TWI510248B - 抗－ｖｅｇｆ抗體及其用途 - Google Patents

Description

抗-VEGF抗體及其用途

本發明係關於抗VEGF抗體、包含抗VEGF抗體之醫藥組合物及此等抗體之治療用途。

相關申請案之交叉參考

本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張2009年6月17日申請之美國臨時申請案第61/218,005號的權利，該臨時申請案之內容以全文引用的方式併入本文中。

血管生成已由於其與各種病理學病狀有關而成為有吸引力的治療標靶，該等病理學病狀包括腫瘤生長、增生性視網膜病、年齡相關之黃斑部變性、類風濕性關節炎(RA)及牛皮癬(Folkman等人，1992,J. Biol. Chem. 267:10931-10934)。特異性分子血管生成因子之第一指示係基於對由移殖腫瘤誘導之強烈新生血管反應的觀察結果。目前已知血管生成為大多數原發腫瘤之生長及其後續轉移所必需。此後眾多分子已與血管生成之正調控相關聯，該等分子包括轉化生長因子(TGF)-α、TGF-β、肝細胞生長因子(HGF)、腫瘤壞死因子-α、血管生成素、介白素(IL)-8及血管內皮生長因子(VEGF，亦稱為VEGFA或血管通透性因子(vascular permeability factor，VPF))(Ferrara等人，2003,Nature Medicine 9:669-676)。

VEGF蛋白質為與正常胚胎血小管生成(胚胎循環系統之重新形成)及異常血管生成(來自已存在之血管結構之血管的生長)兩者有關之重要信號傳導蛋白質(Ferrara等人，1996,Nature 380:439-442；Dvorak等人，1995,Am. J. Pathol. 146:1029-1039)。VEGF與實體腫瘤及血液科惡性疾病、眼間新生血管症候群、炎症及腦水腫以及雌性生殖道病變相關(Ferrara等人，2003,Nature Medicine 9:669-676)。VEGF mRNA在許多人類腫瘤中過度表現，該等人類腫瘤包括肺、乳房、胃腸道、腎、胰臟及卵巢之腫瘤(Berkman等人，1993,J. Clin. Invest. 91:153-159)。VEGF在眼睛之水狀液及玻璃狀液中之增加已與各種視網膜病相關聯(Aiello等人,1994,N. Engl. J. Med. 331:1480-1487)。年齡相關之黃斑部變性(AMD)，即老年人視力喪失之一種主要原因，係歸因於新血管生成及血管滲漏。已證明在患者中VEGF在脈絡膜新生血管膜中之定位受AMD影響(Lopez等人，1996,Invest. Ophtalmo.Vis. Sci. 37:855-868)。

VEGF基因家族包括原型成員VEGFA以及VEGFB、VEGFC、VEGFD及胎盤生長因子(PLGF)。人類VEGFA基因經組織成由七個內含子隔開之八個外顯子。存在VEGF之至少六種不同的同功異型物：VEGF₁₂₁ 、VEGF₁₄₅ 、VEGF₁₆₂ 、VEGF₁₆₅ 、VEGF_165b 、VEGF₁₈₃ 、VEGF₁₈₉ 及VEGF₂₀₆ ，其中下標係指在信號裂解之後所剩餘之胺基酸數目。天然VEGF為45 kDa同源二聚肝素結合醣蛋白(Ferrara等人，2003,Nature Medicine 9:669-676)。VEGF(特定言之為VEGFA)結合至兩種相關受體酪胺酸激酶VEGFR-1(亦稱為Flt-1)及VEGFR-2(亦稱為Flk-1或激酶結構域區(KDR)或CD309)。各受體皆具有七個細胞外區域及一個跨膜區域。VEGF亦結合至神經纖毛蛋白NRP1(亦稱為血管內皮細胞生長因子165受體(VEGF165R)或CD304)及NRP2(亦稱為血管內皮細胞生長因子165受體2(VEGF165R2))。

考慮到VEGF在調控血管生成方面之重要作用，其向治療性干預提供一種有吸引力的標靶。實際上，當前正在開發各種旨在阻斷VEGF或其受體信號傳導系統之治療策略用於治療贅生性疾病。抗VEGF抗體貝伐單抗(bevacizumab)，亦稱為rhuMAb VEGF或，為一種由Genentech製造且出售之重組人類化抗VEGF單株抗體(Presta等人，1997,Cancer Res. 57:4593-4599)。為了建構貝伐單抗，將鼠類抗VEGF單株抗體A.4.6.1之互補決定區(CDR)接枝於人類構架及IgG恆定區上。接著除CDR以外將額外突變引入分子中以改良結合，提供約93%之胺基酸序列源自人類IgG₁ 且約7%之序列源自鼠類抗體A.4.6.1的抗體。貝伐單抗之分子質量為約149,000道爾頓且經糖基化。

蘭尼單抗(Ranibizumab)為一種源自貝伐單抗之親和力成熟的Fab片段。蘭尼單抗對VEGF具有較高親和力且尺寸亦較小，此允許其更好地穿透視網膜，且因而治療與AMD相關之眼部新血管生成(Lien及Lowman,Chernajovsky,2008,Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology 181,Springer-Verlag,Berlin Heidelberg 131-150)。蘭尼單抗由Genentech開發且以商標名出售。

用包括之方案治療癌症患者會導致副作用，包括高血壓、蛋白尿、血栓栓塞事件(thromboembolic event)、出血及心臟毒性(cardiac toxicity)(Blowers及Hall,2009,Br. J. Nurs. 18(6):351-6,358)。又，儘管貝伐單抗為人類化抗體，但其在投與人類時會引起免疫反應。此類免疫反應會導致在免疫複合物介導下自循環中清除抗體或片段，且使得重複投藥不適用於治療，藉此降低對患者之治療益處且限制抗體之再投與。

因此，需要提供能克服一或多個此等問題之改良抗VEGF抗體或片段，例如藉由產生可以減低之劑量投與的親和力高於貝伐單抗之變異體或相較於貝伐單抗免疫原性及其他副作用有降低之變異體來達成。

「先前技術」章節中或本申請案之任何其他章節中對任何參考文獻的引用或標識不應理解為承認此參考文獻可用作本發明之先前技術。

本發明係關於相較於貝伐單抗或蘭尼單抗，免疫原性有降低及/或對VEGF之親和力有改良的抗VEGF抗體貝伐單抗之變異體。貝伐單抗具有三個重鏈CDR，在本文中(按胺基至羧基端之順序)稱為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；及三個輕鏈CDR，在本文中(按胺基至羧基端之順序)稱為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。貝伐單抗CDR之序列展示於圖1A及圖1B中，且其編號列於表1(關於重鏈CDR)及表2(關於輕鏈CDR)中。經由使貝伐單抗親和力成熟來產生一種相關抗體蘭尼單抗。蘭尼單抗具有與貝伐單抗一致之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及CDR-H2序列，但是其CDR-H1及CDR-H3序列不同於貝伐單抗。蘭尼單抗之重鏈及輕鏈序列展示於圖1C中，且CDR展示於圖1D中。

本發明抗體相較於貝伐單抗及蘭尼單抗一般在至少一個重鏈CDR中具有至少一個胺基酸取代。

在某些態樣中，抗VEGF抗體相較於貝伐單抗或蘭尼單抗包括至少一個選自以下之取代：CDR-H1中之N31F、CDR-H2中之K64S、CDR-H2中之K64Q、CDR-H2中之Y53F、CDR-H3中之H97E、CDR-H3中之H97D、CDR-H3中之H97P、CDR-H3中之Y98F、CDR-H3中之Y99E、CDR-H3中之Y99D、CDR-H3中之S100aG及CDR-L2中之T51A。在其他態樣中，抗VEGF抗體包括至少一個選自表8及9之取代。可併入親和力有改良之變異抗體中的額外突變可為候選去免疫取代(deimmunizing substitution)，諸如彼等列示於表6中者；以及其他突變，例如不會破壞抗體結合至VEGF之能力的取代，包括(但不限於)列示於表10及11中之突變，或已知突變，諸如列示於表12-1至12-9及13中之突變。可合併之其他突變包括(但不限於)列示於表14-16中之突變。

在特定實施例中，本發明之抗VEGF抗體包括選自表7之取代及視情況存在之一或多個額外突變的組合，該等額外突變為例如候選去免疫取代，諸如彼等列示於表6中者；以及其他突變，例如不會破壞抗體結合至VEGF之能力的取代，包括(但不限於)列示於表10及11中之突變，或已知突變，諸如列示於表12-1至12-9及13中之突變。可併入本發明之抗VEGF抗體中的其他突變包括(但不限於)列示於表14-16中之突變。

在其他實施例中，本發明之抗VEGF抗體包括一或多個下列CDR取代：K64S(CDR-H2)、K64Q(CDR-H2)、Y53F及K64Q(CDR-H2)、H97E及Y98F(CDR-H3)或T51A(CDR-L2)。抗VEGF抗體亦可視情況包括一或多個額外突變或突變之組合，該等突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1至12-9或13-16中之一或多者。

其他CDR取代可包括N31F(CDR-H1)、H97E(CDR-H3)、H97D(CDR-H3)、H97P(CDR-H3)、Y99E(CDR-H3)、Y99D(CDR-H3)、S100aG(CDR-H3)(其中CDR-H3中之位置3視情況不為酪胺酸)、T28P、N31F、N31G及N31M(CDR-H1)；H97A、H97Q、H97S、H97T、S100aD、S100aE及S100Av(CDR-H3)；T30W、T30R或T30Q(CDR-H1)；Y53F、T58F、A61G、A61K、A61R、A61H、A61Y、K64G、K64E、R65L、R65T、R65A、R65E及R65D(CDR-H2)；及Y98F及Y100eF(CDR-H3)。CDR視情況含有一或多個額外突變或突變之組合，該等突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1至12-9及13中之一或多者。

其他取代可包括重鏈CDR取代，包括選自以下之取代的組合：(a)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97D、於CDR-H3中之Y99D、及於CDR-H3中之S100aG；(b)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97P、於CDR-H3中之Y99D、及於CDR-H3中之S100aG；(c)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97P、及於CDR-H3中之Y99E；(d)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97E、及於CDR-H3中之Y99E；(e)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97D、及於CDR-H3中之Y99E；(f)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97E、於CDR-H3中之Y99D、及於CDR-H3中之S100aG；(g)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之Y99D、及於CDR-H3中之S100aG；(h)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97P、及於CDR-H3中之Y99D；(i)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97D、及於CDR-H3中之S100aG；(j)於CDR-H1中之N31F及於CDR-H3中之S100aG；或(k)於CDR-H1中之N31F、於CDR-H3中之H97P及於CDR-H3中之S100aG。其他視情況存在之取代可包括一或多個額外突變或突變之組合，該等突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1至12-9及13中之一或多者。

其他重鏈取代可包括至少一個選自以下之取代：於CDR-H2中之A61F、於CDR-H2中之A61E、於CDR-H2中之A61D、於CDR-H2中之D62L、於CDR-H2中之D62G、於CDR-H2中之D62Q、於CDR-H2中之D62T、於CDR-H2中之D62K、於CDR-H2中之D62R、於CDR-H2中之D62E、於CDR-H2中之D62H、於CDR-H2中之K64S、於CDR-H2中之K64V、於CDR-H2中之K64Q、於CDR-H2中之R65V、於CDR-H2中之R65F、於CDR-H2中之R65H、於CDR-H2中之R65N、於CDR-H2中之R65S、於CDR-H2中之R65Q、於CDR-H2中之R65K、於CDR-H2中之R651及於CDR-H3中之Y98H。視情況而定，可包括一或多個額外突變或突變之組合，該等突變選自表7、8、9、10、11、12-1至12-9及13中之一或多者。

在某些態樣中，本發明抗體具有與貝伐單抗或蘭尼單抗之V_H 及V_L 序列具有至少80%序列一致性(且在某些實施例中，具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性)的V_H 及V_L 序列，且相較於貝伐單抗或蘭尼單抗在至少一個CDR中包括至少一個胺基酸取代。在其他態樣中，本發明抗體具有與貝伐單抗或蘭尼單抗之V_H 及V_L 序列具有至少80%序列一致性(且在某些實施例中，具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性)的V_H 及V_L 序列，且相較於貝伐單抗或蘭尼單抗在至少一個構架區中包括至少一個胺基酸取代。在特定實施例中，相較於貝伐單抗或蘭尼單抗之V_H 及V_L 序列，重鏈及輕鏈的序列一致性百分比獨立地選自至少80%、至少85%、至少90%、至少95%序列一致性或至少99%序列一致性。在某些態樣中，本發明抗體具有與貝伐單抗或蘭尼單抗之V_H 及/或V_L 序列具有至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的V_H 及/或V_L 序列。

在某些態樣中，本發明抗體相較於貝伐單抗或蘭尼單抗在其CDR中具有至多17個胺基酸取代。保持標靶結合能力之具有17個胺基酸取代的變異抗體已根據Bostrom等人，2009,Science 323:1610-14而產生。

在特定實施例中，本發明之抗VEGF抗體獨立地具有：

‧　相較於貝伐單抗或蘭尼單抗之相應CDR，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個、至多九個或至多十個CDR-H1取代；

‧　相較於貝伐單抗或蘭尼單抗之相應CDR，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個、至多九個、至多十個、至多十一個、至多十二個、至多十三個、至多十四個、至多十五個、至多十六個或至多十七個CDR-H2取代；

‧　相較於貝伐單抗或蘭尼單抗之相應CDR，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個、至多九個、至多十個、至多十一個、至多十二個、至多十三個或至多十四個CDR-H3取代；

‧　相較於貝伐單抗或蘭尼單抗之相應CDR，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個、至多九個、至多十個或至多十一個CDR-L1取代；

‧　相較於貝伐單抗或蘭尼單抗之相應CDR，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個或至多七個CDR-L2取代；及

‧　相較於貝伐單抗或蘭尼單抗之相應CDR，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個或至多九個CDR-L3取代。

本發明進一步提供包含經修飾之抗VEGF抗體的醫藥組合物。在一些態樣中，醫藥組合物相較於貝伐單抗或蘭尼單抗，對VEGF之親和力增加及/或免疫原性有降低。

本文提供包含編碼本發明之抗VEGF抗體之核苷酸序列的核酸以及包含該等核酸之載體。另外，本文提供用包含編碼抗VEGF抗體之核苷酸序列之載體轉型的原核及真核宿主細胞，以及經工程改造而表現該等核苷酸序列之真核(諸如哺乳動物)宿主細胞。亦提供藉由培養宿主細胞產生抗VEGF抗體之方法。

本發明之抗VEGF抗體適用於治療癌症(例如結腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌及乳癌)、視網膜疾病(例如年齡相關之黃斑部變性(「AMD」))及免疫病症(例如類風濕性關節炎)。

在某些態樣中，本發明之抗VEGF抗體相較於貝伐單抗或蘭尼單抗可以減低之劑量使用，例如為減低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之劑量。

