ES2656446T3 - Anticuerpos anti-VEGF y sus usos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de unión anti-VEGF de un anticuerpo que comprende seis CDR que tienen una o más sustituciones de aminoácidos o combinaciones de sustituciones de aminoácidos en comparación con un anticuerpo anti-VEGF de referencia o un fragmento de unión a antígeno anti-VEGF de referencia que tiene CDR que tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a la SEQ ID NO: 3 (CDR-H1), la SEQ ID NO: 4 (CDR-H2), la SEQ ID NO: 5 (CDR-H3), la SEQ ID NO: 6 (CDR-L1), la SEQ ID NO: 7 (CDR-L2) y la SEQ ID NO: 8 (CDR L3), en el que dichas una o más sustituciones de aminoácidos o combinaciones de sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre: (i) la sustitución de CDR-H2 K64S; (ii) la sustitución de CDR-H2 K64Q; (iii) las sustituciones de CDR-H2 Y53F y K64Q; (iv) las sustituciones de CDR-H2 Y53F y K64S; (v) la sustitución de CDR-H3 H97E; (vi) la sustitución de CDR-H3 Y98F; (vii) las sustituciones de CDR-H3 H97E y Y98F; (viii) las sustituciones de CDR-H3 H97P y Y98F; y opcionalmente la sustitución de CDR-L2 T51A, en el que las sustituciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-VEGF y sus usos

2. Campo de la invención 5

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-VEGF, composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-VEGF, y los usos terapéuticos de tales anticuerpos.

3. Antecedentes 10

La angiogénesis ha surgido como una diana terapéutica atractiva debido a su implicación en una variedad de afecciones patológicas, que incluyen el crecimiento tumoral, las retinopatías proliferativas, la degeneración macular relacionada con la edad, la artritis reumatoide (RA), y psoriasis (Folkman et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-10934). La primera indicación de factores angiogénicos moleculares específicos se basaba en la observación de la 15 fuerte respuesta neovascular que inducían los tumores trasplantados. Se sabe ahora que la angiogénesis es esencial para el crecimiento de la mayoría de los tumores primarios y su metástasis posterior. Ya se han asociado numerosas moléculas con la regulación positiva de la angiogénesis, que incluyen al factor de crecimiento transformante (TGF)- α, TGF-β, factor de crecimiento del hepatocito (HGF), factor de necrosis tumoral-α, angiogenina, interleucina (IL)-8, y factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF, también llamado VEGFA o factor 20 de permeabilidad vascular (VPF)) (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676).

Las proteínas VEGF son importantes proteínas de señalización implicadas tanto en la vasculogénesis embrionaria normal (la formación de novo del sistema circulatorio embrionario) como la angiogénesis anormal (el crecimiento de vasos sanguíneos a partir de un sistema vascular pre-existente) (Ferrara et al., 1996, Nature 380:439-442; Dvorak et 25 al., 1995, Am. J. Pathol. 146:1029-1039).El VEGF se asocia con tumores sólidos y enfermedades malignas hematológicas, síndromes neovasculares intraoculares, inflamación y edema cerebral, y patologías del tracto reproductor femenino (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676). El ARNm VEGF está sobre-expresado en muchos tumores humanos, incluyendo los de pulmón, mama, tracto gastrointestinal, riñón, páncreas y ovario (Berkman et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:153-159). Los aumentos de VEGF en el humor acuoso y vítreo de los ojos 30 se han asociado con varias retinopatías (Aiello et al., 1994, N. Engl. J. Med. 331:1480-1487). La degeneración macular relacionada con la edad (AMD), una de las principales causas de pérdida de visión en la vejez se debe a la neovascularización y permeabilidad vascular. Se ha demostrado la localización del VEGF en las membranas coroideas neovasculares en pacientes afectados con AMD (López et al., 1996; Invest. Ophtalmo.Vis. Sci. 37:855-868). 35

La familia del gen VEGF incluye el miembro VEGFA prototípico, así como VEGFB, VEGFC, VEGFD y el factor de crecimiento placentario (PLGF). El gen VEGFA humano se organiza como ocho exones separados por siete intrones. Al menos existen seis isoformas diferentes de VEGF, VEGF121, VEGF145, VEGF162, VEGF165, VEGF165b, VEGF183, VEGF189, y VEGF206, donde los subíndices se refieren al número de aminoácidos que permanecen tras la 40 escisión de señal. El VEGF nativo es una glucoproteína homodimérica de unión a la heparina de 45 kDa (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676). El VEGF (específicamente el VEGFA) se une a dos receptores de la tirosina quinasa relacionados, el VEGFR-1 (también llamado Flt-1) y VEGFR-2 (también llamado Flk-1 o región del dominio quinasa (KDR) o CD309). Cada receptor tiene siete regiones extracelulares y una transmembrana. El VEGF también se une a las neuropilinas NRP1 (también llamada receptor del factor de crecimiento celular vascular endotelial 165 45 (VEGF165R o CD304) y NRP2 también llamada receptor 2 del factor de crecimiento celular vascular endotelial 165 (VEGF165R2)).

Dado su papel central en la regulación de la angiogénesis, el VEGF proporciona una diana atractiva para la intervención terapéutica. Además, se están desarrollando actualmente una variedad de estrategias terapéuticas con 50 el fin de bloquear al VEGF o su sistema de señalización del receptor, para el tratamiento de enfermedades neoplásicas. El anticuerpo anti-VEGF bevacizumab, también llamado rhuMab VEGF o Avastin®, es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF recombinante humanizado creado y comercializado por Genentech (Presta et al., 1997, Cancer Res. 57:4593-4599). Con el fin de construir el bevacizumab las regiones determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-VEGF murino A.4.6. 1 se injerta en armazones humanos 55 y una región constante de IgG. Se introdujeron entonces mutaciones adicionales fuera de las CDR en la molécula para mejorar la unión, consiguiendo un anticuerpo en el que ∼ 93% de la secuencia de aminoácidos se deriva de la IgG1 humana y ∼ 7% de la secuencia se deriva del anticuerpo murino A.4.6.1. El bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149.000 Daltons y está glucosilado.

60

El Ranibizumab es un fragmento Fab madurado por afinidad derivado del bevacizumab. El ranibizumab tiene una mayor afinidad por VEGF y también es de menor tamaño, lo que le permite penetrar mejor en la retina, y por lo tanto tratar la neovascularización ocular asociada con la AMD (Lien y Lowman, en: Chernajovsky, 2008, Therapeutic Antibodies. Handbook de Experimental Pharmacology 181, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 131-150). El ranibizumab se desarrolló y comercializó por Genentech bajo la marca registrada Lucentis®. 65

El tratamiento de pacientes de cáncer con un régimen que incluye el Avastin® puede dar como resultado efectos secundarios que incluyen hipertensión, proteinuria, acontecimientos tromboembólicos, hemorragia y toxicidad cardíaca (Blowers & Hall, 2009, Br. J. Nurs. 18(6):351-6, 358). También, a pesar de ser un anticuerpo humanizado, el bevacizumab puede producir una respuesta inmunitaria cuando se administra a seres humanos. Tal respuesta inmunitaria puede dar como resultado un aclaramiento mediado por complejos inmunitarios de los anticuerpos o 5 fragmentos de la circulación, y hacer que su administración repetida sea inadecuada para la terapia, reduciendo de esta manera el beneficio terapéutico para el paciente y limitar la re-administración del anticuerpo.

En consecuencia, existe la necesidad de que se proporcionen anticuerpos anti-VEGF mejorados o fragmentos que superen uno o más de estos problemas, por ejemplo, generando variantes con una afinidad mayor que el 10 bevacizumab que pueda administrarse a dosis reducidas, o variantes con inmunogenicidad y otros efectos secundarios reducidos en comparación con el bevacizumab.

La cita o identificación de cualquier referencia de la Sección 3 o de cualquier otra sección de esta solicitud no se debería tomar como una admisión de que tal referencia está disponible como técnica precedente a la presente 15 divulgación. El documento US 2002/032315 describe anticuerpos anti-VEGF y formas variantes de los mismos.

4. Sumario

La presente divulgación se refiere a variantes del anticuerpo anti-VEGF bevacizumab con inmunogenicidad reducida 20 y afinidad mejorada para el VEGF en comparación con bevacizumab o ranibizumab. El bevacizumab tiene tres CDR de cadena pesada, denominadas en el presente documento (ordenadas del extremo amino- carboxilo) CDR-H1, CDR-H2, y CDR-H3, y tres CDR de cadena ligera, denominadas en el presente documento (ordenadas del extremo amino-carboxilo) CDR-L1, CDR-L2 , y CDR-L3. Las secuencias de las CDR del bevacizumab se muestran en las Figuras 1A y 1B, y su numeración se expone en la Tabla 1 (para las CDR de la cadena pesada) y en la Tabla 2 (para 25 las CDR de la cadena ligera). Se generó un anticuerpo relacionado, el ranibizumab, por maduración de afinidad del bevacizumab. El ranibizumab tiene secuencias CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H2 idénticas al bevacizumab, pero varía en sus secuencias CDR-H1 y CDR-H3 de las del bevacizumab. Las secuencias de cadena pesada y cadena ligera del ranibizumab se muestran en la Figura 1C, y las CDR se exponen en la Figura 1D.

30

Por tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de unión anti-VEGF de un anticuerpo que comprende seis CDR que tienen una o más sustituciones de aminoácidos o combinaciones de sustituciones de aminoácidos en comparación con un anticuerpo anti-VEGF de referencia o un fragmento de unión a antígeno anti-VEGF de referencia que tiene CDR que tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a la SEQ ID NO: 3 (CDR-H1), la SEQ ID NO: 4 (CDR-H2), la SEQ ID NO: 5 (CDR-H3), la SEQ ID 35 NO: 6 (CDR-L1), la SEQ ID NO: 7 (CDR-L2) y la SEQ ID NO: 8 (CDR L3), en el que dichas una o más sustituciones de aminoácidos o combinaciones de sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre:

(i) la sustitución de CDR-H2 K64S;

(ii) la sustitución de CDR-H2 K64Q;

(iii) las sustituciones de CDR-H2 Y53F y K64Q; 40

(iv) las sustituciones de CDR-H2 Y53F y K64S;

(v) la sustitución de CDR-H3 H97E;

(vi) la sustitución de CDR-H3 Y98F;

(vii) las sustituciones de CDR-H3 H97E y Y98F;

(viii) las sustituciones de CDR-H3 H97P y Y98F; 45

y opcionalmente la sustitución de CDR-L2 T51A,

en el que las sustituciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat

Los anticuerpos de la divulgación generalmente tienen al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una CDR de cadena pesada en comparación con el bevacizumab y ranibizumab. 50

En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen al menos una sustitución en comparación con bevacizumab o ranibizumab que se selecciona de entre, N31F en CDR-H1; K64S en CDR-H2; K64Q en CDR-H2; Y53F en CDR-H2; H97E en CDR-H3; H97D en CDR-H3; H97P en CDR-H3; Y98F en CDR-H3; Y99E en CDR-H3; Y99D en CDR-H3; S100aG en CDR-H3, y T51A en CDR-L2. En otros aspectos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen al menos una 55 sustitución que se selecciona de las Tablas 8 y 9. Las mutaciones adicionales que se pueden incorporar en las variantes de anticuerpo con afinidad mejorada pueden ser candidatas a sustituciones desinmunizantes, tales como las que se describen en la Tabla 6, así como otras mutaciones, por ejemplo, sustituciones que no eliminan la capacidad de los anticuerpos para unirse a VEGF, incluyendo pero sin limitarse a las mutaciones descritas en las Tablas 10 y 11, o mutaciones conocidas, tales como las mutaciones descritas en las Tablas 12-1 a 12-9 y 13. Se 60 pueden incorporar más mutaciones aún que incluyen pero sin límite, las mutaciones descritas en las Tablas 14-16.

En realizaciones específicas, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación incluyen una combinación de sustituciones que se seleccionan de la Tabla 7, y opcionalmente una o más mutaciones adicionales, por ejemplo, sustituciones candidatas a desinmunizantes, tales como las que se describen en la Tabla 6, así como otras mutaciones, por 65 ejemplo, sustituciones, que no eliminen la capacidad de los anticuerpos para unirse a VEGF, incluyendo pero sin limitarse a las mutaciones descritas en las Tablas 10 y 11, o mutaciones conocidas tales como las mutaciones descritas en las Tablas 12-1 a 12-9 y 13. Aún más mutaciones que se pueden incorporar en los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación incluyen pero no se limitan a las mutaciones descritas en las Tablas 14-16.

En otras realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación incluyen una o más de las siguientes 5 sustituciones de CDR: K64S (CDR-H2), K64Q (CDR-H2), Y53F y K64Q (CDR-H2), H97E y Y98F (CDR-H3), o T51A (CDRL2). Los anticuerpos anti-VEGF también pueden opcionalmente incluir una o más mutaciones adicionales o combinaciones de mutaciones seleccionadas de una o más de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 12-9, o 13-16.

Más sustituciones de CDR pueden incluir N31F (CDR-H1), H97E (CDR-H3), H97D (CDR-H3), H97P (CDR-H3), 10 Y99E (CDR-H3), Y99D (CDR-H3), S100aG (CDR-H3) donde la posición 3 en la CDR-H3 opcionalmente no es tirosina, T28P, N31F, N31G y N31M (CDR-H1), H97A, H97Q, H97S, H97T, S100aD, S100aE, y S100Av (CDR-H3), T30W, T30R o T30Q (CDR-H1), Y53F, T58F, A61G, A61K, A61R, A61H, A61Y, K64G, K64E, R65L, R65T, R65A, R65E, y R65D (CDR-H2), y Y98F y Y100eF (CDR-H3). Las CDR contienen opcionalmente una o más mutaciones adicionales o combinaciones de mutaciones que se seleccionan de una o más de las tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 15 12-9 y 13.

Aún más sustituciones pueden incluir sustituciones de CDR de cadena pesada que incluyen una combinación de sustituciones que se seleccionan de entre: (a) N31F en CDR-H1, H97D en CDR-H3, Y99D en CDR-H3, y S100aG en CDR-H3; (b) N31F en CDRH1, H97P en CDR-H3, Y99D en CDR-H3, y S100aG en CDR-H3; (c) N31F en CDR-20 H1, H97P en CDR-H3, y Y99E en CDR-H3; (d) N31F en CDR-H1, H97E en CDR-H3, y Y99E en CDR-H3; (e) N31F en CDR-H1, H97D en CDR-H3, y Y99E en CDR-H3; (f) N31F en CDR-H1, H97E en CDR-H3, Y99D en CDR-H3, y S100aG en CDR-H3; (g) N31F en CDRH 1, Y99D en CDR-H3, y S100aG en CDR-H3; (h) N31F en CDR-H1, H97P en CDR-H3, y Y99D en CDR-H3; (i) N31F en CDR-H 1, H97D en CDR-H3, y S100aG en CDR-H3; (j) N31F en CDR-H1 y S100aG en CDR-H3; o (k) N31F en CDR-H 1, H97P en CDR-H3, y S100aG en CDR-H3. Más sustituciones 25 opcionales pueden incluir una o más mutaciones o combinaciones de mutaciones que se seleccionan de entre una o más de las tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 12-9 y 13.

Aún más sustituciones de la cadena pesada pueden incluir al menos una sustitución que se selecciona de entre A61F en CDR-H2, A61E en CDR-H2, A61D en CDR-H2, D62L en CDR-H2, D62G en CDR-H2, D62Q en CDR-H2, 30 D62T en CDR-H2, D62K en CDR-H2, D62R en CDR-H2, D62E en CDR-H2, D62H en CDR-H2, K64S en CDR-H2, K64V en CDR-H2, K64Q en CDRH2, R65V en CDR-H2, R65F en CDR-H2, R65H en CDR-H2, R65N en CDR-H2, R65S en CDR-H2, R65Q en CDR-H2, R65K en CDR-H2, R65I en CDR-H2, y Y98H en CDR-H3. Opcionalmente se pueden incluir una o más mutaciones adicionales o combinaciones de mutaciones como las que se seleccionan de entre una o más de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 12-9 y 13. 35

En ciertos aspectos, los anticuerpos de la divulgación tienen secuencias VH y VL que tienen al menos una identidad de secuencia del 80% (y en ciertas realizaciones, una identidad de secuencia de al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, o al menos el 99%) con las secuencias VH y VL del bevacizumab o ranibizumab, e incluyen al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una CDR en comparación con el bevacizumab o el 40 ranibizumab. En otros aspectos, los anticuerpos de la divulgación tienen secuencias VH y VL que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80% (y en ciertas realizaciones, una identidad de secuencia de al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, o al menos el 99%) con las secuencias de VH y VL del bevacizumab o ranibizumab, e incluyen al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una región marco conservada en comparación con el bevacizumab o el ranibizumab. En realizaciones específicas, el porcentaje de 45 identidad de secuencia de la cadena pesada y la cadena ligera en comparación con las secuencias VH y VL del bevacizumab o ranibizumab se selecciona independientemente de una identidad de secuencia de al menos el 80% al menos el 85, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, o una identidad de secuencia de al menos el 99%. En ciertos aspectos, los anticuerpos de la divulgación tienen secuencias de VH y/o VL que tienen una identidad de secuencia de al menos el 95%, al menos el 98%, o al menos el 99% con las secuencias VH y/o VL del 50 bevacizumab o el ranibizumab.

