CN116751300A - 抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用 - Google Patents

抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116751300A
CN116751300A CN202310713175.6A CN202310713175A CN116751300A CN 116751300 A CN116751300 A CN 116751300A CN 202310713175 A CN202310713175 A CN 202310713175A CN 116751300 A CN116751300 A CN 116751300A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cancer
msln
antibody
polynucleotide
heavy chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310713175.6A
Other languages
English (en)
Inventor
王文升
沈晓钢
唐旭东
许晓强
蒲程飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Sidansai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Sidansai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Sidansai Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Sidansai Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310713175.6A priority Critical patent/CN116751300A/zh
Publication of CN116751300A publication Critical patent/CN116751300A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Abstract

本申请公开了一种抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用，属于抗体与癌症治疗技术领域。本发明利用间皮素(MSLN)全长序列和MSLN R3domain作为免疫原免疫羊驼，通过羊驼体内自身的抗体成熟阶段来得到抗体基因，通过噬菌体展示筛选技术从羊驼抗体库中筛选得到最适合的抗体序列。使用针对间皮素(MSLN)的抗体的新型组合物和治疗方法，有选择性地靶向表达MSLN的癌细胞，用于治疗癌症，特别是恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤。

Description

抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用
技术领域
本发明属于抗体与癌症治疗技术领域，具体涉及抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用。
背景技术
间皮素(mesothelin，MSLN)最初发现是一个能被单克隆抗体K1特异性识别的抗原，近年来发现MSLN作为一种肿瘤分化抗原，在恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤中呈过度表达。
抗体是由免疫系统产生的蛋白质，能够特异性地结合到称为抗原的靶分子。单克隆抗体(monoclonal antibody，mAbs)是一种工程化的抗体，能够识别和结合到单个特定的抗原。由于其高度特异性，mAbs已成为治疗癌症等多种疾病的有前途的治疗药物类别之一。
重链单域抗体(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH)，也称为纳米抗体(nanobody,a single domain antibody)，和普通抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单，易于进行基因改造，体积小，抗原特异性好，组织穿透力强，稳定性高，在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用，使用针对间皮素(MSLN)的抗体或抗体药物偶联物(ADCs)的新型组合物和治疗方法，用于治疗癌症，特别是恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤。本申请涵盖了这些治疗药物的开发和使用，以有选择性地靶向表达MSLN的癌细胞，从而提供了一种有针对性的癌症治疗方法，可以减少靶外效应并降低对正常组织的毒性。
本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。
附图说明
图1是免疫羊驼血清抗性测试。
图2是检测PBMC提取RNA纯度凝胶电泳图。
图3是不同cDNA模板浓度下巢式PCR的凝胶电泳图。
图4是cDNA模板浓度为5.0μL的第一轮巢式PCR的凝胶电泳图。
图5是cDNA模板浓度为5.0μL的第二轮巢式PCR的凝胶电泳图。
图6是库转化子数目。
图7是从库转化子数目滴度平板上挑取的48个克隆PCR产物的凝胶电泳图。
图8是用Sequencher Scanner v1.0和DNASTAR软件分析得出库多样性氨基酸比对序列。
图9是用Sequencher Scanner v1.0和DNASTAR软件分析得出库多样性氨基酸比对序列。
图10是用Sequencher Scanner v1.0和DNASTAR软件分析得出库多样性氨基酸进化树。
图11是用Sequencher Scanner v1.0和DNASTAR软件分析得出库多样性氨基酸进化树。
图12是部分neo VHH antibody流式检测图。
图13是部分neo VHH antibody流式检测图。
图14是部分抗体与hM-R3-his结合图。
图15是部分抗体与hM-R3-his结合图。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管可在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但还是描述了优选的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。
本文使用冠词“一个/种(a/an)”是指一个或多于一个(即，至少一个)物品的语法对象。举例来说，“一种要素”意指一种要素或多于一种要素。
“大约”意指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
如本文所用，术语“激活”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞状态。激活也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。
