JP2021518387A - ペリオスチン抗体およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明者らは、ヒトペリオスチンタンパク質上のがん特異的グリカン（炭水化物）改変を認識する抗原結合試薬および抗原結合コンジュゲートを開発した。Ｍｇａｔ３遺伝子が増幅しているがんを特異的に処置するための、これらの組成物を使用する様々なｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの診断および／または治療方法も本明細書に開示される。

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／６４４，６８１号および２０１８年９月６日に出願された米国仮特許出願第６２／７２７，９１５号（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
連邦政府に支援された研究に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（「ＮＩＨ」）の認可番号ＵＯ１ＣＡ１６８８７０−０１によって認められた米国政府の支援と共に為されたものである。米国は、本発明におけるある特定の権利を有する。

配列表
本出願には配列表が添付される。配列は、本明細書においては配列番号によって列挙され、対応する配列は、参照により本明細書に組み込まれる、本明細書と共に提出される配列表に見出される。

序論
がんの抗体に基づく療法および診断は、がん患者を処置および診断するための重要な戦略になってきている。正常細胞と比較して、がん細胞によって選択的に発現される細胞表面抗原は、標的がん療法および診断ツールを開発する魅力的な手段を提供する。しかしながら、この分野における重要な課題は、がん細胞を選択的に標的とするために使用することができる抗原を同定することであった。ペプチド抗原は、がん細胞特異的抗体を開発するために一般的に使用されるが、そのような抗原の適用可能性は、ある特定の状況では、例えば、ペプチド抗原の発現が正常細胞とがん細胞において類似している場合、限定的であり得る。
タンパク質におけるがん特異的グリコシル化変化は、がん細胞と、正常細胞とを区別することができ、診断適用と治療適用の両方の開発において有用であり得る別の魅力的な抗原群である。しかしながら、がん細胞上で選択的に発現される炭水化物部分を特異的に標的とする抗体はわずかしか開発されていない。かくして、がん細胞と、正常細胞とのグリコシル化の差異を特異的に標的とする新しい抗体が当業界において依然として必要である。

本発明の一態様では、抗原結合試薬が提供される。抗原結合試薬は、ヒトペリオスチン糖タンパク質、好ましくは、ヒトペリオスチン糖タンパク質のグリカンエピトープに特異的に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合試薬は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ Ｈ１、ＧＦＩＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１）、ＣＤＲ Ｈ２、ＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴ（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３、ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号３）、ＣＤＲ Ｌ３、ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号４）または配列番号５を含む重鎖可変領域および配列番号６を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
別の態様では、抗原結合コンジュゲートが提供される。抗原結合コンジュゲートは、薬剤に連結された本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれか１つを含んでもよい。
さらなる態様では、細胞が提供される。細胞は、本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれかまたは抗原結合コンジュゲートのいずれかを含んでもよい。
別の態様では、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、または細胞のいずれかと、薬学的担体、賦形剤、または希釈剤とを含んでもよい。
別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞をイメージングするための方法に関する。この方法は、対象に、本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、または医薬組成物のいずれかを有効量で投与すること、およびイメージングモダリティを使用して対象の少なくとも一部の画像を生成することを含んでもよい。好ましくは、これらの方法の実施形態では、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、または医薬組成物に結合した細胞のイメージングは、細胞ががん細胞であることを示す。

さらなる態様では、本発明は、対象の試料中のがん細胞を検出する方法に関する。この方法は、対象から試料を取得すること、試料と、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれかまたは抗原結合コンジュゲートのいずれかとを接触させること、および試料中の細胞に対する抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合を検出することを含んでもよい。好適には、細胞に対する抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合は、細胞ががん細胞であることを示す。

さらなる態様では、本発明は、対象におけるがん細胞を処置する方法に関する。この方法は、対象に、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、細胞のいずれか、または医薬組成物のいずれかを有効量で投与して、対象におけるがんを処置することを含んでもよい。

図１Ａ〜１Ｃは、ペリオスチンドメイン構造および複雑なＮ結合グリコシル化の位置を示す。図１Ａは、最後のＦＡＳ１ドメインに印を付けたグリコシル化部位を有するヒトペリオスチンタンパク質のドメインマップを示す。 図１Ｂは、アスパラギン５９９が位置する非構造ループを示すＦＡＳ４ドメインのＮＭＲ構造（ＰＤＢ ５ＷＴ７）を示す³⁵。Ｎ５９９溶媒に曝露されたヒトペリオスチンのＦＡＳ１〜ＦＡＳ４ドメインの結晶構造（ＰＤＢ ５ＹＪＧ）³⁴。 図１Ｃは、抗Ｆｌａｇ樹脂上で培養上清から精製されたペリオスチンタンパク質のウェスタンブロット分析である。上の切り取られた画像は、レクチンＥ−ＰＨＡ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して検出され、下の切り取られた画像は、ペリオスチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた同じブロットの検出である。それぞれの細胞株に関する以前に検出されたグリカン構造の例を、各レーンの上に示す^3、39。 図２は、選択、精製、および検証手法の流れ図を示す。まず、卵巣がん酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリーを、非悪性Ｐｒｏ５−ＰＮおよびＬｅｃ４−ＰＮ細胞でそれぞれ６回サブトラクションにかけた。非バインダーを増殖させ、ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ細胞に添加して、複数回選択した。バインダーのクローン集団を、酵母細胞ＥＬＩＳＡを使用して評価し、二分岐グリカンに対する結合特異性を有する酵母を、分泌型ｓｃＦｖにした。クローン９を、示されたタグ付きのビオボディ（ｂｉｏｂｏｄｙ）として知られるビオチン標識された抗体に変換し、細胞株および異種移植腫瘍モデルを使用して評価した。 図３は、代表的な酵母細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。候補クローン酵母集団の示差的結合を、２４ウェルプレート上、９０％集密度で播種したＰｒｏ５−ＰＮ（青色）、Ｌｅｃ４−ＰＮ（赤色）、およびＯＶＣＡＲ３−ＰＮ（緑色）細胞上で測定した。結合した酵母（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒで標識された）を、洗浄の前後に測定した。示された代表的なデータは、示されたクローンに関する、それぞれの細胞株についてのそれぞれの洗浄後に結合した酵母のパーセンテージを反映する。 図４Ａ〜図４Ｅは、ｓｃＦｖＣ９ビオボディに関する特異性、細胞局在化および抗体依存性細胞傷害性を示す。図４Ａは、ストレプトアビジンＡＰＣ（赤色の線）またはストレプトアビジンＡＰＣのみ（青色の線）と予め混合したｓｃＦｖＣ９ビオボディで染色されたＯＶＣＡＲ３−ＰＮ対照ｓｈＲＮＡおよびＯＶＣＡＲ３−ＰＮ ＧｎＴ−ＩＩＩ ｓｈＲＮＡ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 図４Ｂは、ｓｃＦｖＣ９ビオボディ結合およびＯＶＣＡ２６細胞への内在化の代表的な画像を示す。バーは１０μｍである。 図４Ｃは、細胞力価グロー発光生存アッセイを使用する細胞の細胞傷害性の機能分析を示す。ｓｃＦｖＣ９ビオボディを、抗ｍｙｃ ｍＡｂと予め混合し、３７℃で４８時間にわたって連続希釈液を細胞に添加した。示される結果は、３回の独立実験の代表である。 図４Ｄおよび図４Ｅは、ヒトグリア芽腫細胞中でのｓｃＦｖＣ９細胞の結合および特異性を示す。図４Ｄは、Ｃ２として知られる単一細胞単離ＬＮ１８クローン中でのＭｇａｔ３遺伝子のＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ ＫＯが、二分岐Ｎ−グリカンの喪失を示すＥ−ＰＨＡ結合の非存在によって確認されることを示す。対照Ａ１として知られる非標的単一細胞単離クローンは、Ｅ−ＰＨＡレクチンの結合によって確認されるＭｇａｔ３発現を有する。バーは２０μｍである。 図４Ｅは、ｓｃＦｖ Ｃ９ビオボディが、ＬＮ１８対照Ａ１クローンに結合し、ＬＮ１８ Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ Ｍｇａｔ３ ＫＯクローンＣ２に結合しないことを示す。 図５は、卵巣腫瘍のＩＶＩＳイメージングを示す。上パネル：Ａ１８４７ヒト卵巣がん細胞に由来する６ｗｋの皮下異種移植腫瘍を有する免疫不全のＮＳＧ雌マウスを、ｓｃＦｖＣ９／ＩＲＢ６８０Ｗ複合体または陰性対照（ＩＲＢ６８０Ｗのみ）の眼窩後方注射の前後にイメージングした。中央パネル：８ｗｋの卵巣内Ｌｕｃ−ＩＤ８マウス卵巣がん細胞を有する免疫能力があるＣ５７Ｂｌ／６雌マウスを、ｓｃＦｖＣ９／ＩＲＢ６８０Ｗ複合体または陰性対照（ＩＲＢ６８０Ｗのみ）の注射の前後にイメージングした。下パネル：８ｗｋの腹腔内Ｌｕｃ−ＩＤ８マウス卵巣がん細胞を有する免疫能力があるＣ５７Ｂｌ／６雌マウスを、ｓｃＦｖＣ９／ＩＲＢ６８０Ｗ複合体またはＩＲＢ６８０Ｗのみの注射の前後にイメージングした。 図６は、２４時間の時点での腫瘍および組織におけるｓｃＦｖＣ９ビオボディの検出を示す。皮下Ａ１８４７異種移植腫瘍を有する免疫不全の雌ＮＳＧマウスに、剖検および組織採取の２４時間前にｓｃＦｖＣ９ビオボディをＩＶにより注射した。ＤＡＰＩを用いる対抗染色の前に、切片をストレプトアビジンＱｄｏｔ（１ＸＰＢＳ中で１：５０）で染色した。白色の矢印は、本文中で考察される目的の領域に印を付けるものである。バーは１００μｍである。 図７Ａおよび図７Ｂは、ｓｃＦｖＣ９ビオボディを用いたＭＲ試験を示す。図７Ａは、細胞のみ、抗ｆｌａｇ磁気ビーズのみ、またはｓｃＦｖＣ９ビオボディおよび抗ｆｌａｇ磁気ビーズを含む細胞を重ねたファントムチューブをＭＲイメージングしたものを示す。示される代表画像およびグラフ中の結果は、右に向かって、３回の独立実験に由来する平均減少シグナル強度を表す。±ＳＥＭ Ｐ＜０．０００１。 図７Ｂは、Ａ１８４７皮下腫瘍を有する免疫不全のＮＳＧ雌マウスに、１：２で磁気アビジンビーズと結合したｓｃＦｖＣ９を注射したことを示す。代表的な１時間の画像を示し、各時点での累積正規化（所与のＲＯＩに関するＳＩ腫瘍／ＳＩ筋肉）シグナル強度を、右に向かってグラフ化する。 図８は、腹腔内注射の８週後のマウスメソテリン^IntＬｕｃ−ＩＤ８マウス卵巣がんモデルおよびルシフェリンを用いたｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングを示す。 図９は、Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウス（ＩＰ注射後８週）におけるマウスメソテリン^IntＬｕｃ−ＩＤ８卵巣がんおよび標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ−グリコシル化ペリオスチン（Ｃ９）を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングを示す。陰性対照（ＳＡのみ）：標識されたストレプトアビジンのみを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス。 図１０は、ＮＳＧ雌マウス（ＩＶ注射後４週）におけるヒトメソテリン^hiＥＫＶＸ肺がんおよび標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ−グリコシル化ペリオスチン（Ｃ９）を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングを示す。陰性対照（ＳＡ）：標識されたストレプトアビジンのみを注射した腫瘍担持ＮＳＧマウス。 図１１は、ＮＳＧ雌マウス（ＩＶ注射後４週）におけるヒトメソテリン^intＨ４６０肺がんおよび標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ−グリコシル化ペリオスチン（Ｃ９）を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングを示す。陰性対照（ＳＡ）：標識されたストレプトアビジンのみを注射した腫瘍担持ＮＳＧマウス。 図１２は、ＮＳＧ雌マウス（ＩＶ注射後４週）におけるヒトメソテリン^loＡ５４９肺がんおよび標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ−グリコシル化ペリオスチン（Ｃ９）を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングを示す。陰性対照（ＳＡのみ）：標識されたストレプトアビジンのみを注射した腫瘍担持ＮＳＧマウス。

ここで、本発明者らは、ヒトペリオスチンタンパク質上のがん特異的グリカン（炭水化物）改変を認識する抗原結合試薬を開発した。以前の研究において、本発明者らは、卵巣がん細胞などのがん細胞中で特異的に発現されるヒトペリオスチンタンパク質上の通常ではない二分岐Ｎ結合グリカン構造を発見した。Abbott et al., Proteomics 10(3): 470-481 (2010)を参照されたい。Ｎ結合グリカン構造は、ガラクトースキャッピングおよびシアル酸伸長の欠如のため通常のものではなく、例えば、Allam, Heba et al. “Glycomic Analysis of Membrane Glycoproteins with Bisecting Glycosylation from Ovarian Cancer Tissues Reveals Novel Structures and Functions.” Journal of Proteome Research 14.1 (2015): 434-446. PMCに記載されている。

