CN104955845A - 间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了使用噬菌体展示抗体工程技术和合成肽筛选法，来确定针对间皮素的人源单域抗体SD1和SD2。SD1识别靠近细胞表面的人的间皮素的C-末端(残基539-588)的构象表位。SD2结合全长的间皮素。为了研究作为潜在的治疗剂的SD1，生成了重组的人源Fc(SD1-hFc)融合蛋白。SD1-hFc蛋白对于表达间皮素的肿瘤细胞，除了抗体-依赖的细胞毒性(ADCC)外，还展现了很强的补体-依赖的细胞毒性(CDC)。此外，在裸鼠体内中，SD1-hFc蛋白对异种移植瘤具有显著的肿瘤生长抑制作用。SD1和SD2是第1个靶向表达间皮素的肿瘤的人源单结构域抗体。

Description

间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法

交叉引用相关申请

本申请要求2012年9月27日提交的美国临时申请号61/706,396的权益，在此整体引入该申请的内容。

技术领域

本公开涉及单克隆抗体，如特异于间皮素的单域的单克隆抗体。本公开进一步涉及该抗体的使用，如用于癌症的诊断和治疗。

背景技术

由于间皮素在恶性间皮瘤中高度表达(Chang等，Cancer Res 52：181-186，1992；Chang和Pastan，proc Natl Acad Sci USA 93：136-140，1996)以及在其它实体肿瘤，如胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、乳腺癌和卵巢癌症中高度表达，因此间皮素被认为是一个治疗靶点。(Hassan等，Clin.Cancer Res.10：3937-3942，2004；McGuire等，N.Engl.J.Med.334：1-6，1996；Argani等，Clin.Cancer Res.7：3862-3868，2001；Hassan等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.13：243-247，2005；Li等，Mol.Cancer Ther.7：286-296，2008；Yu等，J Cancer 1：141-1749，2010；Tchou等，Breast Cancer ResTreat 133(2)：799-804，2012；美国专利号7,081,518)。

间皮素(MSLN)基因编码～70kDa的前体蛋白，该蛋白被加工形成～30kDaN端蛋白和～40kDa的C端膜结合成熟间皮素(Hassan和Ho，Eur J Cancer 44：46-53，2008)。在过去近20年里，开发了许多抗间皮素的单克隆抗体(mAb)，包括SS1P免疫毒素和MORAb-009(也称阿麦妥昔单抗(Amatuximab))，该抗体目前在进行针对于间皮瘤和其它癌症的临床试验的评估(Hassan和Ho，Eur J Cancer 44：46-53，2008；Ho，Biodrugs 25：275-284，2011)。SS1P是重组的免疫毒素，由与截短的假单胞菌外毒素融合的小鼠的抗间皮素Fv组成，其介导细胞杀伤(Pastan和Hassan，Nat Rev Cancer 6：559-565，2006)。关于SS1P的联合化疗的临床试验目前正在进行。基于小鼠SS1Fv的嵌合(鼠/人)抗体MORAb-009在具有间皮素的肿瘤细胞上引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)(Hassan等，Cancer Immure 7：20，2007)。

最近美国国家癌症研究所(NCI)的研究人员制备了两个完全人源的识别间皮素的单克隆抗体(m912和HN1)(Feng等，Mol Cancer Ther 8：1113-1118，2009；Ho等，Int J Cancer 128：2020-2030，2011)。自噬菌体展示库分离HN1人源Fv，并且生成完全人源化IgG。通过将HN1 Fv融合到截短的假单胞菌外毒素A(PE38)而产生HN1的免疫毒素(Ho等，Int J Cancer 128：2020-2030，2011)。HN1的IgG结合于与细胞表面相关联的间皮素并且通过非常强的ADCC来对肿瘤细胞进行杀伤。HN1人源抗体识别重叠间皮素中的SS1位点的构象表位，其表明HN1可以开发成基于SS1的单克隆抗体的完全人源化版本(如MORAb-009)。虽然已知的许多间皮素单克隆抗体都是可用的，但是没有一个可以展现出针对于肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，目前靶向间皮素的治疗由于缺乏具有强效的CDC的抗间皮素的单克隆抗体而被阻碍。

CDC是治疗性抗体的重要的细胞杀伤机制(Weiner等，Nat Rev Immunol10：317-327，2010)。第一个被批准的癌症治疗的单克隆抗体，利妥昔单抗，对于其抗肿瘤活性，部分依赖于CDC。在临床前的研究中，它的抗肿瘤活性在C1q缺失的小鼠中完全丧失(abolished)(Di Gaetano等，J Immunol 171：1581-1587，2003)。在B细胞淋巴瘤的异种移植模型中补体的耗尽也降低其活性(Cragg和Glennie，Blood 103：2738-2743，2004)。目前认为当结合于位点的抗体靠近细胞膜时CDC才可能发生(Pawluczkowycz等，J Immunol 183：749-758，2009)。作为这一解释的依据，奥法木单抗(ofatumumab)，其比利妥昔抗体更靠近细胞膜进行结合，而其CDC的活性也更高(Pawluczkowycz等，J Immunol 183：749-758，2009)。几乎所有现有的间皮素单克隆抗体和免疫毒素(包括HN1和SS1P/MORAb-009)识别I区域，细胞表面的间皮素的N末端被推测为远离细胞膜(Kaneko等，J Biol Chem 284：3739-3749，2009)。

发明内容

本发明公开了间皮素特异性人源单域(VH)抗体(简称为SD1和SD2)。SD1抗体结合在人的间皮素的C末端的构象表位，并且对于表达间皮素的肿瘤细胞展现出很强的CDC活性以及ADCC。SD2特异于全长的人的间皮素，但不能结合间皮素的C末端间皮素肽。

本发明提供的是包含SD1或SD2的一个或者多个(诸如所有的三个)CDR的单克隆抗体。本发明提供的抗体包括免疫球蛋白分子，例如IgG抗体，以及抗体片段和单域(VH)抗体。进一步提供组合物，所述组合物包含结合(例如特异性结合)于间皮素的抗体、编码这些抗体的核酸分子、包括所述核酸分子的表达载体、以及表达所述核酸分子的分离的宿主细胞。本发明还提供了免疫偶联物，所述免疫偶联物包含本文所公开的抗体和效应分子(例如毒素)。也提供了包含所述抗体的融合蛋白，例如包含人的Fc的融合蛋白。

在此提供的抗体和组合物可用于各种目的，例如用于确定表达间皮素的癌症的诊断，所述癌症诸如为间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。因此，在此提供了在受试对象中确定癌症的诊断的方法，所述确定癌症的诊断通过使来自于被诊断为癌症的受试对象的样本与结合间皮素的单克隆抗体进行接触，并检测所述样本与所述抗体的结合来进行。根据所述抗体与所述样本的结合相对于所述所述抗体与对照样本的结合的增加来确定癌症的诊断。在一些实施方案中，该方法进一步的包括使特异性识别所述特异性间皮素抗体的第二抗体与所述样本接触，以及检测所述第二抗体的结合。

同样地，在此提供了在受试对象中检测表达间皮素的癌症的方法。这一方法包括使来自于受试对象的样本与本文所描述的单克隆抗体接触，以及检测所述抗体与所述样本的结合。所述抗体与所述样本的结合相对对照样本的增加检测受试对象的癌症。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括使特异性识别所述特异性间皮素抗体的第二抗体与所述样本接触，以及检测所述第二抗体的结合。

本发明进一步提供对于具有表达间皮素的癌症的受试对象的治疗方法，所述癌症例如为间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌，该方法通过以下来进行：选定患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向受试对象施用治疗有效量的间皮素特异性单克隆抗体或者包含所述抗体的免疫偶联物、融合蛋白或组合物。

本发明还提供了在受试对象中抑制肿瘤生长和抑制表达间皮素的癌症的转移的方法，该方法通过选定患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向该受试对象施用治疗有效量的本文所公开的抗体、免疫偶联物、融合蛋白或组合物。

通过下面参考附图的详细描述，本发明上述的和其它的目标、特征以及优点将变得更加清晰。

附图说明

图1A-1D：对应间皮素C末端的人单域抗体的生成。(图1A)用于通过噬菌体展示技术筛选人源抗体的肽的设计。提出了在膜结合间皮素中的三个功能区：I区：296-390；II区：391-486；III区487-598(SEQ ID NO：9)。指示在细胞表面间皮素上的三个预测的N连接聚糖(Asn388、Asn488和Asn515)。用于目前研究的肽含有在间皮素C末端的50个残基(SEQ ID NO：9的残基539-588)。(图1B)工程化的人源抗体结构域(VH)噬菌体展示库用于针对C末端间皮素肽(残基539-588)的四轮噬菌体筛选。(图1C)单克隆噬菌体ELISA试验在第四轮筛选结束时被执行。选择SD1噬菌体克隆(克隆1)用于进一步分析，因为其对全长间皮素和C末端多肽两者均以强的信号进行结合。(图1D)采用两个所选的抗体噬菌体克隆(SD1和SD2)执行单克隆噬菌体ELISA试验。SD1克隆既结合全长人间皮素(MSLN)又结合所述间皮素肽。而SD2克隆仅结合MSLN，不结合所述肽。

图2A-2B：SD1人源SD1 Fc融合蛋白的制备和分析。(图2A)非还原和还原条件下的纯化的SD1-hFC蛋白(每一泳道4μg蛋白)的SDS-PAGE分析。SD1-hFc蛋白的纯度大于95％。NR：非还原；R：还原。(图2B)A431/H9(在表皮样癌A431细胞系中的间皮素的强制表达)(Ho等，Clin Cancer Res 11：3814-3820，2005)、NCI-H226(间皮瘤)和KMBC(胆管癌)的细胞提取物中的内源性间皮素蛋白的免疫沉淀。SD1被用于免疫沉淀细胞裂解物中的内源性间皮素蛋白。C：无关的VH单域人源Fc融合体(fusion)；IP：免疫沉淀；输入：免疫沉淀之前的全细胞裂解物上的蛋白质印迹。

图3A-3D：SD1-hFc的结合特性。(图3A)直接ELISA。SD1-hFc与全长的人间皮素蛋白(MSLN)和肽结合，但不结合小鼠的间皮素(mMSLN)或BSA。(图3B)竞争性ELISA。间皮素肽而不是SS1P、HN1或者含有50个残基的无关肽，和人的间皮素蛋白竞争与SD1-hFc结合。(图3C)关于人的间皮素蛋白，SD1-hFc解离平衡K_D是13.58nM，而对于所述肽是16.08nM(图3D)。

图4：对表达间皮素的癌细胞和对照癌细胞上的SD1-hFc蛋白的流式细胞术分析。SD1-hFc结合于稳定的间皮素cDNA转染的A431/H9细胞系上，不结合A431细胞系。所述抗体也结合目前研究中所测试的四分之三的人类癌症细胞系。OVCAR8：卵巢癌；NCI-H226：间皮瘤；EKVX和L55：NSCLC；KMBC，Mz-ChA-1和HuCCT1：胆管癌。

图5A-5H：对表达间皮素的癌细胞，SD1-hFc引发CDC和ADCC。(图5A，5B)CDC检测试验。在作为补体来源的正常的人血清(NHS，20％v/v)的存在下，将A431/H9(图5A)和NCI-H226(图5B)细胞与增加的浓度的SD1-hFc一起培养(incubated)。在SD1-hFC存在下，补体蛋白C1q结合H9(图5C)和NCI-H226(图5D)细胞，而在HN1或对照hFc融合蛋白存在的条件下不结合。(图5E-5H)ADCC检测试验。在增加浓度的SD1-hFc的存在下，刚分离的外周血单核细胞(PBMC)以50∶1的比例与靶细胞A431/H9(图5E)或NCI-H226(图5F)细胞一起进行培养。以不同的E∶T比，将纯化的人的NK细胞与靶细胞A431/H9(图5G)或NCI-H226(图5H)，与50μg/ml SD1-hFc一起进行培养。通过LDH检测确定CDC和ADCC活性(^*：p＜0.05)。

图6A-6D：SD1-hFc对肿瘤生长具有强抗肿瘤作用。(图6A)将A431/H9细胞接种在裸鼠胁腹以形成大约70mm³大小的肿瘤。从第7天起，每隔一天用SD1-hFc(50mg/kg)或者PBS处理小鼠。向下的箭头表示注射的日子。在第7-20天计算每一处理组的平均肿瘤尺寸(^*：p＜0.05)。(图6B)在作为小鼠补体的来源的正常小鼠血清(30％v/v)的存在下，将A431/H9细胞与100μg/mLSD1-hFc一起培养。通过LDH检测测定CDC活性(^*：p＜0.05)。(图6C)在作为小鼠效应细胞的来源的纯化的小鼠NK细胞的存在下，将A431/H9细胞与100μg/mL SD1-hFc一起培养。通过LDH检测测定小鼠ADCC活性(^*：p＜0.05)。(图6D)鼠NK细胞的纯度。

图7A-7B：基于SD1的重组免疫毒素的制备和分析。(图7A)在非还原条件下的纯化的SD1-PE38(每一泳道4μg蛋白)的SDS-PAGE分析。SD1-PE38的纯度大于95％。IT：免疫毒素。(图7B)利用WST-8检测以SD1-PE38免疫毒素处理后的A431/H9、A431、NCI-H226和KMBC细胞。

序列表

通过使用标准字母缩写表示核苷酸碱基，以及使用三字母代码表示氨基酸，而示出列于所附的序列表中的核酸和氨基酸序列，如37C.F.R.1.822中定义。每个核酸序列只有一条链被表示，而互补链被理解为通过任意参照所显示的链而被包括。序列表以2013年9月11日创建的、大小26.7KB的ASCII文本文件的形式提交，在此通过参考引入该文本。在所附序列表中：

SEQ ID NO：1是SD1单域抗体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是SD1单域抗体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是假单胞菌外毒素(PE)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是PE38的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是PE-LR的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是PE-LR/6X的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是具有降低的免疫原性的PE的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是PE-LR/8M的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是人的间皮素的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：10-13是引物序列。

SEQ ID NO：14是SD2单域抗体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15是SD2单域抗体的氨基酸序列。