术语“抗体”以最广义使用，是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性或功能即可。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如，抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“Fv”是指包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠，产生了六个高变环(3个环来自H链，3个环来自L链)，其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予了对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。
如本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中的较大者。如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，诸如例如由噬菌体表达的抗体。所述术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而生成的抗体。使用本领域可用和众所周知的技术来获得合成DNA。
术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可涉及抗体产生或特异性免疫能力细胞的激活或两者。抗原包括任何大分子，所述大分子包括所有蛋白质或肽，或衍生自重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引发免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。抗原可以从生物样品中生成、合成或衍生自生物样品，所述生物样品包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减小、肿瘤细胞数减少、转移数减少、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加或与癌性病状相关的各种生理症状改善相关的生物作用。也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先在预防肿瘤发生方面的能力来表现出“抗肿瘤作用”。
术语“自体抗原”是指被免疫系统误认为是外来的抗原。自体抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
术语“自体”用于描述衍生自受试者的材料，其随后被重新引入同一受试者中。
术语“同种异体”用于描述衍生自相同物种的不同受试者的移植物。作为实例，供体受试者可以是相关或不相关的或受体受试者，但是供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标志物。
术语“异种”用于描述衍生自不同物种的受试者的移植物。作为实例，供体受试者与受体受试者来自不同的物种，并且供体受试者和受体受试者可以是遗传学和免疫学上不相容的。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞快速且不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
可以治疗的癌症包括未血管化或尚未充分血管化的肿瘤、以及血管化肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或可以包括实体瘤。待用本公开的抗体治疗的癌症类型包括但不限于癌瘤、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌瘤和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红血球性白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合症、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤根据形成它们的细胞类型而命名(诸如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌瘤的实例包括纤维肉瘤、粘肉肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴性恶性肿瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS(中枢神经系统)肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形胶质细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上低水平表达。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含”、包括”将被理解为暗示包括所述的步骤或要素(成分或组分)或步骤或要素(成分或组分)组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素组。
短语“由......组成”意指包括并且限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”指示所列出的要素是必需或强制性的，而且不会存在其他要素。
短语“基本上由......组成”意指包括在短语之后列出的任何要素，并且可以包括不干扰或不影响本公开中针对所列要素所指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由......组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的，并且取决于它们是否影响所列要素的活动或动作，可以存在或可以不存在。
术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则关联在一起的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配，或在核酸之间可以存在“完全的”或“全部的”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有重要作用。
术语“对应于”或“对应于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补，或者编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。
“疾病”和“病症”这两个词可以互换使用，也可以有所不同，因为特定的疾病或病症可能没有已知的病原体(因此病因尚未确定)，因此尚未得到认可作为一种疾病，但仅作为一种不良状况或综合症，临床医生已经确定了一组或多或少特定的症状。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则受试者的健康继续恶化。相反，受试者的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但动物的健康状态不如没有病症时的健康状态。如果不加以治疗，疾病不一定会导致动物健康状况进一步下降。
术语“有效”是指足以实现期望的、预期的或意图的结果。例如，在治疗背景下的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。
术语“编码”是指多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中的特定核苷酸序列在生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述生物过程具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了用“U”代替“T”以外)并且通常提供在序列表中的编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链可被称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
