ES2639056T3 - Anticuerpos anti-EGFR y sus usos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti - EGFR o un fragmento de unión a anti - EGFR de un anticuerpo que: (a) comprende una secuencia VH correspondiente a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia VL correspondiente a la SEQ ID NO: 10 o una secuencia VH correspondiente a la SEQ ID NO: 1 y una secuencia VL correspondiente a SEQ ID NO: 2; y (b) tiene las siguientes sustituciones: G30Y in CDR-L1, o la combinación de sustituciones 151G en CDR-H2, Y98W en CDR-H3, G30Y en CDR-L1 y N92L en CDR-L3, en donde la numeración de los residuos de aminoácidos de inmunoglobulina se realiza de acuerdo con el sistema de numeración de residuos de aminoácidos de inmunoglobulinas de Kabat et al.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos anti-EGFR y sus usos

2. Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a anticuerpos anti-EGFR, a composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos anti-EGFR y a usos terapeuticos de tales anticuerpos.

3. Antecedentes

La terapia con anticuerpos monoclonales ha proporcionado una oportunidad para atacar y destruir tumores utilizando anticuerpos disenados contra antigenos espedficos de tumores. En general, la terapia con anticuerpos monoclonales estimula el sistema inmunologico de un paciente para atacar celulas tumorales malignas o impide el crecimiento tumoral bloqueando o inhibiendo receptores celulares espedficos. El tratamiento requiere la identificacion de un antigeno espedfico del tumor en una molecula de la superficie celular. Las moleculas representativas de la superficie celular objetivo de los ensayos clmicos incluydonde provienen de varios linfomas/leucemias (tales como linfomas/leucemias de celulas T y/o celulas B) y tumores solidos (tales como tumores epiteliales de mama, colon y pulmon). Se han publicado resultados prometedores en el tratamiento del cancer colorrectal metastasico y el cancer de cabeza y cuello con anticuerpos monoclonales humanizados, particularmente tratamientos dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR, receptor de EGF), una protema de senalizacion que normalmente controla la division celular.

El EGFR (tambien conocido como ErbB-1 y HER1 en seres humanos) es el receptor de la superficie celular de los miembros de la familia del factor de crecimiento epidermico (familia de EGF) de ligandos de protemas extracelulares (Herbst, 2004, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59 (2 Supl.): 21-6). El receptor del factor de crecimiento epidermico es un miembro de la familia de receptores ErbB, una subfamilia de cuatro protemas estrechamente relacionadas: EGFR (ErbB-1), HER2/neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) y HER4 (ErbB-4). Las mutaciones que afectan a la expresion o actividad del EGFR pueden dar lugar a cancer. De hecho, los receptores de EGF estan sobreexpresados en la mayona de las neoplasias epiteliales, incluyendo las del colon y de recto. El EGFR se expresa de forma constitutiva en muchos tejidos epiteliales normales, incluyendo la piel y el folmulo piloso.

El desarrollo de una terapia con anticuerpos monoclonales basada en el descubrimiento del papel de los receptores de EGF en la etiologfa de ciertos canceres implico en primer lugar el desarrollo de un anticuerpo de base murina. La inmunizacion de ratones con celulas de carcinoma epidermoide A431 humanas que expresan niveles altos de EGFR dio como resultado anticuerpos que se uman espedficamente a la porcion extracelular del EGFR (El-Gewely, 2006, Biotechnology Annual Review (Amsterdam, Elsevier) en la pagina 177). El anticuerpo monoclonal, conocido como MAb225, se unio espedficamente al EGFR humano con una afinidad igual a su ligando, compitio con la union al ligando y bloqueo la activacion del receptor tirosina quinasa (Goldstein et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318).

Los anticuerpos murinos tienen el potencial de generar una respuesta inmunogenica no deseada en los pacientes. Por lo tanto, el anticuerpo murino 225 se quimerizo con IgG1 humana para producir un anticuerpo monoclonal quimerico recombinante humano/de raton conocido como C225 que tema regiones constantes de origen de IgG1K humana y regiones murinas variables que se unen espedficamente al dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento epidermico humano (EGFR). Se cree que C225 trabaja principalmente bloqueando la union de EGF a EGFR, con lo que "priva" al tumor del factor de crecimiento necesario. C225 tambien se une espedficamente al EGFR sobre las celulas normales e inhibe de forma competitiva la union de EGF y otros ligandos, tales como factor de crecimiento transformante alfa. La union da como resultado el bloqueo de la fosforilacion y la activacion de quinasas asociadas a receptores, dando como resultado la inhibicion del crecimiento celular, la induccion de apoptosis y la disminucion de la metaloproteinasa de matriz y la produccion de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

C225 se conoce comercialmente como Erbitux® (cetuximab) y esta comercializado por ImClone y Bristol-Myers Squibb en Estados Unidos, y en otros lugares por Merck KgaA. La FDA aprobo Erbitux® en marzo de 2006 para su uso en combinacion con radioterapia para el tratamiento del carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) o como agente unico en pacientes que han recibido terapia previa basada en platino. Erbitux® tambien esta indicado para el tratamiento del cancer de colon metastasico en combinacion con irinotecan (Camptosar®), un bloqueante de la ADN topoisomerasa. Lippow SM et al, Nat Biotechnol. 2007;25(10): 1171-6, introduce mutaciones que mejoran la afinidad en el cetuximab.

Se ha demostrado recientemente que el estado de mutacion de un homologo del oncogen viral del sarcoma de Kirsten (KRAS) es predictivo de respuesta al tratamiento con cetuximab en el cancer colorrectal (Van Cutsem et al., 2008, J. Clin. Oncol 26 (May 20 suppl): Resumen 2). KRAS es una GTPasa con un papel en una serie de vfas de transduccion de senales. Las mutaciones en el gen que codifica KRAS, presente en mas del 25 % de los canceres colorrectales, son predictivas del exito de los farmacos inhibidores del EGFR. La expresion del gen KRAS mutado da como resultado una respuesta disminuida a la terapia con inhibidores de EGFR. Las mutaciones en KRAS pueden

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detectarse mediante diagnosticos de laboratorio comercialmente disponibles.

Erbitux® provoca una respuesta inmunoologica en aproximadamente el 5 % de los pacientes. Dicha respuesta inmunologica puede dar como resultado una eliminacion mediada por el complejo inmunitario de los anticuerpos o fragmentos de la circulacion y hacer que la administracion repetida sea inadecuada para la terapia, reduciendo de este modo el beneficio terapeutico para el paciente y limitando la readministracion del anticuerpo. Ademas, el anticuerpo Erbitux® causa una erupcion acneiforme en el 90 % de los pacientes, habiendose hallado erupciones debilitantes en hasta un 10 % de los receptores de farmacos. Otros efectos secundarios significativos incluyen problemas en la superficie de las mucosas, malestar general, nauseas, fiebre, problemas gastrointestinales y cefalea (Chabner et al., 2008, Harrison's Manual of Oncology (New York: McGraw-Hill Medical), en las paginas 117-118). Finalmente, los problemas adicionales asociados con el uso de anticuerpos monoclonales espedficos de tumores o selectivos de tumores, tales como Erbitux® como agentes terapeuticos, incluyen la variacion antigenica del tumor, la destruccion ineficaz de las celulas despues de la union del anticuerpo monoclonal, la penetracion ineficiente del anticuerpo en la masa tumoral y antfgenos diana solubles que limpian el anticuerpo.

En consecuencia, existe la necesidad de proporcionar anticuerpos monoclonales mejorados que interfieran con la senalizacion del receptor EGFR que superen uno o mas de estos problemas, por ejemplo, generando variantes con mayor afinidad que Erbitux® que se pueden administrar a dosis reducidas (y, por lo tanto, cuya administracion da como resultado una inmunogenicidad reducida en comparacion con Erbitux®), o variantes con inmunogenicidad reducida y otros efectos secundarios en comparacion con Erbitux®.

La mencion o identificacion de cualquier referencia en la seccion 3 o cualquier otra seccion de la presente solicitud no debe interpretarse como admision de que dicha referencia esta disponible como tecnica anterior a la presente divulgacion.

4. SUMARIO

La presente descripcion se refiere a anticuerpos anti-EGFR y a fragmentos de union a anti-EGFR.

La presente invencion proporciona un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de union a anti-EGFR de un anticuerpo que:

(a) comprende una secuencia Vh correspondiente a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia Vl correspondiente a la SEQ ID NO: 10 o una secuencia Vh correspondiente a la SEQ ID NO: 1 y una secuencia Vl correspondiente a SEQ ID NO: 2; y

(b) tiene las siguientes sustituciones: G30Y en CDR-L1, o la combinacion de sustituciones I51G en CDR-H2, Y98W en CDR-H3, G30Y en CDR-L1, y N92L en CDR-L3.

Los anticuerpos de la divulgacion pueden dar como resultado respuestas de reacciones inmunogenicas reducidas (por ejemplo, celulas T y/o anticuerpos humanos anti-raton (HAMA)) cuando se usan terapeuticamente, ya sea porque son inherentemente menos inmunogenicos o porque tienen una afinidad de union mejorada, por lo que se necesitan dosis mas bajas. Ademas, se aumenta la eficacia terapeutica, ya sea porque se mejora la afinidad de union o porque se reduce la inmunogenicidad de manera que se pueden administrar de un modo seguro dosis mas altas o mas dosis repetidas.

Generalmente, los anticuerpos de la divulgacion estan relacionados en lo que respecta a caractensticas estructurales y/o funcionales con el cetuximab, que comprende una cadena pesada (Vh) que tiene una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera (Vl) correspondientes a la SEQ Id NO: 2, tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (CDR), a las que se hace referencia en el presente documento (en orden amino a carboxi terminal) como CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) y CDR-H3 (SEQ ID NO: 5), y tres CDR de cadena ligera a las que se hace referencia en el presente documento (en orden amino a carboxi terminal) como CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 SEQ ID NO: 7) y CDR - L3 (SEQ ID NO: 8). Las secuencias de las CDR de cetuximab se muestran en las Figuras 1A y 1C, y su numeracion se muestra en la Tabla 1 (para las CDR de cadena pesada) y en la Tabla 2 (para las CDR de cadena ligera). Cetuximab es un anticuerpo quimerico, cuyo anticuerpo murino parental se denomina "MAb225", y contiene epftopos inmunogenicos.

En una cierta realizacion, la divulgacion proporciona un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de union a anti-EGFR que comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 9, y una Vl que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 10. Este anticuerpo anti-EGFR o fragmento de union corresponde a una version humanizada de MAb225 y tambien se denomina en el presente documento hu225. hu225 tiene tres CDR de cadena pesada, a las que se hace referencia en el presente documento (en orden amino a carboxi terminal) como CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y tres CDR de cadena ligera a las que se hace referencia en el presente documento (en orden amino a carboxi-terminal) como CDR - L1, CDR - L2 y cDr - L3. Las secuencias de las CDR de hu225 se muestran en las Figuras 1B y 1C, y su numeracion se muestra en la Tabla 1 (para las CDR de cadena pesada) y en la Tabla 2 (para las CDR de cadena ligera). Las CDR de cetuximab y hu225 tienen secuencias de aminoacidos identicas. hu225 tiene una inmunogenicidad reducida en comparacion con

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cetuximab.

La presente divulgacion tambien se refiere a anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de union a anti-EGFR que tienen afinidad mejorada por EGR en comparacion con hu225 y/o cetuximab.

Por ejemplo, en un aspecto, los anticuerpos anti-EGFR o fragmented de union a anti-EGFR tienen las siguientes sustituciones de CDR en comparacion con las correspondientes CDR de cetuximab o hu225: I51G en CDR-H2, Y98W en CDR-H3, G30Y en CDR-L1 y N92L en CDR-L3.

En ciertas realizaciones, distintas de una o mas de las sustituciones o mutaciones de CDR anteriores, los anticuerpos anti-EGFR o los fragmentos de union a anti-EGFR tienen una secuencia de Vh correspondiente a la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de Vl correspondiente a la SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, distintas de dichas una o mas de las sustituciones o mutaciones de CDR anteriores, los anticuerpos anti-EGFR o los fragmentos de union a anti-EGFR tienen una secuencia de Vh correspondiente a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia de Vl correspondiente a la SEQ ID NO: 10.

En otros aspectos mas, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion tienen una afinidad aumentada por el EGFR en comparacion con cetuximab y/o hu225, preferentemente como se determina mediante clasificacion celular activada por fluorescencia ("FACS"). Los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion pueden tener una afinidad que es al menos 1,1 veces, al menos 1,2 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4 veces, al menos 1,5 veces, al menos 1,75 veces, al menos 2 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces la afinidad de cetuximab y/o hu225, segun se determina por FACS. En aspectos adicionales, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR pueden tener una afinidad de hasta 10 veces, hasta 15 veces, hasta 20 veces, hasta 25 veces, hasta 30 veces, hasta 40 veces, hasta 50 veces, o hasta 100 veces la de cetuximab y/o hu225, segun lo determinado por FACS. Preferentemente, la afinidad de union de un anticuerpo de la divulgacion que contiene una o mas sustituciones de CDR con respecto a las CDR de cetuximab o hu225 se evalua en un anticuerpo de referencia que es identico en secuencia pero para dicha una o mas sustituciones de CDR.

En aun otros aspectos, el anticuerpo anti-EGFR o anticuerpo anti-EGFR puede tener una afinidad que es de 2 a 1000 veces, de 10 a 100 veces, de 1,5 a 50 veces o de 2 a 30 veces mayor que la afinidad de un anticuerpo que tiene una secuencia de Vh correspondiente a la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de Vl correspondiente a la SEQ ID NO: 2. En aun otros aspectos, el anticuerpo anti-EGFR o anticuerpo anti-EGFR puede tener una afinidad que es de 4 a 400 veces, 10 a 100 veces, de 1,5 a 50 veces o de 2 a 30 veces mayor que la afinidad de un anticuerpo que tiene un secuencia de Vh correspondiente a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia de Vl correspondiente a la SEQ ID NO: 10.

En algunos aspectos, los anticuerpos anti-EGFR o los fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion son anticuerpos monoclonales o fragmentos de union a anti-EGFR de anticuerpos monoclonales, respectivamente. En algunos aspectos, los anticuerpos anti-EGFR o los fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion son anticuerpos humanos o humanizados o fragmentos de union a anti-EGFR de anticuerpos humanos o humanizados respectivamente. Los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion pueden ser una IgG, incluyendo IgG1 o IgG2. Los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion pueden estar no fucosilados.

Ademas, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR pueden incluir una o mas mutaciones en la region Fc que aumenta o disminuye la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("ADCC"). Los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR pueden incluir una o mas mutaciones en la region Fc que aumenta la union a FcyR o FcRn.

En algunos aspectos, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion tienen una inmunogenicidad reducida en comparacion con el anticuerpo cetuximab. En un aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de union a anti-EGFR que comprende una secuencia de Vh correspondiente a la SEQ ID No: 9 y una secuencia de Vl correspondiente a la SeQ ID No: 10.

En algunos aspectos, los anticuerpos anti-EGFR o los fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion estan purificados. En aun otros aspectos mas, los anticuerpos anti-EGFR o los fragmentos de union a anti-EGFR se purifican hasta al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 98 % de homogeneidad.

En otro aspecto, los anticuerpos anti-EGFR o los fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion se proporcionan como conjugados de anticuerpo-farmaco.

En otros aspectos, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR se proporcionan con un vehteulo farmaceuticamente aceptable como una composicion farmaceutica. En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos anti-EGFR modificados que tienen afinidad incrementada por el EGFR en comparacion con cetuximab o hu225 y/o inmunogenicidad reducida en comparacion

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con cetuximab.

Tambien se proporcionan acidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican los anticuerpos anti-EGFR y los fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion, as^ como vectores que comprenden acidos nucleicos. Adicionalmente, en el presente documento se proporcionan celulas huesped procariotas y eucariotas transformadas con un vector que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion, asf como celulas huesped eucariotas (tales como mairnferos) manipuladas para expresar secuencias nucleotidicas. Tambien se proporcionan procedimientos para producir anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de union a anti-EGFR cultivando celulas huesped.

Los anticuerpos anti-EGFR y los fragmentos de union a anti-EGFR de la divulgacion son utiles en el tratamiento de enfermedades tales como canceres epiteliales y enfermedad de Menetrier. En particular, los anticuerpos anti-EGFR son utiles en el tratamiento de canceres epiteliales, tales como cancer de mama, cancer de ovarios, cancer de pulmon, cancer colorrectal, cancer anal, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer de piel, cancer oral, cancer esofagico, cancer vaginal, cancer cervical, cancer de bazo, cancer testicular y cancer de timo. Por lo tanto, los anticuerpos anti-EGFR y los fragmentos de union a anti- EGFR son utiles para el tratamiento del cancer, incluyendo el carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, y el cancer colorrectal.

En un aspecto, un procedimiento de tratamiento de cancer que comprende administrar a un ser humano que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de union a anti-EGFR de la divulgacion, un conjugado anticuerpo-farmaco de la divulgacion, o una composicion farmaceutica de la divulgacion.

Debe observarse que los artfculos indeterminados "un/uno" y "una" y el artfculo determinado "el/la" se usan en la presente solicitud, como es habitual en las solicitudes de patente, para significar uno o mas a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, el termino "o" se usa en la presente solicitud, como es habitual en las solicitudes de patente, para significar el disyuntivo "o" o la conjuncion "y".

Toda discusion de documentos, actos, materiales, dispositivos, artfculos o similares incluidos en la presente memoria descriptiva se realiza exclusivamente con el fin de proporcionar un contexto para la presente divulgacion. No se debe tomar como admision de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la base de la tecnica anterior o eran conocimientos generales habituales en el campo relevante a la presente divulgacion, ya que existian en cualquier momento antes de la fecha de prioridad de cada reivindicacion de esta solicitud.

Las caractensticas y ventajas de la divulgacion resultaran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de realizaciones de la misma.

5. Breve descripcion de las tablas y figuras

La tabla 1 muestra la numeracion de los aminoacidos en las CDR de cadena pesada de cetuximab y hu225.

La tabla 2 muestra la numeracion de los aminoacidos en las CDR de cadena ligera de cetuximab y hu225.

La tabla 3 muestra mutaciones en las CDR de la cadena pesada de cetuximab y hu225 que los estudios de union preliminares indican una mayor afinidad por el EGFR.

La tabla 4 muestra mutaciones en las CDR de la cadena ligera de cetuximab y hu225 que los estudios de union preliminares indican una mayor afinidad por el EGFR.

La tabla 5 muestra mutaciones candidatas en las CDR de la cadena pesada de cetuximab y hu225 para aumentar la afinidad por el EGFR.

La tabla 6 muestra mutaciones candidatas en las CDR de la cadena ligera de cetuximab y hu225 para aumentar la afinidad por el EGFR.

La tabla 7 muestra mutaciones candidatas adicionales en las CDR de la cadena pesada de cetuximab y hu225 para aumentar la afinidad por el EGFR.