腫瘍細胞は、典型的には、診断のためのバイオマーカーならびに免疫療法のための候補として役立ち得る、表面糖タンパク質および糖脂質上でのグリコシル化の腫瘍特異的変化を示す^1-4。グリコシル化のそのような変化は、その表面発現および腫瘍細胞からの潜在的な分泌をもたらす、ユニークなグリコシルトランスフェラーゼおよび糖タンパク質の発現レベルの変更に起因する。しかしながら、この研究領域は、グリコシル化の腫瘍細胞特異的変化を標的とするのに有用なほんのわずかな特異的抗炭水化物抗体を有することによって妨げられている。

そのような特異的抗炭水化物抗体を開発するための１つの手法は、酵母ディスプレイである。これらの技術は、認識試薬の親和性および特異性を改善することができる^5-7。この方法では、組換え抗体が、細胞壁構成要素（Ａｇａ−２）との融合タンパク質として酵母表面上に提示され、ライブラリー生成は、酵母において固有の相同組換えシステムによって容易になる^8、9。フローサイトメトリーと、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）として発現される組換え抗体の細胞表面ディスプレイとのカップリングは、酵母表面でのｓｃＦｖ発現と、抗原へのｓｃＦｖ結合との両方のモニタリングを可能にする¹⁰。酵母ディスプレイはまた、様々な指向性進化適用についても非常に有効であることが証明されている^11-15。これらの方法は、メソテリン¹⁶、ＴＥＭ１¹⁷、マンノース受容体¹⁸、グリピカン¹⁹、およびＢ７−Ｈ４²⁰に対するｓｃＦｖを含む、いくつかの医学的に関連するタンパク質を指向する多くの機能的ｓｃＦｖの同定を可能にしてきた、ｓｃＦｖの時間および費用効果的な生産およびスクリーニングにつながる。

本発明者らは、卵巣がんにおいて発見された腫瘍特異的二分岐グリカン構造を認識するｓｃＦｖを単離するための酵母ディスプレイ法の強力な利点を利用した³。これらのグリカンは、Ｎ−グリカンのコアβマンノースへのβ１−４結合ＧｌｃＮＡｃの付加によって二分岐複合体型Ｎ−グリカンを作出するＭｇａｔ３遺伝子によってコードされる、ユニークなグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴ−ＩＩＩによって一部生成される²¹。本発明者らは、Ｍｇａｔ３遺伝子が卵巣がんにおいて高度に増幅されることを以前に発見した²²。Ｍｇａｔ３遺伝子は、転写開始部位の近くでのプロモーターの低メチル化変化のため、いくつかのヒトがんにおいて増幅される²³。卵巣がんにおける二分岐Ｎ−グリカンの構造は、非悪性細胞に見出される二分岐Ｎ−グリカンのものとは異なる。予想外にも、卵巣がんに由来する二分岐Ｎ−グリカンは、分枝の減少、ガラクトースおよびシアル酸の欠如、コアフコースのあり、またはなしを示し、このグリカン構造を、卵巣がんおよびおそらく、いくつかの他のヒトがんのためのバイオマーカーにする³。

本発明者らの研究室は、卵巣がんにおいて腫瘍関連二分岐グリカン構造を担持する糖タンパク質を同定するために標的グリコプロテオミック手法を使用した。原発卵巣がん組織からの分泌タンパク質および膜タンパク質の本発明者らの分析により、潜在的なバイオマーカーとして、骨芽細胞特異的因子２（ＯＳＦ−２）としても知られる、ペリオスチンが発見された^3、24。ペリオスチンは、循環中に存在し、また、プロテオミック分析により膜画分中のペリオスチンの存在によって証明される細胞膜と結合する分泌型糖タンパク質である³。細胞表面結合のあり得るメカニズムは、タンパク質ファシクリン中の膜と相互作用することが証明されたＦＡＳ１ドメインの存在に起因する²⁵。ヒトがんにおけるペリオスチンレベルの上昇にも拘わらず、この糖タンパク質は、炎症状態での可変的発現のため、バイオマーカーとして使用されてこなかった^26-28。これは、ペリオスチンタンパク質レベルの検出が疾患負荷と相関しない可能性があるため、がんのためのバイオマーカーとしてのこのタンパク質自体の使用を困難にする。ペリオスチン上のがん特異的二分岐糖型を検出する能力は、診断適用のための優れたバイオマーカーであり、新しい治療手法の開発をもたらすかもしれない。ここで、本発明者らは、酵母により提示されたｓｃＦｖ（ｓｃＦｖＣ９）を同定するための本発明者らのサブトラクション／選択プロセスおよび腫瘍特異的二分岐グリカン構造に対するその特異性の特性評価を記載する。本発明者らはさらに、ｉｎ ｖｉｖｏで卵巣がん異種移植腫瘍を標的とするためのｓｃＦｖＣ９の使用を検証する。同時に、これらの知見は、Ｍｇａｔ３遺伝子の増幅を有するがんのための診断および治療適用におけるこの抗体の使用の可能性を示唆する。

簡単に述べると、本発明者らは、二分岐グリカンを付加する酵素を除去する細胞株ならびにこの酵素を産生する対照細胞株を生産した。本発明者らはまた、Ｎ結合グリコシル化部位を失っているヒトペリオスチンタンパク質の突然変異バージョンも生産した。これらの細胞株を使用して、本発明者らは、卵巣がん患者のＢ細胞に由来するｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリーと共に使用するための選択的パンニング戦略を開発した。ヒトペリオスチンタンパク質のペプチド部分と相互作用するか、または他のグリカン構造と相互作用するｓｃＦｖをサブトラクションにかけるために、本発明者らは最初に、二分岐グリカンを発現しないが、ペリオスチンタンパク質を発現する細胞株を用いてパンニングした。次に、本発明者らは、二分岐グリカンを発現し、ペリオスチンタンパク質を発現する細胞株を用いてパンニングして、Ｎ結合グリコシル化部分に結合するｓｃＦｖを選択した。次いで、これらのバインダーをさらにスクリーニングして、グリカンに特異的に結合するクローンを選択した。Ｃ９として知られる、陽性クローンの１つをさらに特性評価したところ、ヒトペリオスチンタンパク質上のがん特異的Ｎ結合グリカン構造を特異的に標的とし、いくつかのマウスがんモデルにおいて増殖するヒト異種移植卵巣および肺腫瘍を特異的に標的とすることが示された。このデータに基づくと、Ｃ９ ｓｃＦｖが、本明細書に開示される抗原結合試薬のための基礎として役立ち、様々な組成物および方法においてさらに使用することができることが容易に明らかとなる。

抗原結合試薬
本発明の一態様では、抗原結合試薬が提供される。本明細書で使用される場合、用語「抗原結合試薬」は、最も広い意味で使用され、抗体に基づくポリペプチド親和性薬剤を指す。例えば、抗原結合試薬は、限定されるものではないが、一本鎖抗体（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ビオボディ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）など）、モノクローナル抗体、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ断片、ダイアボディ、線状抗体などの抗体断片、または抗体断片から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含んでもよい。抗原結合試薬は、キメラ、ヒト化、または完全ヒトポリペプチド配列であってもよい。抗原結合試薬は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＹ、およびＩｇＭを含む免疫グロブリンの公知の主要なクラス、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）のいずれか１つであってもよい。一部の実施形態では、抗原結合試薬は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＩｇＧモノクローナル抗体であってもよい。

抗原結合試薬は、ヒトペリオスチンタンパク質などの「抗原」と相互作用し、抗原結合試薬に、抗原に特異的に結合する能力を付与するアミノ酸残基を含む。「抗原」は、抗体によって結合され得る分子または分子の一部である。抗原は、１つまたは１つより多いエピトープを有してもよい。「エピトープ」は、抗原結合試薬によって認識され得る、結合され得る任意の分子のその部分を指す。一般に、エピトープは、分子、例えば、抗原結合試薬によって認識される特定の三次元構造を形成するアミノ酸または炭水化物部分の表面基を含む。

抗原結合試薬はさらに、抗原結合アミノ酸残基および／または免疫系（例えば、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、および／または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能）をモジュレートする一部の型の抗体に一般的に見出されるアミノ酸残基の適切なコンフォメーションを維持するのに必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含んでもよい。
抗原結合試薬の抗原結合アミノ酸残基は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」領域として一般に公知である。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定構造に対する抗原結合試薬の基本的特異性を担う。ＣＤＲは、抗体の可変領域内のアミノ酸の非連続的ストレッチである。一部の抗体の可変重鎖および軽鎖はそれぞれ、それぞれの軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）について他方とそれぞれ非連続的である３つのＣＤＲ領域（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）を有する。驚くべきことに、本発明者らは、実施例に開示されるＣ９ビオボディが、３つの重鎖ＣＤＲ領域（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびただ１つの軽鎖ＣＤＲ領域（Ｌ３）を含有することを見出した。

抗原結合試薬は、ヒトペリオスチン糖タンパク質に特異的に結合することができる。ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ、ＰＮ、または骨芽細胞特異的因子ＯＳＦ−２としても知られる）は、アルファ−Ｖ／ベータ−３およびアルファ−Ｖ／ベータ−５インテグリンのためのリガンドとして機能して、細胞運動を制御するヒト糖タンパク質である。ペリオスチンはグリコシル化されることも知られており、以前の研究において、本発明者らは、卵巣がん細胞などのがん細胞中で特異的に発現されるヒトペリオスチンタンパク質上の通常ではない二分岐Ｎ結合グリカン構造を発見した。Abbott et al., Proteomics 10(3): 470-481 (2010)を参照されたい。Ｎ末端配列ペプチドを含むヒトペリオスチンの例示的なタンパク質配列は、配列番号９として提供される。
必要に応じて、抗原結合試薬は、少なくとも１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍ、１０^-8Ｍ、１０^-9Ｍ、１０^-10Ｍ、または１０^-11Ｍの親和性でヒトペリオスチン糖タンパク質に特異的に結合してもよい。抗原結合試薬の親和性を決定するための方法は、当業者には公知である。例えば、Antibodies: A Lab. Manual (Harlow et al., eds., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)を参照されたい。
抗原結合試薬は、ヒトペリオスチン糖タンパク質のグリカンエピトープに特異的に結合することができる。グリカンエピトープは、がん細胞上に存在するペリオスチン糖タンパク質上に特異的に存在してもよい。一部の実施形態では、グリカンエピトープは、Ｎ結合グリカン構造を含む。

本発明によれば、がん細胞は、限定されるものではないが、上皮がん細胞、卵巣がん細胞、肺がん細胞、乳がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、食道がん細胞、結腸がん細胞、皮膚がん細胞、精巣がん細胞、結腸直腸がん細胞、尿路上皮がん細胞、腎がん細胞、肝細胞がん細胞、白血病がん細胞、リンパ腫がん細胞、多発性骨髄腫がん細胞、および中枢神経系がん細胞を含んでもよい。

抗原結合試薬は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ Ｈ１、ＧＦＩＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１）、ＣＤＲ Ｈ２、ＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴ（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３、ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号３）、ＣＤＲ Ｌ３、ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号４）を含んでもよい。一部の実施形態では、抗原結合試薬は、配列番号５を含む重鎖可変領域と、配列番号６を含む軽鎖可変領域とを含んでもよい。一部の実施形態では、抗原結合試薬は、配列番号７（Ｃ９ ｓｃＦｖタンパク質配列）を含んでもよい。

抗原結合コンジュゲート
本発明の別の態様では、抗原結合コンジュゲートが提供される。抗原結合コンジュゲートは、薬剤に連結された本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれか１つを含んでもよい。「薬剤」は、抗原結合試薬に対してさらなる機能を提供する任意の物質であってもよい。好適な薬剤としては、限定されるものではないが、検出可能なイメージング剤、治療剤、免疫タンパク質ドメイン、またはその組合せが挙げられる。
「検出可能なイメージング剤」は、イメージング技術を使用してシグナルまたはコントラストとして検出することができる任意の好適な化学物質または物質であってもよい。好適な検出可能なイメージング剤は、限定されるものではないが、フルオロフォア部分、酵素部分、光学部分、磁気部分、放射標識部分、Ｘ線部分、超音波イメージング部分、ナノ粒子ベースの部分、または列挙された部分の２つ以上の組合せであってもよい。

「フルオロフォア部分」は、蛍光シグナルを生成することができる任意の分子を含んでもよい。様々なフルオロフォア部分が、当業界で周知である、および／または商業的に入手可能である。例示的なフルオロフォア部分としては、限定されるものではないが、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＤｙＬｉｇｈｔ ３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ ８００ＲＳ、およびＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）；ＶｉｖｏＴａｇ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０、およびＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）が挙げられる。