應注意，本申請案中使用不定冠詞「一」及定冠詞「該(等)」，如在專利申請案中所常見一般，除非上下文另有明確指示，否則意謂一或多個(種)。此外，本申請案中使用術語「或」，如在專利申請案中所常見一般，意謂轉折詞(disjunctive)「或」或連接詞(conjunctive)「及」。

本說明書中提及之所有公開案皆以引用的方式併入本文中。有關已包括在本說明書中之文獻、條例、材料、裝置、物品或其類似者之任何論述僅用於為本發明提供背景。不應視為承認任何或所有此等內容構成先前技術基礎之一部分或為與本發明相關之領域中的普通常識，因為其在本申請案之優先日期之前已處處存在。

根據以下關於本發明之實施例的實施方式，本發明之特徵及優點將變得更顯而易見。

6.1　抗VEGF抗體

本發明提供抗VEGF抗體。除非另有指示，否則術語「抗體」(Ab)係指可特異性結合至特定抗原或與特定抗原起免疫反應之免疫球蛋白分子，且包括多株抗體、單株抗體、經基因工程改造之抗體及以其他方式修飾之形式的抗體，包括(但不限於)嵌合抗體、人類化抗體、異源結合抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體)及抗體之抗原結合片段(包括例如Fab'、F(ab')₂ 、Fab、Fv、rIgG及scFv片段)。此外，除非另有指示，否則術語「單株抗體」(mAb)意謂包括完整分子以及能夠特異性結合至蛋白質之抗體片段(諸如Fab及F(ab')₂ 片段)兩者。Fab及F(ab')₂ 片段缺乏完整抗體之Fc片段，自動物循環系統中清除之速度較快速，且可具有比完整抗體低之非特異性組織結合性(Wahl等人，1983,J. Nucl. Med. 24:316)。

術語「scFv」係指單鏈Fv抗體，其中來自傳統抗體之重鏈及輕鏈之可變域已經接合形成一條鏈。

提及「V_H 」係指抗體之免疫球蛋白重鏈(包括Fv、scFv或Fab之重鏈)可變區。提及「V_L 」係指免疫球蛋白輕鏈(包括Fv、scFv、dsFv或Fab之輕鏈)可變區。抗體(Ab)及免疫球蛋白(Ig)為具有相同結構特徵之醣蛋白。儘管抗體展現對特定標靶之結合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體與其他缺乏標靶特異性之抗體樣分子兩者。天然抗體及免疫球蛋白通常為約150 KDa之異源四聚醣蛋白，其由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈構成。各重鏈在胺基末端具有可變域(V_H )，其後為若干個恆定域。各輕鏈在胺基末端具有可變域(V_L )且在羧基末端具有恆定域。

本發明之抗VEGF抗體在細胞內結合至人類VEGF且抑制VEGF受體活性。

本發明之抗VEGF抗體含有在序列上與抗體貝伐單抗(亦稱為)及/或蘭尼單抗(亦稱為)之CDR相關的互補決定區(CDR)。

CDR亦稱為輕鏈及重鏈可變域兩者中之高變區。可變域之較為高度保守的部分被稱為構架(FR)。如此項技術中所知，界定抗體高變區之胺基酸位置/邊界可變化，視此項技術中已知之情形及各種定義而定。可變域內之一些位置可視為雜合高變位置，因為此等位置在一組準則下可視為在高變區內而在一組不同的準則下可視為在高變區外部。一或多個此等位置亦可存在於擴展之高變區中。本發明提供在此等雜合高變位置處包含修飾之抗體。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個主要採用β摺疊構型、經由三個CDR連接之FR區，該等CDR形成連接β摺疊結構之環，且在一些情況下形成β摺疊結構之一部分。各鏈中之CDR經由FR區按順序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4緊密地固持在一起，且與另一鏈之CDR一起促使抗體之標靶結合位點形成(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md. 1987))。除非另有指示，否則如本文所用，對免疫球蛋白胺基酸殘基之編號係根據Kabat等人之免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統來進行。

貝伐單抗之重鏈及輕鏈可變區序列分別以SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2表示。重鏈及輕鏈可變區序列亦顯示於圖1A中。貝伐單抗之CDR序列及其相應標識符呈現於圖1B中。編碼SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之任何核苷酸序列可用於本發明之組合物及方法中。

蘭尼單抗之重鏈及輕鏈序列分別以SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10表示。重鏈及輕鏈序列亦顯示於圖1C中。蘭尼單抗之CDR序列及其相應標識符呈現於圖1D中。編碼SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之任何核苷酸序列可用於本發明之組合物及方法中。

本發明進一步提供包含與貝伐單抗及蘭尼單抗之CDR序列相關之CDR序列的抗VEGF抗體片段。術語「抗體片段」係指全長抗體之一部分，一般為標靶結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')₂ 及Fv片段。「Fv」片段為含有完整標靶識別位點及結合位點之最小抗體片段。此區域由一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域緊密、非共價締合之二聚體(V_H -V_L 二聚體)組成。正是在該構型中各可變域之三個CDR相互作用以在VH-VL二聚體表面上界定標靶結合位點。六個CDR常賦予抗體標靶結合特異性。然而，在有些情況下，甚至單個可變域(或僅包含三個對標靶具有特異性之CDR的Fv之一半)亦可具有識別且結合標靶之能力。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含呈單一多肽鏈之抗體的V_H 及V_L 結構域。一般而言，F_v 多肽進一步包含介於V_H 與V_L 結構域之間使scFv能夠形成標靶結合所需之結構的多肽連接子。「單域抗體」由對標靶展現足夠親和力之單一V_H 或V_L 結構域構成。在一特定實施例中，單域抗體為駱駝科抗體(參見例如Riechmann,1999,Journal of Immunological Methods 231:25-38)。

Fab片段含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH₁ )。Fab'片段因在重鏈CH₁ 結構域之羧基末端添加數個殘基(包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸)而與Fab片段不同。藉由裂解F(ab')₂ 胃蛋白酶消化產物之鉸鏈半胱胺酸處的二硫鍵來產生F(ab')片段。抗體片段之其他化學偶合為一般技術者所知。

在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體為單株抗體。如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指抗體源自單一純系，包括任何真核、原核或噬菌體純系，而非由可產生其之方法來產生。關於本發明適用之單株抗體可使用此項技術已知之各種技術來製備，包括使用融合瘤、重組體及噬菌體呈現技術或其組合。本發明之抗VEGF抗體包括嵌合抗體、靈長類化抗體、人類化抗體或人類抗體。

本發明之抗VEGF抗體可為嵌合抗體。如本文所用之術語「嵌合」抗體係指抗體具有源自非人類免疫球蛋白(諸如大鼠或小鼠抗體)之可變序列及通常選自人類免疫球蛋白模板之人類免疫球蛋白恆定區。產生嵌合抗體之方法在此項技術中為已知的。參見例如Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,BioTechniques 4:214-221；Gillies等人，1985,J. Immunol. Methods 125:191-202；美國專利第5,807,715號、第4,816,567號及第4,816397號，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。

本發明之抗VEGF抗體可被人類化。非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或片段(諸如，Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂ 或抗體之其他標靶結合子域)。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之彼等CDR區且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等FR區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白共同序列之至少一部分。抗體人類化之方法在此項技術中為已知的。參見例如Riechmann等人,1988,Nature 332:323-7；Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第6,180,370號；EP239400；PCT公開案WO 91/09967；美國專利第5,225,539號；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol. Immunol.,28:489-498；Studnicka等人，1994,Prot. Eng. 7:805-814；Roguska等人，1994,Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973；及美國專利第5,565,332號，所有該等文獻據此以全文引用的方式併入本文中。

本發明之抗VEGF抗體可為人類抗體。完全「人類」抗VEGF抗體可為治療性治療人類患者所需。如本文所用，「人類抗體」包括具有人類免疫球蛋白胺基酸序列之抗體且包括自人類免疫球蛋白文庫或自轉殖了一或多種人類免疫球蛋白基因且不表現內源性免疫球蛋白之動物分離的抗體。人類抗體可由此項技術中已知之各種方法製備，該等方法包括使用源自人類免疫球蛋白序列之抗體文庫的噬菌體呈現方法。參見美國專利第4,444,887號及第4,716,111號；及PCT公開案WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及WO 91/10741，該等文獻各自皆以全文引用的方式併入本文中。亦可使用不能表現功能內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠來產生人類抗體。參見例如PCT公開案WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號、第5,885,793號、第5,916,771號及第5,939,598號，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。此外，諸如Medarex(Princeton,NJ)、Astellas Pharma(Deerfield,IL)、Amgen(Thousand Oaks,CA)及Regeneron(Tarrytown,NY)之公司可使用與上文所述類似之技術來致力於提供針對所選抗原之人類抗體。可使用稱為「導向選擇(guided selection)」之技術來產生識別所選抗原決定基之完全人類抗體。在此方法中，所選非人類單株抗體(例如，小鼠抗體)用於引導對識別相同抗原決定基之完全人類抗體的選擇(Jespers等人，1988,Biotechnology 12:899-903)。

本發明之抗VEGF抗體可被靈長類化。術語「靈長類化抗體」係指包含猴可變區及人類恆定區之抗體。產生靈長類化抗體之方法在此項技術中為已知的。參見例如美國專利第5,658,570號、第5,681,722號及第5,693,780號，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。

本發明之抗VEGF抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體為單株、常為人類或人類化之抗體，其對至少兩種不同抗原具有結合特異性。在本發明中，結合特異性之一可針對VEGF，另一者可針對任何其他抗原，例如針對細胞表面蛋白質、受體、受體次單元、組織特異性抗原、病毒源性蛋白質、病毒編碼之包膜蛋白質(envelope protein)、細菌源性蛋白質或細菌表面蛋白質等。在一特定實施例中，本發明抗體為對VEGF及CD3兩者均具有結合特異性之雙特異性抗體。

本發明之抗VEGF抗體包括衍生化抗體。舉例而言，但不作為限制，衍生化抗體通常藉由以下方式來修飾：糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、利用已知保護/阻隔基之衍生化、蛋白水解裂解、鍵聯至細胞配體或其他蛋白質(參見6.6節關於論述抗體結合物之「抗體結合物」章節)等。眾多化學修飾中之任一者皆可藉由已知技術進行，該等技術包括(但不限於)特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素(tunicamycin)之代謝合成等。另外，衍生物可含有一或多個非天然胺基酸，例如使用ambrx技術(參見例如Wolfson,2006,Chem. Biol. 13(10):1011-2)。

在本發明之另一實施例中，抗VEGF抗體或其片段可為序列已經修飾以相對於相應野生型序列改變至少一種恆定區介導之生物效應功能的抗體或抗體片段。

舉例而言，在一些實施例中，本發明之抗VEGF抗體可經修飾以相對於未經修飾之抗體降低至少一種恆定區介導之生物效應功能，例如降低與Fc受體(FcγR)之結合。FcγR結合可藉由使抗體之免疫球蛋白恆定區區段在為FcγR相互作用所必需之特定區域處發生突變來降低(參見例如Canfeld及Morrison,1991,J. Exp. Med. 173:1483-1491；及Lund等人，1991,J. Immunol. 147:2657-2662)。降低抗體之FcγR結合能力亦會降低其他依賴於FcγR相互作用之效應功能，諸如助噬素作用(opsonization)、吞噬作用及抗原依賴性細胞毒性(「ADCC」)。

在其他實施例中，本發明之抗VEGF抗體可經修飾以相對於未經修飾之抗體獲得或改良至少一種恆定區介導之生物效應功能，例如增強FcγR相互作用(參見例如US 2006/0134709)。舉例而言，本發明之抗VEGF抗體可具有以大於相應野生型恆定區之親和力結合FcγRIIA、FcγRIIB及/或FcγRIIIA的恆定區。

因此，本發明抗體可具有使得助噬素作用、吞噬作用或ADCC增加或減少的生物活性變化。此等變化在此項技術中為已知的。舉例而言，可降低ADCC活性之對抗體的修飾描述於美國專利第5,834,597號中。一種例示性降低ADCC之變異體對應於美國專利第5,834,597號之圖4中所示的「突變體3」，其中缺失殘基236且殘基234、235及237(使用EU編號)經丙胺酸取代。

在一些實施例中，本發明之抗VEGF抗體的海藻糖(fucose)含量較低或缺乏海藻糖。缺乏海藻糖之抗體與增強之ADCC活性相關聯，尤其在低劑量之抗體下。參見Shields等人，2002,J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Shinkawa等人，2003,J. Biol. Chem. 278:3466-73。製備海藻糖較少(fucose-less)之抗體的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0細胞(ATCC CRL 1662)中生長。YB2/0細胞表現低含量之FUT8 mRNA，其編碼α-1,6-海藻糖基轉移酶(一種為多肽之海藻糖基化所必需的酵素)。

在另一態樣中，抗VEGF抗體或其片段可為已例如藉由使免疫球蛋白恆定區區段在與FcRn相互作用有關之特定區域處發生突變而經修飾以增加或降低對胎兒Fc受體FcRn之結合親和力的抗體或抗體片段(參見例如WO 2005/123780)。在特定實施例中，IgG類別之抗VEGF抗體經突變以使重鏈恆定區之胺基酸殘基250、314及428中的至少一者單獨或以其任何組合經取代，諸如在位置250及428處、或在位置250及314處、或在位置314及428處、或在位置250、314及428處，其中位置250及428為特定組合。對於位置250，取代胺基酸殘基可為除蘇胺酸外之任何胺基酸殘基，包括(但不限於)丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。對於位置314，取代胺基酸殘基可為除白胺酸外之任何胺基酸殘基，包括(但不限於)丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。對於位置428，取代胺基酸殘基可為除甲硫胺酸外之任何胺基酸殘基，包括(但不限於)丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、白胺酸、天冬醯胺、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。適合胺基酸取代之特定組合列於美國專利第7,217,797號之表1中，該表以全文引用的方式併入本文中。此等突變增加抗體與FcRn之結合，此保護抗體免於降解且增加其半衰期。

在其他態樣中，抗VEGF抗體具有一或多個胺基酸插入到其一或多個高變區中，例如Jung及Plckthun,1997,Protein Engineering 10(9):959-966、Yazaki等人，2004,Protein Eng Des. Sel. 17(5):481-9. Epub 2004年8月17日及US 2007/0280931中所述。

在各種實施例中，抗VEGF抗體或其片段可為已經修飾以增加在異源宿主中之表現的抗體或抗體片段。在某些實施例中，抗VEGF抗體或其片段可為已經修飾以增加在異源宿主細胞中之表現及/或促進自異源宿主細胞分泌的抗體或抗體片段。在一些實施例中，抗VEGF抗體或其片段經修飾以增加在細菌(諸如大腸桿菌(E.　coli ))中之表現。在其他實施例中，抗VEGF抗體或其片段經修飾以增加在酵母中之表現(Kieke等人，1999,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:5651-5656)。在其他實施例中，抗VEGF抗體或其片段經修飾以增加在昆蟲細胞中之表現。在額外實施例中，抗VEGF抗體或其片段經修飾以增加在哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)中之表現。