La tabla 8 muestra mutaciones candidatas adicionales en las CDR de la cadena ligera de cetuximab y hu225 para aumentar la afinidad por el EGFR.

La tabla 9 muestra mutaciones en las CDR de cadena pesada de de cetuximab y hu225 que no afectan sustancialmente a la union a EGFR y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgacion.

La tabla 10 muestra mutaciones en las CDR de cadena ligera de de cetuximab y hu225 que no afectan sustancialmente a la union a EGFR y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgacion.

La tabla 11-1 a 11-2 muestra mutaciones conocidas en las CDR de la cadena pesada de cetuximab y hu225 que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgacion.

La tabla 12 muestra mutaciones conocidas en las CDR de la cadena ligera de cetuximab y hu225 que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgacion.

La tabla 13 muestra mutaciones conocidas en las CDR de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo Fv monocatenario que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgacion.

Las tablas 14-1 a 14-3 muestran las afinidades de union relativas de variantes de ejemplo de la divulgacion en comparacion con hu225 segun se evaluo mediante clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), analisis AlphaLISA®, analisis BIAcore y/o analisis de

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ensayo de exclusion cinetica (KinExA). Las tablas 14-1 y 14-2 muestran la union relativa de variantes de una sola sustitucion con mayor afinidad por EGFR. La tabla 14-3 muestra la union relativa de dos variantes de sustitucion multiple con mayor afinidad por EGFR.

Figuras 1A a 1C. La figura 1A muestra las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de las cadena pesada y ligera de cetuximab, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, con las regiones CDR en texto subrayado en negrita. La figura 1B muestra las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de las cadena pesada y ligera de hu225, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, con las regiones CDR en texto subrayado en negrita. La figura 1C muestra las secuencias de CDR y los correspondientes identificadores de secuencia de cetuximab y hu225.

Las figuras 2A-2B muestran las afinidades de union (CI50) de cetuximab y hu225 a EGFR (Figura 2B), medidas en ensayos de competicion FACS con cetuximab biotinilado (como se muestra en la Figura 2A).

La figura 3 muestra los resultados del analisis FACS de las afinidades de union de ciertas variantes de la divulgacion. De izquierda a derecha, las huellas son de (i) hu225 de tipo silvestre (ensayo 1), (ii) hu225 de tipo silvestre (ensayo 2), (iii) hu225 variante Y59E y (iv) hu225 variante I51G.

Figura 4-1 a 4-2 muestra las secuencias de aminoacidos de todos los peptidos de VH y VL de cetuximab analizados como potenciales epftopos CD4+.

Figura 5-1 a 5-2 muestra las secuencias de aminoacidos de todos los peptidos de VH y VL de hu225 analizados como potenciales epftopos CD4+.

Figuras 6A-6B. La figura 6A muestra el mdice de estimulacion promedio calculado para todos los peptidos de Vh y Vl de cetuximab analizados como potenciales epftopos CD4+. La figura 6B muestra el mdice de estimulacion promedio calculado para todos los peptidos de Vh y Vl de hu225 analizados como potenciales epftopos CD4+.

6. Descripcion detallada

6.1 Anticuerpos anti-EGFR

La presente divulgacion proporciona anticuerpos anti-EFGR. A menos que se indique lo contrario, el termino "anticuerpo"(Ab) se refiere a una molecula de inmunoglobulina que se une espedficamente a, o es inmunologicamente reactiva con, un antfgeno particular, e incluye formas policlonales, monoclonales, modificadas geneticamente y modificadas de otro modo de anticuerpos, incluyendo, pero sin limitaciones, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespedficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos) y fragmentos de anticuerpos de union a antfgeno, incluyendo, por ejemplo, los fragmentos Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG y scFv. Ademas, a menos que se indique lo contrario, se entiende que el termino "anticuerpo monoclonal" (mAb) incluye tanto moleculas intactas como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces de unirse espedficamente a una protema. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan mas rapidamente de la circulacion del animal y pueden tener menos union de tejido no espedfica que un anticuerpo intacto (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).

El termino "Scfv" se refiere a un anticuerpo Fv de cadena unica donde los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo tradicional se han unido para formar una cadena.

Las referencias a "VH" se refieren a la region variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un Fv, scFv o Fab. Las referencias a "VL" se refieren a la region variable de una cadena ligera de inmunoglobulina de una inmunoglobulina, incluyendo la cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Los anticuerpos (Abs) y las inmunoglobulinas (Igs) son glucoprotemas que tienen las mismas caractensticas estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de union a una diana espedfica, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moleculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad por la diana. Los “anticuerpos e inmunoglobulinas nativos” normalmente son glucoprotemas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 dalton compuestas por dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena pesada tiene en el extremo amino, un dominio variable (Vh) seguido por una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene en el extremo amino un dominio variable (Vl) y un dominio constante en el extremo carboxi.

"Cetuximab" se refiere al anticuerpo quimerico humano/de raton conocido como Erbitux®.

"hu225" se refiere a una version humanizada de MAb225, que es el anticuerpo parental del anticuerpo quimerico C225 (tambien conocido como cetuximab o Erbitux®).

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion se unen al EGFR humano e inhiben su actividad en una celula.

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion contienen regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que estan relacionadas en secuencia con las CDR del anticuerpo cetuximab y del anticuerpo hu225.

Las CDR tambien se conocen como regiones hipervariables en los dominios variables tanto de la cadena ligera

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como de la cadena pesada. Las porciones mas conservadas de los dominios variables se denominan el marco (FR). Como se conoce en la tecnica, la posiciondmite de aminoacidos que delinea una region hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y de las diversas definiciones conocidas en la tecnica. Algunas posiciones dentro de un dominio variable pueden considerarse posiciones hipervariables Idbridas en el sentido de que estas posiciones pueden considerarse dentro de una region hipervariable bajo un conjunto de criterios mientras que se considera que estan fuera de una region hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o mas de estas posiciones tambien pueden encontrarse en regiones hipervariables extendidas. La divulgacion proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones hipervariables Idbridas. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, en gran parte adoptando una configuracion de lamina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lamina p. Las CDR de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR en el orden FR1-CDRl-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union diana de los anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)). Como se usa en el presente documento, la numeracion de los residuos de aminoacidos de la inmunoglobulina se realiza de acuerdo con el sistema de numeracion de los residuos de aminoacidos de inmunoglobulinas de Kabat et al., a menos que se indique lo contrario.

Las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera de cetuximab estan representadas por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera tambien se representan en la Figura 1A. Las secuencias de las CDR de cetuximab, y sus correspondientes identificadores, se presentan en la Figura 1C. Cualquier secuencia de nucleotidos que codifica la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 se puede usar en las composiciones y procedimientos de la presente divulgacion.

Las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera de hu225 estan representadas por SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera tambien se representan en la Figura 1B. Las secuencias de las CDR de hu225, que son identicas a las secuencias de las CDR de cetuximab, y sus identificadores de secuencia se presentan en la Figura 1C. Cualquier secuencia de nucleotidos que codifica la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10 se puede usar en las composiciones y procedimientos de la presente divulgacion.

La presente divulgacion proporciona ademas fragmentos de anticuerpo anti-EGFR que comprenden secuencias de CDR que estan relacionadas con las secuencias de CDR de cetuximab y de hu225. La expresion "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porcion de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la region variable o de union a la diana. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Un fragmento "Fv" es el fragmento mmimo de anticuerpo que contiene un reconocimiento de diana completo y un sitio de union. Esta region consiste en un dfmero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociacion estrecha y no covalente (dfmero Vh-Vl)- Es en esta configuracion en que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de union a la diana sobre la superficie del dfmero Vh-Vl. A menudo, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de union a la diana. Sin embargo, en algunos casos, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDR espedficas para una diana) puede tener la capacidad para reconocer y unirse a la diana. Los fragmentos de anticuerpo “Fv de una sola cadena” o "scFv" comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo en una unica cadena polipepddica. En general, el polipeptido Fv comprende ademas un ligador polipepddico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la union a la diana. Los "anticuerpos de dominio unico" estan compuestos por un solo dominio Vh o Vl que exhiben afinidad suficiente por la diana. En una realizacion espedfica, el anticuerpo de dominio unico es un anticuerpo de camelido (vease, por ejemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

El fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 la cadena pesada que incluye una o mas cistemas de la region bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F(ab') se producen mediante la escision del enlace disulfuro en las cistemas bisagra del producto de digestion con pepsina de F(ab')2. Los expertos en la tecnica conocen acoplamientos qrnmicos adicionales de fragmentos de anticuerpo.

En deltas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion son anticuerpos monoclonales. La expresion “anticuerpo monoclonal” como se usa en la presente memoria, no esta limitada a los anticuerpos producidos mediante la tecnologfa de hibridoma. La expresion "anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que deriva de un clon sencillo, incluido un clon eucariota, procariota o de fago, y no el procedimiento por el cual se produce. Los anticuerpos monoclonales en relacion con la presente divulgacion se pueden preparar usando una amplia variedad de tecnicas conocidas en la materia, incluido el uso de tecnologfas de expresion en fagos, hibridoma y recombinante, o una combinacion de las mismas. Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion incluyen anticuerpos quimericos, primatizados, humanizados o humanos.

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden ser anticuerpos quimericos. El termino anticuerpo "quimerico" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una

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inmunoglobulina no humana, tal como anticuerpo de rata o raton, y regiones constantes de inmunoglobulina humana, elegidas tipicamente de un molde de inmunoglobulina humana. En la tecnica se conocen los procedimientos para producir anticuerpos quimericos, Vease, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202- 7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; las patentes de Estados Unidos N.° 5.807.715; 4.816.567; y 4,816397.

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden ser humanizados. Las formas "humanizadas” de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quimericas espedficas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2, u otros subdominios de union a la diana de anticuerpos), que contienen secuencias mmimas derivadas de la inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos o al menos uno, y normalmente dos, dominios variables donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado tambien pueden comprender al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente de la secuencia consenso de una inmunoglobulina humana. Los procedimientos de humanizacion de anticuerpos son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; las patentes de Estados Unidos n.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370 de Queen et al.; el documento EP239400; la publicacion PCT WO 91/09967; la patente de Estados Unidos n.° 5,225,539; el documento EP592106; el documento EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498 (1991); Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; y la patente de Estados Unidos n.° 5.565.332.

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden ser anticuerpos humanos. Pueden ser deseables los anticuerpos anti-EGFR completamente “humanos” para el tratamiento terapeutico de pacientes humanos. Como se usa en el presente documento, “anticuerpos humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgenicos para una o mas inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endogenas. Los anticuerpos humanos se pueden fabricar mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica, incluidos procedimientos de expresion en fagos usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Veanse las patentes de Estados Unidos n.° 4,444,887 y 4,716,111; y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741. Tambien se pueden producir anticuerpos humanos usando ratones transgenicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endogenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; las patentes de Estados Unidos n.° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Ademas, empresas tales como Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), Amgen (Thousand Oaks, CA) y Regeneron (Tarrytown, NY) se pueden comprometer para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antfgeno seleccionado usando tecnologfa similar a la descrita en lo que antecede. Se pueden generar anticuerpos completamente humanos que reconocen un epftopo seleccionado usando una tecnica denominada “seleccion guiada”. En este enfoque se usa un anticuerpos monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo un anticuerpo de raton, para guiar la seleccion de un anticuerpo completamente humano que reconozca el mismo epftopo (Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden ser primatizados. La expresion “anticuerpo primatizado” se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes de humano. En la tecnica se conocen procedimientos para producir anticuerpos primatizados Veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.658.570; 5.681.722; y 5.693.780.

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden ser anticuerpos biespedficos. Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos monoclonales, a menudo humanos o humanizados, que tienen especificidades de union para al menos dos antfgenos diferentes. En la presente divulgacion, una de las especificidades de union se puede dirigir al EGFR, la otra puede ser para cualquier otro antfgeno, por ejemplo para una protema de la superficie celular, receptor, subunidad receptora, antfgeno especifico de tejido, protema derivada viralmente, una protema de la envuelta codificada viralmente, una protema derivada de bacterias o una protema de la superficie bacteriana, etc.

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion incluyen anticuerpos derivatizados. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, los anticuerpos derivatizados se han modificado tfpicamente mediante glicosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion, derivacion mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escision proteolttica, union a un ligando celular u otra protema (vease la Seccion 6.4 para una discusion sobre conjugados de anticuerpos) etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones qmmicas se puede llevar a cabo mediante tecnicas conocidas, incluidas, entre otras, escision qrnmica espedfica, acetilacion, formilacion, smtesis metabolica de tunicamicina etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o mas aminoacidos no naturales, por ejemplo usando tecnologfa ambrx (vease, por ejemplo, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2).

En aun otra realizacion mas de la divulgacion, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos cuya secuencia se ha modificado para alterar al menos una funcion

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efectora biologica mediada por la region constante con relacion a la secuencia de tipo salvaje correspondiente.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede modificarse para reducir al menos una funcion efectora biologica mediada por la region constante con relacion a un anticuerpo no modificado, por ejemplo union reducida al receptor Fc (FcyR). La union a FcyR puede reducirse mutando el segmento de la region constante de la inmunoglobulina del anticuerpo en regiones particulares necesarias para las interacciones de FcyR (vease, por ejemplo, Canfield and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; y Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). La reduccion de la capacidad de union a FcyR del anticuerpo tambien puede reducir otras funciones efectoras que dependen de las interacciones de FcyR, tales como opsonizacion y fagocitosis y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("ADCC”).

En otras realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede modificarse para adquirir o mejorar al menos una funcion efectora biologica mediada por la region constante con relacion a un anticuerpo no modificado, por ejemplo para potenciar las interacciones de FcyR (vease, por ejemplo, el documento US 2006/0134709). Por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede tener una region constante que se une a FcyRIIA, FcyRIIB y/o FcyRIIIA con mayor afinidad que la correspondiente region constante de tipo salvaje.

Por lo tanto, los anticuerpos de la divulgacion pueden tener alteraciones en la actividad biologica que dan lugar a una opsonizacion, fagocitosis o ADCC aumentada o disminuida. Dichas alteraciones son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, las modificaciones en anticuerpos que reducen la actividad de ADCC se describen en la patente de Estados Unidos n.° 5.834.597. Una variante de disminucion de la ADCC de ejemplo corresponde al "mutante 3" mostrado en la figura 3 de la patente de Estados Unidos n.° 5.834.597, donde el residuo 236 se ha delecionado y los residuos 234, 235 y 237 (utilizando numeracion de UE) se sustituyen con alanitas.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion tienen niveles bajos o carecen de fucosa. Los anticuerpos que carecen de fucosa se han correlacionado con una actividad de ADCC potenciada, especialmente a dosis bajas de anticuerpo. Vease Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73. Los procedimientos para preparar anticuerpos sin fucosa incluyen el crecimiento en celulas YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). Las celulas YB2/0 expresan niveles bajos de ARNm de FUT8, que codifica a-1,6-fucosiltransferasa, una enzima necesaria para la fucosilacion de polipeptidos.

En aun otro aspecto, los anticuerpos anti-EGFR o sus fragmentos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se han modificado para aumentar o reducir sus afinidades de union al receptor Fc fetal, FcRn, por ejemplo, mediante la mutacion del segmento de la region constante de inmunoglobulina en regiones concretas implicadas en las interacciones de FcRn (vease, por ejemplo, el documento WO 2005/123780). En realizaciones particulares, un anticuerpo anti-EGFR de la clase IgG esta mutado de manera que al menos uno de los residuos de aminoacidos 250, 314 y 428 de la region constante de la cadena pesada esta sustituido solo o en cualquier combinacion de los mismos, tal como en las posiciones 250 y 428, o en las posiciones 250 y 314, o en las posiciones 314 y 428, o en las posiciones 250, 314 y 428, con las posiciones 250 y 428, una combinacion espedfica. Para la posicion 250, el residuo de aminoacido sustituto puede ser cualquier residuo de aminoacido distinto a treonina, incluidos, entre otros, alanina, cistema, acido aspartico, acido glutamico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptofano o tirosina. Para la posicion 314, el residuo de aminoacido sustituto puede ser cualquier residuo de aminoacido distinto a leucina, incluidos, entre otros, alanina, cistema, acido aspartico, acido glutamico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina valina, triptofano o tirosina. Para la posicion 428, los residuos de aminoacido sustitutos puede ser cualquier residuo de aminoacido distinto a metionina, incluidos, entre otros, alanina, cistema, acido aspartico, acido glutamico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina valina, triptofano o tirosina. Las combinaciones espedficas de sustituciones de aminoacidos adecuadas se identifican en la Tabla 1 de la patente de Estados Unidos n.° 7.217.797. Dichas mutaciones aumentan la union del anticuerpo a FcRn, que protege al anticuerpo de la degradacion y aumenta su semivida.

En aun otros aspectos, un anticuerpo anti-EGFR tiene uno o mas aminoacidos insertados en una o mas de sus regiones hipervariables, por ejemplo, como se describe en Jung y Pluckthun, 1997, Protein Engineering 10(9):959- 966; Yazaki et al., 2004, Protein Eng Des. Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17; y el documento US 2007/0280931.

En diversas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se han modificado para aumentar la expresion en huespedes heterologos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se han modificado para aumentar la expresion y/o la secrecion en las celulas huesped heterologas. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de los mismos se modifican para aumentar la expresion en bacterias, tales como E coli. En otras realizaciones, los anticuerpos anti- EGFR o fragmentos de los mismos se modifican para aumentar la expresion en levaduras (Kieke et al., 1999, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:5651-5656). En aun otras realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de los mismos se modifican para aumentar la expresion en celulas de insecto. En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de los mismos se modifican para aumentar la expresion en celulas de mairnfero, tales como

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celulas CHO.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se han modificado para aumentar la estabilidad de los anticuerpos durante la produccion. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden modificarse para reemplazar uno o mas aminoacidos, tales como asparagina o glutamina, que son susceptibles de desamidacion no enzimatica con aminoacidos que no sufren desamidacion (Huang et al., 2005, Anal. Chem. 77:1432-1439). En otras realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden modificarse para reemplazar uno o mas aminoacidos que son susceptibles a la oxidacion, tales como metionina, cistema o triptofano, con un aminoacido que no sufre oxidacion facilmente. En aun otras realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden modificarse para reemplazar uno o mas aminoacidos que son susceptibles a ciclacion, tales como asparagina o acido glutamico, con un aminoacido que no sufre ciclacion facilmente.

6.2 Acidos nucleicos y sistemas de expresion

La presente divulgacion abarca moleculas de acido nucleico y celulas huesped que codifican los anticuerpos anti- EGFR de la divulgacion.

