CN102439040B - 抗TNF‑α抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对肿瘤坏死因子α(“TNF‑α”)的抗体，和所述抗体例如用于治疗与TNF‑α的活性和/或过量产生相关的疾病的用途。

Description

抗TNF-α抗体和其用途
相关申请案
本申请案主张2009年4月16日申请的美国临时申请案第61/170,053号的权益，所述申请案的内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表参考
与本发明同时提交的序列表以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及抗TNF-α抗体、包含抗TNF-α抗体的医药组合物和所述抗体的治疗用途。
背景技术
肿瘤坏死因子α(TNF-α)为由免疫系统的细胞释放且与免疫系统的细胞相互作用的促发炎性细胞因子。已显示TNF-α在包括慢性疾病(诸如类风湿性关节炎、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎和多发性硬化症)在内的多种人类疾病中上调。举例来说，TNF-α含量升高可见于类风湿性关节炎患者的滑液中且在作为类风湿性关节炎的标志的病理性炎症和关节破坏两者中起重要作用。
人类TNF-α为17kDa蛋白质，且活性形式以均三聚体形式存在(佩尼查(Pennica)等人，1984，自然(Nature)312：724-729；戴维斯(Davis)等人，1987，生物化学(Biochemistry)26：1322-1326；Jones等人，1989，自然(Nature)338：225-228)。TNF-α通过与共表达于大多数细胞类型上的两个结构相关但功能不同的细胞表面受体p55和p75相互作用来发挥其生物作用(罗伊斯切尔(Loetscher)等人，1990，细胞(Cell)61：351-9；史密斯(Smith)等人，1990，科学(Science)248(4958)：1019-23)。p55也称作p55R、p55TNFR、CD120a、TNFR I、TNFR1和TNFRSFIa。p75也称作p75R、p75TNFR、CD120b、TNFR II、TNFR 2和TNFRSFIb。这两种受体也通过蛋白水解以能够结合TNF-α的可溶性分子形式释放。
作为治疗疾病(具体来说，类风湿性关节炎)的方法，对TNF-α活性进行抑制已通过多种不同方式使用诸如抗体和可溶性受体等抑制剂达成。实例包括由伊姆耐斯公司(Immunex Corporation)以ENBREL出售的依那西普(etanercept)，其为包含两个p75可溶性TNF-受体结构域连接于人类免疫球蛋白Fc部分的重组融合蛋白。由森托科尔公司(Centocor Corporation)以REMICADE出售的英利昔单抗(Infliximab)为具有鼠类抗TNF-α可变结构域和人类IgG1恒定结构域的嵌合抗体。其它抑制剂包括经工程改造的TNF-α分子，其与天然TNF-α形成三聚体且阻止受体结合(斯蒂德(Steed)等人，2003，科学(Science)301：1895-1898；WO 03/033720；WO 01/64889)。这些抑制TNF-α活性的当前方法阻断TNF-α与p55和p75受体两者的结合(参见例如密斯(Mease)，2005，生物学疗法专家观点(Expert Opin.Biol.Therapy)5(11)：1491-1504)。由阿波特实验室(AbbottLaboratories)以HUMIRA出售的阿达木单抗(Adalimumab)为重组完全人类抗TNF-α抗体(图斯罗特(Tussirot)和温德林(Wendling)，2004，药物疗法专家观点(ExpertOpin.Pharmacother.)5：581-594)。阿达木单抗特异性结合TNF-α且阻断其与p55和p75细胞表面TNF-α受体的相互作用。阿达木单抗也在活体外通过补体依赖性细胞毒性(“CDC”)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)溶解表面表达TNF-α的细胞。阿达木单抗不结合淋巴毒素(TNF-β)或不使淋巴毒素(TNF-β)失活。阿达木单抗也调节由TNF诱导或调控的生物反应，所述生物反应包括负责白血球迁移的粘附分子(ELAM-1、VCAM-1和ICAM-1，IC50为1-2×10-10M)的含量变化。
尽管阿达木单抗为人类抗体，但当投予人类时，其可能会引发免疫反应。所述免疫反应可能引起免疫复合物介导的抗体或片段从循环中清除，并使反复投药不适用于治疗，从而降低对患者的治疗效益且限制抗体的再投予。
因此，需要提供克服一种或一种以上这些问题中的改良的抗TNF-α抗体或片段，例如通过产生亲和力比阿达木单抗高从而可以降低的剂量投予的变异体或免疫原性相较于阿达木单抗降低的变异体。
对本申请案的第4部分或任何其它部分中的任何参考文献的引用或标明不应视作承认所述参考文献可用作本发明的先前技术。
发明内容
本发明涉及相较于D2E7，与TNF-α的结合得到改良和/或免疫原性降低的抗TNF-α抗体D2E7的变异体。D2E7具有三个重链CDR，本文中称作(以氨基端至羧基端的顺序)CDR-H1(SEQ ID NO：5)、CDR-H2(SEQ ID NO：6)和CDR-H3(SEQ ID NO：7)；以及三个轻链CDR，本文中称作(以氨基端至羧基端的顺序)CDR-L1(SEQ ID NO：8)、CDR-L2(SEQ ID NO：9)和CDR-L3(SEQ ID NO：10)。本发明的抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段一般相较于D2E7在至少一个CDR中具有至少一个氨基酸取代。
在某些方面中，至少一个氨基酸取代或取代的组合选自表11、表12和/或表25。其它突变(包括取代、缺失或插入)可选自表13-25中的一者或一者以上。
在某些方面中，本发明涉及相较于D2E7对TNF-α的结合性质得到改良(例如亲和力得到改良)的抗TNF-α抗体D2E7的变异体。在特定实施例中，本发明的抗体对TNF-α的亲和力大于D2E7，例如如由BIAcore所测量KD得到改良和/或如由竞争ELISA所测量亲和力得到改良。
在某些方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段包括至少一个选自以下的取代：CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的S3K、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的S3R、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的S3N、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的T4H、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的T4Q、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的T4V、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的T4F、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的T4W、CDR-L2(SEQ IDNO：9)中的T4Y、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的L5R、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的L5K、CDR-L2(SEQID NO：9)中的Q6K、CDR-L2(SEQ ID NO：9)中的Q6R、CDR-H1(SEQ ID NO：5)中的D1G、CDR-H1(SEQ ID NO：5)中的Y2H、CDR-H1(SEQ ID NO：5)中的A3G，和CDR-H2(SEQ ID NO：6)中的T3N。其它可并入亲和力改良的变异型抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段中的突变可为去免疫化取代(诸如表11中所述的取代)；以及其它不破坏抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段结合TNF-α的能力的突变(例如取代)，包括(但不限于)表13至24中所述的已知突变或表25中所述的突变。
在某些方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段包括至少一个选自以下的取代：CDR-L2中的T4F、CDR-L2中的T4W、CDR-L2中的T4Y、CDR-L2中的L5R、CDR-L2中的L5K、CDR-L2中的Q6R、CDR-H1中的Y2H、CDR-H1中的A3G，和CDR-H2中的T3N。其它可并入所述抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段中的突变或突变组合可选自表11和13到25中的一者或一者以上。
在某些其它方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段包括至少一个选自以下的取代：CDR-L2中的T4F、CDR-L2中的T4W、CDR-L2中的T4Y、CDR-L2中的L5R、CDR-L2中的L5K、CDR-L2中的Q6R、CDR-H1中的Y2H、CDR-H1中的A3G，和CDR-H2中的T3N。其它可并入所述抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段中的突变或突变组合可选自表11和13至18中的一者或一者以上。
在其它方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段在CDR-L1中包括取代G5S+A11S或G5S+A11G。其它可并入所述抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段中的突变或突变组合可选自表11到25中的一者或一者以上。
在某些方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段包括选自CDR-L2中的S3N、CDR-L2中的T4V、CDR-L2中的Q6K和CDR-H1中的D1G的取代与至少一个选自表11、12和25中的取代的组合。其它可并入所述抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段中的突变或突变组合可选自表11到24中的一者或一者以上。
在某些方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段包括选自CDR-L2中的S3N、CDR-L2中的T4V、CDR-L2中的Q6K和CDR-H1中的D1G的取代与至少一个选自以下的取代的组合：CDR-L2中的S3K、CDR-L2中的S3R、CDR-L2中的T4H、CDR-L2中的T4Q、CDR-L2中的T4F、CDR-L2中的T4W、CDR-L2中的T4Y、CDR-L2中的L5R、CDR-L2中的L5K、CDR-L2中的Q6R、CDR-H1中的Y2H、CDR-H1中的A3G，和CDR-H2中的T3N。
在某些方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段包括选自以下至少一者的取代组合：CDR-L2中的S3K、T4H、L5R和Q6R；S3K、T4Q、L5R和Q6K；S3K、T4Y和L5K；S3K和T4Y；S3N、T4V、L5R和Q6K；S3N、T4W、L5R和Q6R；S3R、T4F和L5R；S3R、T4F、L5R和Q6R；S3R、T4H和Q6K；S3R、T4W、L5K和Q6R；T4H、L5K和Q6K；T4H、L5K和Q6R；T4W、L5R和Q6R；和T4Y和L5R，其中6个CDR相较于抗体D2E7的CDR序列总共具有至多17个氨基酸取代。抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段任选包括一个或一个以上可选自表11到24中一者或一者以上的其它突变或突变组合。
在某些方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段包括一个或一个以上选自以下的取代或取代组合：CDR-L2中的S3K、S3R、S3N、T4F、T4W、T4Y、T4H、T4Q、T4V、L5R、L5K、Q6R和Q6K。其它可并入所述抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段中的突变或突变组合可选自表11到24中的一者或一者以上。
在其它方面中，本发明涉及相较于D2E7，免疫原性降低的抗TNF-α抗体D2E7的变异体。在某些方面中，抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段在CDR-L1(SEQ ID NO：8)中包括至少一个选自以下的取代或取代组合：R7Q；A11S；R7Q+A11S；N8T；N8T+A11S；I6T；A11G；I6T+A11G；Q4G；Q4G+A11S；Q4G+A11G；Q4H；Q4H+A11S；Q4R；Q4R+A11S；G5S；G5S+A11S；N8S+A11S；I6T+A11S；和N8T+A11G。其它可并入抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段中使抗原性降低的突变包括改良对TNF-α的结合性质的取代(诸如表12和/或表25中所述的取代)；以及其它不破坏抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段结合TNF-α的能力的突变(例如取代)，包括(但不限于)表13到25中所述的已知突变。
在某些方面中，本发明的抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段具有与D2E7的VH和VL序列具有80％至99％序列一致性的VH和VL序列，且相较于D2E7在至少一个CDR中包括至少一个氨基酸取代。在特定实施例中，重链和轻链相较于D2E7的VH和VL序列的序列一致性百分比各独立地选自至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列一致性。
在某些方面中，本发明的抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段在其CDR中相较于D2E7的CDR具有至多17个氨基酸取代。具有17个氨基酸取代且保持目标结合能力的变异型抗体已由波斯特罗姆(Bostrom)等人，2009，科学(Science)323：1610-14产生。本发明的抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段在其CDR中相较于抗体D2E7的CDR序列也可具有至多16个、至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个或至多4个氨基酸取代。
在特定实施例中，本发明的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段独立地：
●相较于D2E7的相应CDR具有至多一个，或至多两个，或至多三个CDR-H1取代；
●相较于D2E7的相应CDR具有至多一个、至多两个、至多三个、至多四个、至多五个或至多六个CDR-H2取代；
●相较于D2E7的相应CDR具有至多一个、至多两个、至多三个、至多四个或至多五个CDR-H3取代；
●相较于D2E7的相应CDR具有至多一个、至多两个、至多三个或至多四个CDR-L1取代；
●相较于D2E7的相应CDR具有至多一个、至多两个、至多三个或至多四个CDR-L2取代；以及
●相较于D2E7的相应CDR具有至多一个、至多两个、至多三个或至多四个CDR-L3取代。
本发明进一步提供医药组合物，其包含相较于D2E7对TNF-α的亲和力增加和/或免疫原性降低的经修饰的抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段。
在某些方面中，本发明的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段可为双特异性抗体或双特异性抗体的TNF-α结合片段。所述双特异性抗体可对TNF-α和另一种促发炎性细胞因子(诸如淋巴毒素、干扰素-γ或白介素-1)具有特异性。
本文提供包含编码本发明的抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段的核苷酸序列的核酸，也提供包含核酸的载体。另外，本文提供经包含编码抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段的核苷酸序列的载体转化的原核和真核宿主细胞，以及经工程改造以表达所述核苷酸序列的真核(诸如哺乳动物)宿主细胞。也提供通过培养宿主细胞制备抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段的方法。
本发明的抗TNF-α抗体和抗TNF-α结合片段适用于治疗免疫病症，例如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、甲状腺功能症(thyroidosis)、移植物抗宿主疾病、硬皮病、糖尿病、格雷夫氏病(Grave′s disease)、类肉瘤病、慢性发炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
应注意，除非本文另外明确规定，否则在本申请案中所使用(在专利申请案中也常见)的不定冠词“一”和定冠词“所述”意谓一个(一种)或一个(一种)以上。此外，在本申请案中所使用(在专利申请案中也常见)的术语“或”意谓转折连接词“或”或连接词“和”。
本说明书中所提及的所有出版物以引用的方式并入本文中。本说明书中已包括的对文件、法案、材料、装置、物品等的任何论述仅出于提供本发明背景的目的。不应视作承认任何或所有这些内容形成先前技术基础的一部分或为本发明相关领域中的普通常识，因为其在本申请案的优先权日以前即存在。
本发明的特征和优势将因下列对其实施例的详细描述而进一步变得显而易知。
附图说明
表1分别展示进行免疫原性测试的D2E7 VH肽和D2E7 VL肽。
表2展示D2E7中鉴别出的CD4+T细胞抗原决定基区域。CDR区加有下划线。
表3展示对D2E7 VL区肽抗原决定基的反应与第II类HLA的相关性和其相对风险。
表4展示D2E7 VL CDR1抗原决定基变异体的序列。测试总共99个捐献者。指示所测试各肽的反应者数目、反应者百分比和平均刺激指数。
表5展示CDR-L1中降低D2E7的免疫原性的候选突变。表5中氨基酸的编号对应于在D2E7轻链情形下的位置。