在某些實施例中，抗VEGF抗體或其片段可為已經修飾以增加抗體在產生期間之穩定性的抗體或抗體片段。在一些實施例中，抗體或其片段可經修飾以用不易被脫醯胺化之胺基酸置換一或多個易被非酶促脫醯胺化之胺基酸(諸如天冬醯胺或麩醯胺酸)(Huang等人，2005,Anal. Chem. 77:1432-1439)。在其他實施例中，抗體或其片段可經修飾以用不易被氧化之胺基酸置換一或多個易被氧化之胺基酸(諸如甲硫胺酸、半胱胺酸或色胺酸)。在其他實施例中，抗體或其片段可經修飾以用不易被環化之胺基酸置換一或多個易被環化之胺基酸(諸如天冬醯胺或麩胺酸)。

6.2　核酸及表現系統

本發明涵蓋編碼本發明之抗VEGF抗體之核酸分子及宿主細胞。

可藉由在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因，來製備本發明之抗VEGF抗體。為了重組表現抗體，使用具有編碼抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段的一或多個重組表現載體轉染宿主細胞，以在宿主細胞中表現輕鏈及重鏈且視情況使其分泌至培養宿主細胞之培養基中，自該培養基中可回收該等抗體。使用標準重組DNA方法來獲得抗體重鏈及輕鏈基因，將此等基因併入重組表現載體中，且將載體引入宿主細胞中，該等方法諸如為以下文獻中所描述之彼等方法：Molecular Cloning;ALaboratory Manual，第二版(Sambrook,Fritsch及Maniatis編，Cold Spring Harbor,N. Y.,1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Ausube1,F.M.等人編，Greene Publishing Associates,1989)及美國專利第4,816,397號。

在一實施例中，抗VEGF抗體類似於貝伐單抗或蘭尼單抗，但在一或多個CDR中有變化。在另一實施例中，抗VEGF抗體類似於貝伐單抗或蘭尼單抗，但在一或多個構架區中有變化。在又一實施例中，抗VEGF抗體類似於貝伐單抗或蘭尼單抗，但在一或多個CDR中及在一或多個構架區中有變化。此等抗體在本文中被統稱為具有「貝伐單抗相關」或「蘭尼單抗相關」序列且有時僅在本發明內容中簡單稱為抗VEGF抗體。為了產生編碼抗VEGF抗體之核酸，首先獲得編碼輕鏈及重鏈可變區之DNA片段。此等DNA可藉由例如使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增並修飾編碼輕鏈及重鏈可變序列之生殖系DNA或cDNA來獲得。人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列係此項技術中已知(參見例如「VBASE」人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat,E. A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號；Tomlinson等人，1992,J. Mol. Biol. 22T:116-198；及Cox等人，1994,Eur. J. Immunol. 24:827-836，該等文獻各自之內容以引用的方式併入本文中)。可以合成編碼貝伐單抗或蘭尼單抗之重鏈或輕鏈可變區的DNA片段，並用作誘發突變之模板，以便使用常規誘變技術來產生如本文所述之變異體；或者，可直接合成編碼變異體之DNA片段。

一旦獲得編碼抗VEGF VH及VL區段之DNA片段，即可利用標準重組DNA技術進一步處理此等DNA片段，例如將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等處理中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或可撓性連接子)之另一DNA片段。在此情形下所用之術語「可操作地連接」意欲意謂使兩個DNA片段接合以便由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框(in-frame)。

編碼V_H 區之經分離DNA可藉由可操作地連接該編碼V_H 之DNA至編碼重鏈恆定區(CH₁ 、CH₂ 、CH₃ 及視情況存在之CH₄ )之另一DNA分子而轉換成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因序列在此項技術中為已知的(參見例如Kabat,E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號)，且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但在某些實施例中，為IgG₁ 或IgG₄ 恆定區。對於Fab片段重鏈基因，編碼V_H 之DNA可可操作地連接至僅編碼重鏈CH₁ 恆定區之另一DNA分子。

編碼V_L 區之經分離DNA可藉由可操作地連接該編碼V_L 之DNA至編碼輕鏈恆定區C_L 之另一DNA分子而轉換成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因序列在此項技術中為已知的(參見例如Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,(U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號))，且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但在某些實施例中為κ恆定區。為了產生scFv基因，將編碼V_H 及V_L 之DNA片段可操作地連接至編碼可撓性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4~Ser)₃ )之另一片段，以使得V_H 及V_L 序列可表現為鄰接單鏈蛋白質，其中V_L 與V_H 區由可撓性連接子接合(參見例如Bird等人，1988,Science 242:423-426；Huston等人，1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人，1990,Nature 348:552-554)。

為了表現本發明之抗VEGF抗體，將如上所述獲得之編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中以使得該等基因可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此情形下，術語「可操作地連接」意欲意謂將抗體基因接合於載體中以使載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因轉錄及轉譯之預期功能。表現載體及表現控制序列經選擇而與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入各別載體中，或更通常地，將兩種基因插入同一表現載體中。

藉由標準方法(例如抗體基因片段及載體上互補限制性位點之接合，或若不存在限制性位點，則為鈍端接合(blunt end ligation))將抗體基因插入表現載體中。在插入本發明之抗VEGF抗體的輕鏈或重鏈序列之前，表現載體可已具有抗體恆定區序列。舉例而言，一種將抗VEGF V_H 及V_L 序列轉換成全長抗體基因之方法為將其分別插入已編碼重鏈恆定區與輕鏈恆定區之表現載體中以使V_H 區段可操作地連接至載體內之CH區段且使V_L 區段可操作地連接至載體內之CL區段。或者或另外，重組表現載體可編碼能促進自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖於載體中以使信號肽與抗體鏈基因之胺基末端同框連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。

除抗體鏈基因以外，本發明之重組表現載體還具有控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現的調控序列。術語「調控序列」意欲包括啟動子、增強子及可控制抗體鏈基因轉錄或轉譯之其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。此等調控序列例如描述於Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,CA,1990)中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調控序列之選擇)可視諸如欲轉型之宿主細胞之選擇、所要蛋白質之表現量等因素而定。適用於哺乳動物宿主細胞表現之調控序列包括可引導蛋白質在哺乳動物細胞中之高量表現的病毒元件，諸如源自細胞巨大病毒(CMV)(諸如CMV啟動子/增強子)、猿病毒40(SV40)(諸如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或增強子。對於病毒調控元件及其序列之進一步描述，參見例如Stinski之美國專利第5,168,062號、Bell等人之美國專利第4,510,245號及Schaffner等人之美國專利第4,968,615號。

除抗體鏈基因及調控序列以外，本發明之重組表現載體還可具有額外序列，諸如可調控該載體在宿主細胞中之複製的序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。可選擇標記基因有助於已引入有載體之宿主細胞的選擇(參見例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號，均屬於Axel等人)。舉例而言，通常，可選擇標記基因賦予已引入有載體之宿主細胞對藥物(諸如G418、嘌呤黴素(puromycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、潮黴素(hygromycin)或甲胺喋呤)的耐藥性。適合可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在甲胺喋呤選擇/擴增下用於DHFR-宿主細胞)及neo基因(用於G418選擇)。對於輕鏈及重鏈之表現，利用標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染於宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之各種技術，例如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。

有可能在原核或真核宿主細胞中表現本發明之抗體。在某些實施例中，在真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中進行抗體表現以使經適當摺疊且具有免疫活性之抗體的分泌最佳。用於表現本發明之重組抗體的例示性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括描述於Urlaub及Chasin,1980,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中之DHFR^- CHO細胞，例如Kaufman及Sharp,1982,Mol. Biol. 159:601-621中所述，其與DHFR可選擇標記一起使用)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、293細胞及SP2/0細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以使抗體在宿主細胞中表現或使抗體分泌至宿主細胞所生長之培養基中的時間來產生抗體。可使用標準蛋白質純化法自培養基中回收抗體。宿主細胞亦可用於產生完整抗體之部分，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解關於上述程序之變化形式在本發明之範疇內。舉例而言，可能需要用編碼本發明之抗VEGF抗體的輕鏈或重鏈(但並非兩者)之DNA轉染宿主細胞。

重組DNA技術亦可用於移除一些或所有編碼並非為結合至VEGF所必需之輕鏈及重鏈中之任一者或兩者的DNA。本發明抗體亦涵蓋由此等截短之DNA分子表現之分子。

此外，可藉由利用標準化學交聯方法使本發明抗體與第二抗體交聯來產生雙功能抗體，其中一條重鏈及一條輕鏈屬於本發明抗體且另一條重鏈及輕鏈對除VEGF以外之抗原具有特異性。雙功能抗體亦可藉由表現經工程改造而編碼雙功能抗體之核酸來製備。

在某些實施例中，可藉由使輕鏈及/或重鏈CDR中之胺基酸殘基突變來產生雙特異性抗體，亦即使用同一結合位點結合VEGF及無關抗原之抗體。在各種實施例中，可藉由使抗原結合位點周邊處之胺基酸殘基突變來產生可結合兩種抗原(諸如HER2及VEGF)之雙特異性抗體(Bostrom等人，2009,Science 323:1610-1614)。可藉由表現經工程改造而編碼雙特異性抗體之核酸來製備雙功能抗體。

為了重組表現本發明之抗VEGF抗體，可用本發明之兩個表現載體共轉染宿主細胞，第一載體編碼重鏈源性多肽且第二載體編碼輕鏈源性多肽。通常，兩個載體各含有各別可選擇標記。或者，可使用編碼重鏈及輕鏈多肽兩者之單一載體。

一旦產生編碼抗VEGF抗體之一或多個部分的核酸，即可將進一步的變化或突變引入編碼序列中，例如以產生編碼具有不同CDR序列之抗體、對Fc受體之親和力降低之抗體或不同子類之抗體的核酸。

亦可藉由化學合成(例如藉由描述於Solid Phase Peptide Synthesis,第二版,1984 The Pierce Chemical Co.,Rockford,I11中之方法)產生本發明之抗VEGF抗體。變異抗體亦可使用無細胞平台來產生(參見例如Chu等人,2001,Biochemia No. 2(Roche Molecular Biologicals))。

一旦藉由重組表現產生本發明之抗VEGF抗體，即可藉由此項技術中已知用於純化免疫球蛋白分子之任何方法對其進行純化，該方法例如為層析法(例如離子交換層析法、親和力層析法(特定言之為在蛋白A或蛋白G選擇之後對VEGF之親和力層析法)及尺寸篩分管柱層析法(sizing column chromatography))、離心法、溶解度差異法或任何其他用於純化蛋白質之標準技術。此外，本發明之抗VEGF抗體或其片段可融合至本文所述或此項技術中已知之異源多肽序列以便於純化。

一旦經分離，必要時，即可例如藉由高效液相層析法(參見例如Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology,Work及Burdon編，Elsevier,1980)或藉由凝膠過濾層析法在Superdex^TM 75管柱(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)上來進一步純化抗VEGF抗體。

6.3　抗VEGF抗體之生物活性

在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體具有某些生物活性，諸如與貝伐單抗或蘭尼單抗競爭結合至VEGF或中和VEGF活性。

因此，在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體與貝伐單抗或蘭尼單抗競爭結合至VEGF。可使用競爭檢定測試競爭結合至VEGF之能力。在競爭檢定之一個實例中，藉由使培養盤與VEGF之溶液(例如於PBS中濃度為1 μg/mL，在4℃下隔夜)接觸而使VEGF黏附於固體表面(例如微孔培養盤(microwell plate))上。洗滌培養盤(例如用含0.1% Tween 20之PBS)且進行阻斷(例如以Superblock,Thermo Scientific,Rockford,IL)。將亞飽和量之經生物素標記之貝伐單抗(80 ng/mL)或等效量之經生物素標記之蘭尼單抗與未經標記之貝伐單抗(或視情況而定為蘭尼單抗)(「參考」抗體)或連續稀釋(例如濃度為2.8 μg/mL、8.3 μg/mL或25 μg/mL)之競爭抗VEGF抗體(「測試」抗體)於ELISA緩衝液(例如含1% BSA及0.1% Tween 20之PBS)中的抗體混合物添加至各孔中且在輕微震盪下將培養盤培育1小時。洗滌培養盤，添加用ELISA緩衝液稀釋之1 μg/mL HRP結合抗生蛋白鏈菌素至各孔中且將培養盤培育1小時。洗滌培養盤且藉由添加受質(例如TMB,Biofx Laboratories Inc.,Owings Mills,MD)來偵測所結合之抗體。藉由添加終止緩衝液(例如Bio FX終止試劑,Biofx Laboratories Inc.,Owings Mills MD)來中止反應且使用微定量盤式讀取器(例如VERSAmax,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在650 nm下量測吸光度。該競爭檢定之變化形式亦可用於測試本發明之抗VEGF抗體與貝伐單抗或蘭尼單抗之間的競爭。舉例而言，在某些態樣中，抗VEGF抗體用作參考抗體且貝伐單抗或蘭尼單抗用作測試抗體。另外，可使用在培養物中表現於細胞(例如哺乳動物細胞)表面上之膜結合VEGF代替可溶性VEGF。競爭檢定之其他形式在此項技術中為已知的且可加以使用。

在各種實施例中，當抗VEGF抗體之使用濃度為0.08 μg/mL、0.4 μg/mL、2 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL或使用濃度範圍介於任何上述值之間(例如使用濃度範圍為2 μg/mL至10 μg/mL)時，本發明之抗VEGF抗體使經標記之貝伐單抗或蘭尼單抗之結合降低至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或範圍介於任何上述值之間的百分比(例如本發明之抗VEGF抗體使經標記之貝伐單抗或蘭尼單抗之結合降低50%至70%)。

在其他實施例中，當貝伐單抗或蘭尼單抗之使用濃度為0.4 μg/mL、2 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、250 μg/mL或使用濃度範圍介於任何上述值之間(例如使用濃度範圍為2 μg/mL至10 μg/mL)時，貝伐單抗或蘭尼單抗使本發明之經標記之抗VEGF抗體的結合降低至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或範圍介於任何上述值之間的百分比(例如貝伐單抗或蘭尼單抗使本發明之經標記之抗VEGF抗體的結合降低50%至70%)。

在其他態樣中，本發明之抗VEGF抗體在一系列活體外檢定(諸如細胞增殖或細胞遷移)中抑制(或中和)VEGF活性。舉例而言，在一實施例中，所檢定之VEGF活性為內皮細胞(「EC」)增殖之誘導(參見例如Qin等人之方案，2006,J. Biol. Chem. 281:32550-32558)。在另一實施例中，所檢定之VEGF活性為EC遷移之誘導(參見例如Liang等人，2007,Nat. Protoc. 2:329-333之所述活體外劃痕檢定(scratch assay)方案)。在一特定實施例中，測試抗VEGF抗體逆轉由VEGF刺激之細胞增殖及細胞遷移以及由永生化牛視網膜內皮細胞中之VEGF₁₆₅ 誘導的緊密連接蛋白之離域的能力(Deissler等人，2008,British Journal of Ophthalmology 92:839-843)。在另一實施例中，使用報導體檢定法(參見例如Yohno等人，2003,Biological & Pharmaceutical Bulletin 26(4):417-20及美國專利第6,787,323號)來檢定VEGF活性之中和。