Un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede prepararse mediante expresion recombinante de genes de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina en una celula huesped. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una celula huesped se transfecta con uno o mas vectores de expresion recombinante que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina del anticuerpo, de forma que las cadenas ligera y pesada se expresan en la celula huesped y, opcionalmente, se secretan al medio donde se cultivan las celulas huesped, medio del cual se pueden recuperar los anticuerpos. Las metodologfas de ADN recombinante estandar se usan para obtener genes de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, para incorporar estos acidos nucleicos en vectores de expresion recombinantes y para introducir los vectores en celulas huesped, tales como las descritas en Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda edicion (Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) y en la patente de Estados Unidos n.° 4.816.397.

En una realizacion, los anticuerpos anti-EGFR son similares al cetuximab pero para cambios en una o mas CDR (a las que en el presente documento se hace referencia como que tienen secuencias “relacionadas con cetuximab”). En otra realizacion, los anticuerpos anti-EGFR son similares al hu225 pero para cambios en una o mas CDR (a las que en el presente documento se hace referencia como que tienen secuencias “relacionadas con hu225”). Para generar acidos nucleicos que codifican tales anticuerpos anti-EGFR, primero se obtienen fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de las cadenas ligera y pesada. Estos ADN pueden obtenerse mediante amplificacion y modificacion del ADN de la lmea germinal o el ADNc que codifica las secuencias variables de las cadenas ligera y pesada, por ejemplo, usando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de ADN de la lmea germinal para genes de las regiones variables de las cadena pesada y ligera humanas son conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, la base de datos de secuencias de la lmea germinal humana "VBASE"; vease tambien Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; y Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836). Un fragmento de ADN que codifica la region variable de las cadenas pesada o ligera de cetuximab o de hu225 puede sintetizarse y usarse como molde para la mutagenesis para generar una variante como se describe en el presente documento usando tecnicas de mutagenesis de rutina; como alternativa, se puede sintetizar directamente un fragmento de ADN que codifica la variante.

Una vez que se han obtenido los fragmentos de ADN que codifican los segmentos de Vh y Vl de cetuximab o relacionados con cetuximab, los segmentos de Vh y Vl de hu225 o relacionados con hu225, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante tecnicas estandar de ADN recombinante, por ejemplo para convertir los genes de la region variable en genes de la cadena del anticuerpo de longitud completa, en genes del fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica Vl o Vh esta unido operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra protema, tal como una region constante de anticuerpo o un conector flexible. La expresion “unido operativamente”, como se usa en este contexto”, esta destinada a significar que los dos fragmentos de ADN estan unidos de un modo tal que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.

El ADN aislado que codifica la region VH se puede convertir en un gen de la cadena pesada de longitud completa mediante union operativa del ADN que codifica la region VH en otra molecula de aDn que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4). Las secuencias de los genes de la region constante de la cadena pesada humana son conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificacion por PCR estandar. La region constante de la cadena pesada puede ser una region constante de IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero, en ciertas realizaciones, es una region constante de IgG1 o IgG4. Para un

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gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica Vh se puede unir operativamente a otra molecula de ADN que codifica la region constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la region VL se puede convertir en un gen de la cadena ligera de longitud completa (asf como el gen de la cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL en otra molecula de ADN que codifica la region constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la region constante de la cadena ligera se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242)) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificacion por PCR estandar. La region constante de la cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda, pero, en ciertas realizaciones, es una region constante kappa. Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican Vh y Vl estan unidos de forma operativa a otro fragmento que codifica un ligador flexible, por ejemplo que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4 -Ser)3, de modo que las secuencias Vh y Vl se puedan expresar en forma de una protema monocatenaria contigua, con las regiones Vh y Vl unidas mediante el conector flexible (vease, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554)..

Para expresar los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, obtenidos como se ha descrito en lo que antecede, se insertan en vectores de expresion de modo que los genes estan operablemente unidos a secuencias de control de la transcripcion y la traduccion. En este contexto, la expresion “unido de forma operativa” quiere decir que un gen del anticuerpo esta ligado en un vector tal que las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion dentro del vector sirven a la funcion prevista de regulacion de la transcripcion y la traduccion del gen del anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se escogen de modo que sean compatibles con la celula huesped usada para la expresion. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores distintos o, mas normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion.

Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresion mediante procedimientos estandar (por ejemplo, ligando sitios de restriccion complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y en el vector, o ligando los extremos romos si no hay sitios de restriccion presentes). Antes de la insercion de las secuencias de las cadenas ligera o pesada relacionadas con cetuximab o de cetuximab, o de las secuencias de las cadenas ligera o pesada relacionadas con hu225 o de hu225, el vector de expresion puede llevar ya secuencias de las regiones constantes de anticuerpos. Por ejemplo, un abordaje a la conversion de las secuencias de Vh y Vl en genes de anticuerpo de longitud completa es insertarlas en vectores de expresion que ya codifican la region constante de la cadena pesada y la region constante de la cadena ligera, respectivamente, de forma que el segmento Vh este unido operativamente al o los segmentos Ch dentro del vector y el segmento Vl este unido operativamente al segmento Cl dentro del vector. Adicionalmente, o como alternativa, el vector de expresion recombinante tambien puede codificar un peptido senal que facilita la secrecion de la cadena del anticuerpo a partir de una celula huesped. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el peptido senal este unido dentro del marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El peptido senal puede ser un peptido senal de inmunoglobulina o un peptido senal heterologo (es decir, un peptido senal de una protema no inmunoglobulmica).

Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresion recombinantes de la presente divulgacion portan secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de la cadena del anticuerpo en una celula huesped. Con la expresion “secuencia reguladora” se pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o la traduccion de los genes de la cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen en, por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion, incluida la seleccion de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que se va a transformar, el nivel de expresion de protema deseada, etc. Ejemplos de secuencias reguladoras adecuadas para la expresion en celulas huesped de mairnfero incluyen elementos vmcos que dirigen niveles elevados de expresion proteica en celulas de mamffero, tal como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el potenciador/promotor del CMV), virus 40 de simios (SV40) (tal como el potenciador/promotor del SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardm principal del adenovirus (AdMLP)), y polioma. Para una descripcion adicional de los elementos reguladores virales, y de sus secuencias, vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.168.062 de Stinski, la patente de Estados Unidos n.° 4.510.245 de Bell et al., y la patente de Estados Unidos N.° 4.968.615 de Schaffner et al.

Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes de la divulgacion pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en las celulas huesped (por ejemplo, ongenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de las celulas huesped donde se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos, tales como G418, puromicina, blasticidina, higromicina o metotrexato, a una celula huesped donde el vector se ha introducido. Entre

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los genes marcadores seleccionables adecuados se incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en celulas huesped DHFR- con seleccion con metotrexato/amplificacion) y el gen neo (para la seleccion de G418). Para la expresion de las cadenas ligera y pessda, el(los) vector(es) de expresion que codifican las cadenas ligera y pesada se transfectan en una celula huesped mediante tecnicas estandar. Las diversas formas del termino “transfeccion” estan destinadas a abarcar una amplia variedad de tecnicas usadas habitualmente para la introduccion de ADN exogeno en una celula huesped procariota o eucariota, por ejemplo electroporacion, lipofeccion, precipitacion con fosfato calcico, transfeccion en DEAE-dextrano y similares.

Es posible expresar los anticuerpos de la divulgacion en celulas huesped procarioticas o eucarioticas. En ciertas realizaciones, la expresion de anticuerpos se realiza en celulas eucariotas, por ejemplo, celulas huesped de mairnfero, para la secrecion optima de un anticuerpo debidamente plegado e inmunologicamente activo. Ejemplos de celulas huesped de mamffero para expresar los anticuerpos recombinantes de la divulgacion incluyen celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluidas las celulas CHO DHFR-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo como se describe en in Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), celulas de mieloma NSO, celulas COS, celulas HKB y celulas SP2/0. Cuando los vectores de expresion que codifican genes de anticuerpo se introducen en celulas huesped de mamffero, los anticuerpos se producen mediante cultivo de las celulas huesped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas huesped o, mas preferentemente, la secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo donde crecen las celulas huesped. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando procedimientos de purificacion proteica estandar. Las celulas huesped tambien se pueden usar para producir porciones de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moleculas scFv. Se entiende que variaciones sobre el procedimiento anterior entran dentro del alcance de la presente divulgacion. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una celula huesped con ADN que codifique la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo anti-EGFR de la presente divulgacion.

Tambien se puede usar tecnologfa de ADN recombinante para eliminar parte o todo el ADN que codifica una o las dos cadenas ligera y pesada que no es necesario para la union a EGFR. Las moleculas expresadas a partir de dichas moleculas de ADN truncado tambien estan abarcadas por los anticuerpos de la divulgacion.

Ademas, se pueden producir anticuerpos bifuncionales donde una cadena pesada y una ligera con un anticuerpo de la divulgacion y las otras cadenas pesada y ligera son espedficas de un antfgeno diferente distinto de EGFR mediante reticulacion de un anticuerpo de la divulgacion a un segundo anticuerpo mediante procedimientos de reticulacion qmmica estandar. Los anticuerpos bifuncionales tambien pueden hacerse expresando un acido nucleico disenado para codificar un anticuerpo bifuncional.

En ciertas realizaciones, se pueden producir anticuerpos espedficos duales, es decir anticuerpos que unen a EGFR y un antfgeno no relacionado usando el mismo sitio de union, mediante la mutacion de residuos de aminoacidos en las CDR de la cadena ligera y/o de la cadena pesada. En diversas realizaciones, se pueden producir anticuerpos espedficos duales que se unen a dos antfgenos, tales como EGFR y HER2, mediante la mutacion de residuos de aminoacidos en la periferia del sitio de union al antfgeno (Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-1614). Los anticuerpos funcionales duales tambien pueden hacerse expresando un acido nucleico disenado para codificar un anticuerpo dual espedfico.

Para la expresion recombinante de un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion, la celula huesped se puede cotransfectar con dos vectores de expresion de la divulgacion, donde el primer vector codifica un polipeptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipeptido derivado de la cadena ligera. Tfpicamente, los dos vectores contienen cada uno un marcador seleccionable separado. Como alternativa, se puede usar un solo vector que codifique ambos polipeptidos, de la cadena pesada y de la cadena ligera.

Una vez que se genera un acido nucleico que codifica una o mas porciones de cetuximab, hu225 o de un anticuerpo anti-EGFR con secuencias de CDR relacionadas con las secuencias de CDR de cetuximab o hu225, se pueden introducir otras alteraciones o mutaciones en la secuencia codificante, por ejemplo, para generar acidos nucleicos que codifican anticuerpos con diferentes secuencias de CDR, anticuerpos con afinidad reducida por el receptor Fc, o anticuerpos de diferentes subclases.

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion tambien pueden producirse mediante smtesis qmmica (por ejemplo, mediante los procedimientos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Tambien se pueden generar anticuerpos variantes utilizando una plataforma libre de celulas (vease, por ejemplo, Chu et al., Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)).

Una vez que se ha producido un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion mediante expresion recombinante, se puede purificar por cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la purificacion de una molecula de inmunoglobulina, por ejemplo mediante cromatograffa (por ejemplo, cromatograffa en columna de intercambio ionico, de afinidad, particularmente de afinidad por el anffgeno espedfico despues de la protema A, protema G o protema Ly de exclusion por tamano), centrifugacion, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra tecnica estandar para la purificacion de protemas. Ademas, los anticuerpos anti-EGFR de la presente divulgacion o fragmentos de los

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mismos se pueden condensar con secuencias de polipeptidos heterologos descritas en el presente documento o conocidos de otro modo en la tecnica por que facilitan la purificacion.

Una vez aislado, un anticuerpo anti-EGFR puede, si se desea, purificarse adicionalmente, por ejemplo mediante cromatograffa lfquida de alta resolucion (vease, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work y Burdon, eds., Elsevier, 1980)), o mediante cromatograffa de filtracion en gel en una columna Superdex™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).

6.3 Propiedades biologicas de los anticuerpos anti-EGFR

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion tienen ciertas actividades biologicas, tales como competir con cetuximab o con hu225 por la union a EGFR o actividad de EGFR neutralizante.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion compiten con cetuximab por la union a EGFR. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion compiten con hu225. La capacidad para competir por la union a EGFR se puede analizar usando un ensayo competitivo. En un ejemplo de un ensayo competitivo, el EGFR se adhiere a una superficie solida, por ejemplo una placa de micropocillos, poniendo en contacto la placa con una solucion de EGFR (por ejemplo, a una concentracion de 1 pg/ml en PBS durante la noche a 4 °C). La placa se lava (por ejemplo, Tween 20 al 0,1 % en PBS) y se bloquea (por ejemplo, en Superblock, Thermo Scientific, Rockford, IL). Se anade una mezcla de cantidad subsaturante de cetuximab o hu225 biotinilado (80 ng/ml) y cetuximab o hu225 no marcado (el anticuerpo "de referenda"), o anticuerpo anti-EGFR competidor (el anticuerpo "de prueba”) en dilucion en serie (por ejemplo, a una concentracion de 2,8 pg/ml, 8,3 pg/ml, o 25 pg/ml) en tampon ELISA (por ejemplo, 1 % de bSa y Tween 20 al 0,1 % en PBS) a los pocillos y las placas se incuban durante 1 hora con agitacion suave. La placa se lava, se anade a cada pocillo 1 pg/ml de estreptavidina conjugada con HRP diluida en tampon ELISA y las placas se incuban durante 1 hora. Las placas se lavan y los anticuerpos unidos se detectan mediante la adicion de sustrato (por ejemplo, TMB, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD). La reaccion se termina mediante la adicion de tampon de parada (por ejemplo, Bio Fx Stop Reagents, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD) y la absorbancia se mide a 650 nm usando un lector de microplacas (por ejemplo, VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Tambien se pueden usar variaciones en este ensayo competitivo para analizar la competencia entre un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y cetuximab o hu225. Por ejemplo, en ciertos aspectos, el anticuerpo anti-EGFR se usa como anticuerpo de referencia y cetuximab o hu225 se usan como anticuerpo de prueba. Adicionalmente, en lugar de EGFR soluble, se puede usar EGFR unido a membrana expresado sobre las superficies de las celulas (por ejemplo, celulas de mairnfero) en cultivo. En la tecnica se conocen otros formatos para ensayos de competicion y pueden emplearse.

En varias realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion reduce la union de hu225 marcado o de cetuximab marcado en al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un porcentaje que oscila entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion reduce la union de hu225 marcado o cetuximab marcado en un 50 % a 70 %) cuando se usa el anticuerpo anti-EGFR a una concentracion de 0,08 pg/ml, 0,4 pg/ml, 2 pg/ml, 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml o a una concentracion que vana entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, a una concentracion que vana de 2 pg/ml a 10 pg/ml.).

En diversas realizaciones, la union de los anticuerpos de la divulgacion a EGFR se puede determinar usando un ensayo de Sapidyne KINEXA. En este ensayo, previamente se recubrieron perlas de Sepharose de flujo rapido activadas con NHS (GE Healthcare) con antfgeno (50 pg de anticuerpo anti-EGFR por ml de perlas) y se bloquearon con 10 mg/ml de BSA en Tris-HCl 1 M, pH 8.0. A continuacion se incuban 2 pM, 4 pM, 40 pM de un anticuerpo de la divulgacion con diversas concentraciones (por ejemplo, 2,4 pM a 10 nM, diluciones en serie) de EGFR soluble en tampon de funcionamiento (PBS, Tween 20 al 0,005 % (v/v) y ovalbumina 1 mg/ml) durante 10 horas a temperatura ambiente. Para determinar el anticuerpo libre presente en equilibrio, cada muestra se hace pasar a traves de perlas recubiertas con EGFR soluble. La cantidad de anticuerpo unido a las perlas se cuantifica despues pasando una solucion de anticuerpo Fc antihumano de cabra (Jackson Immuno Research) marcado fluorescente (Cy5) diluido 1:4000 en tampon de ejecucion sobre las perlas. La senal de fluorescencia medida es proporcional a la concentracion del anticuerpo libre en equilibrio. En ciertas realizaciones, cada concentracion de EGFR soluble se mide por duplicado. La constante de disociacion del equilibrio (Kd) se puede obtener a partir de regresion no lineal de las curvas de competicion usando un modelo de union homogeneo de un sitio de curva multiple (software KINEXA).

La constante de la velocidad de asociacion (kon) para la union a EGFR soluble tambien se puede determinar usando un ensayo de Sapidyne KINEXA. Se mezclan dos anticuerpos pM con EGFR soluble 20 pM utilizando las mismas condiciones descritas en el parrafo anterior. En varias ocasiones, las muestras se someten a analisis del anticuerpo libre utilizando las condiciones descritas anteriormente para la union en equilibrio y, a continuacion, la dependencia temporal resultante se ajusta usando el software KINEXA para determinar la velocidad de asociacion (kon). La constante de la velocidad de disociacion (kf se calcula utilizando la expresion kf = Kd X kon

En otros aspectos, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion inhibe (o neutraliza) la actividad de EGFR en un

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intervalo de ensayos In vitro, tal como proliferacion celular, fosforilacion de EGFR y apoptosis. Por ejemplo, en una realizacion, la actividad de EGFR analizada es la induccion de la proliferacion de celulas de carcinoma epidermico A431 (vease, por ejemplo, Sato et al, "Biological Effects in vitro of Monoclonal Antibodies to Human Epidermal Growth Factor Receptors", (1983), Mol. Biol. Med., 1, 511-529). En este ensayo, las celulas A431 se mantienen en DMEM mas FBS al 10 %. El dfa 1, las celulas se colocan en PBS durante 20 minutos y se digieren con tripsina durante 5 minutos antes de sembrar en placas. Las celulas se siembran en placas a una densidad celular de 15.000 celulas por pocillo en un formato de 384 pocillos en placas de cultivo de celulas tratadas Greiner 384 TC usando un multidrop 384. El volumen medio final es de 50 pl. Las placas de cultivo celular se cubren con cinta con orificios (Qiagen, Valencia, CA).. Las celulas se dejaron adherir durante la noche. El dfa dos se retira el medio de cultivo celular y se sustituye por 50 pl de DMEM libre de rojo de fenol (sin FBS) ("pocillos de control") o DMEM y anticuerpo anti-EGFR ("pocillos de tratamiento") por duplicado a una concentracion esperada de 2,5 pg/ml. Dos pocillos de control se encuentran adyacentes a cada pocillo de tratamiento para un total de 192 pocillos de control. El dfa 3, se retira el medio y se reemplaza con DMEM libre de rojo de fenol que contiene el reactivo de proliferacion celular MTS (Promega, Madison, WI, 1 ml/10 ml de medio). La absorbancia a 490 nm se registra despues de 15 y 30 minutos. El valor medio para todos los tratamientos duplicados se divide por la media de todos los pocillos de control.