术语“外源”是指并非天然存在于野生型细胞或生物体中，但通常通过分子生物学技术引入细胞中的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。同样，通过分子生物学技术从第一生物体分离并转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如，以产生原本天然存在的多核苷酸序列的一个或多个其他拷贝，从而促进编码多肽的过表达。
术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用要素；用于表达的其他要素可以由宿主细胞提供或提供在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的并入重组多核苷酸的所有载体，诸如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“同源的”是指当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，例如，如果两个DNA分子中的每个中的一个位置被腺嘌呤占据，则分子在所述位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列享有的匹配或同源位置数除以所比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。当比对两个序列时进行比较，以得到最大同源性。
术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指用作抗体的一类蛋白质。包括在此类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物，诸如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物和呼吸道与泌尿生殖道的粘液分泌物中的一抗。IgG是最常见的循环抗体。在大多数受试者中，IgM是初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且对于防御细菌和病毒很重要。IgD是不具有已知抗体功能但可以充当抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过暴露于过敏原时，引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
术语“分离的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。所述材料可以是细胞或大分子，诸如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已从以天然存在状态的方式位于其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如已从通常与片段相邻的序列中去除的DNA片段。或者，如本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从其天然细胞环境以及从其与细胞的其他组分的缔合中体外分离和/或纯化肽或多肽分子。
术语“基本上纯化的”是指基本上不含在其天然状态下通常与其缔合的组分的材料。例如，基本上纯化的细胞是指在其天然存在或天然状态下从通常与其缔合的其他细胞类型中分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语简单地是指在其天然状态下从与其天然缔合的细胞中分离的细胞。在实施方案中，细胞在体外培养。在实施方案中，细胞并非在体外培养。
在本公开的上下文中，使用了以下常见存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语核苷酸序列也可以包括内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可以包含一个或多个内含子。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。此外，使用慢病毒能够将遗传信息整合到宿主染色体中，从而产生稳定转导的遗传信息。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的情况下受试者中的反应水平相比，和/或与其他相同但未治疗的受试者中的反应水平相比，介导受试者中反应水平的可检测的增加或降低。所述术语涵盖干扰和/或影响天然信号或反应，从而在受试者、优选地人中介导有益的治疗反应。
当核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，所述核酸是“可操作连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。
术语“在转录控制下”是指启动子可操作地连接至多核苷酸并相对于多核苷酸并处于正确的位置和方向，以控制由RNA聚合酶进行的转录开始和多核苷酸表达。
术语“过度表达”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过度表达”旨在指示相对于来自特定组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自患者的所述组织或器官中的疾病区域(例如实体瘤)的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定患有特征在于肿瘤抗原过表达的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。
术语组合物的“肠胃外施用”包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、胸骨内注射或输注技术。
术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文可互换使用，并且是指适用于本文描述的方法的任何人、动物或活生物体。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括在其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物，诸如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。
需要治疗或其有需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病状或病症的受试者。其有需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病状或病症的受试者。在实施方案中，疾病是癌症。
术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。所述术语通常是指长度至少为10个碱基的聚合形式核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或修饰形式的任一类型核苷酸。所述术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。