Los anticuerpos de la divulgación tienen hasta 17 sustituciones de aminoácidos en sus CDR en comparación con el bevacizumab o ranibizumab. Las variantes de anticuerpo con 17 sustituciones que mantienen su capacidad de unión a la diana se han generado por Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-14. 55

Un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación tiene, independientemente:

• Hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho, hasta nueve o hasta diez sustituciones en CDR-H1 en comparación con la CDR correspondiente del bevacizumab o del 60 ranibizumab;

• Hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho, hasta nueve, hasta diez, hasta once, hasta doce, hasta trece, hasta catorce, hasta quince, hasta dieciséis, o hasta diecisiete sustituciones CDR-H2 en comparación con la CDR correspondiente del bevacizumab o del ranibizumab; 65

• Hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho, hasta nueve, hasta diez, hasta once, hasta doce, hasta trece, o hasta catorce sustituciones de CDR-H3 en comparación con la CDR correspondiente del bevacizumab o del ranibizumab;

• Hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho, hasta nueve, hasta diez o hasta once sustituciones en CDR-L1 en comparación con la CDR correspondiente del bevacizumab o del ranibizumab; 5

• Hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis o hasta siete sustituciones en CDR-L2 en comparación con la CDR correspondiente del bevacizumab o del ranibizumab; y

• Hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho o hasta nueve sustituciones en CDR-L3 en comparación con la CDR correspondiente del bevacizumab o del ranibizumab.

10

La presente divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-VEGF modificados. En algunos anticuerpos, las composiciones farmacéuticas tienen un aumento de afinidad por VEGF y/o una reducción de la inmunogenicidad al compararse con el bevacizumab o el ranibizumab.

Se proporcionan en el presente documento los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que 15 codifican los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación, así como los vectores que comprenden los ácidos nucleicos. Adicionalmente, se proporcionan en el presente documento las células huésped procariotas y eucariotas transformadas con un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-VEGF, así como las células huésped eucariotas (tales como las de mamífero) modificadas para expresar las secuencias de nucleótidos. También se proporcionan los métodos para producir anticuerpos anti-VEGF cultivando las células 20 huésped.

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación son útiles para el tratamiento de cánceres (por ejemplo, carcinoma de colon, carcinoma rectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y cáncer de mama), enfermedades retinianas (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (“AMD”)), y trastornos inmunitarios (por ejemplo, artritis 25 reumatoide).

En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación se pueden utilizar en dosificaciones reducidas en comparación con el bevacizumab o ranibizumab, por ejemplo dosificaciones menores al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% 30 o al menos un 90%.

Se debería señalar que los artículos indefinidos “un” y “una” y los artículos definidos “el/la” se utilizan en la presente solicitud, como es común en las solicitudes de patente, significan uno o más a menos de que el contexto dicte claramente otra cosa. Además, el término “o” que se utiliza en la presente solicitud, como es común en las 35 solicitudes de patente, significa la conjunción disyuntiva “o” o la copulativa “y”.

Cualquier exposición de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos y similares que se han incluido en la presente memoria descriptiva solamente tiene el propósito de proporcionar un contexto para la presente divulgación. No son para que se consideren como una admisión de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la 40 base técnica anterior o eran de conocimiento común general en el campo relevante de la presente divulgación como que existieran en algún sitio antes de la fecha de prioridad de esta solicitud.

Las características y ventajas de la divulgación serán más aparentes tras la siguiente descripción detallada de las realizaciones de la misma. 45

Breve descripción de las Tablas y Figuras

La Tabla 1 muestra la numeración de los aminoácidos de las CDR de cadena pesada de bevacizumab. Las CDR 1-3 se desvelan como las SEC ID Nos 3-5, respectivamente. 50

La Tabla 2 muestra la numeración de los aminoácidos de las CDR de cadena ligera de bevacizumab. Las CDR 1-3 se desvelan como las SEC ID Nos 6-8, respectivamente.

La Tabla 3 muestra los péptidos VL del bevacizumab que se ensayaron en cuanto a inmunogenicidad. 55

La Tabla 4 muestra los péptidos VH del bevacizumab que se ensayaron en cuanto a inmunogenicidad.

La Tabla 5 muestra las regiones de epítopo de células T CD4+ en el bevacizumab. Las regiones CDR están subrayadas. 60

La Tabla 6 muestra las mutaciones candidatas en CDR-H2 y CDR-H3 para disminuir la inmunogenicidad del bevacizumab. La numeración de los aminoácidos de la Tabla 6 corresponden a la numeración de Kabat en la cadena pesada de bevacizumab.

65

La Tabla 7 muestra las sustituciones de aminoácidos de CDR de la cadena pesada en el bevacizumab que dan como resultado una KD mejorada según se analizó por resonancia de plasmones superficiales. ∆Kon se refiere a las veces de mejoría en kon (mutante/TpoSil.). ∆koff se refiere a las veces de mejoría en koff (TpoSil./mutante). ∆KD se refiere a la mejoría en la KD en el mutante con respecto al tipo silvestre. La numeración de los aminoácidos de la Tabla 7 corresponden con la numeración de Kabat en la cadena pesada del bevacizumab. 5

La Tabla 8 muestras mutaciones en las CDR de cadena pesada que los estudios de unión preliminares indicaban un aumento de la afinidad para VEGF (datos no mostrados). La numeración de los aminoácidos en la Tabla 8 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena pesada del bevacizumab.

10

La Tabla 9 muestra las mutaciones en las CDR de cadena pesada del bevacizumab que los estudios preliminares indicaban un aumento de afinidad para VEGF (datos no mostrados). La numeración de los aminoácidos de la Tabla 9 corresponden a la numeración de Kabat en la cadena pesada del bevacizumab.

La Tabla 10 muestra las mutaciones en las CDR de cadena pesada del bevacizumab que no tienen un impacto en la 15 unión y que se pueden incorporar a los anticuerpos de la divulgación. La numeración de los aminoácidos de la Tabla 10 corresponde con la numeración de Kabat en la cadena pesada del bevacizumab.

La Tabla 11 muestra mutaciones en las CDR de cadena ligera del bevacizumab que no tienen impacto en la unión y que se pueden incorporar a los anticuerpos de la divulgación. La numeración de los aminoácidos de la Tabla 11 20 corresponde con la numeración de Kabat en la cadena ligera del bevacizumab.

Las Tablas 12-1 a 12-9 muestran mutaciones conocidas de las CDR de cadena pesada del bevacizumab que se pueden incorporar a los anticuerpos de la divulgación. Cada fila de las Tablas 12-1 a 12-9 incluye una variante conocida distinta. Para cada variante, las secuencias CDR conocidas están sombreadas. Los identificadores de 25 secuencia de cada variante identificada en las Tablas 12-1 a 12-9 se exponen en las Tablas 20-1 a 20-9, respectivamente. La columna CDR-H1 proporciona una secuencia parcial de la CDR-H1, la asparagina final de la CDR-H1 no se muestra. Esta secuencia parcial corresponde a la SEC ID Nº 411. Aunque se muestran mutaciones conocidas en CDR-H1 en el contexto de esta secuencia parcial, se señala que las mutaciones existen en el contexto de la CDR de longitud completa. 30

La Tabla 13 muestra mutaciones conocidas en las CDR de la cadena ligera del bevacizumab que se pueden incorporar en los anticuerpos de la divulgación. Cada fila de la Tabla 13 incluye una variante conocida distinta. Para cada variante, las secuencias de CDR conocidas se sombrean. Los identificadores de secuencia de cada variante identificada en la Tabla 13 se expone en la Tabla 20-10. 35

La Tabla 14 muestra péptidos de la CDR2 VH del bevacizumab que se ensayaron en cuanto a su inmunogenicidad, donde los restos sin cambios a partir de la SEC ID Nº 62 se indican por un cuadrado en blanco. También se proporcionan los resultados del ensayo de células T CD4+.

40

La Tabla 15 muestra péptidos de la CDR3 VH del bevacizumab que se ensayaron en cuanto a su inmunogenicidad, donde los restos sin cambios a partir de la SEC ID Nº 74 se indican por un cuadrado en blanco. Se proporcionan también los resultados del ensayo de células T CD4+.

La Tabla 16 muestra péptidos de CDR2 VL que se ensayaron en cuanto a la inmunogenicidad, donde los restos sin 45 cambios a partir de la SEC ID Nº 25 se indican con un cuadrado en blanco. También se proporcionan los resultados del ensayo de células T CD4+.

La Tabla 17 muestra modificaciones del epítopo seleccionado para los tres epítopos de células T CD4+ del bevacizumab. 50

La Tabla 18 muestra mutantes de una sola región variable y su puntuación media de la intensidad de fluorescencia (MFI) asociada.

La Tabla 19 muestra mutantes de la región variable combinada y su CE50 asociada. 55

Las Tablas 20-1 a 20-10 muestran las SEC ID Nos correspondientes, cuando se conocen, que corresponden a las CDR de las variantes del bevacizumab enumeradas en las Tablas 12-1 a 12-9 y la Tabla 13, respectivamente. N/A indica una secuencia CDR desconocida.

60

Figuras 1A-1D. La Figura 1A muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera del bevacizumab, SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2, respectivamente, con las regiones CDR en negrita, con el texto subrayado. La Figura 1B muestra las secuencias CDR y los correspondientes identificadores de secuencia del bevacizumab. La Figura 1C muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del bevacizumab, SEC ID Nº 9 y la SEC ID Nº 10, respectivamente, con las regiones CDR en negrita, y el texto 65 subrayado. La Figura 1D muestra las secuencias CDR y los correspondientes identificadores de secuencia del ranibizumab.

Las Figuras 2A-2B muestran las respuestas de péptidos VL de bevacizumab. La Figura 2A muestra el porcentaje de respuestas donantes de cada péptido VL con un índice de estimulación de 2,95 o más. N = 99 donantes. La Figura 2B muestra el índice medio de estimulación para los 99 donantes para cada péptido más o menos el error estándar. 5

Las Figuras 3A-3B muestran las respuestas de péptido VH del bevacizumab. La Figura 3A muestra el porcentaje de respuestas de donantes a cada péptido VH con un índice de estimulación de 2,95 o mayor. N = 99 donantes. La Figura 3B muestra el índice de estimulación medio para los 99 donantes para cada péptido más o menos el error estándar.

10

Las Figuras 4A-4C muestran la respuestas de células T CD4+ a los epítopos peptídicos mutantes del bevacizumab. Las respuestas medias a las secuencias de epítopo parental sin modificar se indican con marcas abiertas. Los círculos grandes indican cambios seleccionados a los que se refiere la Tabla 17. La Figura 4A se refiere a péptidos CDR2 VH; La Figura 4B se refiere a péptidos CDR3 VH; y

15

La Figura 4C se refiere a péptidos CDR2 VL.

6. Descripción detallada

6.1 Anticuerpos anti-VEGF 20

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-VEGF. A menos de que se indique otra cosa, el término “anticuerpo” (Ab) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a, o es inmunológicamente reactiva con, un antígeno particular, e incluye los policlonales, monoclonales, modificados genéticamente y formas de anticuerpos modificados de otra manera, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos 25 quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos, y tetracuerpos), y fragmentos de unión de anticuerpos, incluyendo por ejemplo, Fab’, F(ab’)2, Fab, Fv, rIgG, y fragmentos scFv. Además, a menos de que se indique otra cosa, la expresión “anticuerpo monoclonal” (mAb) significa que incluye ambas moléculas intactas, así como, fragmentos de anticuerpo (tal como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab’)2 que son capaces de unirse específicamente a una proteína. Los fragmentos 30 Fab y F(ab’)2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación del animal, y pueden tener unión específica de tejidos menor que un anticuerpo intacto (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).

El término “scFv” se refiere a una cadena sencilla Fv de anticuerpo en el que los dominios variables de la cadena 35 pesada y la cadena ligera de un anticuerpo se han unido para formar una cadena.

Las referencias a “VH” se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, que incluye la cadena pesada de un Fv, scFv, o Fab. Las referencias a “VL” se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluye la cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Los anticuerpos (Ab) e 40 inmunoglobulinas (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos muestran una especificidad de unión para una diana específica, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas tipo anticuerpo que carecen de la especificidad de diana. Los anticuerpos nativos e inmunoglobulinas son habitualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Daltons, que se componen de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada 45 tiene en el extremo amino un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en el extremo amino (VL) y un dominio constante en el extremo carboxilo.

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación se unen al VEGF humano e inhiben la actividad del receptor VEGF en una célula. 50

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR) que están relacionadas con las secuencias de las CDR del anticuerpo bevacizumab (también conocido como Avastin® y/o ranibizumab (también conocido como Lucentis®).

55

Las CDR se conocen también como regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones marco (FR). Como se sabe en la técnica, la posición de aminoácidos en el límite que delimita una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y de varias definiciones conocidas en la técnica. Algunas posiciones en un dominio variable se pueden considerar como posiciones hipervariables híbridas 60 ya que estas posiciones se pueden considerar como que están en una región variable bajo un grupo de criterios mientras que se puede considerar que están fuera de una región hipervariable bajo un grupo de criterios diferente. Una o más de estas posiciones se pueden encontrar también en regiones hipervariables extendidas. La divulgación proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones hipervariables híbridas. Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada nativas comprenden cada uno, cuatro regiones FR, en su mayor parte 65 adoptando una configuración de hojas β, conectadas por tres CDR, que forman bucles de conexión, y en algunos casos que forman parte de la estructura de hojas β. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR en el orden FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a la diana de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences de Proteins de Immunological Interest (National Institute de Health, Bethesda, Md. 1987). Como se utiliza en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos se produce de acuerdo con el sistema de numeración de 5 restos de aminoácidos de inmunoglobulinas de Kabat y col., a menos de que se indique otra cosa.

Las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del bevacizumab están representadas por la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2, respectivamente. Las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera también se presentan en la Figura 1A. Las secuencias de las CDR del 10 bevacizumab, y sus correspondientes identificadores, se presentan en la Figura 1B. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos que codifican la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2 se pueden utilizar en las composiciones y métodos de la presente divulgación.

Las secuencias de las cadenas pesada y ligera del ranibizumab se representan por las SEC ID Nº 9 y la SEC ID Nº 15 10, respectivamente. Las secuencias de las cadenas pesada y ligera también se presentan en la Figura 1C. Las secuencias de las CDR del ranibizumab, y sus correspondientes identificadores, se presentan en la Figura 1D. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos que codifican las SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 10 se puede utilizar en las composiciones y métodos de la presente divulgación.

20

La presente divulgación además proporciona fragmentos de anticuerpo anti-VEGF que comprenden secuencias CDR que se relacionan con las secuencias CDR del bevacizumab y ranibizumab. La expresión “fragmento de anticuerpo” se refiere a una parte de un anticuerpo de longitud completa, en general la región de unión a la diana o variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv. Un fragmento “Fv” es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a la diana. Esta región 25 consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera unidos en una asociación estrecha, no covalente (dímero VH-VL). En esta configuración las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a la diana en la superficie del dímero VH-VL. A menudo, las seis CDR confieren la especificidad de un sitio de unión a la diana al anticuerpo. Sin embargo en algunos casos incluso un dominio variable sencillo (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para una diana) puede tener la capacidad de reconocer y 30 unirse a la diana. Los fragmentos de anticuerpo “Fv de cadena sencilla” o “scFv” comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo en una cadena polipeptídica sencilla. En general, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre el dominio VH y VL que hace posible que el scFv forme la estructura deseada para la unión a la diana. Los “anticuerpos de dominio único” están compuestos por un único dominio VH o VL que muestran la afinidad suficiente hacia la diana. En una realización específica, el anticuerpo de un único dominio es un 35 anticuerpo camélido (véase; por ejemplo, Riechmann, 1999, Journal de Immunological Methods 231:25-38).

El fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos cuantos restos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas que deriva de la región 40 bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F(ab’) se producen por escisión del enlace disulfuro en las cisteínas de la bisagra del producto de digestión por pepsina de F(ab’)2. Los acoplamientos adicionales de fragmentos de anticuerpo son conocidos por los expertos habituados en la técnica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación son anticuerpos monoclonales. La expresión 45 “anticuerpo monoclonal” como se utiliza en el presente documento no se limita a anticuerpos producidos por tecnología de hibridoma. La expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se deriva de un único clon, que incluye cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no el método por el que se producen. Los anticuerpos monoclonales útiles en conexión con la presente divulgación se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes, y fago de 50 presentación, o una combinación de las mismas. Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación incluyen anticuerpos quiméricos, primatizados, humanizados o humanos.

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación pueden ser anticuerpos quiméricos. El término anticuerpo “quimérico” como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de 55 una inmunoglobulina no humana, tal como un anticuerpo de rata o ratón, y regiones constantes de inmunoglobulinas humanas, típicamente escogidas de una matriz de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes de EE. UU. Nos 5.807.715; 4.816.567; y 4.816397. 60

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación pueden estar humanizados. Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otros subdominios de unión a la diana de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado 65 comprenderá sustancialmente al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a la inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender también al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Los métodos de humanización de anticuerpos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; Patentes de EE. UU. Nsustancialmente todas las regiones CDR corresponden a la inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender también al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Los métodos de humanización de anticuerpos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; Patentes de EE. UU. Nsustancialmente todas las regiones CDR corresponden a la inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender también al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Los métodos de humanización de anticuerpos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; Patentes de EE. UU. N

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación pueden ser anticuerpos humanos. Los anticuerpos anti-VEGF 10 completamente “humanos” pueden ser deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Como se utiliza en el presente documento “anticuerpos humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluye anticuerpos aislados de las bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos humanos se pueden producir por una variedad de métodos conocidos 15 en la técnica, que incluyen fagos de presentación utilizando bibliotecas de anticuerpo derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véase las Patentes de EE. UU. Nos 4.444.887 y 4.716.111; y publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos se pueden producir también utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Véase, 20 por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patentes de EE. UU. Nos 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Además, las compañías tales como Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), Amgen (Thousand Oaks, CA) y Regeneron (Tarrytown, NY) pueden dedicarse a proporcionar anticuerpos humanos que se dirigen contra antígenos seleccionados utilizando una tecnología similar a la que se ha descrito anteriormente. Los 25 anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado se pueden generar utilizando una técnica llamada “selección guiada”. En esta estrategia un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).

30

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación pueden estar primatizados. La expresión “anticuerpo primatizado” se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes humanas. Los métodos para producir anticuerpos primatizados se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. Nos 5.658.570; 5.681.722; y 5.693.780.

35

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, a menudo humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En la presente divulgación, una de las especificidades de unión se puede dirigir hacia el VEGF, la otra puede ser para cualquier otro antígeno, por ejemplo, para una proteína de superficie celular, receptor, subunidad de receptor, antígeno específico de tejido, proteína derivada vírica, proteína de cápsula 40 codificada víricamente, proteína derivada de bacterias, o proteína de superficie bacteriana, etc. En una realización específica, un anticuerpo de la divulgación es un anticuerpo biespecífico con especificidades de unión tanto para VEGF como para CD3.

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación incluyen anticuerpos derivados. Por ejemplo, pero no de manera 45 limitante, los anticuerpos derivados que están modificados típicamente por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína (véase la Sección 6.6 para tratar los anticuerpos conjugados), etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de las numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. De manera 50 adicional, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo utilizando la tecnología ambrx (véase, por ejemplo, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2).

En otra realización más de la divulgación, los anticuerpos anti-VEGF o los fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpo cuyas secuencias se han modificado para alterar al menos una función 55 efectora biológica mediada por la región constante con respecto a la secuencia correspondiente del tipo silvestre.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se puede modificar para reducir al menos una función efectora biológica mediada por la región constante con respecto a un anticuerpo sin modificar, por ejemplo, la unión reducida al receptor Fc (FcγR). La unión a FcγR puede reducirse mutando el segmento de 60 región constante de inmunoglobulina del anticuerpo en regiones particulares necesarias para las interacciones con el FcγR (véase, por ejemplo, Canfield y Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; y Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). La reducción de la capacidad de unión al FcγR del anticuerpo también puede reducir otras funciones efectoras que se basan en las interacciones con el FcγR, tales como opsonización, fagocitosis y citotoxicidad celular dependiente de antígeno (“ADCC”). 65

En otras realizaciones, se puede modificar un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación para adquirir o mejorar al menos una función efectora biológica mediada por la región constante con respecto a un anticuerpo sin modificar, por ejemplo para aumentar las interacciones con el FcγR (véase por ejemplo, el documento US 2006/0134709). Por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación puede tener una región constante que se une a FcγRIIA, FcγRIIB y/o FcγRIIIA con mayor afinidad que la región constante correspondiente del tipo silvestre. 5

Por lo tanto, los anticuerpos de la divulgación pueden tener alteraciones en la actividad biológica que dan como resultado el aumento o disminución de la opsonización, fagocitosis, o ADCC. Tales alteraciones se conocen en la técnica. Por ejemplo, las modificaciones que reducen la actividad ADCC se describen en la Patente de EE. UU. Nº 5.834.597. Una variante ejemplar que disminuye la ADCC corresponde al “mutante 3” que se muestra en la Figura 4 10 de la Patente de EE. UU. Nº 5.834.597, en la que se ha eliminado el resto 236 y se han sustituido los restos 234, 235 y 237 (utilizando la numeración EU) por alaninas.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación tienen bajos niveles o carecen de fucosa. Los anticuerpos que carecen de fucosa se han relacionado con el aumento de la actividad ADCC, especialmente a bajas 15 dosis de anticuerpo. Véase, Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73. Los métodos para preparar anticuerpos con menos fucosa incluyen el crecimiento en células YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). Las células YB2/0 expresan bajos niveles de ARNm FUT8, que codifica α-1,6-fucosiltransferasa, una enzima necesaria para la fucosilación de polipéptidos.

20

En otro aspecto, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se han modificado para aumentar o disminuir sus afinidades de unión por el receptor Fc fetal, FcRn, por ejemplo mutando el segmento de región constante de inmunoglobulina en las regiones particulares implicadas en las interacciones con FcRn (véase, por ejemplo, el documento WO 2005/123780). En realizaciones particulares, un anticuerpo anti-VEGF de la clase IgG ha mutado tal que al menos uno de los restos de aminoácidos 250, 314, y 25 428 de la región constante de la cadena pesada se ha sustituido, solo o en cualquiera de las combinaciones de los mismos, tal como en las posiciones 250 y 428, o en las posiciones 250 y 314, o en las posiciones 314 y 428, o en las posiciones 250, 314, y 428 , siendo en las posiciones 250 y 428 una combinación específica. Para la posición 250, el resto de aminoácido sustituto puede ser cualquier resto de aminoácido distinto de treonina, incluyendo pero sin limitarse a alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina histidina, isoleucina, lisina, leucina, 30 metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptófano, o tirosina. Para la posición 314, el resto de aminoácido sustituto puede ser cualquier resto de aminoácido distinto de leucina, incluyendo, pero sin limitarse a alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, o tirosina. Para la posición 428, los restos de aminoácido sustitutos pueden ser cualquier resto de aminoácido distinto metionina, que incluyen pero no se 35 limitan a alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, o tirosina. Las combinaciones específicas de sustituciones de aminoácidos adecuadas se identifican en la Tabla 1 de la Patente de EE. UU. Nº 7.217.797. Tales mutaciones aumentan la unión del anticuerpo a FcRn, lo que protege al anticuerpo de la degradación y aumenta su semivida. 40

En otros aspectos más, el anticuerpo anti-VEGF tiene uno o más aminoácidos insertados en una o más de sus regiones hipervariables, por ejemplo como se describe en Jung and Plückthun, 1997, Protein Engineering 10(9):959-966; Yazaki et al., 2004, Protein Eng Des. Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17; y documento US 2007/0280931.

45

En varias realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que han sido modificados para aumentar la expresión en huéspedes heterólogos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se han modificado para aumentar la expresión y/o la secreción en células huésped heterólogas. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos están modificados para aumentar 50 la expresión en bacterias, tales como E. coli. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos están modificados para aumentar la expresión en levaduras (Kieke et al., 1999, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 96:5651-5656). En otras realizaciones más, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos están modificados para aumentar la expresión en células de insecto. En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos están modificados para aumentar la expresión en células de mamífero, tales 55 como células CHO.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se han modificado para aumentar la estabilidad de los anticuerpos durante la producción. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden modificar 60 remplazando uno o más aminoácidos tales como asparagina o glutamina que son susceptibles a la desamidación no enzimática por aminoácidos que no experimenten desamidación (Huang et al., 2005, Anal. Chem. 77:1432-1439). En otras realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden modificar para remplazar uno o más aminoácidos que son susceptibles a la oxidación, tales como la metionina, cisteína o triptófano, por un aminoácido que no experimente fácilmente la oxidación. En otras realizaciones más, los anticuerpos o fragmentos de los mismos 65 se pueden modificar para remplazar uno o más aminoácidos que son susceptibles a la ciclación, tales como la asparagina o el ácido glutámico, por un aminoácido que no experimente fácilmente la ciclación.

6.2 Ácidos nucleicos y sistemas de expresión

La presente divulgación engloba moléculas de ácidos nucleicos y células huésped que codifican los anticuerpos anti-5 VEGF de la divulgación.

Un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se puede preparar por expresión recombinante de los genes de cadena pesada y ligera en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo recombinantemente, se transfecta una célula huésped con uno o más vectores de expresión recombinante que tiene fragmentos de ADN que codifican las 10 cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo tal que se expresen las cadenas ligera y pesada en la célula huésped y, opcionalmente, se segreguen en el medio en el que se cultivan las células huésped, se pueden recuperar los anticuerpos a partir de tal medio. Se utilizan metodologías de ADN recombinante de referencia para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinante e introducir los vectores en células huésped, tal como las que se describen en Molecular Cloning; A 15 Laboratory Manual, Segunda Edición (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) y en la Patente de EE. UU. Nº 4.816.397.

En una realización, los anticuerpos anti-VEGF son similares al bevacizumab o ranibizumab excepto por cambios en 20 una o más CDR. Los anticuerpos anti-VEGF pueden ser similares al bevacizumab o ranibizumab excepto por cambios en una o más regiones marco conservadas. En otra realización más, los anticuerpos anti-VEGF son similares al bevacizumab o ranibizumab excepto por cambios en una o más CDR y una o más regiones marco conservadas. Tales anticuerpos se designan colectivamente en el presente documento como que tienen secuencias “relacionadas con el bevacizumab” o “relacionadas con el ranibizumab” y a veces se denominan simplemente 25 anticuerpos anti-VEGF de la divulgación. Para generar los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-VEGF, se obtienen primero los fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada. Estos ADN se pueden obtener por amplificación y modificación de la línea germinal de ADN o ADNc que codifican secuencias variables de cadena ligera y pesada, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de la línea germinal de ADN para los genes de las regiones variables de cadenas pesada y ligera 30 humanas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, la base de datos de secuencia de la línea germinal humana “VBASE”; véase también Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences de Proteins de Immunological Interest, Primera Edición, U.S. Department de Health and Human Services, NIH Publication Nº 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; y Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836). Un fragmento de ADN que codifica la región variable de cadena pesada o ligera del bevacizumab o ranibizumab se pueden sintetizar y utilizar como una 35 matriz de mutagénesis para generar una variante como la que se describe en el presente documento que utiliza técnicas de mutagénesis de rutina; de manera alternativa, un fragmento de ADN que codifica la variante puede sintetizarse directamente.

Una vez que se obtiene los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL anti-VEGF, estos fragmentos 40 de ADN se pueden modificar más por técnicas de ADN recombinante de referencia, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen scFv. En estas modificaciones, un fragmento de ADN que codifica una VL o VH está unido operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o a un enlazador flexible. La expresión “unido operativamente”, como se utiliza en este contexto, pretende significar que 45 los dos fragmentos de ADN están unidos tal que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en fase.

El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de 50 la cadena pesada (CH1, CH2, CH3 y, opcionalmente CH4). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humanos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences de Proteins de Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department de Health and Human Services, NIH Publication Nº 91-3242) y los fragmentos de ADN que engloban estas regiones se pueden obtener por amplificación PCR de referencia. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, 55 IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero en ciertas realizaciones es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen del fragmento Fab de cadena pesada, el ADN que codifica VH puede estar unido operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante de cadena pesada CH1.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (así 60 como un gen Fab de cadena ligera) uniendo operativamente el ADN que codifica la VL con otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera CL. Las secuencias de los genes de la región constante de cadena ligera humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences de Proteins de Immunological Interest, Quinta Edición (U.S. Department de Health and Human Services, NIH Publication Nº 91-3242)) y los fragmentos de ADN que engloban estas regiones se pueden obtener por amplificación PCR de 65 referencia. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero en ciertas realizaciones es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos operativamente con otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoácidos (Glyrealizaciones es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos operativamente con otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoácidos (Glyrealizaciones es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos operativamente con otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoácidos (Glyrealizaciones es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos operativamente con otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoácidos (Glyrealizaciones es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos operativamente con otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoácidos (Gly

Para expresar los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación, los ADN que codifican las cadenas pesada y ligera parciales o de longitud completa, que se obtienen como se ha descrito anteriormente, se insertan en vectores de expresión tal que los genes están unidos operativamente a las secuencias de control transcripcional y traduccional. 10 En este contexto, la expresión “unido operativamente” pretende significar que un gen de anticuerpo está unido en un vector tal que las secuencias de control transcripcional y traduccional del vector sirven para la intención deseada de regulación de la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión que se utilice. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en vectores separados o, 15 más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.

Los genes de anticuerpos se insertan en el vector de expresión por métodos de referencia (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento genético de anticuerpo y el vector, o ligadura de extremos romos si los sitios de restricción no están presentes). Antes de la inserción de las secuencias de cadena ligera y 20 pesada de los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación, el vector de expresión puede tener ya secuencias de la región constante de anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia para convertir las secuencias VH y VL anti-VEGF en genes de anticuerpo de longitud completa es insertarlas en vectores de expresión que codifican ya regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera, respectivamente, tal que el segmento VH está unido operativamente al segmento CH en el vector y el segmento VL está unido operativamente al segmento CL del 25 vector. De manera adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula huésped. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector tal que el péptido de señal está ligado en fase al extremo amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína no inmunoglobulina). 30

Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la divulgación tienen secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. La expresión “secuencia reguladora” pretende que incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de 35 cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras adecuadas para la expresión en células huésped de mamífero 40 incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión proteica en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador CMV), Virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador SV40), adenovirus (por ejemplo el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Para más descripciones de elementos víricos reguladores y secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. Nº 5.168.062 por Stinski, Patente de EE. UU. Nº 4.510.245 por 45 Bell et al., y Patente de EE. UU. Nº 4.968.615 por Schaffner et al.

Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la divulgación pueden tener secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y marcadores genéticos. El marcador genético facilita 50 la selección de células huésped en los que se ha introducido el vector (véase por ejemplo, las Patentes de EE. UU. Nos 4.399.216. 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel et al.). Por ejemplo, el marcador genético típicamente confiere resistencia a fármacos tales como G418, puromicina, blasticidina, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los marcadores genéticos adecuados incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en la selección/amplificación en células huésped DHFR con metotrexato) y el gen 55 neo (para la selección G418). Para la expresión de cadenas ligera y pesada, el vector de expresión que codifica las cadenas pesada y ligera se transfecta en una células huésped por técnicas de referencia. Las distintas formas del término “transfección” pretenden englobar una amplia variedad de técnicas utilizadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una células huésped procariotas o eucariotas, por ejemplo, electroporación, lipofección, precipitación en fosfato cálcico, transfección DEAE-dextrano. 60

Es posible expresar los anticuerpos de la divulgación en células huésped procariotas o eucariotas. En ciertas realizaciones, la expresión de anticuerpos se llevan a cabo en células eucariotas, por ejemplo, células huésped de mamífero, para la secreción óptima de un anticuerpo inmunológicamente activo plegado apropiadamente. Las células huésped de mamífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes de la divulgación incluyen las 65 de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo las células CHO DHFR, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, que se utilizan con un marcador genético DHFR, por ejemplo como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS0, células COS, células 293 y células SP2/0. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican los genes de anticuerpo en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo en el 5 medio de cultivo en el que se han cultivado las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación proteica de referencia. Las células huésped se pueden utilizar también para producir partes de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entiende que están en el ámbito de la presente divulgación las variaciones del procedimiento anterior. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con un ADN que codifique o la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de 10 un anticuerpo anti-VEGF de la presente divulgación.