En ciertas realizaciones, la actividad analizada es la fosforilacion de la tirosina quinasa EGFR. Tales ensayos de actividad se pueden realizar del siguiente modo. Las celulas A431 se cultivan hasta aproximadamente 70 % de confluencia en placas de 6 pocillos y se dejaron sin suero durante la noche en DMEM 0,5 % de FBS. A continuacion, las celulas se incuban con diluciones de anticuerpo en presencia de EGF 100 nM (Upstate) durante una hora. Las celulas se lavan con PBS fno y se lisan con 0,5 ml de tampon de lisis. (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, 1 % de IGEPGAL CA-630, 0,25 % de desoxicolato de soido al 0,25 %, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM, vanadato de sodio 1 mM (NaVO4), NaF 1 mM, coctel de proteasa de 1/2 comprimido en 10 ml). El material insoluble se elimina por ultracentrifugacion a 10.000 RPM durante 30 minutos. Los lisados celulares se ajustan para determinar la concentracion de protemas y las cantidades equivalentes de cada extracto se separan por sDS-PAGE. Los niveles de EGFR fosforilado se determinan mediante transferencia Western desarrollada con un anticuerpo anti-fosfo-EGFR (Upstate).

En otras realizaciones, la actividad del anticuerpo anti-EGFR se analiza mediante induccion de apoptosis de celulas A431. En este ensayo, las celulas A431 a 20.000 celulas/pocillo en placas de 24 pocillos se incuban con 1,0 ug/ml de anticuerpo anti - EGFR durante 0, 3, 7, 24 u 48 horas. La apoptosis se mide mediante ELISA para la fragmentacion del ADN (Roche). La apoptosis basal de un anticuerpo no espedfico se resta de la media.

En la tecnica se conocen otros formatos para ensayos de neutralizacion del EGFR y pueden emplearse.

En varias realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion neutraliza el EGFR en al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o en un porcentaje que oscila entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion neutraliza la actividad de EGFR en un 50 % a 70 %) cuando se usa el anticuerpo anti-EGFR a una concentracion de 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 0,1 pg/ml, 0,2 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, o a una concentracion que vana entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, a una concentracion que vana de 1 pg/ml a 5 pg/ml).

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion es al menos 0,7 veces mas eficaz, 0,8 veces mas eficaz, al menos 0,9 veces mas eficaz, al menos 1 vez mas eficaz, al menos 1,1 veces mas eficaz, al menos 1,25 veces mas eficaz, al menos 1,5 veces mas eficaz, al menos 2 veces mas eficaz, al menos 5 veces mas eficaz, al menos 10 veces mas eficaz, al menos 20 veces mas eficaz, al menos 100 veces mas eficaz, al menos 100 veces mas eficaz, al menos 200 veces mas eficaz, al menos 500 veces mas eficaz, al menos 1000 veces mas eficaz que cetuximab o hu225 en la neutralizacion del EGFR o que tiene una eficacia En la neutralizacion del EGFR relativo a cetuximab o hu225 que vana entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 0,9 veces a 5 veces mas eficaz que cetuximab o hu225 o de 2 veces a 50 veces mas eficaz que cetuximab o hu225 en la neutralizacion del EGFR).

6.4 Propiedades cineticas de los anticuerpos anti-EGFR

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion tienen una alta afinidad de union por EGFR. En realizaciones espedficas, los anticuerpos anti-EGFR de la presente divulgacion tienen constantes de velocidad de asociacion espedficas (valores de kon Ka), constantes de velocidad de disociacion (valores de koff o Kd), constantes de afinidad (valores de Ka), constantes de disociacion (valores de Kd) y/o valores de CI50. En ciertos aspectos, dichos valores se seleccionan de las siguientes realizaciones.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se une a EGFR con un Ka (kon/koff) De al menos 1010 M-1, al menos 4 X 1011 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 4 X 1012 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 4 X 1013 M-1, al menos 1013 M-1, al menos 4 X 1014 M-1, al menos 1014 M-1, al menos 4 X 1015 M-1, al menos 1015 M-1, o con una Ka de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, de 4 X 10 M' a 4 X 10 Mo de 4 X 1012M'1 a 4 X 1015M'1).

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En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se une a EGFR con un una Kd (koff/kon) de10"10 o

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menos, 4 X 10 M o menos, 10 M o menos, 4 X 10 M o menos, 10 M o menos, 4 X 10 M o menos, 10 M

14 14 15 15

o menos, 4 X 10 M o menos, 10 M o menos, 4 X 10 M o menos, 10 M o menos, o con una Kd de cualquier

11 13 12 1

intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, de 4 X 10 M a 4 X 10 M o de 4 X 10 M a 4

X 10-15 M).

En realizaciones espedficas, el valor de Kd (koff/kon) se determina mediante ensayos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, ELISA, calorimetna de titulacion isotermica (ITC), ensayo de polarizacion fluorescente o cualquier otro biosensor como BIAcore.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se une a EGFR e inhibe la union de EGFR a su ligando EGF a una CI50 menor de 0,02 nM, menor de 0,01 nM, menor de 0,005 nM, menor de 0,002 nM, menor de 0,001 nM, menor de 5 x 10"4 NM, menor de 2 x 10"4 nM, menor de 1 x 10"4 nM, menor de 5 x 10"5 nM, menor de 2 x 10"5 nM, menor de 1 x 10"4 nM, menor de 5 x 10"6 nM, menor de 2 x 10"6 nM, menor de 1 x 10"6 nM, menor de 5 x 10"7 nM, menor de 2 x 10"7 nM, menor de 1 x 10"7 nM, o con una CI50 de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 0,02 nM a 2 x 10"5 nM, o 5 x 10"5 nM a 1 x 10"7 nM). La CI50 puede medirse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo ELISA.

En ciertas realizaciones, las propiedades cineticas de un anticuerpo de la divulgacion son comparables o mejoradas con respecto a cetuximab o hu225 en un ensayo comparable. por ejemplo, en ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se une a EGFR con una velocidad kon que vana de aproximadamente 0,5x a 1000x de la kon de cetuximab o de hu225, por ejemplo, una kon de 0,75 de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,1x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,2x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,3x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,4x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,5x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,6x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,6x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,7x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,8x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 1,9x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 2x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 2,25x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 2,5x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 2,75x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 3x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 4x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 5x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 6x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 7x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 8x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 9x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 10x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 15x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 20x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 50x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 75x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 100x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 150x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 200x de la kon de cetuximab o de hu225, o una kon Que vana entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo una kon de 2x-75x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de5x-100x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 0,05x-1000x de la kon de cetuximab o de hu225, una kon de 0,75x-250x de la kon de cetuximab o de hu225, etc.

En diversas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se une a EGFR con una velocidad de kf que vana de aproximadamente 0,001x a aproximadamente 3x de la kf de cetuximab o de hu225, por ejemplo , una kf de 0,002x de la kf de cetuximab o de hu225, una kf de 0,003x de la kf de cetuximab o de hu225, una kf de 0,004x de la kf de cetuximab o de hu225, una kf de 0,005x de la kf de cetuximab o de hu225, una kf de 0,006x de la koff de cetuximab o de hu225, una kf de 0,0075x de la kf de cetuximab o de hu225, una kf de 0,01x de la kf de cetuximab o de hu225, una koff de 0,025x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 0,05x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 0,075x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 0,1x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 0,25x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 0,5x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 0,75x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 1x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 1,25x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 1,5x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 1,75x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 2x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 2,25x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 2,5x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 3x de la koff de cetuximab o de hu225, o una koff que vana entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo una koff de 0,01x to 1,25x de la koff de cetuximab o de hu225, una koff de 0,05x to 2,5x de la koff de cetuximab o de hu225, o una koff de 0,006x to 0,1 x de la koff de cetuximab o de hu225, etc.

En otras realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se une a EGFR con un una Ka (kon/koff) Que vana de aproximadamente 0,25x a aproximadamente 1000x de la Ka de cetuximab o de hu225, por ejemplo, una Ka de 0,5x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 0,75 de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 1x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 2x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 3x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 4x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 5x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 10x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 15x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 20x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 30x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 40x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 50x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 75x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 100x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 200x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 250x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 300x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 350X de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 400x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 500x de la Ka de cetuximab o

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de hu225, una Ka de 750x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 100x de la Ka de cetuximab o de hu225, o una Ka que vana entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo una Ka de 0,75x to 100x de la Ka de cetuximab o de hu225, una Ka de 10x to 50x de la Ka de cetuximab o de hu225, o una Ka de 5x to 50x de la Ka de cetuximab o de hu225, etc.

En aun otras realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se une a EGFR con una Kd (Wkon) que vana de aproximadamente 0,001x a 10x de la Kd de cetuximab o de hu225, o, por ejemplo, una Kd de 0,001x de la Kd de cetuximab o de hu225, a Kd de 0,002x de la Kd de cetuximab o de hu225, a Kd de O,003x de la Kd de cetuximab o de hu225, a Kd de 0,004x de la Kd de cetuximab o de hu225, a Kd de 0,005x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,0075x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,01x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,025x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,05x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,075x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,1x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,2x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,3x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,4x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,5x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,75x de la Kd de cetuximab una Kd de 1x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 1,5x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 2x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 3x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 4x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de Sx de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 7,5x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 10x de la Kd de cetuximab o de hu225, o una Kd Que vana entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo una Kd de 0,001x o 0,5x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,1x to 4x de la Kd de cetuximab o de hu225, una Kd de 0,05 to 1x de la Kd de cetuximab o de hu225, etc.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se une a EGFR e inhibe la union de EGFR a EGF o neutraliza la actividad de EGFR a un valor de CI50 que vana de aproximadamente 0,001x a 10x de la CI50 de cetuximab o de hu225, por ejemplo a un valor de CI50 de 0,01x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,05x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,1x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,2x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,3x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,4x de la CI 50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,5x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,6x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,7x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,8x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 0,9x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 1x de la CI50 de

cetuximab o de hu225, a una CI50 de 1,5x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 2x de la CI50 de

cetuximab o de hu225, a una CI50 de 3x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 4x de la CI50 de

cetuximab o de hu225, a una CI50 de 5x de la CI50 de cetuximab o de hu225, a una CI50 de 7,5x de la CI50 de

cetuximab o de hu225, a una CI50 de 10x de la CI50 de cetuximab o de hu225, o una CI50 que vana entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo una CI50 de 0,01 A 0,2 de la CI50 de cetuximab o de hu225, una IC50 de 0,1x a 1,5x de la CI50 de cetuximab o de hu225, una CI50 de 0,2x a 2x de la CI50 de cetuximab o de hu225, etc. . En ciertas realizaciones, una unica sustitucion de CDR puede dar como resultado las diferencias anteriores en la CI50 as en comparacion con cetuximab o hu225, mientras que un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede comprender dicha sustitucion y hasta 16 sustituciones de CDR adicionales en comparacion con cetuximab o hu225.

6.5 Conjugados de anticuerpos

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion incluyen conjugados de anticuerpos que se han modificado, por ejemplo mediante la union covalente de cualquier tipo de molecula al anticuerpo de modo que la union covalente no interfiere en la union a EGFR.

En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede conjugarse con un resto efector o un marcador. El termino "resto efector", tal como se utiliza en el presente documento, incluye, por ejemplo, agentes antineoplasicos, farmacos, toxinas, protemas biologicamente activas, por ejemplo, enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polfmeros sinteticos o naturales, acidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN), radionuclidos, particularmente radioyoduro, radioisotopos, metales quelados, nanopartfculas y grupos indicadores, tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopia de RMN o ESR.

En un ejemplo, los anticuerpos anti-EGFR pueden conjugarse con un resto efector, tal como un agente citotoxico, un radionuclido o un resto de farmaco para modificar una respuesta biologica dada. El resto efector puede ser una protema o polipeptido, tal como, por ejemplo, y sin limitacion, una toxina (tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina difterica), una molecula de senalizacion (tal como as a-interferon, p-interferon, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador del plasminogeno tisular), un agente trombotico o un agente antiangiogenico (por ejemplo, angiostatina o endostatina) o un modificador de la respuesta biologica, tal como una citoquina o un factor de crecimiento (por ejemplo, interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de macrofagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) o factor de crecimiento nervioso (NGF)).

En otro ejemplo, los restos efectores pueden ser citotoxinas o agentes citotoxicos. Ejemplos de citotoxinas o agentes citotoxicos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuto de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihIdroxi antracina diona, mitoxantrona,

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mitramIcina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol y puromicina, y analogos u homologos de los mismos.

Los restos efectores tambien incluyen, entre otros, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo descarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretanamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC), calicheamicinas o diocarmicinas) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Otros restos efectores pueden incluir radionuclidos, tales como, pero sin limitaciones, In y Y, Lu , Bismuto

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Californio , Iridio y Tungsteno /Renio y farmacos tales como, pero sin limitaciones, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Las tecnicas para conjugar tales restos efectores a anticuerpos son bien conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., en las paginas 623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).

En un ejemplo, el anticuerpo anti-EGFR o fragmento del mismo se fusiona a traves de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptfdico), a traves del extremo N o del extremo C del anticuerpo o internamente, a una secuencia de aminoacidos de otra protema (o parte de la misma, por ejemplo, al menos una porcion de 10, 20 o 50 aminoacidos de la protema). El anticuerpo o fragmento del mismo puede estar unido a la otra protema en el extremo N del dominio constante del anticuerpo. Se pueden usar procedimientos de ADN recombinante para crear tales fusiones, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745. En otro ejemplo, la molecula efectora puede aumentar la semivida in vivo, y/o mejorar la administracion de un anticuerpo a traves de una barrera epitelial al sistema inmunologico. Ejemplos de moleculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polfmeros, albumina, protemas de union a la albumina o compuestos de union a la albumina tales como los descritos en el documento WO 2005/117984.

En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-EGFR se conjuga con una toxina de molecula pequena. En ciertas realizaciones ejemplares, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se conjuga con dolostatina o un analogo o derivado peptfdico de dolostatina, por ejemplo una auristatina (patentes de Estados Unidos n.° 5.635.483 y 5.780.588). El resto de farmaco de dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo a traves de su extremo N (amino), su extremo C (carboxilo) o internamente (documento WO 02/088172). Ejemplos de realizaciones de auristatina incluyen los restos de farmaco de monometilauristatina unidos al extremo N-terminal DE y DF, como se divulga en la patente de Estados Unidos n.° 7.498.298 (que divulga, por ejemplo, conectores y procedimientos de preparacion de compuestos de monometilvalina, tales como MMAE y MMAF conjugados a conectores).

En otras realizaciones de ejemplo, las toxinas de molecula pequena incluyen, pero no se limitan a, caliqueamicina, maytansina (patente de Estados Unidos n.° 5.208.020), tricoteno y CC1065. En una realizacion de la divulgacion, el anticuerpo esta conjugado con una o mas moleculas de maytansina (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moleculas de maytansina por molecula de anticuerpo). La maytansina puede, por ejemplo, convertirse en May-SS-Me que puede reducirse a May-SH3 y reaccionar con un anticuerpo (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131) Para generar un conjugado de maitansinoide-anticuerpo o conjugado de fusion maitansinoide-Fc. Los analogos estructurales de la caliqueamicina que pueden usarse tambien incluyen, pero no se limitan a los mismos, Y11,Y31,Y31-N-acetil-Y11, PSAG, y 011 (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928; la patente de Estados Unidos n.° 5.714.586; la patente de Estados Unidos n.° 5.712.374; la patente de Estados Unidos n.° 5.264.586; la patente de Estados Unidos n.° 5.773.001).

Los anticuerpos de la divulgacion tambien pueden conjugarse con liposomas para administracion dirigida (vease, por ejemplo, Park et al., 1997, Adv. Pharmacol. 40:399-435; Marty & Schwendener, 2004, Methods in Molecular Medicine 109:389-401).

En un ejemplo, los anticuerpos de la presente divulgacion se pueden unir a restos de poli (etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y los restos de PEG pueden unirse a traves de cualquier grupo amino de aminoacidos disponible o grupo amino terminal funcional situado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier amino libre, imino, tiol, hidroxilo o grupo carboxilo. Tales aminoacidos pueden producirse naturalmente en el fragmento de anticuerpo o pueden manipularse en el fragmento utilizando procedimientos de ADN recombinante. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.219.996. Pueden usarse multiples sitios para unir dos o mas moleculas de PEG. Los restos de PEG pueden unirse covalentemente a traves de un grupo tiol de al menos un residuo de cistema situado en el fragmento de anticuerpo. Cuando se usa un grupo tiol como punto de union, se pueden usar restos efectores apropiadamente activados, por ejemplo, derivados selectivos de tiol, tales como maleimidas y derivados de cistema.

En un ejemplo espedfico, un conjugado de anticuerpo anti-EGFR es un fragmento Fab' modificado que esta

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PEGilado, es decir, tiene PEG (poli (etilenglicol)) unido covalentemente al mismo, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento divulgado en el documento EP0948544. Vease tambien Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris y S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); y Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); y Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. El PEG se puede unir a una cistema en la region bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab' modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un solo grupo tiol en una region bisagra modificada. Un residuo de lisina puede estar unido covalentemente al grupo maleimida ya cada uno de los grupos amina del residuo de lisina se puede unir un polfmero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. Por lo tanto, el peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab' puede ser de aproximadamente 40.000 Da

La palabra "marcador" cuando se usa aqrn, se refiere a un compuesto o composicion detectable que puede conjugarse directa o indirectamente a un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion. El propio marcador puede ser detectable (por ejemplo, marcadores radioisotopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimatico, puede catalizar la alteracion qmmica de un compuesto o composicion sustrato que es detectable. Los restos fluorescentes utiles incluyen, pero no se limitan a, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina y similares. Los marcadores enzimaticos utiles incluyen, pero no se limitan a los mismos, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, glucosa oxidasa y similares.

Los conjugados de anticuerpos anti-EGFR adicionales que son utiles para, entre otras cosas, fines diagnosticos, se describen en la Seccion 6.5 mas adelante.

6.6 Usos diagnosticos de los anticuerpos anti-EGFR

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion, incluyendo los anticuerpos que se han modificados, por ejemplo mediante biotinilacion, peroxidasa de rabano picante, o cualquier otro resto detectable (incluyendo los descritos en la Seccion 6.4), pueden usarse ventajosamente con fines diagnosticos.

En particular, los anticuerpos anti-EGFR se pueden usar, por ejemplo, pero sin limitaciones, para purificar o detectar EGFR, incluyendo procedimientos diagnosticos tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para medir de forma cualitativa y cuantitativa los niveles de EGFR en muestras biologicas. Vease, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Segunda edicion (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).