术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸区分开的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸代替的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和替换，从而使改变后的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物功能或活性或相对于参考多核苷酸具有增加的活性(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与本文描述的参考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％以及其间的所有整数百分比，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。
术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，诸如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括酶促多肽或“酶”，其通常催化各种化学反应(即，增加其速率)。
术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或替换至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分开的多肽。在实施方案中，多肽变体通过一个或多个替换而与参考多肽区分开，所述一个或多个替换可以是保守的或非保守的。在实施方案中，多肽变体包含保守替换，并且就这一点而言，在本领域中众所周知，可以将一些氨基酸改变为具有大致相似特性的其他氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还涵盖其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基代替的多肽。
术语“启动子”是指由细胞的合成机制识别或引入合成机制，开始多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。术语“表达控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
术语“结合”、“结合”或“与......相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中第二分子但基本上不识别或粘附于样品中其他结构无关分子的分子。如本文所用关于抗体的术语“特异性结合”，是指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种种间反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，意味着相互作用取决于化学物种上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是结合任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在包含标记“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离、未标记的A)的分子将减少与抗体结合的标记A的量。
“切割”是指DNA分子的共价主链断裂。可以通过各种方法来进行切割，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割都是有可能的，双链切割可以由两个不同的单链切割事件而引起。DNA切割可以导致钝端或交错端的产生。在实施方案中，融合多肽用于靶向的双链DNA切割。
“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子将结合的核酸的一部分的核酸序列，条件是存在足够的结合条件。例如，序列5'GAATTC 3'是Eco Rl限制性内切酶的靶位点。
“融合”分子是其中两个或更多个亚基分子优选共价连接的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，或可以是不同化学类型的分子。第一类型的融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP DNA结合结构域和一个或多个激活结构域之间的融合)和融合核酸(例如，编码上述融合蛋白的核酸)。第二类型的融合分子的实例包括但不限于形成三链体的核酸与多肽之间的融合，以及小沟结合物(minor groove binder)与核酸之间的融合。
融合蛋白在细胞中的表达可以由融合蛋白向细胞的递送或编码融合蛋白的多核苷酸向细胞的递送引起，其中转录多核苷酸，并且翻译转录物以生成融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽连接也可以参与蛋白质在细胞中的表达。在本公开的其他地方提出了用于多核苷酸和多肽向细胞递送的方法。
基因表达的“调节”是指基因活性的变化。表达的调节可以包括但不限于基因激活和基因抑制。基因组编辑(例如，切割、改变、失活、随机突变)可以用来调节表达。基因失活是指与不包括本文所述的ZFP的细胞相比，基因表达的任何减少。因此，基因失活可以是部分的或全部的。
“目的区域”或“感兴趣的区域”是细胞染色质的任何区域，例如像基因、或基因内或与基因相邻的非编码序列，其中期望结合外源分子。结合可以是出于靶向DNA切割和/或靶向重组的目的进行的。感兴趣的区域可以例如存在于染色体、游离体、细胞器基因组(例如线粒体、叶绿体)或感染性病毒基因组中。感兴趣的区域可以在基因的编码区内，在转录的非编码区内，例如像前导序列、拖尾序列或内含子，或在非转录区内，编码区的上游或下游。感兴趣的区域的长度可以小到单个核苷酸对或高达2,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。
“统计学上显著的”意指结果不太可能是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。常用的显著性度量包括p值，所述p值是在虚假设为真时观察到的事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝虚假设。在简单情况下，显著性水平被定义为0.05或更小的p值。“减少”或“降低”或“较少”的量通常是“统计学上显著的”或生理上显著的量，并且可包括与本文描述的量或水平相比约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括介于1和大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减少量。
术语“治疗”是指治疗和/或预防，通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态的症状可获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指本发明的化合物的量，其将引发研究人员、兽医、医生或另外临床医生所寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应。术语“治疗有效量”包括当施用时足以防止所治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状的发展或在某种程度上对其减轻的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。
术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。
