉形式提供(个别或组合)，其中包括在溶解时即提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。

实例1：比较西妥昔单抗(ERBITUX)与HU225对EGFR的结合亲和力

通过竞争检测，使用荧光活化细胞分选术(FACS)来测定西妥昔单抗与hu225对EGFR的相对结合亲和力。使A431细胞在V形底96孔板上生长到2×10⁵个细胞/孔。用FACS染色缓冲液(FSB)洗涤细胞。以10μg/mL各竞争抗体(未经标记的西妥昔单抗和hu225)的初始浓度开始，进行1:3连续稀释。将经生物素标记的西妥昔单抗稀释到0.5μg/mL的最终浓度(由滴定结果得到)。接着，将经生物素标记的西妥昔单抗与各种浓度的任一竞争抗体混合，并将混合物转移到含有A431细胞的96孔板。接着在冰上培育板1小时，接着用FSB洗涤两次。将在FSB中稀释到2.5μg/mL的25μL抗生蛋白链菌素-RPE偶联物(拜耳索斯公司(Biosource))添加到各孔中，且在冰上于黑暗中再培育所述板30分钟。用FSB洗涤细胞两次，且用200μL固定缓冲液(1%三聚甲醛)再悬浮经染色的细胞。使用流式细胞仪读取样本。

三次实验的结果显示于图2中，且其表明所测量的西妥昔单抗与hu225对EGFR的结合亲和力(IC₅₀)相当。术语“chErbitux”是指西妥昔单抗。

实例2：鉴别对EGFR的亲和力增加的HU225变体

对hu225抗体进行综合性突变分析以鉴别与野生型hu225相比对EGFR的亲和力增加的突变体。通过FACS分析与hu225相比对EGFR的亲和力增加的候选高亲和力突变体以证实与hu225相比较，其与EGFR的结合相对增加。

1.材料和方法

为了测定个别变体与EGFR的结合，在亚饱和条件(低于K_D)下培育细胞表面呈现的hu225免疫球蛋白变体与可溶性EGFR，且通过FACS定量结合度。在哺乳动物细胞表面呈现载体中构筑个别hu225变体(赤松(Akamatsu)等人,2007,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)327(1-2):40-52)，并转染到人类细胞系中。将含400ng质粒DNA的50μL杂交瘤-无血清培养基(SFM)与含1μL脂染胺2000(Lipofectamine 2000)的50μL杂交瘤-SFM混合，并在室温下培育20分钟。接着，将此混合物添加到24孔板中先前在24小时之前在补充有10%胎牛血清和0.25mg/mL G418的0.5mL DME培养基中接种有人类胚肾源性细胞系293c18的2×10⁵个细胞的一个孔中。48小时后，收集细胞并准备进行FACS染色。

对于FACS染色，在1mL磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)加0.5%牛血清白蛋白(BSA)中培育约5×10⁵个细胞与1nM EGFR-Cλ-AF647(与Cλ融合且直接与艾丽莎氟647(AlexaFluor 647)染料偶联的EGFR细胞外结构域)和按1/500稀释的山羊抗人类κ-PE(南方生物技术公司(Southern Biotech)#2060-09)，且在室温下培育2小时。用1mL冷PBS+0.5%BSA洗涤细胞3次，再悬浮于200μL PBS+1%甲醛中，并在BD FACS Calibur上加以分析。细胞经门控处理(gated)而仅包括表达IgG的群体，且测定结合(艾丽莎氟647)通道的平均荧光强度(MFI)。对于各样本组，将各变体的结合的MFI与野生型hu225相比较以便针对实验间可变性进行正规化。

2.结果

表3和4显示hu225重链和轻链CDR中由FACS研究表明增加对EGFR的亲和力的突变。这些hu225变体与EGFR的结合显示于图3中。FACS研究的结果以对EGFR的亲和力超过野生型hu225的增加倍数列于表14-1和14-2中。

表5和7显示hu225重链CDR中由初步研究表明对EGFR的亲和力比hu225高的其它突变(数据未显示)。表6和8显示hu225轻链CDR中由初步研究表明对EGFR的亲和力比hu225高的其它突变(数据未显示)。表9和10分别显示由初步研究表明对EGFR的亲和力类似于hu225的重链变体和轻链变体(数据未显示)。