「酵素部分」とは、検出可能シグナルの産生を触媒するポリペプチドを指す。例示的な酵素部分は、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼを含んでもよい。
「光学部分」は、例えば、発光または音弾光学部分などの、光学イメージングを使用してコントラストまたはシグナルを産生するために使用することができる任意の薬剤を含んでもよい。
「磁気部分」は、例えば、磁気共鳴剤のためのキレート剤を含んでもよい。磁気共鳴剤のためのキレート剤は、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、およびＭｎ（ＩＩ）などの、常磁性金属イオンと安定な複合体を形成するように選択することができる。
他の例示的な検出可能なイメージング剤は、放射標識部分を含んでもよい。例示的な放射活性標識は、限定されるものではないが、⁹⁹Ｍｏ、⁹⁹ｍＴｃ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁷⁷Ｌｕ、⁶⁷Ｃｕ、¹²³Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、ⁿＣ、^X３Ｎ、¹⁵Ｏ、および¹⁸Ｆを含んでもよい。
「Ｘ線部分」は、例えば、ヨウ素化有機分子または重金属イオンのキレートなどのＸ線イメージングを使用してコントラストまたはシグナルを産生するために使用することができる任意の薬剤を含んでもよい。
超音波イメージング部分は、例えば、Ｌｅｖｏｖｉｓｔ、Ａｌｂｕｎｅｘ、またはＥｃｈｏｖｉｓｔなどの超音波イメージングを使用してコントラストまたはシグナルを産生するために使用することができる任意の薬剤を含んでもよい。

検出可能なイメージング剤はまた、ナノ粒子に基づく部分であってもよい。ナノ粒子に基づく部分は、シグナルを生成することができるナノ粒子である。例えば、シリコン含有ナノ粒子を使用して、蛍光、発光、または別の型のシグナルを産生することができる。他の例示的なナノ粒子に基づく部分としては、限定されるものではないが、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＳＩＧＨＴ ６５０、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＳＩＧＨＴ ６９１、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＳＩＧＨＴ ７５１（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのナノスフェア；金属酸化物ナノ粒子；およびＥｖｉＴａｇ（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＱｄｏｔプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの量子ドットが挙げられる。ナノ粒子を使用して、抗原結合試薬を、毒素または他の細胞傷害剤または細胞傷害化合物に連結またはコンジュゲートすることもできる。

「治療剤」は、抗原結合試薬にコンジュゲートされた場合、治療機能を提供する任意の物質であってもよい。例えば、本明細書に開示される抗原結合試薬を含む抗体−薬物コンジュゲートが企図される。好適な治療剤は、限定されるものではないが、細胞傷害化合物、特に、他の抗体−薬物コンジュゲートにおいて有効であることが示されたものを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「細胞傷害化合物」とは、細胞の機能を破壊する、および／または細胞死を引き起こす任意の物質を指す。様々な治療的細胞傷害化合物が当業界で公知であり、限定されるものではないが、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗剤、天然の生成物およびそのアナログを含んでもよい。細胞傷害化合物の例示的なクラスとしては、ジヒドロ葉酸リダクターゼ阻害剤、およびチミジル酸シンターゼ阻害剤などの酵素阻害剤、チューブリン阻害剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、オーリスタチン、メイタンシノイド、分化誘導剤、ならびにタキソールが挙げられる。

より具体的には、好適な細胞傷害化合物は、５−フルオロウラシル、アクラシノマイシン、活性化シトキサン、ビサントレン、ブレオマイシン、カルモフール、ＣＣＮＵ、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、メルファラン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、ペプロマイシンピポブロマン、プリカマイシン、プロカルバジン、レチノイン酸、タモキシフェン、タキソール、テガフール、ＶＰ１６、ＶＭ２５、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド（ＤＭ１を含む）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）およびメイタンシノイド（ＤＭ４）ならびにそれらのアナログを含んでもよい。
例示的な細胞傷害化合物はまた、限定されるものではないが、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁵³Ｓｍ、⁶⁷Ｃｕ、¹⁰⁵Ｒｈ、^mＡｇ、および¹⁹²Ｉｒを含む治療的放射性医薬品を含んでもよい。

一実施形態では、抗原結合試薬を使用して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を開始させ、かくして、これを使用してがん細胞を殺傷することができる。実施例におけるＡＤＣＣデータは、ｓｃＦｖＣ９が完全長ＩｇＧ（実施例において使用される抗ｃｍｙｃなど）に連結された場合、それが有効なＡＤＣＣ応答を開始させることができることを証明する。本明細書に記載されるＶ５タグ抗体は、同様に機能し得る。

抗体−薬物コンジュゲートの調製は、当業界で一般に公知であり、例えば、Doronina et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124に記載されたものと同様の従来の方法によって実行することができる。例えば、米国特許第８，０６７，５４６号、第８，０３９，２７３号、第７，９８９，４３４号、第７，８５１，４３７号、第７，８３７，９８０号、第７，８２９，５３１号、第７，７０５，０４５ ８，０３４，９５９号、第８，０３４，７８７号、第７，９６８，５８６号、第７，８４７，１０５号、および第７，２２３，８３７号も参照されたい。

「免疫ポリペプチド」は、免疫機能を容易にする任意のポリペプチドであってもよい。例えば、本明細書で開示される抗原結合試薬を、さらなる免疫ポリペプチドと組み合わせて、ペリオスチンに特異的な新しいキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生産することができる。ＣＡＲは、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれかなどのターゲティング部分と、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達／活性化ドメインなどの追加の「免疫ポリペプチド」とを含んでもよい。免疫ポリペプチドとして好適な細胞内シグナル伝達／活性化ドメインとしては、限定されるものではないが、ＣＤ３シグナル伝達ドメイン、４１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、またはその組合せが挙げられる。免疫ポリペプチドはまた、樹状細胞ベースワクチンの開発において重要な免疫グロブリンドメインであってもよい。

抗原結合試薬と、薬剤とを、共有結合によって直接連結するか、またはリンカーもしくはスペーサー部分を使用して連結することができる。有用なリンカーまたはスペーサー部分としては、ペプチド、アミノ酸、核酸、ならびにホモ官能性リンカーまたはヘテロ官能性リンカーが挙げられる。抗原結合試薬と、薬剤との共有結合の形成を容易にすることができる特に有用なコンジュゲーション試薬は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよび／またはマレイミドを含んでもよい。一部の実施形態では、抗原結合試薬と、薬剤とを、抗原結合試薬のＮ末端で連結する。一部の実施形態では、抗原結合試薬と、薬剤とを、抗原結合試薬のＣ末端で連結する。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８以上のアミノ酸長である。
抗体−薬物コンジュゲートを包含する実施形態では、リンカーは、細胞内または細胞外条件下で切断可能であってよく、リンカーの切断は、適切な環境で抗原結合試薬から治療剤を放出する。例えば、リンカーは、限定されるものではないが、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む細胞外または細胞内プロテアーゼによって切断可能であってもよい。細胞内プロテアーゼによって切断可能な好適なリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーを含んでもよい。例えば、米国特許第６，２１４，３４５号を参照されたい。

一部の実施形態では、治療剤は、例えば、リソソーム中での、抗原結合試薬および／またはリンカーの分解後に放出されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照されたい。
リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ）中に存在する切断剤によって切断可能であってもよい。
一部の実施形態では、リンカーは、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンによって切断可能であってよく、これらは全て標的細胞内部での活性薬物の放出をもたらすジペプチド薬物誘導体を加水分解することが知られている。
リンカーは、ｐＨ感受性、例えば、ある特定のｐＨ値での加水分解に感受性であってよい。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニックアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール、チオエーテルなど）を使用することができる。例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；第５，８２４，８０５号；第５，６２２，９２９号を参照されたい。そのようなリンカーは、血液中のように、中性のｐＨ条件下では比較的安定であるが、リソソームの近似ｐＨであるｐＨ５．５より下では不安定である。

一部の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能であってよい（例えば、ジスルフィドリンカー）。例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチルチオアセテート）およびＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）を使用して形成させることができるものなどの、様々なジスルフィドリンカーが当業界で公知である。
一部の実施形態では、リンカーは、自壊性である。例えば、ＷＯ２００７０５９４０４、Ｗ００６１１０４７６、Ｗ００５１１２９１９、ＷＯ２０１０／０６２１７１、ＷＯ０９／０１７３９４、ＷＯ０７／０８９１４９、ＷＯ０７／０１８４３１、ＷＯ０４／０４３４９３およびＷＯ０２／０８３１８０を参照されたい。
本発明と共に使用することができる様々な例示的リンカーは、ＷＯ２００４０１０９５７、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号、および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号に記載されている。

一部の実施形態では、抗原結合試薬と、薬剤とを、タグシステムによって連結する。タグシステムは、互いに高い親和性で結合することができる薬剤の任意の群を含む。いくつかのタグシステムが当業界で周知であり、限定されるものではないが、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムが挙げられる。一部の実施形態では、タグシステムは、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンを含む。そのような実施形態では、抗原結合試薬を、ビオチンを含むようにＮ末端またはＣ末端のいずれかで改変することができるが、薬剤を、ストレプトアビジンまたはアビジンを含むように改変することができる。あるいは、抗原結合試薬を、ストレプトアビジンまたはアビジンを含むようにＮ末端またはＣ末端のいずれかで改変することができるが、薬剤を、ビオチンを含むように改変することができる。

細胞
本発明のさらなる態様では、細胞が提供される。細胞は、本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれか１つまたは抗原結合コンジュゲートのいずれか１つを含んでもよい。細胞は、限定されるものではないが、ヒト細胞などの、哺乳動物細胞であってもよい。
一部の実施形態では、細胞は、限定されるものではないが、卵巣がん細胞または肺がん細胞などのがん性細胞であってもよい。
一部の実施形態では、細胞は、限定されるものではないが、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞であってもよい。例えば、免疫細胞は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの操作された免疫細胞であってもよい。

医薬組成物
本発明のさらなる態様では、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、または細胞のいずれかと、用いられる用量および濃度でそれに曝露される細胞または対象にとって非毒性的である、薬学的担体、賦形剤、または希釈剤とを含んでもよい。薬学的希釈剤は、水性のｐＨ緩衝化溶液中にあることが多い。薬学的担体の例としては、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対抗イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）ブランドの界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）界面活性剤などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

方法
本明細書に開示される組成物を使用する様々なｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの診断および／または治療方法が企図される。
さらなる態様では、本発明は、対象におけるがん細胞をイメージングするための方法に関する。この方法は、対象に、本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、または医薬組成物のいずれかを有効量で投与すること、およびイメージングモダリティを使用して対象の少なくとも一部の画像を生成することを含んでもよい。好ましくは、これらの方法の実施形態では、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、または医薬組成物に結合した細胞のイメージングは、細胞ががん細胞であることを示す。

本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、ヒトと非ヒト動物との両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両性類、爬虫類などの、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物を含む。好適には、対象は、ヒト患者である。
本明細書で使用される場合、「イメージングモダリティ」は、対象の画像を生成することができる任意の技術を含んでもよい。一部の実施形態では、イメージングモダリティを、超音波、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、核磁気共鳴イメージング（ＮＭＲＩ）、光学イメージング（ＯＩ）およびコンピューター断層撮影（ＣＴ）からなる群から選択することができる。例えば、本発明の方法の一部の実施形態では、本発明者らは、本明細書に開示される一部の組成物を超音波技術と共に使用して、対象における骨盤内腫瘤をイメージングし、そのような腫瘤が良性であるか、またはがん性であるかどうかを決定できることを企図する。骨盤内腫瘤の除去後の対象の予後は、外科手術を実施する外科医の型と直接関連するため、そのような診断イメージング法は、骨盤内腫瘤の除去前に有用であろう。イメージング法が、骨盤内腫瘤ががん性であることを示す場合、対象はがん性組織を除去するのを専門とする外科医に方向付けられてもよい。他方で、イメージング法が、骨盤内腫瘤が良性であることを示す場合、対象は、腫瘤を除去することができ、がん性組織の除去には特定の経験を有しなくてもよい一般外科医に方向付けられてもよい。そのような方法の一部の実施形態では、対象に、１つまたは複数の超音波イメージング部分を含む本明細書に開示される抗原結合コンジュゲートを投与した後、例えば、経膣または他の超音波イメージング技術を使用して、対象の骨盤領域の超音波画像を生成することができる。超音波画像が、骨盤内腫瘤における、またはその周囲の超音波イメージング部分からの有意な検出可能シグナルを示す場合、これは、骨盤内腫瘤ががん性であることを示すであろう。

別の態様では、本発明は、対象の試料中のがん細胞を検出する方法に関する。この方法は、対象から試料を取得すること、試料と、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれかまたは抗原結合コンジュゲートのいずれかとを接触させること、および試料中の細胞に対する抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合を検出することを含んでもよい。好適には、細胞に対する抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合は、細胞ががん細胞であることを示す。あるいは、この方法は、対象に、本明細書に提供される抗原結合試薬に連結されたイメージング剤または他の検出可能剤を投与すること、次いで、対象中の細胞に対する抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合を検出することを含んでもよい。抗原結合試薬が、対象中の細胞に結合し、検出可能なシグナルを産生する能力は、がんを有する対象を示す。投与は、当業者には利用可能な任意の手段によって実行することができ、疑われるがんの型に応じて変化するであろう。