术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸体外和体内(在受试者体内)递送至细胞内部的多核苷酸。在本领域中已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体是通过多重减毒HIV毒力基因生成的，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，从而使得载体具有生物安全性。
在实施方案中，编码抗原结合分子和/或治疗剂的多核苷酸可用于实施本文所述的技术。该方法或用途包括：提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或它们的变体)，该载体基因组包含多核苷酸，其中多核苷酸可操作地连接至赋予多核苷酸转录的表达控制元件；向受试者施用一定量的病毒颗粒，使得多核苷酸在受试者中表达。在实施例中，AAV制剂可以包括AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产品。有关病毒颗粒给药和制备的更多信息，请参见美国专利号：9840719和Milani等人，Sci.翻译。医学。11,eaav7325(2019)2019年5月22日，通过引用将其并入本文。在实施方案中，多核苷酸可以整合到修饰细胞的基因组中并且修饰细胞的后代也将表达多核苷酸，从而产生稳定转染的修饰细胞。在实施例中，经修饰的细胞表达编码抗体的多核苷酸，但多核苷酸不整合到经修饰的细胞的基因组中，使得经修饰的细胞在有限的时间段(例如，几天)内表达瞬时转染的多核苷酸，之后多核苷酸因细胞分裂或其他因素而丢失。例如，多核苷酸存在于重组DNA构建体、mRNA或病毒载体中的修饰细胞中，和/或多核苷酸是mRNA，其未整合到修饰细胞的基因组中。
范围：在整个公开内容中，可以以范围形式来呈现本公开的各个方面。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不可改变的限制。因此，对范围的描述应被认为已明确公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围的描述诸如从1到6应被认为已明确公开了子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及所述范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
本公开的实施方案涉及使用抗体来治疗癌症。实施方案涉及编码抗体的分离的核酸序列。其中抗体结合实体瘤的抗原。
本公开的药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由诸如患者病状以及患者疾病的类型和严重性等因素来确定，尽管可以通过临床试验确定适当的剂量。
当指明“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”、“治疗量”或“有效量”时，本公开的组合物的精确量至可由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定施用的剂量。
本文描述的药物组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文描述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或或腹膜内向患者施用。
待向患者施用的上述治疗的剂量将随所治疗病状的确切性质和治疗接受者而变化。可以根据各种因素，由医师根据本领域公认的实践来进行用于人类施用的剂量缩放比例。
实施方案涉及抗间皮素重链单域抗体，能够结合间皮素。
在实施例中，抗间皮素重链单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:8任一所示。
实施方案涉及分离的多核苷酸，该多核苷酸编码上述任一抗间皮素重链单域抗体。
在实施例中，编码SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的多核苷酸分别如SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:18所示。
实施方案涉及包含本文所述的分离的多核苷酸的载体。
实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸序列的分离的细胞。
实施方案涉及抗间皮素重链单域抗体、编码抗间皮素重链单域抗体的多核苷酸、含本文所述的分离的多核苷酸的载体和/或包含本文所述的分离的核酸序列的分离的细胞在癌症治疗中的应用。在实施例中，癌症包括恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤的一种或多种。
实施方案涉及抗间皮素重链单域抗体、编码抗间皮素重链单域抗体的多核苷酸、含本文所述的分离的多核苷酸的载体和/或包含本文所述的分离的核酸序列的分离的细胞在制备癌症治疗药物中的应用。在实施例中，癌症包括恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤的一种或多种。
实施方案涉及一种药物组合物，包括抗间皮素重链单域抗体、编码抗间皮素重链单域抗体的多核苷酸、含本文所述的分离的多核苷酸的载体和/或包含本文所述的分离的核酸序列的分离的细胞。
实施方案涉及本文所述的组合物在治疗患有癌症的受试者的方法中的用途，该方法包括：向受试者施用有效量的组合物。在实施例中，癌症包括恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤的一种或多种。
实施方案涉及本文所述的组合物在增强免疫疗法在患有癌症的受试者中的抗肿瘤功效的方法中的用途，该方法包括：向受试者施用有效量的组合物。在实施例中，癌症包括恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤的一种或多种。
实施方案涉及治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物。在实施例中，癌症包括恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤的一种或多种。
通过参考以下示例性实施方案和实施例进一步描述本公开。提供这些示例性实施方案和实施例仅出于说明的目的，除非另有说明，否则它们不意图构成限制。因此，本公开决不应解释为限于以下示例性实施方案和实施例，而应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
重链单域抗体的获得通过免疫羊驼并通过羊驼体内自身的抗体成熟阶段来得到抗体基因，通过噬菌体展示筛选技术从羊驼抗体库中筛选得到最适合的抗体序列。具体包括：
羊驼免疫：
在本实施例中，使用的抗原为间皮素(MSLN)全长序列(SEQ ID NO:21)和MSLN R3domain(SEQ ID NO:22)，即MSLN 487-598region III。
挑选健康强壮、精神状态良好、体型适中的两只羊驼，标记为NB311-A和NB311-B后进行免疫，并在免疫前对羊驼进行采血以留下背景血清(阴性血清)。
在第2、3、4次免疫后进行采血用于免疫评价，结果如图1所示，检测到羊驼经过抗原免疫后血清中产生了抗MSLN的抗体。
噬菌体文库构建：
(1)外周血淋巴细胞分离
采集NB311-A、NB311-B三免、四免之后50mL外周血，按照淋巴细胞分离液(灏洋生物，Cag#LTS1077，Lot#20200610-6839)使用说明分离PBMC。
(2)RNA提取
用RNAiso Plus(Takara，货号：9109)试剂提取NB311-A、NB311-B三免、四免的PBMC总RNA。