具体实施方式

I.缩写

ADCC 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性

CAR 嵌合抗原受体

CDC 补体依赖的细胞毒性

cDNA 互补的DNA

CDR 互补决定区

CTL 细胞毒性T淋巴细胞

ELISA 酶联免疫吸附试验

EM 效应分子

FACS 荧光激活细胞分选

GPI 糖基化磷脂酰肌醇

hFc 人的Fc

HRP 辣根过氧化物酶

Ig 免疫球蛋白

i.v. 静脉注射

K_D 解离常数

LDH 乳酸脱氢酶

mAb 单克隆抗体

MAC 膜攻击复合物

mMSLN 小鼠间皮素

MSLN 间皮素

NHS 正常人血清

PBMC 外周血单核细胞

PCR 聚合酶链式反应

PE 假单胞菌外毒素

PE 藻红蛋白

pfu 空斑形成单位

RIPA 放射免疫沉淀试验

VH 可变重

VL 可变轻

II.术语和方法

除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以在以下中找到：Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编)，The Encyclopedia of MolecularBiology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive DeskReference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为便于理解本公开的各实施方案，下面提供了对特定术语的解释：

抗体：包含至少轻链或重链免疫球蛋白的可变区的多肽配体，其识别和结合(如特异地识别和特异性结合)抗原表位，如间皮素、或其片段。免疫球蛋白分子由重链和轻链组成，其中所述重链和轻链各自具有可变区，所述可变区称为可变重(V_H)区和可变轻(V_L)区。V_H区和V_L区两者一起负责结合抗体所识别的抗原。

抗体包括完整的免疫球蛋白以及本领域公知的抗体的变体和部分，如单域抗体(例如VH结构域抗体)、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’₂片段、单链Fv蛋白(“scFv”)、和二硫化物稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过连接基团而结合，而在dsFvs中，这些链发生了突变，并引入二硫键来稳定链的结合(association)。术语“抗体”还包括基因工程形式如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和异源偶联抗体(如双特异性抗体)。也参见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，3^rd Ed.，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。

通常情况下，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键而相互连接的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，Lambda(λ)和Kappa(κ)。主要有五个确定抗体分子的功能活性的重链类(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE

每个重链和轻链包含恒定区和可变区，(该区也被称为“域”)。在组合中，重链和轻链可变区特异性结合抗原。轻、重链可变区包含被三个高变区间隔开的“骨架(framework)”区域，所述高变区也被称为“互补决定区”或“CDR”。根据Kabat等(见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health andHuman Services，1991)和ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(见Lefranc，Nucleic Acids Res 29：207-9，2001)限定骨架区和CDR的范围。IMGT和Kabat数据库可在线使用。不同的轻链或重链骨架区的序列在物种内(比如人类)是相对保守的。抗体的骨架区，即组成的轻链和重链的结合骨架区，用于在三维空间定位和对齐CDR。

CDR主要负责结合抗原表位。每个链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N-末端开始顺序编号，并且通常由特定CDR所位于的链来识别。因此，V_H CDR3(或H-CDR3)是位于其所被发现的抗体的重链的可变域，而V_LCDR1(或L-CDR1)则是来自其所被发现的抗体的轻链的可变域。以结合间皮素的抗体为例，其具有特异性V_H区和V_L区序列，并因此具有特异性的CDR序列。具有不同的特异性(即，对不同抗原的不同结合位点)的抗体有不同的CDR。虽然不同的抗体，其CDR是不同的，但在CDR内仅有有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。

引用“V_H”或“VH”指的是免疫球蛋白的重链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的重链)的可变区。引用“V_L”或“VL”指的是免疫球蛋白的轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单一克隆或由单一抗体的轻链和/或重链基因所转染到的细胞所产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法来制备，例如通过制备来自骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合的杂交抗体形成细胞来制备。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。

“嵌合抗体”包含来自两种或多于两种的不同抗体分子的结构元素，所述不同的抗体分子通常来源于不同动物物种。例如，嵌合抗体可以具有来自于一种物种(比如人类)的骨架残基，以及来自其它物种(如特异性结合间皮素的小鼠抗体)的CDR(其通常赋予抗原结合性)。

“人”的抗体(也被称为“全人源”抗体)包括人骨架区和来自于人的免疫球蛋白的所有的CDR。在一个实例中，所述骨架区和CDR来自相同起源的人重链和/或轻链的氨基酸序列。然而，来自于一个人抗体的骨架可以被设计成含有来自不同的人抗体的CDR。“人源化”的免疫球蛋白是含有人骨架区和一个或多个来自于非人(例如，小鼠、兔、大鼠、或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，而提供骨架的人的免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施例中，在人源化的免疫球蛋白中，全部CDR是来自于供体免疫球蛋白。恒定区无需存在，但如果它们存在，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即，至少约85-90％，如95％或更多是相同的。因此，人源化的免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR，其余的与自然的人免疫球蛋白序列的对应部分实质上相同。“人源化抗体”是包括人源化的轻链和重链的免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化的免疫球蛋白或抗体的受体骨架可以有来自于供体骨架的氨基酸的有限数目的置换。人源化或其它单克隆抗体可以具有额外的保守的氨基酸的置换，所述额外的保守的氨基酸的置换对于抗源结合或者其它免疫球蛋白的功能是实质上没有影响的。可以依靠基因工程的手段构建人源化的免疫球蛋白(如见美国专利号5,585,089)。

结合亲和力：抗体对于抗原的亲和力。在一个实施例中，亲和力可以通过Frankel等人(Mol.Immunol.，16：101-106，1979)所描述的Scatchard方法的修饰来计算。在另一实施例中，结合亲和力可以通过抗原/抗体的解离速率来测量。在另一实施例中，高结合亲和力也可以通过竞争放射免疫法测定。在另一实施例中，用ELISA法测定结合亲和力。“特异结合”抗原(如间皮素)的的抗体是以高亲和性结合所述抗原、但不与其它不相关的抗原显著地结合的抗体。

乳腺癌：形成于乳腺组织的一种癌症，通常在导管(输送牛奶到乳头的管)和小叶(产奶的腺体)形成。三阴性乳腺癌是指其中癌细胞不表达雌激素受体、孕激素受体、或显著水平的HER2/neu蛋白的一种乳腺癌。三阴性乳腺癌也被称为ER阴性PR阴性HER2/neu阴性乳腺癌。

化疗药物：在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中具有治疗有用性的任意化学试剂。这些疾病包括瘤、肿瘤、和癌症以及有增生性生长特点的疾病如牛皮癣。在一个实施方案中，化疗剂是用于治疗间皮瘤或其它肿瘤的试剂剂，所述其它肿瘤如为胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。在一个实施方案中，化疗试剂是放射性化合物。本领域技术人员可以容易地识别有用的化疗剂(如见Slapak和Kufe，Principles of Cancer Therapy，Harrison′s Principles of Internal Medicine的第86章，第14版；Perry等，Chemotherapy，Abeloff的Ch.17，Clinical Oncology20^nded.，Churchill Livingstone，Inc；Baltzer，L.，Berkery，R.(编)：Oncology Pocket Guide to Chemotherapy，第2版，St.Louis，Mosby-Year Book，1995；Fischer，D.S.，Knobf，M.F.，Durivage，H.J.(编)：The Cancer ChemotherapyHandbook，第4版，St.Louis，Mosby-Year Book，1993)。联合化疗是施用多于一种的试剂去治疗癌症。一个例子是，将结合间皮素的抗体(或免疫偶联物)与放射性或者化学化合物组合施用。

肝胆管型肝癌：一种发生在排列成(line)肝脏中的胆管的细胞中的癌症。

保守性变体：“保守性”氨基酸置换是实质上不影响或降低蛋白(例如间皮素的抗体)亲和性的那些置换。例如特异性结合间皮素的单克隆抗体，其可包括最多约1、约2、约5、约10或者约15个保守的置换并且特异性地结合间皮素多肽。术语“保守性变体”也包括使用经取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸(parent amino acid)，其前提是抗体特异性地结合间皮素。而非保守置换是降低活性或者对间皮素的结合性的置换。

提供功能相似氨基酸的保守性氨基酸置换表对本领域的普通技术人员来说是公知的。下面六组被认为是彼此保守置换的氨基酸的实例。

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

互补决定区(CDR)：是一起定义天然的免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力以及特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的重链和轻链各有三个CDR，分别命名为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。

接触：直接物理关联的放置；包括固体和液体形式。

细胞毒性：是相对于对生物体的其余的细胞，分子(如免疫毒素)对将要靶向的细胞的毒性。在一个实施例中，相比之下，“毒性”指的是免疫毒素对除免疫毒素的靶向部分所将要靶向的细胞之外的细胞的毒性，不同于那些对打算作为靶细胞的重组免疫毒素的一部分，而“动物毒性”指的是通过免疫毒素对除免疫毒素的所将要靶向的细胞之外的细胞的毒性，而引起的免疫毒素对动物的毒性。

简并变体：在本公开的上下文中，“简并变体”是指编码间皮素多肽或结合间皮素的抗体的多核苷酸，其包括作为遗传密码的结果的简并的序列。有20种天然氨基酸，其中大部分是由多于一个的密码子指定。因此，所有简并的核苷酸序列都包括在内，只要所述核苷酸序列所编码的、间皮素多肽或结合间皮素的抗体的氨基酸序列是不变的。

诊断：鉴定病理状况(诸如，但不限于癌症)的存在或性质。诊断方法的灵敏度和特异性是不同的。诊断试验的“灵敏度”是被检查出阳性的患病个体的百分比(真阳性率)。诊断诊断的“特异性”是1减去假阳性率，其中假阳性率被定义为没有患病却被检查出阳性的个体的比率。虽然特定的诊断方法可能无法提供对病症的明确诊断，但如果方法提供了积极的有助于诊断的指示那也是足够的。“预后”是病理状况(如癌症或转移(metastasis))发展(例如，严重程度)的可能性。

效应分子：旨在对嵌合分子所靶向的细胞产生理想的效果的所述嵌合分子的部分。效应分子也被称为效应部分(EM)、治疗剂、或诊断剂，或类似的术语。

治疗剂包括各种化合物，如核酸、蛋白质、多肽、氨基酸或其衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂类、碳水化合物、或重组病毒。核酸的治疗和诊断部分包括反义核酸，用于共价交联单或双链DNA的衍生的寡核苷酸，和三链形成寡核苷酸。可替代地，连接到靶向部分的分子，如抗间皮素抗体，可以是封装系统，例如含有治疗成分的脂质体或胶束，所述治疗成分(如药物、核酸(如反义核酸)或另一治疗性部分)可以被屏蔽而避免直接暴露在循环系统。制备连接有抗体的脂质体的手段对本领域技术人员来说是公知的(如见美国专利号4,957,735；和Connor等，Pharm Ther 28：341-365，1985)。诊断剂或诊断部分包括放射性同位素和其它可检测的标记。用于此类目的的可检测的标记也是本领域中公知的，且包括放射性同位素、荧光团、化学发光剂和酶，所述放射性同位素诸如为³⁵S、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、¹⁹F、^99mTc、¹³¹I、³H、¹⁴C、¹⁵N、⁹⁰y、⁹⁹Tc、¹¹¹In和¹²⁵I。

表位：抗原决定簇。这些是在具有抗原性的分子上的特定的化学基团或肽序列，即引起特异性免疫反应。抗体特异性结合多肽(如间皮素)上的特定的抗原表位。

骨架区：插入在CDR之间的氨基酸序列。骨架区包括可变轻链和可变重链骨架区。骨架区用于将CDR保持在适当的方向，用于与抗原结合。

宿主细胞：在其内载体可以增殖并且可以表达该载体DNA的细胞。所述细胞可以为原核细胞或者真核细胞。该术语也包括对象(subject)宿主细胞的任何后代。应当理解，，所有的后代可能不同于亲本细胞，因为可能在复制过程中发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，这样的后代都包括在内。

杂交瘤：用于生产单克隆抗体的杂交细胞。杂交瘤是通过将产生抗体的细胞(如从被免疫的动物(例如小鼠，大鼠或兔)中获得的B细胞)与骨髓瘤细胞进行融合而产生。

免疫应答：免疫系统的细胞对于刺激物的应答，如B细胞、T细胞、或单核细胞。在一个实施方案中，该应答是是特异于特定抗原抗原的(“抗原特异性应答”)。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，如CD4⁺或CD8⁺应答。在另一个实施方案中，该应答是B细胞应答，其结果是产生特异性抗体。

免疫偶联物：效应分子与抗体或其功能片段的共价连接。效应分子可以是可检测的标记或免疫毒素。特异性的非限制性毒素包括但不限于，相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE，如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或其经修饰的毒素，和其它直接或间接抑制细胞生长或杀伤细胞的毒性试剂。例如PE和DT它们都是高毒性化合物，通常通过肝脏中毒引起死亡。然而，通过除去毒素的原有的靶向组分(如PE的结构域Ia和DT的B链)并且用不同的靶向部分(例如抗体)代替它，可以将PE和DT修饰成用作免疫毒素的形式。“嵌合分子”是偶联(结合)至效应分子的靶向部分，例如配体或抗体。术语“偶联的”或“连接的”指的是使两个多肽形成相连的多肽分子。在一个实施方案中，抗体被连接到效应分子。在另一个实施方案中，连接到效应分子的抗体可以进一步连接到脂质或相对于蛋白质或肽的其它分子以增加其在体内的半衰期。连接方式可以是化学和重组方式。在一个实施方案中，所述连接是化学的，其中抗体部分和效应分子之间的反应已产生了在所述两个分子间形成的共价键，以形成一个分子。肽连接基团(短肽序列)可以任意地被包含在抗体和效应分子之间。因为免疫偶联物起初由两个具有分开的功能的分子(例如抗体和效应分子)所制备的，因此它们有时也被称为是“嵌合分子”。因此，如本文所使用的术语“嵌合分子”指的是偶联(结合)至效应分子的靶向部分，例如配体或者抗体。

分离的：“分离的”生物成分，如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器，已实质上从该成分所天然存在的环境(如：细胞)中的其他生物成分中分离或纯化出来，即，其它染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已被“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达所制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸。