「試料」は、細胞を含んでもよい。特に、本明細書に記載の方法を、組織試料または生検を必要とすることなく実施することができる。「試料」は、がん細胞を検出することができる、細胞、組織、または体液の任意の試料採取を含むことが意図される。そのような試料の例としては、限定されるものではないが、血液、血清、尿、滑液、唾液、もしくは他の任意の分泌液またはその誘導体が挙げられる。血液は、全血、血漿（クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘパリン）、血清、または血液の任意の誘導体を含んでもよい。試料を、当業者には利用可能な様々な技術によって対象から取得することができる。様々な試料を収集するための方法が、当業界で周知である。一部の実施形態では、試料は、血清または血漿である。
本明細書で使用される場合、「接触」は、限定されるものではないが、組成物の試料への単純な添加を含む、組成物を、当業者には明らかであろう試料に適用するために使用される様々な手順のうちのいずれかによって実行することができる。
試料中での細胞に対する抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合を「検出する」のに好適な方法は、当業者には公知であり、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ＦＡＣＳ分析、ウェスタンブロット、磁気イムノアッセイ、および抗体に基づくマイクロアレイを含んでもよい。過去では、血液中の細胞の検出のための判断基準は、ＥＬＩＳＡの使用であった；しかしながら、液体生検技術は、細胞分析のための魅力的な代替手法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、対象におけるがん細胞を処置する方法に関する。この方法は、対象に、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、細胞のいずれか、または医薬組成物のいずれかを有効量で投与して、対象におけるがんを処置することを含んでもよい。がんおよびがん細胞は、Ｍｇａｔ３遺伝子の発現が増加したがんおよびがん細胞を含む。これらのがんとしては、限定されるものではないが、卵巣がん、肺がん、グリア芽腫、腎臓明細胞がん、子宮体類内膜がん、直腸腺癌、結腸がん、および腺癌が挙げられる。肺がんでは、肺扁平上皮がんおよび肺腺癌がＭｇａｔ３発現の増加を示すと報告されており、かくして、本明細書に提供される方法のための候補となるであろう。いくつかのがんが同定されており（参考文献２３を参照されたい）、本発明者らは、Ｍｇａｔ３に対するエピジェネティックな低メチル化変化を有するさらなるがんが同定されると期待している。

がん細胞の処置は、限定されるものではないが、対象内のがん細胞の数または腫瘍のサイズを減少させること、がんの、より侵攻性の形態への進行を減少させること、がん細胞の増殖を減少させること、または腫瘍増殖の速度を低下させること、がん細胞を殺傷すること、がん細胞の転移を減少させること、または対象におけるがんの再発の可能性を低下させることを含む。本明細書で使用される場合の対象の処置は、がんに罹患した、またはがんを発症するリスクがある、またはがんの再発に直面している対象に利益をもたらす任意の型の処置を指す。処置は、対象の状態の改善（例えば、１つまたは複数の症状における）、疾患の進行の遅延、症状の開始の遅延、または症状の進行の減速などを含む。
本発明の方法の一部の実施形態では、方法は、対象に有効量の抗がん治療剤を投与することをさらに含んでもよい。

「抗がん治療剤」は、対象におけるがんを処置するために使用される任意の治療剤であってもよい。好適な抗がん治療剤は、限定されるものではないが、放射線、化学療法剤、抗がん生物製剤、または免疫療法剤を含んでもよい。化学療法剤は、がんを処置するために使用することができる化学治療化合物である。好適な化学療法剤は、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、アクラシノマイシン、活性化シトキサン、ビサントレン、ブレオマイシン、カルモフール、ＣＣＮＵ、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、メルファラン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、ペプロマイシンピポブロマン、プリカマイシン、プロカルバジン、レチノイン酸、タモキシフェン、タキソール、テガフール、ＶＰ１６、またはＶＭ２５を含んでもよい。

抗がん生物製剤は、がんを処置するために使用することができる生体分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質、または炭水化物）である。抗がん生物製剤は、限定されるものではないが、ホルモン、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−２β、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＣＴＬＡ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、もしくはその任意の組合せなどのサイトカイン；またはリツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペルツズマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、およびオビヌツズマブなどの抗がん抗体を含んでもよい。

用語「免疫療法剤」とは、対象における免疫応答を誘導および／または増強することによってその対象内のがんを処置するために使用される任意の治療剤を指す。免疫療法剤は、限定されるものではないが、チェックポイント阻害剤、がんワクチン、操作されたＴ細胞などの免疫細胞、抗がんウイルス、または二重特異性抗体を含んでもよい。

チェックポイント阻害剤は、自己寛容を維持し、免疫応答の程度をモジュレートするのを担う免疫細胞中の免疫チェックポイント経路を遮断する、抗体などの治療剤である。腫瘍は、腫瘍抗原に特異的であるＴ細胞に対する免疫耐性の主要なメカニズムとして、ある特定の免疫チェックポイント経路を利用することが多い。免疫チェックポイントの多くは、受容体−リガンド相互作用によって開始され、かくして、リガンドもしくは受容体に対する抗体によって遮断されるか、または可溶性組換え形態のリガンドもしくは受容体によってモジュレートされ得る。そのような免疫チェックポイント遮断剤により、腫瘍特異的Ｔ細胞はそうでなければ免疫抑制性の腫瘍微小環境中での機能に寄与することができる。例示的なチェックポイント阻害剤としては、限定されるものではないが、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても知られる）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られる）、ＰＤ−Ｌ２、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、Ａ２ＡＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡを標的とする抗体または他の治療剤が挙げられる。好適な抗ＰＤ１抗体としては、限定されるものではないが、ランブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ ＢＭＳ−９３６５５８）、ＡＭＰ−２２４（Ｍｅｒｃｋ）、およびピジリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ ＣＴ−０１１）が挙げられる。好適な抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、限定されるものではないが、ＭＤＸ−１１０５（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＭＥＤＩ４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）およびＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、限定されるものではないが、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。

がんワクチンは、身体の免疫系を刺激して、がん細胞を攻撃する。がんワクチンは一般に、腫瘍抗原特異的ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化する免疫原性製剤中に腫瘍抗原を含む。ワクチンは、限定されるものではないが、樹状細胞、単球、ウイルス、リポソームおよびＤＮＡワクチンを含む、様々な製剤中にあってもよい。好適には、樹状細胞は、自己のものであり、腫瘍細胞または腫瘍抗原をトランスフェクトされる。樹状細胞は、Ｔ細胞に抗原を提示する免疫細胞であり、治療用がんワクチンにおけるその適用を促した。樹状細胞に腫瘍抗原をｅｘ ｖｉｖｏでロードした後、防御的および治療的抗腫瘍免疫を誘導することがわかっている細胞ワクチンとして、樹状細胞を投与することができる。例示的ながんワクチンとしては、限定されるものではないが、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）、またはＡＰＣ８０１５）が挙げられる。Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔは、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）と、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）との操作された融合タンパク質をロードした自己樹状細胞（ＤＣ）から開発されたＦＤＡに認可されたがんワクチンである。

免疫療法剤は、がん細胞を攻撃するか、またはがん細胞増殖を低減させるために対象に養子移入される免疫細胞（すなわち、Ｔ細胞またはＢ細胞）を含んでもよい。免疫細胞は、自己のものであるか、または免疫細胞を受容する対象とは異なる対象に由来するものであり、拒絶を低減させるために改変されていてもよい。免疫細胞はまた、対象のがんに対する天然の、または遺伝子操作された反応性を有してもよい。例えば、天然の自己Ｔ細胞は、転移性がんの処置において有効であることが示されている。Rosenberg SA et al., Nat. Rev. Cancer 8 (4): 299-308 (2008)を参照されたい。天然の自己Ｔ細胞を、切除された対象の腫瘍内に見出すことができる。そのようなＴ細胞を、高濃度のＩＬ−２、抗ＣＤ３および同種反応性支持細胞を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで複製するように誘導することができる。次いで、これらのＴ細胞を、例えば、ＩＬ−２の外因性投与と共に対象に導入し戻して、その抗がん活性をさらに強化する。

Ｔ細胞はまた、操作されたＴ細胞を含んでもよい。操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞に、対象のがん細胞を特異的に破壊することを指令するように遺伝子改変されたＴ細胞である。操作されたＴ細胞は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞または「ＣＡＲ Ｔ細胞」を含んでもよい。

免疫療法剤は、腫瘍溶解性ウイルスを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス」とは、がんを処置するために使用することができる任意のウイルスを指す。例示的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、限定されるものではないが、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ、Ｔ−ＶＥＣ、およびＯｎｙｘ−０１５が挙げられる。ＰＶＳ−ＲＩＰＯは、再発多形成グリア芽細胞腫（ＧＢＭ）の処置のためにＦＤＡによって特例承認された遺伝子改変経口ポリオウイルスである。Ｔ−ＶＥＣ（Ｉｍｌｙｇｉｃ）は、手術不能な腫瘍を有する患者におけるメラノーマの処置のためのＦＤＡに認可された腫瘍溶解性ウイルスである。Ｏｎｙｘ−０１５は、腫瘍溶解性アデノウイルスである。

また、本発明による免疫療法剤として、二重特異性抗体を使用することもできる。二重特異性抗体は、腫瘍関連抗原のための結合部位と、Ｔ細胞による特異的腫瘍細胞の溶解を指令することができるＴ細胞表面受容体のための結合部位とを有する抗体である。二重特異性抗体は、例えば、ヒト患者における脳腫瘍を上手く処置するために使用されている。例えば、Nitta et al., Lancet 355:368-371 (1990)を参照されたい。二重特異性抗体を生産するためのいくつかの方法が当業界で公知であり、限定されるものではないが、クアドローマ法（例えば、Milstein and Cuello, Nature, 305:537-540 (1983)を参照されたい）、２つの異なる抗体もしくは抗体断片を化学的に係留するためのヘテロ二官能性架橋リンカーの使用（例えば、Staerz et al., Nature 314:628-631 (1985)；欧州特許出願第０４５３０８２号を参照されたい）、またはＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ法（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；第７，５２１，０５６号；第７，５３４，８６６号；第７，５２７，７８７号および第７，６６６，４００号を参照されたい）が挙げられる。

二重特異性抗体は、それぞれの１つが２つの異なる抗体に由来する、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む三官能性抗体を含んでもよい。２つのＦａｂ領域は、２つの抗原に対するものであるが、Ｆｃ領域は２つの重鎖から構成され、典型的には、エフェクター機能を惹起することができる第３の結合部位を形成する。二重特異性抗体は、化学的に連結されたＦａｂ領域、様々な型の二価および三価一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または２つの抗体の可変ドメインを模倣する融合タンパク質を含んでもよい。好適な二重特異性抗体としては、限定されるものではないが、Ｒｅｍｏｖａｂ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ−１１０（Ａｍｇｅｎ）、ＡＢＴ−１２２（Ａｂｂｖｉｅ）、ＡＢＴ−９８１（Ａｂｂｖｉｅ）、ＡＦＭ１３（Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＭＭ−１１１（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＳＡＲ１５６５９７（Ｓａｎｏｆｉ）、ＲＧ７２２１（Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ６０１３（Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７５９７（Ｒｏｃｈｅ）、ＡＬＸ−０７６１（Ａｂｌｙｎｘ）、ＭＣＬＡ−１２８（Ｍｅｒｕｓ）、ＭＥＤＩ−５６５（ＡＭＧ−２１１）、ＭＧＤ００６（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、およびＲＥＧＮ１９７９（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」は、状況（ｓｔａｔｅ）、障害または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を処置するために対象に投与された場合、処置（上で定義された）を行うのに十分なものである、組成物（例えば、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、細胞、医薬組成物または抗がん治療剤）の量を意味する。治療有効量は、化合物、製剤または組成物、疾患およびその重症度ならびに処置される対象の年齢、体重、健康状態および応答性に応じて変化するであろう。

本発明の方法によれば、本明細書に記載の組成物（例えば、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、細胞、または抗がん治療剤）および医薬組成物を、限定されるものではないが、静脈内、腫瘍内、病変内、皮内、局所、腹腔内、筋肉内、非経口、皮下および局所投与を含む、当業者には公知の任意の手段によって「投与」することができる。かくして、組成物を、注射可能製剤、局所製剤または摂取可能製剤、座薬製剤として製剤化することができる。本発明に従う、組成物および医薬組成物の対象への投与は、用量依存的様式で有益な効果（例えば、治療的または診断的に）を示してもよい。かくして、広い制限内で、より大量の組成物の投与は、より少ない量の投与よりも増加した有益な生物学的効果を達成すると予想される。さらに、毒性が見られるレベルよりも低い用量での効能も企図される。