VEGF中和檢定之其他形式在此項技術中為已知的且可加以使用。

在各種實施例中，當抗VEGF抗體之使用濃度為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL或使用濃度範圍介於任何上述值之間(例如使用濃度範圍為1 μg/mL至5 μg/mL)時，本發明之抗VEGF抗體中和VEGF至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或範圍介於任何上述值之間的百分比(例如本發明之抗VEGF抗體中和VEGF活性50%至70%)。

在一些實施例中，本發明之抗VEGF抗體在中和VEGF方面之效用為貝伐單抗或蘭尼單抗的至少0.7倍、0.8倍、至少0.9倍、至少1倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍，或相對於貝伐單抗或蘭尼單抗，在中和VEGF方面之效用範圍介於任何一對上述值之間(例如在中和VEGF方面之效用為貝伐單抗或蘭尼單抗之0.9倍至5倍或為貝伐單抗或蘭尼單抗之2倍至50倍)。

6.4抗VEGF抗體之動力學性質

在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體對VEGF具有高結合親和力。在特定實施例中，本發明之抗VEGF抗體具有特定締合速率常數(k_On 或k_a 值)、解離速率常數(k_Off 或k_d 值)、親和力常數(K_A 值)、解離常數(K_D 值)及/或IC₅₀ 值。在各種實施例中，可例如根據Karlsson等人，1991,J. Immunol. Methods 145:229-240中揭示之方法使用表面電漿子共振測定抗VEGF抗體與VEGF受體相互作用之結合常數。在某些態樣中，此等值係選自以下實施例。

在一特定實施例中，本發明之抗VEGF抗體與VEGF結合之k_on 為至少10⁴ M^-1 s^-1 、至少5×10⁴ M^-1 s^-1 、至少10⁵ M^-1 s^-1 、至少5×10⁵ M^-1 s^-1 、至少10⁶ M^-1 s^-1 、至少5×106 M^-1 s^-1 、至少10⁷ M^-1 s^-1 、至少5×10⁷ M^-1 s^-1 、至少10⁸ M^-1 s^-1 、至少5×10⁸ M^-1 s^-1 、至少10⁹ M^-1 s^-1 ，或處於介於任何一對上述值之間的任何範圍內(例如5×10⁵ M^-1 s^-1 至5×10⁶ M^-1 s^-1 ，或10⁷ M^-1 s^-1 至10⁸ M^-1 s^-1 )。

在另一實施例中，本發明之抗VEGF抗體與VEGF結合之k_off 速率為10^-3 s^-1 或以下、5×10^-4 s^-1 或以下、10^-4 s^-1 或以下、5×10^-5 s^-1 或以下、10^-5 s^-1 或以下、5×10^-6 s^-1 或以下、10^-6 s^-1 或以下、5×10^-7 s^-1 或以下、10^-7 s^-1 或以下、5×10^-8 s^-1 或以下、10^-8 s^-1 或以下，或處於介於任何一對上述值之間的任何範圍內(例如5×10^-4 s^-1 至10^-6 s^-1 ，或10^-3 s^-1 至5×10^-5 s^-1 )。

在另一實施例中，本發明之抗VEGF抗體與VEGF結合之K_A (k_on /k_off )為至少10⁸ M^-1 、至少5×10⁹ M^-1 、至少10¹⁰ M^-1 、至少5×10¹⁰ M^-1 、10¹¹ M^-1 、至少5×10¹¹ M^-1 、至少10¹² M^-1 、至少5×10¹² M^-1 、至少10¹³ M^-1 、至少5×10¹³ M^-1 、至少10¹⁴ M-¹ 、至少5×10¹⁴ M^-1 、至少10¹⁵ M^-1 ，或處於介於任何一對上述值之間的任何範圍內(例如5×10⁹ M^-1 至10¹¹ M^-1 ，或10¹¹ M^-1 至5×10¹⁴ M^-1 )。

在其他實施例中，本發明之抗VEGF抗體與VEGF結合之K_D (k_off /k_on )為10^-8 M或以下、5×10^-9 M或以下、10^-9 M或以下、5×10^-10 M或以下、10^-10 M或以下、5×10^-11 M或以下、10^-11 M或以下、5×10^-12 M或以下、10^-12 M或以下、5×10^-13 M或以下、10^-13 M或以下、5×10^-14 M或以下、10^-14 M或以下、5×10^-15 M或以下、10^-15 M或以下，或處於介於任何一對上述值之間的任何範圍內(例如5×10^-9 M至5×10^-12 M，或5×10^-11 M至5×10^-13 M)。

在特定實施例中，藉由此項技術中熟知或本文所述之檢定測定K_D (ko_ff /k_on )值，該等檢定例如為ELISA、等溫滴定熱量測定法(isothermal titration calorimetry，ITC)、螢光偏振檢定或任何其他生物感測器技術(諸如BIAcore)。

在一些實施例中，本發明之抗VEGF抗體結合至VEGF且抑制VEGF與VEGF受體(Flt-1或Flk-1)結合，IC₅₀ 值為小於5×10⁷ nM、小於10⁷ nM、小於5×10⁶ nM、小於10⁶ nM、小於5×10⁵ nM、小於10⁵ nM、小於5×10⁴ nM、小於10⁴ nM、小於5×10³ nM、小於10³ nM、小於5×10² nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於65 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於30 nM、小於25 nM、小於20 nM、小於15 nM、小於12 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於1 nM、小於5×10^-1 nM、小於10^-1 nM、小於5×10^-2 nM、小於10^-2 nM、小於5×10^-3 nM、小於10^-3 nM、小於5×10^-4 nM、或小於10^-4 nM，或處於介於任何一對上述值之間的任何範圍內(例如5×10⁷ nM至50 nM，或15 nM至5×10^-3 nM)。可根據此項技術中熟知或本文所述之方法(例如ELISA)量測IC₅₀ 。

在其他實施例中，本發明之抗VEGF抗體結合至VEGF且在生物檢定(例如EC增殖或遷移)中中和VEGF活性，IC₅₀ 值為小於5×10⁷ nM、小於10⁷ nM、小於5×10⁶ nM、小於10⁶ nM、小於5×10⁵ nM、小於10⁵ nM、小於5×10⁴ nM、小於10⁴ nM、小於5×10³ nM、小於10³ nM、小於5×10² nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於65 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於30 nM、小於25 nM、小於20 nM、小於15 nM、小於12 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於1 nM、小於5×10^-1 nM、小於10^-1 nM、小於5×10^-2 nM、小於10^-2 nM、小於5×10^-3 nM、小於10^-3 nM、小於5×10^-4 nM、或小於10^-4 nM，或處於介於任何一對上述值之間的任何範圍內(例如5×10⁷ nM至50 nM，或15 nM至5×10^-3 nM)。可用於量測抗VEGF抗體之IC₅₀ 的例示性中和檢定描述於上文6.3「抗VEGF抗體之生物活性」章節中。

在某些實施例中，抗VEGF抗體結合至VEGF且在VEGF中和檢定中抑制VEGF結合至Flt-1、Flk-1或兩者，或抑制VEGF活性，IC₅₀ 值為介於約1 pm與約1 μM之間的。在特定實施例中，抗VEGF抗體結合至VEGF且在VEGF中和檢定中抑制VEGF結合至Flt-1、Flk-1或兩者，或抑制VEGF活性，IC₅₀ 值為介於10 pM與100 nM之間、介於100 pM與10 nM之間、介於200 pM與5 nM之間、介於300 pM與4 nM之間、介於500 pM與3 nM之間、介於750 pM與2 nM之間、介於1 nM與20 nM之間、介於500 pM與40 nM之間、介於50 pM與50 nM之間、介於250 pM與100 nM之間、及介於100 nM與1 μM之間，或處於介於任何一對上述值之間的任何範圍內(例如10 pM至50 nM，或750 pM至2 nM)。

在上述實施例之某些態樣中，在VEGF以以下濃度存在下量測IC₅₀ ：0.001 μM、0.005 μM、0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM、1 μM、10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM、60 μM、70 μM、80 μM、90 μM、100 μM、200 μM、300 μM、400 μM、500 μM、600 μM、700 μM、800 μM、900 μM、1000 μM，或在VEGF以介於任何一對上述值之間的任何範圍內(例如0.01 μM至50 μM，或10 μM至100 μM)的濃度存在下量測IC₅₀ 。

在某些實施例中，本發明抗體在可比較檢定中之動力學性質與貝伐單抗或蘭尼單抗之動力學性質類似或相對於貝伐單抗或蘭尼單抗之動力學性質有了改良。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體與VEGF結合之k_on 速率在貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的約0.5×至1000×範圍內，例如k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的0.5×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的0.75×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的0.9×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的1×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的1.1×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的1.2×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的1.3×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的1.4×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的1.5×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的1.75×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的2×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的2.25×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的2.5×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的3×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的4×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的5×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的7.5×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的10×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的15×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的20×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的50×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的75×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的100×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的150×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的200×或k_on 之範圍介於任何一對上述值之間，例如k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的2×至75×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的5×至100×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的0.5×至1000×、k_on 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_on 的0.75×至200×等。

在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體與VEGF結合之k_off 速率在貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.001×至3×範圍內，例如k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.002×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.005×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.0075×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之ko_ff 的0.01×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.025×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.05×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.075×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.1×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.25×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.05×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.75×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.9×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的1×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的1.1×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的1.25×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的1.5×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的1.75×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的4×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的3×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的2×，或k_off 之範圍介於任何一對上述值之間，例如k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.01×至1.1×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.05×至1.25×、k_off 為貝伐單抗或蘭尼單抗之k_off 的0.1×至0.9×等。

在其他實施例中，本發明之抗VEGF抗體與VEGF結合之K_A (k_on /k_off )在貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的0.25×至1000×範圍內，例如K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的0.5×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的0.75×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的1×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的2×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的4×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的10×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的15×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的20×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的30×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的40×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的50×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的100×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的250×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的500×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的750×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的1000×，或K_A 之範圍介於任何一對上述值之間，例如K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的0.75×至105×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的1×至100×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的10×至20×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的4×至50×、K_A 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_A 的2×至20×，或為可根據本文揭示之k_on 及k_off 速率計算的任何值或範圍。

在其他實施例中，本發明之抗VEGF抗體與VEGF結合之K_D (k_off /k_on )在貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.001×至10×範圍內，例如K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.001×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.005×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.01×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.05×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.075×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.1×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.2×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.3×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.4×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.5×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.6×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.7×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.8×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.9×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的1×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的1.5×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的2×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的4×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的7.5×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的10×，或K_D 之範圍介於任何一對上述值之間，例如K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.01×至2×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.1×至1.5×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.7×至4×、K_D 為貝伐單抗或蘭尼單抗之K_D 的0.2×至2×，或為可根據本文揭示之k_on 及k_off 速率計算的任何值或範圍。

在一些實施例中，本發明之抗VEGF抗體結合至VEGF且抑制VEGF結合至Flt-1、Flk-1或兩者，或中和VEGF活性，IC₅₀ 值在貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.001×至10×範圍內，例如IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.001×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.005×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.01×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.05×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.075×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.1×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.2×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.3×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.4×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.5×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.6×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.7×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.8×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.9×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的1×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的1.5×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的2×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的4×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的7.5×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的10×，或IC₅₀ 之範圍介於任何一對上述值之間，例如IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.01×至2×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.1×至1.5×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.7×至4×、IC₅₀ 為貝伐單抗或蘭尼單抗之IC₅₀ 的0.2×至2×。在某些實施例中，相較於貝伐單抗或蘭尼單抗，單一CDR取代可導致IC₅₀ 有上述差異，而本發明之抗VEGF抗體相較於貝伐單抗或蘭尼單抗可包含此取代及至多16個額外CDR取代。

6.5抗VEGF抗體之降低的免疫原性

在某些態樣中，本發明提供相較於貝伐單抗或蘭尼單抗免疫原性有降低之抗VEGF抗體。本發明提供相較於貝伐單抗之CDR在CDR及/或構架區中具有單一或多個胺基酸取代之抗VEGF抗體，其中至少一個取代相較於貝伐單抗或蘭尼單抗可降低該抗體之免疫原性。在某些實施例中，降低之免疫原性由導致消除或減少一或多個T細胞抗原決定基之一或多個胺基酸取代引起。

在某些態樣中，免疫原性降低之本發明之抗VEGF抗體相較於貝伐單抗或蘭尼單抗具有類似或改良之生物活性，例如對VEGF之親和力或對VEGF活性之中和。此等性質可例如藉由上文6.3「抗VEGF抗體之生物活性」章節中所述之方法來測試。

在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體之免疫原性相對於貝伐單抗或蘭尼單抗抗體有降低。此等抗體一般相對於重鏈及/或輕鏈可變區在對應於SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 62及/或SEQ ID NO: 74之區域中具有變異序列。該等抗體將一般在對應於SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 62及SEQ ID NO: 74之一個、兩個或所有三個序列中具有一個、兩個或三個胺基酸取代，但是在本文中亦涵蓋在一個、兩個或所有三個區域中有至多四個或五個取代。

如本發明中所用，「免疫原性降低之」變異體係指在對應於SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 62及/或SEQ ID NO: 74之區域中具有變異序列的抗VEGF抗體分別相較於SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 74之肽可引起末梢血液單核細胞之增殖反應減少。可用於評估增殖反應之例示性增殖檢定闡述於下文7「實例1」章節中。降低之增殖反應可以反應者(responder)百分比、刺激指數或兩者來反映。

在其他實施例中，相較於具有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:74之序列的肽，變異序列導致反應者減少至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、100%，或反應者減少率之範圍介於任何上述值之間，例如反應者減少25%-75%、50%-90%、60%-100%、70%-90%，或其類似範圍。

在其他實施例中，變異序列導致刺激指數比分別由SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 74之肽引起之刺激指數減低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%，或相較於SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:74之肽導致刺激指數減低之百分比範圍介於任何上述值之間，例如減低5%-20%、10%-30%、25%-35%、30%-40%，或其類似範圍。

相較於貝伐單抗或蘭尼單抗，免疫原性降低之候選抗VEGF抗體之例示性實施例包含表6中所示之一或多個CDR取代或該等取代之組合。相較於貝伐單抗或蘭尼單抗，免疫原性降低之抗VEGF抗體視情況包含一或多個額外取代，諸如表7-13之任一者中的CDR突變，呈單一形式或組合形式。

相較於貝伐單抗或蘭尼單抗，免疫原性降低之候選抗VEGF抗體之其他例示性實施例包含表14-16中所示之一或多個CDR取代或該等取代之組合。相較於貝伐單抗或蘭尼單抗，免疫原性降低之抗VEGF抗體之一些較佳實施例提供於表19中。

6.6抗體結合物

本發明之抗VEGF抗體包括例如藉由將任何類型之分子共價連接至抗體以使該共價連接不干擾與VEGF之結合而經修飾的抗體結合物。

在某些態樣中，本發明之抗VEGF抗體可結合至效應部分或標記。如本文所用之術語「效應部分」包括例如抗贅生性藥劑、藥物、毒素、生物活性蛋白(例如酵素)、其他抗體或抗體片段、合成或天然存在之聚合物、核酸(例如DNA及RNA)、放射性核種(特定言之為放射性碘、放射性同位素)、螯合金屬、奈米粒子及報導體族群(諸如螢光化合物或可用NMR或ESR光譜法偵測之化合物)。