标记：直接或间接地偶联到另一分子(如抗体或蛋白质，)的可检测的化合物或组合物，以有助于该分子的检测。标记的具体的非限制性的实例包括荧光标签、酶连接物、和放射性同位素。在一个例子中，“标记抗体”指的是在抗体中并入另一个分子。例如，标记是可检测的标记物，如并入放射性标记的氨基酸或附接生物素部分的多肽，所述生物素部分可以通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或比色方法进行检测的荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)来检测。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记的例子包括，但不限于下列：放射性同位素或放射性核素(例如³⁵S、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、¹⁹F、^99mTc、¹³¹I、³H、¹⁴C、¹⁵N、⁹⁰y、⁹⁹Tc、¹¹¹In和¹²⁵I)、荧光标记物(如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、镧系荧光粉)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基团、由次级报道基团(secondary reporter)(如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合域、表位标签)识别的预先确定的多肽表位、或磁剂，如钆螯合物。此外，通过各种长度的间隔臂来附接标记，以减少潜在的空间位阻。

连接基团：在某些情况下，连接基团是抗体结合片段内的肽(如Fv片段)，其用来间接地将可变重链和轻链进行结合。“连接基团”也可以指用于连接靶向部分(例如抗体)至效应分子(例如细胞毒素和可检测的标记)的肽。

术语“偶联”、“连入”、“结合”或“连接”是指使两个多肽成为一个相连的多肽分子，或将放射性核素或其它分子共价地连接到多肽(如scFv)。在特定的语境中，术语也可以指连接配体(如抗体部分)至效应分子。连接方式可以是化学方式或者重组方式。“化学方式”是指在抗体部分和效应分子之间的反应，该反应使得在所述两个分子间存在所形成的共价键，以形成一个分子。

肺癌：在肺的组织中，通常是在排列成(lining)呼吸道的细胞中形成的癌症。两种主要类型是小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。这些类型根据显微镜下观察细胞来进行诊断。

哺乳动物：该术语包括人类和非人类的哺乳动物。同样，术语“对象”包括人和兽医对象。

间皮素：是40kDa的细胞表面糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的糖蛋白。人类间皮素蛋白首先被合成为70kD的前体，然后将其进行蛋白水解加工。间皮素的30kD的氨基末端被分泌，并被称为巨核细胞促进因子(Yamaguchi等，J.Biol.Chem.269：805 808，1994)。40KD的羧基末端任然结合在膜上，作为成熟的间皮素(Chang等，Natl.Acad.Sci.USA 93：136 140，1996)。示例性的间皮素的核酸和氨基酸序列的描述见PCT公开号WO 97/25,068；美国专利号6,083,502；Chang和Pastan，Int.J.Cancer 57：90，1994；Chang和Pastan，Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：136，1996；Brinkmann等，Int.J.Cancer 71：638，1997；和Chowdhury等，Mol.Immunol.34：9，1997。人的间皮素氨基酸序列在本文中列示为SEQ ID NO：9。间皮素也可以指保留在细胞内的间皮素蛋白或多肽，以及分泌的和/或分离的间皮素蛋白。

间皮瘤：是一类衍生于胸膜和腹膜的衬细胞的肿瘤，间皮瘤可以生长成覆盖内脏的厚片层(thick sheet)，并由梭形细胞或纤维组织构成，其可以围住(enclose)由立方细胞所排列成的腺样空间。间皮瘤通常起源于排列成肺、心脏或腹部的组织。在某些情况下，间皮瘤也可以由暴露于石棉所引起。

MORAb-009：嵌合(鼠/人)单克隆IgG/κ，其对间皮素具有高亲和力和特异性。鼠抗间皮素scFv的VH和VL区通过淘选自小鼠的脾的mRNA制成的噬菌体展示文库来获得，其中所述小鼠是经间皮素阳性细胞上的间皮素cDNA进行免疫的。VH和VL区被接枝(grafted)到具有人类IgGl和κ恒定区的框架中(Hassan和Ho，Eur J Cancer 44(1)：46-53，2008)。

瘤形成、恶性肿瘤、癌症或肿瘤：瘤形成是过度的细胞分裂所导致的组织或细胞的异常生长。瘤的生长可以产生肿瘤。在个体中肿瘤的数量是“肿瘤负荷”，其可测量为肿瘤的数量、体积、或重量。没有转移的肿瘤被称为是“良性的”。侵入周围组织和/或可以转移的肿瘤被称为是“恶性的”。血液肿瘤的实例包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性粒细胞白血病、和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高级形式)、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体肿瘤(如肉瘤和癌)的例子，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、和其它肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、胆管癌、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤(Wilms′tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌，和中枢神经系统肿瘤(如一个神经胶质瘤，星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤，成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑色素瘤，神经母细胞瘤、和视网膜母细胞瘤)。

在一些例子中，癌症是间皮瘤、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、乳腺癌或卵巢癌。

可操作连接：当以与第二核酸序列成功能关系的方式放置第一核酸序列时，所述第一核酸序列可操作地与所述第二核酸序列进行连接。例如，启动子，如CMV启动子，如果该启动子影响编码序列的转录或表达，其就可以可操作地连接到编码序列上。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并在同一个阅读框下，必须连接两个蛋白编码区。

卵巢癌：在卵巢(卵子或卵在其内形成的雌性生殖腺体对中的一个)组织形成的癌症。大多数卵巢癌是卵巢上皮性癌(起源于卵巢表面上的细胞的癌)或恶性生殖细胞肿瘤(始于卵细胞的癌症)。

胰腺癌：其中恶性肿瘤(癌)细胞在胰腺组织中发现的疾病。也叫外分泌腺癌。

药物试剂：当适当地施用于受试对象或细胞时能够诱导所需疗效或者预防效果的化学化合物或组合物。

药学上可接受的载体：使用药学上可接受的载体是常见的。在E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版，1975中描述了适合本发明公开的抗体的药物递送的组合物和制剂。

在一般情况下，载体的性质取决于所使用的施用的特定方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，其包括药物学上和生理学上可接受的液体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等作为载体(vehicle)。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂、或胶囊的形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如，药物级甘露醇、乳糖、淀粉、或硬脂酸镁。除了生物学上的中性载体外，被施用的药物组合物也可以包含少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂、和pH缓冲剂等，如醋酸钠或山梨醇单月桂酸酯。

预防、治疗或改善疾病：“预防”是指抑制疾病的全过程发展。“治疗”是指在疾病开始发展后改善疾病或病理状态的迹象或症状的治疗干预，如使肿瘤负荷或疾病的转移的大小和数目的减少。“改善”则是指降低疾病(如癌症)的迹象或症状的数量或严重程度。

前列腺癌：在前列腺组织(在男性生殖系统的腺体，位于膀胱的下面和直肠的前面)中形成的癌症。前列腺癌通常发生于老年男性。

纯化：该术语“纯化的”不是要求绝对的纯度；相反，它意在作为相对性的概念。因此，例如，纯化的肽制品是指肽或蛋白质在该制品中比在细胞内的所述肽或蛋白质的自然环境中更富集。在一个实施方案中，纯化制品，以使蛋白质或肽代表制品的至少50％的总肽或蛋白质含量。实质纯化表示从其它蛋白和细胞成分的纯化。实质纯化的蛋白质是至少60％、70％、80％、90％、95％或98％纯的。因此，在一特定的非限制性的例子中，实质纯化的蛋白质是90％的不含其它蛋白质或细胞成分的蛋白质。

重组：重组核酸是指具有不是自然产生的序列或具有通过人工组合两个原本分离的序列片段而制成的序列。人工组合通常是通过化学合成或人工的对分离的核酸片段进行操作，例如，通过基因工程技术来完成。

重组毒素：是其中细胞靶向部分被融合到毒素的嵌合蛋白(Pastan等，Science，254：1173-1177，1991)。如果所述细胞靶向部分是抗体的Fv部分，则该分子被称为重组免疫毒素(Chaudhary等，Nature，339：394-397，1989)。毒素部分被从基因上改变以使其不能与存在于大部分正常细胞上的毒素受体结合。重组免疫毒素选择性地杀死抗原结合结构域所识别的细胞。这些重组毒素和重组免疫毒素可用于治疗癌症，例如，表达间皮素的癌症。

样本(或生物样本)：从受试对象中获得的含有基因组DNA、RNA(包括mRNA)、蛋白、或其组合物的生物样品。实例包括，但不限于，外周血、组织、细胞、尿液、唾液、组织活检、细针抽吸物、手术标本和尸检材料。在一个实例中，样品包括肿瘤活检样本，例如，肿瘤活检样本。

序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性是根据序列之间的相似度来表示，又称为序列同一性。序列同一性普遍根据同一性百分比来衡量(或相似性或同源性)；百分比越高，表示两个序列越相似。当利用标准的方法进行比对时，多肽或核酸分子的同源物或变体将具有比较高的序列同一性程度。

用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。许多软件和比对算法被描述在Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988；Higgins和Sharp，Gene 73：237，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151，1989；Corpet等，Nucleic Acids Research 16：10881，1988；和Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988。Altschul等，Nature Genet.6：119，1994，提出了对序列比对方法和同源性计算的详细的考虑。

NCBI基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990)可以经几个来源使用，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和在互联网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。在互联网上的NCBI上网站上提供了如何使用该程序确定序列一致性的说明。

在将gapped blastp设置为默认参数，使用NCBI Blast 2.0进行与抗体氨基酸序列的全长比对时，特异性地结合间皮素或其片段的抗体的V_L和V_H的同源物和变体具有以下典型特征：该同源物或变体与抗体具有至少约75％、例如至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的计算的序列同一性。对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，利用BLAST 2的序列功能，以默认的BLOSUM62矩阵作为默认参数(缺口存在值(gap existence cost)为11，每一残基缺口存在值为1)。当比对短的肽时(少于约30个氨基酸)，比对应当采用设置为默认参数(开放空缺(open gap)9，扩展空缺(extension gap)1罚分)的PAM30矩阵，利用BLAST 2的序列函数来进行。当采用以上方法进行评估时，与参考序列具有更大的相似性的蛋白将显示增加的百分比同一性，如至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％的序列同一性。当对比整个序列小的序列进行序列同一性比对时，通过采用10-20个氨基酸的短窗口的比对方式，同源物和变体将通常至少具有80％的序列同一性，并且取决于它们与参考序列的相似性，其序列同一性可以为至少85％、90％或95％。在互联网上的NCBI网站上通过这样的短窗口来确定序列一致性的方法是可行的。本领域技术人员可以理解的是，所给出的这些序列一致性范围仅是指导性的；落在给定的范围外的非常显著的同源物也可以被获得，这是完全有可能发生的。

鳞状细胞癌：自复层鳞状上皮形成的恶性肿瘤，其也可能在通常存在腺上皮或柱状上皮的诸如支气管黏膜等位置发生。鳞状细胞癌是皮肤癌最常见的类型。

SS1P：由连接到截短的假单胞菌外毒素的抗间皮素Fv(与MORAb-009相同的Fv)构成的重组免疫毒素，其介导细胞杀伤(Chowdhury和Pastan，NatBiotechnol 17：568-572，1999；Pastan等，Nat Rev Cancer 6：559-565，2006)。SS1P，又名Cat-5001，其对于表达间皮素的细胞系具有细胞毒性，在裸鼠体内导致表达间皮素的肿瘤异种移植物的完全消退，对人的癌症患者的细胞也具有细胞毒性(Hassan等，Clin Cancer Res 10：3937-3942，2001；Hassan等，ClinCancer Res 8：3520-3526，2002)。

胃癌：在排列成胃的组织内形成的癌症，也称为胃癌(gastric cancer)。

受试对象：活的多细胞脊椎动物的生物体，其是包括人和兽医对象的类别，包括人类和非人类的哺乳动物。

合成：由人工手段在实验室制备，例如单克隆抗体是通过杂交瘤技术制备或自cDNA构建体进行表达。

治疗有效量：对于正被治疗的对象，特定的物质的量足够获得理想的治疗效果。例如，这可以是抑制或阻碍肿瘤的生长所必需的量。在一个实施方案中，治疗有效量是消除肿瘤、减少肿瘤的尺寸，或防止肿瘤转移的必须量。当对受试对象施用时，一般使用达到靶组织中(例如，肿瘤中)的浓度的剂量，其中所述靶组织中的浓度已展现了可以实现理想的体外效果。

毒素：是对于细胞有细胞毒性的分子。毒素包括相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、皂草素(saporin)、局限曲霉素(restrictocin)或白树毒素，或它们的经修饰的毒素。例如PE和DT它们都是高毒性化合物，通常通过肝脏中毒而引起死亡。然而，通过除去毒素的原有的靶向组分(如PE的结构域Ia或DT的B链)并且用不同的靶向部分(例如抗体)代替它，可以将PE和DT修饰成成用作免疫毒素的形式。

载体：如引入到宿主细胞中的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可以含有允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体还可以包括一个或多个可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元素。

除非另有说明，本发明所使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员的通常理解的相同的含义。除非文中另有明确说明，单数术语“a”、“an”和“the”包括复数个事物，“包括A或B”意为包括A、或B、或者A和B。可以进一步理解的是，对核酸或多肽给出的所有的碱基尺寸或氨基酸尺寸，和所有的分子量或分子质量值都是近似的，并且是出于说明的目的提供的。尽管与本发明所述的相似的或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下文描述了合适的材料和方法。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料都通过引用整体结合入本发明。如有冲突，以本说明书，包括术语的解释为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，不构成对本发明的限制。

III.介绍

目前正在评估抗间皮素的单克隆抗体对间皮瘤和多种其它形式的癌症的治疗效果，并且针对间皮素的单克隆抗体对于固体肿瘤展现出了很好的临床开发前景。已证明，针对间皮素的抗体通过基于免疫毒素抑制肿瘤生长以及诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)而起作用。然而，补体-依赖性细胞毒性(CDC)对这些抗体是无效的，而该补体-依赖性细胞毒性被认为是抗肿瘤的治疗性抗体的最重要的细胞杀伤机制之一。本发明公开了利用噬菌体展示抗体工程技术和合成肽筛选来鉴定针对间皮素的人的单域抗体SD1。SD1识别接近细胞表面的间皮素C-末端的构象表位(SEQ ID NO：9的残基539-588)。还鉴定了识别全长间皮素的单域抗体SD2。为了研究作为潜在的治疗剂的SD1，制备了重组的人的Fc(SD1-hFc)融合蛋白。针对表达间皮素的肿瘤细胞，除ADCC的活性之外，SD1-hFc蛋白还展现了强的CDC活性。此外，在裸鼠中，SD1-hFc蛋白引起了对肿瘤异种移植物的很强的肿瘤生长抑制。SD1是第一个靶向表达间皮素的肿瘤的人的单域抗体。本文所公开的结果表明SD1可以作为癌症的治疗剂，并且与当前的以表达间皮素的肿瘤为靶点的抗体治疗相比，其具有很大的优势。

IV.间皮素特异性单克隆抗体

本发明公开了SD1和SD2，其是特异于间皮素的人单域抗体。与以前曾经报道的间皮素特异性治疗性抗体相比，SD1识别在间皮素C-末端的构象表位。当融合的人Fc后，针对表达间皮素的肿瘤细胞，SD1引发强烈的CDC和ADCC作用。本文也证实了SD1-hFc在表达间皮素的癌症的小鼠异种移植模型体内抑制肿瘤生长。SD2识别间全长皮素，但不结合间皮素的C-末端片段。SD1和SD2的核苷酸和氨基酸序列如下所示.