Se puede utilizar también tecnología de ADN recombinante para eliminar alguno o todos los ADN que codifican o una o ambas cadenas ligera y pesada que no sean necesarios para la unión al VEGF. Las moléculas que se expresan de tales moléculas de ADN truncado también se engloban en los anticuerpos de la divulgación. 15

Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en las que una cadena pesada y una cadena ligera están en un anticuerpo de la divulgación y otra cadena pesada y ligera son específicas de otro antígeno distinto de VEGF por entrecruzamiento de un anticuerpo de la divulgación con un segundo anticuerpo por métodos de entrecruzamiento químico de referencia. Los anticuerpos bifuncionales también se pueden fabricar expresando un ácido nucleico 20 modificado para codificar un anticuerpo bifuncional.

En ciertas realizaciones, se pueden producir anticuerpos duales específicos, es decir, anticuerpos que se unen a VEGF y a un antígeno no relacionado que utilizan el mismo sitio de unión, mutando los restos de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera y/o la cadena pesada. En varias realizaciones, se pueden producir anticuerpos duales 25 específicos que se pueden unir a dos antígenos, tales como HER2 y VEGF, mutando restos de aminoácidos en la periferia del sitio de unión al antígeno (Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-1614). Los anticuerpos funcionales duales se pueden fabricar expresando un ácido nucleico modificado para codificar un anticuerpo dual específico.

Para la expresión recombinante de un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación, la célula huésped se puede co-30 transfectar con dos vectores de expresión de la divulgación, el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Típicamente, los dos vectores contienen cada uno un marcador genético separado. De manera alternativa se puede utilizar un único vector que codifica tanto los polipéptidos de cadena pesada como ligera.

35

Una vez que se genera un ácido nucleico que codifica una o más partes de un anticuerpo anti-VEGF, se pueden introducir más alteraciones o mutaciones en la secuencia codificante, por ejemplo, para generar ácidos nucleicos que codifiquen anticuerpos con diferentes secuencias CDR, anticuerpos con afinidad reducida para el receptor Fc, o anticuerpos de diferentes subclases.

40

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación pueden producirse también por síntesis química (por ejemplo, por los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, I11.). Se pueden generar también variantes de anticuerpos utilizando una plataforma libre de células (véase, por ejemplo, Chu et al., 2001, Biochemia Nº 2 (Roche Molecular Biologicals)).

45

Una vez que se ha producido un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación por expresión recombinante, se puede purificar por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el VEGF tras selección de Proteína A o Proteína G, y cromatografía en columna por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica de referencia para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos anti-50 VEGF de la presente divulgación o fragmentos de los mismos se pueden fusionar con secuencias de polipéptidos heterólogas descritas en el presente documento o conocidas por otra parte en la técnica para facilitar la purificación.

Una vez aislado, un anticuerpo anti-VEGF puede, si así se desea, purificarse más, por ejemplo, por cromatografía líquida de altas prestaciones (véase, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular 55 Biology (Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980), o por cromatografía de filtración en gel en una columna Superdex™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).

6.3 Actividades biológicas de los anticuerpos anti-VEGF

60

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación tienen ciertas actividades biológicas, tales como la competición con el bevacizumab o ranibizumab por la unión al VEGF o la neutralización de la actividad del VEGF.

En consecuencia, en ciertas realizaciones los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación compiten con el bevacizumab 65 o ranibizumab por la unión al VEGF. La capacidad para competir por la unión con VEGF se puede ensayar utilizando un ensayo de competición. En un ejemplo de ensayo de competición, el VEGF se adhiere a una superficie sólida, por ejemplo, una placa con micropocillos, poniendo en contacto la placa con una solución de VEGF (por ejemplo a una concentración de 1 µg/ml en PBS durante una noche a 4 ºC). La placa se lava (por ejemplo con Tween 20 al 0,1% en PBS) y se bloquea (por ejemplo en Superblock, Thermo Scientific, Rockford, IL). Se añade a cada pocillo una mezcla de una cantidad de sub-saturación de bevacizumab biotinilado (80 ng/ml) o una cantidad equivalente de 5 ranibizumab biotinilado y bevacizumab sin marcar (o ranibizumab según el caso) (el anticuerpo de “referencia”) o el anticuerpo anti-VEGF de competencia (el anticuerpo de “ensayo”) en una dilución en serie (por ejemplo, a una concentración de 2,8 µg/ml, 8,3 µg/ml, o 25 µg/ml) en tampón de ELISA (por ejemplo, un 1% de BSA y un 0,1% de Tween 20 en PBS) y se incuban las placas durante una hora con agitación suave. La placa se lava, se añade a cada pocillo 1 µg/ml de Estreptavidina conjugada con HRP diluida en tampón ELISA y se incuban las placas durante 1 10 hora. Se lavan las placas y se detectan los anticuerpos unidos por adición del sustrato (por ejemplo, TMB, Bidex Laboratories Inc. Owings Mills, MD). Se termina la reacción añadiendo un tampón de parada (por ejemplo, Bio FX Stop Reagents, Bidex Laboratories Inc., Owings Mills, MD) y se mide la absorbancia a 650 nm utilizando un lector de microplacas (por ejemplo, VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se pueden utilizar también, variaciones de este ensayo de competición para ensayar la competición entre un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación y el 15 bevacizumab o el ranibizumab. Por ejemplo, en ciertos aspectos, el anticuerpo anti-VEGF se utiliza como anticuerpo de referencia y el bevacizumab o ranibizumab se utiliza como anticuerpo de ensayo. De manera adicional, en vez de VEGF soluble, se puede utilizar VEGF unido a la membrana que se expresa en las superficies de la célula (por ejemplo, células de mamífero) en un cultivo. Se conocen en la técnica otros formatos de ensayos de competición y se pueden emplear. 20

En varias realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación reduce la unión de bevacizumab o ranibizumab marcados en al menos un 30%, en al menos un 40%, en al menos un 50%, en al menos un 60%, en al menos un 70%, en al menos un 80%, en al menos un 90%, en al menos un 95%, en al menos un 99% o en un porcentaje que varía entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación reduce la 25 unión de bevacizumab o ranibizumab marcados en un 50% a 70%) cuando el anticuerpo anti-VEGF se utiliza a una concentración de 0,08 µg/ml, 0,4 µg/ml, 2 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml o a una concentración que varía entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, a una concentración que varía desde 2 µg/ml a 10 µg/ml).

En otras realizaciones, el bevacizumab o ranibizumab reduce la unión de un anticuerpo anti-VEGF marcado de la 30 divulgación en al menos un 40%, en al menos un 50%, en al menos un 60%, en al menos un 70%, en al menos un 80%, en al menos un 90%, o en un porcentaje que varía entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, el bevacizumab o ranibizumab reducen la unión de un anticuerpo anti-VEGF marcado de la divulgación en un 50% a 70%) cuando se utiliza el bevacizumab o ranibizumab a una concentración de 0,4 µg/ml, 2 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, 250 µg/ml o a una concentración que varía entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, a una 35 concentración que varía desde 2 µg/ml a 10 µg/ml).

En otros aspectos, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación inhibe (o neutraliza) la actividad de VEGF en una variedad de ensayos in vitro, tales como la proliferación celular o la migración celular. Por ejemplo, en una realización, la actividad VEGF ensayada es la inducción de la proliferación de células endoteliales (“EC”) (véase, por 40 ejemplo, el protocolo de Qin et al., 2006, J. Biol. Chem. 281:32550-32558). En otra realización, la actividad del VEGF que se ensaya es la inducción de la migración de EC (véase, por ejemplo, del ensayo de raspado in vitro descrito por Liang et al., 2007, Nat. Protoc. 2:329-333). En una realización específica, se ensaya un anticuerpo anti-VEGF en cuanto a su capacidad de invertir la proliferación y migración celular estimulada por el VEGF y la deslocalización de proteínas de unión estrecha inducida por el VEGF165 en células endoteliales retinianas inmortalizadas bovinas 45 (Deissler et al., 2008, British Journal de Ophthalmology 92:839-843). En otra realización más, se ensaya la actividad de neutralización del VEGF utilizando un ensayo de indicador (véase, por ejemplo, Yohno et al., 2003, Biological & Pharmaceutical Bulletin 26(4):417-20 y la Patente de EE. UU. Nº 6.787.323).

Se conocen en la técnica otros formatos de ensayo de neutralización del VEGF y se pueden emplear. 50

En varias realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación neutraliza el VEGF en al menos un 30%, en al menos un 40%, en al menos un 50%, en al menos un 60%, en al menos un 70%, en al menos un 80%, en al menos un 90%, o en un porcentaje que varía entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación neutraliza la actividad del VEGF en un 50% a 70%) cuando el anticuerpo anti-VEGF se 55 utiliza a una concentración de 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 0,1 µg/ml, 0,2 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml, o a una concentración que varía entre cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, a una concentración que varía entre 1 µg/ml a 5 µg/ml).

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación tiene al menos 0,7 veces la eficacia, 0,8 veces 60 la eficacia, al menos 0,9 veces la eficacia, al menos 1 vez la eficacia, al menos 1,1 veces la eficacia, al menos 1,25 veces la eficacia, al menos 1,5 veces la eficacia, al menos 2 veces la eficacia, al menos 5 veces la eficacia, al menos 10 veces la eficacia, al menos 20 veces la eficacia, al menos 50 veces la eficacia, al menos 100 veces la eficacia, al menos 200 veces la eficacia, al menos 500 veces la eficacia, al menos 1000 veces la eficacia del bevacizumab o ranibizumab en la neutralización del VEGF, o tiene una eficacia de neutralización del VEGF con 65 respecto al bevacizumab o ranibizumab que varía entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, de 0,9 veces a 5 veces la eficacia del bevacizumab o ranibizumab o 2 veces a 50 veces la eficacia del bevacizumab o ranibizumab en la neutralización del VEGF).

6.4 Propiedades cinéticas de los anticuerpos anti-VEGF 5

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación tienen una alta afinidad por el VEGF. En realizaciones específicas, los anticuerpos anti-VEGF de la presente divulgación tienen una tasa específica de constantes de asociación (valores kon o ka), tasa de constantes de disociación (valores de koff o kd), constantes de afinidad (valores KA), constantes de disociación (valores de KD) y/o valores de la CI50. En varias realizaciones, las constantes de unión para la 10 interacción de los anticuerpos anti-VEGF con el receptor VEGF se pueden determinar utilizando resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, de acuerdo con el método desvelado en Karlsson et al., 1991, J. Immunol. Methods 145:229-240. En ciertos aspectos, tales valores se seleccionan de las siguientes realizaciones.

En una realización específica, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une al VEGF con una kon de al menos 15 104 M-1s-1, al menos 5 x 104 M-1s-1, al menos 105 M-1s-1, al menos 5 x 105 M-1s-1, al menos 106 M-1s-1, al menos 5 x 106 M-1s-1, al menos 107 M-1s-1, al menos 5 x 107 M-1s-1, al menos 108 M-1s-1, al menos 5 x 108 M-1s-1, al menos 109 M-1s-1 o con una kon en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 x 105 a 5 x 106 M-1s-1 o 107 a 108 M-1s-1).

20

En otra realización un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une al VEGF con una tasa koff de 10-3s-1 o menos, 5 x 10-4s-1 o menos, 10-4s-1 o menos, 5 x 10-5s-1 o menos, 10-5 s-1 o menos, 5 x 10-6s-1 o menos, 10-6s-1 o menos, 5 x 10-7s-1 o menos, 10-7s-1 o menos, 5 x 10-8s-1 o menos, 10-8s-1 o menos, o con una koff en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 x 10-4 a 10-6s-1, o 10-3 a 5 x 10-5s-1).

25

En otra realización, un anticuerpo anti-VEGF de la invención se une al VEGF con una KA (kon/ koff) de al menos 108 M-1, al menos 5 x 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 x 1010 M-1, 1011 M-1, al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 5 x 1012 M-1, al menos 1013 M-1, al menos 5 x 1013 M-1, al menos 1014 M-1, al menos 5 x 1014 M-1, al menos 1015 M-1 o con una KA en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, desde 5 x 109 M-1 a 1011 M-1, o desde 1011 M-1 a 5 x 1014 M-1). 30

En otras realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une a VEGF con una KD (koff/ kon) de 10-8 M o menos, 5 x 10-9 M o menos, 10-9 M o menos, 5 x 10-10 M o menos, 10-10 M o menos, 5 x 10-11 M o menos, 10-11 M o menos, 5 x 10-12 M o menos, 10-12 M o menos,-5 x 10-13 M o menos, 10-13 M o menos, 5 x 10-14 M o menos, 10-14 M o menos, 5 x 10-15 M o menos, 10-15 M o menos, o con una KD en cualquier intervalo entre cualquier par de los 35 valores anteriores (por ejemplo, 5 x 10-9 a 5 x 10-12 M, o de 5 x 10-11 M a 5 x 10-13 M).

En realizaciones específicas, el valor de KD (koff / kon) se determina por ensayos bien conocidos en la técnica o que se describen en el presente documento, por ejemplo, ELISA, calorimetría de titulación térmica (ITC), ensayo de polarización fluorescente o cualquier otro biosensor tal como BIAcore. 40

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une a VEGF e inhibe la unión del VEGF a un receptor VEGF (Flt-1 o Flk-1) con un valor de CI50 menor de 5 x 107 nM, menor de 107 nM, menor de 5 x 106 nM, menor de 106 nM, menor de 5 x 105 nM, menor de 105 nM, menor de 5 x 104 nM, menor de 104 nM, menor de 5 x 103 nM, menor de 103 nM, menor de 5 x 102 nM, menor de 100 nM, menor de 90 nM, menor de 80 nM, menor de 70 nM, 45 menor de 65 nM, menor de 60 nM, menor de 50 nM, menor de 40 nM, menor de 30 nM, menor de 25 nM, menor de 20 nM, menor de 15 nM, menor de 12 nM, menor de 10 nM, menor de 5 nM, menor de 1 nM, menor de 5 x 10-1 nM, menor de 10-1 nM, menor de 5 x 10-2 nM, menor de 10-2 nM, menor de 5 x 10-3 nM, menor de 10-3 nM, menor de 5 x 10-4nM, o menor de 10-4 nM, o con una CI50 de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 x 107 a 50 nM, o 15 nM a 5 x 10-3 nM). La CI50 se puede medir de acuerdo con métodos bien conocidos 50 en la técnica o descritos en el presente documento, por ejemplo, ELISA.

En otras realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une a VEGF y neutraliza la actividad del VEGF en un bioensayo (por ejemplo, proliferación o migración de EC) con un valor de CI50 menor de 5 x 107 nM, menor de 107 nM, menor de 5 x 106 nM, menor de 106 nM, menor de 5 x 105 nM, menor de 105 nM, menor de 5 x 104 nM, 55 menor de 104 nM, menor de 5 x 103 nM, menor de 103 nM, menor de 5 x 102 nM, menor de 100 nM, menor de 90 nM, menor de 80 nM, menor de 70 nM, menor de 65 nM, menor de 60 nM, menor de 50 nM, menor de 40 nM, menor de 30 nM, menor de 25 nM, menor de 20 nM, menor de 15 nM, menor de 12 nM, menor de 10 nM, menor de 5 nM, menor de 1 nM, menor de 5 x 10-1 nM, menor de 10-1 nM, menor de 5 x 10-2 nM, menor de 10-2 nM, menor de 5 x 10-3 nM, menor de 10-3nM, menor de 5 x 10-4 nM, o menor de 10-4nM, o con una CI50 en cualquier intervalo entre 60 cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 x 107 a 50 nM, o 15 nM a 5 x 10-3 nM). Un ensayo de neutralización ejemplar que se puede utilizar para medir la CI50 de un anticuerpo anti-VEGF se describe en la Sección 6.3 posteriormente.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF se une al VEGF e inhibe la unión del VEGF a Flt-1, Flk-1 o ambos, 65 o inhiben la actividad de VEGF en un ensayo de neutralización de VEG, con un valor de la CI50 de entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 1 µM. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-VEGF se une al VEGF e inhibe la unión de VEGF a Flt-1, Flk-1 o ambos, o inhibe la actividad de VEGF en un ensayo de neutralización de VEGF con un valor de CI

En ciertos aspectos de las realizaciones anteriores, la CI50 se mide en presencia de VEGF a una concentración de 0,001 µM, 0,005 µM, 0,01 µM, 0,05 µM, 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 10 µM, 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM, 60 µM, 70 µM, 80 µM, 90 µM, 100 µM, 200 µM, 300 µM, 400 µM, 500 µM, 600 µM, 700 µM, 800 µM, 900 µM, 1000 µM o a una 10 concentración en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 0,01 a 50 µM, o 10 µM a 100 µM).