(3)凝胶电泳检测RNA纯度
取1μg RNA电泳，检测RNA纯度，结果如图2所示，其中M为DNA marker；1为NB311-A三免RNA；2为NB311-A四免RNA；3为NB311-B三免RNA；4为NB311-B四免RNA，结果表明RNA纯度良好。
(4)反转录
参见PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，货号：6210A)说明书，共转录5μg RNA。
具体如下：
从-20℃冰箱取出PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Ki各组分解冻，混匀，短暂离心，冰上放置；在0.2μL的离心管中加入下表1中的组分，混匀；在65℃孵育5min，冰上放置1分钟以上；配置cDNA合成体系，加入下表2中的组分，混匀；轻轻混匀，按照如下表3程序进行反应；反应完成之后将反应产物短暂离心，cDNA放入-20℃保存。
表1反转录反应体系1
表2反转录反应体系2
表3反转录反应程序
反应温度 30℃(Random 6mers) 42℃ 75℃ 4℃
反应时间 10min 60min 15min ∞
(5)巢式PCR第一轮cDNA模板浓度摸索
将NB311-A和NB311-B项目三免和四免cDNA原液等比例混合后稀释5倍进行扩增，巢式PCR第一轮上游引物序列为：5’-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3’(SEQ ID NO:23)，巢式PCR第一轮下游引物序列为5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID NO:24)；反应体系表4所示，反应条件如表5所示，结果如图3所示，其中：1为0.5μL，2为1μL，3为2.5μL，4为5μL。NB311-A和NB311-B项目三免和四免cDNA原液等比例混合后稀释5倍，选择加5.0μL为最佳扩增浓度。
表4巢式PCR一轮反应体系
表5巢式PCR反应条件
温度 时间
步骤1 98℃ 2min
步骤2 98℃ 10s
55℃ 30s
72℃ 45s
按步骤2 25循环
步骤3 72℃ 7min
步骤4 4℃ ∞
(6)巢式PCR第一轮
按上一步探索的模板浓度条件，按上表中反应体系进行PCR反应，共扩增5管。
PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，割胶回收750bp左右的编码羊驼的单重链抗体VHH的片段。
(7)巢式PCR第二轮
采用第一轮巢氏PCR反应体系和反应条件，羊驼单链抗体有两个亚型，因铰链区大小不同，需要设计不同的下游引物，巢氏PCR第二轮上游引物序列为：5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’(SEQ ID NO:25)，巢氏PCR第二轮下游引物-1为：5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3’(SEQ ID NO:26)，巢氏PCR第二轮下游引物-2为：5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3’(SEQ ID NO:27)；以第一轮PCR扩增回收产物作为模版，扩增目的基因片段，并进行2％琼脂糖电泳，结果如图5所示，用DNA产物纯化试剂盒纯化回收500bp左右的编码羊驼的单重链抗体VHH的片段。将纯化的编码羊驼的单重链抗体VHH的片段保存在-20℃以下的条件下。
(8)载体与目的片段连接
将载体pComb3XSS与目的片段(编码VHH的片段)分别用SfiI进行酶切，50℃过夜酶切，然后回收目的片段，载体pComb3XSS与目的片段的连接摩尔比例为Vector:VHH＝1:3。
(9)电转化
共进行了10次电击转化，电击之后立即向电击杯中加入1mL 2YT培养基(37℃预热)复苏，吸出电击产物并用2YT培养基洗净电击杯，共计获得100mL复苏产物，37℃，180rpm复苏45min，取100μL梯度稀释至10-3和10-4测定库转化子数目，涂布于90mm的平板上，其余离心，加入8mL 2YT重悬，涂布于8块200mm的平板上。第二天在测定库转化子数目的平板上NB311-A项目10-4共有312个克隆，NB311-B项目10-4共有179个克隆(图6)。
(10)菌落PCR验证插入率和库多样性分析
随机从测库转化子数目滴度平板上挑取48个克隆进行鉴定(图7)，结果表明插入率为100％。
将48个阳性克隆送测序，测序引物pComb3XSS-F。NB311-A测序成功48个克隆，其中测序为非单克隆3个，克隆编号分别为8，18和45。NB311-B测序成功48个克隆，其中测序为非单克隆3个，克隆编号分别为23，31和40。
用Sequencher Scanner v1.0和DNASTAR软件分析得出库多样性，氨基酸比对序列和进化树如图8-9和图10-11所示。
根据库转化子数，库插入率和多样性测序分析结果，NB311-A项目建库库容为3.12×109(312×1000×104×1×1)；NB311-B项目建库库容为1.79×109(179×1000×104×1×1)。文库库容和多样性良好，可以进行下一步筛选。
(11)噬菌体文库包装
将细菌文库接入2×300mL 2YT+A+G(Amp:100ug/ml、Glu:1％)培养基中，至其初始OD600＝0.1-0.2，37℃、230rpm培养至OD600＝0.8以上。
根据OD600值加入辅助噬菌体M13KO7，(辅助噬菌体：细菌＝20:1)。
加入M13KO7后，混匀，37℃静置30min。37℃，180r pm缓摇30min。5000rpm离心10min，弃尽上清，用等体积2YT+A+K(Amp:100μg/ml、Kan:50μg/ml)培养基重悬沉淀，30℃，220rpm过夜。
过夜培养物4℃，10000rpm离心20min，收取上清，弃沉淀。更换离心筒，4℃，10000rpm，离心20min，收取上清。按上清体积的1/5加入PEG8000/NaCl，混匀，冰浴沉淀2小时以上。
4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，空离一次除尽上清。1mL 1×PBS悬起沉淀，加入1/5体积的PEG8000/NaCl二次沉淀1h。
4℃，12000rpm，离心10min弃上清，空离一次除尽上清。根据沉淀的量，加入1×PBS重悬沉淀。
加100％甘油至终浓度为50％，混匀后分装到1.5mL EP管中，-80℃保存。
取10μL库噬菌体用2YT梯度稀释，从10-8和10-9管中取10μL加到90μL的TG1菌液中，轻柔混匀。37℃静置15min，分别涂布Amp抗性平板，过夜培养。
第二天，NB311-A项目10-9滴度平板上共有668个克隆，噬菌体文库滴度为6.68×1013cfu/mL(668×109×100)；NB311-B项目10-9滴度平板上共有676个克隆，噬菌体文库滴度为6.76×1013cfu/mL(676×109×100)。
抗体筛选：
(1)ELISA检测蛋白结合
包被酶标板：以2μg/ml的浓度分别包被MSLN、MSLN-R3-his作为抗原蛋白。(50mMNaHCO3 pH＝9.6)，100μl/孔，4℃过夜。
封闭：用PBST洗涤3次，以300μl/well，5％的牛奶进行封闭，37℃2h。
加样孵育：用PBST洗涤1次，分别将各待检测蛋白稀释至1μg/ml(5％牛奶稀释)；分别取100μl加入到包被MSLN、MSLN-R3-his为抗原的ELISA板孵育。37℃孵育1h。
加二抗：用PBST洗涤5次，加入封闭液稀释后的二抗(Anti-human IgG-HRP)。