SD1的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)：

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGATTTCGATTTCGCTGCTTATGAAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAAGGCCTTGAGTGGGTGGCAATTATACACATCATCCAATCGATAAATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTTTAAGGCTTGGTGCTGTAGGCCAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAAGT

SD1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASDFDFAAYEMSWVRQAPGQGLEWVAIISHDGIDKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTATYYCLRLGAVGQGTLVTVSSS

表1 SD1中CDR的位置(SEO ID NO：2)

体系	CDR1	CDR2	CDR3
				Kabat	31-35	51-66	99-102
IMGT	26-35	51-58	97-103

SD2的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)：

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGATTTCGCTTTCGATGATTATGAAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGCCCTTGAGTGGATTGGGGACATCAATCATAGTGGAACCACCATCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCATATATTACTGTGCGAGACCTCACTACGGTGACTACTCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAAGT

SD2的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)：

QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASDFAFDDYEMSWVRQAPGKALEWIGDINHSGTTIYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAIYYCARPHYGDYSDAFDIWGQGTMVTVSSS

表2 SD2中CDR的位置(SEQ ID NO：15)

体系	CDR1	CDR2	CDR3
				Kabat	31-35	50-65	99-106
IMGT	26-33	51-57	96-111

本发明提供了分离的结合(例如，特异性结合)间皮素(如细胞表面或可溶性间皮素)的单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体的VH结构域包括在此作为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：15所阐述的氨基酸序列的至少部分，如一个或多个(如全部三个)通过IMGT确定的CDR序列，该CDR序列来自SEQID NO：2或SEQ ID NO：15。在其它实施方案中，该抗体包含一个或多个(如全部三个)使用Kabat方法确定的CDR序列，该CDR序列来自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：15。

在一些实施方案中，该抗体的VH结构域含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基26-35、51-58和97-103。在其它实施方案中，该抗体的VH结构域含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基31-35、51-66和99-102。在一些例子中，该抗体的VH结构域与SEQ ID NO：2至少有90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在特定的实施方案中，抗体的VH结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2，或者由SEQ ID NO：2构成。

在其它实施方案中，该抗体的VH结构域含有SEQ ID NO：15的氨基酸残基26-33、51-57和96-111。在其它实施方案中，该抗体的VH结构域含有SEQ ID NO：15的氨基酸残基31-35、50-65和99-106。在一些实施方案中，该抗体的VH结构域与SEQ ID NO：15有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在具体的实施方案中，抗体的VH结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：15，或者由SEQ ID NO：15构成。

在一些实施方案中，结合(如特异性结合)间皮素的单克隆抗体，是单域抗体。

在一些实施方案中，结合(如特异性结合)间皮素的单克隆抗体，是Fab片段、Fab′片段、F(ab)′₂片段、单链可变片段(scFv)、或二硫化物稳定的可变片段(dsFv)。在其它实施方案中，抗体为免疫球蛋白分子。在特定的实施方案中，抗体为IgG。

在一些实施方案中，单克隆抗体是嵌合的或合成的。

在一些实施方案中，所公开的抗体以以下的解离常数(K_d)结合间皮素(可溶性或细胞表面的间皮素)：约20nM或更小，例如约18nM或更小、16nM或更小、14nM或更小、12nM或更小、或10nM或更小。在一些实施方案中，所述单克隆抗体以以下的结合亲和力结合间皮素：约20nM、约19nM、约17nM、约16nM、约15nM、约14nM、约13nM、约12nM、约11nM、或约10nM。

本发明公开的单克隆抗体可被标记，如用荧光标记、酶标记或放射性标记。

本发明还公开了免疫偶联物，该免疫偶联物包括本发明公开的单克隆抗体和效应分子。效应分子可以是例如毒素或可检测的标记。在一些实施方案中，免疫偶联物包括本发明公开的VH结构域(如包含SD1或SD2的CDR序列的VH结构域，或包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH结构域)和毒素，所述毒素是如PE或其变体，如PE38。在具体的实施方案中，免疫偶联物包括融合到PE38的SD1或SD2VH。在一些实施方案中，毒素是PE38，其包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。免疫偶联物的例子在下面第VI部分中进行了更详细的讨论。

本发明还提供了包括本发明公开的抗体和异源蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，异源蛋白为Fc蛋白。在一个非限制的例子中，Fc蛋白是人的Fc蛋白，如人的IgGγl Fc。

本发明还提供了组合物，该组合物包括治疗有效量的所公开的抗体、免疫偶联物或融合蛋白，以及药学上可接受的载体。

本发明还提供编码被公开的单克隆抗体、免疫偶联物和融合蛋白的分离的核酸分子。在一些实施例中，编码单克隆抗体的VH结构域的核酸序列包含SEQ ID NO 1中的至少部分，如编码抗体的一个或多个CDR的部分。在一些例子中，单克隆抗体的VH结构域被包含SEQ ID NO：1的序列所编码。在其他实施方案中，编码单克隆抗体VH结构域的核酸序列包含SEQ ID NO 4中的至少部分，如编码抗体的一个或多个CDR的部分。在一些例子中，单克隆抗体的VH结构域被包含SEQ ID NO：14的序列所编码。

在一些例子中，分开的核酸分子可操作地连接到启动子。

本发明还提供了包含本文所公开的分离的核酸分子的表达载体。本发明还提供了包括核酸分子或载体的分离的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为T细胞，如细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)。

V.抗体和抗体片段

本发明公开的单克隆抗体可以为任何同种型。单克隆抗体可以是例如IgM或IgG抗体，如IgG₁或者IgG₂。根据公认的过程，特异性结合间皮素的抗体类别可与另一类别进行转换(例如，IgG可以转换成IgM)。类别转换也可以用于将一种IgG亚类转换为另一亚类，如从IgG₁转换为IgG₂。

抗体片段也包括在本公开中，如单域抗体(例如，VH结构域抗体)、Fab、F(ab′)₂、和Fv。这些抗体片段保留与抗原选择性结合的能力。这些片段包括：

(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可通过木瓜蛋白酶对整个抗体进行消化而产生完整的轻链和一个重链的部分来制备；

(2)Fab′，该抗体分子片段可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，随后通过还原而产生完整的轻链和重链的部分来获得；每分子抗体可以获得两个Fab′片段；

(3)(Fab′)₂，该抗体分子片段可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，随后不进行还原来获得；F(ab′)₂是通过二硫键将两个Fab′片段连接的二聚体；

(4)Fv，为基因工程片段，其含轻链的可变区和的重链可变区，表达为两条链；

(5)单链抗体(例如scFv)，其为基因工程分子，含有轻链可变区，重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽连接基团连接成基因融合的单链分子；

(6)单链抗体的二聚体(scFV₂)，其被定义为scFV的二聚体(也称为“微型抗体”)；

(7)VH单域抗体，由重链可变区构成的抗体片段。

制备这些片段的方法在本领域中是已知的(如见Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约，1988)。

在某些情况下，抗体片段可以通过抗体蛋白水解作用或通过编码所述片段的DNA的在宿主细胞(如大肠杆菌)的表达来制备。抗体片段可以通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶通过常规方法消化整个抗体来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶切割抗体以提供表示F(ab′)₂的5S片段来制备。通过使用硫醇还原剂和可选择性的源自二硫键断裂的巯基的保护基团，这个片段可以被进一步切割，以产生3.5S Fab′单价片段。可替代地，采用胃蛋白酶的酶切割也可以直接产生两个单价Fab’片段和Fc片段。(见美国专利号4,036,945和美国专利号4,331,647)。

也可以使用其它切割抗体的方法(如分离(separation)重链以形成单价轻-重链片段，之后该片段被进一步切割)或其它酶、化学和遗传技术，只要该片段与完整的抗体所识别的抗原的片段结合即可。

技术人员将认识到，可以产生抗体的保守变体。抗体片段中所用的保守变体(如dsFv片段或scFv片段)将保留对于V_H和V_L区之间的正确折叠和稳定所必须的关键的氨基酸残基，并将保留残基的电荷特性，以保持分子的低pI和低毒性。可以在VH和/或VL区中进行氨基酸的置换(如最多一个、最多两个、最多三个、最多四个、或最多五个氨基酸置换)，以增加产率。提供功能相似的氨基酸的保守氨基酸置换表是本领域技术人员已知的。下面六组是被认为可以相互保守置换的氨基酸的实例：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

VI.免疫偶联物和融合蛋白

所公开的特异于间皮素的单克隆抗体可以偶联到治疗试剂或效应分子。免疫偶联物包括但不限于，分子内有治疗试剂与抗体的共价键连接的分子。治疗试剂是具有特定的生物活性的试剂，所述特定的生物活性针对特定的靶分子或具有靶分子的细胞。本领域技术人员将理解，目前有治疗试剂有多种，包括各种药物，如长春花碱、柔红霉素等药物；细胞毒素如天然的或修饰的假单胞菌外毒素或白喉毒素；胶囊剂(如脂质体)，所述胶囊剂本身包含药物组合物；放射性试剂如¹²⁵I、³²P、¹⁴C、³H和³⁵S，以及其它标记、靶标部分和配体。

特定的治疗剂的选择取决于特定的靶分子或靶细胞，以及所需的生物学作用。因此，例如，该治疗剂可以是细胞毒素，用来实现特定靶细胞(如肿瘤细胞)的凋亡。相反地，如果需要引起一种非致命的生物反应，该治疗剂可以偶联非致命药剂或偶联含有非致命药剂的脂质体。

利用本发明所述的治疗剂和抗体，本领域技术人员可以很容易地构建各种含有功能上等同的核酸的克隆，如具有不同的序列，但可以编码相同的效应部分或抗体序列的核酸。因此，本发明提供了编码抗体和偶联物及其融合蛋白的核酸。

利用本领域技术人员已知的任何数目的手段，可以将效应分子连接到目标的抗体上。共价的和非共价的连接方式都可以使用。将效应分子连接于抗体上的步骤根据效应分子的化学结构而改变。多肽通常含有多种官能团；如羧酸(COOH)、游离氨基(-NH₂)或巯基(-SH)基团，其用于与抗体上的合适的官能团反应以产生效应分子的结合。可替代地，将抗体衍生化，以暴露或连接额外的反应官能团。衍生化可以涉及许多已知的连接基团分子的任一个的连接。连接基团可以是用于将抗体连接于效应分子上的任意分子。连接基团能够同时与抗体和效应分子形成共价键。合适的连接基团对本领域技术人员来说是已知的，包括但不限于：直链或支链碳连接基团，杂环碳连接基团或肽连接基团。当抗体和效应分子为多肽时，连接基团可以通过它们的侧基(如通过与半胱氨酸的二硫键)连接到组成的氨基酸或末端氨基酸的α-碳的氨基和羧基基团。

在某些情况下，当免疫偶联物已到达了靶位点时，将效应分子自抗体释放是较为理想的情况。因此，在这种情况下，免疫偶联物将包括在靶位点附近可切割的键。用于自抗体释放效应分子的连接基团的裂解(cleavage)可以通过酶活性或免疫偶联物在靶细胞内或靶点的附近所经受的条件来引起。

鉴于对连接多种放射性诊断的化合物、放射性治疗化合物、标记(如酶或荧光分子)药物、毒素和其它试剂到抗体的各种方法已有大量的报道，所以本领域技术人员将能够确定用于将给定的试剂连接到抗体或其它多肽的合适的方法。

本文所公开的抗体或抗体片段可以被衍生或连接到另一个分子(如另一个肽或蛋白质)。在某些情况下，抗体或抗体片段(如VH结构域)与异源蛋白(例如Fc蛋白)融合。

在一般情况下，抗体或其部分被衍生化，这样对靶点抗原的结合就不会受到衍生化或标记的不利影响。例如，抗体可以功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价连接等)到一个或多个其它分子实体，如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、检测试剂、药物学上的试剂、和/或蛋白质或肽，该蛋白质或肽可调节抗体或抗体部分与另一分子(如链霉亲和素核心区或聚组氨酸标签)的连接。

一类衍生化的抗体通过交联两个或多于两个的抗体(同类型的或不同类型的，如产生双特异性抗体)而产生。合适的交联剂包括那些异双功能的、具有被适当的隔离部分(spacer)分开的两个截然不同的反应基团的交联剂(如间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，或者那些同双功能的的交联剂(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)。这些连接基团是市售的。

结合(例如特异性结合)间皮素的抗体或其片段可用可检测部分标记。有用的检测试剂包括荧光化合物、包括荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明，5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系荧光粉等。生物发光标记物也使用，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)。抗体也可以标记可用于检测的酶，如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等。当抗体被用可检测的酶进行标记时，其可以通过添加酶用来生成可以被识别的反应产物所使用的额外试剂来进行检测。例如，当试剂辣根过氧化物酶存在时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺时，导致可见的有色反应产物。抗体也可以用生物素进行标记，通过间接测量抗生物素蛋白或链酶亲和素的结合进行检测。应该指出的是，抗生物素蛋白本身可以被酶或荧光标记物标记。