En ciertas realizaciones, las propiedades cinéticas de un anticuerpo de la divulgación son comparables a, o mejores con respecto al bevacizumab o ranibizumab en un ensayo comparable. Por ejemplo, en ciertas realizaciones un 15 anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une a VEGF con una tasa de kon de aproximadamente 0,5x a 1000x la kon del bevacizumab o del ranibizumab, por ejemplo una kon de 0,5x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 0,75x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 0,9x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 1x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 1,1x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 1,2x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 1,3x de la kon del 20 bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 1,4x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 1,5x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 1,75x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 2x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 2,25x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 2,5x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 3x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 4x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 5x de la kon del bevacizumab o del 25 ranibizumab, una kon de 7,5x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 10x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 15x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 20x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 50x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 75x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 100x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 150x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 200x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, 30 una kon de 200x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab o una kon que varía entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo, una kon de 2x-75x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 5x-100x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 0,5x-1000x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, una kon de 0,75x-200x de la kon del bevacizumab o del ranibizumab, etc.

35

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une al VEGF con una tasa de koff que varía de 0,001 x a 3x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, por ejemplo una koff de 0,002x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,005x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,0075x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,01x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,025x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,05x de la koff del bevacizumab o del 40 ranibizumab, una koff de 0,075x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,1x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,25x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,5x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,75x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,9x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 1x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 1,1 x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 1,25x de la koff del bevacizumab o del 45 ranibizumab, una koff de 1,5x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 1,75x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 4x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 3x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 2x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 3x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, o una koff que varía entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo, una koff de 0,01x a 1,1x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,05x-1,25x de la koff del 50 bevacizumab o del ranibizumab, una koff de 0,1x-0,9x de la koff del bevacizumab o del ranibizumab, etc.

El anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une al VEGF con una KA (kon/koff) que varía entre 0.25x a 1000x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, por ejemplo una KA de 0,5x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 0,75x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 1x de la KA del bevacizumab o del 55 ranibizumab, una KA de 2x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 4x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 10x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 15x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 20x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 30x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 40x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 50x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 100x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA 60 de 250x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 500x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 750x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 1000x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab o una KA que varía entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo, una KA de 0,75x-10 5x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 1x-100x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 10x-20x de la KA del bevacizumab o del ranibizumab, una KA de 4x-50x de la KA del bevacizumab o del 65 ranibizumab, una Kranibizumab, una Kranibizumab, una Kranibizumab, una Kranibizumab, una Kranibizumab, una Kranibizumab, una Kranibizumab, una Kranibizumab, una K

El anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une al VEGF con una KD (koff/kon) que varía desde 0,001 x una 10x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, por ejemplo una KD de 0,001x de la KD del bevacizumab o del 5 ranibizumab, una KD de 0,005x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,01x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,05x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,075x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,1x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,2x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,3x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,4x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,5x de la KD del bevacizumab o del 10 ranibizumab, una KD de 0,6x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,7x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,8x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,9x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 1x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 1,5x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 2x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 4x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 7,5x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 10x 15 de la KD del bevacizumab o del ranibizumab o una KD que varía entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo, una KD de 0,01x-2x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,1x-1,5x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,7x-4x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab, una KD de 0,2x-2x de la KD del bevacizumab o del ranibizumab o cualquier valor o intervalo que se pueda calcular a partir de las tasas de kon y koff que se desvelan en el presente documento. 20

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se une al VEGF e inhibe la unión del VEGF a Flt-1, Flk-1 o ambos, o neutraliza la actividad del VEGF con un valor de CI50 que varía desde 0,001x a 10x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, por ejemplo una CI50 de 0,001x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,005x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,01x de la CI50 del bevacizumab o 25 del ranibizumab, una CI50 de 0,05x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,075x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,1x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,2x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,3x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,4x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,5x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,6x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,7x de la CI50 del 30 bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,8x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,9x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 1x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 1,5x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 2x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 4x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 7,5x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 10x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab o una CI50 que varía entre cualquier par 35 de los valores anteriores, por ejemplo una CI50 de 0,01x-2x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,1x-1,5x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,7x-4x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab, una CI50 de 0,2x-2x de la CI50 del bevacizumab o del ranibizumab.

6.5 Inmunogenicidad reducida de los anticuerpos anti-VEGF 40

En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-VEGF que tienen una inmunogenicidad reducida en comparación con el bevacizumab o el ranibizumab. La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-VEGF que tienen sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples en sus CDR y/o regiones marco conservadas en comparación con las CDR del bevacizumab, donde al menos una sustitución reduce la inmunogenicidad del 45 anticuerpo en comparación con el bevacizumab o el ranibizumab. En ciertas realizaciones, la inmunogenicidad reducida resulta de una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación o mitigación de uno o más epítopos de células T.

En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación que tienen una inmunogenicidad reducida tienen 50 una actividad biológica comparable o mejorada en comparación con el bevacizumab o ranibizumab, por ejemplo, la afinidad por el VEGF o la neutralización de la actividad del VEGF. Tales propiedades se pueden ensayar, por ejemplo, por lo métodos descritos en la Sección 6.3 anterior.

En ciertas realizaciones, la inmunogenicidad de un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación está reducida con 55 respecto al anticuerpo bevacizumab o ranibizumab. Tales anticuerpos tienen en general variantes de secuencias con respecto a la región variable de la cadena pesada y/o ligera en regiones que corresponden a las SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 62 y/o SEC ID Nº 74. Los anticuerpos tendrán generalmente una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en una, dos o las tres secuencias que corresponden a las SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 62, y SEC ID Nº 74, aunque se contemplan en el presente documento hasta cuatro o cinco sustituciones en una, dos o las tres regiones. 60

Como se utiliza en la presente divulgación, una variante con “inmunogenicidad reducida” se refiere a un anticuerpo anti-VEGF con una secuencia variante en una región que corresponde a las SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 62, y/o SEC ID Nº 74 que produce una respuesta proliferativa reducida en células mononucleares de sangre periférica en comparación con un péptido de la SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 62, o SEC ID Nº 74, respectivamente. Un ensayo de 65 proliferación ejemplar que se puede utilizar para evaluar la respuesta proliferativa se expone en la Sección 7 posterior. La respuesta proliferativa reducida se puede reflejar en términos de porcentaje de respondedores, índice de estimulación, o ambos.

En otras realizaciones, al compararse con un péptido que tiene la SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 62, o la SEC ID Nº 74, la secuencia variante da como resultado al menos un 25% menos de respondedores, al menos un 30% menos de 5 respondedores, al menos un 35% menos de respondedores, al menos un 40% menos de respondedores, al menos un 45% menos de respondedores, al menos un 50% menos de respondedores, al menos un 60% menos de respondedores, al menos un 65% menos de respondedores, al menos un 70% menos de respondedores, al menos un 75% menos de respondedores, al menos un 80% menos de respondedores, al menos un 85% menos de respondedores, al menos un 90% menos de respondedores, al menos un 95% menos de respondedores, un 100% 10 menos de respondedores, o una reducción de respondedores en un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo un 25%-75% menos de respondedores, 50%-90% menos de respondedores, 60%-100% menos de respondedores; un 70%-90% menos de respondedores, o de manera similar.

En otras realizaciones, la secuencia variante da como resultado un índice de estimulación que es al menos un 5% 15 menor, al menos un 10% menor, al menos un 15% menor, al menos un 20% menor, al menos un 25% menor, al menos un 30% menor, al menos un 35% menor, o al menos un 40% menor que el índice de estimulación producido por un péptido de la SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 62, o la SEC ID Nº 74, respectivamente, o da como resultado un índice de estimulación reducido en un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores al compararse con un péptido de la SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 62, o la SEC ID Nº 74, por ejemplo, un 5%-20% menos, 10%-30% menos, 20 25%-35% menos, 30%-40% menos, o de manera similar.

Las realizaciones ejemplares de los anticuerpos anti-VEGF candidatos con inmunogenicidad reducida en comparación con bevacizumab o ranibizumab comprende una o más sustituciones o combinaciones de sustituciones en las CDR expuestas en la Tabla 6. Opcionalmente los anticuerpos anti-VEGF con inmunogenicidad reducida en 25 comparación con bevacizumab o ranibizumab comprenden una o más sustituciones adicionales, tales como las mutaciones de CDR de cualquiera de las Tablas 7-13, únicas o en combinación.

Más realizaciones ejemplares de anticuerpos anti-VEGF candidatos con inmunogenicidad reducida en comparación con bevacizumab o ranibizumab comprenden una o más sustituciones o combinaciones de sustituciones en las CDR 30 que se exponen en las Tablas 14-16. Algunas realizaciones preferidas de anticuerpos anti-VEGF con inmunogenicidad reducida en comparación con bevacizumab o ranibizumab se proporcionan en la Tabla 19.

6.6 Anticuerpos conjugados

35

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación incluyen anticuerpos conjugados que se han modificado, por ejemplo, uniendo covalentemente cualquier tipo de molécula al anticuerpo, tal que la unión covalente no interfiera con la unión al VEGF.

En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación puede conjugarse con un resto efector o un 40 marcador. La expresión “resto efector” como se utiliza en el presente documento incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN), radionúclidos, particularmente, yodo radioactivo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas, y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar por espectroscopia NMR o 45 ESR.

En un ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF se pueden conjugar con un resto efector, tal como un agente citotóxico, un radionúclido o resto de fármaco para modificar una determinada respuesta biológica. El resto efector puede ser una proteína o polipéptido, tal como, por ejemplo y sin limitación, una toxina (tal como abrina, ricina A, exotoxina de 50 Pseudomonas, o toxina diftérica), una molécula de señal (tal como interferón α, interferón β, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador del plasminógeno tisular), un agente trombótico o un agente anti-angiogénico (por ejemplo, angiostatina o endostatina) o un modificador de la respuesta biológica tal como una citoquina o factor de crecimiento (por ejemplo, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante del crecimiento de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de 55 colonias de granulocitos (G-CSF), o factor de crecimiento de nervios (NGF)).

En otro ejemplo, los restos efectores pueden ser citotoxinas o agentes citotóxicos. Ejemplos de citotoxinas y agentes citotóxicos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, 60 mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

Los restos efectores incluyen también, pero no se limitan a estos, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbacina), agentes alquilantes (por ejemplo, 65 meclorestamina, tiotepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozocina, mitomicina C5 y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o duocarmicinas), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

5

Otros restos efectores pueden incluir radionúclidos tales como, pero sin limitarse a, 111In y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Tungsteno188/Renio188 y fármacos tales como, pero sin limitarse a alquilfosfocolinas, inhibidores de la topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Las técnicas para conjugar tales restos efectores con los anticuerpos se conocen bien en la técnica (véase, por 10 ejemplo, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2ª Ed., at pp. 623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).

En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF o un fragmento del mismo se fusiona por medio de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), a través del extremo N o el extremo C del anticuerpo o internamente, a una secuencia 15 de aminoácidos de otra proteína (o una parte de la misma; por ejemplo, al menos a una parte de 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína). El anticuerpo, o fragmento del mismo, puede unirse a otra proteína en el extremo N del dominio constante del anticuerpo. Se pueden utilizar procedimientos de ADN recombinante para crear tales fusiones, por ejemplo como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745. En otro ejemplo la molécula efectora puede aumentar la semivida in vivo, y/o aumentar el suministro de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al 20 sistema inmunitario. Ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas que se unen a albúminas o compuestos que se unen a albúminas tales como se describen en el documento WO 2005/117984.

En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-VEGF se conjuga con una toxina de molécula pequeña. En ciertas 25 realizaciones ejemplares, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se conjuga con dolastatina o análogos o derivados peptídicos de dolastatina, por ejemplo, una auristatina (Patentes de EE. UU. Nos 5.635.483 y 5.780.588). El resto farmacológico dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo por medio de su extremo N (amino), carboxilo (C) o internamente (documento WO 02/088172). Las realizaciones ejemplares de auristatina incluyen restos farmacológicos de monometilauristatina DE y DF, como se desvela en la Patente de EE. UU. Nº 7.498.298 30 (que desvela, por ejemplo, enlazadores y métodos para preparar compuestos de monometilauristatina tales como MMAE y MMAF conjugados con enlazadores).

En otras realizaciones ejemplares, las toxinas de molécula pequeña incluyen pero no se limitan a caliqueamicina, maitansina (Patente de EE. UU. Nº 5.208.020), tricoteno, y CC1065. En una realización de la divulgación, el 35 anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de maitansina (por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo). La maitansina puede, por ejemplo, convertirse en May-SS-Me que se puede reducir en May-SH3 y reaccionar con un anticuerpo (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131) para generar un conjugado de fusión anticuerpo-maitansinoide o Fc-maitansinoide. Los análogos estructurales de la caliqueamicina que también se pueden utilizar incluyen pero no se limitan a γ11, γ31, 40 PSAG, y θ11, (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928; Patente de EE. UU. Nº 5.714.586; Patente de EE. UU. Nº 5.712.374; Patente de EE. UU. Nº 5.264.586; Patente de EE. UU. Nº 5.773.001).

Los anticuerpos de la divulgación también se pueden conjugar con liposomas para un suministro dirigido (véase, por 45 ejemplo, Park et al., 1997, Adv. Pharmacol. 40:399-435; Marty & Schwendener, 2004, Methods in Molecular Medicine 109:389-401).

En un ejemplo, los anticuerpos de la presente divulgación se pueden unir a restos de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y los restos PEG se pueden unir por medio de 50 cualquier cadena lateral del aminoácido o grupo funcional de aminoácidos terminal que se localiza en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Tales aminoácidos del fragmento de anticuerpo pueden ser de origen natural o se pueden modificar en el fragmento utilizando métodos de ADN recombinante. Véase por ejemplo, la Patente de EE. UU. Nº 5.219.996. Se pueden utilizar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG. Los restos de PEG se pueden unir covalentemente por medio de un grupo tiol de al 55 menos un resto de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cuando se utiliza un grupo tiol como el punto de unión, se pueden utilizar restos efectores activados apropiadamente, por ejemplo derivados selectivos del tiol tales como derivados de maleimidas y cisteína.

En un ejemplo específico, un anticuerpo anti-VEGF conjugado es un fragmento modificado Fab’ que está PEGilado, 60 es decir, que tiene PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente, por ejemplo, según el método desvelado en el documento EP0948544. Véase también, Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); y Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam y A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); y 65 Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. El PEG se puede unir a una cisteína de la región bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab’ modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un único grupo tiol en una región bisagra modificada. Se puede unir covalentemente un resto de lisina al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina en el resto de lisina se puede unir a un polímero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab’ puede ser por lo tanto de aproximadamente 40.000 Da. 5

La palabra “marcador” cuando se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se puede conjugar directa o indirectamente a un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos, o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar una alteración química en un compuesto o composición de 10 sustrato que es detectable. Los restos fluorescentes útiles incluyen, pero no se limitan a estos, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilcloruro, ficoeritrina. Los marcadores enzimáticos útiles incluyen, pero no se limitan a estos, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano rusticano, glucosa oxidasa.

15

Conjugados de anticuerpo anti-VEGF adicionales que son útiles, inter alia, para fines diagnósticos, se describen en la Sección 6.7 posterior.

6.7 Usos diagnósticos de los anticuerpos anti-VEGF

20

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación, incluyendo los anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por biotinilación, peroxidasa de rábano rusticano, o cualquier otro resto detectable (incluyendo los descritos en la Sección 6.6), pueden utilizarse ventajosamente para fines diagnósticos.

En particular, los anticuerpos anti-VEGF se pueden utilizar, por ejemplo, pero sin limitación, para purificar o detectar 25 VEGF, incluyendo métodos diagnósticos tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo los anticuerpos son útiles en inmunoensayos para medir cualitativa y cuantitativamente los niveles de VEGF en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).

30

La presente divulgación engloba además anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un agente diagnóstico. Los anticuerpos se pueden utilizar diagnósticamente, por ejemplo, para detectar la expresión de una diana de interés en células, tejidos, o un suero específico; o para controlar el desarrollo o progresión de una respuesta inmunológica como parte del procedimiento de ensayo clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado. La detección se puede facilitar acoplando el anticuerpo a una sustancia 35 detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones que se utilizan en varias tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. La sustancia detectable se puede acoplar o conjugar o directamente al anticuerpo (o fragmento del mismo) o indirectamente por medio de un intermediario (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) 40 utilizando técnicas conocidas en la técnica. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de EE. UU. Nº 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como la peroxidasa de rábano rusticano (HRPO), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, acetilcolinesterasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales 45 como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa. Ejemplos de complejos de grupos prostéticos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina de fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye el luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen la luciferasa, luciferina, y aequorina; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados 50 incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

La divulgación proporciona la detección de la expresión de VEGF, que comprende poner en contacto una muestra biológica (células, tejidos, o fluidos corporales de un individuo) utilizando uno o más anticuerpos anti-VEGF de la divulgación (conjugados opcionalmente con un resto detectable), y detectar si la muestra es positiva a la expresión 55 de VEGF o no, o si se ha alterado la expresión en la muestra (por ejemplo, ha aumentado o disminuido) en comparación con una muestra de control.