显色读数：将孵育了二抗的酶标板，用PBST洗涤5次，每孔100μl加入TMB单组分显色液37℃孵育7min，50μl/孔加入1M HCL终止反应，OD450读数。
结果如表6和表7所示，NB311-B-Anti-MSLN-1、NB311-B-Anti-MSLN-24、NB311-B-Anti-MSLN-30、NB311-B-Anti-MSLN-61、NB311-B-Anti-MSLN-107、NB311-A-85、NB311-B-10、NB311-B-48、NB311-B-98、NB311-B-109、NB311-B-118蛋白均能有效识别MSLN和MSLN-R3-his蛋白。其中NB311-B-48结合能力较弱；NB311-A-94蛋白不能识别MSLN、MSLN-R3-his蛋白。
表6
/>
表7
NB311-B-109/NB311-A-2-26/NB311-A-2-30/NB311-A-2-68/NB311-A-2-82/NB311-A-2-109/NB311-A-2-168/NB311-A-2-172/NB311-B-2-1/NB311-B-2-187/NB311-B-2-262蛋白均能识别MSLN、MSLN-R3-his。
(2)neo VHH antibody(流式检测结果)
收获细胞并用FACS缓冲液洗涤细胞一次；将2×105个活细胞等分到每个试管中；将上述蛋白质稀释至2μg/ml，然后将50μL稀释的样品溶液加入带有细胞沉淀的管中；充分混合并在4℃下孵育60分钟；用FACS缓冲液洗涤细胞一次；按照制造商说明稀释二抗，并向每个试管中加入100μL稀释溶液，在4℃下孵育60分钟(避光)；用FACS缓冲液洗涤细胞3次，并将细胞沉淀重悬于每个样品的200μL PBS中；将细胞悬液转移到流管中，并通过流式细胞术检测细胞。
结果如图12和图13所示。
在图12中，NB311-B-109>NB311-B-Anti-MSLN-61＝NB311-A-85>NB311-B-Anti-MSLN-1(有一点非特异)>NB311-B-Anti-MSLN-24>NB311-B-98。
在图13中，NB311-B-2-1、NB311-A-2-30、NB311-A-2-82、NB311-A-2-109、NB311-B-2-187、NB311-B-2-262(293T稍微有些偏移)都有特异性结合，结合亲和力等其他数据开展下一步实验，其余与293T有非特异性结合。
(3)亲和力测定
分别检测NB311各蛋白与hM-R3-his(MSLN R3 domain)的结合情况。
试剂耗材：缓冲液：PBST(20mmPBS+0.02％吐温20+0.1％BSA)；Sensor：ProA；
样品如表8所示：
表8
Sample 检测用浓度
hM-R3-his 100、50、25nM
Anti-MSLN-1(NB311-B-Anti-MSLN-1) 100nM
Anti-MSLN-24(NB311-B-Anti-MSLN-24) 100nM
Anti-MSLN-61(NB311-B-Anti-MSLN-61) 100nM
Anti-MSLN-A-85(NB311-A-85) 100nM
Anti-MSLN-B-109(NB311-B-109) 100nM
Anti-MSLN-B-2-1(MB311-B-2-1) 100nM
Anti-MSLN-A-2-30(NB311-A-2-30) 100nM
Anti-MSLN-A-2-82(NB311-A-2-82) 100nM
Anti-MSLN-A-2-109(NB311-A-2-109) 100nM
Anti-MSLN-B-2-187(NB311-B-2-187) 100nM
结果如表9和图14、图15所示，在与hM-R3-his的互作中，各蛋白所得曲线清晰，且结合解离状态明确(其中阳参M5，Anti-MSLN-B-109未检测到结合)，R^2高，可信度高。NB311各蛋白与hM-R3-his的亲和力有以下顺序：Anti-MSLN-B-2-1＞Anti-MSLN-24＞Anti-MSLN-B-2-187＞Anti-MSLN-A-2-30＞Anti-MSLN-1＞Anti-MSLN-A-2-109＞Anti-MSLN-61＞Anti-MSLN-A-2-82＞Anti-MSLN-A-85＞Anti-MSLN-B-109。
表9
Sample KD(M) ka(1/Ms) kdis(1/s) Full R^2
Anti-MSLN-1(NB311-1) 4.40E-09 1.23E+05 5.42E-04 0.9979
Anti-MSLN-24(NB311-24) 1.22E-09 1.81E+05 2.21E-04 0.9936
Anti-MSLN-61(NB311-61) 5.27E-09 1.06E+05 5.60E-04 0.9977
Anti-MSLN-A-85(NB311-A-85) 9.40E-09 1.48E+05 1.39E-03 0.9905
Anti-MSLN-B-109(NB311-B-109)
Anti-MSLN-B-2-1(NB311-B-2-1) <1.0E-12 1.65E+05 <1.0E-07 0.9954
Anti-MSLN-A-2-30(NB311-A-2-30) 3.99E-09 1.40E+05 5.58E-04 0.9986
Anti-MSLN-A-2-82(NB311-A-2-82) 7.99E-09 1.50E+05 1.20E-03 0.9962
Anti-MSLN-A-2-109(NB311-A-2-109) 4.99E-09 1.53E+05 7.62E-04 0.9975
Anti-MSLN-B-2-187(NB311-B-2-187) 2.86E-09 1.59E+05 4.54E-04 0.9954
注：ka/kdis，即Kon/Koff。

Claims (8)

1.一种抗间皮素重链单域抗体，其特征在于，能够结合间皮素，氨基酸序列如SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:8任一所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1中所述抗间皮素重链单域抗体。
3.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1-8所示的抗间皮素重链单域抗体的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11-18所示。
4.一种载体，其特征在于，包含权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一种细胞，其特征在于，包含权利要求2或3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体。
6.权利要求1所述抗间皮素重链单域抗体、或权利要求2或3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的载体、或权利要求5所述细胞在制备癌症治疗药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述癌症包括恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤的一种或多种。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述抗间皮素重链单域抗体、或权利要求2或3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的载体、或权利要求5所述细胞。