任意の所与の事例において投与される組成物（例えば、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、細胞、医薬組成物または抗がん治療剤）の特定の用量は、当業者には周知のように、投与される組成物または複数の組成物、投与部位に有効に送達することができる組成物の容量、処置または阻害される疾患、対象の状態、および組成物の活性または対象の応答を改変し得る他の関連する医学的因子に従って調整されるであろう。例えば、特定の対象のための組成物（例えば、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、細胞、医薬組成物または抗がん治療剤）の特定の用量は、年齢、体重、一般的健康状況、食事、投与のタイミングおよび様式、排出の速度、組み合わせて使用される薬剤ならびに療法が適用される特定の障害の重症度に依存する。所与の患者のための用量を、従来の考慮を使用して、例えば、本明細書に記載の組成物と、既知の薬剤との活性の差異の慣用的な比較により、例えば、適切な従来の薬理学的プロトコールなどを用いて決定することができる。組成物を、単回用量スケジュール、または複数用量スケジュールで与えることができる。
対象のための（例えば、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、細胞、医薬組成物または抗がん治療剤）の最大用量は、望ましくない、または許容できない副作用を引き起こさない最も高い用量である。個々の処置レジメンに関する変数の数は大きく、かなりの用量範囲が予想される。投与の経路も、用量の要件に影響するであろう。組成物の用量は、例えば、処置しない場合と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上、腫瘍サイズを減少させるか、または腫瘍の増殖速度を低下させることによって、がんを処置するであろうと予測される。

本明細書における（例えば、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、細胞、医薬組成物または抗がん治療剤）の有効な投薬量は、投与される総量を指す、すなわち、１つより多い組成物が投与される場合、組成物の有効な投薬量は、投与される総量に一致する。組成物を、単回用量として、または分割用量として投与することができる。例えば、組成物を、４時間、６時間、８時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、１週、２週、または３週以上空けて２回以上投与してもよい。

本明細書に記載の組成物（例えば、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、細胞、医薬組成物または抗がん治療剤）を、がんを効率的に処置するために、対象に１回または１回より多く投与してもよい。組成物のための好適な用量範囲は、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、好ましくは、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で、数百マイクログラムの桁の阻害剤および／または薬剤のものであってよい。投与するのに必要とされる組成物の正確な量は、医師の判断に依存し、それぞれの対象にとって特有であってもよい。本明細書に記載の組成物および医薬組成物の治療有効量が、特に、投与スケジュール、投与される薬剤の単位用量、組成物が他の治療剤と共に投与されるかどうか、レシピエントの状態および健康、ならびに特定の組成物の治療活性に依存することは、当業者には明らかであろう。

抗がん治療剤の有効性を、本明細書に開示される組成物（例えば、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、細胞、医薬組成物）と組み合わせた場合、および抗がん治療剤のみで処置した対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増強することができる。好適には、本明細書に記載の組成物および方法は、対象における腫瘍のサイズまたは腫瘍の拡散を、食塩水などの対照と比較して、または抗がん治療剤のみの投与と比較して、少なくとも５％、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させることができる。

本開示は、本明細書に記載の構築物、構成要素の配置、または方法ステップの特定の詳細に限定されない。本明細書に開示される組成物および方法を、以下の本開示の観点から当業者には明らかであろう様々な方法で作製、実施、使用、実行および／または形成することができる。本明細書で使用される表現および用語は、説明のみを目的とするものであり、特許請求の範囲を限定すると見なされるべきではない。説明および特許請求の範囲で使用される場合、第１、第２、および第３などの序数の指標は、様々な構造または方法ステップを指し、任意の特定の構造もしくはステップ、またはそのような構造もしくはステップの任意の特定の順序もしくは構成を示すと解釈されることを意味しない。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で別途指摘しない限り、または本文によって別途明確に否定されない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意かつ全ての例、または例を表す言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示を容易にすることを意図するものであり、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に対して制限を課すものではない。明細書にない言い回し、および図面に示されていない構造は、特許請求されていない要素が、開示される主題の実施にとって必須であることを示すと解釈されるべきである。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその変形の本明細書での使用は、以後列挙される要素およびその等価物、ならびに追加の要素を包含することを意味する。ある特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」と記載される実施形態はまた、それらのある特定の要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と企図される。

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で別途指摘されない限り、範囲内にあるそれぞれ別々の値に個別に言及する短縮法として働くことを単に意図するものであり、それぞれ別々の値は、あたかもそれが本明細書に個別に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％〜５０％と記述される場合、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％などの値が本明細書に明示的に列挙されることが意図される。これらのものは、具体的に意図されるもののほんの一例であり、列挙される最も低い値と、最も高い値との間、およびそれを含む数値の全ての可能な組合せが、本開示に明示的に記述されると考えるべきである。特定の記載される量または量の範囲を記載するための単語「約」の使用は、製造公差、測定値を形成する際の機器の誤差およびヒューマンエラーなどに起因して構成され得た、または自然に構成されたであろう値などの、記載される量に非常に近い値がその量に含まれることを示すことを意味する。量に関する全てのパーセンテージは、別途指摘しない限り、質量による。

本明細書で引用される任意の非特許文献または特許文献を含む任意の参考文献は先行技術を構成すると承認されない。特に、別途記述しない限り、本明細書における任意の文献に対する参照は、これらの文献のいずれかが米国または任意の他の国における当業界の共通一般知識の部分を形成するとの承認を構成しない。参考文献の考察はいずれも、その著者が主張することを記述し、出願人は、本明細書で引用される文献のいずれかの正確性および適切性に挑戦する権利を保持する。本明細書で引用される全ての参考文献は、別途明示的に指摘しない限り、その全体が参照により完全に組み込まれる。引用される参考文献に見出される任意の定義および／または説明の間に相違点がある事象においては、本開示が制御するものとする。

本文によって別途特定または指摘されない限り、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、「１または複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味する。例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「ＲＮＡ（ａｎ ＲＮＡ）」は、それぞれ、「１または複数のタンパク質（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」または「１または複数のＲＮＡ（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ＲＮＡｓ）」を意味すると解釈されるべきである。
以下の実施例は、例示を意味するに過ぎず、本発明の範囲または添付の特許請求の範囲に対する限定を意味しない。

（実施例１）
腫瘍特異的Ｎ結合グリカンを標的とする新規ｓｃＦｖ抗体の選択および特性評価
材料および方法
細胞株
レトロウイルスベクター中にクローニングされたペリオスチンｃＤＮＡは、Ｄｒ．Ｘｉａｏ−Ｆａｎ Ｗａｎｇ（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）からの贈り物であった。ウイルスを、２９３−ＧＰ２パッケージング細胞およびレシピエント細胞（Ｌｅｃ４、Ｐｒｏ５、ＯＶＣＡＲ３）への形質導入前のＶＳＶ−Ｇエンベロープを使用して産生させ、枯渇および濃縮のために使用されるペリオスチン（ＰＮ）発現細胞株を作出した。ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ４およびＰｒｏ５は、Ｄｒ．Ｐａｍｅｌａ Ｓｔａｎｌｅｙ（Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｒｏｎｘ、ＮＹ）からの贈り物であった。ＯＶＣＡＲ３およびＯＶＣＡ２６対照ならびにＧｎＴ−ＩＩＩ ｓｈＲＮＡ細胞株は、以前に記載されている^3、29。ヒトメソテリンＡ１８４７、Ｃ３０、およびヒトメソテリンＬｕｃ−ＩＤ８細胞株は、Ｄｒ．Ｓｃｈｏｌｌｅｒ（ＳＲＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）により生成された。

ウェスタンブロット分析
細胞培養上清（５０ｍＬ）を、プロテアーゼ阻害剤を添加して、ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ、Ｐｒｏ５−ＰＮ、およびＬｅｃ４−ＰＮ細胞から収集した。ペリオスチンを、製造業者の説明書に従って抗Ｆｌａｇ樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上で精製した。ＰＶＤＦ膜に転移させる前に１Ｘ ＭＥＳ緩衝剤を使用して、ＮｕＰａｇｅ ４〜１２％ビストリスゲル上でタンパク質を分離した。ブロットを３％ＢＳＡ／１Ｘ ＴＢＳＴ中でブロックした後、ビオチン標識されたＥ−ＰＨＡ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）の（１：５０００）希釈液およびストレプトアビジンＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）の（１：１０，０００）希釈液を使用して二分岐グリカンを検出し、次いで、増強化学発光により検出した。ブロットをＰｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）ストリッピング緩衝剤中で剥がし、５％無脂肪ミルク１ＸＴＢＳＴ中でブロックし、ペリオスチンに対する抗体の（１：２５０）希釈液（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して検出した。

酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングによる二分岐グリカン選択的ｓｃＦｖの選択
１１人の卵巣がん患者に由来する浸潤性Ｂ細胞およびＰＢＭＣから単離されたｓｃＦｖの酵母ディスプレイライブラリーが、以前に記載されている³⁰。このライブラリーを、ＳＤ−ＣＡＡ（０．６７％酵母窒素塩基、および０．５％カザミノ酸）中で増殖させ、ｓｃＦｖの細胞表面ディスプレイの誘導を、以前に記載されたように誘導した³¹。複数回のライブラリー枯渇を、以下のように実施した：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１ｘ１０⁸の誘導酵母ディスプレイｓｃＦｖを、ＰＢＳでリンスした付着性Ｌｅｃ４−ＰＮ細胞（Ｔ１７５フラスコ中で９５％集密）に添加した。３０分のインキュベーション後に非付着酵母を、Ｌｅｃ４−ＰＮ細胞の別のＴ１７５フラスコに採取し、このプロセスを合計６個のフラスコについて繰り返した。このプロセスを、Ｐｒｏ５−ＰＮフラスコを使用して繰り返した。次に、この新しい枯渇したサブライブラリーを増殖させ、再度誘導し、これを使用して、ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ細胞を使用してペリオスチン上の腫瘍特異的グリコシル化に結合するｓｃＦｖについて濃縮した。６回の濃縮と共に、細胞選択用プローブを使用する結合した酵母の手動による選択の後、以下のように酵母−細胞ＥＬＩＳＡを使用して、濃縮のレベルをモニタリングした：ｓｃＦｖが濃縮されたプール中の酵母を、ＳＤ−ＣＡＡプレート上に塗布し、２〜３日間増殖させて、コロニーを生じさせた。個々のコロニーを、別々のＳＤ−ＣＡＡプレート上に画線を作り、ＳＧＲ−ＣＡＡで誘導して、酵母細胞表面上にｓｃＦｖを発現させた。酵母ｓｃＦｖを、Ｈ₂Ｏ／ＮａＯＨ中、１ｍｇ／ｍＬの蛍光増白剤２８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カルコフロール）を使用して標識した。簡単に述べると、細胞表面上にｓｃＦｖを有する酵母を、室温で５分間、カルコフロール溶液（最終１０％）中に１×１０⁷個で再懸濁した後、ＰＢＳ中で洗浄した。標識された酵母を、室温で３０分間、２４ウェルプレート上、９０％の集密度でＬｅｃ４−ＰＮ／Ｐｒｏ５−ＰＮ／ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ細胞上でパンニングした。細胞への示差的酵母結合を、穏やかに撹拌しながらそれぞれ５分間洗浄する前後に（Ｅｘ３５５／Ｅｍ４０５）でＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４マルチラベルリーダーを用いて測定した。洗浄緩衝剤の除去および新鮮なＰＢＳの添加後、洗浄後の読取りを行った。

酵母ディスプレイｓｃＦｖから可溶性ｓｃＦｖへの変換
ｓｃＦｖ ＤＮＡを、溶解した酵母からＰＣＲ増幅させた。簡単に述べると、飽和で増殖させた酵母５μＬを、２０μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨ中に懸濁し、３分間マイクロ波を照射して、酵母を溶解させた。ｓｃＦｖ断片に対応するＤＮＡを、Ｐｈｉｒｅ ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって増幅し、ゲル精製した後、エレクトロポレーションによってＶＹＨ１０酵母株に線状化ｐ４１６ＢＣＣＰベクターを同時形質転換した¹⁷。酵母を、トリプトファン（ＴＲＰ）を添加したＳＤ ＣＡＡ培地中で一晩増殖させ、以前の報告の通り⁶、１ｍＬのＳＧＲ ＣＡＡ／ＴＲＰ中でさらに誘導した。検出のためのＨＩＳおよびＶ５タグを使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用して、可溶性ｓｃＦｖを確認した。可溶性ｓｃＦｖクローンを、以前の報告の通り³²、部位特異的ビオチン化可溶性抗体（ビオボディ）に変換した。