Las enfermedades que se pueden diagnosticar utilizando los presentes métodos incluyen, pero no se limitan a las enfermedades descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, el tejido o fluido corporal es sangre 60 periférica, leucocitos de sangre periférica, tejidos de biopsia tales como biopsias pulmonares o de piel, y tejidos.

6.8 Métodos terapeúticos usando anticuerpos anti-VEGF

6.8.1 Beneficios clínicos 65

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación se pueden utilizar para tratar varias neoplasias o afecciones no neoplásicas que se caracterizan por angiogénesis patológicas.

Los anticuerpos de la divulgación son útiles en el tratamiento de tumores en los que la angiogénesis tiene un papel importante en el crecimiento tumoral, que incluye cánceres y tumores benignos. Ejemplos del cáncer que se trata en 5 el presente documento incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón de células escamosas), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo el cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer ovárico, 10 cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL), NHL linfocítico de células pequeñas (SL); NHL de grado medio/folicular; NHL difuso de grado medio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico 15 de alto grado; NHL de alto grado de células pequeñas no escindidas; NHL de enfermedad masiva; linfoma de células en mantel; linfoma relacionado con SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica aguda; y trastorno linfoproliferativo pos-trasplante (PTLD), así como una proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el que se asocia con tumores cerebrales), y síndrome de Meigs. Más particularmente, los cánceres 20 que son susceptibles de tratarse con los anticuerpos de la divulgación incluyen el cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no Hodgkin (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer ovárico, mesotelioma, y mieloma múltiple. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación se utilizan para tratar el cáncer colorrectal en un 25 paciente humano.

La presente divulgación engloba toda la terapia angiogénica, una estrategia de tratamiento del cáncer que tiene el fin de inhibir el desarrollo de los vasos sanguíneos tumorales que se necesitan para el aporte de nutrientes y el soporte del crecimiento tumoral. Debido a que la angiogénesis está implicada tanto en el crecimiento del tumor primario 30 como en la metástasis, el tratamiento antiangiogénico proporcionado por la divulgación es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico o del tumor en el sitio primario así como para prevenir la metástasis de tumores en sitios secundarios.

Las afecciones no neoplásicas que son susceptibles de tratamiento con los anticuerpos de la divulgación incluyen 35 las enfermedades retinianas (por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad) y enfermedades inmunitarias e inflamatorias (por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatías diabética y otras retinopatías proliferativas incluyendo la retinopatía del neonato prematuro, fibroplasia retrocristalina, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, hiperplasia tiroidea (incluyendo la enfermedad de Grave), trasplante corneal y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, pre-40 eclampsia, ascitis, derrame pericárdico (tal como el que se asocia con pericarditis), y derrame pleural.

En consecuencia, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de cualquiera de las enfermedades anteriores en un paciente que tiene necesidad de los mismos, que comprenden: la administración al paciente de un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación. Opcionalmente, dicha administración se repite, por ejemplo, después de un 45 día, dos días, tres días, cinco días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, ocho semanas, dos meses, o tres meses. La administración repetida puede ser con la misma dosis o con una dosis diferente. La administración se puede repetir una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más. Por ejemplo, de acuerdo con ciertos regímenes de tratamiento un paciente recibe terapia anti-VEGF durante un periodo prolongado de 50 tiempo, por ejemplo, 6 meses, 1 año o más. La cantidad del anticuerpo anti-VEGF que se administra al paciente es en ciertas realizaciones una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se utiliza en el presente documento una cantidad “terapéuticamente eficaz” de anticuerpo VEGF se puede administrar como una dosis única o en el curso de un régimen terapéutico, por ejemplo, en el curso de una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, tres meses, seis meses, un año, o más. Los regímenes terapéuticos ejemplares se describen en la Sección 6.11 posterior. 55

De acuerdo con la presente divulgación, el tratamiento de una enfermedad engloba el tratamiento de pacientes ya diagnosticados como que tienen cualquier forma de la enfermedad y en cualquier estadio o manifestación clínica; el retraso de la aparición o la evolución o agravamiento o deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o reducción de la gravedad de la enfermedad. 60

Un “sujeto” o “paciente” al que se administra el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación es preferentemente un mamífero tal como uno no primate (por ejemplo, una vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (por ejemplo, un mono o un ser humano). En ciertas realizaciones, el sujeto o paciente es un ser humano. En ciertos aspectos, el ser humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el ser humano es un paciente adulto. 65

6.9 Composiciones farmacéuticas y vías de administración

Se proporcionan en el presente documento, composiciones que comprenden un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación y, opcionalmente uno o más agentes terapéuticos, tales como los agentes terapéuticos de combinación descritos en la Sección 6.10 posterior. Las composiciones se suministrarán normalmente como parte de una 5 composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado para su administración al paciente).

Los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación se pueden administrar a un paciente por una variedad de vías tales 10 como vía oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intraocular, tópica, intratecal, e intracerebroventricular. La ruta más adecuada para la administración en un caso determinado dependerá del anticuerpo particular, el sujeto y la naturaleza y gravedad de la enfermedad y la condición física del sujeto.

Para el tratamiento de indicaciones distintas de las enfermedades retinianas, la dosis eficaz de un anticuerpo anti-15 VEGF de la divulgación puede variar desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 75 mg/kg por administración única (por ejemplo, en embolada), administraciones múltiples o administración continua, o para conseguir una concentración sérica de 0,01-5000 µg/ml por administración única (por ejemplo, en embolada), administraciones múltiples o administración continua, o cualquier intervalo o valor eficaz en el mismo que depende de la afección que se va a tratar, la vía de la administración y la edad, peso y condición del sujeto. En ciertas realizaciones, por 20 ejemplo, para el tratamiento del cáncer, cada dosis puede variar entre aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, por ejemplo de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 25 mg por kilogramo de peso corporal. El anticuerpo se puede formular como una solución acuosa y administrarse por inyección subcutánea.

25

Para el tratamiento de enfermedades retinianas (por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), la dosificación da como resultado una concentración adecuada en el humor acuoso del anticuerpo anti-VEGF en el ojo inyectado de 1-50 µ/ml. Para el tratamiento de AMD, cada dosis puede ser desde 0,1 mg a aproximadamente 1 mg, por ejemplo, desde aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5 mg. El anticuerpo se puede formular en una solución acuosa y administrarse por inyección intravítrea. 30

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unitaria que contengan una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación por dosis. Tal unidad puede contener por ejemplo pero sin limitación 0,1 mg a 5 g, por ejemplo 1 mg a 1g, o 10 a 50 mg. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso en la divulgación puede tener una amplia variedad de formas que dependen, por ejemplo, de 35 la afección que se va a tratar o la vía de administración.

Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación se pueden preparar para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que se emplean 40 típicamente en la técnica (a todos los cuales se les denomina “vehículos” en el presente documento), es decir, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes, y otra miscelánea de aditivos. Véase, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª edición (Osol, ed. 1980). Tales aditivos no deben ser tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.

45

Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden estar presentes en intervalos de concentración desde aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes tamponantes adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen ácidos tanto orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos tales como tampones de citrato (por ejemplo una mezcla de citrato monosódico – citrato disódico, mezcla de ácido cítrico – citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico – citrato monosódico, etc.), 50 tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico – succinato monosódico, mezcla de ácido succínico – hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico – succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, una mezcla de ácido tartárico – tartrato sódico, una mezcla de ácido tartárico – tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico – hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, una mezcla de ácido fumárico – fumarato monosódico, una mezcla de ácido fumárico – fumarato disódico, una mezcla de fumarato monosódico - fumarato 55 disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, una mezcla de ácido glucónico – gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico – hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico – gluconato potásico, etc.) tampones de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico – oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico – hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico – oxalato potásico, etc.), tampones lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico – lactato sódico, mezcla de ácido láctico – hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico – lactato potásico, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, 60 mezcla de ácido acético – acetato sódico, mezcla de ácido acético – hidróxido sódico, etc.). Adicionalmente, se pueden utilizar tampones de fosfato, tampones de histidina, y sales de trimetilamina tales como Tris.

Los conservantes que se pueden añadir para retardar el crecimiento microbiano, y se pueden añadir en cantidades que varían desde 0,2% -1% (p/v). Los conservantes adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen, 65 fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, Metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, hálidos de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro, y yoduro), cloruro de hexametonio, y alquilparabenos tales como el metil o el propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, y 3-pentanol. Los isotonificadores a veces llamados “estabilizantes” se pueden añadir para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente divulgación e incluyen alcoholes polihídricos de azúcares, por ejemplo, alcoholes de azúcares trihídricos o mayores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Estabilizantes se refiere a una amplia 5 categoría de excipientes que pueden variar de función desde un agente de volumen a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a evitar la desnaturalización o la adherencia a las paredes del envase. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes polihídricos de azúcares (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, 10 sorbitol, xilitol, ribitol, mionisitol, galactitol, glicerol, incluyendo ciclitoles tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen sulfuros, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglucolato de sodio, tioglicerol, α-monotioglicerol y sulfato tiosódico; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 restos o menos); proteínas tales como la seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona, monosacáridos tales como xilosa, manosa, 15 fructosa, glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacáridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizantes pueden estar presentes en el intervalo desde 0,1 a 10.000 partes por peso de proteína activa.

Se pueden añadir tensioactivos no iónicos o detergentes (también conocidos como “agentes humectantes”) para 20 ayudar a solubilizar el agente terapéutico así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por agitación, lo que permite también a la formulación exponerse a tensiones superficiales de cizalladura sin que se produzca la desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles pluriónicos, monoéteres de polietileno sorbitán (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de 25 aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Una miscelánea adicional de excipientes incluye agentes de volumen (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E), y cosolventes. 30

La formulación del presente documento puede contener también un agente terapéutico de combinación además del anticuerpo anti-VEGF de la divulgación. Ejemplos de agentes terapéuticos de combinación adecuados se proporcionan en la Sección 6.10 posterior.

35

La programación de la dosificación para la administración subcutánea puede variar entre una vez cada seis meses a diariamente dependiendo de factores clínicos, que incluyen el tipo de enfermedad, gravedad de la enfermedad, y la sensibilidad del paciente al anticuerpo anti-VEGF.

La dosificación de un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación que se va a administrar variará de acuerdo con el 40 anticuerpo particular, el tipo de enfermedad (por ejemplo, cáncer, inflamatoria, etc.), el sujeto, la gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un agente terapéutico de combinación), y la vía seleccionada para la administración; la dosificación apropiada la puede determinar fácilmente un experto en la técnica.

45

Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad y espacio de dosificaciones individuales óptimas de un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación, se determinará por la naturaleza y la extensión de la afección que se va a tratar, la forma, vía y sitio de administración, y la edad y condición del sujeto en particular que se va a tratar, y que un médico en último término determinará las dosificaciones adecuadas que se van a utilizar. Esta dosificación se puede repetir tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios la cantidad y/o frecuencia de 50 la dosificación se puede alterar o reducir, de acuerdo con la práctica clínica normal.

6.10 Terapia de combinación

Se describe a continuación métodos de combinaciones en los que se pueden utilizar los anticuerpos anti-VEGF de la 55 divulgación. Los métodos de combinaciones de la divulgación implican la administración de al menos dos agentes al paciente, el primero de los cuales es un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación, y el segundo de los cuales es un agente terapéutico de combinación. El anticuerpo anti-VEGF y el agente terapéutico de combinación se pueden administrar simultáneamente, secuencialmente o por separado.

60

Los métodos de terapia combinada de la presente divulgación pueden dar como resultado un efecto mayor que el de la suma, proporcionando beneficios terapéuticos cuando ni el anticuerpo anti-VEGF ni el agente terapéutico de combinación se administran en una cantidad que es terapéuticamente eficaz por sí sola.

En los métodos presentes, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación y el agente terapéutico de combinación se 65 pueden administrar concurrentemente, bien simultáneamente o sucesivamente. Como se utiliza en el presente documento, se dice que el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación y el agente terapéutico de combinación se administran sucesivamente si se administran al paciente el mismo día, por ejemplo, durante la misma visita del paciente. La administración sucesiva puede producirse con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas de separación. Por el contrario, se dice que el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación y el agente terapéutico de combinación se administran por separado si se administran al paciente en días diferentes, por ejemplo el anticuerpo anti-VEGF y el 5 agente terapéutico de combinación se pueden administrar con intervalos de 1 día, 2 días, o 3 días, una semana, 2 semanas o mensuales. En los métodos de la presente divulgación, la administración del anticuerpo anti-VEGF de la divulgación puede preceder o seguir a la administración del agente terapéutico de combinación.

Como ejemplo no limitante, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación y el agente terapéutico de combinación se 10 pueden administrar concurrentemente durante un periodo de tiempo, seguido por un segundo periodo de tiempo en el que la administración del anticuerpo anti-VEGF de la divulgación y el agente terapéutico de combinación se alternan.

Debido a los efectos potencialmente sinérgicos de la administración de un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación y 15 un agente terapéutico de combinación, tales agentes se pueden administrar en cantidades que, si uno o ambos agentes se administraran solos, no serían terapéuticamente eficaces.

En ciertos aspectos, el agente terapéutico de combinación es un agente anti-angiogénico, un fármaco anti-reumático, un agentes anti-inflamatorio, un agente quimioterápico, un radioterápico, un agente inmunosupresor, o un 20 fármaco citotóxico.

Se contempla que cuando se utiliza para tratar varias enfermedades, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación se pueden combinar con otros agentes terapéuticos adecuados para la misma o enfermedades similares. Cuando se utilizan para tratar el cáncer, los anticuerpos de la presente divulgación se pueden utilizar en combinación con 25 terapias convencionales contra el cáncer, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas.

En algunos otros aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia tumoral de combinación con el anticuerpo de la divulgación incluyen los antagonistas, por ejemplo, anticuerpos, de otros factores que están 30 implicados en el crecimiento tumoral, tales como EGFR, ErbB2 (también conocido como Her2), ErbB3, ErbB4, o TNF-α.

A veces, para el tratamiento de cánceres y enfermedades inmunitarias, puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. En una realización preferida el anticuerpo VEGF se co-administra con un agente 35 inhibidor del crecimiento.

Las dosis adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son las que se utilizan actualmente y que se pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo anti-VEGF.

40

Para el tratamiento de cánceres, enfermedades inmunitarias y enfermedades de retina, se pueden utilizar adecuadamente agentes anti-inflamatorios en combinación con los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación. Los agentes anti-inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, acetaminofeno, difenhidramina, meperidina, dexametasona, pentasa, mesalazina, asacol, fosfato de codeína, benorilato, fenbufeno, naprosin, diclofenaco, etodolaco e indometacina, aspirina e ibuprofeno. 45

Para el tratamiento de cánceres, se pueden utilizar adecuadamente agentes quimioterápicos en combinación con los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación. Los agentes quimioterápicos incluyen, pero no se limitan a, moléculas radioactivas, toxinas, también denominadas citotoxinas o agentes citotóxicos, que incluyen cualquier agente que es perjudicial para la viabilidad de las células, agentes y liposomas y otras vesículas que contienen compuestos 50 quimioterápicos. Ejemplos de agentes quimioterápicos adecuados incluyen pero no se limitan a 1-deshidrotestosterona, 5-fluorouracilo decarbazina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, un anticuerpo anti-α5β1 integrina, agentes alquilantes, alopurinol sódico, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, diaminocloro platino, antraciclinas, antibióticos, antimetabolitos, asparaginasa, BCG vivo (intravesical), fosfato de betametasona 55 sodica y acetato debetametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfan, leucovorín cálcico, claqueamicina, capecitabina, carboplatino, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), clorambucilo, cisplatino, cladribina, colchicina, estrógenos conjugados, ciclofosfamida, citarabina, citocalasina B, citoxan, dacarbazina, dactinomicina (llamada anteriormente actinomicina), daunorrubicina HCL, citrato de daunorrubicina, denileucina diftitox, dexrazoxano, dibromomanitol, dihidroxiantracindiona, docetaxel, mesilato de dolasetron, HCL de doxorrubicina, dronabinol, 60 asparaginasa de E. coli, eolociximab, emetina, epoetina-α, asparaginasa de Erwinia, estrógenos esterificados, estradiol, fosfato de estramustina sodio, bromuro de etidio, etinil estradiol, etidronato, etopósido de factor citrororum, fosfato de etopósido, filgrastim, floxuridina, Fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, flutamida, ácido folínico, HCL de gemcitabina, glucocorticoides, acetato de goserelina, gramicidina D, HCL de granisetron, hidroxiurea, HCL de idarrubicina, ifosfamida, interferón α-2β, HCL de irinotecan, letrozol, leucovorín calcio, acetato de leuprolida, HCL 65 de levamisol, lidocaína, lomustina, maitansinoide, HCL de mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, HCL de melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreotida, CHL de ondansetron, paclitaxel, pamidronato disódico, pentostatina, HCL de pilocarpina, plimicina, polifeprosan 20 con implante de carmustina, porfimer sódico, procaína, HCL de procarbazina, propranolol, rituximab, sargaramostim, estreptozocina, tamoxifeno, taxol, tenipósido, testolactona, tetracaína, tiotepa clorambucilo, tioguanina, HCL de tiotepa topotecan, citrato de toremifeno, 5 trastuzumab, tretinoina, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, y tartrato de vinorelbina.