La presente divulgacion abarca ademas anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de los mismos conjugados con un agente diagnostico. Los anticuerpos pueden usarse diagnosticamente, por ejemplo, para detectar la expresion de una diana de interes en celulas, tejidos o suero espedficos; o para monitorizar el desarrollo o la progresion de una respuesta inmunologica como parte de un procedimiento de ensayo clmico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un regimen de tratamiento dado. La deteccion se puede facilitar mediante acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones que usan varias tomograffas de emision de positrones e iones metalicos paramagneticos no radioactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente al anticuerpo (o fragmento del mismo) o indirectamente, a traves de un intermedio (tal como, por ejemplo, un conector conocido en la tecnica) usando tecnicas conocidas en la materia. Ejemplos de marcadores enzimaticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciernaga y luciferasa bacteriana; patente de Estados Unidos n.° 4.737.456), luciferina, 2,3- dihidroftalazinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tales como peroxidasa de rabano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, acetilcolinesterasa, glucoamilasa, lisozima, sacarido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterodclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Ejemplos de complejos de grupo prostetico adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo, puntos cuanticos o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

La divulgacion proporciona la deteccion de la expresion de EGFR, que comprende poner en contacto una muestra biologica (celulas, tejido, o fluido corporal de un individuo) usando uno o mas anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion (opcionalmente conjugado a un resto detectable) y detectar si o no la muestra es positiva para la expresion de EGFR, o si la muestra tiene una expresion alterada (por ejemplo, reducida o aumentada) en comparacion con una muestra de control.

Las enfermedades que pueden diagnosticarse utilizando los procedimientos de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a las mismas, las enfermedades descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, el tejido o fluido corporal es sangre periferica, leucocitos de sangre periferica, tejidos de biopsia tales como biopsias de

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mama o de ganglios linfaticos y tejido.

6.7 Procedimientos terapeuticos que utilizan anticuerpos anti-EGFR

6.7.1 Beneficios clinicos

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion se pueden usar para tratar diversas neoplasias. En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden usarse para tratar la enfermedad de Menetrier.

Los anticuerpos de la divulgacion son utiles en el tratamiento de tumores, incluyendo canceres y tumores benignos. Mas particularmente, los canceres que son susceptibles de tratamiento por los anticuerpos de la divulgacion incluyen aquellos que expresan exceso de EGFR. En ciertas realizaciones, los canceres que son susceptibles al tratamiento con los anticuerpos divulgados en el presente documento incluyen canceres de celulas epiteliales. En realizaciones particulares, los canceres susceptibles de tratamiento con anticuerpos anti-EGFR de la presente divulgacion incluyen cancer de mama, cancer de ovarios, cancer de pulmon, cancer colorrectal, cancer anal, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer de piel, cancer oral, cancer esofagico, cancer vaginal, cancer cervical, cancer de bazo, cancer testicular y cancer de timo. En algunas realizaciones particulares, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion se usan para tratar el cancer de cabeza y cuello en un paciente humano. En otras realizaciones particulares, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion se usan para tratar el cancer colorrectal en un paciente humano.

Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona procedimientos para tratar cualquiera de las enfermedades anteriores en un paciente que lo necesite, que comprende: administrar al paciente un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion. Opcionalmente, dicha administracion se repite, por ejemplo, despues de un dfa, dos dfas, tres dfas, cinco dfas, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, ocho semanas, dos meses o tres meses. La administracion repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. La administracion puede repetirse una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o mas. Por ejemplo, de acuerdo con ciertos regfmenes de dosificacion, un paciente recibe terapia anti-EGFR durante un penodo prolongado de tiempo, por ejemplo, 6 meses, 1 ano o mas. La cantidad de anticuerpo anti-EGFR administrado al paciente es, en ciertas realizaciones, una cantidad terapeuticamente eficaz. Como se usa en el presente documento, una cantidad "terapeuticamente eficaz" de anticuerpo EGFR puede administrarse como una dosis unica o durante el transcurso de un regimen terapeutico, por ejemplo, a lo largo de una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, tres meses, seis meses, un ano o mas. Los regfmenes terapeuticos de ejemplo se describen en la Seccion 6.9 a continuacion.

De acuerdo con la presente divulgacion, el tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes ya diagnosticados con cualquier forma de la enfermedad en cualquier estadio o manifestacion clmica; El retraso de la aparicion o evolucion o agravamiento o deterioro de los smtomas o signos de la enfermedad; y/o prevenir y/o reducir la gravedad de la enfermedad.

Un "sujeto" o "paciente" al que se administra el anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion es, preferentemente, un mairnfero tal como un no primate (por ejemplo, vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (por ejemplo, mono o humano). En ciertas realizaciones, el sujeto o paciente es un ser humano. En ciertos aspectos, el ser humano es un paciente adulto. En otros aspectos, el ser humano es un paciente pediatrico.

6.8 Composiciones farmaceuticas y vias de administracion

En el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y, opcionalmente, uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como los agentes terapeuticos de combinacion descritos en la Seccion 6.8 a continuacion. Las composiciones se suministraran normalmente como parte de una composicion farmaceutica esteril que incluira normalmente un vetuculo farmaceuticamente aceptable. La composicion puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado de administracion a un paciente).

Los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden administrarse a un paciente mediante diversas vfas, tales como por via oral, transdermica, subcutanea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intraocular, topica, intratecal e intracerebroventricular. La via mas adecuada para la administracion en cualquier caso dado dependera del anticuerpo particular, el sujeto, y la naturaleza y gravedad de la enfermedad y la condicion ffsica del sujeto.

Para el tratamiento de las indicaciones descritas en el presente documento, la dosis eficaz de un anticuerpo anti- EGFR de la divulgacion puede variar desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 500 mg/m2 (es decir., de aproximadamente 0,003 a aproximadamente 13 mg/kg para un ser humano adulto medio que tiene un peso corporal de 60 kg y una superficie corporal de 1,6 m2) para una unica administracion (por ejemplo, bolo), multiples administraciones o administracion continua, o para lograr una concentracion serica de 0,01-5000 pg/ml, concentracion serica una unica administracion (por ejemplo, bolo), multiples administraciones o administracion continua, o cualquier intervalo o valor efectivo en el mismo dependiendo de la afeccion a tratar, la via de

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administracion y la edad, el peso y el estado del sujeto. En ciertas realizaciones, por ejemplo, para el tratamiento del cancer, cada dosis puede variar desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 250 mg por metro2 de superficie corporal, por ejemplo, de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 100 mg por metro2 del area de superficie corporal, por ejemplo, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg por metro2 del area de superficie corporal. El anticuerpo puede formularse como una solucion acuosa y administrarse por inyeccion subcutanea.

Las composiciones farmaceuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion por dosis. Dicha unidad puede contener, por ejemplo, pero sin limitacion, de 0,1 mg a 5 g, por ejemplo, de 1 mg a 1 g, o de 10 a 50 mg. Los vehmulos farmaceuticamente aceptables para su uso en la divulgacion pueden tomar una amplia variedad de formas dependiendo, por ejemplo, de la afeccion que se va a tratar o la via de administracion.

Las formulaciones terapeuticas de los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden prepararse para el almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con vehmulos excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables tfpicamente empleados en la tecnica (todos los cuales se denominan en el presente documento "vehmulos"), es decir, agentes tampon, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificadores, detergentes no ionicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Vease, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion (Osol, ed. 1980). Tales aditivos no deben ser toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas.

Los agentes tampon ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiologicas. Pueden estar presentes a una concentracion comprendida entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 50 mM. Los agentes tampon adecuados para su uso con la presente divulgacion incluyen acidos organicos e inorganicos y sales de los mismos tales como tampones de citrato (por ejemplo, citrato monode soido-citrato de disodio, mezcla de acido cftrico-citrato tride soido, mezcla de acido cftrico-citrato monode soido, etc), tampones de succinato (por ejemplo, succinato monode soido de acido succmico, mezcla de acido succmico - hidroxido de sodio, mezcla de succinato dide soido- acido succmico etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de acido tartarico-tartrato de sodio, mezcla de acido tartarico-tartrato de potasio, mezcla de acido tartarico-hidroxido de sodio, etc), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de acido fumarico - fumarato monode soido, mezcla de acido fumarico - fumarato dide soido, mezcla de fumarato monode soido - fumarato dide soido, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de acido gluconico - gliconato de sodio, mezcla de acido gluconico - hidroxido de sodio, mezcla de acido gluconico- gluconato de potasio, etc), Tampon de oxalato (por ejemplo, mezcla acido oxalico - oxalato de sodio, mezcla de acido oxalico - hidroxido de sodio, mezcla de acido oxalico - oxalato de potasio, etc), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de acido lactico -lactato de sodio, mezcla de acido lactico - hidroxido de sodio, mezcla de acido lactico - lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de acido acetico - acetato de sodio, mezcla de acido acetico - hidroxido de soido, etc.). Adicionalmente, se pueden usar tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina tales como Tris.

Pueden anadirse conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y pueden anadirse en cantidades que vanan de 0,2 % -1 % (p/v). Los conservantes adecuados para su uso con la presente divulgacion incluyen fenol, alcohol bendlico, metacresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio y alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol. Se pueden anadir isotonicificadores a veces conocidos como "estabilizantes" para asegurar la isotonicidad de las composiciones ftquidas de la presente divulgacion e incluyen alcoholes de azucares polivalentes, por ejemplo, alcoholes de azucar trihndricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizantes se refieren a una amplia categona de excipientes que pueden variar en funcion desde un agente de carga a un aditivo que solubiliza el agente terapeutico o ayuda a prevenir la desnaturalizacion o adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes tfpicos pueden ser alcoholes de azucares polihndricos (enumerados anteriormente); aminoacidos, tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, acido glutamico, treonina, etc, azucares organicos o alcoholes de azucar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles tales como inositol; polietilenglicol; poftmeros de aminoacidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutation, acido tioctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tio-sulfato de soido; polipeptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, peptidos de 10 residuos o menos); protemas, tales como seroalbumina humana, seroalbumina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; poftmeros hidroffticos, tales como polivinilpirrolidona monosacaridos, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacaridos, tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacacaridos, tales como rafinosa; y polisacaridos, tales como dextrano. Los estabilizantes pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de peso de protema activa.

Pueden anadirse tensioactivos o detergentes no ionicos (tambien conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapeutico, asf como para proteger la protema terapeutica frente a la agregacion inducida por agitacion, que tambien permite que la formulacion se exponga en la superficie de cizallamiento estresada sin causar la desnaturalizacion de la protema. Los tensioactivos no ionicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxameros (184, 188 etc), polioles Pluronic, monoeteres de polioxietilensorbitano

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(TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no ionicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Otros diversos excipientes adicionales incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidon), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, acido ascorbico, metionina, vitamina E), y codisolventes.

La formulacion del presente documento tambien puede contener un agente terapeutico combinado ademas del anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion. Ejemplos de agentes terapeuticos de combinacion adecuados se proporcionan en la Seccion 6.8 a continuacion.

El programa de dosificacion para la administracion subcutanea puede variar de una vez cada seis meses a diario dependiendo de una serie de factores clmicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al anticuerpo anti-EGFR.

La dosificacion de un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion a administrar variara de acuerdo con el anticuerpo particular, el tipo de enfermedad, el sujeto y la gravedad de la enfermedad, el estado ffsico del sujeto, el regimen terapeutico (por ejemplo, si se usa un agente terapeutico combinado), y la via de administracion seleccionada; un experto en la materia puede determinar facilmente la dosis apropiada.

Un experto en la tecnica reconocera que la cantidad optima y la separacion de dosis individuales de un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se determinara mediante la naturaleza y la extension de la afeccion que se esta tratando, la forma, la ruta y el sitio de administracion, y la edad y el estado del sujeto particular que se esta tratando, y que un medico finalmente determinara las dosificaciones apropiadas que se utilizaran. Esta dosificacion puede repetirse tantas veces como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, la cantidad y/o la frecuencia de la dosis puede alterarse o reducirse de acuerdo con la practica clmica normal.

6.9 Terapia combinada

A continuacion se describen procedimientos combinatorios donde pueden utilizarse los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion. Los procedimientos combinados de la divulgacion implican la administracion de al menos dos agentes a un paciente, el primero de los cuales es un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion, y el segundo de los cuales es un agente terapeutico de combinacion. El anticuerpo anti-EGFR y el agente terapeutico combinado pueden administrarse simultaneamente, secuencialmente o por separado.

Los procedimientos de tratamiento combinado de la presente divulgacion pueden dar como resultado un efecto mayor que aditivo, proporcionando beneficios terapeuticos donde ni el anticuerpo anti-EGFR ni el agente terapeutico combinado se administran en una cantidad que sea solo terapeuticamente eficaz.

En los presentes procedimientos, el anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y el agente terapeutico combinado pueden administrarse concurrentemente, simultaneamente o sucesivamente. Como se usa en el presente documento, se dice que el anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y el agente terapeutico combinado se administran sucesivamente si se administran al paciente el mismo dfa, por ejemplo, durante la misma visita del paciente. La administracion sucesiva puede producirse con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas de separacion. Por el contrario, se dice que el anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y el agente terapeutico combinado se administran por separado si se administran al paciente en los diferentes dfas, por ejemplo, el anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y el agente terapeutico combinado pueden administrarse a intervalos de 1, 2 o 3 dfas, de una semana, de 2 semanas o mensualmente. En los procedimientos de la presente divulgacion, la administracion del anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede preceder o seguir a la administracion del agente terapeutico combinado.

Como ejemplo no limitativo, el anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y el agente terapeutico combinado se pueden administrar simultaneamente durante un penodo de tiempo, seguido de un segundo periodo de tiempo donde la administracion del anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y el agente terapeutico combinado se alterna.

Debido a los efectos potencialmente sinergicos de administrar un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion y un agente terapeutico combinado, dichos agentes pueden administrarse en cantidades que, si uno o ambos agentes se administran solos, no son terapeuticamente eficaces.

En ciertos aspectos, el agente terapeutico combinado es un agente quimioterapeutico, un agente antiangiogenico, un farmaco antirreumatico, un agente antiinflamatorio, un agente radioterapeutico, un agente inmunosupresor o un farmaco citotoxico.

Se contempla que cuando se usan para tratar diversas enfermedades, los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion pueden combinarse con otros agentes terapeuticos adecuados para las mismas enfermedades o enfermedades similares. Cuando se usan para tratar el cancer, los anticuerpos de la presente divulgacion pueden usarse en combinacion con terapias de cancer convencionales, tales como cirugfa, radioterapia, quimioterapia o

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combinaciones de las mismas.

En algunos otros aspectos, otros agentes terapeuticos utiles para la terapia tumoral de combinacion con el anticuerpo de la divulgacion incluyen antagonistas, por ejemplo anticuerpos, de otros factores que estan implicados en el crecimiento tumoral, tales como HER2, HER3, HER4, VEGF o TNF-a.

A veces, para el tratamiento de canceres puede ser beneficioso administrar tambien una o mas citoquinas al paciente. En una realizacion preferida, el anticuerpo anti-EGFR se coadministra con un agente inhibidor del crecimiento.

Las dosificaciones adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son las que se usan actualmente y se pueden reducir debido a la accion combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y del anticuerpo anti-EGFR.

Para el tratamiento de canceres, los agentes antiinflamatorios pueden utilizarse adecuadamente en combinacion con los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion. Los agentes antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a los mismos, acetaminofeno, difenhidramina, meperidina, dexametasona, pentasa, mesalazina, asacol, fosfato de codema, benilato, fenbufeno, naprosina, diclofenaco, etodolaco e indometacina, aspirina e ibuprofeno.

Para el tratamiento de canceres, los agentes quimioterapeuticos pueden utilizarse adecuadamente en combinacion con los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion. Los agentes quimioterapeuticos incluyen, pero no se limitan a los mismos, moleculas radiactivas, toxinas, tambien denominadas citotoxinas o agentes citotoxicos, que incluye cualquier agente que sea perjudicial para la viabilidad de celulas, agentes y liposomas u otras vesfculas que contienen compuestos quimioterapeuticos. Ejemplos de agentes quimioterapeuticos adecuados incluyen, pero sin limitacion, 1-deshidrotestosterona, 5-fluorouracil decarbazina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, un anticuerpo anti-a5p1 integrina, agentes alquilantes, alopurinol de soido, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC)), agentes antimitoticos, cisplorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, diamino dicloro platino, antraciclinas, antibioticos, antimetabolitos, asparaginasa, BCG vivo (intravesical), betametasona fosfato de soido y acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfan, leucouorina calcica, caliqueamicina, capecitabina, carboplatino, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), clorambucilo, cisplatino, cladribina, colchicina, estrogenos conjugados, ciclofosfamida, ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, citoxan, dacarbazina, dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina HCl, citrato de daunorucbicina, denileucina diftitox, dexrazoxano, dibromomanitol,

dihidroxiantracindiona, docetaxel, mesilato de dolasetron, doxorrubicina HCl, dronabinol, L-asparaginasa de E coli, eolociximab, emetina, epoetina-a, L-asparaginasa de Erwinia, estrogenos esterificados, estradiol, fosfato de soido de estramustina, bromuro de etidio, etinilestradiol, etidronato, factor etoposfdico citrororum, fosfato de etoposido, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, flutamida, acido folmico, gemcitabina HCl, glucocorticoides, acetato de goserelina, gramicidina D, granisetron Gcl, hidroxiurea, idarubicina HCl, ifosfamida, interferon a-2b, irinotecan HCl, letroxol, leucovorina calcica, acetato de leuprolida, levamisol HCl, lidocama, lomustina, maytansinoide, mecloretamina HCl, acetato de mdroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalan HCl, mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreotido, ondansetron HCl, paclitaxel, pamidronato dide soido, pentostatina, pilocarpina HCl, plimicina, polifeprosano 20 con implante de carmustina, porffmero de soido, procama, procarbazina HCl, propranolol, rituximab, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifen, taxol, teniposido, tenoposido, testolactona, tetracama, tioepa clorambucilo, tioguanina, tiotepa, topotecan HCl, citrato de toremifeno, trastuzumab, tretinoin, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina y tartrato de vinorelbina.

Cualquier agente antiangiogenico puede usarse junto con los anticuerpos anti-EGFR de la divulgacion, incluyendo los enumerados por Carmeliet y Jain, 2000, Nature 407: 249 - 257. En ciertas realizaciones, el agente antiangiogenico es un antagonista de VEGF u otro antagonista del receptor de VEGF, tal como variantes de VEGF, fragmentos del receptor de VEGF soluble, aptameros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos neutralizantes anti-VEGFR, inhibidores de bajo peso molecular de tirosina quinasas VEGFR y cualquier combinacion de los mismos. Como alternativa, o ademas de, un anticuerpo anti-VEGF puede coadministrarse al paciente.

En ciertas realizaciones, por ejemplo para tratar la enfermedad de Menetrier, se puede usar un anticuerpo anti- EGFR junto con un antagonista de TNF-a. Ejemplos de tales antagonistas de TNF-a incluyen, pero no se limitan a los mismos, receptores de TNF-a solubles; etanercept (ENBRELTM; Immunex) or o un fragmento, derivado o analogo del mismo; infliximab (REMICADE®; Centacor) o un derivado, analogo o fragmento de union a antfgeno del mismo; IL-10, que se sabe que bloquea la produccion de TNF-a a traves de macrofagos activados con interferon y (Oswald et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8676-8680), TNFR-IgG (Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539); el producto murino TBP-1 (Serono/Yeda); la vacuna CytoTAb (Protherics); molecula antisentido 104838 (ISIS); el peptido RDP-58 (SangStat); talidomida (Celgene); CDC-801 (Celgene); DPC-333 (Dupont); VX-745 (Vertex); AGIX-4207 (AtheroGenics); ITF-2357 (Italfarmaco); NPI-13021-31 (Nereus); SCIO-469 (Scios); TACE targeter (Immunix/AHP); CLX-120500 (Calyx); tiazolopirim (Dynavax); auranofina (Ridaura) (SmithKline Beecham Pharmaceuticals); quinacrina (mepacrina diclorhidrato); tenidap (Enablex); melanina (Large Scale Biological); y agentes anti-p38 MAPK de Uriach. En diversas realizaciones, el antagonista de TNF-a es un anticuerpo.