表6展示CDR-L1中相较于D2E7，不引起结合显著减少的取代的BIAcore和ELISA结果。表6中氨基酸的编号对应于D2E7轻链情形下的位置。KD(如由BIAcore所测量)和结合的IC50(如由ELISA所测量)的改良由“WTx”指示。CV％是指呈总测量值的百分比形式的标准差。
表7展示D2E7抗原决定基的所有单突变和双重突变的T细胞分析结果。肽1为亲本肽。对亲本肽的修饰呈黑体字型。
表8展示仅基于T细胞分析结果的优选抗原决定基肽变异体。表8中氨基酸的编号对应于D2E7轻链情形下的位置。
表9展示建构成含有优选变异型抗原决定基肽的抗体的抗增殖生物活性。亲本为未经修饰的D2E7抗体。表9中氨基酸的编号对应于D2E7轻链情形下的位置。
表10展示如由BIAcore所分析D2E7和D2E7变异体针对TNF-α的结合动力学。表10中氨基酸的编号对应于D2E7轻链情形下的位置。
表11展示可并入D2E7相关抗体中以降低其免疫原性的CDR-L1取代或取代组合。
表12展示在CDR-L1外部，相较于D2E7使KD(如由BIAcore所分析)、亲和力(如由ELISA所测量)或两者改良的CDR氨基酸取代。表12中氨基酸的编号对应于D2E7轻链和重链情形下的位置。KD(如由BIAcore所测量)和结合的IC50(如由ELISA所测量)的改良由“WTx”指示。CV％是指呈总测量值的百分比形式的标准差且“ND”意谓“未进行”。
表13展示CDR-H1中可并入本发明抗体中的已知突变。
表14展示CDR-H2中可并入本发明抗体中的已知突变。单个单元格中包括2个氨基酸指示CDR变异体在CDR中并有添加或插入。单元格的阴影指示CDR变异体缺乏画有阴影的氨基酸残基。
表15展示CDR-H3中可并入本发明抗体中的已知突变。
表16展示CDR-L1中可并入本发明抗体中的已知突变。单个单元格中包括两个氨基酸指示CDR变异体在CDR中并有添加或插入。
表17展示CDR-L2中可并入本发明抗体中的已知突变。单个单元格中包括两个氨基酸指示CDR变异体在CDR中并有所指示的额外N端氨基酸。
表18展示CDR-L3中可并入本发明抗体中的已知突变。单个单元格中包括两个氨基酸指示CDR变异体在CDR中并有所指示的额外N端氨基酸。
表19展示CDR-H1中可并入本发明抗体中的其它已知突变。
表20展示CDR-H2中可并入本发明抗体中的其它已知突变。
表21展示CDR-H3中可并入本发明抗体中的其它已知突变。
表22展示CDR-L1中可并入本发明抗体中的其它已知突变。
表23展示CDR-L2中可并入本发明抗体中的其它已知突变。
表24展示CDR-L3中可并入本发明抗体中的其它已知突变。
表25展示CDR-L2中相较于D2E7使KD(如由BIAcore所分析)、亲和力(如由ELISA所测量)或两者改良的点突变的组合。点突变可单独或组合并入本发明的抗体中。
图1A-1E。图1A展示D2E7重链和轻链的氨基酸序列，其中CDR区为粗体加下划线文字。图1B展示D2E7的CDR序列和相应序列识别符。图1C展示重链CDR编号与重链卡贝特编号之间的对应表。图1D展示轻链CDR编号与轻链卡贝特编号之间的对应表。图1E展示如美国专利第6,090,382号中所公开的D2E7的重链和轻链可变区的核苷酸序列(分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)。
图2展示对D2E7VL肽的反应百分比(下部)和平均刺激指数(上部)。
图3展示对D2E7 VH肽的平均刺激指数(上部)和反应百分比(下部)。在一个捐献者中第27号肽具有异常刺激指数，且以较暗阴影指示。
图4展示D2E7 VL CDR1抗原决定基肽变异体。空心符号(open symbol)指示对数据集中未经修饰亲本肽的多次重复测试。实心符号(filled symbol)表示独特肽丙氨酸扫描变异体。指示反应诱导性降低最多的变异体的序列。
图5展示D2E7VL CDR1抗原决定基肽变异体。空心符号指示对数据集中未经修饰亲本肽的多次重复测试。实心符号表示独特肽变异体。反应诱导性降低最多的变异体以圆圈指示。此图以图解方式表示表7的数据。
图6展示D2E7变异型抗体的竞争ELISA的结果。用TNF-α涂布ELISA板。所有孔中包括单一浓度的生物素化D2E7，且在其中滴定变异型抗体。计算各抗体的IC50值。实验进行3次。Y轴以亲本抗体结合百分比形式展示平均结果。
具体实施方式
7.1抗TNF-α抗体
本发明提供抗TNF-α抗体。除非另外指示，否则术语“抗体”(Ab)是指特异性结合特定抗原或可与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子，且包括抗体的多克隆形式、单克隆形式、遗传工程改造形式和以其它方式修饰的形式，包括(但不限于)嵌合抗体、人类化抗体、异源接合抗体(例如双特异性抗体、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体)，以及抗体的抗原结合片段(包括例如Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。此外，除非另外指示，否则术语“单克隆抗体”(mAb)意欲包括完整分子，以及能够特异性结合蛋白质的抗体片段(诸如Fab和F(ab′)2片段)两者。Fab和F(ab′)2片段缺乏完整抗体的Fc片段，更迅速地自动物或植物的循环中清除，且相较于完整抗体可具有较少非特异性组织结合(华尔(Wahl)等人，1983，核酸医学杂志(J.Nucl.Med.)24：316)。
术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中来自传统抗体的重链和轻链的可变结构域已联接形成一条链。
提及“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv或Fab的重链)的可变区。提及“VL”是指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)为具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体对特定目标展现结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏目标特异性的抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿(dalton)，由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。各重链在氨基端具有可变结构域(VH)，随后为多个恒定结构域。各轻链在氨基端具有可变结构域(VL)且在羧基端具有恒定结构域。
本发明的抗TNF-α抗体在细胞中结合人类TNF-α且抑制TNF-α受体活性。在不受任一理论束缚，本发明者相信抗体减少TNF-α与低亲和力TNF-α受体(p75)和高亲和力TNF-α受体(p55)两者的结合。
本发明的抗TNF-α抗体含有序列与抗体D2E7(也称作阿达木单抗或HUMIRA)的CDR相关的互补决定区(CDR)。
CDR在轻链和重链可变结构域两者中也称作高变区。可变结构域的较高度保守部分称作构架(FR)。如所属领域中所已知，视上下文和所属领域中已知的各种定义而定，界定抗体高变区的氨基酸位置/边界可有所不同。可变结构域中的一些位置可视作杂交型高变位置，因为这些位置按一组准则可视作处于高变区内，而按一组不同准则可视作处于高变区之外。这些位置中的一者或一者以上也可见于扩展的高变区中。本发明提供在这些杂交型高变位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR区，主要采用β折叠构型，由三个CDR连接，所述CDR形成连接β折叠结构的环(且在一些情况下，形成β折叠结构的一部分)。各链中的CDR由FR区以顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密接近保持在一起且与另一链中的CDR一起帮助形成抗体的目标结合位点(参见卡贝特(Kabat)等人，免疫学相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(国家卫生研究院(National Institute of Health)，马里兰州贝赛思达市(Bethesda，Md.)1987))。如本文所用，除非另外指示，否则根据卡贝特(Kabat)等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统对免疫球蛋白氨基酸残基进行编号。
D2E7的重链和轻链可变区的序列分别由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4表示，且分别由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3编码。重链和轻链可变区的序列也描述于图1A中。D2E7的CDR序列和其相应识别符提供于图1B中。D2E7的重链和轻链可变区的序列(如美国专利第6,090,382号中所公开)展示于图1C中。编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的任何核苷酸序列皆可用于本发明的组合物和方法中。
本发明进一步提供包含与D2E7的CDR序列相关的CDR序列的抗TNF-α抗体片段。术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，一般为目标结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。“Fv”片段为含有完整目标识别和结合位点的最小抗体片段。此区域由紧密非共价缔合的一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在此构型中各可变结构域的三个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的目标结合位点。通常，6个CDR使抗体具有目标结合特异性。然而，在一些情况下，即使单个可变结构域(或仅包含三个对目标具有特异性的CDR的一半Fv)仍具有识别和结合目标的能力。“单链Fv”或“scFv”抗体片段在单个多肽链中包含抗体的VH和VL结构域。一般说来，Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽连接子，使scFv能够形成目标结合所需的结构。“单 结构域抗体”由对TNF-α展现足够亲和力的单个VH结构域或VL结构域构成。在一特定实施例中，单结构域抗体为骆驼抗体(参见例如里奇曼(Riechmann)，1999，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)231：25-38)。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段因在重链CH1结构域的羧基端添加包括一个或一个以上来自抗体铰链区的半胱氨酸的数个残基而不同于Fab片段。F(ab′)片段通过使F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键裂解而产生。抗体片段的其它化学偶合为所属领域的一般技术人员所已知。
在某些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体为单克隆抗体。如本文所用的术语“单克 隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指抗体来源于单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)而非指其产生方法。关于本发明适用的单克隆抗体可使用所属领域中已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体呈现技术或其组合。本发明的抗TNF-α抗体包括嵌合、灵长类化、人类化或人类抗体。
本发明的抗TNF-α抗体可为嵌合抗体。如本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有来源于非人类免疫球蛋白(诸如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人类免疫球蛋白模板的人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法在所属领域中为已知的。参见例如莫里森(Morrison)，1985，科学(Science)229(4719)：1202-7；沃伊(Oi)等人，1986，生物技术(Bio Techniques)4：214-221；基利斯(Gillies)等人，1985，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)125：191-202；美国专利第5,807,715号；第4,816,567号；和第4,816,397号，所述文献皆以全文引用的方式并入本文中。
本发明的抗TNF-α抗体可为人类化抗体。非人类(例如鼠类)抗体的“人类化”形式为含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它目标结合子结构域)。一般说来，人类化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的实质上全部，其中所有或实质上所有CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，且所有或实质上所有FR区为人类免疫球蛋白序列的FR区。人类化抗体也可包含免疫球蛋白恒定区(通常为人类免疫球蛋白共同序列的免疫球蛋白恒定区)的至少一部分(Fc)。抗体人类化的方法在所属领域中为已知的。参见例如里奇曼(Riechmann)等人，1988，自然(Nature)332：323-7；美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号和第6,180,370号(奎恩(Queen)等人)；EP 239400；PCT公开案WO 91/09967；美国专利第5,225,539号；EP 592106；EP 519596；帕德兰(Padlan)，1991，分子免疫学(Mol.Immunol.)，28：489-498；斯塔德尼卡(Studnicka)等人，1994，蛋白质工程(Prot.Eng.)7：805-814；罗古斯卡(Roguska)等人，1994，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)91：969-973；和美国专利第5,565,332号，所有文献皆以全文引用的方式并入本文中。
本发明的抗TNF-α抗体可为人类抗体。完全“人类”抗TNF-α抗体对于治疗性治疗人类患者可为合乎需要的。如本文所用的“人类抗体”包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包括自人类免疫球蛋白文库或自一种或一种以上不表达内源性免疫球蛋白的人类免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体。人类抗体可通过所属领域中已知的多种方法制备，包括使用来源于人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体呈现方法。参见美国专利第4,444,887号和第4,716,111号；和PCT公开案WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735；和WO 91/10741，各文献以全文引用的方式并入本文中。人类抗体也可使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。参见例如PCT公开案WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利第5,413,923号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,569,825号；第5,661,016号；第5,545,806号；第5,814,318号；第5,885,793号；第5,916,771号；和第5,939,598号，所述文献以全文引用的方式并入本文中。另外，诸如美达斯公司(Medarex)(新泽西州普林斯顿市(Princeton，NJ))、阿斯泰拉医药公司(Astellas Pharma)(伊利诺伊州迪尔菲尔德市(Deerfield，IL))、安进公司(Amgen)(加利弗利亚州橡木城(Thousand Oaks，CA))和里捷龙公司(Regeneron)(纽约州塔里顿市(Tarrytown，NY))等公司可从事使用与上文所述类似的技术提供针对所选抗原的人类抗体。识别所选抗原决定基的完全人类抗体可使用称作“导向选择(guided selection)”的技术产生。在此方法中，使用所选非人类单克隆抗体(例如小鼠抗体)来引导对识别相同抗原决定基的完全人类抗体的选择(杰斯佩尔斯(Jespers)等人，1988，生物技术(Biotechnology)12：899-903)。
本发明的抗TNF-α抗体可为灵长类化抗体。术语“灵长类化抗体”是指包含猴可变区和人类恒定区的抗体。产生灵长类化抗体的方法在所属领域中为已知的。参见例如美国专利第5,658,570号；第5,681,722号；和第5,693,780号，所述专利皆以全文引用的方式并入本文中。
本发明的抗TNF-α抗体可为双特异性抗体。双特异性抗体为对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，通常为人类或人类化抗体。在本发明中，结合特异性中的一者可针对TNF-α，而另一者可针对任何其它抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源的蛋白质、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源的蛋白质或细菌表面蛋白等。
本发明的抗TNF-α抗体包括衍生化抗体。举例来说(但不限于)，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、利用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、连接于细胞配位体或其它蛋白质(参见论述抗体接合物的第7.6部分)等进行修饰。众多化学修饰中的任一者可通过已知技术进行，所述已知技术包括(但不限于)特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、代谢性合成衣霉素(tunicamycin)等。另外，例如使用ambrx技术(参见例如沃尔夫森(Wolfson)，2006，化学生物学(Chem.Biol.)13(10)：1011-2)，衍生物可含有一个或一个以上非天然氨基酸。