Se puede utilizar cualquier agente anti-angiogénico en conjunción con los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación, incluyendo los enumerados por Carmeliet y Jain, 2000, Nature 407:249-257. En ciertas realizaciones, el agente anti-angiogénico es otro antagonista del VEGF o un antagonista del receptor del VEGF tales como variantes del VEGF, 10 fragmentos del receptor VEGF soluble, aptámeros capaces de bloquear el VEGF o VEGFR, anticuerpos neutralizantes VEGFR, inhibidores de bajo peso molecular o tirosina quinasas VEGFR y cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, o además, se pueden administrar al paciente dos o más anticuerpos anti-VEGF.

En ciertas realizaciones, se puede utilizar una terapia hormonal en conjunción con los anticuerpos anti-VEGF de la 15 divulgación. En algunas realizaciones, la terapia hormonal incluye uno o más agentes que inhiben estrógenos y/o progesterona que promueven el crecimiento celular tumoral, por ejemplo, un modulador selectivo del receptor estrogénico tal como el tamoxifeno, un inhibidor de la aromatasa tal como exemestano (Aromasin®), o un agente que inhibe la producción de estrógenos tal como la goserelina (Zoladex). En otras realizaciones, la terapia hormonal es uno o más agentes que inhiben la producción de hormonas por los ovarios. 20

En algunos aspectos, el anticuerpo anti-VEGF se puede utilizar en conjunción con un inhibidor de molécula pequeña de la proteína tirosina quinasa (PTK). En algunas realizaciones, el inhibidor de PTK es específico para un receptor VEGF tirosina quinasa. En otras realizaciones el inhibidor de la PTK se une a más de uno de los receptores VEGF de la familia de las tirosinas quinasas (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2). En otras realizaciones los inhibidores de 25 la proteína tirosina quinasa útiles en la composición y métodos de la invención incluyen inhibidores de la PTK que no se unen selectivamente a la familia de receptores VEGF de tirosina quinasa, sino que también se unen a los dominios tirosina quinasa de otras familias de proteínas tales como HER2, HER3, HER4, PDGFR, y/o Raf.

En algunas realizaciones, la tirosina quinasa es un receptor de tirosina quinasa, es decir, es un dominio intra-celular 30 de una proteína más grande que tiene un dominio de unión ligando extracelular y se activa por la unión de uno o más ligandos. En ciertas realizaciones, la proteína tirosina quinasa no es un receptor tirosina quinasa. Los inhibidores de la PTK para su uso en los métodos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a estos, gefitinib (ZD-1839, Iressa®), erlotinib (OSI-1774, Tarceva™), canertinib (CI-1033), vandetanib (ZD6474, Zactima®), tirfostina AG-825 (CAS 149092-50-2), lapatinib (GW-572016), sorafenib (BAY43-9006), AG-494 (CAS 133550-35-3), 35 RG-13022 (CAS 149286-90-8), RG-14620 (CAS 136831-49-7), BIBW 2992 (Tovok), tirfostina 9 (CAS 136831-49-7), tirfostina 23 (CAS 118409-57-7), tirfostina 25 (CAS 118409-58-8), tirfostina 46 (CAS 122520-85-8), tirfostina 47 (CAS 122520-86-9), tirfostina 53 (CAS 122520-90-5), buteina (1-(2,4-dihidroxifenil)-3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propen-1-ona 2’,3,4,4’-Tetrahidroxichalcona; CAS 487-52-5), curcumina ((E,E)-1,7-bis(4-Hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadieno-3,5-diona; CAS 458-37-7), N4-(1-Benzil- 1H-indazol-5-il)-N6,N6-dimethil-pirido-[3,4-d]-pirimidine-4,6-diamine (202272-68-40 2), AG-1478, AG-879, ácido Ciclopropanocarboxílico-(3-(6-(3-trifluorometil-fenilamino)-pirimidin-4-il amino)-fenil)-amida (CAS 879127-07-8), N8-(3-Chloro-4-fluorofenil)-N2-(1-metilpiperidin-4-il)-pirimido[5,4-d]pirimidine-2,8-diamine, 2HCl (CAS 196612-93-8), 4-(4-Benziloxianilino)-6,7-dimetoxiquinazolina (CAS 179248-61-4), N-(4-((3-Cloro-4-fluorofenil) amino) pirido [3,4-d]pirimidin-6-il)2-butinamida (CAS 881001-19-0), EKB-569, HKI-272, y HKI-357.

45

En otra realización específica, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se utiliza en combinación con quimioterapia intravenosa basada en 5-fluorouracilo. Esta combinación es adecuada, inter alia, para la primera o segunda línea de tratamiento del carcinoma metastático del colon o el recto.

En otra realización específica, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se utiliza en combinación con carboplatino y 50 paclitaxel. Esta combinación es adecuada para, inter alia, el tratamiento de primera línea de pacientes con cáncer de pulmón no operable, avanzado localmente, recurrente o metastático no de células escamosas, no de células pequeñas.

En otra realización específica, el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se utiliza en combinación con paclitaxel. 55 Esta combinación es adecuada para, inter alia, el tratamiento de pacientes que no han recibido quimioterapia para cáncer de mama metastático negativo a HER-2.

Para el tratamiento de enfermedades retinianas, los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación se pueden utilizar en la combinación con E10030, un aptámero pegilado anti factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), con 60 ARC1905, un aptámero pegilado dirigido al componente C5 de la cascada de complemento; y volociximab, un anticuerpo monoclonal que se dirige al receptor transmembrana α5β1 integrina; terapia fotodinámica con Visudyne® (PDT); o con Macugen®, un aptámero (pegatanib sódico).

65 6.11 Regímenes terapéuticos

La presente divulgación proporciona regímenes terapéuticos que implican la administración de los anticuerpos anti-VEGF de la divulgación. El régimen terapéutico variará dependiendo de la edad, peso y afección enfermedad del paciente. El régimen terapéutico puede continuar durante 2 semanas hasta indefinidamente. En realizaciones 5 específicas, el régimen terapéutico se continúa durante 2 semanas hasta 6 meses, desde 3 meses a 5 años, desde 6 meses a 1 o 2 años, desde 8 meses a 18 meses, o de manera similar. El régimen terapéutico puede ser un régimen de dosis no variable o un régimen de dosis múltiple variable.

Para los regímenes de dosificación ejemplares descritos posteriormente, el anticuerpo anti-VEGF se puede 10 administrar como una solución estéril libre de conservantes para administración subcutánea.

Para el tratamiento del cáncer colorrectal metastático, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se administra intravenosamente a una dosis de 0,5-15 mg/kg cada 2 semanas con IFL (régimen de irinotecán, 5-fluorouracilo y leucovorín) en embolada. En realizaciones específicas, la dosis es de 1-4 mg/kg, 2-6 mg/kg, 0,5-3 mg/kg, 1-10 15 mg/kg, 3-4,8 mg/kg o 1-4,5 mg/kg cada dos semanas con IFL en embolada.

En otra realización para el tratamiento del cáncer colorrectal metastático, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se administra por vía intravenosa a una dosis de 1-30 mg/kg cada dos semanas con FOLFOX4 (con un régimen de oxaliplatino, leucovorina, y fluorouracilo), En realizaciones específicas, la dosis es de 2-9 mg/kg, 3-12 mg/kg, 1-7,5 20 mg/kg, 2-20 mg/kg, 6-9,75 mg/kg o 4-9,5 mg/kg cada dos semanas con FOLFOX4.

Para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se administra por vía intravenosa a una dosis de 2-40 mg/kg cada tres semanas con carboplatino/paclitaxel, En realizaciones específicas, la dosis es de 5-14 mg/kg, 4-20 mg/kg, 10-17,5 mg/kg, 7-14 25 mg/kg, 10-30 mg/kg o 3-30 mg/kg cada tres semanas con carboplatino/paclitaxel.

Para el tratamiento de cáncer de mama metastático, un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación se administra por vía intravenosa a un dosis de 0,5-20 mg/kg cada dos semanas con paclitaxel, En realizaciones específicas, la dosis es de 1-4 mg/kg, 2-6 mg/kg, 0,5-3 mg/kg, 1-10 mg/kg, 3-4,8 mg/kg o 1-4,5 mg/kg cada dos semanas con paclitaxel. 30

Para el tratamiento de cáncer de mama metastático, se administra un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación por vía intravenosa a una dosis de 0,5-20 mg/kg cada dos semanas como monoterapia. En realizaciones específicas, la dosis es de 1-4 mg/kg, 2-6 mg/kg, 0,5-3 mg/kg, 1-10 mg/kg, 3-4,8 mg/kg o 1-4,5 mg/kg cada dos semanas como monoterapia. 35

Para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), se administra un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación a una dosis de 0,1-1 mg por inyección intravítrea una vez al mes (aproximadamente 28 días). En realizaciones específicas, la dosis es de 0,1-0,4 mg, 0,2-0,6 mg, 0,1-0,25 mg, 0,25-0,5 mg, 0,25-0,75 mg, o 0,3-0,45 mg por inyección intravítrea una vez al mes (aproximadamente 28 días). En una realización específica, un 40 paciente tratado con un anticuerpo anti-VEGF de la divulgación tiene AMD húmeda. En otra realización específica, un paciente tiene una AMD seca.

6.12 Kits de diagnóstico y farmacéuticos

45

Se engloban en la presente divulgación kits farmacéuticos que contienen los anticuerpos anti-VEGF (incluyendo anticuerpos conjugados) de la divulgación. El kit farmacéutico es un envase que comprende el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación (por ejemplo, en forma liofilizada o como una solución acuosa) y uno o más de los siguientes:

• Un agente terapéutico de combinación, por ejemplo como los descritos en la Sección 6.10 anterior. 50

• Un dispositivo para administrar el anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo, un inyector de pluma, una aguja y/o una jeringa; y

• Agua o tampón de calidad farmacéutica para resuspender el anticuerpo si el anticuerpo está en forma liofilizada.

55

En ciertos aspectos, cada dosis unitaria del anticuerpo anti-VEGF se envasa por separado, y un kit puede contener una o más dosis unitarias (por ejemplo, dos dosis unitarias, tres dosis unitarias, cuatro dosis unitarias, cinco dosis unitarias, ocho dosis unitaria, diez dosis unitarias, o más). En una realización específica, la una o más dosis unitarias se albergan cada una en una jeringa o inyección de pluma.

60

Los kits de diagnóstico que contienen los anticuerpos anti-VEGF (incluyendo los anticuerpos conjugados) de la divulgación también se engloban en el presente documento. El kit de diagnóstico es un envase que comprende el anticuerpo anti-VEGF de la divulgación (por ejemplo, o en forma liofilizada o como una solución acuosa) y uno o más reactivos útiles para llevar a cabo un ensayo diagnóstico. Cuando el anticuerpo anti-VEGF está marcado con una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores necesarios para la enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que 65 proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis). En ciertas realizaciones el anticuerpo anti-VEGF incluido en un kit de diagnóstico está inmovilizado en una superficie sólida, o se incluye en el kit una superficie sólida (por ejemplo un portaobjetos) en el que se puede inmovilizar el anticuerpo. Las cantidades relativas de varios reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En una realización específica, se pueden 5 proporcionar el anticuerpo y uno o más reactivos (individualmente o combinados) como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes en los que cuando se disuelven proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

7. Ejemplo 1: Identificación de los epítopos de células T del bevacizumab 10

7.1 Materiales y Métodos

7.1.1 Péptidos

15

Se sintetizaron los péptidos utilizando un formato multi-pin de Mimotopes (Adelaida, Australia). Las secuencias de las regiones V de cadena ligera y pesada del bevacizumab se sintetizaron como péptidos 15meros que se solapan en 12 aminoácidos (Tablas 3 y 4) para un total de 69 péptidos. Los péptidos se liofilizaron y se resuspendieron en DMSO (Sigma-Aldrich) a aproximadamente 1-2 mg/ml. Los péptidos de reserva se mantuvieron congelados a -20 ºC.

20

7.1.2 Células mononucleares humanas de sangre periférica

La comunidad de donantes de productos de la capa leucocitaria se consiguió en el Stanford Blood Center, Palo Alto, CA. El material de la capa leucocitaria se diluyó 1:1 v:v con DPBS que no contenía ni calcio ni magnesio. El material de la capa leucocitaria diluido (25-35 ml) se precipitó en tubos de centrífuga cónicos de 50 ml (Sarsted o Costar) con 25 12,5 ml de FicollPlaque-PLUS (GE Healthcare). Las muestras se centrifugaron a 900 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se recolectaron de la interfase. Se añadió DPBS para llegar a un volumen final de 50 ml y se centrifugaron las células a 350 g durante 5 minutos. Las células aglomeradas se resuspendieron en DPBS y se contaron.

30

7.1.3 Células dendríticas

Para aislar las células dendríticas, se sembraron en matraces de cultivo T75 (Costar) 108 PBMC recién aisladas con un volumen total de 30 ml de medio AIM V (Invitrogen). El exceso de PBMC se congeló a -80 ºC en un 90% de suero bovino fetal (FCS), un 10% de DMSO a 5 x 107 células/ml. Se incubaron los matraces T75 a 37 ºC en un 5% de CO2 35 durante 2 horas. Las células no adheridas se retiraron, y la monocapa adherida se lavó con DPBS. Para diferenciar las células dendríticas de los monocitos, se añadieron 30 ml de medio AIM V que contenía 800 unidades/ml de GM-CSF (R & D Systems) y 500 unidades/ml de IL-4 (R & D Systems). Los matraces se incubaron durante 5 días. El día 5 se añadieron IL-1α (Endogen) y TNF α (Endogen) a 50 pg/ml y 0,2 ng/ml. Los matraces se incubaron dos días más. El día 7, se recolectaron las células dendríticas por adición de 3 ml de 10 mM de EDTA que contenía 0,5 a 1,0 40 mg de Mitomicina C (Sigma-Aldrich) para una concentración final de 10 mM de EDTA y 16,5 a 33 µg/ml de Mitomicina C. Los matraces se incubaron una hora adicional a 37 ºC y un 5% de CO2. Se recolectaron las células dendríticas y se lavaron en medio AIM V 2-3 veces.

7.1.4 Cultivo celular 45

El día 7, las PBMC autólogas previamente congeladas se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 ºC. Se diluyeron inmediatamente las células en DPBS o medio AIM V y se centrifugaron a 350 g durante 5 minutos. Se enriquecieron las células CD4+ por selección negativa utilizando perlas magnéticas (kit Easy-Sep CD4+, Stem-Cell Technologies). Las células T CD4+ autólogas y las células dendríticas se co-cultivaron a 2 x 105 células T CD4+ por 2 50 x 104 células dendríticas por pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos (Costar 9077). Se añadieron los péptidos a aproximadamente 5 µg/ml. Los pocillos de control contenían el vehículo DMSO (Sigma) solo a 0,25% v:v. Los pocillos de control positivo contenían DMSO al 0,25% y toxoide tetánico (List Biologicals o CalBioChem) a 1 µg/ml. Los cultivos se cultivaron durante 5 días. El día 5, se añadieron 0,25 µCi de timidina tritiada por pocillo (Amersham o GE Healthcare). Los cultivos se recolectaron el día 6 de las mallas de filtro utilizando un recolector 55 celular Packard Filtermate. Se llevó a cabo el recuento de centelleo utilizando un contador de centelleo Wallac MicroBeta 1450 (Perkin Elmer).