在一實例中，抗VEGF抗體可結合至效應部分(諸如細胞毒性劑、放射性核種或藥物部分)，以改變特定生物反應。效應部分可為蛋白質或多肽，諸如(但不限於)毒素(諸如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin或)或白喉毒素)、信號傳導分子(諸如α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子)、血栓形成劑(thrombotic agent)或抗血管生成劑(例如血管抑制素或內皮抑制素)或生物反應修飾藥(諸如細胞激素或生長因子，例如介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-6(IL-6)、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球集落刺激因子(G-CSF)或神經生長因子(NGF))。

在另一實例中，效應部分可為細胞毒素或細胞毒性劑。細胞毒素及細胞毒性劑之實例包括紫杉醇、細胞遲緩素B、短桿菌素D、溴化乙錠、吐根素、絲裂黴素、依託泊苷、特諾波賽、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素(colchicin)、小紅莓、道諾黴素(daunorabicin)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質素、普魯卡因(procaine)、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素，以及其類似物或同系物。

效應部分亦包括(但不限於)抗代謝物(例如甲胺喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如二氯甲基二乙胺、硫替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(BSNU)及環己亞硝脲(CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露糖醇、鏈尿黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C5(mitomycin C5)及順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑(cisplatin))、蒽環黴素(例如道諾黴素(daunorubicin)(以前稱為柔紅黴素(daunomycin))及小紅莓(doxorubicin))、抗生素(例如放線菌素(dactinomycin)(以前稱為放線菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)及胺茴黴素(anthramycin，AMC)、卡奇黴素(calicheamicin)或倍癌黴素(duocarmycin))、及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。

其他效應部分可包括放射性核種，諸如(但不限於)¹¹¹ In及⁹⁰ Y、Lu¹⁷⁷ 、鉍²¹³ 、鉲²⁵² 、銥¹⁹² 及鎢¹⁸⁸ /錸¹⁸⁸ ；及藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、紫杉醇衍生物(taxoid)及蘇拉明(suramin)。

使此等效應部分結合至抗體之技術係相關技術熟知者(參見例如Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第二版，第623-53頁(Robinson等人編，1987))；Thorpe等人，1982,Immunol. Rev. 62:119-58；及Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics 83:67-123)。

在一實例中，抗VEGF抗體或其片段藉助於共價鍵(例如肽鍵)，經由抗體之N末端或C末端或在其內部融合至另一蛋白質(或其部分，例如蛋白質之至少10、20或50個胺基酸部分)之胺基酸序列。抗體或其片段可在該抗體恆定域之N末端連接至另一蛋白質。重組DNA程序可用於產生此等融合物，例如WO 86/01533及EP0392745中所述。在另一實例中，效應分子可延長活體內半衰期及/或增強抗體通過上皮障壁傳遞至免疫系統。此類型之適合效應分子之實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如彼等描述於WO 2005/117984中者。

在某些態樣中，抗VEGF抗體結合至小分子毒素。在某些例示性實施例中，本發明之抗VEGF抗體結合至海兔毒素(dolastatin)或海兔毒素之肽類似物或衍生物，例如奧瑞他汀(auristatin)(美國專利第5,635,483號及第5,780,588號)。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可經由其N(胺基)末端、C(羧基)末端或在內部連接至抗體(WO 02/088172)。例示性奧瑞他汀實施例包括經N末端連接之單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF，如美國專利第7,498,298號中所揭示(該專利據此以全文引用的方式併入本文中)(其揭示例如：製備結合至連接子之單甲基纈胺酸化合物(諸如MMAE及MMAF)之連接子及方法)。

在其他例示性實施例中，小分子毒素包括(但不限於)卡奇黴素、美登素(美國專利第5,208,020號)、新月毒素(trichothene)及CC1065。在本發明之一實施例中，抗體結合至一或多個美登素(maytansine)分子(例如每個抗體分子約1至約10個美登素分子)。美登素可例如轉化成May-SS-Me，May-SS-Me可被還原成May-SH3且與抗體反應(Chari 等人，1992,Cancer Research 52:127-131)以產生美登素類-抗體(maytansinoid-antibody)或美登素類-Fc融合結合物。亦可使用之卡奇黴素之結構類似物包括(但不限於)γ₁ ¹ 、γ₃ ¹ 、N-乙醯基-γ₁ ¹ 、PSAG及θ₁ ¹ (Hinman等人，1993,Cancer Research 53:3336-3342；Lode等人，1998,Cancer Research 58:2925-2928；美國專利第5,714,586號、美國專利第5,712,374號、美國專利第5,264,586號、美國專利第5,773,001號)。

本發明抗體亦可結合至脂質體以用於靶向傳遞(參見例如Park等人，1997,Adv. Pharmacol. 40:399-435；Marty及Schwendener,2004,Methods in Molecular Medicine 109:389-401)。

在一實例中，本發明抗體可連接至聚乙二醇(PEG)部分。在一特定實例中，抗體為抗體片段且PEG部分可經由位於抗體片段中之任何可用胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基(例如任何自由胺基、亞胺基、硫醇基、羥基或羧基)而連接。此等胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經工程改造至該片段中。參見例如美國專利第5,219,996號。多個位點可用於連接兩個或兩個以上PEG分子。PEG部分可經由位於抗體片段中之至少一個半胱胺酸殘基的硫醇基而共價鍵聯。當硫醇基用作連接點時，可使用適當活化之效應部分，例如硫醇選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。

在一特定實例中，抗VEGF抗體結合物為聚乙二醇化之經修飾Fab'片段，亦即具有例如根據EP0948544中揭示之方法共價連接至其上的PEG(聚乙二醇)。亦參見Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications,(J. Milton Harris編，Plenum Press,New York,1992)；Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications,(J. Milton Harris及S. Zalipsky編，American Chemical Society,Washington D.C.,1997)；及Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences,(M. Aslam及A. Dent編，Grove Publishers,New York,1998)；及Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545。PEG可在鉸鏈區中連接至半胱胺酸。在一實例中，PEG修飾之Fab'片段在經修飾鉸鏈區中具有共價鍵聯至單一硫醇基之順丁烯二醯亞胺基。離胺酸殘基可共價鍵聯至順丁烯二醯亞胺基，且對於離胺酸殘基上之各胺基，可連接分子量約為20,000 Da之甲氧基聚乙二醇聚合物。連接至Fab'片段之PEG的總分子量因此可約為40,000 Da。

詞語「標記」在本文中使用時係指可直接或間接結合至本發明之抗VEGF抗體的可偵測化合物或組合物。標記(例如放射性同位素標記或螢光標記)自身可為可偵測的或在酶標記情形下可催化受質化合物或組合物之化學變化，而該變化為可偵測的。適用螢光部分包括(但不限於)螢光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素及其類似物。適用酶標記包括(但不限於)鹼性磷酸酯酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶及其類似物。

尤其適用於診斷目的之其他抗VEGF抗體結合物描述於下文6.7「抗VEGF抗體之診斷用途」章節中。

6.7　抗VEGF抗體之診斷用途

本發明之抗VEGF抗體，包括彼等已例如利用生物素化、辣根過氧化酶或任何其他可偵測部分(包括彼等描述於6.6「抗體結合物」章節中者)而經修飾之抗體，可有利地用於診斷目的。

特定言之，可使用抗VEGF抗體來例如(但不限於)純化或偵測VEGF，包括活體外及活體內診斷方法兩者。舉例而言，抗體可在免疫檢定中用於定性及定量量測生物樣本中VEGF的含量。參見例如Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)，其以全文引用的方式併入本文中。

本發明進一步涵蓋結合至診斷劑之抗體或其片段。可在診斷上使用抗體(例如)來偵測相關標靶於特定細胞、組織或血清中之表現；或監測免疫反應之發展或進展作為臨床測試程序之一部分以(例如)確定既定治療方案之功效。可藉由使抗體與可偵測物質偶合而便於偵測。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性物質、正電子發射金屬(使用各種正電子發射斷層攝影術)及非放射性順磁金屬離子。可偵測物質可直接或使用此項技術中已知之技術經由中間物(諸如此項技術中已知之連接子)間接偶合或結合至抗體(或其片段)。酶標記之實例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)、蘋果酸去氫酶、尿素酶、過氧化物酶(諸如辣根過氧化酶(HRPO))、鹼性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、乙醯膽鹼酯酶、葡糖澱粉酶(glucoamylase)、溶菌酶、醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化酶(lactoperoxidase)、微過氧化酶(microperoxidase)，及其類似物。適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合螢光物質之實例包括繖酮、螢光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、二甲胺基磺萘醯氯或藻紅素；發光物質之實例包括魯米諾(luminol)；生物發光物質之實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白(aequorin)；適合放射性物質之實例包括¹²⁵ I、¹³¹ I、¹¹¹ In或⁹⁹ Tc。

本發明提供VEGF表現之偵測，其包含使用一或多種本發明之抗VEGF抗體(視情況結合至可偵測部分)接觸生物樣本(個體細胞、組織或體液)，且偵測樣本對於VEGF表現是否為陽性或相較於對照樣本，樣本之表現是否發生改變(例如降低或增加)。

可使用本發明方法診斷之疾病包括(但不限於)本文所述之疾病。在某些實施例中，組織或體液為末梢血液、末梢血液白血球、生檢組織(諸如肺或皮膚生檢組織)、及組織。

6.8　使用抗VEGF抗體之治療方法

6 . 8 . 1 　 臨床益處

本發明之抗VEGF抗體可用於治療特徵在於病理性血管生成之各種贅瘤或非贅生性病狀。

本發明抗體適用於治療血管生成在腫瘤生長中起重要作用之腫瘤，包括癌症及良性瘤。本文中欲治療之癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。此等癌症之更特定的實例包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括腸胃癌)、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌(vulval cancer)、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各種類型之頭頸部癌，以及B細胞淋巴瘤(包括低度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中度/濾泡性NHL、中度彌漫性NHL、重度免疫母細胞性NHL、重度淋巴母細胞性NHL、重度小無裂細胞(non-cleaved cell)NHL、巨瘤症性NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關之淋巴瘤及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)、慢性骨髓母細胞白血病、及移植後淋巴組織增生病症(PTLD)，以及與母斑病、水腫(諸如與腦腫瘤相關之水腫)及梅格氏症候群(Meigs'syndrome)相關之異常血管增殖。更特定言之，可用本發明抗體治療之癌症包括乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡堡氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、類癌(carcinoid carcinoma)、頭頸部癌、黑素瘤、卵巢癌、間皮瘤(mesothelioma)及多發性骨髓瘤。在一些實施例中，本發明之抗VEGF抗體用於治療人類患者中之結腸直腸癌。

本發明涵蓋抗血管生成療法，一種旨在抑制為提供養分以支持腫瘤生長所需之腫瘤血管之發育的癌症治療策略。因為血管生成與原發腫瘤生長及轉移兩者有關，所以本發明提供之抗血管生成治療能夠抑制原發部位處之腫瘤的贅生性生長以及防止繼發部位處之腫瘤的轉移。

可用本發明抗體治療之非贅生性病狀包括視網膜疾病(例如年齡相關之黃斑部變性)及免疫及發炎疾病(例如類風濕性關節炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、糖尿病性及其他增生性視網膜病(包括早產兒視網膜病)、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑部變性、甲狀腺增生(包括格雷氏病(Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性炎症、肺炎、腎病症候群、子癇前症、腹水症、心包積液(諸如與心包炎相關之心包積液)及胸膜積液)。

因此，本發明提供治療有需要之患者之任何上述疾病的方法，其包含：投與該患者本發明之抗VEGF抗體。視情況而定，例如在以下時間之後重複該投藥：一天、兩天、三天、五天、一週、兩週、三週、一個月、五週、六週、七週、八週、兩個月或三個月。可以相同劑量或不同劑量重複投藥。投藥可重複一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或十次以上。舉例而言，根據某些給藥方案，患者接受抗VEGF療法持續較長時間，例如6個月、1年或1年以上。投與患者之抗VEGF抗體之量在某些實施例中為治療有效量。如本文所用，「治療有效」量之VEGF抗體可作為單次劑量投與或歷經治療方案之整個過程來投與，歷經之時間例如為一週、兩週、三週、一個月、三個月、六個月、一年或一年以上。例示性治療方案描述於下文6.11「治療方案」章節中。

根據本發明，治療疾病涵蓋治療已診斷為患有任何形式之處於任何臨床階段或表現形式之疾病的患者、延遲疾病症狀或跡象之發作或發展或加重或惡化、及/或防止及/或降低疾病之嚴重性。

本發明之抗VEGF抗體所投與的「個體」或「患者」較佳為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、犬、大鼠等)或靈長類動物(例如猴或人類)。在某些實施例中，個體或患者為人類。在某些態樣中，人類為嬰兒患者。在其他態樣中，人類為成人患者。

6.9醫藥組合物及投藥途徑

本文提供包含本發明之抗VEGF抗體、視情況選用之一或多種額外治療劑(諸如描述於下文6.10「組合療法」章節中的組合治療劑)的組合物。組合物通常將作為一般將包括醫藥學上可接受之載劑之無菌醫藥組合物的一部分來提供。該組合物可呈任何適合形式(視將其投與患者之所需方法而定)。

本發明之抗VEGF抗體可藉由各種途徑投與患者，該等途徑諸如為經口、經皮、經皮下、經鼻內、經靜脈內、經肌肉內、經眼內、經局部、經鞘內及經腦室內。在任何既定情況下，最適合之投藥途徑將視特定抗體、個體及疾病之特性與嚴重性以及個體之身體狀況而定。

對於治療除視網膜疾病以外之適應症，本發明之抗VEGF抗體的有效劑量範圍在每單次(例如團注)投藥、多次投藥或連續投藥時可為約0.1 mg/kg至約75 mg/kg，或在每單次(例如團注)投藥、多次投藥或連續投藥時血清濃度達到0.01 μg/mL至5000 μg/mL血清濃度，或其中任何有效範圍或值，此視所治療病狀、投藥途徑及個體年齡、重量及狀況而定。在某些實施例中，例如對於治療癌症，各劑量範圍可為每公斤體重約0.1 mg至約50 mg，例如每公斤體重約3 mg至約25 mg。抗體可調配成水溶液且藉由皮下注射來投與。

對於治療視網膜疾病(例如年齡相關之黃斑部變性(AMD))，劑量宜使抗VEGF抗體在所注射之眼中的水狀液濃度為1 μg/mL至50 μg/mL。對於治療AMD，各劑量可為0.1 mg至約1 mg，例如約0.25至約0.5 mg。抗體可調配成水溶液且藉由玻璃體內注射來投與。

醫藥組合物可適宜呈每劑量含有預定量之本發明之抗VEGF抗體的單位劑型。此類單位可含有例如(但不限於)0.1 mg至5 g，例如1 mg至1 g、或10至50 mg。用於本發明中之醫藥學上可接受之載劑可呈現各種形式，此例如視欲治療病狀或投藥途徑而定。