抗体可以被磁剂标记，如钆。抗体也可以被镧系元素(如铕和镝)、和锰所标记。顺磁颗粒如超顺磁性氧化铁也可以作为标记使用。抗体也可以被预先确定的、次级报道基团(如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)所识别的多肽表位所标记。在一些实施例中，通过各种长度的间隔臂来连接标记，以减少潜在的空间位阻。

抗体也可以被放射性标记的氨基酸所标记。放射性标记可用于诊断和治疗。例如，放射性标记可通过x-ray、发射光谱和其它诊断技术来检测间皮素。用于多肽的标记的例子包括但不限于以下的放射性同位素或放射性核素(radionucleotide)：³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I。

抗体也可以被化学基团如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或碳水化合物基团衍生化。这些基团有助于提高抗体的生物学特性，例如增加的血清半衰期或增加组织结合力。

毒素可以与本文所描述的单克隆抗体一起使用，以生成免疫毒素。典型的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素及其亚单位，以及A-F型肉毒杆菌毒素。这些毒素已经可以很容易地通过商品渠道(例如Sigma ChemicalCompany，St.Louis，MO)获得。预期的毒素也包括本文所描述的毒素变体(例如见美国专利号5,079,163和4,689,401)。在一个实施方案中，毒素是假单胞菌外毒素(PE)(美国专利号5,602,095)。本发明所使用的“假单胞菌外毒素”是指全长天然的(自然生成的)PE或已被修饰的PE。所述的修饰包括但不限于：结构域Ia的消除，结构域Ib、II和III中的多种氨基酸的删除、单个氨基酸的置换和在羧基末端添加一个或更多个的序列(例如见Siegall等，J.Biol.Chem.264：14256-14261，1989)。

与本文描述的单克隆抗体一起使用的PE包括天然序列、天然序列的细胞毒性片段和天然PE及其细胞毒性片段的保守修饰的变体。PE的细胞毒性片段包括那些具有细胞毒性的、经过或未经过随后的在靶细胞内的蛋白水解或其它处理的片段。PE的细胞毒性片段包括PE40、PE38和PE35。PE及其变体的附加说明见例如美国专利号4,892,827；5,512,658；5,602,095；5,608,039；5,821,238；和5,854,044；PCT公开号WO 99/51643；Pai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3358-3362，1991；Kondo等，J.Biol.Chem.263：9470-9475，1988；Pastan等，Biochim.Biophys.Acta 1333：C1-C6，1997。

全长PE序列在此阐明为SEQ ID NO：3：

AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQTQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK

在一些实施例中，PE是PE38，包括如下氨基酸序列：

GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ IDNO：4)

在此还考虑了抗蛋白酶的PE变体和具有降低的免疫原性的PE变体，例如，但不限于PE-LR、PE-6X、PE-8X、PE-LR/6X和PE-LR/8X(见例如Weldon等，Blood 113(16)：3792-3800，2009；Onda等，Proc Natl Acad Sci USA 105(32)：11311-11316，2008；和PCT公开号WO 2007/016150，WO 2009/032954和WO2011/032022)。

在一些实例中，PE是抵抗溶酶体降解的变体，如PE-LR(Weldon等，Blood113(16)：3792-3800，2009；PCT公开号WO 2009/032954)，氨基酸序列如下所示：

RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO：5)

在其它的实施例中，PE是定名为PE-LR/6X的变体(PCT公开号WO2011/032022)，其具有如下所示的氨基酸序列：

RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO：6)

在其它的实施例中，PE变体是具有降低的免疫原性的PE，例如具有如下氨基酸序列的PE：

RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGXVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEXGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWXGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAXGRIRNGALLRVYVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDXEXAISALPDYASQPGKPPREDLK(X＝G，A或S；SEQ ID NO：7)

在其它的实施例中，PE是定名为PE-LR/8M的变体(PCT公开号WO2011/032022)，其具有如下所示的氨基酸序列：

RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGAVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEAAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO：8)

在此，通过参照本文中阐明为SEQ ID NO：3的全长PE氨基酸序列，来定义PE的置换。在本文中，通过参考存在于特定位置的氨基酸残基，接着是在特定的置换中用来替换该残基的氨基酸，来描述PE的置换。在这方面，PE的特定实施方案的氨基酸序列的位置在此被称为特定实施方案的氨基酸序列位置，或被称为SEQ ID NO：3限定的位置。因此，替换指的是对应SEQID NO：3的613-氨基酸序列的指定位置的、PE的特定实施方案的氨基酸序列中的氨基酸残基的替换，并且可以理解在各氨基酸序列中实际位置可能不同。在两个或多于两个位置的多个置换的情况下残，除非有详细的说明，两个或多于两个的置换可以是相同的或是不同的-两个或多于两个的被置换的氨基酸残基中的每个氨基酸残基可以用相同的或不同的氨基酸基来置换。

对PE的修饰可以发生在任何前述的变体中，包括PE的细胞毒性片段(例如，PE38、PE-LR和PE-LR/8M)。被修饰的PE可包括上述的任何对PE的一个或多个T细胞表位和/或B细胞表位内的一个或多个氨基酸残基的任意置换。

本发明所描述的抗体也可用于将任何数量的作为诊断或治疗的化合物靶向到在细胞表面表达间皮素的细胞上。因此，本公开的抗体可以间接连接或通过连接基团连接药物，该药物被直接传送到表达细胞-表面间皮素的细胞。这样就可以用于治疗、诊断或研究的目的。治疗试剂包括化合物，如核酸、蛋白质、多肽、氨基酸或其衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂类、碳水化合物、或重组病毒。核酸的治疗和诊断部分包括反义核酸、用于与单或双链DNA共价交联的衍生的寡核苷酸，以及三链形成的寡核苷酸。

另外，连接有抗间皮素抗体的分子可以是封装系统，例如脂质体或胶束，其包含治疗成分，如药物、核酸(例如，反义核酸)或其它可以被屏蔽而避免直接暴露在循环系统的治疗部分。制备连接有抗体的脂质体的方法是本领域技术人员已知的(见例如美国专利号4,957,735；Connor等，Pharm.Ther.28：341-365，1985)。

本发明描述的抗体也可共价或非共价连接一个可检测的标记。适合于这种用途可检测的标记包括任何通过以下方法可检测的成分：光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学和化学的方法。有用的标记包括磁珠、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、若丹明，绿色荧光蛋白等)，放射性标记物(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)，酶类(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA中的酶)，和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。

检测这些标记的方法是本领域技术人员所熟知的。因此，例如，放射性标记物可以使用照相胶片或闪烁计数器来检测，荧光标记物可以用光检测器来检测，以检测发出的光。酶标记物通常是通过对酶提供底物，和依靠酶对于底物的作用来检测所产生的反应产物来进行检测，比色标记是通过简单地使有色标记可视化来检测。

VII.组合物和使用方法

本发明提供组合物，其包括在载体中的一个或多个所公开的结合(例如，特异性结合)间皮素的抗体。还提供了包括融合蛋白、免疫偶联物或免疫毒素的组合物。组合物以用于施用于受试对象的单位剂量形式来制备。施用量和时间由治疗的临床医师决定，以获得理想的结果。抗体可以被配制用于全身或局部(如肿瘤内部)施用。在一个实例中，抗体被配制成用于肠胃外施用，如静脉内施用。

用于施用的组合物包括被溶解在药物学上可接受的载体中的抗体的溶液，如水性载体。可以使用各种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的且通常没有不期望的物质。这些组合物采用常规的、公知的灭菌技术进行杀菌。组合物也可以按照接近生理条件的要求而包含在药物学上可接受的辅助物质，如pH调节剂、缓冲剂、和毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、和乳酸钠等。在这些制剂中抗体的浓度可以有很大不同，主要是根据液体体积、粘度、和体重等并按照所选的特定施用方式以及受试对象的需要进行选择。

用于静脉内施用的典型药物组合物包括每一受试对象每天约0.1至10mg抗体。每一受试对象每天可用剂量是从0.1mg最高到约100mg，特别地如果试剂被施用在隔离位点且有进入循环或淋巴系统的情况，如进入体腔或器官内腔内。用于制备可施用的组合物的实际方法对本领域技术人员而言是已知的或明显的，更详细的描述见如Remington′s Pharmaceutical Science，第19版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1995)等出版物。

虽然抗体可以是以已知浓度的无菌溶液的形式提供，在施用前，抗体可以以冻干的形式提供并用无菌水再水化。将抗体溶液加入到含0.9％NaCl、USP的输液袋中，并且在某些情况下以0.5-15mg/kg的体重的剂量施用。自从在1997年批准后，在本领域中在施用已经在美国上市的抗体药物方面有许多丰富的经验是可以使用的。抗体可以通过缓慢输注施用，而不是静脉推注或团注的施用。在一个实施方案中，以较高的负荷剂量施用，随后，再以低水平的维持剂量施用。例如以4mg/kg的初始负荷剂量注入约90分钟，如果对之前的剂量耐受性良好，随后每周维持剂量2mg/kg注入30分钟，持续4-8周。

控制释放的胃肠外制剂可被制成移植物、油性注射剂、或微粒系统。对于蛋白质传送系统的广泛的概述见Banga，A.J.，Therapeutic Peptides andProteins：Formulation，Processing，and Delivery systems，Technomic PublishingCompany，Inc.，Lancaster，PA，(1995)。微粒系统包括微球、微粒子、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有治疗性蛋白(如细胞毒素或药物)作为核心。在微球体中治疗剂分散在整个粒子中。小于约1μm的粒子、微球和微胶囊通常被称为纳米颗粒，纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径为约5μm，这样只有纳米颗粒可以通过静脉施用。微粒子的直径通常为大约100μm，需要在皮下或肌内施用。例如见Kreuter，J.，Colloidal Drug Deliverysystems，J.Kreuter编，Marcel Dekker，Inc.，纽约，NY，第219-342页(1994)；和Tice&Tabibi，Treatise on Controlled Drug Delivery，A.Kydonieus编，MarcelDekker，Inc.纽约，NY，第315-339页，(1992)。

聚合物可用于本文所公开的抗体组合物的受离子控制的释放中。在该领域中，用于在受控的药物递送中使用的各种可降解和不可降解的聚合物的基体在本领域是已知的(Langer，Accounts Chem.Res.26：537-542，1993)。例如，嵌段共聚物，泊洛沙姆-407，在低温下以具有粘性但有流动性的液体的形式存在，但在体温时形成半固体凝胶。它已被证明是用于重组的白细胞介素-2和脲酶的配制和持续递送的有效载体(Johnston等，Pharm.Res.9：425-434，1992；和Pec等，J.Parent.Sci.Tech.44(2)：58-65，1990)。可选地，羟基磷灰石已用作为蛋白的受控释放的微载体(Ijntema等，Int.J.Pharm.112：215-224，1994)。另一方面，脂质体被用于受控释放以及脂质胶囊药物的药物靶向(Betageri等，Liposome Drug Delivery Systems，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA(1993))。治疗性蛋白的受控递送的许多附加系统是已知的(见美国专利号5,055,303；美国专利号5,188,837；美国专利号4,235,871；美国专利号4,501,728；美国专利号4,837,028；美国专利号4,957,735；美国专利号5,019,369；美国专利号5,055,303；美国专利号5,514,670；美国专利号5,413,797；美国专利号5,268,164；美国专利号5,004,697；美国专利号4,902,505；美国专利号5,506,206；美国专利号5,271,961；美国专利号5,254,342和美国专利号5,534,496)。

A治疗方法

可以施用本发明公开的抗体、组合物、融合蛋白和免疫偶联物，以延缓或抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿瘤细胞的转移，如间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。在这些应用中，向受试对象施用治疗有效量的抗体，该量足以抑制癌细胞的生长、复制或转移，或抑制癌症的迹象或症状。适用的受试对象可以包括被诊断为患有表达间皮素的癌症的受试对象，所述癌症例如为但不限于：间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、三阴乳腺癌或卵巢癌。

在一个非限制性的实施方案中，本发明提供了治疗癌症受试对象的方法，该方法通过选择患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向受试对象施用治疗有效量的本发明公开的抗体、组合物、融合蛋白或免疫偶联物而进行。

本发明还提供了抑制肿瘤生长或转移的方法，该方法通过选择患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向受试对象患者施用治疗有效量的本发明公开的抗体、组合物、融合蛋白或免疫偶联物而进行。

治疗有效量的间皮素特异性抗体、融合蛋白、组合物、或免疫偶联物将取决于疾病的严重程度和病人的总健康状况。治疗有效量的抗体是指，该量提供或者症状的主观上的缓解或者如临床医生或其它有资格的观察员所注意到的客观上可识别的改善。

本文所公开的抗体、融合蛋白和免疫偶联物(或其组合物)的施用也可以伴随其它抗癌药物或治疗性治疗(如肿瘤的手术切除)的施用。任何合适的抗癌剂可以与本文所公开的抗体、组合物、融合蛋白和免疫偶联物一起施用。典型的抗癌试剂包括但不限于化疗试剂，例如有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗残留剂(anti-survival agents)、生物反应调节剂、抗激素(如抗雄激素)和抗血管生成剂。其它抗癌治疗包括放射治疗和其它特异性靶向癌细胞的抗体。

非限制性的烷化剂例子包括氮芥(如双氯乙基甲胺、环磷酰胺、美法仑、脲嘧啶氮芥或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸盐(如白消安)、亚硝基脲类(如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲佐菌素、或氮烯咪胺)。

非限制性的抗代谢物的例子包括叶酸类似物(如氨甲喋呤)、嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶或阿糖胞苷)、和嘌呤类似物，如巯嘌呤或硫鸟嘌呤。

非限制性的天然产物的例子包括长春花生物碱(如长春碱、长春新碱、或长春地辛)、表鬼臼毒素(如依托泊苷或替尼泊苷)、抗生素(如更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素，或丝裂霉素C)和酶(如L-天门冬酰胺酶)。

非限制性的杂项剂(miscellaneous agent)的例子包括铂配位络合物(如顺-双氨双氯络铂II，也被称为顺铂)，取代的脲类(如羟基脲)，甲基肼衍生物(如甲基苄肼)，和肾上腺皮质抑制剂(如米托坦和氨鲁米特)。