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En algunos aspectos, se puede usar un anticuerpo anti-EGFR junto con un inhibidor de la protema tirosina quinasa (PTK) de molecula pequena. En algunas realizaciones, el inhibidor de PTK es espedfico para la tirosina quinasa EGFR. En otras realizaciones, el inhibidor de PTK se une a mas de una de la familia HER de tirosina quinasas (por ejemplo, EGFR, HER2 y/o HER4). En aun otras realizaciones, los inhibidores de PTK se unen e inhiben las tirosina quinasas de una o mas protemas que interaccionan con o son reguladas por uno o mas miembros de la familia HER, por ejemplo protemas implicadas en una o mas cascadas de senalizacion que se originan con uno o mas miembros de la familia HER. En otras realizaciones, los inhibidores de la protema tirosina quinasa utiles en las composiciones y procedimientos de la invencion incluyen inhibidores de PTK que no se unen selectivamente a la familia HER de tirosina quinasas receptoras, sino que tambien se unen a los dominios de tirosina quinasa de otras familias de protemas tales como VEGFR , PDgFr, y/o Raf.

En algunas realizaciones, la tirosina quinasa es una tirosina quinasa receptora, es decir, es un dominio intracelular de una protema mayor que tiene un dominio de union al ligando extracelular y se activa mediante la union de uno o mas ligandos. En ciertas realizaciones, la protema tirosina quinasa es una tirosina quinasa no receptora. Los inhibidores de PTK para su uso en los procedimientos de la presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de PTK utiles en los procedimientos y composiciones de la invencion incluyen, pero no se limitan a gefitinib (ZD-1839, Iressa®), erlotinib (OSI-1774, Tarceva™), canertinib (CI-1033), vandetanib (ZD6474, Zactima®), tirfostina AG-825 (CAS 149092-50-2), lapatinib (GW-572016), sorafenib (BAY43-9006), AG-494 (CAS 133550-35-3), RG-13022 (CAS 149286-90-8), RG-14620 (CAS 136831-49-7), BIBW 2992 (Tovok), tirfostina 9 (CAS 136831-49-7), tirfostina 23 (CAS 118409-57-7), tirfostina 25 (CAS 118409-58-8), tirfostina 46 (CAS 122520-85-8), tirfostina 47 (CAS 122520-86-9), tirfostina 53 (CAS 122520-90-5), butema (1-(2,4-dihidroxifenil)-3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propen-1-ona 2',3,4,4'-tetrahidroxichalcona; CAS 487-52-5), curcumina ((E,E)-1,7-bis(4-Hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadieno-3,5- diona; CAS 458-37-7), N4-(1-Bencil-1H-indazol-5-il)-N6,N6-dimetil-pirido-[3,4-d]-pirimidina-4,6-diamina (202272-682), AG-1478, Ag-879, (3-(6-(3-trifluorometil-fenilamino)-pirimidin-4-ilamino)-fenil)-amida de acido

ciclopropanocarboxflico (CAS 879127-07-8), N8-(3-cloro-4-fluorofenil)-N2-(1-metilpiperidin-4-il)-pirimido[5,4- d]pirimidina-2,8-diamina, 2HcI (CAS 196612-93-8), 4-(4-Benciloxianilino)-6,7-dimetoxiquinazolina (CAS 179248-614), N-(4-((3-cloro-4-fluorofenil)amino)pirido[3,4-d]pirimidin-6-il)2-butinamida (CAS 881001-19-0), EKB-569, HKI-272, y HKI-357.

En una realizacion espedfica, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se usa en combinacion con terapia de radiacion. Esta combinacion es adecuada para, entre otros, el tratamiento inicial de pacientes con carcinoma de celulas escamosas avanzado local o regionalmente de cabeza y cuello.

En otra realizacion espedfica, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se usa como un solo agente despues de una terapia sin exito basada en platino. Este regimen es adecuado para, entre otros, el tratamiento de pacientes con carcinoma de celulas escamosas recurrente o metastasico de cabeza y cuello.

En aun otra realizacion espedfica, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se usa como terapias sin exito basadas en irinote'can y basadas en oxaliplatino. Este regimen es adecuado para, entre otros, el tratamiento de pacientes con cancer colorrectal metastasico que sobreexpresa EGFR. Este regimen tambien es adecuado para, entre otros, el tratamiento de pacientes con cancer colorrectal metastasico que sobreexpresa EGFR que son intolerantes a terapias basadas en irinotecan.

En otra realizacion espedfica, el anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se usa en combinacion con irinotecan. Esta combinacion es adecuada para, entre otros, el tratamiento de pacientes con carcinoma colorrectal metastasico que sobreexpresa EGFR que son resistentes a quimioterapia basada en irinotecan.

6.10 Regimenes terapeuticos

La presente divulgacion proporciona regfmenes terapeuticos que implican la administracion de los anticuerpos anti- EGFR de la divulgacion. El regimen terapeutico variara dependiendo de la edad, el peso y el estado de enfermedad del paciente. El regimen terapeutico puede continuar durante 2 semanas indefinidamente. En realizaciones espedficas, el regimen terapeutico se continua durante 2 semanas a 6 meses, de 3 meses a 5 anos, de 6 meses a 1 o 2 anos, de 8 meses a 18 meses, o similares. El regimen terapeutico puede ser un regimen de dosis no variable o un regimen de multiples dosis variables.

Para los regfmenes de dosificacion de ejemplo descritos a continuacion, el anticuerpo anti-EGFR puede administrarse como una solucion esteril, sin conservantes para administracion subcutanea.

Para el tratamiento del carcinoma de celulas escamosas avanzado local o regionalmente de cabeza y cuello en combinacion con radioterapia, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede administrarse por via intravenosa una semana antes del comienzo de la radioterapia a una dosis inicial de 0,1 a 500 mg mg/m2 (por ejemplo de 0,003 a 13,3 mg/kg para un humano adulto medio que pesa 60 kg y que tiene una superficie corporal de 1,6 m2). En realizaciones espedficas, la dosis inicial es de 0,1-400 mg/m2, 0,25-300 mg/m2, 0,5-250 mg/m2, 1-200 mg/m2, 1-150 mg/m2, 2-100 mg/m2, 5-75 mg/m2, 8-50 mg/m2, 10-350 mg/m2, 15-300 mg/m2, 20-250 mg/m2, 30-200 mg/m2 o 40100 mg/m2. Despues de la dosis inicial, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion puede administrarse por via

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intravenosa semanalmente durante 6-7 semanas (es dedr, La duracion de la radioterapia) a una dosis de 0,1 a 300 mg/m2 (es dedr, de 0,003 a 8 mg/kg kg para un humano adulto medio que pesa 60 kg y que tiene una superficie corporal de 1,6 m2). En realizaciones espedficas, la dosis posterior semanal es de 0,1 a 250 mg/m2, tal como 0,5200 mg/m2, tal como 1-150 mg/m2, tal como 2-100 mg/m2, tal como 2.5-100 mg/m2, tal como 5-75 mg/m2, tal como 10-50 mg/m2, tal como 15-150 mg/m2, tal como 20-100 mg/m2, tal como 30-125 mg/m2, tal como 40-150 mg/m2, o tal como 50-175 mg/m2.

Para el tratamiento del carcinoma de celulas escamosas recurrente o metastasico de cabeza y cuello tras un tratamiento sin exito con una terapia previa basada en platino, se administra un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion por via intravenosa como agente unico a una dosis inicial de 0,1 a 500 mg mg/m2 (por ejemplo de 0,003 a 13,3 mg/kg para un humano adulto medio que pesa 60 kg y que tiene una superficie corporal de 1.6 m2). En realizaciones espedficas, la dosis inicial es de 0,1-400 mg/m2, 0,25-300 mg/m2, 0,5-250 mg/m2, 1-200 mg/m2, 1-150 mg/m2, 2-100 mg/m2, 5-75 mg/m2, 8-50 mg/m2, 10-350 mg/m2, 15-300 mg/m2, 20-250 mg/m2, 30-200 mg/m2 o 40100 mg/m2. Despues de la dosis inicial, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se administra por via intravenosa una vez a la semana a una dosis de 0,1 a 300 mg/m2 (es decir, de 0,003 a 8 mg/kg kg para un humano adulto medio que pesa 60 kg y que tiene una superficie corporal de 1,6 m2). En realizaciones espedficas, la dosis posterior semanal es de 0,1 a 250 mg/m2, tal como 0,5-200 mg/m2, tal como 1-150 mg/m2, tal como 2-100 mg/m2, tal como 2.5-100 mg/m2, tal como 5-75 mg/m2, tal como 10-50 mg/m2, tal como 15-150 mg/m2, tal como 20-100 mg/m2, tal como 30-125 mg/m2, tal como 40-150 mg/m2, o tal como 50-175 mg/m2.

Para el tratamiento de cancer colorrectal que expresa EGFR despues de un tratamiento infructuoso con ambas terapias a base de irinotecan y a base de oxaliplatino o en pacientes que son intolerantes a regfmenes basados en irinotecan, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se administra por via intravenosa como un solo agente a un dosis inicial de 0,1 a 500 mg/m2 (por ejemplo, de 0,003 a 13,3 mg/kg para un humano adulto medio que pesa 60 kg y que tiene una superficie corporal de 1,6 m2). En realizaciones espedficas, la dosis inicial es de 0,1-400 mg/m2, 0,25300 mg/m2, 0,5-250 mg/m2, 1-200 mg/m2 1-150 mg/m2, 2-100 mg/m2, 5-75 mg/m2, 8-50 mg/m2, 10-350 mg/m2, 15300 mg/m2, 20-250 mg/m2, 30-200 mg/m2 o 40-100 mg/m2. Despues de la dosis inicial, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se administra por via intravenosa una vez a la semana a una dosis de 0,1 a 300 mg/m2 (es decir, de 0,003 a 8 mg/kg kg para un humano adulto medio que pesa 60 kg y que tiene una superficie corporal de 1,6 m2). En realizaciones espedficas, la dosis posterior semanal es de 0,1 a 250 mg/m2, tal como 0,5-200 mg/m2, tal como 1-150 mg/m2, tal como 2-100 mg/m2, tal como 2.5-100 mg/m2, tal como 5-75 mg/m2, tal como 10-50 mg/m2, tal como 15150 mg/m2, tal como 20-100 mg/m2, tal como 30-125 mg/m2, tal como 40-150 mg/m2, o tal como 50-175 mg/m2.

Para el tratamiento del carcinoma colorrectal metastasico que expresa EGFR en pacientes que son refractarios a la quimioterapia basada en inriotecan se administra un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion por via intravenosa como agente unico a una dosis inicial de 0,1 a 500 mg/m2 (por ejemplo de 0,003 a 13,3 mg/kg para un humano adulto medio que pesa 60 kg y que tiene una superficie corporal de 1,6 m2). En realizaciones espedficas, la dosis inicial es de 0,1-400 mg/m2, 0,25-300 mg/m2, 0,5-250 mg/m2, 1-200 mg/m2, 1-150 mg/m2, 2-100 mg/m2, 5-75 mg/m2, 8-50 mg/m2, 10-350 mg/m2, 15-300 mg/m2, 20-250 mg/m2, 30-200 mg/m2 o 40-100 mg/m2. Despues de la dosis inicial, un anticuerpo anti-EGFR de la divulgacion se administra por via intravenosa una vez a la semana a una dosis de 0,1 a 300 mg/m2 (es decir, de 0,003 a 8 mg/kg kg para un humano adulto medio que pesa 60 kg y que tiene una superficie corporal de 1,6 m2). En realizaciones espedficas, la dosis posterior semanal es de 0,1 a 250 mg/m2, tal como 0,5-200 mg/m2, tal como 1-150 mg/m2, tal como 2-100 mg/m2, tal como 2.5-100 mg/m2, tal como 5-75 mg/m2, tal como 10-50 mg/m2, tal como 15-150 mg/m2, tal como 20-100 mg/m2, tal como 30-125 mg/m2, tal como 40-150 mg/m2, o tal como 50-175 mg/m2.

6.11 Kits diagnosticos y farmaceuticos

Se incluyen en la presente divulgacion kits farmaceuticos que contienen los anticuerpos anti-EGFR (incluyendo conjugados de anticuerpos) de la divulgacion. El kit farmaceutico es un envase que comprende el anticuerpo anti- EGFR de la divulgacion (por ejemplo, ya sea en forma liofilizada o como una solucion acuosa) y uno o mas de los siguientes:

• Un agente terapeutico combinado, por ejemplo, como se describe en la Seccion 6.8 anterior;

• un dispositivo para administrar el anticuerpo anti - EGFR, por ejemplo, una pluma, una aguja y/o una jeringuilla; y

• agua de calidad farmaceutica o tampon para volver a suspender el anticuerpo si el anticuerpo esta en forma liofilizada.

En ciertos aspectos, cada dosis unitaria del anticuerpo anti-EGFR se envasa por separado, y un kit puede contener una o mas dosis unitarias (por ejemplo, dos dosis unitarias, tres dosis unitarias, cuatro dosis unitarias, cinco dosis unitarias, ocho dosis unitarias, diez dosis unitarias, o mas). En una realizacion espedfica, las una o mas dosis unitarias estan alojadas cada una en una jeringa o pluma.

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o mas reactivos utiles para realizar un ensayo diagnostico. Cuando el anticuerpo anti-EGFR esta marcado con una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromoforo o fluoroforo detectable). Ademas, se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampon de bloqueo o un tampon de lisis), y similares. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-EGFR incluido en un kit de diagnostico se inmoviliza sobre una superficie solida, o una superficie solida (por ejemplo, un portaobjetos) donde el anticuerpo puede inmovilizarse se incluye en el kit. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solucion de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En una realizacion espedfica, el anticuerpo y uno o mas reactivos pueden proporcionarse (individualmente o combinados) como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que al disolverse proporcionaran una solucion de reactivo que tiene la concentracion apropiada.

7. Ejemplo 1: Comparacion de la afinidad de union de cetuximab (erbitux) y hu225 a EGFR

Las afinidades de union relativas de cetuximab y hu225 a EGFR se determinaron mediante un ensayo de competicion usando clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS). Las celulas A431 se cultivaron hasta 2 x 105 por pocillo de placas de 96 pocillos de fondo en V. Las celulas se lavaron con tampon de tincion para FACS (FSB). Comenzando con una concentracion inicial de 10 pg/ml de cada uno de los anticuerpos competidores (cetuximab no marcado y hu225), se hicieron diluciones en serie 1:3. El cetuximab biotinilado se diluyo hasta una concentracion final de 0,5 pg/ml (derivada de los resultados de titulacion). A continuacion, el cetuximab biotinilado se mezclo con cualquier anticuerpo competidor a diversas concentraciones y las mezclas se transfirieron a las placas de 96 pocillos que conteman las celulas A431. Las placas se incubaron despues sobre hielo durante 1 hora, y despues se lavaron dos veces con FSB. Se anadieron a los pocillos 25 pl de conjugado de etrepavidina-RPE (Biosource) diluido a 2,5 pg/ml en FSB y las placas se incubaron en hielo durante otros 30 minutos a oscuras. Las celulas se lavaron dos veces con FSB, y las celulas tenidas se resuspendieron con 200 pl de tampon de fijacion (paraformaldehndo al 1 %). Las muestras se leyeron utilizando un citometro de flujo.

Los resultados de tres experimentos se muestran en la Figura 2 e indican que las afinidades de union medidas (CI50) de cetuximab y hu225 a EGFR son comparables. El termino "chErbitux" se refiere a cetuximab.

8. Ejemplo 2: Identificacion de variantes de hu225 con afinidad aumentada POR EGFR

El anticuerpo hu225 se sometio a un amplio analisis mutacional para identificar mutantes que habfan aumentado la afinidad a EGFR en comparacion con hu225 de tipo salvaje. El aumento de la afinidad de los candidatos mutantes de alta afinidad por EGFR en comparacion con hu225 se analizo por FACS para confirmar su aumento relativo en la union a EGFR en comparacion con hu225.

8.1 Materiales y procedimientos

Para determinar la union de variantes individuales a EGFR, se incubaron variantes de inmunoglobulina de hu225 mostradas en la superficie celular con EGFR soluble en condiciones subsaturantes (por debajo de Kd), y el grado de union se cuantifico mediante FACS. Se construyeron variantes de hu225 individuales en el vector de presentacion en la superficie de celulas de mamffero (Akamatsu et al., 2007, J. Immunol. Methods 327(1-2):40-52) y se transfectaron a una lmea celular humana. Se mezclaron 400 ng de ADN plasmfdico en 50 pl de medio sin suero- hibridoma (SFM) con 1 pl de Lipofectamina 2000 en 50 pl de hibridoma-SFM y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, esta mezcla se anadio a un pocillo de una placa de 24 pocillos, previamente sembrada 24 horas antes con 2 x 105 de la lmea celular 293c18 derivada de rinon embrionario humano en 0,5 ml de medio DME suplementado con suero bovino fetal al 10 % y 0,25 mg/ml de G418. Despues de 48 horas, se recogieron las celulas y se prepararon para la tincion con FACS.

Para la tincion FACS, se incubaron aproximadamente 5 x 105 celulas con EGFR-CLambda-AF647 1nM (dominio extracelular de EGFR fusionado a CLambda y directamente conjugado con colorante Alexa Fluor 647) y una dilucion 1/500 de Kappa-PE de cabra anti-humana (Southern Biotech # 2060-09) en 1 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) mas seroalbumina bovina al 0,5 % (BSA), y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las celulas se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS frio + BSA al 0,5 %, se resuspendieron en 200 pl de PBS + formaldehndo al 1 % y se analizaron en un BD FACS Calibur. Las celulas se acotaron para incluir solamente la poblacion que expresa IgG y se determino la intensidad de fluorescencia media (MFI) del canal de union (Alexa Fluor 647). La mFi para la union de cada variante se comparo con hu225 de tipo salvaje para cada conjunto de muestras para normalizar la variabilidad experimento a experimento.

8.2 Resultados

Las tablas 3 y 4 muestran mutaciones en las CDR de las cadenas pesada y ligera de hu225 que los estudios de FACS indican una mayor afinidad por el EGFR. La union de estas variantes de hu225 a EGFR se muestra en la Figura 3. Los resultados de los estudios de FACS se tabulan en las Tablas 14-1 y 14-2 como aumento de la afinidad por EGFR sobre hu225 de tipo salvaje.

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Las Tablas 5 y 7 muestran mutaciones adicionales en las CDR de la cadena pesada de hu225 que los estudios preliminares indican que tienen mayor afinidad que hu225 por EGFR (datos no mostrados). Las Tablas 6 y 8 muestran mutaciones adicionales en las CDR de la cadena ligera de hu225 que los estudios preliminares indican que tienen mayor afinidad que hu225 por EGFR (datos no mostrados). Las Tablas 9 y 10 muestran respectivamente variantes de cadena pesada y variantes de cadena ligera que los estudios preliminares indican que tienen una afinidad por EGFR similar a la de hu225 (datos no mostrados).

9. Ejemplo 3: CARACTERIZACION ADICIONAL DE VARIANTES DE HU225 CON AFFINIDAD AUMENTADA POR EGFR (ELISA, ALPHALISA® Y ESTUDIOS BIACORE)

9.1 Materiales y procedimientos

Para determinar la union de variantes individuales a EGFR, se incubaron variantes de inmunoglobulina de hu225 mostradas en la superficie celular con EGFR soluble en condiciones subsaturantes (por debajo de Kd), y el grado de union se cuantifico mediante FACS (como se describe en el Ejemplo 2 anterior), ELlSA, alphaLISA y/o BIAcore.

El ELISA implica la union de un anticuerpo de captura a un soporte de fase solida, despues de lo cual se anaden muestras que contienen antigeno en una matriz o tampon adaptado para minimizar la union a la fase solida. A continuacion, se anade un anticuerpo marcado con enzima para la deteccion y determinacion de afinidades de union. El ELISA puede usarse para determinar la afinidad de union de variantes individuales, por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anticuerpos de la divulgacion, a EGFR. Vease, por ejemplo, Patel et al. Anticancer Research 27, no. 5A:3355-3366, 2007; y Nix et al. in "Immunoassays, a Practical Approach," ed. J.P. Gosling, pp. 239-261, Oxford University Press, 2000).

AlphaLISA es analogo al ELISA: un analito es capturado por un anticuerpo biotinilado unido a perlas de donante recubiertas con estreptavidina y un segundo anticuerpo conjugado a perlas aceptoras de AlphaLISA. La union de los dos anticuerpos al analito acerca las perlas de donante y de aceptor. La irradiacion con laser de las perlas donantes a 680 nm genera un flujo de oxfgeno singlete, desencadenando una cascada de eventos qmmicos en perlas aceptoras cercanas, lo que da lugar a una emision quimioluminiscente a 615 nm. En inmunoensayos AlphaLISA competitivos, se utiliza un analito biotinilado unido a perlas de donante de estreptavidina con un anticuerpo conjugado a las perlas aceptoras de AlphaLISA. El AlphaLISA tambien puede usarse para determinar la afinidad de union de variantes individuales, por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anticuerpos de la divulgacion, a EGFR. Vease, por ejemplo, Ullman et al., Clinical Chemistry 42, no. 9:1518-1526, 1996; y Hideharu et al., Cancer Science 98, no. 8:1275-1280, 2007.

Los ensayos BIAcore determinan la union usando la Resonancia de plasmon superficial (SPR), un fenomeno optico que permite la deteccion de interactivos no marcados. El BIAcore es otro procedimiento para determinar la afinidad de union de variantes individuales, por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anticuerpos de la divulgacion, a EGFR. Vease, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2008/0274114; and Che et al., J. of Pharm. and Biomed. Analysis 50, no. 2 (September 8, 2009):183-188.

KinExA (ensayo de exclusion cinetica) mide la concentracion de la molecula receptora (R) que no esta en complejo en una mezcla de receptor, ligando (L) y complejo LR. La concentracion de R sin complejos se mide exponiendo la mezcla en fase de solucion a L inmovilizada en fase solida durante un penodo de tiempo muy breve. El "tiempo de contacto" entre la mezcla en fase de solucion y la fase solida inmovilizada L se mantiene lo suficientemente corto como para que la disociacion del complejo LR sea insignificante. Cuando la posibilidad de disociacion significativa del complejo LR se excluye cineticamente, solo el R sin complejos ("libre") puede unirse a la fase solida. La cantidad de R libre que se une a la fase solida (medida por emision de fluorescencia a partir de un marcador secundario) es directamente proporcional a la concentracion de R libre en la muestra en fase de solucion. KinExA tambien puede usarse para determinar la afinidad de union de variantes individuales, por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de union a anticuerpos de la divulgacion, a EGFR. Vease, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2008/0274114; y Darling, et al. ASSAY and Drug Development Technologies, 2:647-657, 2004.

9.2 Resultados

Los resultados de estos estudios de union adicionales para ejemplos de variantes de sustitucion unica en las CDR de la cadena pesada se muestran en la Tabla 14-1. Los resultados para las variantes de sustitucion unica de ejemplo en las CDR de la cadena ligera se muestran en la Tabla 14-2. Los resultados para las variantes de sustitucion multiple de ejemplo estan en las cadenas pesada y ligera y se muestran en la Tabla 14-3. Los resultados en las Tablas 14-1 a 14-3 se muestran como un incremento en la afinidad en comparacion con hu225.

10. Ejemplo 4: Pruebas para las regiones del epitopo de celulas T CD4 + en cetuximab y cetuximab humanizado

10.1 Materiales y Procedimientos

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10.1.1 Peptidos

Los peptidos se sintetizaron usando un formato multi-pin de Mimotopes (Adelaide, Australia). Las secuencias de las regiones variables de de las cadenas ligera y pesada de cetuximab y hu225 se sintetizaron como peptidos de 15 unidades que se solapan por 12 aminoacidos (Figuras 4 y 5, respectivamente) para un total de 134 peptidos. Los peptidos llegaron liofilizados y se volvieron a suspender en DMSO (Sigma-Aldrich) a aproximadamente 1-2 mg/ml. Los peptidos de reserva se mantuvieron congelados a -20 °C.

10.1.2 Celulas mononucleares de sangre periferica humana

Los productos de la capa leucocitaria del donante de la comunidad se adquirieron del Stanford Blood Center, Palo Alto, CA. El material de la capa leucocitaria se diluyo 1: 1 v: v con DPBS que no contema calcio ni magnesio. El material de la capa leucocitaria (25-35 ml) se coloco en tubos de centnfuga conicos de 50 ml (Sarsted o Costar) con

12.5 ml de FicollPaque-PLUS (GE Healthcare). Las muestras se centrifugaron a 900 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se recogieron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de la interfase. Se anadio DPBS para llevar el volumen final a 50 ml y las celulas se centrifugaron a 350 g durante 5 minutos. Las celulas sedimentadas se resuspendieron en DPBS y se contaron.

10.1.3 Celulas dendriticas

Para el aislamiento de las celulas dendnticas, los frascos de cultivo T75 (Costar) se sembraron con 108 PBMC recien aisladas en un volumen total de 30 ml de medio AIM V (Invitrogen). El exceso de PBMC se congelo a -80 °C en 90 % de suero fetal de ternera (FCS), 10 % de DMSO a 5 x 107 celulas/ml. Los matraces T75 se incubaron a 37 °C y 5 % de CO 2 durante 2 horas. Las celulas no adherentes se retiraron, y la monocapa adherente se lavo con DPBS. Para diferenciar celulas dendriticas de monocitos, se anadieron 30 ml de medio AIM V que contema 800 unidades/ml de GM-CSF (Sistemas R y D) y 500 unidades/ml de IL-4 (Sistemas R y D). Los matraces se incubaron durante 5 dfas. El dfa 5 se anadieron IL-1a (endogeno) y TNFa (endogeno) a 50 pg/ml y 0,2 ng/ml. Los matraces se incubaron dos dfas mas. El dfa 7, se recogieron las celulas dendnticas mediante la adicion de 3 ml de EDTA 100 mM que contema de 0,5 a 1,0 mg de mitomicina C (Sigma-Aldrich) para una concentracion final de EDTA 10 mM y de mitomicina C de

16.5 a 33 pg/ml. Los matraces se incubaron una hora adicional a 37 °C y 5 % de CO2. Se recogieron celulas dendnticas y se lavaron en medio AIM V 2 - 3 veces.

10.1.4 Cultivo celular

El dfa 7, las PBMC autologas previamente congeladas se descongelaron rapidamente en un bano de agua a 37 °C. Las celulas se diluyeron inmediatamente en medio DPBS o AIM V y se centrifugaron a 350 g durante 5 minutos. Las celulas CD4+ se enriquecieron mediante seleccion negativa usando perlas magneticas (Easy-Sep CD4+ Kit, Stem Cell Technologies). Las celulas T CD4+ autologas y las celulas dendnticas se co-cultivaron a 2 x 105 celulas T CD4+ para 2 x 104 dendnticas por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Costar 9077). Se anadieron peptidos aproximadamente a 5 pg/ml. Los pocillos de control conteman el vehmulo DMSO (Sigma) solo a 0,25 % v: v. Los pocillos control positivos conteman DMSO al 0,25 % y toxoide tetanico (List Biologicals o CalBioChem) a 1 pg/ml. Los cultivos se incubaron durante 5 dfas. El dfa 5, se anadieron 0,25 pCi por pocillo de timidina tritiada (Amersham o GE Healthcare). Los cultivos se cosecharon el dfa 6 a matrices de filtracion usando una cosechadora de celulas Packard Filtermate Cell.. El recuento de centelleo se realizo usando un contador de centelleo Wallac MicroBeta 1450 (Perkin Elmer).

10.1.5 Analisis de datos

Los valores promedio de CPM de fondo se calcularon promediando los resultados individuales de 6 a 12 repeticiones. Se promediaron los valores de CPM de los cuatro pocillos de control positivo. Se promediaron los pocillos duplicados o triplicados para cada peptido. Se calcularon los valores del mdice de estimulacion para el control positivo y los pocillos de peptidos dividiendo los valores de CPM promedop experimentales por los valores de control promedio. Para su inclusion en el conjunto de datos, se requirio un mdice de estimulacion de mas de 3,0 en los pocillos de control positivo del toxoide del tetanos. Se observo una respuesta para cualquier peptido que daba como resultado un mdice de estimulacion de 2,95 o mayor. Los peptidos se analizaron usando muestras de sangre periferica de un grupo de 106 donantes para los peptidos hu225 y 87 donantes para los peptidos de cetuximab. Se recopilaron respuestas a todos los peptidos. Para cada peptido analizado, se calculo el porcentaje del conjunto donante que respondio con un mdice de estimulacion de 2,95 o mayor. In Ademas, tambien se calculo el mdice de estimulacion promedio para todos los donantes.

10.2 Resultados

10.2.1 Identificacion de epitopos de celulas T CD4+ en las regiones de VH y VL de cetuximab y cetuximab humanizado

Se identificaron peptidos de epttopos de celulas T CD4+ mediante un analisis del porcentaje de respuestas a los

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peptidos dentro de los conjuntos donantes. Se calculo el porcentaje de respuesta promedio para todos los peptidos analizados que describen las regiones variables de las cadenas pesadas y ligera de cetuximab y hu225. Se considero una tasa de respuesta mayor o igual a la respuesta promedio de fondo mas tres desviaciones estandar una CD4 potencial. El mdice de estimulacion promedio se calculo para todos los peptidos en el conjunto de datos. Los datos para las regiones Vh y Vl del anticuerpo se muestran en la Figura 6. En la figura 6a se muestran los datos compuestos para las regiones Vh y Vl de cetuximab El mdice promedio general de estimulacion es de 1,27 ± 0,27 desviaciones estandar. El porcentaje de respuesta promedio es de 4,72 ± 4,38 desviaciones estandar. La desviacion estandar ancha se debe a la presencia de respuestas dentro del conjunto de datos que son muy altas tanto en el SI promedio como en el porcentaje de respuesta. Como el cetuximab es un anticuerpo quimerico, es probable que la alta tasa de respuesta se deba a la derivacion murina de las secuencias peptidicas. De acuerdo con esta interpretacion, no hay prominentes peptido respuestas en el conjunto de datos de hu225 (Figura 6B]. El mdice de estimulacion promedio en el conjunto de datos hu225 es de 1,22 ± 0,14, y el porcentaje promedio de respuesta es de 3,3 ± 2,19.

Estos resultados sugieren que el proceso de humanizacion tal como se realiza en las regiones Vh Y Vl del hibridoma M225 resultaron en una molecula de anticuerpo sin epftopos de celulas T colaboradoras + CD4+ detectables- La ausencia de epftopos de celulas T CD4+ es probable que confieran potencial inmunogenico reducido al producto del anticuerpo.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> AKAMATSU, YOSHIKO

DUBRIDGE, ROBERT B.

POWERS, DAVID B.

<120> ANTICUERPOS ANTI-EGFR Y SUS USOS

<130> 381493-229US

<140>

<141>

<150> 61/255.632 <151>

<160> 387

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 119 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: polipeptido sintetico <400> 1

imagen1

<210>2 <211> 108 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: polipeptido sintetico

10

<400>2

5

10

15

20

25

30

imagen2

<210>3 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400>3

Asn Tyr Gly Val His 1 5

<210> 4 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 4

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 5 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

10

<400>5

Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 15 10

<210>6 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 6

15

20

25

30

35

40

45

Arg Ala Ser Gin Ser 1 5

lie Gly Thr Asn lie His 10

<210>7 <211>7 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 7

Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser 1 5

<210>8 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 8

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 9 <211> 119 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: polipeptido sintetico <400> 9

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 10 <211> 108 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: polipeptido sintetico

10

<400> 10

5

10

15

20

25

30

35

imagen3

<210> 11 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 11

Gin Val Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser 15 10 15

<210> 12 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 12

Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Val lie Leu Ser Val Ser Pro 15 10 15

<210> 13 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Ser Leu 15 10 15

<210> 14 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 14

Leu Thr Gin Ser Pro Val lie Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg 15 10 15

<210> 15 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 15

Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie Thr 15 10 15

<210> 16 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 16

Ser Pro Val lie Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe 15 10 15

<210> 17 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 17

Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val 15 10 15

<210> 18 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 18 5

lie Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg 15 10 15

<210> 19 <211> 15

10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico 15

<400> 19

Gin Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 15 10 15

20 <210> 20

<211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial 25 <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 20

30

Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin 15 10 15

<210> 21 <211> 15 <212> PRT

35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico 40 <400> 21

Gin Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr 15 10 15

<210> 22 45 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

50 <223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 22

Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 23

Ser lie Thr Cys 1

Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly 5 10 15

<210> 24 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 24

Val Ser Phe Ser 1

Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie 5 10 15

<210> 25 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 25

Cys Thr Val 1

Ser

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp 5 10 15

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

26

15

PRT

Secuencia artificial

Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico 26

Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His Trp Tyr 15 10 15

27

15

PRT

Secuencia artificial

Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico 27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gin 15 10 15

<210> 28 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 28

Ala Ser Gin Ser 1

lie Gly Thr Asn lie His Trp Tyr Gin Gin Arg 5 10 15

<210> 29 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 29

Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly 15 10 15

<210> 30 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 30

Ser lie Gly Thr Asn lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly 15 10 15

<210> 31 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 31

Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu 15 10 15

<210> 32 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 32

Thr Asn lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg 15 10 15

<210> 33 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 33

Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 15 10 15

<210> 34 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 34

His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie 15 10 15

<210> 35 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 35

Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie 15 10 15

<210> 36 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 36

Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala 15 10 15

<210> 37 <211> 15 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 37

Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie Trp Ser Gly 15 10 15

<210> 38 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 38

Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser 15 10 15

<210> 39 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 39

Lys Gly Leu Glu 1

Trp Leu Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr 5 10 15

<210> 40 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 40

Ser Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly 15 10 15

<210> 41 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 41

Glu Trp Leu Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 42 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 42

Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Ser 15 10 15

<210> 43 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 43

Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe 15 10 15

<210> 44 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 44

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser 15 10 15

<210> 45 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 45

Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg 15 10 15

<210> 46 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 46

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 15 10 15

<210> 47 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 47

Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser lie 15 10 15

<210> 48 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 48

lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 15 10 15

<210> 49 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 49

Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp 15 10 15

<210> 50 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 50

lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

<210> 51 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 51

Thr Pro Phe Thr 1

Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys 5 10 15

<210> 52 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 52

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie 15 10 15

<210> 53 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 53

Thr Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val 15 10 15

<210> 54 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 54

Gly Ser Gly Ser Gly 1 5

Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val 10 15

<210> 55 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 55

Leu Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe Lys 15 10 15

<210> 56 <211> 15 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 56

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser 1 5

lie Asn Ser Val Glu Ser Glu 10 15

<210> 57 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 57

Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe Lys Met Asn Ser 15 10 15

<210> 58 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 58

Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp lie Ala 15 10 15

<210> 59 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 59

Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe Lys 1 5

Met Asn Ser Leu Gin Ser 10 15

<210> 60 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 60

Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 61 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 61

Ser Gin Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gin Ser Asn Asp Thr

15 10 15

<210> 62 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 62

Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin 15 10 15

<210> 63 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 63

Phe Phe Lys Met 1

imagen4

<210> 64 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 64

Glu Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn 15 10 15

<210> 65 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 65

Met Asn Ser Leu Gin Ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 15 10 15

<210> 66 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 66

Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr 15 10 15

<210> 67 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 67

Leu Gin Ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu 15 10 15

<210> 68 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 68

Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly 15 10 15

<210> 69 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 69

Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyi 15 10 15

<210> 70 <211> 15 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 70

Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr 15 10 15

<210> 71 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 71

Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu 1 5

Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu 10 15

<210> 72 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 72

Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 15 10 15

<210> 73 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 73

Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 15 10 15

<210> 74 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 74

Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 75 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 75

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 15 10 15

<210> 76 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 76

Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 15 10 15

<210> 77 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 77

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

<210> 78 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 78

Asp lie Leu Leu 1

Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 5 10 15

<210> 79 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 79

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 10 15

<210> 80 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 80

Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 15 10 15

<210> 81 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 81

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 15 10 15

<210> 82 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 82

Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 15 10 15

<210> 83 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 83

Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 15 10 15

<210> 84 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 84

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 15 10 15

<210> 85 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 85

Gin Pro Gly Gly 1

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 5 10 15

<210> 86 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 86

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin 15 10 15

<210> 87 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 87

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr 15 10 15

<210> 88 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 88

Gly Glu Arg Ala 1

Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie 5 10

Gly

15

<210> 89 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 89

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly 15 10 15

<210> 90 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 90

Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie 15 10 15

<210> 91 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 91

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp 15 10 15

<210> 92 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 92

Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His Trp Tyr 15 10 15

<210> 93 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 93

Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gin 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 94 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 94

Ala Ser Gin Ser 1

lie Gly Thr Asn lie His Trp Tyr Gin Gin Lys 5 10 15

<210> 95 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 95

Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro 15 10

Gly

15

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

96

15

PRT

Secuencia artificial

Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico 96

Ser lie Gly Thr Asn lie His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 15 10 15