在本发明的另一实施例中，抗TNF-α抗体或其片段可为序列已经修饰从而至少一种由恒定区介导的生物效应功能相对于相应野生型序列发生改变的抗体或抗体片段。举例来说，在一些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体可经修饰以使至少一种由恒定区介导的生物效应功能相对于未经修饰的抗体降低，例如与Fc受体(FcγR)的结合减少。可通过使抗体中FcγR相互作用所必需的特定区域处的免疫球蛋白恒定区区段突变来减少FcγR结合(参见例如坎费尔德和莫里森(Morrison)，1991，实验医学杂志(J.Exp.Med.)173：1483-1491；和伦德(Lund)等人，1991，免疫学杂志(J.Immunol.)147：2657-2662)。降低抗体的FcγR结合能力也可降低其它依赖于FcγR相互作用的效应功能，诸如调理作用、吞噬作用和抗原依赖性细胞毒性(“ADCC”)。
在本发明的其它实施例中，抗TNF-α抗体或其片段可经修饰以相对于未经修饰的抗体获得或改良至少一种由恒定区介导的生物效应功能，例如增强FcγR相互作用(参见例如US 2006/0134709)。举例来说，本发明的抗TNF-α抗体可具有以高于相应野生型恒定区的亲和力结合FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的恒定区。
因此，本发明的抗体在生物活性方面可具有引起调理作用、吞噬作用或ADCC增强或降低的改变。所述改变在所属领域中为已知的。举例来说，抗体中降低ADCC活性的修饰描述于美国专利第5,834,597号中。例示性ADCC降低变异体对应于“突变体3”(展示于美国专利第5,834,597号的图4中)，其中残基236缺失，且残基234、235和237(使用EU编号)经丙氨酸取代。
在一些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体具有低含量的岩藻糖或缺乏岩藻糖。缺乏岩藻糖的抗体与增强的ADCC活性相关，尤其在低抗体剂量下时更是如此。参见谢尔德(Shields)等人，2002，生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.)277：26733-26740；新川(Shinkawa)等人，2003，生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.)278：3466-73。制备含较少岩藻糖的抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中生长。YB2/0细胞表达低含量的编码α-1，6-岩藻糖基转移酶的FUT8 mRNA，所述种酶为一种使多肽岩藻糖基化所必需的酶。
在另一方面中，抗TNF-α抗体或其片段可为例如通过使胎儿Fc受体FcRn相互作用中所涉及的特定区域处的免疫球蛋白恒定区区段突变而进行修饰从而增强或降低与FcRn的结合亲和力的抗体或抗体片段(参见例如WO 2005/123780)。在特定实施例中，IgG类别的抗TNF-α抗体经突变以使得重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中的至少一者单独经取代，或以其任何组合形式经取代，诸如在位置250和428处，或在位置250和314处，或在位置314和428处，或在位置250、314和428处经取代，其中位置250和428为一特定组合。对于位置250，取代的氨基酸残基可为除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314，取代的氨基酸残基可为除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428，取代的氨基酸残基可为除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。适合氨基酸取代的特定组合在美国专利第7,217,797号的表1中标明，所述表格以全文引用的方式并入本文中。所述突变增强抗体与FcRn的结合，保护抗体免遭降解且增加其半衰期。
在其它方面中，抗TNF-α抗体具有一个或一个以上氨基酸插入其一个或一个以上高变区中，例如如以下文献中所述：琼格(Jung)和普鲁克顿(Plückthun)，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10：9，959-966；矢崎(Yazaki)等人，2004，蛋白质工程、设计和选择(Protein Eng.Des Sel.)17(5)：481-9.Epub 2004年8月17日；和美国专利申请案第2007/0280931号。
7.2核酸和表达系统
本发明涵盖编码本发明的抗TNF-α抗体的核酸分子和宿主细胞。
本发明的抗TNF-α抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为重组表达抗体，用一个或一个以上带有编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，以使得轻链和重链在宿主细胞中表达，且任选分泌至培养宿主细胞的培养基中，可从所述培养基回收抗体。使用标准重组DNA方法来获得抗体重链和轻链基因，将这些基因并入重组表达载体中和将载体引入宿主细胞中，诸如以下文献中所述：分子克隆实验室手册(Molecular Cloning；A Laboratory Manual)，第2版(萨姆布鲁克(Sambrook)，弗里奇(Fritsch)和马里亚蒂斯(Maniatis)(编)，纽约州冷泉港(ColdSpring Harbor，N.Y.)，1989)；分子生物学方案选编(Current Protocols in MolecularBiology)(F.M.奥苏贝尔(Ausubel，F.M.)等人编，格林出版社(Greene PublishingAssociates)，1989)；和美国专利第4,816,397号。
在一实施例中，抗TNF-α抗体类似于D2E7，但在一个或一个以上CDR中具有变化(在下文称作具有“D2E7相关”序列)。在另一实施例中，抗TNF-α抗体类似于D2E7，但在一个或一个以上构架区中具有变化。在另一实施例中，抗TNF-α抗体类似于D2E7，但在一个或一个以上CDR中和一个或一个以上构架区中具有变化。为产生编码所述抗TNF-α抗体的核酸，首先获得编码轻链可变区和重链可变区的DNA片段。可通过例如使用聚合酶链反应(PCR)扩增和修饰编码轻链可变序列和重链可变序列的生殖系DNA或cDNA获得这些DNA。人类重链可变区基因和轻链可变区基因的生殖系DNA序列在所属领域中为已知的(参见例如“VBASE”人类生殖系序列数据库；也参见E.A.卡贝特(Kabat，E.A.)等人，1991，免疫学相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号：91-3242；汤姆林森(Tomlinson)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)22T：116-198；和考克斯(Cox)等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24：827-836；所述文献各自的内容以引用的方式并入本文中)。可合成编码序列展示于图1C中的D2E7的重链可变区或轻链可变区的DNA片段且将其用作突变诱发的模板以使用常规突变诱发技术产生如本文所述的变异体；或者，可直接合成编码变异体的DNA片段。
在获得编码D2E7或D2E7相关VH和VL区段的DNA片段后，可进一步通过标准重组DNA技术来操作这些DNA片段以例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，使编码VL或VH的DNA片段可操作地连接于编码另一蛋白质(诸如抗体恒定区或柔性连接子)的另一DNA片段。如在此上下文中所用的术语“可操作地连接”欲意谓两个DNA片段经联接以使由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。
可通过使编码VH的DNA可操作地连接于编码重链恒定区(CH1、CH2、CH3和任选CH4)的另一DNA分子来使分离的编码VH区的DNA转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在所属领域中为已知的(参见例如E.A.卡贝特(Kabat，E.A.)等人，1991，免疫学相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号：91-3242)，且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在某些实施例中，为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可使编码VH的DNA可操作地连接于仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可通过使编码VL的DNA可操作地连接于编码轻链恒定区CL的另一DNA分子来使分离的编码VL区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在所属领域中为已知的(参见例如E.A.卡贝特(Kabat，E.A.)等人，1991，免疫学相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版(美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号：91-3242))，且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但在某些实施例中，为κ恒定区。为产生scFv基因，使编码VH和编码VL的DNA片段可操作地连接于编码柔性连接子(例如编码氨基酸序列(Gly4～Ser)3)的另一片段，以使得VH序列和VL序列可表达为连续单链蛋白质，其中VL区与VH区由柔性连接子联接(参见例如比尔德(Bird)等人，1988，科学(Science)242：423-426；哈斯顿(Huston)等人，1988，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：5879-5883；麦克卡费尔蒂(McCafferty)等人，1990，自然(Nature)348：552-554)。
为表达本发明的抗TNF-α抗体，将如上文所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，以使得基因可操作地连接于转录和翻译控制序列。在此上下文中，术语“可操作地连接”欲意谓将抗体基因连接至载体中以使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控抗体基因转录和翻译的预期功能。表达载体和表达控制序列选择为与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入独立载体中，或者更通常，将两种基因插入同一表达载体中。
通过标准方法(例如连接抗体基因片段与载体上的互补限制性位点，或若不存在限制性位点则连接钝端)将抗体基因插入表达载体中。在插入D2E7或D2E7相关轻链或重链序列之前，表达载体可能已具有抗体恒定区序列。举例来说，将D2E7或D2E7相关VH和VL序列转化为全长抗体基因的一种方法为将其分别插入已编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，以使得VH片段可操作地连接于载体内的CH区段，且使得VL片段可操作地连接于载体内的CL区段。或者或另外，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌出来的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中，以使得信号肽同框连接于抗体链基因的氨基端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因外，本发明的重组表达载体还带有控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”意欲包括启动子、强化子和控制抗体链基因转录或翻译的其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。所述调控序列描述于例如古伊德尔(Goeddel)，基因表达技术：酶学方法185(Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185)(学院出版社(Academic Press)，加利弗利亚州圣迭戈市(San Diego，CA)，1990)中。所属领域的技术人员应了解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于多种因素，例如欲转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达量等。适用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中引导高含量蛋白质表达的病毒元件，例如来源于以下的启动子和/或强化子：巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/强化子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/强化子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。关于病毒调控元件和其序列的进一步描述，参见例如斯廷斯基(Stinski)的美国专利第5,168,062号；贝尔(Bell)等人的美国专利第4,510,245号；和夏弗纳(Schaffner)等人的美国专利第4,968,615号。
除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体还可带有其它序列，诸如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于选择已引入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号(皆来自阿克谢尔(Axel)等人))。举例来说，可选择标记基因通常使已引入了载体的宿主细胞对诸如G418、嘌呤霉素(puromycin)、杀稻瘟菌素(blasticidin)、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤(methotrexate)等药物具有抗性。适合的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于利用甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR-宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。为表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意欲涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙沈淀、DEAE-聚葡萄糖转染等。
可在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。在某些实施例中，抗体表达在真核细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中进行以获得经适当折叠的免疫活性抗体的最佳分泌。用于表达本发明重组抗体的例示性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括乌尔劳勃(Urlaub)和凯辛(Chasin)，1980，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：4216-4220中所述的DHFR-CHO细胞，例如如考夫曼(Kaufman)和夏普(Sharp)，1982，分子生物学(Mol.Biol.)159：601-621中所述，与DHFR可选择标记一起使用)；NS0骨髓瘤细胞；COS细胞；293细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或允许抗体分泌至培养宿主细胞的培养基中的时间来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。也可使用宿主细胞来产生完整抗体的部分，诸如Fab片段或scFv分子。应了解，上述程序的变化形式在本发明的范围内。举例来说，可能需要用编码本发明抗TNF-α抗体的轻链或重链(但非两者)的DNA转染宿主细胞。
也可使用重组DNA技术来移除一些或所有编码对于结合TNF-α不必要的轻链和重链中的任一者或两者的DNA。本发明抗体也涵盖由所述截短型DNA分子表达的分子。
另外，可通过标准化学交联方法使本发明抗体与第二抗体交联来产生一条重链和一条轻链为本发明抗体而另一重链和轻链对除TNF-α以外的抗原具有特异性的双功能抗体。双功能抗体也可通过表达经工程改造以编码双功能抗体的核酸来制备。
在某些实施例中，双重特异性抗体(即使用同一结合位点结合TNF-α和一不相关抗原的抗体)可通过使轻链和/或重链CDR中的氨基酸残基突变来产生。在各种实施例中，结合TNF-α和另一抗原(例如另一促发炎性细胞因子(诸如淋巴毒素、干扰素-γ或白介素-1))的双重特异性抗体可通过使抗原结合位点周边的氨基酸残基突变来产生(参见例如波斯特罗姆(Bostrom)等人，2009，科学(Science)323：1610-1614)。双重功能性抗体可通过表达经工程改造以编码双重特异性抗体的核酸来制备。
为重组表达本发明的抗TNF-α抗体，可用两个本发明表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链来源的多肽而第二载体编码轻链来源的多肽。通常，两个载体各自含有各别可选择标记。或者，可使用编码重链多肽和轻链多肽两者的单一载体。
在产生编码D2E7或具有与D2E7的CDR序列相关的CDR序列的抗TNF-α抗体的一个或一个以上部分的核酸后，可将其它改变或突变引入编码序列中例如以产生编码具有不同CDR序列的抗体、对Fc受体的亲和力降低的抗体或不同子类的抗体的核酸。
本发明的抗TNF-α抗体也可通过化学合成(例如通过固相肽合成(Solid PhasePeptide Synthesis)，第2版，1984皮尔斯化学公司(The Pierce Chemical Co.)，伊利诺伊州罗克福德市(Rockford，Ill.)中所述的方法)产生。变异型抗体也可使用无细胞平台产生(参见例如楚(Chu)等人，生物化学2(Biochemia No.2)，2001(罗氏分子生物学(RocheMolecular Biologicals)))。