实例3：进一步表征对EGFR的亲和力增加的HU225变体(ELISA、ALPHALISA

和BIACORE研究)

1.材料和方法

为了测定个别变体与EGFR的结合，在亚饱和条件(低于K_D)下培育细胞表面呈现的hu225免疫球蛋白变体与可溶性EGFR，且通过FACS(如上文的实例2中所述)、ELISA、alphaLISA和/或BIAcore定量结合度。

ELISA涉及使捕捉抗体附着到固相支撑物上，接着在所述支撑物上将含有抗原的样本添加到适宜使对固相的附着减到最少的基质或缓冲液中。接着添加经酶标记的抗体以检测并测定结合亲和力。ELISA可用于测定个别变体(例如本发明的抗EGFR抗体或抗体结合片段)对EGFR的结合亲和力。参看例如帕特尔(Patel)等人,抗癌研究(AnticancerResearch)27,第5A:3355-3366号,2007；和尼克斯(Nix)等人,“免疫检测实践方法(Immunoassays,a Practical Approach)”,J.P.古斯灵(J.P.Gosling)编,第239-261页,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)。

AlphaLISA类似于ELISA：通过结合于经抗生蛋白链菌素涂布的供体珠粒的经生物素标记的抗体和偶联于AlphaLISA受体珠粒的第二抗体来捕捉分析物。两种抗体与分析物的结合使供体珠粒与受体珠粒接近。在680nm下激光照射供体珠粒产生单态氧流，在附近的受体珠粒中引发化学事件级联，所述级联在615nm下引起化学发光发射。在竞争性AlphaLISA免疫检测中，将结合于抗生蛋白链菌素供体珠粒的经生物素标记的分析物与偶联于AlphaLISA受体珠粒的抗体一起使用。AlphaLISA也可用于测定个别变体(例如本发明的抗EGFR抗体或抗体结合片段)对EGFR的结合亲和力。参看例如乌尔曼(Ullman)等人,临床化学(Clinical Chemistry)42,第9:1518-1526号,1996；和英治(Hideharu)等人,癌症科学(Cancer Science)98,第8:1275-1280号,2007。

BIAcore检测使用表面等离子体共振(SPR)来测定结合，表面等离子体共振是一种能够检测未标记相互作用物的光学现象。BIAcore是用于测定个别变体(例如本发明的抗EGFR抗体或抗体结合片段)对EGFR的结合亲和力的另一种方法。参看例如美国专利申请案第2008/0274114号；和车(Che)等人,药学与生物医学分析杂志(J.of Pharm.andBiomed.Analysis)50,第2号(2009年9月8日):183-188。

KinExA(动力学排除检测)测量未复合受体(R)分子在受体、配体(L)和LR复合物的混合物中的浓度。通过使溶液相混合物暴露于经固相固定的L一段极短的时间来测量未复合的R的浓度。保持足够短的溶液相混合物与经固相固定的L之间的“接触时间”以使LR复合物的解离可忽略。当在动力学上排除LR复合物显著解离的可能性时，仅未复合(“游离”)的R可结合于固相。结合于固相的游离R的量(用来自第二标记的荧光发射来测量)与溶液相样本中的游离R的浓度成正比。KinExA也可用于测定个别变体(例如本发明的抗EGFR抗体或抗体结合片段)对EGFR的结合亲和力。参看例如美国专利申请案第2008/0274114号；和达灵(Darling)等人,检测与药物开发技术(ASSAY and DrugDevelopment Technologies),2:647-657,2004。

2.结果

针对重链CDR中的示范性单取代变体的这些其它结合研究的结果显示于表14-1中。轻链CDR中的示范性单取代变体的结果显示于表14-2中。重链和轻链中的示范性多取代变体的结果显示于表14-3中。表14-1到14-3中的结果是以相比hu225的亲和力增加倍数来显示。

实例4：测试西妥昔单抗和人源化西妥昔单抗中的CD4+T细胞表位区

1.材料和方法

1.1肽

由米摩托培公司(Mimotopes)(澳大利亚阿德莱德(Adelaide，Australia))使用多中心格式(multi-pin format)来合成肽。合成的西妥昔单抗和hu225轻链和重链可变区的序列为有12个氨基酸重叠的十五聚体肽，总共有134种肽(分别如图4和5所示)。将肽冻干并以约1-2mg/mL再悬浮于DMSO(西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))中。储备肽在-20℃下冷冻保持。

1.2人类周边血液单核细胞

社区供体白细胞层制品(Community donor buffy coat product)购自斯坦福血液中心(Stanford Blood Center)(加利福尼亚州帕罗奥多(Palo Alto，CA))。用不含钙或镁的DPBS按1:1v:v稀释白细胞层物质。将经稀释的白细胞层物质(25-35mL)铺于具有12.5mL菲科尔帕克-PLUS(FicollPaque-PLUS)(GE医疗集团)的50mL锥形离心管(沙斯特(Sarsted)或科斯塔(Costar))下面。在室温下以900g离心样本30分钟。自界面收集周边血液单核细胞(PBMC)。添加DPBS使最终体积达到50mL，且以350g离心细胞5分钟。将聚结成团的细胞再悬浮于DPBS中并计数。

1.3树突状细胞

为分离树突状细胞，用含10⁸个新鲜分离的PBMC的总体积为30mL的AIM V培养基(英杰公司(Invitrogen))接种T75培养瓶(科斯塔)。在-80℃下，将过量PBMC按5×10⁷个细胞/毫升于90%胎牛血清(FCS)、10%DMSO中冷冻。在37℃下于5%CO₂中培育T75烧瓶2小时。移除未粘附的细胞，且用DPBS洗涤粘附的单层。为了区分树突状细胞与单核细胞，添加含800个单位/毫升GM-CSF(R&D系统公司(R and D Systems))和500个单位/毫升IL-4(R&D系统公司)的30mL AIM V培养基。培育烧瓶5天。在第5天，添加IL-1α(英多杰公司(Endogen))和TNFα(英多杰公司)达到50pg/mL和0.2ng/mL。再培育烧瓶两天。在第7天，通过添加3mL含有0.5到1.0mg丝裂霉素C(西格玛-阿尔德里奇公司)的100mM EDTA达到10mM EDTA和16.5到33μg/mL丝裂霉素C的最终浓度来收集树突状细胞。在37℃和5%CO₂下再培育烧瓶1小时。收集树突状细胞，且在AIM V培养基中洗涤2-3次。

1.4细胞培养

在第7天，在37℃水浴中使先前冷冻的自体PBMC迅速解冻。立即将细胞稀释于DPBS或AIM V培养基中，并以350g离心5分钟。使用磁性珠粒(Easy-Sep CD4⁺试剂盒，干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))通过阴性选择来富集CD4⁺细胞。在96孔圆底板(科斯塔9077)中按2×10⁵个CD4⁺T细胞/2×10⁴个树突状细胞/孔来共培养自体CD4⁺T细胞和树突状细胞。添加约5μg/mL肽。对照孔仅含有0.25%v:v DMSO(西格玛公司)媒剂。阳性对照孔含有0.25%DMSO和1μg/mL破伤风类毒素(李斯特生物公司(ListBiologicals)或卡尔生物化学公司(CalBioChem))。培育培养物5天。在第5天，每孔添加0.25μCi氚化胸苷(安玛西亚公司(Amersham)或GE医疗集团)。在第6天使用帕卡德费特美(Packard Filtermate)细胞收集器将培养物收集到过滤垫(filtermat)上。使用沃拉克麦克贝塔1450型(Wallac MicroBeta 1450)闪烁计数器(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))进行闪烁计数。

1.5数据分析

通过对6到12份重复实验的个别结果求平均值来计算平均背景CPM值。对4个阳性对照孔的CPM值求平均值。对各肽的重复实验孔或三次重复实验孔求平均值。通过用平均实验CPM值除以平均对照值来计算阳性对照孔和肽孔的刺激指数值。为了能被纳入数据集中，需要破伤风类毒素阳性对照孔中的刺激指数大于3.0。记录刺激指数为2.95或2.95以上的任何肽的应答。使用来自一组106个供体(对于hu225肽)和87个供体(对于西妥昔单抗肽)的周边血液样本来测试肽。汇集对所有肽的应答。对于所测试的各肽，计算在2.95或2.95以上的刺激指数下作出应答的供体组的百分比。另外，也计算所有供体的平均刺激指数。

2.结果

2.1鉴别西妥昔单抗和人源化西妥昔单抗VH和VL区中的CD4⁺T细胞表位

通过分析对供体组内的肽的应答百分比来鉴别CD4⁺T细胞表位肽。计算描述西妥昔单抗和hu225重链和轻链可变区的所有测试肽的平均应答百分比。应答率大于或等于平均背景应答加上3个标准偏差就视为潜在CD4⁺T细胞表位。计算数据集中所有肽的平均刺激指数。抗体V_H和V_L区的数据显示于图6中。在图6A中，显示西妥昔单抗V_H和V_L区的复合数据。总体平均刺激指数为1.27±0.27标准偏差。平均应答率百分比为4.72±4.38标准偏差。大的标准偏差是归因于数据集内存在平均SI和应答百分比极高的应答。由于西妥昔单抗为嵌合抗体，故高应答率可能由肽序列的鼠类衍生化所致。与此解释一致的是，在hu225数据集中不存在显著的肽应答(图6B)。hu225数据集中的平均刺激指数为1.22±0.14，且平均应答率百分比为3.3±2.19。

这些结果表明，对M225杂交瘤V_H和V_L区进行的人源化处理使得抗体分子不含可检测的CD4⁺T细胞辅助表位。不存在CD4⁺T细胞表位有可能降低抗体产物的免疫原性潜力。

特定实施例、参考文献的引用

本申请案中所引用的所有出版物、专利、专利申请案和其它文献是以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，其引用程度就如同个别地指示各个别出版物、专利、专利申请案或其它文献是以引用的方式并入本文中用于所有目的一般。

虽然已说明并描述了各种特定实施例，但应了解可在不背离本发明精神和范围的情况下作出各种变化。

Claims (57)

1.一种抗EGFR抗体或抗体的抗EGFR结合片段，其：

(a)包含6个CDR，所述CDR具有与对应于SEQ ID NO：3(CDR-H1)、SEQ IDNO：4(CDR-H2)、SEQ ID NO：5(CDR-H3)、SEQ ID NO：233(CDR-L1)、SEQ ID NO：7(CDR-L2)和SEQ ID NO：8(CDR-L3)的所述CDR具有总体至少70％序列一致性的氨基酸序列；和

(b)具有(i)与第一参考抗体相比或与第二参考抗体相比增加的对EGFR的亲和力，所述第一参考抗体具有对应于SEQ ID NO：9的V_H序列和对应于SEQ ID NO：10的V_L序列，且所述第二参考抗体具有对应于SEQ ID NO：1的V_H序列和对应于SEQID NO：2的V_L序列，和/或(ii)与所述第二参考抗体相比降低的免疫原性。

2.根据权利要求1所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其包含6个CDR，所述CDR具有与氨基酸序列对应于SEQ ID NO：3(CDR-H1)、SEQ ID NO：4(CDR-H2)、SEQ ID NO：5(CDR-H3)、SEQ ID NO：6(CDR-L1)、SEQ ID NO：7(CDR-L2)和SEQ ID NO：8(CDR-L3)的CDR具有总体至少70％序列一致性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过荧光活化细胞分选术“FACS”所测定，其具有与所述第一参考抗体或所述第二参考抗体相比增加的对EGFR的亲和力。

4.根据权利要求3所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过FACS所测定，其对EGFR的亲和力是所述第一参考抗体或所述第二参考抗体的至少1.5倍。

5.根据权利要求3所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过FACS所测定，其对EGFR的亲和力是所述第一参考抗体或所述第二参考抗体的至少2倍。

6.根据权利要求3所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过FACS所测定，其对EGFR的亲和力是所述第一参考抗体或所述第二参考抗体的至少3倍。

7.根据权利要求3所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过FACS所测定，其对EGFR的亲和力是所述第一参考抗体或所述第二参考抗体的至少4倍。