97

15

PRT

Secuencia artificial

Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico 97

Asn Tyr Gly Val 1

His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 5 10 15

<210> 98 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 98

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Thr Asn lie His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 15 10 15

<210> 99 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 99

Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 15 10 15

<210> 100 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 100

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 15 10 15

<210> 101 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 101

Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie 15 10 15

<210> 102 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 102

Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala 15 10 15

<210> 103 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 103

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie Trp Ser Gly 15 10 15

<210> 104 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 104

Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser 15 10 15

<210> 105 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 105

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr 15 10 15

<210> 106 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 106

Ala Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser 15 10

Gly

15

<210> 107 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 107

Glu Trp Leu Gly Val 1 5

lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn 10 15

<210> 108 <211> 15 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 108

Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Asp 15 10 15

<210> 109 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 109

Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr 1 5

Asp Tyr Asn Thr Pro Phe 10 15

<210> 110 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 110

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 15 10 15

<210> 111 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 111

Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg 15 10 15

<210> 112 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 112

Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 15 10 15

<210> 113

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 113

Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Thr lie 15 10 15

<210> 114 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 114

lie Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 15 10 15

<210> 115 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 115

Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Thr lie Asn Lys Asp 15 10 15

<210> 116 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 116

lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 117

5

10

15

20

25

30

35

40

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50

55

Thr Pro Phe Thr Ser 1 5

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 118

Arg Phe Ser Gly 1

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 5 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 119

Thr Ser Arg Leu Thr lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 120

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu 15 10 15

<210> 121 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 121

Leu Thr lie Asn 1

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin 5 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

5

10

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20

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30

35

40

45

50

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 122

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 123

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<210> 124 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 124

Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 15 10 15

<210> 125 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 125

Asn Ser Lys Asn Thr Val 1 5

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 126

imagen5

5

10

15

20

25

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40

45

50

55

<210> 127 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 127

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 128

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 129

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 130

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn 15 10 15

<210> 131 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 131

5

10

15

20

25

30

35

40

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50

55

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 132

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<210> 133 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 133

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 134

Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly 15 10 15

<210> 135 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 135

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr 15 10 15

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<213> Secuencia artificial

5

10

15

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55

<220>

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 137

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 138

Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 15 10 15

<210> 139 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 139

Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 140

Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 15 10 15

5

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 141

Arg Ala Leu Thr Tyr 1 5

Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 142

Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 143

Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 144

Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 15 10 15

<210> 145 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 145

5

10

15

20

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55

Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 15 10 15

<210> 146 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 146

Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 15 10 15

<210> 147 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 147

Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 148

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<213> Secuencia artificial <220>

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5

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<220>

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<213> Secuencia artificial <220>

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<213> Secuencia artificial <220>

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<210> 153 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

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<213> Secuencia artificial <220>

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 155

Asn Trp Asp Val His 1 5

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 156

imagen6

<210> 157 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 157

Asn Tyr Asp Val His 1 5

<210> 158 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 158

Val lie Trp Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 159 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 159

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Ser Leu Lys Ser 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 160 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 160

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Leu Thr Ser 15 10 15

<210> 161 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 161

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Ser Val Lys Gly 15 10 15

<210> 162 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 162

Tyr lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15

<210> 163 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 163

Val lie Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 164 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 164

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Asp Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Ala Ser 15 10 15

<210> 165 <211 > 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 165

Asn lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 166 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 166

Asn lie Trp Ser Gly Gly Asn Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 167 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 167

Asn lie Trp Ser Gly Gly Thr Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 168 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 168

Val lie Trp Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Ala Ser 15 10 15

<210> 169 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 169

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Ala Ser 15 10 15

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 170

Val lie Trp Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Asn Ser 15 10 15

<210> 171 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 171

Val lie Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 172 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 172

Asn lie Trp Ser Gly Gly Ala Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 173 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 173

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 174

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Glu Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 175 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 175

Val lie Trp Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Glu Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 176 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 176

Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Asn Phe Ala Tyr 15 10

<210> 177 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 177

Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Asp Phe Ala Tyr 15 10

<210> 178 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 178

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Asp Ala Tyr 15 10

<210> 179 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 179

Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Tyr 15 10

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 180

Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 15 10

<210> 181 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 181

Arg Ala Ser Glu Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 182 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 182

Arg Ala Ser Phe Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 183 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Arg Ala Ser Tyr Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 184 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 184

Arg Ala Ser His Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 185 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 185

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn Leu His 15 10

<210> 186 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 186

Arg Ala Asp Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 187 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 187

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Glu Asn lie His 15 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 188 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 188

Arg Ala Asp Gin Ser lie Gly Glu Asn lie His 15 10

<210> 189 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 189

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Leu Thr 1 5

<210> 190 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 190

Gin Gin Asn Asn Asp Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 191 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 191

Gin Gin Asn Asn Glu Trp Pro Thr Thr

1 5

<210> 192 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 192

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Ser 1 5

<210> 193 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 193

Gin Gin Asn Asn Asp Trp Pro Thr Ser 1 5

<210> 194 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 194

Gin Gin Asn Asn Glu Trp Pro Thr Ser 1 5

<210> 195 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 195

Gin Gin Asn Asn Lys Trp Pro Thr Ser 1 5

<210> 196 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 196

His Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 197 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Gin Gin Asn Asn Ala Trp Pro Thr Thr 1 5

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 198

Ala Leu Thr Tyr 1

Tyr Cys Tyr Glu Phe Ala Tyr 5 10

<210> 199 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 199

Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Cys Tyr 15 10

<210> 200 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 200

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie Cys 15 10

<210> 201 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 201

Val Tyr Gly Val His 1 5

<210> 202 <211>5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 202

Asn Arg Gly Val His 1 5

<210> 203 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 203

Asn Tyr Gly Leu His 1 5

<210> 204 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 204

Asn Tyr Gly Asn His 1 5

<210> 205 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 205

Leu lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 206 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 206

Gin lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 207

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<210> 208 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 208

Val Met Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 209 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 209

Val Ser Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe 15 10

Thr Ser 15

<210> 210 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 210

Val Gin Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 211 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 211

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 212 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 212

Val lie Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 213 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 213

Val lie Trp Gin Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 214 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 214

Val lie Trp Thr Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 215 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 215

Val lie Trp Ser Gly Asp Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 216 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 216

Val lie Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 217 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 217

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Ala Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 218 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 218

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Asp Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 219 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 219

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Gly Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 220 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 220

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Ser Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 221 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 221

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Ala Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 222 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 222

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Cys Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 223 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 223

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Glu Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 224 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 224

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Phe Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 225 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 225

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 226 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 226

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Ser Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 227 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 227

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Trp Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 228 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 228

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asp Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 229 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 229

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Glu Ser 15 10 15

<210> 230 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 230

Ala Leu Thr Trp Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 15 10

<210> 231 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 231

Arg Val Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 232 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes.

<400> 232

Arg Ser Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 233 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 233

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 234 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 234

Gin Gin Leu Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 235 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 235

Gin Gin Asn Leu Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 236 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 236

Gin Gin Asn Arg Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 237 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 237

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Ala 1 5

<210> 238 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 238

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Asp 1 5

<210> 239 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 239

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Glu 1 5

<210> 240 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 240

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Pro 1 5

<210> 241 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 241

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp His Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 242 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 242

Pro Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 243 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes.

<400> 243

Arg Cys Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 244 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 244

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 245 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 245

Arg Met Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 246 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 246

Arg Leu Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 247 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 247

Arg Ala Ser Trp Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 248 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<400> 248

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Arg Ala Ser Gin Arg lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 249 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 249

Arg Ala Ser Gin Ser lie Trp Thr Asn lie His 15 10

<210> 250 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 250

Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Thr Asn lie His 15 10

<210> 251 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 251

Arg Ala Ser Gin Ser lie Thr Thr Asn lie His 15 10

<210> 252 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 252

Arg Ala Ser Gin Ser lie Met Thr Asn lie His 15 10

<210> 253 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 253

Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Thr Asn lie His 15 10

<210> 254 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 254

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Val Asn lie His 15 10

<210> 255 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 255

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 256 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 256

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr His lie His 15 10

<210> 257 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 257

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr lie 1 5

<210> 258 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 258

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Gly 1 5

<210> 259 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 259

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Leu 1 5

<210> 260 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 260

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr His 1 5

<210> 261 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 261

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Arg 1 5

<210> 262 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 262

Asp Tyr Gly Val His 1 5

<210> 263 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 263

lie Tyr Gly Val His 1 5

<210> 264 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 264

Asn Tyr Gly Glu His 1 5

<210> 265 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 265

Asn Tyr Gly Gin His 1 5

<210> 266 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 266

Glu lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 267

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 267

lie lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 268 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 268

Val Ala Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 269 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 269

Val Cys Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 270 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<400> 270

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Val lie Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 271 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 271

Val lie Trp Ser Gly Ala Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 272 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 272

Val lie Trp Ser Gly Glu Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 273 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 273

Val lie Trp Ser Gly His Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 274 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 274

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Glu Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 275 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 275

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Pro Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 276 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 276

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Gin Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 277 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 277

Arg lie Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 278 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 278

Arg Pro Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 279 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 279

Arg Thr Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 280 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 280

Arg Tyr Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 281 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 281

Arg Ala Ser Gin Ser lie Cys Thr Asn lie His 15 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 282 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 282

Arg Ala Ser Gin Ser lie His Thr Asn lie His 15 10

<210> 283 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 283

Arg Ala Ser Gin Ser lie Lys Thr Asn lie His 15 10

<210> 284 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 284

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gin Thr Asn lie His 15 10

<210> 285 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Thr Asn 1 5

lie His 10

<210> 286 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 286

Gin Gin Asn Lys Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 287 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 287

Gin Gin Asn Met Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 288 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 288

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Cys 1 5

<210> 289 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 289

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Lys 1 5

<210> 290 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 290

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Asn 1 5

<210> 291 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 291

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Gin 1 5

<210> 292 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 292

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Val Thr Ser 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 293 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 293

Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Tyr Ala Tyr 15 10

<210> 294 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 294

Asn Trp Gly Val His 1 5

<210> 295 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 295

Asn Tyr Ala Val His 1 5

<210> 296 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Asn Tyr Asp Val His 1 5

<210> 297 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 297

Asn Tyr Glu Val His 1 5

<210> 298 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 298

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 299 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 299

Val lie Trp Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 300 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 300

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Glu Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 301 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 301

Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 15 10

<210> 302 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 302

Arg Ala Ser Glu Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 303 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 303

Arg Ala Ser Phe Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 304 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 304

Arg Ala Ser Tyr Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 305 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 305

Arg Ala Asp Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 306 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 306

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Glu Asn lie His 15 10

<210> 307 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Leu Thr 1 5

<210> 308 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 308

Gin Gin Asn Asn Asp Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 309 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 309

Gin Gin Asn Asn Glu Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 310 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes.

<400> 310

Gin Gin Asn Asn Ala Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 311 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 311

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Ser 1 5

<210> 312 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <220>

<223> vease la memoria descriptiva presentada para una descripcion detallada de las sustituciones y realizaciones preferentes

<400> 312

Ala Leu Thr Trp Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 15 10

<210> 313 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 313

Arg Val Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 314 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 314

Arg Ser Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 315 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Thr Asn lie His 15 10

<210> 316 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 316

Gin Gin Leu Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 317 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 317

Gin Gin Asn Leu Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 318 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 318

Gin Gin Asn Arg Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 319 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 319

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Ala 1 5

<210> 320 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 320

<210> 321 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Asp 1 5

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 321

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Glu 1 5

<210> 322 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 322

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp His Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 323 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 323

Pro Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 324 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 324

Arg Cys Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 325

Arg Phe Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 326 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 326

Arg Met Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 327 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 327

Arg Leu Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 328 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 328

Arg Ala Ser Trp Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 329 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 329

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Arg Ala Ser Gin Arg lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 330 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 330

Arg Ala Ser Gin Ser lie Trp Thr Asn lie His 15 10

<210> 331 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 331

Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Thr Asn lie His 15 10

<210> 332 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 332

Arg Ala Ser Gin Ser lie Thr Thr Asn lie His 15 10

<210> 333 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 333

Arg Ala Ser Gin Ser lie Met Thr Asn lie His 15 10

<210> 334 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 334

Arg Ala Ser Gin Ser lie 1 5

Ser Thr Asn lie His 10

<210> 335 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 335

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Val Asn lie His 15 10

<210> 336 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 336

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Glu Asn lie His 15 10

<210> 337 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 337

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr His lie His 15 10

<210> 338 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 338

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr lie 1 5

<210> 339 <211>9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 339

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Gly 1 5

<210> 340 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 340

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Leu 1 5

<210> 341 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 341

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr His 1 5

<210> 342 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 342

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Arg 1 5

<210> 343 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 343

Asp Tyr Gly Val His 1 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 344 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 344

lie Tyr Gly Val His 1 5

<210> 345 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 345

Thr Tyr Gly Val His 1 5

<210> 346 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 346

Asn Tyr Gly Glu His 1 5

<210> 347 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 347

Asn Tyr Gly Gin His 1 5

<210> 348 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 348

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Glu lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 349 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 349

lie lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 350 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 350

Val Ala Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 351 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 351

Val Cys Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 352 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 352

Val lie Trp Asn Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 353 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 353

imagen7

<210> 354 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 354

Val lie Trp Ser Gly Glu Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 355 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 355

Val lie Trp Ser Gly His Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 356 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 356

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Glu Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 357 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 357

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Pro Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 358 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 358

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Gin Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 359 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 359

Arg lie Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 360 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 360

Arg Pro Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 361 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 361

Arg Thr Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 362 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 362

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 363 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 363

Arg Ala Ser Gin Ser lie Cys Thr Asn lie His 15 10

<210> 364 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 364

Arg Ala Ser Gin Ser lie His Thr Asn lie His 15 10

<210> 365 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 365

Arg Ala Ser Gin Ser lie Lys Thr Asn lie His 15 10

<210> 366 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 366

Arg Ala Ser Gin Ser lie Gin Thr Asn lie His 15 10

<210> 367 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 367

Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Thr Asn lie His 15 10

<210> 368 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 368

Gin Gin Asn Lys Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 369 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 369

Gin Gin Asn Met Asn Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 370 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 370

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Cys 1 5

<210> 371 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 371

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Lys 1 5

<210> 372 <211>9 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 372

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Asn 1 5

<210> 373 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 373

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Gin 1 5

<210> 374 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 374

Asn Tyr Gly Ser His 1 5

<210> 375 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 375

Val Val Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 376 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 376

Val lie Trp Ser Gly Phe Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 377 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 377

Val lie Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 378 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 378

Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Thr Pro Phe Thr Ser 15 10 15

<210> 379 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 379

Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Phe 15 10

<210> 380 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 380

Arg Trp Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn lie His 15 10

<210> 381 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 381

<210> 382 <211> 11

5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

10

<400> 382

Arg Ala Ser Gin 1

Phe lie Gly Thr Asn lie His 5 10

15 <210> 383

<211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial 20 <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 383

25

30

35

Arg Ala Ser Gin Ser lie Ala Thr Asn 1 5

lie His 10

<210> 384 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico <400> 384

Arg Ala Ser Gin 1

Ser lie Gly Arg Asn lie His 5 10

<210> 385 40 <211>7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

45 <223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 385

Tyr Ala Ser Glu Val lie Ser 1 5

50

<210> 386 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial 55

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 386 5

Gin Gin Asn Asn Val Trp Pro Thr Thr 1 5

<210> 387 <211>9

10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico 15

<400> 387

Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr Arg 1 5

20

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Un anticuerpo anti - EGFR o un fragmento de union a anti - EGFR de un anticuerpo que:

   (a) comprende una secuencia Vh correspondiente a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia Vl correspondiente a la SEQ ID NO: 10 o una secuencia Vh correspondiente a la SEQ ID NO: 1 y una secuencia Vl correspondiente a SEQ ID NO: 2; y

   (b) tiene las siguientes sustituciones: G30Y in CDR-L1, o la combinacion de sustituciones 151G en CDR-H2, Y98W en CDR-H3, G30Y en CDR-L1 y N92L en CDR-L3, en donde la numeracion de los residuos de aminoacidos de inmunoglobulina se realiza de acuerdo con el sistema de numeracion de residuos de aminoacidos de inmunoglobulinas de Kabat et al.
2. 2. El anticuerpo anti-EGFR o fragmento de union a anti-EGFR de la reivindicacion 1, que es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union a anti-EGFR de un anticuerpo monoclonal, respectivamente.
3. 3. El anticuerpo anti-EGFR o fragmento de union a anti-EGFR de la reivindicacion 1, que es una IgG, preferentemente una IgG1 o una IgG2.
4. 4. El anticuerpo anti-EGFR o fragmentos de union a anti-EGFR de la reivindicacion 1, que no esta fucosilado.
5. 5. El anticuerpo anti-EGFR o fragmento de union anti-EGFR de la reivindicacion 1 que se purifica, preferentemente se purifica hasta al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de homogeneidad.
6. 6. El anticuerpo de anti-EGFR o fragmento de union anti-EGFR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que incluye una o mas mutaciones en la region Fc que aumentan la actividad de ADCC.
7. 7. El anticuerpo de anti-EGFR o fragmento de union anti-EGFR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que incluye una o mas mutaciones en la region Fc que aumentan la union a FcyR.
8. 8. El anticuerpo de anti-EGFR o fragmento de union anti-EGFR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que incluye una o mas mutaciones en la region Fc que aumentan la union a FcRn.
9. 9. El anticuerpo de anti-EGFR o fragmento de union anti-EGFR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que incluye una o mas mutaciones en la region Fc que disminuyen la actividad de ADCC.
10. 10. Un conjugado anticuerpo-farmaco que comprende un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de union a anti-EGFR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de union a anti - EGFR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un conjugado anticuerpo - farmaco segun la reivindicacion 10, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
12. 12. Un acido nucleico que comprende una o mas secuencias de nucleotidos que codifican un anticuerpo anti - EGFR o fragmento de union a anti - EGFR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. 13. Un vector que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 12.
14. 14. Una celula huesped procariota transfectada con un vector de acuerdo con la reivindicacion 13.
15. 15. Una celula huesped eucariota transformada con un vector de acuerdo con la reivindicacion 13.
16. 16. Una celula huesped eucariotica cultivada modificada geneticamente para expresar una o mas secuencias de nucleotidos que codifican un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de union a anti-EGFR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, preferentemente donde dicha celula huesped eucariotica cultivada es una celula huesped de mairnfero.
17. 17. Un procedimiento para producir un anticuerpo anti - EGFR o fragmento de union anti - EGFR que comprende recuperar el anticuerpo anti - EGFR o el anticuerpo de fragmento de union anti - EGFR de la celula huesped eucariotica cultivada de las reivindicaciones 15 o 16.
18. 18. Un anticuerpo anti - EGFR o un fragmento de union a anti - EGFR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un conjugado anticuerpo - farmaco segun la reivindicacion 10, o una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 11 para su uso en una cantidad terapeuticamente eficaz en el tratamiento del cancer en un humano.
19. 19. Un anticuerpo anti-EGFR, un fragmento de union a anti-EGFR, un conjugado anticuerpo-farmaco o composicion

    farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 18, donde el cancer es carcinoma de celulas escamosas de la cabeza y el cuello, o cancer colorrectal.