在通过重组表达产生了本发明的抗TNF-α抗体后，可通过所属领域中已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通过色谱(例如，离子交换色谱；亲和力色谱，尤其在蛋白质A或蛋白质G选择后通过对TNF-α进行亲和力色谱；以及尺寸管柱色谱)、离心、不同溶解度，或通过任何其它用于纯化蛋白质的标准技术对其进行纯化。此外，可将本发明的抗TNF-α抗体或其片段融合至本文所述或所属领域中另外已知的异源多肽序列以促进纯化。
分离后，必要时，可例如通过高效液相色谱(参见例如费舍尔(Fisher)，生物化学和分子生物学实验技术(Laboratory Techniques In Biochemistry And MolecularBiology)(沃尔克(Work)和布尔顿(Burdon)编，爱思维尔(Elsevier)，1980))或通过利用SuperdexTM 75管柱(法玛西亚生物技术AB公司(Pharmacia Biotech AB)，瑞典乌普萨拉(Uppsala，Sweden))进行凝胶过滤色谱来进一步纯化抗TNF-α抗体。
7.3抗TNF-α抗体的生物活性
在某些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体具有某些生物活性，诸如与D2E7竞争结合TNF-α或中和TNF-α活性。
因此，在某些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体与D2E7竞争结合TNF-α。可使用竞争分析测试竞争结合TNF-α的能力。在竞争分析的一实例中，通过使板与TNF-α溶液接触(例如，以于PBS中1μg/mL的浓度，在4℃下过夜)使TNF-α粘附于固体表面(例如微孔板)上。洗涤(例如含0.1％吐温20(Tween 20)的PBS)板并且进行阻断(例如，以Superblock，赛默科技公司(Thermo Scientific)，伊利诺伊州罗克福德市(Rockford，Il))。将ELISA缓冲液(例如含1％BSA和0.1％吐温20的PBS)中次饱和量的生物素化D2E7(80ng/mL)和连续稀释(例如，浓度为2.8μg/mL、8.3μg/mL或25μg/mL)的未经标记D2E7(“参照”抗体)或竞争性抗TNF-α抗体(“测试”抗体)抗体的混合物添加至各孔中，且各板在和缓振荡下培育1小时。洗涤各板，将于ELISA缓冲液中稀释的1μg/mL接合HRP的抗生蛋白链菌素(Streptavidin)添加至各孔中且将各板培育1小时。洗涤各板且通过添加底物(例如TMB，百福斯实验室有限公司(BiofxLaboratories Inc.)，马里兰州欧文斯密尔市(Owings Mills，MD))检测结合的抗体。通过添加停止缓冲液(例如Bio FX停止试剂，百福斯实验室有限公司(Biofx LaboratoriesInc.)，马里兰州欧文斯密尔市(Owings Mills，MD))终止反应且使用微板读取器(例如VERSAmax，分子装置公司(Molecular Devices)，加利弗利亚州桑尼维尔市(Sunnyvale，CA))在650nm下测量吸光度。也可使用此竞争分析的变化形式来测试本发明抗TNF-α抗体与D2E7之间的竞争。举例来说，在某些方面中，将抗TNF-α抗体用作参照抗体而将D2E7用作测试抗体。另外，可使用在培养物中表达于细胞表面(例如哺乳动物细胞，诸如293S)上的膜结合型TNF-α代替可溶性TNF-α。或者，也可使用在培养物中表达于细胞表面(例如哺乳动物细胞，诸如293c18)上的抗体代替可溶性D2E7和测试抗体。一般说来，使用约104至106个转染子，例如约105个转染子。其它竞争分析形式在所属领域中为已知的且可使用。
在各种实施例中，当使用浓度为0.08μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，或浓度在任何上述值之间的范围内(例如浓度在2μg/mL至10μg/mL的范围内)的抗TNF-α抗体时，本发明的抗TNF-α抗体使经标记D2E7的结合减少至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或任何上述值之间的范围内的百分比(例如，本发明的抗TNF-α抗体使经标记D2E7的结合减少50％至70％)。
在其它实施例中，当使用浓度为0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、250μg/mL，或浓度在任何上述值之间的范围内(例如浓度在2μg/mL至10μg/mL的范围内)的D2E7时，D2E7使经标记的本发明抗TNF-α抗体的结合减少至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或在任何上述值之间的范围内的百分比(例如，D2E7使经标记的本发明抗TNF-α抗体的结合减少50％至70％)。
在其它方面中，本发明的抗TNF-α抗体在一系列活体外分析中抑制TNF-α活性，诸如细胞毒性、致有丝分裂作用、细胞因子诱导和诱导粘附分子。或者，可使用天然或重组表达于细胞上的膜结合型TNF-α通过活体外分析测量本发明的抗TNF-α抗体的活性，诸如诱导逆向信号传导、细胞因子诱导、诱导粘附分子、CDC和ADCC的能力。使用对TNF-α敏感的细胞(例如L929)测量对可溶性TNF-α细胞毒性的抑制作用的例示性TNF-α中和分析描述于下文中。也可使用其它TNF-α细胞毒性分析来评估本发明的抗TNF-α抗体的活性。
因此，在一例示性实施例中，抗TNF-α细胞毒性分析需要将3×104个鼠类L929细胞涂铺于平底96孔微量滴定板的个别孔中。在37℃下在含湿气5％CO2培育箱中培育细胞过夜。次日，在25μL无血清培养基中制备抗TNF-α抗体的连续稀释液(例如0.712μg/mL、0.949μg/mL、1.27μg/mL、1.69μg/mL、2.25μg/mL或3μg/mL)，且将其添加至细胞中(例如，于150μL培养物中的最终浓度为119ng/mL、158ng/mL、211ng/mL、282ng/mL、375ng/mL或500ng/mL)。在37℃、5％CO2下培育2小时后，添加最终浓度为40ng/mL(例如25μL的240ng/mL)的TNF-α，且在37℃、5％CO2下再培育细胞48小时。使用活力分析(例如CellTiter-Blue，普洛麦格公司(Promega)，威斯康辛州麦迪逊市(Madison))，相较于对照板(其在某些实施例中经TNF-α处理而未与抗TNF-α抗体一起培育(例如与同型对照抗体一起培育)而在其它实施例中经D2E7处理)，针对细胞毒性对各孔进行评分。TNF-α中和分析的其它形式在所属领域中为已知的且可使用。
在各种实施例中，当使用浓度为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，或浓度在任何上述值之间的范围内(例如，浓度在1μg/mL到5μg/mL的范围内)的抗TNF-α抗体时，本发明的抗TNF-α抗体将TNF-α中和至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或在任何上述值之间的范围内的百分比(例如，本发明的抗TNF-α抗体将TNF-α活性中和50％至70％)。在一些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体中和TNF-α的有效性为D2E7的有效性的至少80％、D2E7的有效性的至少90％、D2E7的有效性的至少100％、D2E7的有效性的至少110％、D2E7的有效性的至少125％或D2E7的有效性的至少150％，和达D2E7的有效性的110％、达D2E7的有效性的125％、达D2E7的有效性的150％或达D2E7的有效性的200％，或在任一对上述值之间的任何范围内(例如中和TNF-α的有效性为D2E7的有效性的80％至125％或为D2E7的有效性的125％至200％)。
在某些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体对TNF-α具有高结合亲和力。在特定实施例中，本发明的抗TNF-α抗体具有特定缔合速率常数(kon或ka值)、解离速率常数(koff或kd值)、亲和常数(KA值)、解离常数(KD值)和/或IC50值。在某些方面中，所述值选自下列实施例。
7.4抗TNF-α抗体的动力学性质
在一特定实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中kon为至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1，或kon在任一对上述值之间的任何范围内(例如5×105至5×106M-1s-1或107至108M-1s-1)。
在另一实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中koff速率为5×10-1s-1或5×10-1s-1以下、10-1s-1或10-1s-1以下、5×10-2s-1或5×10-2s-1以下、10-2s-1或10-2s-1以下、5×10-3s-1或5×10-3s-1以下、10-3s-1或10-3s-1以下、5×10-4s-1或5×10-4s-1以下、10-4s-1或10-4s-1以下、5×10-5s-1或5×10-5s-1以下、10-5s-1或10-5s-1以下、5×10-6s-1或5×10-6s-1以下、10-6s-1或10-6s-1以下、5×10-7s-1或5×10-7s-1以下、10-7s-1或10-7s-1以下、5×10-8s-1或5×10-8s-1以下、10-8s-1或10-8s-1以下、5×10-9s-1或5×10-9s-1以下、10-9s-1或10-9s-1以下、5×10-10s-1或5×10-10s-1以下、10-10s-1或10-10s-1以下，或koff速率在任一对上述值之间的任何范围内(例如5×10-4至10-6s-1，或5×10-5至5×10-8s-1)。
在另一实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中KA(kon/koff)为至少1011nM-1、至少5×1011nM-1、至少1012nM-1、至少5×1012nM-1、至少1013nM-1、至少5×1013nM-1、至少1014nM-1、至少5×1014nM-1、至少1015nM-1、至少5×1015nM-1、至少1016nM-1、至少5×1016nM-1、至少1017nM-1、至少5×1017nM-1、至少1018nM-1、至少5×1018nM-1、至少1019nM-1、至少5×1019nM-1、至少1020nM-1、至少5×1020nM-1、至少1021nM-1、至少5×1021nM-1、至少1022nM-1、至少5×1022nM-1、至少1023nM-1、至少5×1023nM-1、至少1024nM-1、至少5×1024nM-1，或KA在任一对上述值之间的任何范围内(例如5×1014至1022nM-1，或1011到5×1018nM-1)。
在其它实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中KD(koff/kon)为5×107nM或5×107nM以下、107nM或107nM以下、5×106nM或5×106nM以下、106nM或106nM以下、5×105nM或5×105nM以下、105nM或105nM以下、5×104nM或5×104nM以下、104nM或104nM以下、5×103nM或5×103nM以下、103nM或103nM以下、5×102nM或5×102nM以下、100nM或100nM以下、90nM或90nM以下、80nM或80nM以下、70nM或70nM以下、60nM或60nM以下、50nM或50nM以下、20nM或20nM以下、15nM或15nM以下、10nM或10nM以下、5nM或5nM以下、3.8nM或3.8nM以下、2nM或2nM以下、1.5nM或1.5nM以下、1nM或1nM以下、5×10-1nM或5×10-1nM以下、10-1nM或10-1nM以下、5×10-2nM或5×10-2nM以下、10-2nM或10-2nM以下、5×10-3nM或5×10-3nM以下、10-3nM或10-3nM以下、5×10-4nM或5×10-4nM以下、10-4nM或10-4nM以下、5×10-5nM或5×10-5nM以下、10-5nM或10-5nM以下、5×10-6nM或5×10-6nM以下、10-6nM或10-6nM以下，或KD在任一对上述值之间的任何范围内(例如5×107至50nM，或15nM至5×10-3nM)。
在某些特定实施例中，本发明的TNF-α抗体结合TNF-α，其中KD(koff/kon)介于约0.1nM与约1nM之间，或约0.1nM与约2nM之间，或约0.1nM与约3nM之间，或约0.1nM与约4nM之间，或约0.1nM与约5nM之间，或约0.1nM与约6nM之间，或约0.1nM与约7nM之间，或约0.1nM与约8nM之间，或约0.1nM与约9nM之间，或约0.1nM与约10nM，或介于约0.01nM与约0.1nM之间，或介于约0.01nM与约1nM之间，或介于约0.01nM与约2nM之间，或介于约0.01nM与约3nM之间，或介于约0.01nM与约4nM之间，或介于约0.01nM与约5nM之间，或介于约0.01nM与约6nM之间，或介于约0.01nM与约7nM之间，或介于约0.01nM与约8nM之间，或介于约0.01nM与约9nM之间，或介于约0.6nM与约1.1nM之间，或介于约0.7nM与约1.2nM之间，或介于约0.5与约5nM之间。在其它特定实施例中，抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中KD(koff/kon)为约5nM、约3.5nM、约1.5nM、约1nM、约0.5nM、约0.1nM、约0.05nM或约0.01nM。在特定实施例中，KD(koff/kon)值是通过所属领域中熟知或本文所述的分析测定，例如ELISA、等温滴定热量测定(ITC)、BIAcore或荧光偏振分析。
在一些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α且抑制TNF-α与p55、p75或两者的结合，其中IC50值低于5×107nM、低于107nM、低于5×106nM、低于106nM、低于5×105nM、低于105nM、低于5×104nM、低于104nM、低于5×103nM、低于103nM、低于5×102nM、低于100nM、低于90nM、低于80nM、低于70nM、65nM、低于60nM、低于50nM、低于40nM、低于30nM、低于25nM、低于20nM、低于15nM、低于12nM、低于10nM、低于5nM、低于1nM、低于5×10-1nM、低于10-1nM、低于5×10-2nM、低于10-2nM、低于5×10-3nM、低于10-3nM、低于5×10-4nM或低于10-4nM，或IC50在任一对上述值之间的任何范围内(例如5×107至50nM，或15nM至5×10-3nM)。IC50可根据所属领域中熟知或本文所述的方法测量，例如ELISA。
在其它实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α且中和TNF-α，其中IC50值低于5×107nM、低于107nM、低于5×106nM、低于106nM、低于5×105nM、低于105nM、低于5×104nM、低于104nM、低于5×103nM、低于103nM、低于5×102nM、低于100nM、低于90nM、低于80nM、低于70nM、65nM、低于60nM、低于50nM、低于40nM、低于30nM、低于25nM、低于20nM、低于15nM、低于12nM、低于10nM、低于5nM、低于1nM、低于5×10-1nM、低于10-1nM、低于5×10-2nM、低于10-2nM、低于5×10-3nM、低于10-3nM、低于5×10-4nM或低于10-4nM，或IC50在任一对上述值之间的任何范围内(例如5×107至50nM，或15nM至5×10-3nM)。可用于测量抗TNF-α抗体的IC50的例示性中和分析描述于下文第7.5部分中。
在某些特定实施例中，抗TNF-α抗体结合TNF-α且抑制TNF-α与p55、p75或两者的结合，或在TNF-α中和分析中抑制TNF-α活性，其中IC50值介于约1nM与约10nM之间、介于约1nM与约15nM之间、介于约1nM与约20nM之间、介于约1nM与约25nM之间、介于约1nM与约30nM之间、介于约1nM与约40nM之间、介于约1nM与约50nM之间、介于约10nM与约102nM之间、介于约102nM与约103nM之间、介于约10nM与约104nM之间、介于约104nM与约105nM之间、介于约105nM与约106nM之间，或介于约106nM与约107nM之间。
在其它特定实施例中，抗TNF-α抗体结合TNF-α且抑制TNF-α与p55、p75或两者的结合，或在TNF-α中和分析中抑制TNF-α活性，其中IC50值介于约5nM与约10nM之间、介于约5nM与约15nM之间、介于约10nM与约15nM之间、介于约10nM与约20nM之间、介于约10nM与约30nM之间、介于约10nM与约40nM之间、介于约10nM与约50nM之间、介于约1nM与约100nM之间、介于约10nM与约100nM之间、介于约20nM与约100nM之间、介于约30nM与约100nM之间、介于约40nM与约100nM之间、介于约50nM与约100nM之间、介于约15nM与约25nM之间，或介于约15nM与约20nM之间。
在上述实施例的某些方面中，在如下浓度的TNF-α存在下测量IC50：0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1000μM，或任一对上述值之间的任何范围内(例如0.01至50μM，或10μM至100μM)的浓度。
在某些实施例中，本发明抗体的动力学性质在类似分析中与D2E7抗体类似或相对于D2E7抗体得到改良。举例来说，在某些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中kon速率在D2E7的kon的0.2倍到5倍的范围内，例如kon为D2E7的kon的0.2倍，kon为D2E7的kon的0.3倍，kon为D2E7的kon的0.4倍，kon为D2E7的kon的0.5倍，kon为D2E7的kon的0.6倍，kon为D2E7的kon的0.7倍，kon为D2E7的kon的0.8倍，kon为D2E7的kon的0.9倍，kon为D2E7的kon的1倍，kon为D2E7的kon的1.1倍，kon为D2E7的kon的1.2倍，kon为D2E7的kon的1.3倍，kon为D2E7的kon的1.4倍，kon为D2E7的kon的1.5倍，kon为D2E7的kon的1.75倍，kon为D2E7的kon的2倍，kon为D2E7的kon的2.25倍，kon为D2E7的kon的2.5倍，kon为D2E7的kon的2.75倍，kon为D2E7的kon的3倍，kon为D2E7的kon的3.5倍，kon为D2E7的kon的4倍，kon为D2E7的kon的4.5倍，kon为D2E7的kon的5倍，或kon在任一对上述值之间的范围内，例如kon为D2E7的kon的0.7倍-1.5倍，kon为D2E7的kon的0.9倍-1.3倍，kon为D2E7的kon的0.8倍-2倍，kon为D2E7的kon的0.9倍-3倍等。