8.根据权利要求3所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过FACS所测定，其对EGFR的亲和力是所述第一参考抗体或所述第二参考抗体的至少5倍。

9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：6的CDR-L1相比较，其在CDR-L1中具有至少一个取代。

10.根据权利要求9所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：6的CDR-L1相比较，其具有以下所述CDR-L1取代中的一者或一者以上：G30Y、A25V和A25S(通过卡贝特编号(Kabat numbering)确定)。

11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：3的CDR-H1相比较，其在CDR-H1中具有至少一个取代。

12.根据权利要求11所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：3的CDR-H1相比较，其具有以下所述CDR-H1取代中的一者或一者以上：Y32R、N31V、V34N和V34L(通过卡贝特编号确定)。

13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：4的CDR-H2相比较，其在CDR-H2中具有至少一个取代。

14.根据权利要求13所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：4的CDR-H2相比较，其具有以下所述CDR-H2取代中的一者或一者以上：V50L、T57G、T57D、Y59E、I51G、G55D、W52G、S53Q、V50Q、N56G、W52T、Y59S、I51M、I51Q、S53T、N60D、I51S、Y59W、T57S、Y59A、Y59C、Y59F、T57A、Y59G和T64E(通过卡贝特编号确定)。

15.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：5的CDR-H3相比较，其在CDR-H3中具有至少一个取代。

16.根据权利要求15所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：5的所述CDR-H3相比较，其具有所述CDR-H3取代Y98W(通过卡贝特编号确定)。

17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：8的CDR-L3相比较，其在CDR-L3中具有至少一个取代。

18.根据权利要求17所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，与SEQ ID NO：8的所述CDR-L3相比较，其具有以下所述CDR-L3取代中的一者或一者以上：N92L、N91L、T97D、T97E、N92R和T97A(通过卡贝特编号确定)。

19.根据权利要求1或2所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其具有以下CDR取代：与SEQ ID NO：4的CDR-H2相比较，CDR-H2中的I51G；与SEQ ID NO：5的CDR-H3相比较，CDR-H3中的Y98W；与SEQ ID NO：6的CDR-L1相比较，CDR-L1中的G30Y；和与SEQ ID NO：8的CDR-L3相比较，CDR-L3中的N92L(都通过卡贝特编号确定)。

20.根据权利要求1或2所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其具有以下CDR取代：与SEQ ID NO：3的CDR-H1相比较，CDR-H1中的N31V；与SEQ ID NO：4的CDR-H2相比较，CDR-H2中的V50L；与SEQ ID NO：6的CDR-L1相比较，CDR-L1中的A25V；和与SEQ ID NO：8的CDR-L3相比较，CDR-L3中的N91L(都通过卡贝特编号确定)。

21.根据权利要求1到20中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其具有相对于SEQ ID NO：3(CDR-H1)、SEQ ID NO：4(CDR-H2)、SEQ ID NO：5(CDR-H3)、SEQ ID NO：6(CDR-L1)、SEQ ID NO：7(CDR-L2)和SEQ ID NO：8(CDR-L3)的CDR存在至少一个取代以及任选存在选自表3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14中一者或一者以上的一个或一个以上额外CDR突变或突变组合的CDR。

22.根据权利要求1到21中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其包含6个CDR，所述CDR具有与SEQ ID NO：3(CDR-H1)、SEQ ID NO：4(CDR-H2)、SEQ ID NO：5(CDR-H3)、SEQ ID NO：6(CDR-L1)、SEQ ID NO：7(CDR-L2)和SEQ ID NO：8(CDR-L3)的所述CDR具有总体至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％或至少95％序列一致性的氨基酸序列。

23.根据权利要求1到21中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其中与SEQ ID NO：3(CDR-H1)、SEQ ID NO：4(CDR-H2)、SEQ ID NO：5(CDR-H3)、SEQ ID NO：6(CDR-L1)、SEQ ID NO：7(CDR-L2)和SEQ ID NO：8(CDR-L3)的CDR相比较，所述6个CDR总共具有至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个或至多4个氨基酸取代。