可藉由混合具有所要純度之抗體與通常用於此項技術中之視情況選用的醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(所有在本文中皆稱為「載劑」，亦即緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等張劑、非離子清潔劑、抗氧化劑及其他混雜添加劑)而將本發明之抗VEGF抗體之治療調配物製備成凍乾調配物或水溶液以供儲存。參見Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版(Osol編1980)。此等添加劑在所用劑量及濃度下對接受者必須無毒。

緩衝劑幫助維持pH值在接近生理條件之範圍內。其可以範圍為約2 mM至約50 mM之濃度存在。適用於本發明之緩衝劑包括有機酸與無機酸兩者及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩衝液(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩衝液(例如琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、反丁烯二酸鹽緩衝液(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸單鈉混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二鈉混合物、反丁烯二酸單鈉-反丁烯二酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩衝液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)及乙酸鹽緩衝液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可使用磷酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝液及三甲胺鹽(諸如Tris)。

可添加防腐劑以阻止微生物生長且其添加量範圍可為0.2%-1%(w/v)。適用於本發明之防腐劑包括苯酚、苄醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯化十八基二甲基苄基銨、鹵化苯甲烴銨(例如，氯化物、溴化物及碘化物)、氯化六羥季銨及對羥基苯甲酸烷基酯(諸如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇及3-戊醇。可添加等張劑(有時稱為「穩定劑」)以確保本發明之液體組合物的等張性且其包括多元糖醇，例如為三元或三元以上的糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。穩定劑係指一大類賦形劑，其在功能上可介於增積劑(bulking agent)至使治療劑溶解或有助於防止變性或黏著於容器壁之添加劑之間。典型穩定劑可為多元糖醇(上文列舉)；胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油及其類似物，包括環醇(cyclitol)，諸如纖維醇(inositol)；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，諸如尿素、麩胱甘肽、硫辛酸(thioctic acid)、巰乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量多肽(亦即具有10個或10個以下殘基之肽)；蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣，諸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣，諸如乳糖、麥芽糖、蔗糖；及三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如葡聚糖。穩定劑可在每重量份活性蛋白質0.1至10,000重量之範圍內存在。

可添加非離子界面活性劑或清潔劑(亦稱為「濕潤劑」)以幫助溶解治療劑以及保護治療蛋白質免於發生攪拌誘發之聚集，其亦允許調配物暴露於承受應力之剪切面而不引起蛋白質變性。適合非離子界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、氧化異丙烯多元醇(Pluronic polyol)、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單醚(-20、-80等)。非離子界面活性劑可在約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml，例如約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml之範圍內存在。

其他混雜賦形劑包括增積劑(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E)及共溶劑。

本文調配物除本發明之抗VEGF抗體外亦可含有組合治療劑。適合組合治療劑之實例提供於下文6.10「組合療法」章節中。

皮下投藥之給藥時程可在每六個月一次至每日一次之間變化，此視眾多臨床因素而定，該等臨床因素包括疾病類型、疾病嚴重性及患者對抗VEGF抗體之敏感性。

欲投與之本發明之抗VEGF抗體的劑量將視以下而變化：特定抗體、疾病類型(例如癌症、發炎等)、個體、疾病嚴重性、個體之身體狀況、治療方案(例如是否使用組合治療劑)及所選投藥途徑，熟習此項技術者可容易地確定適當劑量。

熟習此項技術者應瞭解，本發明之抗VEGF抗體的最佳量及個別劑量之間隔將決定於所治療病狀之特性及程度、投藥形式、途徑及部位以及所治療特定個體之年齡及狀況，且醫師將最終確定欲使用之適當劑量。每當適當時可重複該劑量。若顯現副作用，則可根據常規臨床實踐來改變或降低給藥之量及/或頻率。

6.10　組合療法

下文描述組合方法，其中可利用本發明之抗VEGF抗體。本發明之組合方法涉及投與患者至少兩種藥劑，第一藥劑為本發明之抗VEGF抗體，且第二藥劑為組合治療劑。抗VEGF抗體與組合治療劑可同時、依序或分別投與。

本發明之組合治療方法可產生比加性效應大之效應，提供治療益處，其中抗VEGF抗體或組合治療劑均不以單獨治療有效之量投與。

在本發明方法中，本發明之抗VEGF抗體及組合治療劑可並行(同時或依次)投與。如本文中所用，若本發明之抗VEGF抗體及組合治療劑在同一天(例如在同一患者就診期間)投與患者，則認為其為依次投與。依次投藥可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小時發生。相反，若本發明之抗VEGF抗體及組合治療劑在不同日投與患者(例如本發明之抗VEGF抗體及組合治療劑可按1天、2天或3天、一週、2週或每月之間隔投與)，則認為其為分別投與。在本發明之方法中，投與本發明之抗VEGF抗體可在投與組合治療劑之前或之後進行。

作為一非限制性實例，本發明之抗VEGF抗體及組合治療劑可並行投與持續一段時間，隨後為交替投與本發明之抗VEGF抗體及組合治療劑的第二時段。

由於投與本發明之抗VEGF抗體及組合治療劑具有潛在協同效應，所以此等藥劑可以在單獨投與該等藥劑中之一或兩者時不具治療有效性之量投與。

在某些態樣中，組合治療劑為抗血管生成劑、抗風濕病藥、消炎劑、化學治療劑、放射線治療劑、免疫抑制劑或細胞毒性藥。

可預期當用於治療各種疾病時，本發明之抗VEGF抗體可與適用於相同或類似疾病之其他治療劑組合。當用於治療癌症時，本發明抗體可與習知癌症療法(諸如手術、放射線療法、化學療法或其組合)組合使用。

在一些其他態樣中，可與本發明抗體一起用於組合腫瘤療法之其他治療劑包括與腫瘤生長有關之其他因子(諸如EGFR、ErbB2(亦稱為Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF-α)之拮抗劑，例如抗體。

有時，對於治療癌症及免疫疾病，投與患者一或多種細胞激素亦可能為有益的。在一較佳實施例中，將VEGF抗體與生長抑制劑共投與。

生長抑制劑之適合劑量為目前使用之劑量且可能由於生長抑制劑與抗VEGF抗體之聯合作用(協同作用)而降低。

對於治療癌症、免疫疾病及視網膜疾病，消炎劑可宜與本發明之抗VEGF抗體組合使用。消炎劑包括(但不限於)乙醯胺苯酚、雙苯羥基胺、嘜啶(meperidine)、地塞米松(dexamethasone)、頗得斯安(pentasa)、美沙拉嗪(mesalazine)、安腸克(asacol)、磷酸可待因(codeine phosphate)、貝諾酯(benorylate)、聯苯丁酮酸(fenbufen)、萘普生(naprosyn)、雙氯芬酸(diclofenac)、依託度酸(etodolac)及吲哚美辛(indomethacin)、阿斯匹靈(aspirin)及布洛芬(ibuprofen)。

對於治療癌症，化學治療劑可宜與本發明之抗VEGF抗體組合使用。化學治療劑包括(但不限於)放射性分子、毒素(亦稱為細胞毒素或細胞毒性劑，其包括任何對細胞活力有害之藥劑)、含有化學治療化合物之藥劑及脂質體或其他微脂粒。適合化學治療劑之實例包括(但不限於)1-去氫睾酮、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放線菌素D、阿德力黴素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、抗α5β1整合素抗體、烷基化劑、別嘌呤醇鈉(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、胺磷汀(amifostine)、安美達錠(anastrozole)、胺茴黴素(anthramycin，AMC)、抗有絲分裂劑、順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑、二胺基二氯鉑(diamino dichloro platinum)、蒽環黴素(anthracycline)、抗生素、抗代謝物、天門冬醯胺酶、BCG活體(膀胱內)、倍他米松磷酸鈉(betamethasone sodium phosphate)及乙酸倍他米松(betamethasone acetate)、比卡魯胺(bicalutamide)、硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate)、硫酸布他卡因(busulfan)、甲醯四氫葉酸鈣(calcium leucouorin)、卡奇黴素、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、環己亞硝脲(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱(Cladribine)、秋水仙素、結合雌激素、環磷醯胺、環硫磷醯胺、阿糖胞苷、細胞遲緩素B、環磷醯胺、達卡巴嗪(Dacarbazine)、放線菌素、放線菌素(dactinomycin，以前稱為放線菌素(actinomycin))、鹽酸道諾黴素、檸檬酸道諾黴素、地尼白介素-毒素連接物(denileukin diftitox)、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴甘露醇、二羥基炭疽菌素二酮、多西他賽、甲磺酸多拉司瓊(dolasetron mesylate)、鹽酸小紅莓、屈大麻酚(dronabinol)、大腸桿菌L-天門冬醯胺酶、伊洛昔單抗(eolociximab)、吐根素、依泊汀-α(epoetin-α)、伊文氏桿菌屬L-天門冬醯胺酶(Erwinia L-asparaginase)、酯化雌激素、雌二醇、雌莫司汀磷酸鈉、溴化乙錠、乙烯雌二醇(ethinyl estradiol)、依替膦酸鹽、依託泊苷嗜橙菌因子(etoposide citrororum factor)、磷酸依託泊苷、惠爾血添(filgrastim)、氟尿苷、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟達拉賓(fludarabine phosphate)、氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、醛葉酸、鹽酸吉西他濱、糖皮質素、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、短桿菌素D、鹽酸格拉司瓊(granisetron HCL)、羥基脲、鹽酸黃膽素(idarubicin HCL)、異環磷醯胺(ifosfamide)、干擾素α-2b、鹽酸伊立替康(irinotecan HCL)、來曲唑(letrozole)、甲醯四氫葉酸鈣、乙酸柳培林(leuprolide acetate)、鹽酸左旋咪唑(levamisole HCL)、利多卡因、環己亞硝脲(lomustine)、美登素類(maytansinoid)、鹽酸氮芥(mechlorethamine HCL)、乙酸甲羥助孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、鹽酸美法侖(melphalan HCL)、硫醇嘌呤(mercaptipurine)、巰乙磺酸鈉(mesna)、甲胺喋呤、甲基睪固酮、光神黴素、絲裂黴素C、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特(nilutamide)、乙酸奧曲肽、鹽酸昂丹司瓊、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸二鈉、噴司他丁(pentostatin)、鹽酸毛果芸香素(pilocarpine HCL)、吡利黴素(plimycin)、以聚苯丙生20為載體的卡莫司汀植入劑(polifeprosan 20 with carmustine implant)、卟非姆鈉(porfimer sodium)、普魯卡因、鹽酸丙卡巴肼(procarbazine HCL)、普萘洛爾(propranolol)、利妥昔單抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、鏈佐黴素(streptozotocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、替尼泊甙(teniposide)、特諾波賽(tenoposide)、睾內酯(testolactone)、四卡因(tetracaine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、硫鳥嘌呤、噻替派、鹽酸拓朴替康(topotecan HCL)、檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、維甲酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、硫酸長春鹼(vinblastine sulfate)、硫酸長春新鹼(vincristine sulfate)及酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate)。

任何可與本發明之抗VEGF抗體結合使用的抗血管生成劑包括彼等由Carmeliet及Jain,2000,Nature 407:249-257所列舉者。在某些實施例中，抗血管生成劑為另一VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑，諸如VEGF變異體、可溶性VEGF受體片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR之適體、中和抗VEGFR抗體、低分子量VEGFR酪胺酸激酶抑制劑及其任何組合。或者，或此外，可共投與患者兩種或兩種以上抗VEGF抗體。

在某些實施例中，可將激素療法與本發明之抗VEGF抗體結合使用。在一些實施例中，激素療法包括一或多種可抑制雌激素及/或孕酮促進癌細胞生長之藥劑，例如選擇性雌激素受體調節劑(諸如他莫昔芬)、芳香酶抑制劑(諸如安美達錠()或來曲唑(Femara))、芳香酶去活劑(諸如依西美坦(exemestane，))或雌激素產生抑制劑(諸如戈舍瑞林(Zoladex))。在其他實施例中，激素療法為一或多種可抑制激素自卵巢產生之藥劑。

在一些態樣中，抗VEGF抗體可與小分子蛋白質酪胺酸激酶(PTK)抑制劑結合使用。在一些實施例中，PTK抑制劑對VEGF受體酪胺酸激酶具有特異性。在其他實施例中，PTK抑制劑結合至酪胺酸激酶之VEGF受體家族中的一個以上成員(例如VEGFR-1、VEGFR-2)。在其他實施例中，適用於本發明之組合物及方法中的蛋白質酪胺酸激酶抑制劑包括PTK抑制劑，其不是選擇性結合至受體酪胺酸激酶之VEGF家族，而是亦結合至其他蛋白質家族(諸如HER2、HER3、HER4、PDGFR及/或Raf)之酪胺酸激酶結構域。

在一些實施例中，酪胺酸激酶為受體酪胺酸激酶，亦即，為具有細胞外配體結合域且可由一或多個配體之結合而活化之較大蛋白質的細胞內結構域。在某些實施例中，蛋白質酪胺酸激酶為非受體酪胺酸激酶。可用於本發明方法中之PTK抑制劑包括(但不限於)吉非替尼(gefitinib)(ZD-1839，)、埃羅替尼(erlotinib)(OSI-1774，Tarceva^TM )、卡奈替尼(canertinib)(CI-1033)、凡德他尼(vandetanib)(ZD6474，)、酪胺酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)AG-825(CAS 149092-50-2)、拉帕替尼(lapatinib)(GW-572016)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006)、AG-494(CAS 133550-35-3)、RG-13022(CAS 149286-90-8)、RG-14620(CAS 136831-49-7)、BIBW 2992(Tovok)、酪胺酸磷酸化抑制劑9(CAS 136831-49-7)、酪胺酸磷酸化抑制劑23(CAS 118409-57-7)、酪胺酸磷酸化抑制劑25(CAS 118409-58-8)、酪胺酸磷酸化抑制劑46(CAS 122520-85-8)、酪胺酸磷酸化抑制劑47(CAS 122520-86-9)、酪胺酸磷酸化抑制劑53(CAS 122520-90-5)、紫鉚花素(butein)(1-(2,4-二羥苯基)-3-(3,4-二羥苯基)-2-丙烯-1-酮2',3,4,4'-四羥查酮；CAS 487-52-5)、薑黃素(curcumin)((E,E)-1,7-雙(4-羥基-3-甲氧苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮；CAS 458-37-7)、N4-(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-N6,N6-二甲基-吡啶并-[3,4-d]-嘧啶-4,6-二胺(202272-68-2)、AG-1478、AG-879、環丙烷甲酸-(3-(6-(3-三氟甲基-苯胺基)-嘧啶-4-基胺基)-苯基)-醯胺(CAS 879127-07-8)、N8-(3-氯-4-氟苯基)-N2-(1-甲基哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺二鹽酸鹽(CAS 196612-93-8)、4-(4-苄氧苯胺基)-6,7-二甲氧喹唑啉(CAS 179248-61-4)、N-(4-((3-氯-4-氟苯基)胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基)2-丁醯胺(CAS 881001-19-0)、EKB-569、HKI-272及HKI-357。

在一特定實施例中，本發明之抗VEGF抗體與靜脈內基於5-氟尿嘧啶之化學療法組合使用。該組合尤其適用於第一線或第二線治療患有結腸或直腸轉移癌之患者。

在另一特定實施例中，本發明之抗VEGF抗體與卡鉑及太平洋紫杉醇組合使用。該組合尤其適用於第一線治療患有不可切除、局部晚期、反覆性或轉移性之非鱗狀非小細胞肺癌的患者。

在另一特定實施例中，本發明之抗VEGF抗體與太平洋紫杉醇組合使用。該組合尤其適用於治療尚未接受用於轉移性HER2陰性乳癌之化學療法的患者。

對於治療視網膜疾病，本發明之抗VEGF抗體可與以下組合使用：E10030，一種抗血小板衍生生長因子(PDGF)聚乙二醇化適體；ARC1905，一種靶向補體級聯之C5組分的聚乙二醇化適體；及伏洛昔單抗(volociximab)，一種靶向α5β1整合素跨膜受體之單株抗體；用之光動力學療法(PDT)；或，一種適體(哌加他尼鈉(pegaptanib sodium))。

6.11　治療方案

本發明提供包括投與本發明之抗VEGF抗體的治療方案。治療方案將視患者年齡、重量及疾病狀況而變化。治療方案可持續2週至無限期。在特定實施例中，治療方案持續2週至6個月、3個月至5年、6個月至1或2年、8個月至18個月，或其類似時間。治療方案可為不變劑量方案或多變劑量方案。

對於下述劑量例示性方案，抗VEGF抗體可以適於皮下投藥之無菌、不含防腐劑溶液形式來投與。

對於治療轉移性結腸直腸癌症，本發明之抗VEGF抗體與團注IFL(伊立替康、5-氟尿嘧啶及甲醯四氫葉酸方案)一起以每2週0.5-15 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在特定實施例中，與團注IFL一起，劑量為每兩週1-4 mg/kg、2-6 mg/kg、0.5-3 mg/kg、1-10 mg/kg、3-4.8 mg/kg或1-4.5 mg/kg。

在另一個治療轉移性結腸直腸癌症之實施例中，本發明之抗VEGF抗體與FOLFOX4(奧沙利鉑(oxaliplatin)、甲醯四氫葉酸及氟尿嘧啶方案)一起以每2週1-30 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在特定實施例中，與FOLFOX4一起，劑量為每兩週2-9 mg/kg、3-12 mg/kg、1-7.5 mg/kg、2-20 mg/kg、6-9.75 mg/kg或4-9.5 mg/kg。

對於治療非鱗狀非小細胞肺癌，本發明之抗VEGF抗體與卡鉑/太平洋紫杉醇一起以每三週2-40 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在特定實施例中，與卡鉑/太平洋紫杉醇一起，劑量為每三週5-14 mg/kg、4-20 mg/kg、10-17.5 mg/kg、7-14 mg/kg、10-30 mg/kg或3-30 mg/kg。

對於治療轉移性乳癌，本發明之抗VEGF抗體與太平洋紫杉醇一起以每兩週0.5-20 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在特定實施例中，與太平洋紫杉醇一起，劑量為每兩週1-4 mg/kg、2-6 mg/kg、0.5-3 mg/kg、1-10 mg/kg、3-4.8 mg/kg或1-4.5 mg/kg。

對於治療轉移性乳癌，本發明之抗VEGF抗體作為單藥療法以每兩週0.5-20 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在特定實施例中，作為單藥療法，劑量為每兩週1-4 mg/kg、2-6mg/kg、0.5-3 mg/kg、1-10 mg/kg、3-4.8 mg/kg或1-4.5 mg/kg。

對於治療年齡相關之黃斑部變性(AMD)，一月(約28天)一次以0.1-1 mg之劑量藉由玻璃體內注射來投與本發明之抗VEGF抗體。在特定實施例中，一月(約28天)一次藉由玻璃體內注射投與之劑量為0.1-0.4 mg、0.2-0.6 mg、0.1-0.25 mg、0.25-0.5 mg、0.25-0.75 mg、或0.3-0.45 mg。在一特定實施例中，用本發明之抗VEGF抗體治療的患者患有濕性AMD。在另一特定實施例中，患者患有乾性AMD。

6.12　診斷及醫藥套組

本發明涵蓋含有本發明之抗VEGF抗體(包括抗體結合物)之醫藥套組。醫藥套組為包含本發明之抗VEGF抗體(例如呈凍乾形式或呈水溶液)及一或多種以下物質之包裝：

‧　組合治療劑，例如上文6.10「組合療法」章節中所述；

‧　用於投與抗VEGF抗體之裝置，例如筆、針及/或注射器；及

‧　用於再懸浮抗體之醫藥級水或緩衝液(若抗體呈凍乾形式時)。

在某些態樣中，分別包裝各單位劑量之抗VEGF抗體，且套組可含有一或多個單位劑量(例如兩個單位劑量、三個單位劑量、四個單位劑量、五個單位劑量、八個單位劑量、十個單位劑量，或十個以上單位劑量)。在一特定實施例中，將一或多個單位劑量各自置於注射器或筆中。

本文亦涵蓋含有本發明之抗VEGF抗體(包括抗體結合物)之診斷套組。診斷套組為一種包含本發明之抗VEGF抗體(例如呈凍乾形式抑或呈水溶液)及一或多種適用於進行診斷檢定之試劑的包裝。當抗VEGF抗體用酵素標記時，套組可包括為該酵素所需之受質及輔因子(例如提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體)。此外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝劑(例如阻斷緩衝劑或溶解緩衝劑)及其類似物。在某些實施例中，包括於診斷套組中之抗VEGF抗體固定於固體表面上，或在套組中包括上面可固定有抗體之固體表面(例如載片)。可大幅改變各種試劑之相對量以提供實質上使檢定敏感度最佳之試劑溶液中的濃度。在一特定實施例中，抗體及一或多種試劑可以乾粉(通常經凍乾)之形式提供(以個別方式或以組合方式)，該等乾粉包括在溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液的賦形劑。

7.實例1：貝伐單抗之T細胞抗原決定基之鑑別

7.1　材料及方法

7 . 1 . 1 　 肽

使用多中心(multi-pin)形式由模擬抗原表位(Mimotope)(Adelaide，Australia)合成肽。合成出貝伐單抗輕鏈及重鏈V區之序列，其呈有12個胺基酸重疊之15聚體肽形式(表3及4)，總計為69種肽。使肽凍乾且以約1-2 mg/mL再懸浮於DMSO(Sigma-Aldrich)中。保持儲備肽冷凍於-20℃下。

7 . 1 . 2 　 人類末梢血液單核細胞

社區型供體白血球層產物(Community donor buffy coat product)購自Stanford Blood Center,Palo Alto,CA。用不含鈣或鎂之DPBS按1:1 v:v稀釋白血球層物質。用12.5 ml之FicollPaque-PLUS(GE Healthcare)使所稀釋之白血球層物質(25-35 ml)處於50 ml錐形離心管(Sarsted或Costar)下層。在室溫下以900 g將樣本離心30分鐘。自界面收集末梢血液單核細胞(PBMC)。添加DPBS以使最終體積達到50 ml且以350 g將細胞離心5分鐘。將經集結之細胞再懸浮於DPBS中且加以計數。

7.1.3樹突狀細胞

為了分離樹突狀細胞，用含10⁸ 個新鮮分離之PBMC的AIM V培養基(Invitrogen)(總體積為30 ml)接種T75培養瓶(Costar)。將過量PBMC以於90%胎牛血清(FCS)、10%DMSO中5×10⁷ 個細胞/毫升之形式冷凍於-80℃下。在37℃下於5% CO₂ 中培育T75培養瓶2小時。移除非黏著細胞，且用DPBS洗滌黏著單層細胞。為了將樹突狀細胞與單核細胞區分開來，添加30 ml含有800個單位/毫升GM-CSFA(R and D Systems)及500個單位/毫升IL-4(R and D Systems)的AIMV培養基。將培養瓶培育5天。在第5天添加IL-1α(Endogen)及TNFα(Endogen)達到50 pg/mL及0.2 ng/mL。將培養瓶再培育兩天。在第7天，藉由添加3 ml含有0.5至1.0 mg絲裂黴素C(Sigma-Aldrich)之100 mM EDTA達到最終濃度為10 mM EDTA及16.5至33 μg/mL絲裂黴素C來收集樹突狀細胞。在37℃及5% CO₂ 下再培育培養瓶1小時。收集樹突狀細胞，且用AIM V培養基洗滌2-3次。

7.1.4　細胞培養

在第7天，在37℃水浴中迅速解凍先前冷凍之自體PBMC。立即將細胞稀釋於DPBS或AIM V培養基中且以350 g離心5分鐘。藉由陰性選擇使用磁珠(Easy-Sep CD4⁺ 套組，Stem Cell Technologies)來增濃CD4⁺ 細胞。在96孔圓底培養盤(Costar 9077)中以每孔每2×10⁴ 個樹突狀細胞對應2×10⁵ 個CD4⁺ T細胞來共培養自體CD4⁺ T細胞及樹突狀細胞。以約5 μg/mL添加肽。對照孔僅含有DMSO(Sigma)媒劑(0.25% v:v)。陽性對照孔含有0.25%之DMSO及1 μg/mL之破傷風類毒素(List Biologicals或CalBioChem)。將培養物培育5天。在第5天，每孔添加0.25 μCi之氚化胸腺嘧啶(Amersham或GE Healthcare)。在第6天，使用Packard Filtermate細胞收集器將培養物收集至過濾墊(filtermat)。使用Wallac MicroBeta 1450閃爍計數器(Perkin Elmer)進行閃爍計數。

7.1.5　數據分析

藉由對6至12個重複實驗之個別結果求平均值來計算平均背景CPM值。對四個陽性對照孔之CPM值求平均值。對各肽之重複實驗孔或一式三份孔求平均值。藉由用平均對照值除平均實驗CPM值來計算陽性對照孔及肽孔之刺激指數值。為了包括在資料集中，需要破傷風類毒素陽性對照孔中大於3.0之刺激指數。記錄產生2.95或2.95以上之刺激指數的任何肽之反應。使用來自一具有99個供體之組的末梢血液樣本來測試肽。彙集對所有肽之反應。對於所測試之各肽，計算在2.95或2.95以上之刺激指數下起反應之供體組(donorset)所佔的百分比。此外，亦計算對所有供體之平均刺激指數。

7.2　結果

7.2.1　貝伐單抗V _H 及V _L 區中CD4 ⁺ T細胞抗原決定基之鑑別

藉由分析在具有99個供體之組內對肽之反應百分比來鑑別CD4⁺ T細胞抗原決定基肽。對所測試之說明貝伐單抗重鏈及輕鏈V區之所有肽計算平均反應百分比及標準偏差。大於或等於平均背景反應加上3個標準偏差之反應率視為潛在CD4⁺ T細胞抗原決定基。對於貝伐單抗輕鏈V區，測試32種肽(表3)，所得平均背景反應百分比為2.1±2.7%。背景以上之3個標準偏差經測定為10.2%。在貝伐單抗輕鏈肽資料集中，一種在位置13處之肽(Q40-T54)展現此種程度的反應，反應率為15.2%(圖2A)。對於貝伐單抗重鏈V區，測試37種肽(表4)。平均背景反應百分比為2.8±3.1%。背景以上之3個標準偏差為12.1%。在貝伐單抗重鏈資料集內之一種肽#18(N52-R56)達到16.2%之反應百分比(圖3A)。重鏈資料集中在位置#30處之第二肽達成9.1%之反應率，且由於刺激指數增加而被視為抗原決定基(參見下文)。

計算資料集中所有肽之平均刺激指數。輕鏈肽13之高平均刺激指數為1.82±0.24 s.e.m.(圖2B)。重鏈肽#18之平均刺激指數值為2.16±0.35 s.e.m.(圖3B)。位置#30處之肽由於平均刺激指數升高及反應率在平均值以上而返回1.45+0.18 s.e.m.之平均刺激指數(圖3B)。當測定該抗體V區之CD4⁺ T細胞抗原決定基含量時包括位置#30處之肽。所有此等刺激指數值皆顯著高於兩個資料集中所有肽之平均刺激指數(所有69種重鏈及輕鏈肽之平均刺激指數為1.14±0.07)。

此等數據表明在貝伐單抗V區中有三個CD4⁺ T細胞抗原決定基區(表5)。在V_L 區中，在肽位置13處發現一抗原決定基，其涵蓋構架2及兩個來自CDR2之胺基酸。序列含有在人類化期間插入該序列中之鼠類回復突變(V46)。在表5中，對源自CDR之胺基酸加下劃線。在重鏈中，鑑別出兩個抗原決定基肽區。位置#18處之較強抗原決定基涵蓋所有CDR2。第二抗原決定基肽區含有構架3及CDR3胺基酸。

7 . 2 . 2 　 貝伐單抗變異抗體之免疫原性降低之變異體

對貝伐單抗進行突變分析(參見下文實例2)。基於結合突變分析進行之抗原結合研究，鑑別出CDR-H2及CDR-H3區內之一組不會顯著降低抗體對VEGF之親和力的候選胺基酸取代(表6)。此等胺基酸取代經單獨及組合測試以鑑別相較於野生型抗體，免疫原性有降低之貝伐單抗的變異體。

8.實例2：對VEGF之親和力有增加的貝伐單抗之變異體的鑑別

對貝伐單抗抗體進行綜合突變分析以鑑別相較於貝伐單抗，對VEGF之親和力有增加的突變體。藉由BIAcore對候選高親和力突變體進行分析以證實其結合特徵：相較於貝伐單抗，對VEGF之親和力有增加。

8.1　材料及方法

8.1.1　BIAcore

將十五個變異貝伐單抗V_H 區構築體連同未經修飾之V_L 區一起選殖入含有人類IgG₁ 之質體中，藉由短暫轉染在293T/17細胞株中表現，且藉由蛋白A或蛋白G親和力法來純化抗體。藉由使用BIAcore 2000及3000表面電漿子共振系統(BIAcore,GE Healthcare,Piscataway,NJ)來測定抗體對VEGF(R&D systems,Minneapolis,MN)之親和力。首先使用標準BIAcore胺偶合試劑(N-乙基-N'-二甲胺基-丙基碳化二亞胺，EDC；N-羥基丁二醯亞胺，NHS；及鹽酸乙醇胺，pH值8.5)將多株山羊抗人類Fc抗體(Jackson Immunoresearch)固定至生物感測器表面，隨後在平行表面上以5 μL/min之低流速捕捉抗VEGF抗體(貝伐單抗及貝伐單抗變異體)。將RL保持較低以使歸因於VEGF之二聚特性的親和力最小。未於參考表面上捕捉抗體以充當陰性對照。隨後，以50 μL/min之流速持續兩分鐘將VEGF注射至所有流槽中以監測締合，隨後為持續25分鐘流過HBS-P操作緩衝液(10 mM HEPES、150 mM氯化鈉、0.005% P-20，pH值7.4)以監測解離階段。在各循環中，將VEGF以VEGF介於0 nM與512 nM之間且呈四倍增加之6個不同濃度注射於表面上。在各循環結束時，以兩個簡短脈衝用1.5% H₃ PO₄ 在100 μL/min流速下再生表面。將結合數據擬合成1:1朗繆爾模型以由BIAevaluate軟體求出結合常數。在各分析中應用雙重參考以消除參考表面及僅有緩衝液之對照組的背景反應。分析至少三次獨立測定之所有結合動力學數據。