在实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中koff速率在D2E7的koff的0.2倍到5倍的范围内，例如koff为D2E7的koff的0.2倍，koff为D2E7的koff的0.3倍，koff为D2E7的koff的0.4倍，koff为D2E7的koff的0.5倍，koff为D2E7的koff的0.6倍，koff为D2E7的koff的0.7倍，koff为D2E7的koff的0.8倍，koff为D2E7的koff的0.9倍，koff为D2E7的koff的1倍，koff为D2E7的koff的1.1倍，koff为D2E7的koff的1.2倍，koff为D2E7的koff的1.3倍，koff为D2E7的koff的1.4倍，koff为D2E7的koff的1.5倍，koff为D2E7的koff的1.75倍，koff为D2E7的koff的2倍，koff为D2E7的koff的2.25倍，koff为D2E7的koff的2.5倍，koff为D2E7的koff的2.75倍，koff为D2E7的koff的3倍，koff为D2E7的koff的3.5倍，koff为D2E7的koff的4倍，koff为D2E7的koff的4.5倍，koff为D2E7的koff的5倍，或koff在任一对上述值之间的范围内，例如koff为D2E7的koff的0.7倍-1.5倍，koff为D2E7的koff的0.9倍-1.3倍，koff为D2E7的koff的0.8倍-2倍，koff为D2E7的koff的0.9倍-3倍等。
在其它实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中KA(kon/koff)在D2E7的KA的0.04倍到25倍的范围内，例如KA为D2E7的KA的0.04倍，KA为D2E7的KA的0.1倍，KA为D2E7的KA的0.25倍，KA为D2E7的KA的0.5倍，KA为D2E7的KA的0.6倍，KA为D2E7的KA的0.7倍，KA为D2E7的KA的0.8倍，KA为D2E7的KA的0.9倍，KA为D2E7的KA的1倍，KA为D2E7的KA的1.1倍，KA为D2E7的KA的1.25倍，KA为D2E7的KA的1.5倍，KA为D2E7的KA的1.75倍，KA为D2E7的KA的2倍，KA为D2E7的KA的2.5倍，KA为D2E7的KA的3倍，KA为D2E7的KA的4倍，KA为D2E7的KA的4x％，KA为D2E7的KA的5倍，KA为D2E7的KA的7.5倍，KA为D2E7的KA的10倍，KA为D2E7的KA的12.5倍，KA为D2E7的KA的15倍，KA为D2E7的KA的20倍，KA为D2E7的KA的25倍，或KA在任一对上述值之间的范围内，例如KA为D2E7的KA的0.7倍-1.25倍，KA为D2E7的KA的0.9倍-1.5倍，KA为D2E7的KA的0.9倍-2倍，KA为D2E7的KA的0.8倍-1.75倍，KA为D2E7的KA的0.9倍-5倍，或任何可由本文所揭示的kon和koff速率计算出的值或范围。
在其它实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α，其中KD(koff/kon)在D2E7的KD的0.04倍到25倍的范围内，例如KD为D2E7的KD的0.04倍，KD为D2E7的KD的0.1倍，KD为D2E7的KD的0.25倍，KD为D2E7的KD的0.5倍，KD为D2E7的KD的0.6倍，KD为D2E7的KD的0.7倍，KD为D2E7的KD的0.8倍，KD为D2E7的KD的0.9倍，KD为D2E7的KD的1倍，KD为D2E7的KD的1.1倍，KD为D2E7的KD的1.25倍，KD为D2E7的KD的1.5倍，KD为D2E7的KD的1.75倍，KD为D2E7的KD的2倍，KD为D2E7的KD的2.5倍，KD为D2E7的KD的3倍，KD为D2E7的KD的4倍，KD为D2E7的KD的4x％，KD为D2E7的KD的5倍，KD为D2E7的KD的7.5倍，KD为D2E7的KD的10倍，KD为D2E7的KD的12.5倍，KD为D2E7的KD的15倍，KD为D2E7的KD的20倍，KD为D2E7的KD的25倍，或KD在任一对上述值之间的范围内，例如KD为D2E7的KD的0.7倍-1.25倍，KD为D2E7的KD的0.9倍-1.5倍，KD为D2E7的KD的0.9倍-2倍，KD为D2E7的KD的0.8倍-1.75倍，KD为D2E7的KD的0.9倍-5倍，或任何可由本文所揭示的kon和koff速率计算出的值或范围。
在一些实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α且抑制TNF-α与p55、p75或两者的结合，其中IC50值在D2E7的IC50的50％至200％范围内，例如IC50为D2E7的IC50的50％，IC50为D2E7的IC50的60％，IC50为D2E7的IC50的70％，IC50为D2E7的IC50的75％，IC50为D2E7的IC50的80％，IC50为D2E7的IC50的90％，IC50为D2E7的IC50的95％，IC50为D2E7的IC50的100％，IC50为D2E7的IC50的110％，IC50为D2E7的IC50的120％，IC50为D2E7的IC50的125％，IC50为D2E7的IC50的130％，IC50为D2E7的IC50的140％，IC50为D2E7的IC50的150％，IC50为D2E7的IC50的160％，IC50为D2E7的IC50的170％，IC50为D2E7的IC50的175％，IC50为D2E7的IC50的180％，IC50为D2E7的IC50的190％，IC50为D2E7的IC50的200％，或IC50在任一对上述值之间的任何范围内，例如IC50为D2E7的IC50的75％-125％，IC50为D2E7的IC50的90％-130％，IC50为D2E7的IC50的95％-125％，IC50为D2E7的IC50的90％-110％，IC50为D2E7的IC50的90％-180％，或IC50为D2E7的IC50的80％-175％。在其它实施例中，单个CDR取代可引起上述相较于D2E7的IC50差异，而本发明的抗TNF-α抗体相较于D2E7可包含所述取代和至多16个其它取代。
在其它实施例中，本发明的抗TNF-α抗体结合TNF-α且中和TNF-α，其中IC50值在D2E7的IC50的50％至200％范围内，例如IC50为D2E7的IC50的50％，IC50为D2E7的IC50的60％，IC50为D2E7的IC50的70％，IC50为D2E7的IC50的75％，IC50为D2E7的IC50的80％，IC50为D2E7的IC50的90％，IC50为D2E7的IC50的95％，IC50为D2E7的IC50的100％，IC50为D2E7的IC50的110％，IC50为D2E7的IC50的120％，IC50为D2E7的IC50的125％，IC50为D2E7的IC50的130％，IC50为D2E7的IC50的140％，IC50为D2E7的IC50的150％，IC50为D2E7的IC50的160％，IC50为D2E7的IC50的170％，IC50为D2E7的IC50的175％，IC50为D2E7的IC50的180％，IC50为D2E7的IC50的190％，IC50为D2E7的IC50的200％，或IC50在任一对上述值之间的任何范围内，例如IC50为D2E7的IC50的75％-125％，IC50为D2E7的IC50的90％-130％，IC50为D2E7的IC50的95％-125％，IC50为D2E7的IC50的90％-110％，IC50为D2E7的IC50的90％-180％，或IC50为D2E7的IC50的80％-175％。在其它实施例中，单个CDR取代可引起上述相较于D2E7的IC50差异，然而本发明的抗TNF-α抗体相较于D2E7可包含所述取代和至多16个其它取代。
7.5抗TNF-α抗体的免疫原性降低
在某些方面中，本发明提供相较于D2E7免疫原性有所降低的抗TNF-α抗体。本发明也提供在CDR中相较于D2E7的CDR具有多个氨基酸取代的抗TNF-α抗体，其中至少一个取代相较于D2E7降低抗体的免疫原性。在某些实施例中，降低的免疫原性由一个或一个以上致使消除或减少一个或一个以上T细胞抗原决定基的氨基酸取代所引起。
在某些方面中，免疫原性降低的本发明抗TNF-α抗体相较于D2E7具有类似或改良的生物活性，例如对TNF-α的亲和力或对TNF-α活性的中和。可例如通过上文第7.3部分中所述的方法测试所述性质。
在某些实施例中，本发明TNF-α抗体的免疫原性相对于D2E7抗体有所降低。所述抗体一般在对应于SEQ ID NO：81和/或SEQ ID NO：82和/或SEQ ID NO：83的区域中具有相对于重链和/或轻链可变区的变异型序列。抗体一般在对应于SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83的一个、两个或全部三个序列中具有一个、两个或三个氨基酸取代，不过本文也涵盖一个、两个或全部三个区域中多达四个或五个取代。
产生免疫原性相较于D2E7降低的抗体的例示性CDR-L1取代列于表11中。本发明的抗体可包含表11中所列的任何取代或取代组合，且任选包含单独或呈组合形式的一个或一个以上其它取代，诸如表12-25中任一者中的CDR突变。
如本发明中所用，术语“免疫原性降低”指示相较于SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83变异的序列分别与SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的肽相比，引起周边血液单核细胞的增殖反应降低。可用于评估增殖反应的例示性增殖分析在下文第8部分中进行阐述。增殖反应降低可由反应者的百分比、刺激指数或两者来反映。
在其它实施例中，相较于具有SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的序列的肽，变异型序列使反应者减少至少25％，使反应者减少至少30％，使反应者减少至少35％，使反应者减少至少40％，使反应者减少至少45％，使反应者减少至少50％，使反应者减少至少60％，使反应者减少至少65％，使反应者减少至少70％，使反应者减少至少75％，使反应者减少至少80％，使反应者减少至少85％，使反应者减少至少90％，使反应者减少至少95％，使反应者减少100％，或反应者减少在任何上述值之间的范围内，例如反应者减少25％-75％，反应者减少50％-90％，反应者减少60％-100％，反应者减少70％-90％等。
在其它实施例中，变异型序列所产生的刺激指数比分别由SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：82或SEQ ID NO：83的肽引起的刺激指数低至少5％，低至少10％，低至少15％，低至少20％，低至少25％，低至少30％，低至少35％，或低至少40％，或致使刺激指数相较于SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的肽降低任何上述值之间的范围，例如降低5％-20％、降低10％-30％、降低25％-35％、降低30％-40％等。
相较于D2E7免疫原性降低的抗TNF-α抗体的例示性实施例包含表11中所述的一个或一个以上CDR取代或取代组合。
7.6抗体接合物
本发明的抗TNF-α抗体包括例如通过将任何类型的分子共价连接于抗体使得共价连接不干扰与TNF-α的结合而修饰的抗体接合物。
在某些方面中，本发明的抗TNF-α抗体可接合于效应部分或标记。如本文所用的术语“效应部分”包括例如抗赘生剂、药物、毒素、生物活性蛋白质(例如酶)、其它抗体或抗体片段、合成或天然产生的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、放射性核种(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金属、纳米粒子和报导基团(诸如荧光化合物或可由NMR或ESR光谱法检测的化合物)。
在一实例中，抗TNF-α抗体可接合于效应部分(诸如细胞毒性剂、放射性核种或药物部分)以改变指定生物反应。效应部分可为蛋白质或多肽，诸如(而不限于)毒素(诸如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(Diphtheria toxin))；信号传导分子(诸如α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化因子)；血栓形成剂或抗血管生成剂(例如血管抑制素(angiostatin)或内皮抑制素(endostatin))；或生物反应调节剂，诸如细胞因子或生长因子(例如白介素-1(IL-I)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞群落刺激因子(G-CSF)或神经生长因子(NGF))。
在另一实例中，效应部分可为细胞毒素或细胞毒性剂。细胞毒素和细胞毒性剂的实例包括紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、吐根素(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、小红莓(doxorubicin)、道诺霉素(daunorabicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放射菌素D(actinomycin D)、1-去氢睪酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素，和其类似物或同系物。
效应部分也包括(但不限于)抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))；烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)和洛莫司汀(lomustine，CCNU)、环硫磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链佐霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C5和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂(cisplatin))；蒽环霉素(anthracycline)(例如道诺霉素(先前称作柔红霉素(daunomycin))和小红莓)；抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin)(先前称作放射菌素(actinomycin))、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素、安曲霉素(anthramycin，AMC)、卡奇霉素(calicheamicin)或倍癌霉素(duocarmycin))；和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
其它效应部分可包括放射性核种(诸如(但不限于)111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188)和药物(诸如(但不限于)烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷(taxoid)和舒拉明(suramin))。
用于将所述效应部分接合于抗体的技术在所属领域中为熟知的(参见例如海尔斯特罗姆(Hellstrom)等人，受控药物传递(Controlled Drug Delivery)，第2版，第623-53页(罗宾逊(Robinson)等人编，1987))；索普(Thorpe)等人，1982，免疫学综述(Immunol.Rev.)62：119-58；和杜波维基奇(Dubowchik)等人，1999，药理学和治疗学(Pharmacology andTherapeutics)83：67-123)。
在一实例中，抗体或其片段通过共价键(例如肽键)经所述抗体的N端或C端或内部融合于另一蛋白质(或其部分，例如蛋白质的至少10个、20个或50个氨基酸部分)的氨基酸序列。抗体或其片段可在所述抗体的恒定结构域的N端连接于另一蛋白质。例如如WO 86/01533和EP 0392745中所述，可使用重组DNA程序产生所述融合体。在另一实例中，效应分子可增加活体内半衰期，和/或增强抗体穿过上皮对免疫系统的屏障的传递。适合的此类型效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，诸如WO 2005/117984中所述的那些分子。
在某些方面中，抗TNF-α抗体接合于小分子毒素。在某些例示性实施例中，本发明的抗TNF-α抗体接合于海兔毒素(dolastatin)或海兔毒素肽类似物或衍生物，例如奥瑞他汀(auristatin)(美国专利第5,635,483号和第5,780,588号)。海兔毒素或奥瑞他汀药物部分可通过抗体的N(氨基)端、C(羧基)端或内部连接于抗体(WO 02/088172)。例示性奥瑞他汀实施例包括如美国专利第7,498,298号(其以全文引用的方式并入本文中，揭示例如连接子和制备接合于连接子的单甲基缬氨酸化合物(诸如MMAE和MMAF)的方法)中所揭示的N端连接型单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF。
在其它例示性实施例中，小分子毒素包括(但不限于)卡奇霉素、美登素(maytansine)(美国专利第5,208,020号)、单端孢霉烯族毒素(trichothene)和CC1065。在本发明的一实施例中，抗体接合于一个或一个以上美登素分子(例如，每个抗体分子接合约1至约10个美登素分子)。可例如将美登素转化为May-SS-Me，May-SS-Me可还原为May-SH3且与抗体反应(查瑞(Chari)等人，1992，癌症研究(Cancer Research)52：127-131)，产生类美登素(maytansinoid)-抗体或类美登素-Fc融合接合物。也可使用的卡奇霉素结构类似物包括(但不限于)γ1 1、γ3 1、γ3 1N-乙酰基-γ1 1、PSAG和θ1 1(辛曼(Hinman)等人，1993，癌症研究(Cancer Research)53：3336-3342；罗德(Lode)等人，1998，癌症研究(Cancer Research)58：2925-2928；美国专利第5,714,586号；美国专利第5,712,374号；美国专利第5,264,586号；美国专利第5,773,001号)。
本发明的抗体也可接合于脂质体以用于靶向传递(参见例如帕克(Park)等人，1997，药理学进展(Adv.Pharmacol.)40：399-435；马蒂(Marty)和施文登耐尔(Schwendener)，2004，分子医学方法(Methods in Molecular Medicine)109：389-401)。