ＡＤＣＣアッセイ
ＯＶＣＡＲ５細胞（条件あたり３個のウェル）を、０．８ｘ１０⁴細胞／ウェルで播種した４８時間後、ｓｃＦｖＣ９抗体のみ、抗ｍｙｃ抗体のみ、または抗ｍｙｃ抗体と混合したｓｃＦｖＣ９の連続希釈液を添加した。０．５ｍｇ／ｍＬのｓｃＦｖＣ９および１ｍｇ／ｍＬの抗ｍｙｃ抗体との複合体を、４℃で３０分間形成させた後、細胞に添加した。複合体および対照ｓｃＦｖＣ９のみ（０．５ｍｇ／ｍＬ）または抗ｍｙｃ抗体のみ（１ｍｇ／ｍＬ）の連続希釈液を、４８時間にわたって細胞に添加した。等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各ウェルに添加した。プレートを、オービタルシェーカー上で２分間振とうし、室温に１０分間置いた後、発光を記録した。得られる細胞溶解は、生細胞数に存在するＡＴＰに比例する発光シグナルを生成する。３回の独立実験を行った。

免疫化学細胞染色
卵巣がん細胞を、ポリＬ−リシンカバースリップ上に塗布し、５０％集密まで増殖させた後、免疫蛍光染色を行った。ＰＢＳ中のｓｃＦｖＣ９ビオボディ抗体（５０μｇ／ｍＬ）を、５分または３０分の時点で細胞に添加した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、氷冷メタノール中で５分間固定した。細胞を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで１０分間ブロックした後、ストレプトアビジンコンジュゲート化Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４を使用してｓｃＦｖＣ９ビオボディを検出した。核を、ＤＡＰＩの１：１０，０００溶液で１０秒間対抗染色した後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ培地中にマウントした。

異種移植ｓｃＦｖＣ９イメージング
免疫不全のＮＳＧ雌マウスに、１．０×１０⁶個のＡ１８４７ヒト卵巣がん細胞を皮下注射し、６週間後にイメージング試験を行った。免疫能力があるＣ５７Ｂｌ／６雌マウスに、１．０×１０⁶個のルシフェラーゼ形質導入ＩＤ８マウス卵巣がん細胞を卵巣内または腹腔内注射し、８週間後にイメージングを行った³³。Ｌｕｃ−ＩＤ８腫瘍を、ルシフェリン注射を用いてモニタリングした後、イメージング試験を行った。マウスを、イソフルランで麻酔し、ベースラインのために抗体注射の前にイメージングし、次いで、抗体複合体の注射後、２分、５分、３０分、６０分、４時間、２４時間、および４８時間の時点でイメージングした。ｓｃＦｖＣ９複合体は、複合体を形成するために４℃で３０分間、１：１の蛍光標識されたストレプトアビジンＩＲＢ６８０Ｗと共に予備インキュベートした３０μｇのｓｃＦｖＣ９ビオボディを含んでいた。複合体のＩＶ注射を、全てのマウスについて眼窩後方で実施した。
組織中でのｓｃＦｖＣ９の免疫蛍光局在化
皮下Ａ１８４７腫瘍を担持するＮＳＧマウスに、３０μｇのｓｃＦｖＣ９ビオボディを注射し、２４時間後に犠牲にして、腫瘍、腎臓、脾臓、肺、および肝臓を収獲した。全ての組織を、ホルマリン中ですぐに固定し、組織切片にするまで７０％エタノール中で保存した。キシレンおよび段階的エタノール系列に逐次的に浸すことにより、スライドを脱パラフィン化した。暗室中、室温で１時間にわたって、ＰＢＳ中のストレプトアビジン−Ｑｄｏｔ８００（１：５０希釈）と共に組織をインキュベートした。スライドを、ＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄し、１：１０，０００のＤＡＰＩで１５分間、対抗染色を行った。スライドを、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＦｌｕｏｒＳａｖｅ試薬を使用して、スライドにマウントした。

磁気共鳴イメージング
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析−ＭＲＩイメージングを、１．５Ｔ ＭＲシステム（Ｂｒｕｋｅｒ ＰｈａｒｍａＳｃａｎ ７０／１６）上で実施した。抗ｆｌａｇ磁気ビーズに結合した２５μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬのｓｃＦｖＣ９と共にインキュベートする前または後に、アガロースゲルのスペーサー間に積み重ねたＡ１８４７、Ｃ３０、またはＩＤ８細胞（０．４〜１ｘ１０⁶細胞）を用いて、Ｐｈａｎｔｏｍチューブを生成した。ｓｃＦｖＣ９／磁気ビーズ複合体を、４℃で３０分間、細胞と共にインキュベートした後、洗浄し、４℃で２０分間、２％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、固定された細胞およびｓｃＦｖＣ９／磁気複合体を、１％アガロースゲル中の１００μＬに再懸濁し、最後に、２％超低温アガロースゲルのスペーサー間に積み重ねて、ファントムチューブを生成した。最適なＴ１およびＴ２加重配列を決定し、それぞれの細胞層に関する目的の領域を、Ｃ９／磁気ビーズと共にインキュベートした細胞との比較のために、対照細胞のみおよび対照磁気ビーズのみについて測定した。３つの別々の実験の結果を算出し、正規化されたシグナル強度について±ＳＥＭを算出した。

ｉｎ ｖｉｖｏでの分析−ＭＲＩイメージングを、１．５Ｔ ＭＲシステム上で実施した。６週間の皮下Ａ１８４７異種移植腫瘍を担持するＮＳＧマウスに、アビジン被覆磁気ビーズのみ、または４℃で３０分間、１００μＬのＰＢＳ中のアビジン被覆磁気ビーズと１：２で結合したｓｃＦｖＣ９ビオボディを注射した。目的の領域を、それぞれ２ｍｍのスライスにわたって腫瘍および対照（筋肉）について算出した。ＭＲイメージング中の温度は２８℃であり、獲得時間は３０分であった。腫瘍のシグナル強度（ＳＩ）値を、対照（筋肉）で除算して、正規化されたシグナル強度を得た。正規化されたシグナル強度を、眼窩後方注射による磁気ビーズのみ、またはＣ９／磁気ビーズの注射の前および１時間、４時間、または２４時間後に算出した。

動物試験倫理
全ての動物試験および手順を、ＳＲＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可されたプロトコールの下で行った。全ての方法を、ＳＲＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの指針および規則に従って実施した。ＳＲＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌは、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（国際実験動物管理公認協会）（ＡＡＡＬＡＣ）によって公認された、米国農務省（ＵＳＤＡ）に登録された一元管理された動物管理および使用プログラムを維持し、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ（実験動物福祉局）（ＯＬＡＷ）のファイル上に保証を有する。

結果
腫瘍特異的グリカンを有するヒトｓｃＦｖ結合の選択
ペリオスチンは、タンパク質のＣ末端近くの最後のＦＡＳ１ドメイン中に位置する１つの高度に保存されたＮ結合グリコシル化部位を有する（図１Ａ）。ペリオスチン上に存在するグリコシル化の機能は不明であるが、この部位は、配列が高度に保存されており、その潜在的な重要性を暗示し、この部位は、ペリオスチンの全ての既知のアイソフォーム中に存在する。体系化されていない、溶媒露出した領域中のＮ−グリコシル化部位の保存および位置^34、35（図１Ｂ）により、本発明者らは、ペリオスチンの糖型に対する特異的ｓｃＦｖ抗体のサブトラクションおよび濃縮を可能にする異なる糖型のペリオスチンを提示するための足場としてペリオスチンタンパク質を使用することができるとの仮説に導かれた。上の画像は、ヒトペリオスチンの最後のＦＡＳ１ドメインのＮＭＲ構造を示し（図１Ｂ）、アスパラギン５９９（グリコシル化されたアミノ酸）が非構造ループ中に位置することを示す。全てのＦＡＳ１ドメインの結晶構造内でのこの領域の位置は、Ｎ−グリコシル化部位の露出をさらに検証する下の画像に示される。３つの主要な形態のＮ−グリカンが存在する：高マンノース型、ハイブリッド型、または複合体型。典型的な糖タンパク質は、これらの３つの形態のいずれかからなってもよいいくつかのＮ−グリコシル化部位を有する。ある特定の部位が高マンノースである傾向を有し、他の部位がハイブリッドまたは複合体である理由はまだよく理解されていない。しかしながら、以前の研究は、糖タンパク質内のこれらのグリカン型に対する部位特異性が存在することを示している³⁶。本発明者らは、ペリオスチン中の単一のＮ−グリコシル化部位が、異なるがんにおけるグリコシル化パターンの変化のため複雑なＮ−グリカンを示すことを決定した。乳がん組織の本発明者らの以前のグリコプロテオミック分析は、ペリオスチンが４分枝（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）シアル化された複合Ｎ結合グリカンを示すことを示している³⁷。卵巣がん組織では、本発明者らの以前の研究は、ペリオスチンがコアフコースを有する、または有しない、トランケートされた、無ガラクトシル化された、無シアル化されたＮ−グリカン構造を示すことを示している^3、24。ヒトがん組織中での高い発現にも拘わらず、付着増殖条件下で増殖させたヒトがん細胞株は、ペリオスチンを発現しない。非付着条件下で増殖させた細胞株は、ペリオスチンを発現し始めるスフェロイドの形成を可能にする。本発明者らは、卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ３ならびに非悪性チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株Ｐｒｏ５（親）およびＬｅｃ４（ＧｎＴ−Ｖ発現を欠く）中で安定なペリオスチン発現を作出して、付着増殖条件下での発現を可能にした。図１Ｃに示されるように、Ｆｌａｇタグ抗体を使用して単離されたペリオスチンは、ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ細胞株についてのみ、二分岐Ｎ−グリカンを認識することが知られるレクチン³⁸であるレクチンＥ−ＰＨＡに結合したが、これは二分岐グリカンの存在を示している。Ｅ−ＰＨＡによって結合した反応するさらにより高分子量のバンドが存在するが、これは、他の糖タンパク質が、卵巣がん細胞中でこの形態のグリコシル化も担持するペリオスチンと共に単離されたことを示している。Ｐｒｏ５−ＰＮおよびＬｅｃ４−ＰＮ ｆｌａｇタグプルダウンは、Ｅ−ＰＨＡ結合について陰性であり、これらの細胞株中に二分岐グリコシル化が存在しないことを反映している（図１Ｃ）。Ｐｒｏ５およびＬｅｃ４細胞株から単離された糖タンパク質上に見出されるＮ−グリコシル化糖型の以前に公開された質量分析は、４分枝および３分枝複合型Ｎ−グリカンがこれらの細胞株において顕著であることを示唆している³⁹。全ての細胞株が、同様のレベルのペリオスチンタンパク質を発現する（図１Ｃ）。これらの結果は、ペリオスチンが、異なる形態の複合型Ｎ−グリカンと共にこれらの細胞株中で発現されることを確認するものであり、本発明者らは、ｓｃＦｖ抗体のサブトラクションおよび選択のためにこれらのものを使用することができる。

使用したｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリーは、卵巣がん患者のＢ細胞から単離された。図２に記載される本発明者らの濃縮戦略は、Ｐｒｏ５−ＰＮおよびＬｅｃ４−ＰＮ細胞株を使用して複数回のサブトラクションにかけて新しいサブライブラリーを作出し、次いで、それをＯＶＣＡＲ３−ＰＮ細胞に添加して結合する酵母クローンを選択することからなる。酵母ディスプレイ結合クローン集団（ｎ＝２１）を、酵母細胞−ＥＬＩＳＡ手順を使用して、付着性ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ、Ｌｅｃ４−ＰＮ、およびＰｒｏ５−ＰＮ細胞上でパンニングすることによって、さらにスクリーニングした。図３は、これらの細胞株を使用したｓｃＦｖ結合クローンの代表的な分析を示す。＃１、＃４、および＃７などのある特定のクローンは、連続洗浄後に全ての細胞株に類似する親和性で結合したが、これは、これらのクローンが細胞株に対する特異性および親和性を示さないことを示唆している；＃１３、＃１５、および＃１８などの他のクローンは、Ｌｅｃ４−ＰＮおよびＯＶＣＡＲ３−ＰＮ（＃１３および＃１５）またはＰｒｏ５−ＰＮ（＃１８）に最良に結合したが、これは、これらのｓｃＦｖクローンが、卵巣がん特異的ではないタンパク質エレメントまたはグリカンエレメントに対する親和性を示すことを示している。しかしながら、＃９、＃１１、および＃１２などの他のクローンは、それぞれの連続洗浄後にＯＶＣＡＲ３−ＰＮ細胞に親和性をもって示差的に結合したが、これは、卵巣がんに対する特異性を示している。クローン＃９、＃１１、および＃１２を、以前の報告の通り¹⁷、可溶性ｓｃＦｖ抗体に変換した。