8.2　結果

結果呈現為絕對數及相較於野生型改良之倍數。幾乎所有列出之變異體當相較於貝伐單抗或野生型時皆具有改良之締合(k_on )及解離(k_off )速率(表7)。變異體之最終親和力值在0.1 nM範圍內且對應於SEQ ID NO: 82之變異體達到低至0.08 nM。此等值與在此等實驗中所測得之親和力為1.9 nM之貝伐單抗形成對比。

表8及表9展示初步結合研究顯示對VEGF之親和力高於貝伐單抗(數據未示)的其他重鏈變異體。表10展示初步研究指示對VEGF之親和力類似於貝伐單抗(數據未示)的重鏈變異體。表11展示初步研究指示對VEGF之親和力類似於貝伐單抗(數據未示)的輕鏈變異體。

9.實例3:去免疫之變異肽之選擇

產生對應於貝伐單抗之免疫原性區域(參見實例1)的變異肽(表14-16)。基於實例2中描述之綜合突變分析來選擇變異肽，其中鑑別出不會實質上降低貝伐單抗對VEGF之結合親和力的CDR修飾。

總共合成77種肽且基於抗原結合研究加以測試，包括各親本15聚體肽之兩種合成法。利用7.1「材料及方法」章節中描述之方法用親本肽及變異肽測試總共93個供體且結果展示於圖4A-4C中。特定言之，圖4A-4C展示對突變貝伐單抗抗原決定基肽之CD4⁺ T細胞反應。用空心標記指示對未經修飾之親本抗原決定基序列的平均反應。大圓指示表17(參見下文)中提及之所選肽。圖4A展示V_H CDR2肽；圖4B展示V_H CDR3肽；且圖4C展示V_L CDR2肽。所選肽之免疫原性數據展示於表17中。

對於重鏈可變區CDR2肽，在該研究中對親本肽之平均反應百分比為5.38%及6.45%。三種突變肽展示相較於親本肽，總反應率及平均刺激指數降低。

重鏈可變區CDR3抗原決定基肽之親本肽反應率在該研究中為7.53%及6.45%。發現了展示相較於親本肽總反應降低之單突變肽序列。

最後，輕鏈可變區CDR2肽親本反應率在該研究中為25.8%及15%。鑑別出一種展示相較於親本肽總免疫原性降低之突變肽。

為了證實去免疫之突變體相較於貝伐單抗維持對VEGF之親和力，使用流動式細胞測量術來比較在經修飾之抗原決定基肽中併有突變之變異抗體(呈單一或雙重胺基酸修飾形式)與貝伐單抗的結合性質。若干去免疫之突變體對VEGF之親和力與貝伐單抗相當或有增加。

在一項研究中，用3 nM結合有Alexa647之rHuVEGF(Invitrogen目錄號PHG0143)及呈1:400稀釋度之山羊抗人類κ RPE(Southern Biotech目錄號2063-09)染色表現表面結合形式之貝伐單抗變異體的經短暫轉染之293c18細胞。藉由流動式細胞測量術使用DakoCytomation CyAn ADP流式細胞儀來收集數據且使用Treestar's FloJo分析程式加以分析。該研究中量測之平均螢光強度(MFI)列於表18中。

在另一研究中，量測貝伐單抗及變異抗體與VEGF結合之EC₅₀ 。使用貝伐單抗及其變異體以及如上所述的結合有Alexas647之rHu VEGF來產生抗體滴定曲線，其中將VEGF自5 μM以兩倍稀釋度連續稀釋至0.01 μM。在表19中展示EC₅₀ 值。

特定實施例、參考文獻之引用

本申請案中引用之所有公開案、專利、專利申請案及其他文獻皆出於所有目的而以全文引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已出於所有目的而個別地將各個別公開案、專利、專利申請案或其他文獻以引用的方式併入一般。儘管已說明及描述各種特定實施例，但應瞭解可在不脫離本發明之精神及範疇的情況下作出各種變化。

【表格簡單說明】

表1 展示貝伐單抗重鏈CDR中之胺基酸之編號。CDR 1-3分別被揭示為SEQ ID NO: 3-5。

表2 展示貝伐單抗輕鏈CDR中之胺基酸之編號。CDR 1-3分別被揭示為SEQ ID NO: 6-8。

表3 展示已測試過免疫原性之貝伐單抗V_L 肽。

表4 展示已測試過免疫原性之貝伐單抗V_H 肽。

表5 展示貝伐單抗中經鑑別之CD4⁺ T細胞抗原決定基區域。對CDR區域加下劃線。

表6 展示CDR-H2及CDR-H3中降低貝伐單抗免疫原性之候選突變。表6中之胺基酸編號對應於貝伐單抗重鏈中之Kabat編號。

表7 展示如經由表面電漿子共振分析得知使K_D 改良的貝伐單抗中之重鏈CDR胺基酸取代。Δk_on 係指k_on 之改良倍數(突變體/WT)。Δk_off 係指k_off 之改良倍數(WT/突變體)。ΔK_D 係指突變體相對於野生型之K_D 的改良。表7中之胺基酸編號對應於貝伐單抗重鏈中之Kabat編號。

表8 展示初步結合研究指示可增加對VEGF之親和力(數據未示)的貝伐單抗重鏈CDR中之突變。表8中之胺基酸編號對應於貝伐單抗重鏈中之Kabat編號。

表9 展示初步研究指示可增加對VEGF之親和力(數據未示)的貝伐單抗重鏈CDR中之突變。表9中之胺基酸編號對應於貝伐單抗重鏈中之Kabat編號。

表10 展示不影響結合且可併入本發明抗體中的貝伐單抗重鏈CDR中之突變。表10中之胺基酸編號對應於貝伐單抗重鏈中之Kabat編號。

表11 展示不影響結合且可併入本發明抗體中的貝伐單抗輕鏈CDR中之突變。表11中之胺基酸編號對應於貝伐單抗輕鏈中之Kabat編號。

表12-1至12-9 展示可併入本發明抗體中的貝伐單抗重鏈CDR中之已知突變。表12-1至12-9中之各列皆包括不同已知變異體。對於各變異體，已知CDR序列用陰影表示。表12-1至12-9中所標識之各變異體的序列標識符分別列於表20-1至20-9中。CDR-H1欄提供CDR-H1之部分序列。未展示CDR-H1之最終天冬醯胺。該部分序列對應於SEQ ID NO: 411。儘管在該部分序列情形下展示CDR-H1中之已知突變，但應注意到突變存在於全長CDR之情形下。

表13 展示可併入本發明抗體中的貝伐單抗輕鏈CDR中之已知突變。表13中之各列皆包括不同已知變異體。對於各變異體，已知CDR序列用陰影表示。表13中所標識之各變異體的序列標識符列於表20-10中。

表14 展示已測試過免疫原性之貝伐單抗CDR2 V_H 肽，其中未自SEQ ID NO: 62改變之殘基由空白方框指示。亦提供CD4⁺ T細胞檢定結果。

表15 展示已測試過免疫原性之貝伐單抗CDR3 V_H 肽，其中未自SEQ ID NO: 74改變之殘基由空白方框指示。亦提供CD4⁺ T細胞檢定結果。

表16 展示已測試過免疫原性之貝伐單抗CDR2 V_L 肽，其中未自SEQ ID NO: 25改變之殘基由空白方框指示。亦提供CD4⁺ T細胞檢定結果。

表17 展示貝伐單抗中之三個CD4⁺ T細胞抗原決定基之所選抗原決定基修飾。

表18 展示單可變區突變體及其相關平均螢光強度(MFI)計分。

表19 展示組合可變區突變體及其相關EC₅₀ 。

表20-1至20-10 展示SEQ ID NO，其中已知、對應於貝伐單抗之CDR的變異體分別列於表12-1至12-9及表13中。N/A指示未知CDR序列。

<110> 美商菲錫特生物科技股份有限公司

<120> 抗-VEGF抗體及其用途

<130> 381493-223WO(104004)

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<141> 2010-06-17

<150> 61/218,005

<151> 2009-06-17

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註釋=「人工序列之說明：合成肽」

<400> 413

<210> 415

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> /註釋=「人工序列之說明：合成肽」

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> /註釋=「人工序列之說明：合成肽」

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> /註釋=「人工序列之說明：合成肽」

<400> 417

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註釋=「人工序列之說明：合成肽」

<400> 418

圖1A-ID。圖1A 展示貝伐單抗重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列，分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2，CDR區用粗體、加下劃線之文字表示。圖1B 展示貝伐單抗之CDR序列及相應序列標識符。圖1C 展示蘭尼單抗重鏈及輕鏈之胺基酸序列，分別為SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10，CDR區用粗體、加下劃線之文字表示。圖1D 展示蘭尼單抗之CDR序列及相應序列標識符。

圖2A-2B 展示貝伐單抗V_L 肽反應。圖2A展示在2.95或2.95以上之刺激指數下對各V_L 肽起反應之供體所佔的百分比。N=99個供體。圖2B展示各肽對所有99個供體之平均刺激指數加上或減去標準誤差。

圖3A-3B 展示貝伐單抗V_H 肽反應。圖3A展示在2.95或2.95以上之刺激指數下對各V_H 肽起反應之供體所佔的百分比。N=99個供體。圖3B展示各肽對所有99個供體之平均刺激指數加上或減去標準誤差。

圖4A-4C 展示對突變貝伐單抗抗原決定基肽之CD4⁺ T細胞反應。用空心標記指示對未經修飾之親本抗原決定基序列的平均反應。大圓指示表17 中提及之所選變化。圖4A 係關於V_H CDR2肽；圖4B 係關於V_H CDR3肽；且圖4C 係關於V_L CDR2肽。

(無元件符號說明)

Claims (31)

1. 一種抗VEGF抗體或抗體之抗VEGF結合片段，其包含6個互補決定區(CDR)，其相較於具有對應於SEQ ID NO：3(CDR-H1)、SEQ ID NO：4(CDR-H2)、SEQ ID NO：5(CDR-H3)、SEQ ID NO：6(CDR-L1)、SEQ ID NO：7(CDR-L2)及SEQ ID NO：8(CDR-L3)之胺基酸序列之CDR的抗VEGF參考抗體或抗VEGF參考結合片段，具有一或多個胺基酸取代或胺基酸取代之組合，其中該一或多個胺基酸取代或胺基酸取代之組合係選自：(i)於CDR-H2中之K64S；(ii)於CDR-H2中之K64Q；(iii)於CDR-H2中之Y53F及K64Q；(iv)於CDR-H2中之Y53F及K64S；(v)於CDR-H3中之H97E；(vi)於CDR-H3中之Y98F；(vii)於CDR-H3中之H97E及Y98F；(viii)於CDR-H3中之H97P及Y98F；及視情況地，於CDR-L2中之T51A胺基酸取代。
2. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包括CDR-H2之取代K64S。
3. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包括CDR-H2之取代K64Q。
4. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包括CDR-H2之取代Y53F及K64Q。
5. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包括CDR-H3之取代H97E。
6. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包括CDR-H3之取代H97P及Y98F。
7. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包括CDR-H3之取代H97E及Y98F。
8. 如請求項1至7中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包括CDR-L2之取代T51A。
9. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTYTGEPTYAADFSR(SEQ ID NO：413)；CDR-H3之胺基酸序列YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：5)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FTSSLHS(SEQ ID NO：7)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
10. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTYTGEPTYAADFQR(SEQ ID NO：414)；CDR-H3之胺基酸序列YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：5)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FTSSLHS(SEQ ID NO：7)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
11. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTFTGEPTYAADFQR(SEQ ID NO：415)；CDR-H3之胺基酸序列YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：5)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FTSSLHS(SEQ ID NO：7)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
12. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：4)；CDR-H3之胺基酸序列YPEYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：416)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FTSSLHS(SEQ ID NO：7)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
13. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：4)；CDR-H3之胺基酸序列YPPFYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：417)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FTSSLHS(SEQ ID NO：7)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
14. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：4)；CDR-H3之胺基酸序列YPEFYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：418)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FTSSLHS(SEQ ID NO：7)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
15. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTYTGEPTYAADFSR(SEQ ID NO：413)；CDR-H3之胺基酸序列YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：5)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FASSLHS(SEQ ID NO：387)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
16. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTYTGEPTYAADFQR(SEQ ID NO：414)；CDR-H3之胺基酸序列YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：5)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FASSLHS(SEQ ID NO：387)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
17. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTFTGEPTYAADFQR(SEQ ID NO：415)；CDR-H3之胺基酸序列YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：5)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)； CDR-L2之胺基酸序列FASSLHS(SEQ ID NO：387)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
18. 如請求項1之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其包含以下序列：CDR-H1之胺基酸序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：3)；CDR-H2之胺基酸序列WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：4)；CDR-H3之胺基酸序列YPEFYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：418)；CDR-L1之胺基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：6)；CDR-L2之胺基酸序列FASSLHS(SEQ ID NO：387)；及CDR-L3之胺基酸序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：8)。
19. 如請求項1至7及9至18中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其：(i)分別為單株抗體或單株抗體之抗VEGF結合片段；及/或(ii)分別為人類或人類化抗體、或人類或人類化抗體之抗VEGF結合片段。
20. 如請求項1至7及9至18中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其為IgG。
21. 如請求項20之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其中該IgG為IgG₁ 或IgG₂ 。
22. 如請求項1至7及9至18中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其： a.在Fc區中包括一或多個可增加ADCC活性之突變；b.為未經海藻糖基化；及/或c.在Fc區中包括一或多個可增加與FcγR之結合或可增加與FcRn之結合的突變。
23. 如請求項1至7及9至18中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段，其除該一或多個突變之外，還具有對應於SEQ ID NO：1之V_H 序列及對應於SEQ ID NO：2之V_L 序列。
24. 一種抗體-藥物結合物，其包含如請求項1至23中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段。
25. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至23中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段或如請求項24之抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑。
26. 一種如請求項1至23中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段、如請求項24之抗體-藥物結合物或如請求項25之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療癌症之藥物。
27. 如請求項26之用途，其中該癌症為結腸轉移癌、直腸轉移癌、非鱗狀非小細胞肺癌或轉移性HER2陰性乳癌。
28. 如請求項27之用途，其中該非鱗狀非小細胞肺癌為不可切除、局部晚期、具反覆性或具轉移性者。
29. 一種如請求項1至23中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段、如請求項24之抗體-藥物結合物或如請求項25之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療年齡相關之黃斑部變性之藥物。
30. 一種如請求項1至23中任一項之抗VEGF抗體或抗VEGF結合片段、如請求項24之抗體-藥物結合物或如請求項25之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療免疫病症之藥物。
31. 如請求項30之用途，其中該免疫病症為類風濕性關節炎或格雷氏病(Grave's disease)。