在一实例中，本发明的抗体可连接于聚(乙二醇)(PEG)部分。在一特定实例中，抗体为抗体片段且PEG部分可通过位于抗体片段中的任何可用氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何自由氨基、亚氨基、硫醇、羟基或羧基)连接。所述氨基酸可天然存在于抗体片段中，或可使用重组DNA方法工程改造至片段中。参见例如美国专利第5,219,996号。可使用多个位点来连接两个或两个以上PEG分子。PEG部分可通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基以共价方式连接。在使用硫醇基作为连接点时，可使用经适当活化的效应部分(例如，硫醇选择性衍生物(诸如顺丁烯二酰亚胺)和半胱氨酸衍生物)。
在一特定实例中，抗TNF-α抗体接合物为例如根据EP 0948544中所揭示的方法进行聚乙二醇化的经修饰Fab′片段，即其具有PEG(聚(乙二醇))与其共价连接。也参见聚(乙二醇)化学的生物技术和生物医学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnicaland Biomedical Applications)(J.米尔顿·哈里斯(J.Milton Harris)编，普莱南出版社(Plenum Press)，纽约(New York)，1992)；聚(乙二醇)化学和生物学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications)(J.米尔顿·哈里斯(J.Milton Harris)和S.泽里普斯基(S.Zalipsky)编，美国化学学会(American ChemicalSociety)，华盛顿特区(Washington D.C.)，1997)；和生物医学中的生物接合蛋白质偶合技术(Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences)(M.阿斯拉姆(M.Aslam)和A.邓特(A.Dent)编，格罗夫出版社(Grove Publishers)，纽约(NewYork)，1998)；和查普曼(Chapman)，2002，药物传递进展综述(Advanced Drug DeliveryReviews)54：531-545。PEG可连接于绞链区中的半胱氨酸。在一实例中，经PEG修饰的Fab′片段具有顺丁烯二酰亚胺基团共价连接于经修饰绞链区中的单个硫醇基。赖氨酸残基可共价连接于顺丁烯二酰亚胺基团且赖氨酸残基上的各氨基可连接于分子量为约20,000Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。连接于Fab′片段的PEG的总分子量因此可为约40,000Da。
“标记”一词在本文使用时是指可直接或间接接合于本发明的抗TNF-α抗体的可检测化合物或组合物。标记自身可为可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可催化可检测的底物化合物或组合物发生化学变化。适用的荧光部分包括(但不限于)荧光素(fluorescein)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红素(phycoerythrin)等。适用的酶标记包括(但不限于)碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶等。
其它尤其适用于诊断目的的抗TNF-α抗体接合物描述于下文第7.7部分中。
7.7抗TNF-α抗体的诊断用途
本发明的抗TNF-α抗体(包括已例如经生物素化、辣根过氧化酶或任何其它可检测部分(包括第7.6部分中所述的部分)修饰的抗体)可适用于诊断目的。
具体来说，抗TNF-α抗体可用于例如(但不限于)纯化或检测TNF-α，包括活体外和活体内诊断方法两者。举例来说，抗体可用于定性和定量测量生物样品中TNF-α的含量的免疫分析中。参见例如哈洛(Harlow)等人，抗体实验室手册(Antibodies：A LaboratoryManual)，第2版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1988)，其以全文引用的方式并入本文中。在一实施例中，本发明的抗TNF-α抗体可用于检测和定量血清中TNF-α的含量。
本发明进一步涵盖接合于诊断剂的抗体或其片段。所述抗体可用于诊断以便例如检测相关目标于特定细胞、组织或血清中的表达；或作为临床测试程序的一部分监测免疫反应的发展或进展以便例如判断指定治疗方案的功效。可通过将抗体偶合至可检测物质来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属，和非放射性顺磁性金属离子。可使用所属领域中已知的技术将可检测物质直接偶合或接合于抗体(或其片段)，或通过中间物(诸如，所属领域中已知的连接子)间接偶合或接合于抗体(或其片段)。酶标记的实例包括荧光素酶(luciferase)(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4,737,456号)、发光素(luciferin)、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸去氢酶、尿素酶、过氧化酶(诸如辣根过氧化酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸去氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化酶、微过氧化酶等。适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合荧光物质的实例包括伞酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺、荧光素、丹酰氯(dansyl chloride)或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光物质的实例包括荧光素酶、发光素和水母发光蛋白(aequorin)；且适合放射性物质的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
本发明提供对TNF-α表达的检测，其包含使用一种或一种以上本发明的抗TNF-α抗体(任选接合于可检测部分)接触生物样品(个体的细胞、组织或体液)，和检测样品关于TNF-α表达是否呈阳性，或检测样品相较于对照样品是否具有改变(例如减少或增加)的表达。
可使用本发明方法诊断的疾病包括(但不限于)本文所述的疾病。在某些实施例中，组织或体液为周边血液、周边血液白血球、活组织检查组织(诸如肺或皮肤活组织检查)以及组织。
7.8使用抗TNF-α抗体的治疗方法
7.8.1临床效益
本发明的TNF-α抗体适用于治疗各种免疫和自体免疫性病变以及发炎性疾病的病症或症状。可用本发明的抗TNF-α抗体治疗的TNF-α相关病变和疾病包括(但不限于)以下：
●急性和慢性免疫和自体免疫性病变，诸如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、甲状腺功能症、移植物抗宿主疾病、硬皮病、糖尿病、格雷夫氏病等；
●感染，包括(但不限于)败血症综合症；恶病质；由急性或慢性细菌感染所致的循环性虚脱和休克；急性和慢性寄生虫和/或细菌、病毒或真菌感染性疾病，诸如AIDS(包括后遗症，诸如恶病质、自体免疫性病症、AIDS痴呆综合症和感染)；
●发炎性疾病，诸如慢性发炎性病变和血管发炎性病变，包括诸如类肉瘤病、慢性发炎性肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病等慢性发炎性病变，和诸如(但不限于)散播性血管内凝血、动脉粥样硬化和川崎氏病(Kawasaki′s pathology)等血管发炎性病变；
●神经退化性疾病，包括(但不限于)脱髓鞘疾病，诸如多发性硬化症和急性横贯性脊髓炎；锥体外和小脑病症，诸如皮质脊髓系统的病变；基底神经节病症或小脑病症；过动性运动障碍，诸如亨廷顿氏舞蹈病(Huntington′s Chorea)和老年性舞蹈病；药物诱发性运动障碍，诸如由阻断CNS多巴胺受体的药物诱发的运动障碍；运动不足性运动障碍，诸如帕金森氏症(Parkinson′s disease)；进行性核上麻痹；小脑和脊髓小脑病症，诸如小脑结构性病变；脊髓小脑退化(脊髓性共济失调、弗里德里希氏共济失调(Friedreich′sataxia)、小脑皮质退化、多系统退化(门则病(Mencel)、代哲因-托马斯病(Dejerine-Thomas)、史德尔格病(Shi-Drager)和马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph))；和全身性病症(雷夫苏姆氏病(Refsum′s disease)、无β脂蛋白血症、共济失调、毛细血管扩张和线粒体多系统病症)；脱髓鞘核心病症，诸如多发性硬化症、急性横贯性脊髓炎；运动单位病症，诸如神经性肌肉萎缩(前角细胞退化，诸如肌萎缩性侧索硬化、婴儿脊髓性肌肉萎缩和青少年脊髓性肌肉萎缩)；阿兹海默氏症(Alzheimer′s disease)；中年唐氏综合症(Down′sSyndrome in middle age)；泛发性路易体疾病(Diffuse Lewy body disease)；路易体型老年性痴呆(Senile Dementia of Lewy body type)；韦尼克-科尔萨科夫综合症(Wernicke-Korsakoff syndrome)；慢性酒精中毒；库贾氏症(Creutzfeldt-Jakobdisease)；亚急性硬化性全脑炎；哈洛弗登-史巴兹氏苍白球色素退化症(Hallerrorden-Spatz disease)；和拳击员痴呆；或其任何子集；
●涉及TNF-α分泌性肿瘤的恶性病变或其它涉及TNF-α的恶性疾病，诸如(但不限于)白血病(急性、慢性髓细胞性、慢性淋巴细胞性和/或脊髓发育不良性综合症)；淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)和非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′slymphoma)，诸如恶性淋巴瘤(伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)或蕈样真菌病(Mycosis fungoides))，和
●酒精诱发性肝炎。
在某些特定实施例中，本发明的抗体用于治疗以下一者或一者以上：
●成人的中度至重度类风湿性关节炎(RA)；
●4岁和4岁以上儿童的中度至重度多关节型青少年特发性关节炎(JIA)；
●成人的牛皮癣性关节炎(PsA)；
●成人的僵直性脊椎炎(AS)。
●对常规治疗反应不良的成人的中度至重度克罗恩氏病(CD)；
●成人的中度至重度慢性斑块型牛皮癣(Ps)。
因此，本发明提供治疗有需要的患者的任何上述疾病的方法，其包含：向所述患者投予本发明的抗TNF-α抗体。所述投药任选例如在1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月或3个月后重复。重复投药可以相同剂量或不同剂量进行。投药可重复1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或10次以上。举例来说，根据某些给药方案，患者长期接受抗TNF-α治疗，历时例如6个月、1年或1年以上。向患者投予的抗TNF-α抗体的量在某些实施例中为治疗有效量。如本文所用，“治疗有效”量的TNF-α抗体可以单一剂量形式或经历治疗方案的时程，例如经历1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月、1年或更久的时程投予。例示性治疗方案描述于下文第7.11部分中。
根据本发明，治疗疾病涵盖治疗已诊断罹患任何形式的处于任何临床阶段或表现的疾病的患者；延迟疾病的症状或征兆的发作或演变或加重或恶化；和/或预防疾病和/或减轻疾病的严重度。
投予本发明的抗TNF-α抗体的“个体”或“患者”优选为哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如母牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴或人类)。在某些实施例中，个体或患者为人类。在某些方面中，人类为儿科患者。在其它方面中，人类为成人患者。
7.9医药组合物和投药途径
本文提供包含本发明的抗TNF-α抗体且任选包含一种或一种以上其它治疗剂(诸如下文第7.10部分中所述的组合治疗剂)的组合物。组合物通常将作为通常包括医药学上可接受的载剂的无菌医药组合物的一部分供应。此组合物可呈任何适合形式(视将其投予患者的所需方法而定)。
可通过多种途径(诸如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、眼内、局部、鞘内和脑室内)向患者投予本发明的抗TNF-α抗体。在任何指定情况下最适于投药的途径将视特定抗体、个体和疾病的性质和严重度以及个体的身体状况而定。
为治疗本文所述的适应症，本发明的抗TNF-α抗体的有效剂量可在每单次(例如大丸剂(bolus))投药、多次投药或连续投药约0.001至约75mg/kg的范围内，或可达成每单次(例如大丸剂)投药、多次投药或连续投药0.01-5000μg/mL血清浓度的血清浓度，或为其中任何有效范围或值，视所治疗的病状、投药途径和个体的年龄、体重和状况而定。在一特定实施例中，各剂量可在每公斤体重约0.5μg至约50μg，例如每公斤体重约3μg至约30μg的范围内。抗体可调配成水溶液且通过皮下注射投予。
医药组合物可以每剂含有预定量的本发明抗TNF-α抗体的单位剂型方便地提供。所述单位可含有例如(但不限于)5mg至5g，例如10mg至1g，或20至50mg。用于本发明中的医药学上可接受的载剂可采用多种形式，视例如欲治疗的病状或投药途径而定。
本发明抗TNF-α抗体的治疗调配物可通过混合具有所需纯度的抗体与任选所属领域中通常使用的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(在本文中皆称作“载剂”)(即，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型清洁剂、抗氧化剂和其它各种添加剂)来制备成冻干调配物或水溶液以供储存。参见雷明顿医药科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)，第16版(欧索尔(Osol)编，1980)。所述添加剂在所用的剂量和浓度下须对接受者无毒。
缓冲剂帮助使pH值维持于接近生理条件的范围内。其可以约2mM至约50mM范围内的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机酸和无机酸两者和其盐，诸如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、丁二酸盐缓冲液(例如丁二酸-丁二酸单钠混合物、丁二酸-氢氧化钠混合物、丁二酸-丁二酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、反丁烯二酸盐缓冲液(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸单钠混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二钠混合物、反丁烯二酸单钠-反丁烯二酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)，和乙酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐(诸如Tris)。
可添加防腐剂以阻碍微生物生长，且可以0.2％-1％(w/v)范围内的量添加。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八基二甲基苯甲基铵、卤化苯甲烃铵(benzalconium halide)(例如氯化苯甲烃铵、溴化苯甲烃铵和碘化苯甲烃铵)、氯化六羟季铵和对羟基苯甲酸烷酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可添加有时称作“稳定剂”的等渗剂以确保本发明的液体组合物的等渗性，且所述等渗剂包括多元糖醇，例如三元或更高级糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛类别的赋形剂，其功能范围可为膨化剂至溶解治疗剂或帮助防止变性或粘附至容器壁的添加剂。典型稳定剂可为多元糖醇(上文所列举)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括环糖醇(诸如肌醇(inositol))；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代羟乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如具有10个或10个以下残基的肽)；蛋白质，诸如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，诸如棉子糖；和多糖，诸如聚葡萄糖。稳定剂可以每重量份活性蛋白质0.1至10,000重量份的范围存在。
可添加非离子型界面活性剂或清洁剂(也称作“湿润剂”)来帮助溶解治疗剂以及保护治疗蛋白质避免搅动诱发的聚集，其也允许调配物暴露于受到应力的剪切表面而不引起蛋白质变性。适合的非离子型界面活性剂包括聚山梨醇酯(聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(泊洛沙姆184、泊洛沙姆188等)、普洛尼克多元醇(Pluronicpolyols)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(吐温-20、吐温-80等)。非离子型界面活性剂可以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL，例如约0.07mg/mL至约0.2mg/mL的范围存在。
其它各种赋形剂包括膨化剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。其它适于本发明的抗TNF-α抗体的调配物揭示于美国专利申请案第2004/0033228A1号中，其内容以全文引用的方式并入本文中。
除本发明的抗TNF-α抗体外，本文的调配物还可含有组合治疗剂。适合的组合治疗剂的实例提供于下文第7.10部分中。
皮下投药的给药时程变化可为每6个月、每5个月、每4个月、每3个月、每2个月一次、1个月一次至每两周一次、每周一次或每日一次，视包括疾病类型、疾病严重度和患者对抗TNF-α抗体的敏感性在内的多种临床因素而定。