ｓｃＦｖＣ９結合の特異性、分布、および抗体により開始される細胞傷害のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析
クローン＃９は、最大収率の可溶性ビオチン標識ｓｃＦｖ抗体産生を有し、これを、ＯＶＣＡＲ３細胞を使用して二分岐Ｎ−グリカンに対する結合特異性についてさらに分析した。本発明者らは、いかなる遺伝子も標的としない対照ＳｈＲＮＡまたはＧｎＴ−ＩＩＩ（Ｍｇａｔ３遺伝子）^3、29を標的とするＳｈＲＮＡの安定な発現を有するＯＶＣＡＲ３細胞中で安定なペリオスチン発現を確立した。図４Ａに示されるフローサイトメトリーデータは、ｓｃＦｖＣ９が、ＧｎＴ−ＩＩＩ ＳｈＲＮＡ ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ細胞と比較して、対照ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ細胞への結合が増加していることを示し、二分岐Ｎ−グリカンに対する結合特異性を示している。ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ対照ＳｈＲＮＡと、ＯＶＣＡＲ３−ＰＮ ＧｎＴ−ＩＩＩ ＳｈＲＮＡは両方とも、ペリオスチンタンパク質を発現するが、これは、結合が二分岐Ｎ−グリカンに特異的であって、タンパク質に特異的ではないことを示している。次に、ｓｃＦｖＣ９の潜在的ターゲティングおよび内在化を評価するために、本発明者らは、顕微鏡観察を使用して、以前に記載された患者由来細胞株ＯＶＣＡ２６²⁹を使用して、卵巣がん細胞中でのｓｃＦｖＣ９の結合および分布を追跡した。５分でのＯＶＣＡ２６対照ＳｈＲＮＡ細胞の細胞染色は、細胞表面でのｓｃＦｖＣ９の蓄積を示している（図４Ｂ）。抗体は、３０分の時点で完全に内在化される。本発明者らは、ｓｃＦｖＣ９のＯＶＣＡ２６ ＧｎＴ−ＩＩＩ ＳｈＲＮＡ細胞への結合を観察しなかったが、これは二分岐Ｎ−グリカンに対する特異性をさらに検証するものである。本発明者らは、グリア芽腫細胞もＧｎＴ−ＩＩＩの発現レベルが上昇するため、この腫瘍型に対するｓｃＦｖＣ９の結合をさらに評価した。図４Ｄおよび図４Ｅに示される本発明者らの３０分の結合データは、ｓｃＦｖＣ９が、二分岐グリカンを示す対照ＬＮ１８細胞に結合し、Ｍｇａｔ３のＬＮ１８ Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ ＫＯへの結合がないことを示す（図４Ｅ）。これらのデータは、ｓｃＦｖＣ９が、結合のために二分岐グリカンを必要とすること、および他のがんに由来する二分岐構造を標的とすることができることを確認するものである。細胞表面でのｓｃＦｖＣ９の蓄積は、ｓｃＦｖＣ９が抗体依存性細胞傷害を開始するように機能することができることを示唆する。ｓｃＦｖＣ９ビオボディは、ｍｙｃタグを含有し（図２）、本発明者らは、細胞をｓｃＦｖＣ９／抗ｍｙｃ ａｂ複合体に曝露して、細胞傷害性を評価することができる。卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ５を、４８時間にわたって抗体複合体の連続希釈液と予め混合した後、発光生存能力アッセイを使用して、細胞生存能力を測定した。結果は、ｓｃＦｖＣ９のみ、または抗ｍｙｃ ａｂのみでは細胞傷害を誘導しなかったことを示している（図４Ｃ）。しかしながら、複合体の最初の２つの連続希釈液（２．５μｇ／ｍＬおよび１．２５μｇ／ｍＬ）への細胞の曝露は、細胞傷害活性を有していた。

ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍に対するｓｃＦｖＣ９のターゲティング、安定性、および特異性
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでのイメージング（ＩＶＩＳ）を使用して、ヒト異種移植モデルおよび同系マウスモデルの両方を使用してｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を標的とするｓｃＦｖＣ９の能力を評価した。図５の上パネルは、６週間前に確立されたヒトＡ１８４７卵巣がん皮下異種移植腫瘍を有するＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスにおける、蛍光標識されたストレプトアビジンと１：１で複合体化したｓｃＦｖＣ９の局在化および蓄積を示す。ｓｃＦｖＣ９抗体は、腫瘍を標的とし、２４時間のピークで腫瘍中に蓄積し、徐々の減少が４８時間で始まる。次に、本発明者らは、免疫能力があるＣ５７Ｂｌ／６雌マウスにおいてルシフェラーゼを形質導入したＩＤ８マウス卵巣がん細胞（Ｌｕｃ−ＩＤ８）を標的とするｓｃＦｖＣ９の能力を評価した。ＩＶＩＳイメージングの８週前に、細胞を卵巣内または腹腔内に注射した。蛍光標識されたストレプトアビジンと１：１で複合体化したｓｃＦｖＣ９抗体を、イメージングの前の示された時間で、眼窩後方に注射した。ヒト皮下異種移植注射について観察されたように（図５、上パネル）、卵巣内注射（図５の中央パネル）は、２４時間の時点で最大に蓄積した。しかしながら、４８時間での減少は、より実質的であった。同系腹腔内モデルは、４時間の時点でｓｃＦｖＣ９／蛍光ストレプトアビジン複合体の最大蓄積に達した。これらの結果は、ｓｃＦｖＣ９が眼窩後方注射によりｉｎ ｖｉｖｏでヒトとマウスの両方の卵巣腫瘍を標的とすることができることを確認するものである。

正常組織ではなく、腫瘍組織に対するｓｃＦｖＣ９抗体の特異性を評価するために、本発明者らは、注射後の抗体局在化を評価した。Ａ１８４７皮下腫瘍を担持するＮＳＧマウスに、ｓｃＦｖＣ９ビオボディまたはビヒクルのみを注射した。２４時間後、マウスを犠牲にし、ストレプトアビジンＱｄｏｔ８００による免疫蛍光染色のために組織を収獲して、ｓｃＦｖＣ９ビオボディを局在化させた。本発明者らは、エンドソーム区画局在化を示す、腫瘍細胞中の核の末梢に局在化された非常に点状のシグナルを観察した（図６の最初の画像下パネルの白色の矢印が例に印を付ける）。非悪性二分岐Ｎ−グリカンを発現することが知られる臓器である腎臓は、腫瘍に見られるｓｃＦｖＣ９の点状の上皮細胞染色について陰性であった。本発明者らは腎臓の血管中に染色を観察するが、腎臓組織の上皮細胞は陰性であった。脾臓にはいくらかのバックグラウンド染色を見ることができたが、この染色は核の間の領域において観察することができ、腫瘍細胞（図４Ｂ）および腫瘍組織（図６の最初の画像の下パネル）について観察されるように、核周囲での抗体の蓄積よりもむしろ、細胞外局在化の可能性（図６の３番目の画像の下パネルの矢印が例を示す）を示唆している。本発明者らはまた、肺の細胞外空間でのｓｃＦｖＣ９のいくらかの蓄積にも気付いている。全体として、ｓｃＦｖＣ９抗体は、血管系を介してｉｎ ｖｉｖｏで悪性上皮細胞を優先的に標的とする能力を示す。

磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）検証試験
ｓｃＦｖＣ９による腫瘍に対するターゲティングが成功したため、本発明者らは、ｓｃＦｖＣ９ビオボディが磁気共鳴イメージング試験によるシグナルの増幅のために腫瘍に対して磁気ビーズをターゲティングすることができるかどうかを試験した。標的ＭＲイメージングプローブとしてのｓｃＦｖＣ９の開発の成功には、特異性、蓄積の規模、および安定性が必要である。本発明者らは、ファントムチューブを使用するＭＲＩによりｉｎ ｖｉｔｒｏで卵巣がん細胞中のｓｃＦｖＣ９磁気ビーズ複合体を検出する能力を測定することによって、ＭＲイメージングプローブとしてのｓｃＦｖＣ９の評価を開始した。Ａ１８４７、ＩＤ８、およびＣ３０細胞を、アガロースに埋め込み、積み重ねた。細胞のみ（洗浄および固定した）、抗ｆｌａｇタグ磁気ビーズのみ、または細胞（ｓｃＦｖＣ９／抗ｆｌａｇタグ磁気ビーズと共にインキュベートした後、洗浄および固定した）の層を、ＭＲＩを使用して測定した。その結果、細胞のみに対してｓｃＦｖＣ９／磁気ビーズと共に細胞を含有する層において、正規化されたシグナル強度の有意な減少が検出可能であることが示された（図７Ａ）。これらの結果は、シグナル増幅の蓄積を示している。

次に、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を標的とするｓｃＦｖＣ９／磁気ビーズ複合体の能力を試験するために、ＮＳＧマウスにおいて皮下Ａ１８４７異種移植腫瘍を開始させた。アビジン被覆磁気ビーズのみ、または部位特異的ビオチン化ｓｃＦｖ（Ｃ９ビオボディ）と１：２で複合体化したアビジン被覆磁気ビーズを、眼窩後方にＩＶ注射した。動物を、注射前および注射の１時間後、４時間後、または２４時間後にＭＲイメージングした。腫瘍および対照（筋肉）に関する目的の領域（ＲＯＩ）を、２ｍｍスライスにわたって測定した。磁気ビーズのみと、ｓｃＦｖＣ９／磁気ビーズ複合体との正規化されたシグナル強度差は、全ての注射後の時点で高度に有意であった（図７Ｂ）。注射後１時間の時点での代表的な画像を示す（図７Ｂ）。これらのデータは、腫瘍に関するＭＲＩシグナルの減少は１時間から２４時間までの時点で一貫していたため、ｓｃＦｖＣ９／磁気ビーズ複合体が、標的腫瘍に対する特異性を有し、シグナル増幅、特異性、および安定性を示すことを示している。

考察
本発明者らの結果は、顕著な腫瘍特異的グリコシル化変化を標的とする完全ヒトｓｃＦｖ抗体であるｓｃＦｖＣ９の単離および精製をもたらした有効なスクリーニングプラットフォームの開発成功を示している。本発明者らは、卵巣がんに対するこの抗体の結合特異性およびターゲティングを特徴付けたところ、ＬＮ１８グリア芽腫細胞株を使用した本発明者らの初期顕微鏡観察データは、ｓｃＦｖＣ９がＭｇａｔ３遺伝子の増幅を示す他の腫瘍に結合するはずであることを示している²³。本発明者らは、ビオボディ中のｓｃＦｖＣ９クローンを開発し、大規模精製を可能にし、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍グリカンに対するｓｃＦｖＣ９ビオボディの特異性を証明した。ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が増強された抗体の細胞表面結合および内在化は、多様なイメージングおよび治療適用の将来の開発を可能にするはずである品質である。ｓｃＦｖＣ９ビオボディを、免疫コンジュゲート、毒素、または薬物コンジュゲートなどの多様な治療分子にコンジュゲートすることができる。これらの潜在的な治療的革新に加えて、ビオボディは、腫瘍イメージングおよびイメージングと治療選択肢との潜在的な対形成にとって有用であり得る。

腫瘍抗原に対して開発された多くの抗体は、Ｔｎ、シアリル−Ｔｎ、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）、ＬｅＸ、シアリル−ＬｅＸ、およびＬｅＹなどのいくつかの周知の腫瘍炭水化物抗原が存在するという事実⁴⁰にも拘わらず、タンパク質を標的とする。多くのこれらの腫瘍−グリカンエピトープに対する、単離された抗体は、臨床使用における適用が限られるＩｇＭである。ヒト患者由来抗体ライブラリーに由来する膜タンパク質糖型または分泌タンパク質糖型に対する抗体の単離は限定的であり、これは、ライブラリー内のこれらの抗原を標的とする抗体の存在量が少ないためであり得る。したがって、本発明者らは、本研究において新しい戦略を用いて、この制限を克服し、顕著な腫瘍−グリカンを標的とする完全ヒトｓｃＦｖ（ｓｃＦｖＣ９）の単離を可能にした。腫瘍糖型を発現する無傷の糖タンパク質を使用する抗原濃縮の前の、非腫瘍糖型を発現する無傷の糖タンパク質を含む患者由来ライブラリーの反復的サブトラクションは、本発明者らの戦略の重要な構成要素である。精製された糖タンパク質または合成糖ペプチドよりもむしろ、ライブラリーをスクリーニングするための哺乳動物細胞の本発明者らの使用もユニークである。本発明者らの知る限り、これは、複合型Ｎ結合腫瘍グリカンを標的とするヒトｓｃＦｖの初めての単離および記載である。