非限制性的激素和拮抗剂的例子包括肾上腺皮质激素(如强的松)、孕激素(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、和醋酸甲地孕酮(magestrol acetate))、雌激素(如己烯雌酚和炔雌醇)、抗雌激素(如他莫昔芬)，和雄激素(如丙酸睾酮(testerone proprionate)和氟甲睾酮)。最常用的化疗药物的例子包括阿霉素、马法兰、阿糖胞苷、BiCNU、白消安、CCNU、卡铂、顺铂、环磷酰胺、柔红霉素，DTIC、5-FU、氟达拉滨、羟基脲(Hydrea)、伊达比星、异环磷酰胺、氨甲喋呤、普卡霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇(Taxol)(或其它紫杉烷类，如多西紫杉醇)，长春花碱(Velban)、长春新碱、VP-16、而一些更新的药物包括吉西他滨(健择)、赫赛汀、伊立替康(CAMPTOSAR，CPT-11)、克拉屈滨(Leustatin)、诺维本、利妥昔单抗STI-571、泰索帝、拓扑替康(Hycamtin)、希罗达(卡培他滨)、Zevelin和骨化三醇。

非限制性的免疫调节剂的例子可以包括：AS-101(Wyeth-Ayerst Labs.)、溴匹立明(Upjohn)、γ-干扰素(Genentech)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；Genetics Institute)、IL-2(Cetus或Hoffman-LaRoche)、人免疫球蛋白(CutterBiological)、IMREG(来自New Orleans，La.的Imreg)，SK&F 106528、和TNF(肿瘤坏死因子；Genetech)。

对于某些类型的癌症的另一种常用治疗是手术治疗，例如对癌症或它的部分进行手术切除。另外的治疗的例子是放射性治疗，例如将放射性的物质或能量(如外束治疗)施加到肿瘤部位，有助于消除肿瘤或在手术切除前缩小肿瘤。

B.诊断和检测方法

本发明提供了在体外或体内检测间皮素的表达的方法。在某些情况下，在生物样本中检测间皮素的表达。这一样本可以是任何样本，包括但不限于：来自活组织检查的组织、尸检和病理标本。生物样本还包括组织切片，例如用于组织学目的的冰冻切片。生物样本还包括体液，如血液、血清、血浆、痰液、脊髓液或尿液。生物样本通常是从哺乳动物获得的，如人类或非人类的灵长类动物。

在一个实施方案中，提供了确定受试对象是否患有癌症的方法，所述方法通过将来自受试对象的样本与本文所公开的单克隆抗体进行接触，并检测抗体与样本的结合来进行。与抗体与对照样本的结合相比，抗体与受试对象的样本的结合的增加确定受试对象为患有癌症。

在另一实施方案中，提供了一种受试对象中的癌症诊断结果的确认方法，所述方法通过将来自被诊断为癌症的受试对象的样本与本文所公开的单克隆抗体进行接触，并检测抗体与样本的结合来进行。与抗体与对照样本的结合相比，抗体与受试对象的样本的结合的增加确认受试对象中的的癌症诊断结果。

在所公开的方法的一些实施例中，单克隆抗体被直接标记。

在一些实施例中，该方法进一步包括使第二抗体与样本接触，该第二抗体特异性结合单克隆抗体；并检测第二抗体的结合。与第二抗体与对照样本的结合相比，第二抗体与受试对象的样本的结合的增加检测受试对象中的癌症，或者确认受试对象的癌症诊断结果。

在某些情况下，癌症是间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、三阴性乳腺癌或卵巢癌，或任何其它类型的表达间皮素的癌症。

在一些实施方案中，对照样本是来自未患癌症的受试对象的样本。在具体的实施例中，样本是血液或组织样本。

在某些情况下，结合(例如特异性结合)间皮素的抗体可直接以可检测的标记物来标记。在另一实施例中，不标记结合(例如特异性结合)间皮素的抗体(第一抗体)，而是对可以结合特异性结合间皮素的抗体的第二抗体或其它分子进行标记。如本领域技术人员所公知的，选择能够特异性结合特定种类和类别的第一抗体的第二抗体。例如，如果第一抗体是人IgG，那么第二抗体可以是抗人IgG。可以结合抗体的其它分子包括而不受限于：A蛋白和G蛋白，它们都可以在市面上购得。

用于抗体或第二抗体的合适标记物，在上面有所描述，包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性试剂和放射性材料。合适的酶的非限制性例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基配合物的非限制性例子包括链霉亲和素/生物素与亲和素/生物素。合适的荧光材料的非限制性例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的非限制性例子是鲁米诺；非限制性的示例性磁剂为钆，和放射性标记物的非限制性例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

在可选实施方案中，在生物样本中的间皮素可以通过竞争性免疫测定的方法测定，该竞争性免疫测定的方法利用标记有可检测物质的间皮素标准品和特异性结合间皮素的未标记抗体。在这一检测中，将生物样本、被标记的间皮素标准品和特异性结合间皮素的抗体结合，并确定结合到未标记的抗体的经标记的间皮素标准品的量。在生物样品中的间皮素的量同与特异性结合间皮素的抗体进行结合的标记的间皮素标准品的量成反比。

本文所公开的免疫测定和方法可用于许多目的。在一个实施例中，特异性结合间皮素的抗体可用于检测在细胞培养物中的细胞中的间皮素的产量(production)。在另一实施方案中，所述抗体可用于检测生物样本中的间皮素的量，所述生物样本如为组织样本、或血液或血清样本。在一些实施例中，间皮素为细胞表面间皮素分子。在其它实施例中，间皮素是可溶性间皮素(例如在细胞培养物上清液中的间皮素、或在体液样品中的可溶性间皮素，该体液样品如血液或血清样品)。

在一个实施方案中，提供了用于检测生物样品如血液或组织样本中的间皮素的试剂盒。例如，为确定受试对象的癌症诊断结果，可以进行活检来获得用于组织学检测的组织样本。可替代地，为了检测可溶性间皮素蛋白或片段的存在，也可以获取血液样本。用于检测多肽的试剂盒将通常包括特异性结合间皮素的单克隆抗体，如本文公开的任一抗体。在一些实施方案中，试剂盒也含有抗体片段，如scFv片段、VH结构域，或Fab。在进一步的实施方案中，抗体被标记(例如，用荧光性、放射性、或酶的标记)。

在一个实施方案中，试剂盒中含指导材料，所述指导材料公开使用结合间皮素抗体的方式。指导材料可以以电子版的形式(如计算机软盘或光盘)写入或可以是可视的(如视频文件)。试剂盒也可以包含额外的有助于特定应用的成分，试剂盒针对所述特定应用而被设计。因此，例如，该试剂盒可以附加地包含检测标记的装置(如对应酶标记物的酶底物、检测荧光标记物的滤光片组(filter sets)，或适当的第二标记物如第二抗体等)。该试剂盒可以附加地包括缓冲液和常规用于特定方法的实施的其它试剂。这样的试剂盒和合适的内容物是本领域技术人员所熟知的。

在一个实施方案中，诊断试剂盒包括免疫测定。虽然免疫测定法的细节可能随着使用的特定的版本而有所不同，但检测生物样品中的间皮素的方法通常包括将生物样品与抗体进行接触的步骤，其中所述抗体与间皮素多肽在免疫反应的条件下特异地反应。在免疫反应的环境下抗体可以特异性地进行结合，以形成免疫复合物，且免疫复合物(结合的抗体)的存在直接或间接地被检测。

确定细胞表面标记物存在或不存在的方法在本领域中是公知的。例如，抗体能够与其它化合物偶联，所述其它化合物包括但不限于：酶类、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物和药物。抗体也可以应用于免疫测定法，例如但不限于：放射性免疫测定法(RIA)、ELISA、或免疫组织化检测。抗体也可以用于荧光激活细胞分选(FACS)。FACS采用多种颜色通道、低角和钝角光散射的检测通道和阻抗通道，以及其它更精密的检测水平，用以分离或分选细胞(见美国专利号5,061,620)。本发明公开的任何结合间皮素的单克隆抗体都可以用于这些测定方法。因此，抗体可用于常规免疫测定法，包括但不限于：ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、蛋白质印迹法或免疫沉淀法。

C.工程化的胞毒性T淋巴细胞(CTLs)

所公开的单克隆抗体也可用于产生工程化的CTL，以表达嵌合抗原受体(CAR；也称为嵌合T细胞受体、人造T细胞受体或嵌合免疫受体)。一般来说，CAR包含结合部分、细胞外的铰链和间隔元件(spacer element)、跨膜区和胞质区(endodomain)，该胞质区执行信号功能(Cartellieri等，J BiomedBiotechnol 2010：956304，2010)。在许多情况下，结合部分是单克隆抗体的抗原结合片段，如scFv。几种不同胞质区被用于产生CAR。例如，胞质区可以由具有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号链构成，如CD3ζ或FcεRIγ。在一些例子中，胞质区还包括至少一个附加的共刺激结构域的胞内部分，如CD28和/或CD137。

表达CAR的CTL可以用于靶向特定的细胞类型，如肿瘤细胞。因此，本发明公开的单克隆抗体可用于工程化CTL，该CTL表达含有间皮素特异性抗体的抗原结合片段的CAR，从而使工程化的CTL靶向于表达间皮素的肿瘤细胞。工程化T细胞以前就被用于某些类型的癌症的过继治疗中(例如见Park等，Mol Ther 15(4)：825-833，2007)。与标准的基于CTL的免疫治疗相比，表达CAR的T细胞是更普遍的。因为表达CAR的CTL不受HLA限制，因此可用于任何患有表达靶抗原的肿瘤病人中。

因此，本发明提供包括间皮素特异性抗体结合片段的CAR，如scFv。本发明还提供了分离的核酸分子、编码CAR的载体和宿主细胞，如CTL，其包括核酸分子和载体。表达由间皮素特异性抗体结合片段构成的CAR的CTL被用于表达间皮素的癌症的治疗，如间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。因此，本发明提供了治疗患有癌症的受试对象的方法，该方法通过选择患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向受试对象施用治疗有效量的表达靶向于间皮素的CAR的CTL而进行。

D双特异性抗体

双特异性抗体是由两个不同的单克隆抗体的抗原结合片段构成的重组蛋白。因此，双特异性抗体结合两种不同的抗原。双特异性抗体通过同时靶向CTL(如CTL受体组分如CD3)和肿瘤抗原从而用于癌症的免疫治疗。本发明公开的间皮素特异性单克隆抗体可以用于产生靶向间皮素和CTL的双特异性抗体，从而提供了治疗表达间皮素癌症的方法。

本发明提供了双特异性单克隆抗体，其包括间皮素特异性单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，双特异性单克隆抗体还可以包括特异性结合T细胞受体成分(如CD3)的单克隆抗体，或其抗原结合片段。本发明还提供了编码双特异性抗体的分离的核酸分子、载体、以及包括核酸分子或载体的宿主细胞。包括间皮素特异性单克隆抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体可用于表达间皮素的癌症的治疗，如间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。因此，本发明提供了治疗患有癌症的受试对象的方法，该方法通过选择患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向受试对象施用治疗有效量的靶向间皮素的双特异性抗体而进行。

下面提供的实施例用于说明某些特定的特征和/或实施方案。这些实施例不应被认为是将本发明公开的内容限定至所述的特定特征或实施方案。

实施例

实施例1：材料与方法

本实施例描述了用于实施例2所述研究的实验步骤。

细胞培养

如文献所述(Ho等，Int J Cancer 128：2020-2030，2011；Yu等，J Cancer 1：141-149，2010)的，使人胆管癌(CCA)细胞系(KMBC，Mz-ChA-1和HuCCT-1)、以及A431(表皮癌)、NCI-H226(间皮瘤)、EKVX(人非小细胞肺癌或NSCLC)，OVCAR-8(卵巢癌)、和L55(NSCLC)细胞生长。A431/H9是转染的A431细胞系，其稳定表达人类间皮素(Ho等，Clin Cancer Res 11：3814-3820，2005)。使HEK-293F细胞系(Invitrogen，Carlsbad，CA)在FreeStyle^TM无血清培养基(Invitrogen)中生长。所有的细胞系在初次冻存被解冻后仅能进行几次的传代(小于1个月)，以减少总的传代数使其小于15，其中使初次冻存在获得细胞系之后立刻发生。所有的细胞系都可依据形态学和生长速率进行检测和鉴定，并且是无支原体的。

工程化的人源抗体域库的筛选

命名为m81的工程化的人源(VH)抗体域库显示了为2.5x10¹⁰的估计的多样性(Chen等，J Mol Biol 382：779-789，2008)。合成了由50个氨基酸(VQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLV；SEQ ID NO：9的残基539-588)构成的C-末端间皮素肽(GenScript，Piscataway，NJ)。如(Kaneko等，J Biol Chem 284：3739-3749，2009)所描述的，制备了全长人类间皮素蛋白(MSLN)。按照标准的实验室协议，针对人的间皮素或C-末端间皮素肽，对噬菌体库进行四轮筛选(Ho等，J Biol Chem 280：607-617，2005；Ho和Pastan，Methods Mol Biol 525：293-308，2009)。在每轮筛选结束后随机挑选的克隆通过噬菌体酶联免疫吸附法(ELASA)被分析对抗原的结合。

SD1-人源Fc融合蛋白的制备

编码融合人源的IgGγl Fc和FLAG/His标签的SD1人源抗体的结构域的VH区通过两个引物(正向：GTC ATC ACA ACT TCG ATA TCG CGG TGCAGC GGT GCA GTC GGG AGG CTT GGT A；SEQ ID NO：10；反向：GAAGTT GTG ATG ACT CCG GAG CCC TTA TCG TCA TCG TCC TTG TAG TCGCCG TGG；SEQ ID NO：11)进行PCR扩增。将PCR产物插入到载体pVRC8400的EcoRV和BspEI位点(下划线)(Barouch等，J Virol 79：8828-8834，2005；Ofek等，J Virol 84：2955-2962，2010)。将最终的质粒(命名为pMH148)转染进HEK-293F细胞中，并且用蛋白A柱(GE healthcare，Piscataway，NJ)纯化蛋白。通过向HEK-293F细胞(Invitrogen)中转染pMH148质粒来建立稳定的细胞系。该稳定的细胞系在培养物的上清液中以高表达水平(＞70mg/L)产生了SD-hFc融合蛋白。

免疫沉淀和蛋白质印迹分析

将细胞裂解物(1.5mg)与50μg的SD1或无关的人源的单域抗体共同培养在500μl的RIPA缓冲液中(Cell signaling，Boston，MA)，并且在4℃下旋转过夜。加入30μl的蛋白质A珠子(sigma，St.Louis，MO)在4℃旋转2小时。珠子被离心，并用RIPA缓冲液冲洗。在100μl的2×上样缓冲液中煮沸5分钟后，免疫复合物从珠子中被释放。按照标准的实验室手册进行蛋白质印迹分析(Yu等，J Cancer 1：141-149，2010)。

ELISA

直接的ELISA和亲和力测量-按照先前描述的步骤(Kaneko等，J BiolChem 284：3739-3749，2009)，在涂有间皮素肽、人源的间皮素、或鼠源的间皮素(mMSLN)的ELISA板上，评估SD1-hFc的直接结合力和亲和力。

竞争性ELISA-将各种量的间皮素肽、无关的含50个氨基酸的肽、HN1人源单克隆抗体或SS1P免疫毒素与5μg/ml的SD1-hFc混合，在室温下培养1小时。然后按照上面描述的步骤，将混合物转移到涂有5μg/ml的人源的间皮素蛋白的ELISA板，并再在室温下培养一小时。

流式细胞术

为确定SD1抗体结合到与细胞表面相关的间皮素，按照标准手册进行流式细胞仪分析(Yu等，J Cancer 1：141-149，2010)。每个细胞的间皮素位点的平均数量使用BD Quantibrite^TM PE珠(BD Biosciences)在FACSCalibur(BDBiosciences，San Jose，CA)上检测。C1q和抗间皮素结合试验可以按照已被建立的方案进行(Pawluczkowycz等，J Immunol 183：749-758，2009；Li等，CancerRes 68：2400-2408，2008)。简而言之，将A431/H9或NCI-H226细胞以1×10⁶个细胞/ml进行悬浮，并与不同浓度的SD1-hFC、对照人源IgG或HN1人源IgG在冰上培养1小时。洗涤之后，将细胞与20μg/ml的纯化后的C1q(Complement Technologies，Tyler，TN)在37℃下培养0.5小时。再次洗涤细胞，之后在冰上与FITC标记的羊抗人C1q单克隆抗体(AbD Serotec，Raleigh，NC)培养0.5小时。在培养结束时，将细胞进行洗涤并用FACSCalibur进行分析。

ADCC和CDC

ADCC测定采用LDH检测试剂盒(Roche，Mannheim，德国)根据标准操作方法进行(Ho等，Int J Cancer 128：2020-2030，2011)。SD1-hFc的CDC活性也通过LDH释放法测定。简而言之，在37℃，在5％的CO₂的恒温箱中，将细胞与SD1-hFc在DMEM培养基培养1小时，随后添加正常人血清(20％体积/体积)或新抽取的小鼠的血清(30％体积/体积)作为补体源。正常人血清由Department of Transfusion Medicine，HIH Clinical Center(Bethesda，MD)提供。在37℃下又额外的培养4小时后，通过测定释放到培养物上清液中的LDH的量来确定细胞裂解。通过在1％Triton X-100中的裂解确定最大的LDH释放。特异性裂解的百分比的计算根据以下公式：裂解％＝[实验释放-自发释放]/[最大释放-自发释放]×100。

在小鼠中的异种移植物抗肿瘤试验

按照按照建立好的NCI方法(Hassan等，Cancer Immun 7：20，2007)，使用裸鼠中的A431/H9异种移植物来评价SD1-hFc的肿瘤实验。4～6周龄雌性无胸腺裸鼠在实验过程中被安置在微型隔离笼内。将三百万个A431/H9细胞皮下接种到小鼠的右胁腹。用卡尺测定肿瘤体积(mm³)，该肿瘤体积由下式计算：长×(宽)²×0.5。当肿瘤达到约70mm³大小时开始治疗。不同的治疗方案包括：将PBS和SD1-hFc(50mg/kg)在肿瘤接种后的第7、9、11、14、17、20天经静脉注射。而当肿瘤超过1000mm³时，处死小鼠。

重组免疫毒素的制备

来自于选定的噬菌粒的SD1抗体结构域通过使用两个引物(正向：GTCATC ACA ACT TCC ATA TGC AGG TGC AGC TGG TGC AGT CT，SEQ IDNO：12；和反向：GAA GTT GTG ATG ACA AGC TTT GGC CGC ACT TGAGGA GAC GGT GAC CAG GGT TC；SEQ ID NO：13)进行PCR扩增，该两个引物引入了NdeI和Hind-III限制性位点(下划线)。将该反应的产物克隆到pRB98。使用最终的表达质粒(命名为pMH149)来产生重组免疫毒素，如之前所述(Pastan和Ho，″Recombinant immunotoxins for Treating Cancer，″见Antibody Engineering，第II卷，纽约：Springer；2010，第127-146页)。

细胞增殖抑制试验

细胞生长的抑制通过WST-8测定法来进行测定，如之前所述(Ho等，Int JCancer 128：2020-2302，2011；Ho等，J Biol Chem 280：607-617，2005)。

实施例2：人源单域抗体通过靶向靠近癌细胞表面的间皮素中的表位而引起有效的抗肿瘤活性

本实施例描述了特异于人源间皮素的C-末端表位的人源单域抗体的鉴定和表征。

SD1人源抗体的发现与制备

为了寻找靶向靠近细胞表面的位点的新的抗间皮素单克隆抗体，C-末端的间皮素肽被设计为用于筛选小型(small-size)结合物(VH)库。人类间皮素(MSLN)基因编码含有622个氨基酸的前体蛋白(GenBank登记号：AY743922)。当转运到内质网中时，N-末端的信号肽(残基：1-33)和C-末端的GPI锚定附加(addition)信号肽(预测切割位点：Ser598)被移除，后者被GPI锚所替代。使用big-PI预测软件，预测GPI切割位点为Ser598。最初打算制备与预测的C末端相对应的含有50个氨基酸的肽(残基549-598)，但在可能是由于该肽的疏水性造成的聚集问题之后，合成失败了。设计了新的肽(SEQ ID NO：9的残基539-588；VQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLQGGIPNGYLV)，距离间皮素的GPI切割位点有10个氨基酸的距离(图1A)。新的肽与工程化的人源抗体结构域噬菌体展示库一起用于噬菌体筛选(Chen等，J Mol Biol 382：779-789，2008)(表1)。

在四轮噬菌体筛选后，噬菌体滴度明显增加(图1B)，并且超过95％的克隆是肽结合剂。噬菌体克隆SD1被选定进行进一步的分析，因为其不仅结合所述肽而且还结合全长的间皮素(图1C)。相比之下，针对人间皮素，使用同样的单域抗体噬菌体库进行筛选，但只有克隆SD2富集(enriched)且特异于全长人源间皮素，而不是所述肽(图1D)。如果依靠杂交瘤或噬菌体展示技术来针对全长蛋白进行筛选，似乎不太可能获得识别间皮素C末端的单克隆抗体(Onda等，Clin Cancer Res 11：5840-5846，2005)。

表1 噬菌体筛选

以空斑形成单位(pfu)表示每轮筛选后的噬菌体滴度

为研究作为潜在的治疗剂的SD1，将其转化成临床相关的分子：人Fc(hFc)融合蛋白(图2A)。SD1-hFc人源蛋白是通过将人VH融合到位于人的IgG重链γ1的恒定区中的CH₂和CH₃内而形成。为了大规模生产SD1-hFc融合蛋白，在HEK-293F细胞的培养物上清液中建立了具有高表达水平(＞70mg/L)的稳定的细胞系。SD1-hFc是类似于抗体的二聚分子(无轻链)，且在非还原条件下的SDS-PAGE上估计为约100kDa。因此，针对通过噬菌体展示的间皮素的C-末端，SD1人源抗体结构域被成功地分离，并且基于SD1 VH产生了人源Fc融合体(SD1-hFC)，用于潜在的临床应用。

SD1人源抗体结合癌细胞表面相关的间皮素

为分析SD1抗体对于癌细胞中的间皮素蛋白的结合特性，利用癌细胞裂解物，将SD1-hFc或作为对照的无关的人源VH单域hFc融合蛋白用于进行蛋白质印迹和下拉实验。使用SD1-hFc的各种癌细胞裂解物的起初的蛋白质印迹分析，即使在高表达间皮素的细胞系中在还原条件下也不能检测间皮素带，这表明SD1-hFc不能识别变性了的间皮素蛋白质。如图2B所示，通过采用下拉试验来检测溶液中的内源性的间皮素蛋白质，SD1-hFc蛋白成功地拉下了来自于3种不同癌细胞系(A431/H9、NCI-H226和KMBC)的成熟的间皮素蛋白质。NCI-H226和KMBC是天然的人的癌细胞系。而A431/H9是在细胞表面过表达间皮素的工程化的A431细胞系(Ho等，Clin Cancer Res 11：3814-3820，2005)。成熟的间皮素的分子量(～40kDa)与过去的研究(Yu等，JCancer 1：141-149，2010；Ho等，Clin Cancer Res 13：1571-1575，2007)相一致。在ELISA试验中，SD1-hFc蛋白同时结合全长人源间皮素蛋白和间皮素肽(图3A)，但不结合全长小鼠间皮素蛋白、牛血清白蛋白(BSA)或其它无关的蛋白质。正如预期的那样，SSP1和HN1只结合全长的人源间皮素，不结合C-末端肽。

为了评估SD1-hFc是否识别C-末端，我们将SD1-hFc、HN1、或SS1P，与间皮素肽(残基：539-588)一起预培养，并测定抗体肽混合物与涂覆在ELISA板上的人源间皮素的结合。竞争性ELISA(图3B)显示C-末端多肽阻断了SD1-hFc与全长人源间皮素的结合，而没有阻断SS1P或HN1与全长人源间皮素的结合，这表明SD1-hFc结合C-末端序列，并且结合间皮素的SD1不受SS1P和HN1的竞争。用全长间皮素蛋白和C-末端多肽测定SD1的结合动力学。SD1-hFc以13.59nM的解离平衡常数(K_D)结合人类间皮素蛋白，和以16.08nM的K_D结合肽。使用Windows(3.02版)Prism(GraphPad software，San Diego，CA)确定平衡常数和斯卡查德图(Kaneko等，J Biol Chem 284：3739-3749，2009)。

为了分析SD1是否适用于癌症的治疗，可以通过判定SD1-hFc是否与人的肿瘤细胞上的天然间皮素分子结合来分析。对表达间皮素的癌细胞的群体进行流式细胞仪分析，并且用QuantiBRITE荧光定量系统试验性测定每个细胞的间皮素位点的平均数量(表2)。SD1-hFc蛋白可以结合A431/H9，不结合A431，这表明结合细胞表面上相关的间皮素的SD1具有高特异性(图4)。天然的人肿瘤细胞系群体上的SD1-hFc的结合也被检测。以前的研究已经报道了，在恶性间皮瘤、卵巢癌(Chang等，Cancer Res 52：181-186，1992)、肺腺癌(Ho等，Clin Cancer Res 13：1571-1575，2007)、和胆管癌(Yu等，J Cancer 1：141-149，2010)中的间皮素表达较高。在目前的研究中，已发现SD1-hFc很强地结合人卵巢癌(OVCAR-8)、间皮瘤(NCI-H226)、人NSCLC细胞系(EKVX和L55)和胆管癌细胞系(KMBC和MZ-CHA-1)；它不结合间皮素阴性细胞系胆管癌细胞，HuCCT1(Yu等，J Cancer 1：141-149，2010)。总之，这些结果表明，SD1人源抗体识别靠近癌细胞表面的天然的间皮素的构象表位，并且以高亲和力和优异的特异性结合细胞表面相关的天然间皮素蛋白。

表2 在癌细胞系上的每个细胞的间皮素位点的数量

*通过蛋白质印迹法证明可间皮素表达的不存在。

SD1-hFc的抗肿瘤活性：CDC和ADCC

为评价SD1-hFc对于癌细胞的抗肿瘤活性，在A431/H9和NCI-H266细胞模型中，在作为补体源的人血清的存在下，检测细胞毒性活性。SD1-hFc产生了很强的CDC活性，杀伤了40％的A431/H9细胞(图5A)并且杀伤了超过30％的NCI-H266间皮瘤细胞系(图5B)，而对间皮素阴性A431细胞系未表现出活性。在同样的浓度下，无关对照抗体也未表现出该活性。这是非常重要的观测结果，因为当前正在临床试验中被评估的嵌合抗体MORAb-009，对肿瘤细胞未表现出显著的CDC活性(Hassan等，Cancer Immure 7：20，2007)。这表明，对于补体膜攻击复合物(MAC)，结合间皮素的MORAB-009可能由于远离细胞表面而不能有效发挥作用。通过靶向接近细胞表面的间皮素表位，结合间皮素的SD1-hFc可以在癌细胞表面引起有效的补体MAC。

为了分析补体在SD1-hFc的抗肿瘤活性中的作用，按照用于表征利妥昔单抗、奥法木单抗、以及其它的抗-CD20的治疗性单克隆抗体的已建立的比较完善方案(Pawluczkowycz等，J lmmunol 183：749-758，2009；Li等，CancerRes 68：2400-2408，2008)，使用流式细胞仪来确定与癌细胞结合的C1q，其中所述癌细胞与抗间皮素的人源单克隆抗体反应。之前已表明，如MORAb-009，特异于细胞表面的间皮素I区(远离细胞表面)的HN1人源单克隆抗体，都不能针对表达抗间皮素的癌细胞展现任何CDC活性(Ho等，Int J Cancer 128：2020-2030，2011)。如图5C和5D所示，在SD1-hFc存在的条件下，C1q补体结合于A431/H9或NCI-H266细胞。然而，在HN1或对照hFc融合蛋白存在的条件下，却未发现C1q的结合。此外，C1q与癌症细胞的结合以剂量效应的方式和SD1-hFC与细胞的结合相关。这些结果表明，C-末端的结合剂SD1-hFc可以招募(recruit)C1q到表达间皮素的癌细胞的表面，而不是N-末端的结合剂。