欲投予的本发明抗TNF-α抗体的剂量将根据特定抗体、自体免疫或发炎性疾病的类型、个体以及疾病的性质和严重度、个体的身体状况、治疗方案(例如，是否使用组合治疗剂)和所选的投药途径而变化；适合的剂量可由所属领域的技术人员轻易地确定。
为治疗和/或预防人类和动物的自体免疫或发炎性疾病，可使用任何适合的投药途径(诸如注射和所属领域中已知用于基于抗体的临床产品的其它投药途径)向患者(例如人类个体)投予治疗或预防有效剂量(例如，使自体免疫或发炎性疾病得到抑制和/或减轻自体免疫或发炎性疾病症状的剂量)的包含抗TNF-α抗体的医药组合物。
所属领域的技术人员应了解，本发明抗TNF-α抗体的最佳量和个别剂量的间隔将由所治疗病状的性质和程度、投药的形式、途径和部位以及所治疗特定个体的年龄和状况决定，且医师将最终决定所用的适合剂量。此剂量可适当重复多次。若产生副作用，则可根据常规临床实践改变或降低给药的量和/或频率。
7.10组合治疗
下文描述可利用本发明的抗TNF-α抗体的组合方法。本发明的组合方法涉及向患者投予至少两种药剂，其中第一药剂为本发明的抗TNF-α抗体，而其它药剂为组合治疗剂。抗TNF-α抗体和组合治疗剂可同时、相继或分开投予。
本发明的组合治疗方法可产生大于相加作用的作用，从而提供抗TNF-α抗体和组合治疗剂两者皆不以单独使用时治疗有效的量投予的治疗效益。
在本发明方法中，可共同(同时或依次)投予本发明的抗TNF-α抗体和组合治疗剂。如本文所用，若例如在同一次患者就诊期间的同一天向患者投予本发明的抗TNF-α抗体和组合治疗剂，则称本发明抗TNF-α抗体和组合治疗剂是依次投予。依次投药可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小时进行。相比之下，若在不同日期向患者投予本发明的抗TNF-α抗体和组合治疗剂，例如可以1天、2天或3天、1周、2周或一个月的时间间隔投予本发明的抗TNF-α抗体与组合治疗剂，则称本发明的抗TNF-α抗体和组合治疗剂是分开投予。在本发明的方法中，可在投予组合治疗剂之前或之后投予本发明的抗TNF-α抗体。
作为一非限制性实例，可在一段时间中同时投予本发明的抗TNF-α抗体和组合治疗剂，随后在第二段时间中交替投予本发明抗TNF-α抗体和组合治疗剂。
由于投予本发明抗TNF-α抗体和组合治疗剂的潜在协同效应，所以所述药剂可以在单独投予所述药剂中的一者或两者时无治疗有效性的量投予。
在某些方面中，组合治疗剂为抗风湿药物、消炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂或细胞毒性药物。
抗风湿药物包括(但不限于)金诺芬(auranofin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯喹(chloroquine)、D-青霉胺(D-penicillamine)、硫代苹果酸金钠(gold sodiumthiomalate)、羟基氯喹(hydroxychloroquine)、硫代苯酸金钠(Myocrisin)和柳氮磺胺吡啶(sulfasalzine)、甲氨蝶呤。
消炎剂包括(但不限于)地塞米松(dexamethasone)、颇得斯安(pentasa)、美色拉嗪(mesalazine)、阿肠克(asacol)、磷酸可待因(codeine phosphate)、扑炎痛(benorylate)、芬布芬(fenbufen)、萘普生(naprosyn)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)和吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹灵(aspirin)和布洛芬(ibuprofen)。
化学治疗剂包括(但不限于)放射性分子、毒素(也称作细胞毒素或细胞毒性剂，其包括任何对细胞活力有害的药剂)、含有化学治疗化合物的药剂和脂质体或其它囊泡。适合化学治疗剂的实例包括(但不限于)1-去氢睪酮、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、放射菌素D、阿霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、烷化剂、别嘌醇钠(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、安美达锭(anastrozole)、安曲霉素(anthramycin，AMC))、抗有丝分裂剂、顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、二氨基二氯铂、蒽环霉素、抗生素、抗代谢物、天冬酰胺酶、活BCG(膀胱内)、倍他米松磷酸钠(betamethasone sodium phosphate)和乙酸倍他米松、比卡鲁胺(bicalutamide)、硫酸博莱霉素、白消安、甲酰四氢叶酸钙(calcium leucouorin)、卡奇霉素、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉曲滨(Cladribine)、秋水仙碱、接合雌激素、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、环硫磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷、细胞松弛素B、癌得星(Cytoxan)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、放线菌素D、放线菌素D(先前称作放射菌素)、盐酸道诺霉素(daunirubicin HCL)、柠檬酸道诺霉素(daunorucbicin citrate)、地尼白介素(denileukin diftitox)、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌素二酮、多烯紫杉醇(Docetaxel)、甲磺酸多拉司琼(dolasetron mesylate)、盐酸小红莓、屈大麻酚(dronabinol)、大肠杆菌(E.coli)L-天冬酰胺酶、伏洛昔单抗(eolociximab)、吐根素、依泊丁-α(epoetin-α)、伊文氏杆菌L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)、酯化雌激素、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀磷酸钠(estramustine phosphate sodium)、溴化乙锭、炔雌醇(ethinyl estradiol)、依替膦酸盐(etidronate)、依托泊苷嗜橙菌因子(etoposide citrororum factor)、磷酸依托泊苷、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷(floxuridine)、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、醛叶酸、盐酸吉西他滨(gemcitabine HCL)、糖皮质激素、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、短杆菌肽D、盐酸格拉司琼(granisetron HCL)、羟基脲、盐酸黄胆素(idarubicin HCL)、异环磷酰胺(ifosfamide)、干扰素α-2b、盐酸伊立替康(irinotecan HCL)、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸钙(leucovorin calcium)、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、盐酸左旋咪唑(levamisole HCL)、利多卡因、洛莫司汀、类美登素、盐酸氮芥、乙酸甲羟助孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、盐酸美法仑、巯基嘌呤(mercaptipurine)、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤、甲基睪酮(methyltestosterone)、光神霉素、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、尼鲁米特(nilutamide)、乙酸奥曲肽(octreotide acetate)、盐酸昂丹司琼(ondansetron HCL)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸二钠(pamidronate disodium)、喷司他丁(pentostatin)、盐酸毛果芸香碱(pilocarpine HCL)、吡利霉素(plimycin)、聚苯丙生20与卡莫司汀植入物(polifeprosan20 with carmustine implant)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、普鲁卡因、盐酸丙卡巴肼(procarbazine HCL)、普萘洛尔、利妥昔单抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、链佐霉素、他莫西芬(tamoxifen)、紫杉醇、替尼泊苷(teniposide)、鬼臼噻吩苷、睪内酯(testolactone)、四卡因、噻替派苯丁酸氮芥、硫鸟嘌呤、噻替派、盐酸拓扑替康(topotecan HCL)、柠檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱和酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)。
在本发明的其它方面中，组合治疗剂为除本发明抗TNF-α抗体以外的TNF-α拮抗剂。所述TNF-α拮抗剂的实例包括(但不限于)可溶性TNF-α受体；依那西普(ENBRELTM；伊姆耐斯公司(Immunex))或其片段、衍生物或类似物；英利昔单抗(REMICADE；森托科尔公司(Centacor))或其衍生物、类似物或抗原结合片段；IL-10，其已知通过干扰素-γ活化的巨噬细胞阻断TNF-α产生(欧斯瓦尔德(Oswald)等人，1992，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：8676-8680)，TNFR-IgG(阿什肯纳兹(Ashkenazi)等人，1991，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：10535-10539)；鼠类产品TBP-1(雪兰诺公司(Serono)/耶达公司(Yeda))；疫苗CytoTAb(普罗薛瑞克斯公司(Protherics))；反义分子104838(伊希斯公司(ISIS))；肽RDP-58(桑斯塔特公司(SangStat))；沙立度胺(thalidomide)(赛尔金公司(Celgene))；CDC-801(赛尔金公司(Celgene))；DPC-333(杜邦公司(Dupont))；VX-745(弗尔泰克斯公司(Vertex))；AGIX-4207(阿什洛基因公司(AtheroGenics))；ITF-2357(伊塔法玛可公司(Italfarmaco))；NPI-13021-31(耐瑞乌斯公司(Nereus))；SCIO-469(赛奥斯公司(Scios))；TACE靶向剂(伊姆尼克斯公司(Immunix)/美国家用产品公司(AHP))；CLX-120500(卡利克斯公司(Calyx))；噻唑普瑞(Thiazolopyrim)(迪纳法科斯公司(Dynavax))；金诺芬(瑞得(Ridaura))(史密斯科林比彻姆医药公司(SmithKline Beecham Pharmaceuticals))；奎纳克林(quinacrine)(二氯水合美帕克林(mepacrine dichlorohydrate))；替尼达普(tenidap)(伊纳布利克斯公司(Enablex))；黑色素(大型生物学公司(Large Scale Biological))；和抗p38 MAPK剂(乌利亚齐公司(Uriach))。
适用于与抗TNF-α抗体组合的其它第二治疗剂以及与所述第二治疗剂的组合治疗适用的特定适应症揭示于WO 2004/004633中，其以全文引用的方式并入本文中。
7.11治疗方案
本发明提供涉及投予本发明抗TNF-α抗体的治疗方案。治疗方案将视患者的年龄、体重和疾病病况而变化。治疗方案可持续2周至无限期。在特定实施例中，治疗方案持续2周至6个月、3个月至5年、6个月至1年或2年、8个月至18个月等。治疗方案可为非可变剂量方案或多可变剂量方案，例如如WO 2005/110452中所述，其以全文引用的方式并入本文中。
对于下文所述的例示性给药方案，抗TNF-α抗体可以用于皮下投药的无菌无防腐剂溶液形式投予。
在某些实施例中，药物产品以内部封装有1mL预填充玻璃注射器的一次性预填充注射笔形式，或以单一剂量1mL预填充玻璃注射器形式供应。对于成人患者，在某些实施例中，注射器传递0.8mL包含本发明抗TNF-α抗体的医药学上可接受的溶液。在一特定实施例中，除抗体外，溶液还含有4.93mg氯化钠、0.69mg二水合磷酸二氢钠、1.22mg二水合磷酸氢二钠、0.24mg柠檬酸钠、1.04mg单水合柠檬酸、9.6mg甘露糖醇、0.8mg聚山梨醇酯80和注射用水(USP)以及必要时添加以调节pH值的氢氧化钠。对于儿科患者，在某些实施例中，注射器传递0.4mL包含本发明抗TNF-α抗体的医药学上可接受的溶液。在一特定实施例中，除抗体外，溶液还含有2.47mg氯化钠、0.34mg二水合磷酸二氢钠、0.61mg二水合磷酸氢二钠、0.12mg柠檬酸钠、0.52mg单水合柠檬酸、4.8mg甘露糖醇、0.4mg聚山梨醇酯80和注射用水(USP)以及必要时添加以调节pH值的氢氧化钠。
为治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎和僵直性脊椎炎，可每隔一周投予剂量为10至50mg(例如10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg或50mg)的本发明的抗TNF-α抗体。在以本发明的抗TNF-α抗体治疗期间，甲氨蝶呤、糖皮质激素、水杨酸盐、非类固醇消炎药(NSAID)、镇痛剂或其它疾病改善性抗风湿药(DMARD)可继续使用。在类风湿性关节炎中，一些未伴随服用甲氨蝶呤的患者可因将给药频率从每两周一次增加至每周一次而获得额外益处。
为治疗青少年特发性关节炎，本发明抗TNF-α抗体的投予剂量可视患者的体重而定。在某些非限制性实施例中，用于体重为15公斤(33磅)至30公斤(66磅)以下的儿科患者的剂量在每隔一周5至25mg的范围内(例如5mg、7.5mg、10mg、12.5mg、15mg、20mg或25mg)。在某些非限制性实施例中，用于体重高于30公斤(66磅)的儿科患者的剂量在每隔一周10至50mg的范围内(例如10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg或50mg)。在以抗TNF-α抗体治疗期间，甲氨蝶呤、糖皮质激素、水杨酸盐、NSAID或镇痛剂可继续使用。
为治疗克罗恩氏病，在某些非限制性实施例中，可如下投予本发明的抗TNF-α抗体：最初(在第1天或在第1天与第2天之间分次)给与40-280mg(例如40mg、80mg、100mg、120mg、140mg、160mg、180mg、200mg、240mg或280mg)的剂量，继而在2周后(第15天)给与初始剂量的约40％至60％(例如50％)的剂量。2周后(第29天)，每隔一周投予初始剂量的20％至30％(例如25％)的维持剂量。在以抗TNF-α抗体治疗期间，氨基水杨酸盐、皮质类固醇和/或免疫调节剂(例如6-巯基嘌呤和硫唑嘌呤)可继续使用。
为治疗斑块状牛皮癣，在某些非限制性实施例中，可如下投予本发明的抗TNF-α抗体：最初给与40-160mg(例如40mg、80mg、100mg、120mg、140mg或160mg)的剂量，继而从初始剂量后1周开始每隔一周给与初始剂量的一半。
7.12诊断和医药试剂盒
本发明涵盖含有本发明的抗TNF-α抗体(包括抗体接合物)的医药试剂盒。医药试剂盒为包含本发明的抗TNF-α抗体(例如呈冻干形式或呈水性溶液形式)和以下一者或一者以上的包装：
●例如如上文第7.10部分中所述的组合治疗剂；
●用于投予抗TNF-α抗体的装置，例如注射笔、针和/或注射器；和
●在抗体呈冻干形式情况下用以再悬浮抗体的医药级水或缓冲液。
在某些方面中，各单位剂量的抗TNF-α抗体分开封装，且试剂盒可含有一个或一个以上单位剂量(例如2个单位剂量、3个单位剂量、4个单位剂量、5个单位剂量、8个单位剂量、10个单位剂量或10个以上单位剂量)。在一特定实施例中，一个或一个以上单位剂量各自容纳于注射器或注射笔中。
本文还涵盖含有本发明的抗TNF-α抗体(包括抗体接合物)的诊断试剂盒。诊断试剂盒为包含本发明的抗TNF-α抗体(例如呈冻干形式或呈水性溶液形式)和一种或一种以上适用于进行诊断分析的试剂的包装。在抗TNF-α抗体经酶标记的情况下，试剂盒可包括酶所需要的底物和辅因子(例如提供可检测发色团或荧光团的底物前驱物)。另外，可包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或溶解缓冲液)等。在某些实施例中，诊断试剂盒中所包括的抗TNF-α抗体固定于固体表面上，或试剂盒中包括可用于固定抗体的固体表面(例如载片)。各种试剂的相对量可广泛变化以提供实质上使分析灵敏度最优化的试剂于溶液中的浓度。在一特定实施例中，抗体和一种或一种以上试剂可以包括赋形剂的干燥粉末(通常为冻干粉末)形式提供(个别地或组合)，其在溶解时将提供具有适合浓度的试剂溶液。
8.实例1：鉴别去免疫化的D2E7变异体
8.1材料和方法
8.1.1肽
肽由米莫托普斯公司(Mimotopes)(澳大利亚阿德莱德市(Adelaide，Australia))使用多中心(multi-pin)格式合成。D2E7轻链和重链可变区的序列合成为具有12个氨基酸重叠的15聚体肽(图1和表1)，总共69个肽。将肽冻干且以约1-2mg/mL再悬浮于DMSO(西格玛阿德里奇公司(Sigma-Aldrich))中。储备肽在-20℃下保持冷冻。
8.1.2人类周边血液单核细胞
社区捐献者白血球层产品购自斯坦福血液中心(Stanford Blood Center)，加利弗利亚州帕洛阿尔托市(Palo Alto，CA)。用不含钙或镁的DPBS以1∶1(v∶v)稀释白血球层物质。将经稀释的白血球层物质(25-35mL)置于含12.5mL FicollPaque-PLUS(GE医疗公司(GEHealthcare))的50mL锥形离心管(萨斯迪德公司(Sarsted)或科斯塔公司(Costar))下层。在室温下将样品以900g离心30分钟。从界面收集周边血液单核细胞(PBMC)。添加DPBS以使最终体积达到50mL且将细胞以350g离心5分钟。使细胞集结块再悬浮于DPBS中且进行计数。
8.1.3树突状细胞