グリカンに対する抗体を選択するためには、以前は一本鎖抗体が利用されていた。以前に公開された研究の多くは、酵母ディスプレイよりもむしろファージディスプレイを利用した。酵母抗体ライブラリーは、哺乳動物細胞と同様、翻訳後改変を示し、これは、溶解度およびフォールディングにおいて利点を提供し得る。ファージディスプレイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでメラノーマおよび乳がん細胞に対する特異性を有する糖脂質炭水化物抗原Ｇ（Ｍ３）に対するヒト一本鎖抗体を単離するために使用された⁴¹。ファージディスプレイを使用する別の研究は、シアリル−ＬｅＸおよびＬｅＸを標的とするヒト一本鎖抗体を患者由来ライブラリーから単離することができることを証明した⁴²。多くの有名な腫瘍炭水化物抗原、ＴｎおよびＳＴｎは、これらの炭水化物抗原のサイズがより小さいため、課題を示す。顕著なＴｎおよびＳＴｎ抗原を示すＪｕｒｋａｔ細胞で免疫されたマウスに由来するマウスｓｃＦｖライブラリーの構築を含む戦略と共に、Ｔｎ抗原を標的とするｓｃＦｖの単離をもたらす協調的サブトラクションおよび濃縮戦略のため、Ｔｎ抗原を標的とする一本鎖抗体が単離された⁴³。本発明者らの戦略は、以下の特徴を利用するこれらの研究に立脚する：（ｉ）本発明者らが、１１人の異なる卵巣がん患者のＢ細胞（末梢血リンパ球および腹水に由来する）から開発された患者由来ｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーの深度を増大させたこと、（ｉｉ）本発明者らが、腫瘍グリカンを示す糖タンパク質を発現する哺乳動物細胞を使用して本発明者らのライブラリーをパンニングし、腫瘍グリカンの最適な提示を可能にしたこと、（ｉｉｉ）本発明者らが、複数回のサブトラクションおよび濃縮を使用したこと、および（ｉｖ）本発明者らの方法が、類似するコンフォメーションが抗体結合特異性の変化を最小化する、細胞表面ｓｃＦｖおよび分泌型ｓｃＦｖの産生を可能にする相補的酵母系を使用すること。

本発明者らは、本発明者らの酵母細胞−ＥＬＩＳＡデータ、フローサイトメトリー分析、および細胞染色に起因して、ｓｃＦｖＣ９が、腫瘍特異的二分岐Ｎ−糖型に結合し、ペリオスチンタンパク質発現に依存しないと確信しているが、本発明者らは、この時点で、ｓｃＦｖＣ９が結合するＮ−糖型の正確な構造を知らない。本発明者らが原発卵巣がん組織から以前に決定した構造³に由来する二分岐Ｎ−糖型の差異を発現し得るヒト卵巣がん細胞株を使用して、抗体を単離した。抗体を単離するために使用されたＯＶＣＡＲ３細胞株とはそれぞれ異なる、ヒト卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡ２６、Ｃ３０、Ａ１８４７）、マウス卵巣がん細胞（ＩＤ８−Ｌｕｃ）、およびヒトグリア芽腫細胞（ＬＮ１８）を使用する本発明者らの検証分析は、ｓｃＦｖＣ９が広範囲の腫瘍二分岐Ｎ−グリカンを認識することに信頼を加える。

腫瘍グリカンを認識する抗体については強力な利点がある。患者は、グリカンを含む、腫瘍関連抗原に対する抗体を作る。タンパク質上の腫瘍特異的糖型は免疫寛容を克服することができることが公知である⁴⁴。ＭＵＣ１ペプチドに対する体液性免疫応答を惹起する試みは失敗したが、がん関連Ｏ−グリカンＴｎおよびＳＴｎエピトープを含む化学酵素的に合成されたＭＵＣ１ペプチドは、がん特異的体液性応答を惹起した⁴⁴。腫瘍グリカンを標的とする抗体は、固形腫瘍の免疫抑制を克服するための戦略を改善するためのチェックポイント阻害剤と連携し得る。腫瘍グリカンを標的とする抗体は、複数のタンパク質上の腫瘍炭水化物抗原の存在量のため、標的化学療法戦略を改善することができる。腫瘍グリカンに対する一本鎖抗体は、サイズが小さいため、伝統的な薬物標的としては考えられてこなかった糖タンパク質のための新規治療剤に発展させることができる。まとめると、本発明者らの結果は、腫瘍特異的グリカンを標的とするヒト抗体の単離にとって有用な新規手法を証明する。

ビオボディ＃Ｃ９（Ｂｂ＃Ｃ９）の配列決定
本発明者らは、ビオボディ＃Ｃ９の２つのクローン（Ｅ１１およびＦ１１）を配列決定した。Ｅ１１およびＦ１１クローンに由来するＢｂ＃Ｃ９をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲ増幅し、配列決定した。クローンは、予想通りタンパク質およびＤＮＡレベルで同一であった。

ビオボディ＃Ｃ９の最終的なＤＮＡおよびタンパク質配列は、本明細書と共に提供される配列表に開示される。Ｃ９ビオボディは、以下の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖：ＣＤＲ Ｈ１、ＧＦＩＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１）、ＣＤＲ Ｈ２、ＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴ（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３、ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号３）を含んでいた。驚くべきことに、Ｃ９ビオボディは、単一の軽鎖ＣＤＲ−ＣＤＲ Ｌ３、ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号４）を含むトランケートされた軽鎖を含んでいた。Ｃ９ビオボディ重鎖可変領域の配列は、配列番号５として提供され、Ｃ９ビオボディ軽鎖可変領域は、配列番号６として提供される。リンカーおよびＶ５タグを含む、完全長Ｃ９ビオボディのタンパク質およびＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号７および配列番号８として提供される。

（実施例２）
ｉｎ ｖｉｖｏでのイメージング試験
方法
モデル系
標識された抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ−グリカンｓｃＦｖ（Ｃ９）抗体を使用して、いくつかの肺がんモデルをイメージングした。モデルは、
・腹腔内マウスメソテリン^intＬｕｃ−ＩＤ８マウス卵巣がんを有するＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（図８〜９）
・同所性ヒトメソテリン^loＡ５４９ヒト肺がんを有するＮＳＧマウス（図１０）
・同所性ヒトメソテリン^IntＨ４６０ヒト肺がんを有するＮＳＧマウス（図１１）
・同所性ヒトメソテリン^hiＥＫＶＸヒト肺がんを有するＮＳＧマウス（図１２）
を含んでいた。

注射
１）標識されたストレプトアビジンＩＲＢ６８０Ｗに結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ、３０μｇ）、２）標識されたストレプトアビジンＩＲＢ６８０Ｗに結合したビオチン化抗Ｎ−グリカンｓｃＦｖ（Ｃ９、３０μｇ）、および３）標識されたストレプトアビジンＩＲＢ６８０Ｗのみ（陰性対照）の眼後方注射を、上記モデルにおいて行った。
画像の正規化
・Ｌｕｃ−ＩＤ８オルト卵巣メソテリン^Int 最小：１．２５ｅ９ 最大：５ｅ９
・Ｌｕｃ−ＩＤ８ ＩＰ 卵巣メソテリン^Int 最小：２ｅ９ 最大：９ｅ９
・ＮＳＧ ＳＣ 卵巣メソテリン^hi 最小：１．５ｅ１０ 最大：８ｅ９
・ＮＳＧ ＳＣ 肺メソテリン^hi/Int/lo 最小：１．８９ｅ９ 最大：４ｅ９

結果
抗メソテリンナノボディは、卵巣内、ＩＶ、ＩＰまたはＳＣで注射された、卵巣および肺がんによって発現されるヒトとマウスの両方のメソテリンを検出した。感度は高かった。ルシフェリン（図８）によってほとんど可視化されない、または全く視認できない（図１０）腫瘍が、抗メソテリンナノボディによって検出されたが、これは、がんの早期検出に適していることを支持する。特異度は高かった。メソテリンを発現しない大きい肺腫瘍は検出されなかった（図１２）。
抗Ｎ−グリカンペリオスチンｓｃＦｖは、卵巣内、ＩＰ、またはＳＣで注射された、ヒトとマウスの両方の卵巣がんを検出した。Ｃ９生体分布は、メソナノ生体分布よりも速く、試験した全部で３つの卵巣がんモデルにおいて注射後にシグナルのより早い増加および減少を示した。

参考文献

Claims (33)

1. 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
   ＣＤＲ Ｈ１、ＧＦＩＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１）、
   ＣＤＲ Ｈ２、ＮＳＧＦＱＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴ（配列番号２）、
   ＣＤＲ Ｈ３、ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号３）、
   ＣＤＲ Ｌ３、ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号４）
   のうちの少なくとも１つを含む抗原結合試薬。
2. ヒトペリオスチン糖タンパク質に特異的に結合することができる、請求項１に記載の抗原結合試薬。
3. 前記ヒトペリオスチン糖タンパク質のグリカンエピトープに特異的に結合する、請求項２に記載の抗原結合試薬。
4. 前記グリカンエピトープががん細胞上に特異的に存在する、請求項３に記載の抗原結合試薬。
5. 前記がん細胞が、卵巣がん、グリア芽腫、腎臓がん、子宮がん、直腸がん、結腸がん、腺癌および肺がんからなる群から選択されるがんに由来するがん細胞を含む、請求項４に記載の抗原結合試薬。
6. 前記がん細胞のＭｇａｔ３遺伝子の発現が上昇している、請求項４に記載の抗原結合試薬。
7. 前記グリカンエピトープがＮ−結合グリカン構造を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
8. 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
   ＣＤＲ Ｈ１、ＧＦＩＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１）、
   ＣＤＲ Ｈ２、ＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴ（配列番号２）、
   ＣＤＲ Ｈ３、ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号３）、
   ＣＤＲ Ｌ３、ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号４）
   の全部を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
9. 配列番号５を含む重鎖可変領域と、配列番号６を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
10. ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＩｇＧモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
11. 配列番号７を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
12. 薬剤に連結された請求項１〜１１に記載の抗原結合試薬のうちの１つを含む、抗原結合コンジュゲート。
13. 前記薬剤が検出可能なイメージング剤を含む、請求項１２に記載の抗原結合コンジュゲート。
14. 前記検出可能なイメージング剤が、フルオロフォア部分、酵素部分、光学部分、磁気部分、放射標識部分、Ｘ線部分、超音波イメージング部分、ナノ粒子ベースの部分、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の抗原結合コンジュゲート。
15. 前記薬剤が治療剤を含む、請求項１２に記載の抗原結合コンジュゲート。
16. 前記治療剤が細胞傷害化合物を含む、請求項１５に記載の抗原結合コンジュゲート。
17. 前記薬剤が免疫ポリペプチドを含む、請求項１２に記載の抗原結合コンジュゲート。
18. 前記抗原結合試薬と前記薬剤とが、共有結合によって連結されている、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の抗原結合コンジュゲート。
19. 前記抗原結合試薬と前記薬剤とが、タグシステムによって連結されている、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の抗原結合コンジュゲート。
20. 前記タグシステムがビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンを含む、請求項１９に記載の抗原結合コンジュゲート。
21. 請求項１〜１１に記載の抗原結合試薬のうちの１つ、または請求項１２〜２０に記載の抗原結合コンジュゲートのうちの１つを含む細胞。
22. ヒト免疫細胞である、請求項２１に記載の細胞。
23. 請求項１〜１１に記載の抗原結合試薬のうちの１つ、請求項１２〜２０に記載の抗原結合コンジュゲートのうちの１つ、または請求項２１〜２２に記載の細胞のうちの１つと、薬学的担体とを含む医薬組成物。
24. 対象におけるがん細胞をイメージングするための方法であって、前記対象に、請求項１〜１１に記載の抗原結合試薬のうちの１つ、請求項１２〜２０に記載の抗原結合コンジュゲートのうちの１つ、または請求項２３に記載の医薬組成物を有効量で投与すること、およびイメージングモダリティを使用して前記対象の少なくとも一部の画像を生成することを含む方法。
25. 前記抗原結合試薬、前記抗原結合コンジュゲート、または前記医薬組成物に結合した細胞のイメージングが、前記細胞ががん細胞であることを示す、請求項２４に記載の方法。
26. 前記イメージングモダリティが、超音波、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、核磁気共鳴イメージング（ＮＭＲＩ）、光学イメージング（ＯＩ）およびコンピューター断層撮影（ＣＴ）からなる群から選択される、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 対象の試料中のがん細胞を検出する方法であって、前記対象から試料を取得すること、および前記試料と、請求項１〜１１に記載の抗原結合試薬のうちの１つまたは請求項１２〜２０に記載の抗原結合コンジュゲートのうちの１つとを接触させること、および前記試料中の細胞に対する前記抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合を検出することを含む方法。
28. 前記細胞に対する前記抗原結合試薬または前記抗原結合コンジュゲートの結合が、前記細胞ががん細胞であることを示す、請求項２７に記載の方法。
29. 対象におけるがん細胞を処置するための方法であって、前記対象に、請求項１〜１１に記載の抗原結合試薬のうちの１つ、請求項１２〜２０に記載の抗原結合コンジュゲートのうちの１つ、請求項２１〜２２に記載の細胞のうちの１つ、または請求項２３に記載の医薬組成物を有効量で投与して、前記対象におけるがんを処置することを含む方法。
30. 前記対象に有効量のがん治療剤を投与することをさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記がん細胞が、卵巣がん、グリア芽腫、腎臓がん、子宮がん、直腸がん、結腸がん、腺癌および肺がんからなる群から選択されるがんに由来する細胞を含む、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記がんのＭｇａｌ３遺伝子の発現が上昇している、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記対象がヒト患者である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。

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