除了CDC活性外，SD1-hFc针对肿瘤细胞的ADCC活性也被检测。以不同的浓度使用SD1-hFc与人的外周血单核细胞(PBMC)，发现了高水平的细胞毒性。SD1对于A431/H9细胞(图5E)和NCI-H266间皮瘤细胞(图5F)均表现了显著的ADCC活性。并在间皮素阴性A431细胞中未发现该活性。也可以测定SD1-hFc的对于使用纯化的NK细胞的肿瘤细胞的ADCC活性。将人的NK细胞与A431/H9或NCI-H266靶细胞(以E∶T为5∶1、10∶1和20∶1的比例)和50μg/ml的SD1-hFc一起培养。在全部的E∶T比例的条件下，对于A431/H9和NCI-H266细胞，SD1再次展现出了显著的ADCC活性(图5G-5H)。

总之，这些结果表明：在体外，SD1-hFc蛋白对于表达间皮素的肿瘤细胞具有较强的CDC和ADCC抗肿瘤活性。

在小鼠体内的抗肿瘤活性

为评价SD1-hFc的体内的抗肿瘤活性，按照过去的在临床前研究中评价MORAb-009所建立的方法(Hassan等，Cancer Immure 7：20，2007)，使用具有异种移植瘤的免疫缺陷小鼠。从第7天起，对具有A431/H9肿瘤的无胸腺裸鼠用50mg/kg的SD1-hFc(图6A)进行处理。在A431/H9中的间皮素位点的数量与在内源性表达间皮素的恶性间皮瘤细胞中的数量是相当的，且它们在小鼠中的植入都一致地导致了侵袭性的肿瘤生长。肿瘤细胞接种20天后，单独被SD1-hFc处理的小鼠中的平均肿瘤尺寸(平均300mm³)与对照组(平均1000mm³)相比发生了显著的缩小。这些结果表明：SD1-hFc作为单独的试剂是非常具有活性的。用同样的方法，在小鼠体内，MORAb-009作为单独的试剂仅仅适中地诱导肿瘤生长的抑制(Hassan等，Cancer Immun 7：20，2007)。在癌症治疗方面，ADCC和CDC是通过抗体介导肿瘤细胞杀伤的重要机制。SD1-hFc对于肿瘤细胞可以同时引起ADCC和CDC，但MORAb-009只引起ADCC，而不引起CDC。因此，认为CDC在小鼠体内有效的抑制肿瘤生长方面具有重要的作用。

为评价小鼠体内SD1诱导的CDC，用鼠血清来测定CDC活性。在从裸鼠中抽取的新鲜的30％的鼠血清的存在下，SD1-hFc杀伤了11％的A431/H9细胞(图6B)，表明对于SD1-hFc，人的补体的活性(图5)是鼠补体的10倍。这与过去报道所展示的对于具有人源Fc的抗体，鼠的补体比人的补体活性低(Di Gaetano等，J Immunol 171：1581-1587，2003)是一致的。HN1不能诱导显著水平的CDC。还评价了SD1和HN1诱导的ADCC。如图6C所示，这两种抗体都能诱显著水平的ADCC。鼠源的NK细胞的纯度如图6D所示。

总之，结果表明，SD1-hFc在小鼠体内诱导有效的肿瘤生长的抑制作用，并且CDC似乎是主要的潜在机制。

讨论

本发明公开了通过噬菌体显示技术鉴定SD1，其是识别间皮素C-末端表位的工程化抗体结构域。该表位不与目前的任何治疗性的、处于临床前的和临床开发的用于靶向间皮素的治疗的抗体(SS1P/MORAb-009和HN1)的表位重叠。SD1在体内和体外都表现出了抗肿瘤活性。在体外试验中，SD1-hFc蛋白对于表达间皮素的癌细胞展现了显著的CDC活性。在体内小鼠试验中，SD1-hFc也展现了有效的抑制肿瘤生长的作用。本文公开的这些结果表明了SD1代表一类新的抗间皮素单克隆抗体，并且在以间皮素为靶点的治疗中可以作为治疗性抗体使用。

通过在间皮素的C末端的50各残基的肽上的噬菌体筛选，分离了SD 1结构域。通过流式细胞术和下拉试验表明该抗体与癌细胞中的天然的间皮素蛋白结合。而该抗体不与蛋白质印迹上的变性的间皮素蛋白结合，并表明SD1结构域结合靠近癌细胞表面的间皮素的构象表位。这一区域从未被任何已知的抗间皮素的抗体(包括SS1P/MORAb-009和HN1)接近(accessed)过。我们认为以该区域为靶点来设计抗体，是一个非常重要的策略。CDC是针对肿瘤的治疗性抗体的最强大的细胞杀伤机制之一，但可能需要靠近细胞膜的抗体结合在位点(Pawluczkowycz等，J Immunol 183：749-758，2009)。目前的数据表明，SD1-hFc所引发的CDC是依靠特异性的新表位，因为HN1(特异于间皮素的N-末端I区，远离细胞表面)不能展现出CDC活性，并且不能招募C1q到癌细胞上。此外，几乎所有已有的间皮素抗体(例如，MORAB-009/阿麦妥昔单抗、SS1P、HN1)都识别I区。然而，过去的报道中也展示了富粘蛋白MUC16/CA125也可以结合癌细胞上的间皮素的I区(Kaneko等，J Biol Chem284：3739-3749，2009)，且可以与抗体进行竞争结合。而SD1不与MUC16/CA125发生竞争结合间皮素；因此，SD1对于肿瘤细胞的结合和活性不可能被MUC16/CA125压制(neutralized)。

使用裸鼠中的异种移植瘤模型的动物体内实验，展现了SD1-hFc的有效抗肿瘤活性。采用同样的方法，MORAb-009鼠/人的嵌合单克隆抗体的抗肿瘤作用仅表现为适中的抗肿瘤活性，最有可能的原因是MORAb-009没有针对肿瘤细胞引起显著的CDC活性(Hassan等，Cancer Immure 7：20，2007)。为了进一步评价在肿瘤微环境中的SD1-hFc，在小鼠体内生成人肿瘤异种移植物，结果展现SD1-hFc确实具有显著的体内活性。

天然存在的单域抗体，如骆驼VHH和鲨鱼VNAR，对于癌症免疫治疗的而言已被认为是新类别的治疗剂。因为在人体内其可能具有免疫原性，这些动物抗体可能不能直接地用于一些临床应用中。因此，人源单域VH是用于癌症治疗的引人注目的备选物。然而，人类的VH通常是容易聚集的(Arbabi-Ghahroudi等，Methods Mol Biol 502：341-364，2009)。在现在的研究中，SD1 VH被融合到人的IgGγl的CH₂和CH₃，以在哺乳动物HEK-293F细胞中生成SD1-hFc作为二聚化的IgG类似蛋白。基于SD1的重组免疫毒素也被生成，其以剂量依赖的方式(表2和图7A-7B)抑制阳性间皮素肿瘤细胞的增殖。在体外和体内试验中，所有的重组蛋白都是正确折叠的。

总之，制备了针对表达间皮素的肿瘤的第一个人源单域抗体，并且其通过靶向靠近癌细胞表面的表位经由ADCC和CDC在体外和体内展现出有效的抗肿瘤活性。目前没有任何已知的处于临床前或临床研究中的抗间皮素抗体接近该结合位点。

实施例3：间皮素特异性单克隆抗体用于检测受试对象的癌症或确定受试对象的癌症诊断

本实施例描述了使用诸如本发明所公开的单克隆抗体等间皮素特异性单克隆抗体(例如SD1或SD2，或包括SD1或SD2的CDR序列的单克隆抗体)来检测受试对象的癌症。本实施例还进一步介绍了使用这些抗体来确定受试对象的癌症诊断。

血液样本来自被诊断或被疑为患有间皮素阳性癌症(即，过表达间皮素的癌症，如间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、三阴性乳腺癌或卵巢癌)的患者。可以将从未患癌症的患者中获得的血液样本作为对照。进行ELISA试验以检测血液样本中可溶性间皮素的存在。根据本领域中公知的方法(如见Robinson等，Lancet 362：1612-1616，2003)，将存在于血液样本(来自于患者样本和对照样本)中的蛋白质固定在固体支持物上，如96孔板。固定后，将以荧光标记物直接标记的间皮素特异性单克隆抗体加入到蛋白质固定板中。为了移去所有未结合的抗体和最小化抗体的非特异性的结合，用适当的缓冲液(如PBS)洗涤板。之后可以按照标准的方法用荧光读板仪对荧光标记进行检测。相对于对照样本，患者样本的荧光强度的增加，表明抗间皮素抗体与来自患者的血液样本中的蛋白质发生了特异性结合，因此在样本中检测到了间皮素蛋白质的存在。在患者样本中检测到了间皮素蛋白质表明患者已经患有间皮素阳性癌症，或确定了受试对象的癌症诊断。

实施例4：间皮素特异性单克隆抗体对癌症的治疗

本实施例描述了将如本发明公开的单克隆抗体(例如SD1或SD2、或包括SD1或SD2的CDR序列的单克隆抗体)等间皮素特异性单克隆抗体用于表现出过表达间皮素(这里称为“间皮素阳性”癌症)的癌症的治疗，所述癌症包括但不限于：间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、三阴性乳腺癌或卵巢癌。被诊断为间皮素阳性癌症的患者可通过本领域中标准步骤进行治疗(如见Hassan等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.21：29a，2002；Kreiman等，Proc.Am.Soc.Clinl Oncol.21：22b，2002)。

在一个实施例中，对被诊断为间皮素阳性癌症的患者施用免疫偶联物，该免疫偶联物包括连接假单胞菌外毒素(PE)的间皮素特异性单克隆抗体。PE免疫偶联物的制备方法已有描述(如见美国专利号7,081,518和美国专利申请公开号2005/0214304)。在另一例子中，对被诊断为间皮素阳性癌症的患者施用SD1或SD1-hFc融合蛋白，其能够引起CDC和ADCC作用，并在没有连接毒素的情况下介导肿瘤细胞杀伤。

对于一些患者，SD1、SD1-hFc或免疫偶联物每隔一天通过静脉推注施用，总计为三至六个剂量。对于另一些病人，在十天的疗程中，SD1、SD1-hFc或免疫偶联物通过连续静脉输注施用。患者的SD1、SD1-hFc或免疫偶联物施用剂量取决于患者的体重和性别，以及施用的方式和时程。治疗后，评估患者的癌症发展(包括肿瘤生长和转移)以及疾病的其它临床症状。

考虑到所公开的发明的原理可用在许多的可能实施方案中，应当认为所说明的实施方案仅是本发明的优选实施例，而不是对本发明范围的限制。相反地，本发明的范围由随后的权利要求限定。因此我们要求将在这些权利要求的范围和精神之内的所有内容作为本发明加以保护。

Claims (26)

1.分离的特异性结合人的间皮素的单克隆抗体，其中所述抗体的VH结构域包括：

(i)SEQ ID NO：2的氨基酸残基26-35、51-58和97-103；

(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸残基31-35、51-66和99-102；

(iii)SEQ ID NO：15的氨基酸残基26-33、51-57和96-111；或

(iv)SEQ ID NO：15的氨基酸残基31-35、50-65和99-106。

2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述VH结构域的氨基酸序列至少90％或至少95％与SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：15是相同的。

3.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述VH结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：15。

4.如权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是单结构域抗体。

5.如权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是Fab片段、Fab’片段、F(ab)’₂片段、单链可变片段(scFv)、或二硫化物稳定的可变片段(dsFv)。

6.如权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是IgG。

7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是嵌合的或合成的。

8.如权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体被标记。

9.如权利要求8所述的分离的单克隆抗体，其中所述标记是荧光标记、酶标记或者放射性标记。

10.分离的免疫偶联物，其包括权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗体和效应分子。

11.如权利要求10所述的分离的免疫偶联物，其中所述效应分子是毒素。

12.如权利要求11所述的分离的免疫偶联物，其中所述毒素是假单胞菌外毒素或其变体。

13.如权利要求12所述的分离的免疫偶联物，其中所述假单胞菌外毒素或其变体包括SEQ ID NOs：3-8中的任一个的氨基酸序列。

14.融合蛋白，其包括权利要求1-9中任一项所述的抗体和异源蛋白。

15.如权利要求14所述的融合蛋白，其中异源蛋白是人的Fc。

16.组合物，其包括在药学上可接受的载体中的治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗体、权利要求10-13中任一项所述的免疫偶联物、或权利要求14或权利要求15所述的融合蛋白。

17.在受试对象中治疗表达间皮素的癌症的方法，其包括：选择患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗体、权利要求10-13中任一项所述的免疫偶联物、权利要求14或权利要求15所述的融合蛋白、或者权利要求16所述的组合物，从而治疗表达间皮素的癌症。

18.在受试对象中抑制表达间皮素的肿瘤的肿瘤生长或肿瘤转移的方法，其包括：选择患有表达间皮素的肿瘤的受试对象，并向所述受试对象施用治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗体、权利要求10-13中任一项所述的免疫偶联物、权利要求14或权利要求15所述的融合蛋白、或者权利要求16所述的组合物，从而抑制肿瘤的生长或转移。

19.确定受试对象是否患有癌症的方法，其包括：

使来自所述受试对象的样本与权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗体相接触；以及

检测所述抗体与所述样本的结合，

其中，与所述抗体和对照样本的结合相比，所述抗体与所述样本的结合的增加确定所述受试对象患有癌症。

20.确定受试对象的癌症诊断结果的方法，其包括：

使来自被诊断患有癌症的受试对象的样本与权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗体相接触；以及

检测所述抗体与所述样本的结合，

其中，与所述抗体和对照样本的结合相比，所述抗体与所述样本的结合的增加确认所述受试对象的癌症诊断结果。

21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述癌症是间皮素瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、三阴性乳腺癌或卵巢癌。

22.分离的核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗体、权利要求10-13中任一项所述的免疫偶联物、或权利要求14或权利要求15所述的融合蛋白。

23.如权利要求22所述的分离的核酸分子，其中，编码所述单克隆抗体的VH结构域的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：14。

24.如权利要求22或权利要求23所述的分离的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接到启动子。

25.表达载体，其包括权利要求22-24中任一项所述的分离的核酸分子。

26.分离的宿主细胞，所述宿主细胞被权利要求22-25中任一项所述的核酸分子或表达载体转化。