为分离树突状细胞，将含108个新鲜分离的PBMC的总体积为30mL的AIM V培养基(英杰公司(Invitrogen))接种于T75培养瓶(科斯塔公司(Costar))中。将过量的PBMC于90％胎牛血清(FCS)、10％DMSO中以5×107个细胞/毫升在-80℃下冷冻。T75培养瓶在37℃、5％CO2下培育2小时。移除未附着的细胞，且用DPBS洗涤附着的单层。为区分树突状细胞与单核细胞，添加30mL含有800单位/毫升GM-CSF(R&D系统公司(R and D Systems))和500单位/毫升IL-4(R&D系统公司(R and D Systems))的AIM V培养基。培育培养瓶5天。在第5天，添加IL-1α(恩杜金公司(Endogen))和TNF-α(恩杜金公司(Endogen))达到50pg/mL和0.2ng/ml。再培育培养瓶2天。在第7天，通过添加3mL含有0.5至1.0mg丝裂霉素C(西格玛阿德里奇公司(Sigma-Aldrich))的100mM EDTA，使EDTA的最终浓度为10mM并且丝裂霉素C的最终浓度为16.5至33μg/mL来收集树突状细胞。或者，可以4,000拉德(rad)照射树突状细胞以进行固定。在37℃和5％CO2下再培育培养瓶1小时。收集树突状细胞，且在AIM V培养基中洗涤2-3次。
8.1.4细胞培养
在第7天，在37℃水浴中使先前冷冻的自体性PBMC快速解冻。将细胞立即稀释于DPBS或AIM V培养基中且以350g离心5分钟。通过使用磁性珠粒(Easy-Sep CD4+试剂盒，干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))进行阴性选择使CD4+细胞富集。在96孔圆底板(科斯塔9077)中以每孔每2×104个树突状细胞2×105个CD4+T细胞共培养自体性CD4+T细胞与树突状细胞。添加约5μg/mL的肽。对照孔含有单独0.25％v∶vDMSO(西格玛公司(Sigma))媒剂。阳性对照孔含有0.25％的DMSO和1μg/mL的破伤风类毒素(tetanus toxoid)(李斯特生物公司(List Biologicals)或卡尔生物化学公司(CalBioChem))。培育培养物5天。在第5天，每孔添加0.25μCi的氚化胸苷(安玛西亚公司(Amersham)或GE医疗公司(GEHealthcare))。在第6天，使用Packard Filtermate细胞收集器将培养物收集至过滤垫(filtermat)上。使用Wallac MicroBeta 1450闪烁计数器(皮尔金埃尔墨公司(PerkinElmer))进行闪烁计数。
8.1.5数据分析
通过计算来自6至12次重复实验的个别结果的平均值来计算平均背景CPM值。计算4个阳性对照孔的CPM值的平均值。计算各肽的两个重复孔或三个重复孔的平均值。通过用平均实验CPM值除以平均对照值来计算阳性对照和肽孔的刺激指数值。为纳入数据集中，需要破伤风类毒素阳性对照孔中刺激指数大于3.0。记录产生2.95或2.95以上的刺激指数的任何肽的反应。使用来自一组81名捐献者的周边血液样品对肽进行测试。汇编对所有肽的反应。对于所测试的各肽，计算以2.95或2.95以上的刺激指数反应的捐献者组的百分比。另外，计算所有捐献者的平均刺激指数。
8.1.6HLA基因型分析
使用市售Dynal RELI分型试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，英国(UK))确定各捐献者的HLA DRB1和HLA DQB1等位基因。报导低严格度SSO结果。使用卡方分析(Chi-squaredanalysis)(一个自由度)确定对任何指定肽的反应性的HLA相关性。在等位基因在反应者和非反应者群体两者中皆存在时，报导相对风险值。
8.1.7D2E7变异型抗体的竞争ELISA
通过在4℃下使板与浓度为1μg/mL的TNF-α的PBS溶液接触过夜来使TNF-α粘附于微孔板上。在含0.1％吐温20的PBS中洗涤板，且在Superblock(赛默科技公司(ThermoScientific)，伊利诺伊州罗克福德市(Rockford，IL))中阻断。将ELISA缓冲液(例如含1％BSA和0.1％吐温20的PBS)中次饱和量的生物素化D2E7(80ng/mL)与连续稀释(浓度为2.8μg/mL、8.3μg/mL或25μg/mL)的未经标记D2E7(“参照”抗体)或竞争性抗TNF-α抗体(“测试”抗体)抗体的混合物添加至各孔中，且在和缓振荡下培育各板1小时。洗涤各板，将稀释于ELISA缓冲液中的1μg/mL接合HRP的抗生蛋白链菌素添加至各孔中，且培育各板1小时。洗涤各板且通过添加TMB(百福斯实验室有限公司(Biofx Laboratories Inc.)，马里兰州欧文斯密尔市(Owings Mills，MD))检测结合的抗体。通过添加停止缓冲液(例如Bio FX停止试剂，百福斯实验室有限公司(Biofx Laboratories Inc.)，马里兰州欧文斯密尔市(OwingsMills，MD))终止反应且使用微板读取器(例如VERSAmax，分子装置公司(MolecularDevices)，加利弗利亚州桑尼维尔市(Sunnyvale，CA))在650nm下测量吸光度。计算各抗体的IC50值。实验进行3次，且平均结果表示为亲本抗体结合结果的百分比。
8.1.8生物分析
将3×104个鼠类L929细胞涂铺于平底96孔微量滴定板的个别孔中。在37℃下于含湿气5％CO2培育箱中培育细胞过夜。次日，在25μL无血清培养基中制备抗TNF-α抗体的连续稀释液(例如0.712μg/mL、0.949μg/mL、1.27μg/mL、1.69μg/mL、2.25μg/mL或3μg/mL)，且添加至细胞中(以使得于150μL培养物中的最终浓度为119ng/mL、158ng/mL、211ng/mL、282ng/mL、375ng/mL或500ng/mL)。在37℃、5％CO2下培育2小时后，添加25μL的240ng/mL TNF-α溶液至40ng/mL的最终浓度，且在37℃、5％CO2下再培育细胞48小时。使用CellTiter-Blue活力分析(普洛麦格公司(Promega)，威斯康辛州麦迪逊市(Madison))，相较于对照板(其经TNF-α处理但与同型对照抗体或与亲本抗体D2E7一起培育)针对细胞毒性对各孔进行评分。测定IC50值且表示为亲本D2E7结果的百分比。
8.1.9通过BIAcore对D2E7变异体进行动力学分析
使用BIAcore 2000和3000表面等离子体激元共振系统(BIAcore，GE医疗公司(GEHealthcare)，新泽西州皮斯卡塔韦市(Piscataway，NJ))测量抗TNF-α抗体的结合亲和力。首先使用标准BIAcore胺偶合试剂(N-乙基-N′-二甲基氨基-丙基碳化二亚胺，EDC；N-羟基丁二酰亚胺，NHS；和盐酸乙醇胺，pH 8.5)将多克隆山羊抗人类Fc抗体(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))固定于生物传感器表面，继而在5微升/分钟的低流动速率下将抗TNF-α抗体(D2E7和D2E7变异体)捕捉于平行表面上。保持低RL以达成25-60RU的低Rmax。参照表面上不进行抗体捕捉以用作阴性对照。随后，将TNF-α以80微升/分钟的流动速率注射至所有流槽中历时3分钟以监测缔合，继而使HBS-P操作缓冲液(10mM HEPES、150mM氯化钠、0.005％P-20，pH 7.4)流动30分钟以监测解离相。在各循环，将TNF-α(R&D系统公司(R&D systems)，明尼苏达州明尼阿波利斯市(Minneapolis，MN))以处于0nM与128nM之间的范围内且具有四倍增量的6种不同TNF浓度注射于表面上。在各循环结束时以100微升/分钟的流动速率用1.5％H3PO4以2次短暂的脉冲使表面再生。
通过使用BIA评估程序对由不同浓度TNF-α收集的传感器图谱数据进行整体分析来计算各TNF-α与抗体对的结合动力学。在各分析中应用双重参照以消除来自参照表面和仅有缓冲液的对照物(0nM TNF-α)的背景反应。通过使用一对一朗缪耳结合质量转移模型(1∶1 Langmuir binding with mass transfer model)同时拟合传感器图谱的缔合和解离相获得各结合对的解离常数(KD)、缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。各组实验单独进行3次。
8.2结果
8.2.1鉴别D2E7VH和VL区中的CD4+T细胞抗原决定基
通过分析一组81名捐献者中对肽反应的百分比来鉴别CD4+T细胞抗原决定基肽。计算所测试的描述D2E7重链和轻链的所有肽的平均反应百分比和标准差。反应率大于或等于平均背景反应加上3个标准差视作潜在CD4+T细胞抗原决定基。对于D2E7轻链可变区，测试32个肽(图2)，其产生5.09+3.53％的平均背景反应百分比。高于背景3个标准差经测定为15.68％。在D2E7轻链肽数据集中一个处于位置8的肽呈现此反应程度，反应率为17.28％(图2)。另外，处于位置11的肽呈现12.35％的极高反应率。对于D2E7重链可变区，测试37个肽(图3)。平均背景反应百分比为2.64+2.04％。高于背景3个标准差为8.78％。D2E7重链数据集中的一个肽(第20号)达到8.64％的反应百分比(图3)。
计算数据集中所有肽的平均刺激指数。第8号轻链肽具有1.97+0.08s.e.m的高平均刺激指数。处于第11号位置的肽产生1.63+0.32s.e.m的平均刺激指数。轻链数据集中的第27号肽具有1.83的平均SI。此归因于单个捐献者对此肽具有29的极高刺激指数。第20号重链肽具有1.34+0.05s.e.m的平均刺激指数值。所有这些值皆显著高于两个数据集中所有肽的平均刺激指数(所有68个重链和轻链肽的平均刺激指数为1.02+0.02)。
这些数据指示在D2E7中存在两个主要CD4+T细胞抗原决定基区域(表2)。在VH区中，发现抗原决定基位于涵盖构架2与CDR2的接合点的肽位置20处。在表2中，来源于CDR的氨基酸加有下划线。在轻链中，可含有一个以上CD4+T细胞抗原决定基的大区域包括第8号和第11号肽。这些肽涵盖轻链的构架1、CDR1和构架2的部分。
8.2.2对VL抗原决定基肽的反应的HLA相关性
使用基于低严格度SSO PCR的方法测定肽数据集中所有81名捐献者的第II类HLA基因型。通过卡方分析测定特定HLA等位基因的存在与对2种VL肽的反应之间的相关性。测定所有HLA类型和2种肽的费氏P值(Fischer P value)和相对风险(表3)。任何HLA DR或DQ类型与对VL第8号肽(T22-Y36)的反应之间不存在显著相关性。此结果表明所述肽能够以广泛不同的方式结合第II类HLA分子。CD4+T细胞回应于VL第11号肽(N31-K45)的增殖反应与HLA-DQ2的存在密切相关(p＝0.003；相对风险＝7.7)。由于HLA-DR3与HLA-DQ2存在连锁不平衡，所以对此肽的反应与HLA-DR3之间存在相关性，但不具有统计显著性(p＝0.10；相对风险为3.3)。除HLA-DQ2外，也发现HLA-DR12与对N31-K45的反应之间存在相关性(p＝0.03；相对风险为5.2)。由于总共存在极少的反应者，所以未测试HLA对VH第20号肽的反应。由于对2种VL肽的反应者为离散的，所以可推断出所述2种VL肽代表两个各别肽抗原决定基。因此，D2E7VH和VL区含有3个主要肽抗原决定基区域。
8.2.3鉴别免疫原性降低的变异体
丙氨酸扫描修饰：D2E7轻链的21个氨基酸的序列涵盖处于T22-Y36和N31-K45处的抗原决定基。所选的21个氨基酸的序列为C23-K45。在各氨基酸处并入丙氨酸修饰(表4)。用变异型肽测试一组99名捐献者(图4)。在肽组中产生亲本21聚体4次。这些4次重复用作对照以获得分析再现性。平均亲本肽反应为8.3％，其中CV％为30％。因此，具有低于5.8％的平均百分比的变异型肽可视作具有降低的反应率。降低最多的变异体为C23A(2.02％)和P40A(3.03％，参见图4)。位置23处的半胱氨酸为恒定的，且因此不为用于在整个蛋白质中进行修饰的良好候选者。由于脯氨酸残基的独特性质，所以对此残基的修饰也不可能产生功能性变异型抗体。第三候选者为Y32A(4.04％)。另外，有多种变异体产生5.05％的平均反应率。这些变化也可能有效，但需要针对降低的免疫原性和功能活性测试整个蛋白质分子。
也测试一组基于D2E7VH抗原决定基肽序列的丙氨酸修饰肽(数据未展示)。未经修饰的亲本肽在重复测试中的反应率极低。因此，不再研究此肽。
抗原结合研究：对D2E7抗体的CDR-L1区进行综合突变分析。基于联合突变分析进行的抗原结合研究，鉴别出CDR-L1区内不显著降低抗体对TNF-α的亲和力的一组候选氨基酸取代(表5)。使用BIAcore和ELISA分析若干含有候选CDR-L1取代的变异型抗体(表6)。产生在CDR-L1区内含有具有改变氨基酸序列的同时保持整体抗体分子的亲和力的性质的氨基酸修饰的肽(表7)。测试单氨基酸修饰或双重修饰形式的经修饰的抗原决定基肽。双重修饰含有位置32处的谷氨酰胺或甘氨酸，或位置34处的丝氨酸或甘氨酸。测试总共79个肽，包括两个亲本21聚体肽合成物。用变异型肽测试总共102名捐献者，且结果展示于图5中。亲本肽的平均反应百分比为10.3+2.1％。关于低于亲本3个标准差的反应率百分比，反应率将低于4％。亲本肽的平均刺激指数为1.49+0.15。关于达到低于亲本反应3个标准差的刺激指数，其将为1.03或低于1.03。
随后对Y32G和Y32Q突变的亲和力测量显示此氨基酸修饰对抗原结合具有负面影响。因此，从分析中移除所有带有此修饰的肽。选择总共10个肽以供进一步研究。所有所选的肽具有低于4％的反应率。然而，肽中无一者显示低于平均亲本反应3个标准差的刺激指数(表8)。
8.2.4经修饰D2E7变异型抗体的亲和力和生物活性测试
将10个变异型D2E7VL区构筑体与未经修饰的VH区一起克隆至含人类IgG1的质体中，通过短暂转染使其在293T/17细胞系中表达，且通过蛋白质A或蛋白质G亲和力纯化抗体。在竞争ELISA分析中测试经纯化抗体与TNF-α的结合。所有10个变异体皆与未经修饰的D2E7抗体竞争结合TNF-α。然而，呈现一系列亲和力，自Q27R+A34S变异体的大致相等亲和力至自N31S+A34S变异体的亲和力降至1/10(图6)。
进行TNF-α毒性生物分析。将L292细胞接种于96孔板中，且将恒定浓度的TNF-α添加至培养基中。将变异型抗体滴定至培养基中。测定各变异体的EC50值(表9)。类似地，变异体Q27R+A34S呈现大致等于亲本D2E7抗体的EC50值。
最后，通过BIAcore分析测定抗体对TNF-α的亲和力(表10)。在所测试的10个变异体中，Q27H+A34S、Q27R+A34S和G28S+A34S变异体皆呈现类似于D2E7的缔合和解离速率。变异体的最终亲和力值在130pM范围内，相比而言，D2E7在这些实验中的实测亲和力为114pM。
9.实例2：鉴别对TNF-α的亲和力增加的D2E7变异体
对D2E7抗体进行综合突变分析以鉴别相较于D2E7对TNF-α的亲和力增加的突变体。通过ELISA和BIAcore分析相较于D2E7，候选突变体对TNF-α的亲和力增加以确定候选突变体特征。
9.1材料和方法
9.1.2竞争ELISA
如第8.1.7部分中所述进行竞争ELISA分析。重复ELISA两次且平均IC50改良倍数表示为WT/x。
9.1.2BIAcore
如第8.1.9部分中所述进行BIAcore分析。
9.2结果
相对于D2E7而言，KD得到改良(如由BIAcore所测量)、在ELISA中竞争能力得到改良，或两者皆得到改良的D2E7的CDR变异体展示于表12和25中。
10.特定实施例、参考文献的引用
本申请案中所引用的所有出版物、专利、专利申请案和其它文献出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，其程度如同各个别出版物、专利、专利申请案或其它文献个别地指示为出于所有目的以引用的方式并入本文中一般。
虽然已说明和描述了各种特定实施例，但应了解可在不背离本发明的精神和范围下进行各种改变。

Claims (9)

1.一种抗TNF-α抗体或抗体的抗TNF-α结合片段，其是一种参照的单克隆抗TNF-α抗体的变异体或抗TNF-α抗原结合片段，所述参照的单克隆抗TNF-α抗体或抗TNF-α抗原结合片段包括：
CDR-H1，氨基酸序列为DYAMH(SEQ ID NO:5)；
CDR-H2，氨基酸序列为AITWNSGHIDYADSVEG(SEQ ID NO:6)；
CDR-H3，氨基酸序列为VSYLSTASSLDY(SEQ ID NO:7)；
CDR-L1，氨基酸序列为RASQGIRNYLA(SEQ ID NO:8)；
CDR-L2，氨基酸序列为AASTLQS(SEQ ID NO:9)；和
CDR-L3，氨基酸序列为QRYNRAPYT(SEQ ID NO:10)；
其中，所述变异体包括选自如下的CDR-L1氨基酸取代的组合：Q4G+A11G、Q4H+A11S、Q4R+A11S或G5S+A11S。
2.如权利要求1所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段，其包含选自如下的CDR-L1氨基酸取代的组合：Q4H+A11S、Q4R+A11S或G5S+A11S。
3.如权利要求1所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段，其包含如下的CDR-L1氨基酸取代的组合：G5S+A11S。
4.如权利要求1所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段，其分别是人类或人源化抗体，或是人类或人源化抗体的抗TNF-α结合片段。
5.如权利要求1所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段，其是IgG；任选地，其中所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段是IgG1。
6.如权利要求1所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段，其未经岩藻糖基化。
7.如权利要求1所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段，其除所述CDR-L1氨基酸取代的组合以外，具有对应于SEQ ID NO:2的VH序列和对应于SEQ ID NO:4的VL序列。
8.一种医药组合物，其包含权利要求1所述的所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段和医药学上可接受的载剂。
9.一种如权利要求1所述的抗TNF-α抗体或抗TNF-α结合片段或如权利要求8所述的医药组合物在制备用于治疗人类患者的免疫病症的药物中的用途；任选地，其中所述免疫病症为类风湿性关节炎、慢性发炎性肠病、溃疡性结肠炎、僵直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、斑块状牛皮癣、或克罗恩氏病。
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