24.根据权利要求1到23中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其中与SEQ ID NO：3(CDR-H1)、SEQ ID NO：4(CDR-H2)、SEQ ID NO：5(CDR-H3)、SEQ ID NO：6(CDR-L1)、SEQ ID NO：7(CDR-L2)和SEQ ID NO：8(CDR-L3)的CDR相比较，任何个别CDR具有不超过3个氨基酸取代。

25.根据权利要求1到24中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其中与SEQ ID NO：3(CDR-H1)、SEQ ID NO：4(CDR-H2)、SEQ ID NO：5(CDR-H3)、SEQ ID NO：6(CDR-L1)、SEQ ID NO：7(CDR-L2)和SEQ ID NO：8(CDR-L3)的CDR相比较，任何个别CDR具有不超过2个氨基酸取代。

26.根据权利要求1到25中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其分别为单克隆抗体或单克隆抗体的抗EGFR结合片段。

27.根据权利要求1到26中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其分别为人类抗体或人源化抗体，或者人类抗体或人源化抗体的抗EGFR结合片段。

28.根据权利要求1到27中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其为IgG。

29.根据权利要求28所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其为IgG₁。

30.根据权利要求28所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其为IgG₂。

31.根据权利要求1到30中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其在Fc区中包括一个或一个以上增加ADCC活性的突变。

32.根据权利要求1到31中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其未经岩藻糖基化。

33.根据权利要求1到30中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其在所述Fc区中包括一个或一个以上增加与FcγR的结合的突变。

34.根据权利要求1到30中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其在所述Fc区中包括一个或一个以上增加与FcRn的结合的突变。

35.根据权利要求1到30中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其在所述Fc区中包括一个或一个以上降低ADCC活性的突变。

36.根据权利要求1到35中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，除所述CDR以外，其具有对应于SEQ ID NO：1的V_H序列和对应于SEQ ID NO：2的V_L序列。

37.根据权利要求1到35中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，除所述CDR以外，其具有对应于SEQ ID NO：9的V_H序列和对应于SEQ ID NO：10的V_L序列。

38.根据权利要求1到37中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过FACS所测定，其对EGFR的亲和力是所述第一参考抗体或所述第二参考抗体的多达30倍。

39.根据权利要求1到37中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过FACS所测定，其对EGFR的亲和力是所述第一参考抗体或所述第二参考抗体的多达50倍。

40.根据权利要求1到37中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，如通过FACS所测定，其对EGFR的亲和力是所述第一参考抗体或所述第二参考抗体的多达100倍。

41.根据权利要求1或2所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其具有相比所述第二参考抗体降低的免疫原性。

42.根据权利要求41所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其包含对应于SEQ IDNO：9的V_H序列和对应于SEQ ID NO：10的V_L序列。

43.根据权利要求3到40中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其具有相比所述第二参考抗体降低的免疫原性。

44.根据权利要求1到43中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其经纯化。

45.根据权利要求44所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段，其经纯化到至少85％、至少90％、至少95％或至少98％均质性。

46.一种抗体-药物偶联物，其包含根据权利要求1到45中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段。

47.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到45中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段或根据权利要求46所述的抗体-药物偶联物，和医药学上可接受的载剂。

48.一种核酸，其包含一个或一个以上编码根据权利要求1到43中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段的核苷酸序列。

49.一种载体，其包含根据权利要求48所述的核酸。

50.一种原核宿主细胞，其经根据权利要求49所述的载体转化。

51.一种真核宿主细胞，其经根据权利要求49所述的载体转化。

52.一种真核宿主细胞，其经工程改造成表达一个或一个以上编码根据权利要求1到43中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段的核苷酸序列。

53.根据权利要求52所述的真核宿主细胞，其为哺乳动物宿主细胞。

54.一种产生抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段的方法，其包含(a)培养根据权利要求51到53中任一权利要求所述的真核宿主细胞和(b)回收所述抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段抗体。

55.一种治疗癌症的方法，其包含投予有需要的人类治疗有效量的根据权利要求1到45中任一权利要求所述的抗EGFR抗体或抗EGFR结合片段、根据权利要求46所述的抗体-药物偶联物或根据权利要求47所述的医药组合物。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症为头颈部鳞状细胞癌。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症为结肠直肠癌。

Images