7.1.5 Análisis de datos

60

Los valores CPM medios de fondo se calcularon promediando los resultados individuales de 6 a 12 repeticiones. Los valores CPM de los cuatro pocillos de control positivo se promediaron. Se replicaron o triplicaron pocillos para cada péptido y se promediaron. Los valores del índice de estimulación de los pocillos del control positivo y los péptidos se calcularon dividiendo los valores de CPM medios experimentales por los valores de control medios. Con el fin de incluirse en el grupo de datos, era necesario un índice de estimulación superior a 3,0 en los pocillos de control 65 positivo de toxoide tetánico. Se señalaba una respuesta para cualquier péptido que resultara en un índice de estimulación de 2,95 o más. Los péptidos se ensayaron utilizando muestras de sangre periférica de un grupo de 99 donantes. Se recopilaron las respuestas de todos los péptidos. Para cada péptido que se ensayó, se calculó el porcentaje del grupo del donante que respondía con un índice de estimulación de 2,95 o mayor. Además, se calculó también el promedio del índice de estimulación de todos los donantes.

5

7.2 Resultados

7.2.1 Identificación de epítopos de células T CD4+ en las regiones VH y VL del bevacizumab

Los epítopos peptídicos de células T CD4+ se identificaron por un análisis del porcentaje de respuestas a los 10 péptidos en el grupo de 99 donantes. El porcentaje medio de respuesta y la desviación estándar se calcularon para todos ensayos de los péptidos que describen las regiones V de la cadena pesada y ligera del bevacizumab. Una tasa de respuesta mayor o igual que la respuesta de fondo media más tres desviaciones estándar se consideraba un epítopo de células T CD4+ potencial. Para la región V de la cadena ligera del bevacizumab, se ensayaron 32 péptidos (Tabla 3) que daban un resultado de la media del porcentaje de la respuesta de fondo de 2,1 ± 2,7%. Se 15 determinó que tres desviaciones estándar por encima del fondo era un 10,2%. Un péptido en la posición 13 (Q40-T54) presentaba este nivel de respuesta en el grupo de datos de los péptidos de la cadena ligera del bevacizumab, con una tasa de respuesta del 15,2% (Figura 2A). Para la región V de la cadena pesada del bevacizumab, se ensayaron 37 péptidos (Tabla 4). El porcentaje medio de respuesta de fondo era de 2,8 ± 3,1%. Tres desviaciones estándar por encima del fondo era un 12,1%. Un péptido en el grupo de datos la cadena pesada del bevacizumab, nº 20 18 (N52-R56), alcanzaba un porcentaje de respuesta del 16,2% (Figura 3A). Un segundo péptido en la posición nº 30 del grupo de datos de la cadena pesada alcanzaba una tasa de respuesta del 9,1% y se consideró un epítopo debido a un aumento del índice de estimulación (véase a continuación).

Se calculó el índice de estimulación medio para todos los péptidos del grupo de datos. El péptido 13 de cadena 25 ligera teína un alto índice de estimulación de 1,82 ± 0,25 e.e.m (Figura 2B). El péptido de cadena pesada nº 18 tenía un valor medio del índice de estimulación de 2,16 ± 0,35 e.e.m. (Figura 3B). El péptido en la posición nº 30 devolvía un índice de estimulación medio de 1,45 ± 0,18 e.e.m (Figura 3B) debido a un índice de estimulación medio elevado y una tasa de respuesta media superior. El péptido en la posición nº 30 se incluyó cuando se determinó el contenido de epítopo de células T CD4+ de esta región V de anticuerpo. Todos estos valores del índice de estimulación son 30 significativamente más altos que el índice de estimulación medio de todos los péptidos en los dos grupos de datos (1,14 ± 0,07 de los 69 péptidos de la cadena pesada y ligera).

Estos datos indican que hay tres regiones de epítopos de células T CD4+ en las regiones V del bevacizumab (Tabla 5). En la región VL, se encuentra un epítopo en el péptido de la posición 13 que engloba la región marco conservada 35 2 y dos aminoácidos de CDR2. La secuencia contiene una retromutación (V46) insertada en la secuencia durante la humanización. En la tabla 5, los aminoácidos derivados de la CDR están subrayados. En la cadena pesada, se identificaron dos regiones de epítopos peptídicos. El epítopo más fuerte en la posición nº 18 engloba toda la CDR2. La segunda región de epítopo peptídico contiene aminoácidos tanto de la región marco conservada 3 como de la CDR3. 40

7.2.2 Variantes de inmunogenicidad reducida de las variantes de anticuerpo Bevacizumab

El bevacizumab se sometió a análisis mutacional (véase el Ejemplo 2, posteriormente). Basándose en estudios de unión al antígeno que se llevaron a cabo en conjunción con el análisis mutacional, se identificó un grupo de 45 sustituciones de aminoácidos candidatas en las regiones CDR-H2 y CDR-H3 que no tenían una afinidad significativamente reducida para el VEGF (Tabla 6). Se ensayaron estas sustituciones de aminoácidos individualmente y en combinación para identificar las variantes del bevacizumab con inmunogenicidad reducida en comparación con el anticuerpo de tipo silvestre.

50

8. Ejemplo 2: Identificación de variantes del bevacizumab con afinidad aumentada para el VEGF

Se sometió el anticuerpo bevacizumab a análisis mutacional completo para identificar mutantes que tenían un aumento de afinidad por el VEGF en comparación con el bevacizumab. El aumento de afinidad de los mutantes de alta afinidad candidatos para el VEGF en comparación con el bevacizumab se analizó por BIAcore para confirmar 55 sus características de unión.

8.1 Materiales y Métodos

8.1.1 BIAcore 60

Se clonaron quince variantes de construcciones de la región VH del bevacizumab junto con la región VL sin modificar en un plásmido que contenía IgG1 humana, que se expresaba en las líneas celulares 293T/17 por transfección transitoria, y anticuerpos purificados por afinidad con Proteína A o Proteína G. La afinidad de los anticuerpos para el VEGF (R&D systems, Minneapolis, MN) se determinó utilizando un sistema de resonancia de 65 plasmones superficiales BIAcore 2000 y 3000 (BIAcore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Primero se inmovilizó un anticuerpo policlonal Fc de cabra anti-humano (Jackson Immunoresearch) en la superficie de un biosensor utilizando los reactivos BIAcore de acoplamiento amino de referencia (N-etil-N’-dimetilamino-propilcarbodiimida, EDC; N-hidroxisuccinimida, NHS; y HCL de etanolamina, pH 8,5), seguido por la captura de los anticuerpos anti-VEGF (bevacizumab y variantes de bevacizumab) en superficies paralelas con una tasa de flujo lenta de 5 µl/min. La TF se 5 mantuvo baja para minimizar la avidez debido a la naturaleza dimérica del VEGF. No se hizo la captura del anticuerpo en la superficie de referencia para que sirviera como control negativo. Posteriormente, se inyectó el VEGF a todas las celdas de flujo con una tasa de flujo de 50 µl/min durante dos minutos para controlar la asociación seguida por un flujo de 25 minutos de tampón de ejecución HBS-P (10 mM de HEPES, 150 mM de cloruro sódico, 0,005% de P-20, pH 7,4) para controlar la fase de disociación. En cada ciclo, se inyectó la superficie, con 6 10 concentraciones diferentes de VEGF que variaban entre 0 nM y 512 nM y en incrementos de cuatro veces. Se regeneró la superficie con un 1,5% de H

8.2 Resultados

Los resultados se presentan como números absolutos y como veces de mejora sobre el tipo silvestre. Casi todas las 20 variantes enumeradas tienen tasas mejoradas de asociación (kon) y disociación (koff) en comparación con el bevacizumab tipo silvestre (Tabla 7). Los valores de afinidad finales de las variantes estaban en el intervalo de 0,1 nM y alcanzaba como mínimo 0,08 nM para la variante correspondiente con la SEC ID Nº 82. Estos valores contrastan con el bevacizumab que tenía una afinidad medida en estos experimentos de 1,9 nM.

25

Las Tablas 8 y 9 muestran variantes adicionales de cadena pesada que los estudios de unión preliminares mostraban que tenían una afinidad mayor para el VEGF que el bevacizumab (datos no mostrados). La Tabla 10 muestra variantes de cadena pesada que los estudios preliminares indicaban que tenían una afinidad por el VEGF similar al bevacizumab (datos no mostrados).

30

9. Ejemplo 3: Selección de las variantes peptídicas desinmunizadas

Se generaron las variantes peptídicas que corresponden con las regiones inmunogénicas del bevacizumab (véase el Ejemplo 1) (Tablas 14-16). Las variantes peptídicas se seleccionaron basándose en el análisis mutacional completo descrito en el Ejemplo 2, en el que se identificó que las modificaciones no reducían sustancialmente la afinidad de 35 unión del bevacizumab al VEGF.

Se sintetizaron y ensayaron un total de 77 péptidos basándose en los estudios de unión al antígeno, incluyendo dos síntesis de cada uno de los péptidos parentales 15méricos. Se ensayaron un total de 93 donantes con los péptidos parentales y variantes utilizando el método descrito en la Sección 7.1 y los resultados se muestran en las Figuras 40 4A-4C. En particular, las Figuras 4A-4C muestran las respuestas de las células T CD4+ a los epítopos peptídicos del bevacizumab mutante. Las respuestas medias de las secuencias del epítopo parental sin modificar se indican con marcas abiertas, Los círculos grandes indican péptidos seleccionados relacionados con la Tabla 17 (véase posteriormente). La Figura 4A muestra péptidos CDR2 VH; la Figura 4B muestra péptidos de CDR3 VH; y la Figura 4C muestra péptidos CDR2 VL. Los datos de inmunogenicidad para los péptidos seleccionados se muestran en la 45 Tabla 17.

Para los péptidos de CDR2 de la región variable de la cadena pesada, el porcentaje de respuesta media a los péptidos parentales en este estudio era del 5,38% y 6,45%. Tres péptidos mutantes demostraron una tasa de respuesta total y un índice de estimulación medio reducidos en comparación con los péptidos parentales. 50

Las tasas de respuesta del péptido parental para los epítopos peptídicos CDR3 de la región variable de la cadena pesada en este estudio eran del 7,53% y 6,45%. Se encontró una secuencia peptídica mutante única que demostraba que reducía las respuestas totales en comparación con el péptido parental.

55

Finalmente, las tasas de respuesta del péptido parental de la CDR2 de la región variable de la cadena ligera en este estudio eran del 25,8% y 15%. Se identificó un péptido mutante que demostraba una inmunogenicidad total reducida en comparación con el péptido parental.

Para demostrar que las mutaciones desinmunizadas mantenían la afinidad por el VEGF en comparación con el 60 bevacizumab, se utilizó la citometría de flujo para comparar las propiedades de unión de las variantes de anticuerpo incorporando mutaciones en los epítopos peptídicos modificados (sea como modificaciones de aminoácidos simples o dobles y bevacizumab). Varias mutaciones desinmunizadas tenían una afinidad comparable o aumentada por el VEGF en comparación con el bevacizumab.

65

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de unión anti-VEGF de un anticuerpo que comprende seis CDR que tienen una o más sustituciones de aminoácidos o combinaciones de sustituciones de aminoácidos en comparación con un anticuerpo anti-VEGF de referencia o un fragmento de unión a antígeno anti-VEGF de referencia que tiene 5 CDR que tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a la SEQ ID NO: 3 (CDR-H1), la SEQ ID NO: 4 (CDR-H2), la SEQ ID NO: 5 (CDR-H3), la SEQ ID NO: 6 (CDR-L1), la SEQ ID NO: 7 (CDR-L2) y la SEQ ID NO: 8 (CDR L3), en el que dichas una o más sustituciones de aminoácidos o combinaciones de sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre:

   10

   (i) la sustitución de CDR-H2 K64S;

   (ii) la sustitución de CDR-H2 K64Q;

   (iii) las sustituciones de CDR-H2 Y53F y K64Q;

   (iv) las sustituciones de CDR-H2 Y53F y K64S;

   (v) la sustitución de CDR-H3 H97E; 15

   (vi) la sustitución de CDR-H3 Y98F;

   (vii) las sustituciones de CDR-H3 H97E y Y98F;

   (viii) las sustituciones de CDR-H3 H97P y Y98F;

   y opcionalmente la sustitución de CDR-L2 T51A, 20

   en el que las sustituciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat.
2. 2. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes secuencias:

   una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3); 25

   una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T Y T G E P T Y A A D F S R;

   una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P H Y Y G S S H W Y F D V (SEQ ID NO: 5);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F T S S L H S (SEQ ID NO: 7); y

   una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8). 30
3. 3. El anticuerpo monoclonal anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes secuencias:

   una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T Y T G E P T Y A A D F Q R; 35

   una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P H Y Y G S S H W Y F D V (SEQ ID NO: 5);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F T S S L H S (SEQ ID NO: 7); y

   una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8).

   40
4. 4. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes secuencias:

   una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T F T G E P T Y A A D F Q R;

   una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P H Y Y G S S H W Y F D V (SEQ ID NO: 5); 45

   una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F T S S L H S (SEQ ID NO: 7); y

   una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8).
5. 5. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes 50 secuencias:

   una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T Y T G E P T Y A A D F K R (SEQ ID NO: 4);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P E Y Y G S S H W Y F D V;

   una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6); 55

   una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F T S S L H S (SEQ ID NO: 7); y

   una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8).
6. 6. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes secuencias: 60

   una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I NT Y T G E P T Y A A D F K R (SEQ ID NO: 4);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P P F Y G S S H W Y F D V;

   una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F T S S L H S (SEQ ID NO: 7); y 65

   una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8).
7. 7. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes secuencias:

   una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T Y T G E P T Y A A D F K R (SEQ ID NO: 4);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P E F Y G S S H W Y F D V; 5

   una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F T S S L H S (SEQ ID NO: 7); y

   una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8).
8. 8. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes 10 secuencias:

   una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T Y T G E P T Y A A D F S R;

   una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P H Y Y G S S H W Y F D V (SEQ ID NO: 5);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6); 15

   una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F A S S L H S (SEQ ID NO: 387); y

   una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8).
9. 9. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes secuencias: 20

   una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3);

   una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T Y T G E P T Y A A D F Q R;

   una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P H Y Y G S S H W Y F D V (SEQ ID NO: 5);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6);

   una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F A S S L H S (SEQ ID NO: 387); y 25

   una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8).
10. 10. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes secuencias:

    una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3); 30

    una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T F T G E P T Y A A D F Q R;

    una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P H Y Y G S S H W Y F D V (SEQ ID NO: 5);

    una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6);

    una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F A S S L H S (SEQ ID NO: 387); y

    una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8). 35
11. 11. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de la reivindicación 1 que comprende las siguientes secuencias:

    una secuencia de aminoácidos CDR-H1 de G Y T F T N Y G M N (SEQ ID NO: 3);

    una secuencia de aminoácidos CDR-H2 de W I N T Y T G E P T Y A A D F K R (SEQ ID NO: 4); 40

    una secuencia de aminoácidos CDR-H3 de Y P E F Y G S S H W Y F D V;

    una secuencia de aminoácidos CDR-L1 de S A S Q D I S N Y L N (SEQ ID NO: 6);

    una secuencia de aminoácidos CDR-L2 de F A S S L H S (SEQ ID NO: 387); y

    una secuencia de aminoácidos CDR-L3 de Q Q Y S T V P W T (SEQ ID NO: 8).

    45
12. 12. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que es:

    (i) un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión anti-VEGF de un anticuerpo monoclonal, respectivamente; y/o

    (ii) un anticuerpo humanizado o fragmento de unión anti-VEGF de un anticuerpo humanizado, respectivamente.

    50
13. 13. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que es una IgG, opcionalmente una IgG1 o una IgG2.
14. 14. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que:

    (i) incluye una o más mutaciones en la región Fc que aumentan la actividad ADCC; 55

    (ii) no está fucosilado; y/o

    (iii) incluye una o más mutaciones en la región Fc que o aumentan la unión a FcγR o aumentan la unión a FcRn.
15. 15. El anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que tiene otras distintas de dichas una o más mutaciones, (i) una secuencia VH que corresponde a la SEQ ID NO: 1 y 60 una secuencia VL que corresponde a la SEQ ID NO: 2; o (ii) una secuenciad VH que corresponde a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia VL que corresponde a la SEQ ID NO: 10.
16. 16. Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. 65
17. 17. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o un conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. 18. Un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 1 a 15, un conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 16 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17, para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente humano, opcionalmente en el que el cáncer es un carcinoma metastático del colon, un carcinoma metastático del recto, un cáncer de pulmón no microcítico de células no escamosas o un cáncer de mama metastático negativo para HER2, opcionalmente además en el que el cáncer de pulmón no microcítico de células no escamosas es inoperable, avanzado localmente, 10 recurrente o metastático.
19. 19. Un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión anti-VEGF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, un conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 16 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17, para su uso en el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad 15 o un trastorno inmunitario en un paciente humano, opcionalmente en el que el trastorno inmunitario es la artritis reumatoide o la enfermedad de Grave.