CN202310713175.6A 2023-06-15 2023-06-15 抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用 Pending CN116751300A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310713175.6A CN116751300A (zh) 2023-06-15 2023-06-15 抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310713175.6A CN116751300A (zh) 2023-06-15 2023-06-15 抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116751300A true CN116751300A (zh) 2023-09-15

Family

ID=87958408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310713175.6A Pending CN116751300A (zh) 2023-06-15 2023-06-15 抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116751300A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104955845A (zh) * 2012-09-27 2015-09-30 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法
CN108129566A (zh) * 2017-12-31 2018-06-08 中国科学院武汉病毒研究所 靶向间皮素的高亲和力c-型单域抗体及其制备方法与应用
WO2019043026A1 (en) * 2017-08-30 2019-03-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) ANTI-MESOTHELIC RADIOMARQUATED SINGLE DOMAIN ANTIBODIES SUITABLE FOR IMAGING AND TREATING CANCERS
CN114685666A (zh) * 2020-12-28 2022-07-01 浙江纳米抗体技术中心有限公司 抗间皮素纳米抗体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104955845A (zh) * 2012-09-27 2015-09-30 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法
WO2019043026A1 (en) * 2017-08-30 2019-03-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) ANTI-MESOTHELIC RADIOMARQUATED SINGLE DOMAIN ANTIBODIES SUITABLE FOR IMAGING AND TREATING CANCERS
CN108129566A (zh) * 2017-12-31 2018-06-08 中国科学院武汉病毒研究所 靶向间皮素的高亲和力c-型单域抗体及其制备方法与应用
CN114685666A (zh) * 2020-12-28 2022-07-01 浙江纳米抗体技术中心有限公司 抗间皮素纳米抗体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDENNOUR BENLOUCIF 等: "Rapid nanobody-based imaging of mesothelin expressing malignancies compatible with blocking therapeutic antibodies", FRONT IMMUNOL ., vol. 14, pages 1200652 *
吴标 等: "羊驼非免疫重链单域抗体库的构建和鉴定", 现代免疫学, vol. 31, no. 05, pages 353 - 357 *
段爱军 等: "间皮素与肿瘤靶向治疗", 中国医药生物技术, vol. 14, no. 03, pages 258 - 262 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110818802B (zh) 一种嵌合t细胞受体star及其应用
US20200102366A1 (en) Chimeric antigen receptors (car) and methods for making and using the same
CN107531800B (zh) 用于嵌合抗原受体分子的调控表达的慢病毒载体
CN112280796A (zh) 使用融合蛋白进行t细胞受体重编程的组合物和方法
CN106459916A (zh) 作为细胞治疗剂的car‑表达nk‑92细胞
CN106574272A (zh) 靶向多样的多种抗原的通用嵌合抗原受体表达性免疫细胞及其制造方法及其在癌症、感染和自身免疫病的治疗中的应用
CN114667294B (zh) 特异性结合b细胞成熟抗原的抗体及其用途
CN107033248A (zh) 识别癌胚抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN108949828A (zh) 表达TGF-β抗体的慢病毒载体、CAR-T细胞的构建方法及应用
CN109897110B (zh) 纳米抗体及其制备方法
CN110922482B (zh) 可结合cd19的多肽及其应用
CN110713536B (zh) 可结合sftsv的多肽、其核酸编码序列及应用
US11707486B2 (en) Natural killer cell expressing anti-cotinine chimeric antigen receptor
WO2020248486A1 (zh) 以Tcm为主要效应成分的CAR-T制备方法及其应用
WO2018137294A1 (zh) 共表达抗msln嵌合抗原受体和无功能egfr的转基因淋巴细胞及其用途
US11926676B2 (en) Masked chimeric antigen receptor specific to tyrosine-protein kinase like 7 (PTK7) and immune cells expressing such
JP7138989B1 (ja) メソテリンに特異的に結合する抗メソテリンキメラ抗原受容体
CN106967684A (zh) 共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的转基因淋巴细胞及其用途
CN116751300A (zh) 抗间皮素重链单域抗体及其在癌症治疗中的应用
CN114920841B (zh) 抗cd87抗体及其特异性嵌合抗原受体
CN116535514B (zh) 抗鸟苷酸环化酶c抗体及其在癌症治疗中的应用
WO2019144707A1 (zh) 一种改良的铰链区及其在构建car骨架中的应用
CN110078817B (zh) 一种改良的铰链区及其在构建car骨架中的应用
CN112661844A (zh) 一种靶向EGFRvIII的单链抗体及应用
Anna et al. Promoter’s choice drive CAR-T efficiency

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination