CN111479590A - 靶向间皮素的癌症疫苗及其使用 - Google Patents

Abstract

本文公开了包括编码修饰的共有间皮素抗原的一种或多种核酸序列的核酸分子。公开了包括编码修饰的共有间皮素抗原的一种或多种核酸序列的载体、组合物和疫苗。公开了治疗具有表达间皮素的肿瘤的受试者的方法和预防表达间皮素的肿瘤的方法。公开了修饰的共有间皮素抗原。

Description

靶向间皮素的癌症疫苗及其使用

相关申请的引证

本申请要求于2017年12月13日提交的美国临时专利申请第62/598,289号的优先权和权益，所述美国临时专利申请的公开内容通过引证以其整体并入本文。

序列表

本申请含有呈ASCII格式以电子方式提交并且通过引用以其整体并入本文的序列表。于2018年12月11日创建的所述ASCII文本被命名为104409_000444.txt并且大小为8,223字节。

技术领域

本发明涉及间皮素抗原和编码它们的核酸分子。本发明还涉及包含间皮素抗原和/或核酸分子的疫苗。本发明进一步涉及使用疫苗诱导免疫应答以及预防和/或治疗具有表达间皮素的癌细胞的受试者的方法。

背景技术

癌症仍然是美国和世界范围内主要的死亡原因。癌症疫苗市场正在迅速增长。有效的肿瘤疫苗可用于预防肿瘤生长和/或用作晚期癌症患者的标准疗法的更有效、毒性更低的替代选择。间皮素是与癌症相关的抗原，并且因此是抗肿瘤疫苗的靶标。

间皮素是一种71kD的蛋白质，其可裂解为两种产物：30kD巨核细胞增强因子和41kD GPI锚定的膜结合成熟间皮素。尽管间皮素的功能尚不清楚，但最近的研究表明间皮素可能通过与MUC16结合而在卵巢癌转移中发挥作用，MUC16也在卵巢癌细胞表面高度表达。IHC已在82-100％的浆液性卵巢癌中观察到间皮素的表达。Hassan,R.Europeanjournal of cancer 44,46-53(2008)；Ordonez,N.G.The American journal of surgicalpathology27,1418-1428(2003)。由于间皮素在卵巢癌中的高表达以及其与肿瘤侵袭的相关性，因此其是有吸引力的癌症治疗疫苗靶标。

疫苗用于治疗和预防癌症具有重要意义。现有靶向肿瘤细胞抗原疫苗通常受到体内抗原表达差的限制。因此，在本领域中仍然需要开发适用于表达间皮素的肿瘤的安全和有效疫苗，从而为罹患此类癌症的受试者提供治疗以及提高存活率。

发明内容

本文提供了核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-607的核酸序列；(b)编码包括蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列，所述蛋白质包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；(c)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％相同的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

本文还提供了核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：核苷酸55-1821SEQ ID NO:1；(b)包括核酸分子的全长的至少90％的片段，所述核酸分子包括SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821；(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％相同的片段；以及(d)包括与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。

本文提供了核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；(b)编码包括SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段的核酸序列；(c)编码与SEQ ID NO:2至少96％相同的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码包括与SEQ IDNO:2至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

本文还提供了核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)SEQ ID NO:1；(b)包括SEQ ID NO:1的全长的至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:1至少96％相同的片段；以及(d)包括与SEQ ID NO:1至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包括SEQ ID NO:1所示的所述核酸序列。

本文所述的核酸分子可掺入到载体，如质粒或病毒载体。本文所述的核酸分子可以掺入到载体，如质粒或病毒载体。在一些实施例中，载体包括核酸分子，所述核酸分子包括由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-607的核酸序列；(b)编码包括蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列，所述蛋白质包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；(c)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％相同的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。在进一步的实施例中，载体包括了核酸分子，所述核酸分子包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：核苷酸55-1821SEQ ID NO:1；(b)包括核酸分子的全长的至少90％的片段，所述核酸分子包括SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821；(c)与SEQID NO:1的核苷酸55-1821至少96％相同的片段；以及(d)包括与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。在仍进一步的实施例中，载体包括核酸分子，所述核酸分子包括由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)编码SEQ IDNO:2的核酸序列；(b)编码包括SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段的核酸序列；(c)编码与SEQ ID NO:2至少96％相同的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码包括与SEQ ID NO:2至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。在进一步的实施例中，载体包括核酸分子，所述核酸分子包括由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)SEQ ID NO:1；(b)包括SEQ ID NO:1的全长的至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:1至少96％相同的片段；以及(d)包括与SEQ ID NO:1至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。在仍进一步的实施例中，载体包括SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。

在一些实施例中，本文所述的核酸可操作地连接至调节元件。在一些实施例中，调节元件是启动子和/或聚腺苷酸化信号。在进一步实施例中，启动子是人巨细胞病毒立即早期启动子(hCMV启动子)。在仍进一步的实施例中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH poly A)。

本文还提供了包括本文所述的一种或多种核酸分子的组合物。在一些实施例中，所述组合物包括药学上可接受的载剂。

进一步提供了包括选自由以下组成的组的氨基酸序列的间皮素抗原蛋白质：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；(b)包括蛋白质的全长的至少90％的片段，所述蛋白质包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；(c)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少95％相同的氨基酸序列；以及(d)包括与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少95％相同的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。

进一步提供了包括选自由以下组成的组的氨基酸序列的间皮素抗原蛋白质：(a)SEQ ID NO:2；(b)包括SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:2至少96％相同的氨基酸序列；以及(c)包括与SEQ ID NO:2至少96％相同的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。在一些实施例中，蛋白质包括SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

还提供了包括间皮素抗原的疫苗，其中所述抗原包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施例中，抗原由SEQ ID NO:1编码。

进一步提供了包括核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包括在SEQ ID NO:1所示的所述核酸序列的全长上具有至少约96％相同性的核酸序列。本文进一步公开的是包括核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码间皮素抗原，所述间皮素抗原包括在SEQ ID NO:2所述的所述氨基酸序列的全长上具有至少约96％相同性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子可以包括表达载体。疫苗可进一步包括药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，疫苗可以进一步包括佐剂。在某些实施例中，佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本文还提供了包括间皮素抗原的疫苗，其中所述抗原包括在SEQ ID NO:2所示所述氨基酸序列的全长上具有至少约90％相同性的氨基酸序列。

进一步提供了治疗具有表达间皮素的癌细胞的受试者的方法，该方法包括施用治疗有效量的本文所述的疫苗。在一些实施例中，施用包含电穿孔步骤。在其他实施例中，施用在所述受试者的一个或多个部位发生。

还提供了针对表达间皮素的癌细胞给受试者接种疫苗的方法，其包括施用一定量的本文所述的有效诱导体液免疫应答的疫苗。在一些实施例中，施用包含电穿孔步骤。在其他实施例中，施用在所述受试者的一个或多个部位发生。

本文还提供了核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；(b)编码包括SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段的核酸序列；(c)编码与SEQ ID NO:2至少96％相同的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码包括与SEQID NO:2至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的用作药物的核酸序列。在一些实施例中，本文所述的核酸分子被用作治疗癌症的药物。在一些实施例中，本文描述的核酸分子用于药物的制备。在一些实施例中，本文所述的核酸分子用于制备用于治疗癌症的药物。

本文还提供了核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)SEQ ID NO:1；(b)包括SEQ ID NO:1的全长的至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:1至少96％相同的片段；以及(d)包括与SEQ ID NO:1至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包括SEQ ID NO:1所示的用作药物的核酸序列。在一些实施例中，本文所述的核酸分子被用作治疗癌症的药物。在一些实施例中，本文描述的核酸分子用于药物的制备。在一些实施例中，本文所述的核酸分子用于制备用于治疗癌症的药物。

附图说明

图1说明了间皮素突变体的产生。

图2是GPI锚定的间皮素蛋白前体的结构的示意图。

图3示出了合成共有间皮素的示意图。

图4是修饰的pVAX1主链(pGX0001)的图示。

图5是质粒pGX1438的图示。

图6示出了人横纹肌肉瘤细胞中合成共有间皮素抗原表达的免疫印迹。

图7A-7B使用本公开的实施例说明了合成共有间皮素的免疫原性。

图8使用本公开的实施例说明了流式细胞术门控策略。

图9A-9D说明了由pGX1430诱导的细胞免疫应答。图9A示出了合成共有间皮素诱导的抗原特异性CD4⁺ T细胞应答的频率。图9B示出了合成共有间皮素诱导的抗原特异性CD8⁺T细胞应答的频率。图9C示出了合成共有间皮素特异性CD4⁺ T细胞的细胞因子谱。图9D示出了合成共有间皮素特异性CD8⁺ T细胞的细胞因子谱。

图10A-10D说明了合成共有间皮素特异性T细胞的溶细胞潜力。图10A示出了抗原特异性CD4⁺CD107a⁺ T细胞的频率。图10B示出了抗原特异性CD8⁺CD107a⁺ T细胞的频率。图10C示出了合成共有间皮素特异性CD4⁺CD107a⁺ T细胞的细胞因子谱。图10D示出了合成共有间皮素特异性CD8⁺CD107a⁺ T细胞的细胞因子谱。

图11A-11C使用本公开的实施例示出了来自各个NHP的间皮素特异性IFNγSFU/10⁶PBMC。图11A仅示出间皮素，图11B示出了具有低剂量IL-12(0.04mg)的间皮素，并且图11C示出了具有高剂量IL-12(0.2mg)的间皮素。

图12A-12C使用本公开的实施例示出了平均间皮素特异性IFNγSFU/10⁶ PBMC。图12A仅示出间皮素，图12B示出了具有低剂量IL-12(0.04mg)的间皮素，并且图12C示出了具有高剂量IL-12(0.2mg)的间皮素。

具体实施方式

本发明涉及包括间皮素抗原的疫苗。间皮素在许多肿瘤中表达。因此，疫苗为表达间皮素的癌症或肿瘤提供治疗。本发明的疫苗可以提供用于特定预防或治疗需要治疗的受试者的癌症的特定癌症抗原的任何组合。

设计重组癌症抗原的核酸及其编码的氨基酸序列的一种方式是通过引入改变天然癌症抗原的全部氨基酸序列中特定氨基酸的突变。突变的引入并不会改变癌症抗原以致不能广泛应用于哺乳类受试者，并且优选地人或狗受试者，但可以改变到足以使所得氨基酸序列破坏耐受性或被认为是外源抗原以产生免疫应答。另一种方式可以是创建共有重组癌症抗原，其与其对应的天然癌症抗原具有至少85％至高达99％的氨基酸序列相同性；优选地至少90％至高达98％的序列相同性；更优选地至少93％且最高达98％的序列相同性；或甚至更优选地至少95％且最高达98％的序列相同性。在一些情况下，重组癌症抗原与其相应的天然癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列相同性。天然癌症抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。取决于癌症抗原，癌症抗原的共有序列可以跨哺乳动物物种或在物种的亚型内或跨病毒株或血清型。一些癌症抗原与癌症抗原的野生型氨基酸序列相差不大。一些癌症抗原的核酸/氨基酸序列在物种间差异很大以致于无法产生一致的序列。在这些情况下，产生将打破耐受并产生免疫应答的重组癌症抗原，所述重组癌症抗原与其对应的天然癌症抗原具有至少85％以及高达99％的氨基酸序列相同性；优选地至少90％以及高达98％的序列相同性；更优选地至少93％以及高达98％的序列相同性；或者更优选地至少95％以及高达98％的序列相同性。在一些情况下，重组癌症抗原与其相应的天然癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列相同性。上述方法可以结合起来，使得最终的重组癌症抗原与上述天然癌症抗原氨基酸序列具有类似性百分比。

间皮素抗原可以是部分来自不同物种间皮素序列或一个物种内的不同亚型的共有间皮素抗原，并且因此，共有间皮素抗原是非天然的。修饰可以包含MUC16结合域和/或GPI锚定信号的突变，以及将上游Kozak和IgE前导序列添加到间皮素抗原的N末端。

合成间皮素可诱导抗原特异性T细胞和/或高效价抗体反应，从而诱导或诱发针对表达抗原的癌症或肿瘤的免疫应答或对其作出反应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫应答可以是细胞、体液或细胞和体液两者免疫应答。在一些实施例中，诱导或引起的细胞免疫应答可以包含干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其他实施例中，诱导或诱发的免疫应答可以减少或抑制促进表达抗原的肿瘤或癌症生长的一种或多种免疫抑制因子，例如但不限于下调MHC呈递的因子，上调抗原特异性调节性T细胞(Tregs)、PD-L1、FasL、细胞因子(如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子。

疫苗可进一步与抗检查点抑制剂(如PD-1和PDL-1)的抗体组合，以增强细胞和体液免疫应答的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体可防止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞反应。总体而言，通过设计免疫系统识别的癌症抗原有助于克服肿瘤细胞对免疫的其他形式的抑制作用，这些疫苗可用于与抑制或抑制疗法(如抗PD-1和抗PDL-1抗体疗法)结合以进一步增加T细胞和/或B细胞反应。

定义

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在有冲突的情况下，将以本文件(包含定义)为准。虽然以下描述了优选的方法和材料，但是与本文所述的那些类似或相当的方法和材料可以用于本发明的实施或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用以其整体并入本文。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在是限制性的。本文所使用的术语是出于仅描述特定实施例的目的并且不旨在限制本发明。

如本文所用，术语“包括”、“包含”、“具有(having、has)”“可以”、“含有”以及其变体旨在是开放式过渡型短语、术语或单词，不排除额外行为或结构的可能性。除非上下文明确地另外指明，否则单数形式“一”、“和”和“所述”包含复数指代物。本公开也设想了“包括”、“由本文呈现的实施例或元件组成”和“基本上由本文呈现的实施例或元件组成”的其它实施例，无论是否明确地指出。

对于在此列举数值范围，明确地设想了具有与所列举范围的最小值和最大值相同的精确度的每个中间值。例如，对于6-9的范围，除了6和9外，设想了数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确设想了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

本文所用的“佐剂”是指添加到本文所述的疫苗中以增强间皮素抗原和/或编码本文所述抗原的核酸分子的免疫原性的任何分子。

本文所用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类的抗体，或其片段或衍生物，包含Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双抗体、双特异性抗体、无功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其对期望的表位或从其衍生的序列具有足够的结合特异性的任何混合物。

“间皮素抗原”是指：具有突变的间皮素氨基酸序列的蛋白质，包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；SEQ ID NO:2；具有本文所述长度的其片段、变体，即具有与本文所述SEQ IDNO:2具有相同性的序列的蛋白质、具有本文所述长度的变体的片段、SEQ ID NO:2；具有本文所述长度的其片段、变体，即具有与本文所述SEQ ID NO:2具有相同性的序列的蛋白质、具有本文所述长度的变体的片段，及其组合。抗原可以任选地包含信号肽，如来自其他蛋白质的那些。

本文所用的“编码序列”或“编码核酸”是指包括编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包含与调节元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调节元件包含能够在施用了核酸的受试者或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。

本文所用的“互补(complement、complementary)”是指核酸可以指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文所用，“共有”或“共有序列”是指基于对来自不同生物的相同基因的多个序列的比对的分析的多肽序列。可以制备编码共有多肽序列的核酸序列。包括包括共有序列的蛋白质的疫苗和/或编码此类蛋白质的核酸分子的疫苗可用于诱导针对抗原的广泛免疫。

本文所用的“恒定电流”描述了在递送至组织的电脉冲的持续时间内由所述组织或限定所述组织的细胞所接收或经历的电流。电脉冲从本文所述的电穿孔装置递送。由于本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈，因此此电流在电脉冲的整个生命期内保持在所述组织中的恒定安培数。反馈元件可以在整个脉冲持续时间内测量组织(或细胞)的电阻，并使电穿孔装置改变其电能输出(例如，增加电压)，从而使同一组织中的电流在整个电脉冲(大约几微秒)以及从脉冲到脉冲保持恒定。在一些实施例中，反馈元件包括控制器。

本文所使用的“电流反馈”或“反馈”可以互换使用，并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，其包括测量电极之间的组织中的电流并相应地改变由EP装置递送的能量输出，以便将电流保持在恒定水平。此恒定水平由使用者在脉冲序列或电治疗开始之前预设。反馈可以通过电穿孔装置的电穿孔部件(例如，控制器)来实现，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流并将所监测的电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较，并不断进行能量输出调整，以将监控电流保持在预设水平。反馈回路可能是瞬时的，因为它是模拟闭环反馈。

本文所用的“分散的电流”可以表示从本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流的模式，其中所述模式最小化或优选地消除了在被电穿孔的组织的任何区域上与电穿孔相关的热应力的发生。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动增强”(“EP”)是指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观通路(孔)；它们的存在使生物分子(如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水)从细胞膜的一侧穿过到另一侧。

本文所用的关于核酸序列的“片段”意指编码能够在与本文公开的抗原交叉反应的哺乳动物中诱发免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下述蛋白质片段的各种核苷酸序列中的至少一种的DNA片段。除了添加的任何异源信号肽，片段可包括本文描述的一种或多种核酸序列全长的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，除了添加的任何异源信号肽，片段可包括本文描述的一种或多种核酸序列全长的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。

在一些实施例中，除了添加的任何异源信号肽，片段可与本文描述的一种或多种核酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％相同。在一些实施例中，除了添加的任何异源信号肽外，这些片段可以与下述一种或多种核酸序列至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

在进一步的实施例中，片段可另外任选地包括编码异源信号肽的序列，所述异源信号肽在计算相同性百分比时不包含在内。片段也可以包括如免疫球蛋白信号肽的信号肽的编码序列，例如IgE或IgG信号肽。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以连接至编码序列的片段。

在一些实施例中，片段可包括下述至少一种核酸序列的至少1500种或更多种核苷酸、1510种或更多种核苷酸、1520种或更多种核苷酸、1530种或更多种核苷酸、1540种或更多种核苷酸、1550种或更多种核苷酸、1560种或更多种核苷酸、1570种或更多种核苷酸、1580种或更多种核苷酸、1590种或更多种核苷酸、1600种或更多种核苷酸、1610种或更多种核苷酸、1620种或更多种核苷酸、1630种或更多种核苷酸、1640种或更多种核苷酸、1650种或更多种核苷酸、1660种或更多种核苷酸、1670种或更多种核苷酸、1680种或更多种核苷酸、1690种或更多种核苷酸、1700种或更多种核苷酸、1710种或更多种核苷酸、1720种或更多种核苷酸、1730种或更多种核苷酸、1740种或更多种核苷酸、1750种或更多种核苷酸、1760种或更多种核苷酸、1770种或更多种核苷酸、1780种或更多种核苷酸、1790种或更多种核苷酸、1800种或更多种核苷酸、1810种或更多种核苷酸、或1820种或更多核苷酸。

关于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”是指能够在与本文公开的抗原交叉反应的哺乳动物中诱发免疫应答的多肽。片段可以是选自本文所述的各种氨基酸序列中的至少一种的多肽片段。除了添加的任何异源信号肽，共有蛋白质可包括共有蛋白质全长的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，除了添加的任何异源信号肽，片段可包括下文描述的一种或多种氨基序列长度的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。

在一些实施例中，除了添加的任何异源信号肽，片段可与本文描述的一种或多种氨基酸序列至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％相同。在一些实施例中，除了添加的任何异源信号肽外，这些片段可以与下述一种或多种氨基酸酸序列至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

在进一步的实施例中，片段可另外任选地包括编码异源信号肽的序列，所述异源信号肽在计算相同性百分比时不包含在内。片段可以进一步包括如免疫球蛋白信号肽的信号肽，例如IgE或IgG信号肽。

在一些实施例中，共有蛋白的片段可包括本文所公开的蛋白质序列的至少546种氨基酸或更多、547种氨基酸或更多、548种氨基酸或更多、549种氨基酸或更多、550种氨基酸或更多、551种氨基酸或更多、552种氨基酸或更多、553种氨基酸或更多、554种氨基酸或更多、555种氨基酸或更多、556种氨基酸或更多、557种氨基酸或更多、558种氨基酸或更多、559种氨基酸或更多、560种氨基酸或更多、561种氨基酸或更多、562种氨基酸或更多、563种氨基酸或更多、564种氨基酸或更多、565种氨基酸或更多、566种氨基酸或更多、567种氨基酸或更多、568种氨基酸或更多、569种氨基酸或更多、570种氨基酸或更多、571种氨基酸或更多、572种氨基酸或更多、573种氨基酸或更多、574种氨基酸或更多、575种氨基酸或更多、576种氨基酸或更多、577种氨基酸或更多、578种氨基酸或更多、579种氨基酸或更多、580种氨基酸或更多、581种氨基酸或更多、582种氨基酸或更多、583种氨基酸或更多、584种氨基酸或更多、585种氨基酸或更多、586种氨基酸或更多、587种氨基酸或更多、588种氨基酸或更多、589种氨基酸或更多、590种氨基酸或更多、591种氨基酸或更多、592种氨基酸或更多、593种氨基酸或更多、594种氨基酸或更多、595种氨基酸或更多、596种氨基酸或更多、597种氨基酸或更多、598种氨基酸或更多、599种氨基酸或更多、600种氨基酸或更多、601种氨基酸或更多、602种氨基酸或更多、603种氨基酸或更多、604种氨基酸或更多、605种氨基酸或更多、606种氨基酸或更多、607。

如本文所用，术语“遗传构建体”是指包括编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包含与调节元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调节元件包含能够在施用了核酸分子的受试者的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。如本文所用，术语“可表达形式”是指基因构建体，其含有可操作地连接至编码序列的必需调节元件，所述编码序列编码蛋白质使得当存在于受试者的细胞中时所述编码序列将会被表达。

如本文所用，术语“同源性”是指一定程度的互补性。可能存在部分同源性或完全同源性(即相同性)。至少部分抑制完全互补序列与靶核酸杂交的部分互补序列指的是使用功能术语“基本上同源的”。当用于指双链核酸序列，如cDNA或基因组克隆时，如本文所用，术语“基本上同源的”是指可以在低严格条件下与双链核酸序列的链杂交的探针。当用于指单链核酸序列时，如本文所用，术语“基本上同源的”是指可以在低严格条件下与单链核酸模板序列杂交(即与其互补)的探针。

如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所使用的“相同的”或“相同性”是指该序列具有在指定区上相同百分比的残基的指定百分比。可以通过以下方式计算百分比：优化地比对两个序列、在指定区内比较两个序列、确定两个序列中出现相同残基的位置数以得到匹配位置数、然后将匹配位置数除以指定区中的位置总数、并将结果乘以100可得出序列相同性的百分比。如果两个序列的长度不同，或者比对产生一个或多个交错的末端，并且指定的比较区仅包含单个序列，则单个序列的残基包含在计算结果的分母中，但不在分子中。比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以认为是等效的。相同性可以手动执行，也可以使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST 2.0)执行。

当讨论反馈机制时，可以使用本文中使用的“阻抗”，并且可以根据欧姆定律将其转换为电流值，从而可以与预设电流进行比较。

本文所用“免疫应答”是指响应抗原的引入而激活宿主(例如哺乳动物)的免疫系统。免疫应答可以是细胞应答或体液应答或两者的形式。

本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指至少两个共价连接在一起的核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸也涵盖基本相同的核酸及其互补物。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸也涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂种、其中核酸可以含有脱氧核糖和核糖核苷酸的组合，以及包含尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或重组方法获得。

本文所用的“可操作地连接”是指基因的表达处于与其空间连接的启动子的控制之下。启动子可以位于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与该启动子与在其来源的基因中其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中已知的，可以适应该距离的变化而不会丢失启动子功能。

本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然的或合成的的修饰或组合。

本文所用的“启动子”是指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然衍生的分子。启动子可以包括一种或多种特异性转录调控序列，以进一步增强核酸的表达和/或改变核酸在细胞中的空间表达和/或时间表达。启动子还可以包括远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对的位置。启动子可以来自包含病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官，或相对于其中发生表达的发育阶段，或响应外部刺激(如生理压力、病原体、金属离子或诱导剂)而组成性或差异性地调节基因成分的表达。启动子的代表性实例包含噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子、CMV IE启动子以及人巨细胞病毒立即早期启动子(hCMV)。在一些实施例中，启动子是hCMV启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用，并且是指可以在本文所述的蛋白质的氨基末端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生它的细胞中分泌。信号肽/前导序列通常在从细胞分泌后从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)上裂解下来。信号肽/前导序列连接在蛋白质的氨基末端(即N末端)。

本文所用的“严格杂交条件”是指第一核酸序列(例如探针)将与第二核酸序列(例如靶标)杂交的条件，如在核酸的复杂混合物中。严格条件取决于序列，并且在不同情况下会有所不同。可以选择严格条件，使其比特定序列在定义的离子强度pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是温度(在定义的离子强度pH和核酸浓度下)，在该温度下，与靶标互补的50％的探针在平衡状态下与靶标序列杂交(因为靶标序列过量存在，在Tm时，50％的探针处于平衡状态)。严格条件可以是其中盐浓度小于约1.0M钠离子的条件，如pH 7.0至8.3时约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且短探针的温度至少为约30℃。(例如约10-50个核苷酸)并且长探针至少为约60℃(例如，大于约50个核苷酸)。通过添加如甲酰胺的去稳定剂也可以达到严格的条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包含以下条件：50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或5xSSC，1％SDS，在65℃下孵育，在0.2x SSC下洗涤以及0.1％SDS，在65℃下。

本文所用的“受试者”可以意指想要或需要用本文描述的疫苗进行免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人类，非人类的灵长类动物，如黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。

本文所用的“基本上互补”是指第一序列在区8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540上或更多核苷酸或氨基酸上与第二个序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或两个序列在严格杂交条件下杂交。

本文所用的“基本上相同”是指第一序列和第二个序列在区8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540上或更多核苷酸或氨基酸上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或关于核酸，如果第一序列与第二序列的互补基本上互补。

本文所用的“治疗(treat、treatment、treating)”是指通过预防、抑制、镇压或完全消除疾病来保护动物免受疾病侵害。预防疾病涉及在发病之前向动物施用本发明的疫苗。抑制疾病涉及在疾病诱导之后但在其临床症候之前向动物施用本发明的疫苗。镇压疾病涉及在疾病的临床症候后向动物施用本发明的疫苗。

如本文所用，关于核酸的“变体”是指(i)参考核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补物；(iii)与参考核酸或其互补物基本相同的核酸；(iv)在严格条件下与参照核酸、其互补物或与其基本相同的序列杂交的核酸。

如本文所用，关于肽或多肽的“变体”是指通过氨基酸的插入、删除或保守取代而在氨基酸序列上不同但仍保留至少一种生物学活性的肽或多肽。变体也可以意指具有与具有保留至少一种生物学活性的氨基酸序列的参照蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的保守取代在本领域中通常涉及微小的改变，即用具有类似性质(例如，亲水性、带电区的程度和分布)的不同氨基酸取代氨基酸。如本领域所理解的，这些微小的变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有类似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍然保留蛋白质功能。一方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示取代基，该取代基将导致蛋白质保留生物学功能。考虑肽上下文中氨基酸的亲水性可以计算出该肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的方法，据报道与抗原性和免疫原性密切相关。美国专利号第4,554,101号，其全部内容通过引用并入本文。如本领域所理解的，具有类似亲水性值的氨基酸的取代可以导致肽保留生物学活性，例如免疫原性。可以用亲水性值在彼此的±2之内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物学功能兼容的氨基酸取代应理解为取决于氨基酸的相对类似性，尤其是如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他属性所揭示的那些氨基酸的侧链。

变体可以是在完整基因序列或其片段的全长上基本相同的核酸序列。核酸序列可以在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上基本相同的氨基酸序列。氨基酸酸序列可以在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

如本文所用，“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并且优选地是DNA质粒。载体可以含有或包含一种或多种异源核酸序列。

疫苗

本文提供的疫苗包括如本文所述的间皮素抗原或编码间皮素抗原的核酸分子。在一些实施例中，疫苗包括编码如本文所述的间皮素抗原的一种或多种核酸分子。在一些实施例中，疫苗包括：一种或多种核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-607的核酸序列；编码包括蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列，所述蛋白质包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％相同的蛋白质的核酸序列；和/或编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

在一些实施例中，疫苗包括：一种或多种核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQ IDNO:2的核酸序列；编码包括SEQ ID NO:2全长的至少90％的片段的核酸序列；编码与SEQ IDNO:2至少96％相同的蛋白质的核酸序列；和/或编码包括与SEQ ID NO:2至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

在一些实施例中，疫苗包括：一种或多种核酸分子，所述核酸分子包括：核苷酸55-1821SEQ ID NO:1；包括核酸分子的全长的至少90％的片段，所述核酸分子包括SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821；与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％相同的片段；和/或包括与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。

在一些实施例中，疫苗包括：一种或多种核酸分子，所述核酸分子包括SEQ ID NO:1；包括SEQ ID NO:1的全长的至少90％的片段；与SEQ ID NO:1至少96％相同的片段；和/或包括与SEQ ID NO:1至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。

在一些实施例中，疫苗包括：MUC16抗原，其中所述抗原包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；包括蛋白质的全长的至少90％的片段，所述蛋白质包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少95％相同的核酸序列；和/或包括与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少95％相同的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。

在一些实施例中，疫苗包括：MUC16抗原，其中所述抗原包括SEQ ID NO:2；包括SEQID NO:2的长度的至少90％的片段；与SEQ ID NO:2至少96％相同的氨基酸序列；和/或包括与SEQ ID NO:2至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段。

疫苗能够在受试者中产生针对抗原的免疫应答。免疫应答可以是治疗性或预防性免疫应答。疫苗可用于防御癌症，例如表达间皮素的癌症或肿瘤。疫苗可用于在需要其的受试者中预防和/或治疗表达间皮素的肿瘤。疫苗可以诱导针对间皮素和表达间皮素的肿瘤的细胞和/或抗体应答。在一个实施例中，疫苗可用于防御、预防和/或治疗或诱导针对表达间皮素的卵巢癌细胞的细胞和/或抗体应答，特别是表达间皮素的上皮性卵巢癌细胞，更特别地针对表达间皮素的浆液性卵巢癌。

如本文所述的癌症疫苗的开发包括鉴定未被免疫系统识别并且是异常表达的自身抗原的癌症抗原，例如间皮素。识别出的癌症抗原从自身抗原变为外来抗原，以便被免疫系统识别。重组癌症抗原的核酸和氨基酸序列从自身到外源抗原的重新设计破坏了免疫系统对抗原的耐受性。为了打破耐受性，可以如下所述将几种重新设计措施应用于癌症抗原。

疫苗的重组癌症抗原未被识别为自身，从而破坏了耐受性。耐受性的打破可诱导抗原特异性T细胞和/或高效价抗体反应，从而诱导或诱发针对表达抗原的癌症或肿瘤的免疫应答或对其作出反应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫应答可以是细胞、体液或细胞和体液两者免疫应答。在一些实施例中，诱导或引起的细胞免疫应答可以包含干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其他实施例中，诱导或诱发的免疫应答可以减少或抑制促进表达抗原的肿瘤或癌症生长的一种或多种免疫抑制因子，例如但不限于下调MHC呈递的因子，上调抗原特异性调节性T细胞(Tregs)、PD-L1、FasL、细胞因子(如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1以及免疫检查点分子。

疫苗可以是DNA疫苗。DNA疫苗在美国专利第5,593,972号、第5,739,118号、第5,817,637号、第5,830,876号、第5,962,428号、第5,981,505号、第5,580,859号、第5,703,055号以及第5,676,594号中公开，所述美国专利全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，核酸分子可以包括表达载体。DNA疫苗可以进一步包括抑制其整合到染色体中的元件或试剂。

疫苗可包含编码癌症抗原的RNA。RNA疫苗可以被引入到细胞中。

疫苗可以是减毒活疫苗，使用重组载体递送抗原的疫苗，亚单位疫苗和糖蛋白疫苗，例如但不限于描述在以下的疫苗：美国专利第4,510,245号、第4,797,368号、第4,722,848号、第4,790,987号、第4,920,209号、第5,017,487号、第5,077,044号、第5,110,587号、第5,112,749号、第5,174,993号、第5,223,424号、第5,225,336号、第5,240,703号、第5,242,829号、第5,294,441号、第5,294,548号、第5,310,668号、第5,387,744号、第5,389,368号、第5,424,065号、第5,451,499号、第5,453,364号、第5,462,734号、第5,470,734号、第5,474,935号、第5,482,713号、第5,591,439号、第5,643,579号、第5,650,309号、第5,698,202号、第5,955,088号、第6,034,298号、第6,042,836号、第6,156,319号、以及第6,589,529号，所述美国专利各自通过引用并入本文。

在一些实施例中，核酸疫苗可以进一步包括分子佐剂，在一些情况下，分子佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES，并且在一些情况下，分子佐剂是检查点抑制剂，包含抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、抗程序死亡受体1(PD-1)和抗淋巴细胞激活基因(LAG-3)。IL-12、IL-15、IL-28和/或RANTES的编码序列可以包含在一种或多种核酸分子上，所述核酸分子包括一种或多种抗原的编码序列。IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列可以由核酸疫苗编码，如在同一质粒上，或者可以包含在单独的核酸分子，如单独的质粒。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所需的特征：如安全使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；预防疾病；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞反应；并提供舒适的施药，副作用少，生物学稳定性以及每剂量成本低。疫苗可以通过含有如下讨论的癌症抗原来实现某些或所有这些特征。

疫苗可进一步包括一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子在下面更详细地描述。免疫检查点抑制剂是可防止抑制免疫系统中任何组分的任何核酸或蛋白质，如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号传导。如下面更详细描述的，疫苗可进一步与抗检查点抑制剂(如PD-1和PDL-1)的抗体组合，以增强细胞和体液免疫免疫应答的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体可防止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞反应。

抗原

如上所述，疫苗可包括抗原或编码抗原的核酸分子。抗原可以是间皮素、其片段、其变体或其组合。

间皮素是一种71kD的蛋白质，其可裂解为两种产物：30kD巨核细胞增强因子和41kD GPI锚定的膜结合成熟间皮素。间皮素的功能尚不清楚，但最近的研究表明间皮素可能通过与MUC16结合而在卵巢癌转移中发挥作用，MUC16也在卵巢癌细胞表面高度表达。IHC已在82-100％的浆液性卵巢癌中观察到间皮素的表达。Hassan,R.European journal ofcancer 44,46-53(2008)；Ordonez,N.G.The American journal of surgicalpathology27,1418-1428(2003)。

因此，该疫苗可用于治疗患有表达间皮素的癌症或肿瘤的受试者。在一些实施例中，所述癌症是卵巢癌。间皮素抗原可以不同于天然的“正常”间皮素，并且因此可以针对表达间皮素抗原的肿瘤提供治疗或预防。因此，本文提供了不同于天然间皮素基因的间皮素抗原序列(即重组或突变的间皮素基因或序列)。

提供了包括上述异源序列的核酸分子。提供了由上述异源序列组成的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子包括由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)核苷酸55-1821SEQ ID NO:1；(b)包括核酸分子的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段，所述核酸分子包括SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821；(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％、97％、98％或99％相同的片段；以及(d)包括核酸序列的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段，所述核酸序列与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％、97％、98％或99％相同。在一些实施例中，核酸分子包括由以下组成的组的一种或多种核酸序列：(a)SEQ ID NO:1；(b)包括SEQID NO:1的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:1至少96％、97％、98％或99％相同的片段；以及(d)包括与SEQ ID NO:1至少96％、97％、98％或99％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包括SEQ ID NO:1所示的所述核酸序列。

本文提供了编码间皮素抗原的核酸序列。在一些实施例中核酸分子包括选自以下的一种或多种核酸：(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-607的核酸序列；(b)编码包括蛋白质的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段的核酸序列，所述蛋白质包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；(c)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％、97％、98％或99％相同的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码包括蛋白质的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段的核酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％、97％、98％或99％相同。在一些实施例中，提供了包括由以下组成的组的一种或多种核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；(b)编码包括SEQ ID NO:2的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段的核酸序列；(c)编码与SEQ ID NO:2至少96％、97％、98％或99％相同的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码包括与SEQ ID NO:2至少96％、97％、98％或99％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

可以将包括上述异源序列的分离的核酸分子掺入到载体，如质粒、病毒载体和如下所述的其他形式的核酸分子。

提供了包括上述异源氨基酸序列的蛋白质分子。提供了由上述异源氨基酸序列组成的蛋白质分子。本文提供了具有上述序列的蛋白质和多肽。蛋白质和多肽可以称为间皮素抗原和间皮素免疫原。间皮素抗原能够诱发针对表达间皮素抗原的肿瘤的免疫应答。在一些实施例中，蛋白质包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；(b)包括蛋白质的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段，所述蛋白质包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；(c)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少95％相同的氨基酸序列；以及(d)包括氨基酸序列的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的核苷酸19-607至少96％、97％、98％或99％相同。在一些实施例中，蛋白质包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:2；(b)包括SEQ ID NO:2的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:2至少96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；以及(c)包括氨基酸序列的全长的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少96％、97％、98％或99％相同。在一些实施例中，蛋白质包括SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

一方面，期望共有抗原提供改善的转录和翻译，包含具有以下一种或多种：低GC含量的前导序列以增加转录；mRNA稳定性和密码子优化；以及在可能的范围内消除顺式作用序列基序(即内部TATA盒)。

间皮素抗原可以是衍生自两个或更多个物种的共有抗原(或免疫原)序列。间皮素共有抗原可以包括一种或多种突变，其可以包含MUC-16结合域中一种或多种氨基酸的取代。一种或多种突变可以包括导致酪氨酸被丙氨酸取代的核酸突变。一种或多种突变可包含GPI锚定信号中一种或多种氨基酸的取代。一种或多种突变可包括丝氨酸被苏氨酸取代和/或苏氨酸被缬氨酸取代。因此，在一些实施例中，一种或多种突变可以替换间皮素MUC16结合和/或GPI锚定信号中的1、2或3种氨基酸。

间皮素抗原可包括用于改善表达的修饰。修饰可包含密码子优化、RNA优化、添加用于增加翻译起始的kozak序列(例如，GCC ACC)和/或添加免疫球蛋白前导序列以增加间皮素抗原的免疫原性。间皮素抗原可包括信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。

结合免疫检查点抑制剂的疫苗

疫苗可进一步包括一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子在下面更详细地描述。免疫检查点抑制剂是可防止抑制免疫系统中任何组分的任何核酸或蛋白质，如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号传导。

此类抑制剂可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸还可以包含编码通过肽键与免疫检查点抑制剂连接的接头或标签序列的另外的序列。所述小分子可以有着低分子量，例如小于800道尔顿，可以用作酶底物、被蛋白质或核酸结合的配体(或其类似物)或生物过程调节剂的有机或无机化合物。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。

在一些实施例中，免疫检查点抑制剂可以是编码抗体、其变体、其片段或他们的组合的一种或多种核酸序列。在其他实施例中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、其变体、其片段或他们的组合。

a.免疫检查点分子

免疫检查点分子可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸还可以包含编码通过肽键与免疫检查点抑制剂连接的接头或标签序列的另外的序列。所述小分子可以有着低分子量，例如小于800道尔顿，可以用作酶底物、被蛋白质或核酸结合的配体(或其类似物)或生物过程调节剂的有机或无机化合物。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。

(1)PD-1和PD-L1

免疫检查点分子可以是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、其片段、其变体或其组合。PD-1是由PDCD1基因编码的细胞表面蛋白质。PD-1是免疫球蛋白超家族的成员，在T细胞和pro-B细胞上表达，并且因此有助于这些细胞的命运和/或分化。特别地，PD-1是T细胞调节剂CD28/CTLA-4家族的1型膜蛋白质，并且可负调节T细胞受体(TCR)信号，从而负调节免疫应答。PD-1可以负调节CD8+T细胞反应，并且从而抑制CD8介导的细胞毒性并增强肿瘤的生长。

PD-1具有两个配体PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员。响应LPS和GM-CSF处理，PD-L1在巨噬细胞和树突状细胞(DC)上上调，而在TCR和B细胞受体发信号时，在T细胞和B细胞上上调。PD-L1由许多肿瘤细胞系表达，包含骨髓瘤、肥大细胞瘤以及黑色素瘤。

b.抗免疫检查点分子抗体

如上所述，免疫检查点抑制剂可以是抗体。抗体可以与抗原(即上述免疫检查点分子)结合或反应。因此，该抗体可以被认为是抗免疫检查点分子抗体或免疫检查点分子抗体。抗体可以由含在其中的核酸序列编码。

抗体可以包含重链多肽和轻链多肽。重链多肽可包含可变重链(VH)区和/或至少一个恒定重链(CH)区。至少一个恒定的重链区可以包含恒定的重链区1(CHI)、恒定的重链区2(CH2)以及恒定的重链区3(CH3)和/或铰链区。

在一些实施例中，重链多肽可包含VH区和CHI区。在其他实施例中，重链多肽可包含VH区、CHI区、铰链区、CH2区以及CH3区。

重链多肽可包含互补决定区(“CDR”)集。CDR集可以含有VH区的三个高变区。从重链多肽的N末端开始，这些CDR分别表示为“CDR1,”、“CDR2,”和“CDR3,”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可有助于抗原的结合或识别。

轻链多肽可包含可变轻链(VL)区和/或恒定轻链(CL)区。轻链多肽可包含互补决定区(“CDR”)集。CDR集可以含有VL区的三个高变区。从轻链多肽的N末端开始，这些CDR分别表示为“CDR1,”、“CDR2,”和“CDR3,”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可有助于抗原的结合或识别。

抗体可以包括分别插入重链和轻链构架(“FR”)集之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)集，其为CDR提供支持并定义了CDR相对于彼此的空间关系。CDR集含有重链或轻链V区的三个超变区。从重链或轻链的N末端出发，这些区分别表示为“CDR1,”、“CDR2,”和“CDR3,”。因此，抗原结合位点可以包含六个CDR，其包括来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE以及IgG。免疫球蛋白可以包含重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可包含VH区、CHI区、铰链区、CH2区以及CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可包含VL区和CL区。

另外，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先裂解IgG分子以产生若干片段，所述片段(F(ab)片段)中的两个各自包括包含完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够裂解IgG分子以提供若干片段，包含包括两个抗原结合位点的F(ab')2片段。另外，抗体可以是Fab或F(ab')2。Fab可以包含重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可包含VH区和CHI区。Fab的轻链可包含VL区和CL区。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟的抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人类物种的抗体，其结合具有来自非人物种的一种或多种互补确定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。

(1)PD-1抗体

抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-1抗体(在本文中也称为“PD-1抗体”)、其变体、其片段或其组合。PD-1抗体可以是纳武单抗。抗PD-1抗体可以抑制PD-1活性，从而诱导，诱发或增加针对肿瘤或癌症的免疫应答并减少肿瘤的生长。

(2)PD-L1抗体

抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-L1抗体(在本文中也称为“PD-L1抗体”)、其变体、其片段或其组合。抗PD-L1抗体可以抑制PD-L1活性，从而诱导，诱发或增加针对肿瘤或癌症的免疫应答并减少肿瘤的生长。

载体

疫苗可包括一种或多种载体，其包含编码间皮素抗原的异源核酸。一种或多种载体可以能够表达有效量的抗原，以在哺乳动物中诱发免疫应答。载体可以包括编码抗原的异源核酸。载体可以具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自我复制的额外染色体载体或整合入宿主基因组的载体。

一种或多种载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因导入靶细胞的质粒。一旦表达载体进入细胞内部，由基因编码的蛋白质就由细胞转录和翻译机制的核糖体复合物产生。经常对质粒进行改造，使其含有充当增强子和启动子区并导致表达载体上携带的基因有效转录的调控序列。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，并因此表达蛋白质。

载体可以具有表达信号，如强启动子、强终止密码子、启动子与克隆的基因之间的距离的调节以及转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)的插入。

载体可包括可操作地连接至选自启动子和聚腺苷酸化信号的调节元件的核酸序列。在一些实施例中，启动子是人巨细胞病毒立即早期启动子(hCMV启动子)。在一些实施例中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH poly A)。

载体可以是环型质粒或线性核酸。环型质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在合适的受试者细胞中的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列的启动子，其可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有正确翻译核苷酸序列所需的序列以及用于克隆和亚克隆载体及其片段的序列。包括目的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，意味着其至少一种组分相对于其他至少一种组分是异源的。核苷酸序列在表达盒中的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，其仅在宿主细胞暴露于某些特定的外部刺激时才启动转录。在多细胞生物的情况下，启动子也可以对特定的组织或器官或发育阶段具有特异性。

载体可以是质粒。质粒可用于用编码抗原的核酸转染细胞，在发生抗原表达的条件下培养并维护转化的宿主细胞。

质粒可包括编码一种或多种的以上公开的各种抗原中的核酸序列，包含编码能够诱发针对抗原的免疫应答的合成的共有抗原的编码序列、此类蛋白质的片段、此类蛋白质的变体、变体或融合蛋白质的片段，所述变体或融合蛋白质的片段由共有蛋白质和/或共有蛋白质的片段和/或共有蛋白质的变体和/或变体共有蛋白质的片段的组合构成。

在一些实施例中，质粒可以进一步包括单独地或作为这些质粒之一的部分来编码CCR20的编码序列。类似地，质粒可以进一步包括IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。

质粒可以进一步包括起始密码子和终止密码子，起始密码子可以在编码序列的上游，终止密码子可以在编码序列的下游。起始密码子和终止密码子可以与编码序列符合读框。

质粒还可以包括与编码序列可操作连接的启动子。可操作地连接至编码序列的启动子可以是猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)的启动子，如牛免疫缺陷病毒(BIV)的长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV立即早期启动子(hCMV启动子)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子也可以是来自人类基因的的启动子，如人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸或人类金属硫蛋白。启动子也可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开号US20040175727，所述美国专利申请公开的内容以其整体并入本文。

质粒还可以包括聚腺苷酸化信号，其可以在编码序列的下游。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号、人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号或牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH poly A)。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)的聚腺苷酸化信号。

质粒还可以在编码序列的上游包括增强子。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强描述于美国专利第5,593,972、第5,962,428号和第W094/016737号，所述每个美国专利的内容通过引用完全并入本文。

质粒还可以包括哺乳动物的复制起点，以便在染色体外维持质粒并在细胞中产生质粒的多个副本。质粒可以是来自Invitrogen(加利福尼亚州圣地亚哥)的pVAXI、pCEP4或pREP4，其可以包括爱泼斯坦巴尔病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可以产生高仿的游离型复制而不整合。质粒的主链可以是pA V0242。质粒可以是复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)质粒。

质粒还可以包括调节序列，其可以非常适合在施用质粒的细胞中表达基因。编码序列可包括密码子，其可允许编码序列在宿主细胞中更有效地转录。

编码序列还可包括免疫球蛋白(Ig)前导序列。前导序列可以是编码序列的5"。由该序列编码的共有抗原可以包括N端Ig前导序列，其后是共有抗原蛋白质。N端Ig前导序列可以是IgE或IgG。

质粒可以是pSE420(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)，其可以用于在大肠杆菌(E.coli)中生产蛋白质。质粒也可以是p-YES2(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)，其可以用于酵母的酿酒酵母菌株中的蛋白质生产。该质粒还可以是MAXBAC^TM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)，其可以用于在昆虫细胞中生产蛋白质。质粒也可以是pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)，其可用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。质粒也可以是pGX001(Inovio)，其是从pVAX1(Thermo Fisher Scientific，马塞诸塞州沃尔瑟姆)修饰的。

载体可以是环型质粒，其可以通过整合入细胞基因组或在染色体外存在而转化靶细胞(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

本文还提供了线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其能够经由电穿孔有效递送给受试者并表达一种或多种所需抗原。LEC可以是没有任何磷酸主链的任何线性DNA。DNA可以编码一种或多种抗原。LEC可含有启动子、内含子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。抗原的表达可以由启动子控制。LEC可能不含有任何抗生素抗性基因和/或磷酸盐主链。LEC可能不含有与所需抗原基因表达无关的其他核酸序列。

LEC可以源自能够线性化的任何质粒。质粒可能能够表达抗原。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别来自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

载体可以具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并调节分离的核酸表达的任何启动子。此类启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件，其转录本文所述的抗原序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于特定的应用。所述启动子可以定位成距所述载体中的转录起始点大约与其在其天然环境中距转录起始位点相同的距离。然而，可以适应该距离的变化而不会丢失启动子功能。

启动子可以可操作地连接至编码抗原的核酸序列和转录本，核糖体结合位点和翻译终止的有效聚腺苷酸化所需的信号。

所述启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中有效表达的启动子。

载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有结构基因下游的转录终止区以提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。

载体的制备方法

本文提供了制备包括编码本文讨论的间皮素抗原的核酸分子的载体的方法。使用本领域已知的方法，在最后的亚克隆步骤到哺乳动物表达质粒中之后，可将载体用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。

可以使用已知装置和技术的组合来配制或制造与电穿孔装置一起使用的载体，下文将对此进行更详细的描述，但优选地使用2008年5月23日申请的美国公开第2009/004716号中描述的优化的质粒制造技术来生产。在一些实例中，这些研究中使用的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除了在美国序列号60/939792中描述的那些，包含在2007年7月3日发布的美国专利第7,238,522号中描述的那些之外，制造技术还包含或结合了本领域普通技术人员通常已知的各种装置和协议。上面引用的公开和专利(分别是美国公开第2009/004716号和美国专利第7,238,522号)以其整体并入本文。

疫苗的辅料和其他组分

疫苗可进一步包括药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，如媒介物、载剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包含表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、包含单磷酰脂A的LPS类似物、胞壁肽、醌类似物，如角鲨烯和角鲨烯的囊泡、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子、包含聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包含表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂，包含单磷酰脂A的LPS类似物、胞壁肽、醌类似物，如角鲨烯和角鲨烯的囊泡，并且透明质酸也可以是与基因构建体联合施用。DNA质粒疫苗还可包含转染促进剂，如脂质、脂质体(其包含作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)的卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子、包含聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。疫苗中转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml、或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种佐剂。佐剂可以是在替代质粒中表达的其他基因，或者是与疫苗中上述质粒结合作为蛋白质递送的其他基因。一种或多种佐剂可以选自由以下组成的组：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、胸腺上皮表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1a、MIP-1～、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18突变形式、CD40突变形式、CD40L突变形式、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK、LIGAND、Ox40、Ox40、LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2、IL-15，其具有编码缺失的信号序列的信号序列或编码序列，并选择性地包含不同的信号肽、如来自IgE的信号肽或编码不同的信号肽(如来自IgE的信号肽)的编码序列、及其功能片段，或其组合。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

在一些实施例中，佐剂可以是一种或多种蛋白质和/或编码选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子：CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US1997/019502和相应的美国申请序列号08/956,865以及2011年12月12日提交的美国临时申请序列号61/569600中，所述文献各自通过引用并入本文。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US04/18962和相应的美国申请序列号10/560,650，以及PCT申请号PCT/US07/00886和相应的美国申请序列号12/160,766，以及PCT申请号PCT/US10/048827，其各自通过引用并入本文。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US09/039648和相应的美国申请序列号12/936,192，其各自通过引用并入本文。RANTES和其他构建体和序列的实例公开在PCT申请号PPCT/US1999/004332和相应的美国申请序列号09/622452，其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其他实例公开于PCT申请号PCT/US11/024098，其通过引用并入本文。RANTES和其他构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US 1999/004332和相应的美国申请序列号09/622452，其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其他实例公开于PCT申请号PCT/US11/024098，其通过引用并入本文。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US2005/042231和相应的美国申请序列号11/719,646，其各自通过引用并入本文。OX40和其他免疫调节剂的实例公开于美国申请序列号10/560,653中，其通过引用并入本文。DR5和其他免疫调节剂的实例在美国申请序列号09/622452中公开，其通过引用并入本文。

可用作佐剂的其他基因包含那些编码：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18突变形式、CD40突变形式、CD40L突变形式、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

疫苗可进一步包括基因疫苗促进剂，如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所描述的，其通过引用完全并入本文。

疫苗可以包括约1纳克至100毫克的量的抗原编码载体；约1微克至约10毫克；或优选地约0.1微克至约10毫克；或更优选地约1毫克至约2毫克。在一些优选的实施例中，根据本发明的疫苗包括约5纳克至约1000微克的核酸。在一些优选的实施例中，疫苗可含有约10纳克至约800微克的核酸。在一些优选的实施例中，疫苗可含有约0.1至约500微克的核酸。在一些优选的实施例中，疫苗可含有约1至约350微克的核酸。在一些优选的实施例中，疫苗可含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；约0.1微克至约10毫克；约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克抗原或其质粒。

疫苗可以根据使用的施药模式进行配制。可注射疫苗药物组合物可以是无菌的、无热原的和无微粒的。可以使用等渗制剂或溶液。等渗添加剂可以包含氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。疫苗可包括血管收缩剂。等渗溶液可以包含磷酸盐缓冲盐水。疫苗可进一步包括包含明胶和白蛋白的稳定剂。稳定剂可以使制剂在室温或环境温度下长时间稳定，包含LGS或聚阳离子或聚阴离子。

疫苗的药物组合物

疫苗可以是药物组合物的形式。药物组合物可以包括疫苗。药物组合物可包括约5纳克(ng)至约10毫克(mg)的疫苗核酸分子。在一些实施例中，根据本发明的药物组合物包括约25ng至约5mg的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约50ng至约1mg的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约0.1至约500微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约1至约350微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约5至约250微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约10至约200微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约15至约150微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约20至约100微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约25至约75微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约30至约50微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约35至约40微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物含有约100至约200微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物包括约10微克至约100微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物包括约20微克至约80微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物包括约25微克至约60微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物包括约30ng至约50微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物包括约35ng至约45微克的疫苗核酸分子。在一些优选的实施例中，药物组合物含有约0.1至约500微克的疫苗核酸分子。在一些优选的实施例中，药物组合物含有约1至约350微克的疫苗核酸分子。在一些优选的实施例中，药物组合物含有约25至约250微克的疫苗核酸分子。在一些优选的实施例中，药物组合物含有约100至约200微克的疫苗核酸分子。

在一些实施例中，根据本发明的药物组合物包括至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng疫苗的核酸分子。在一些实施例中，药物组合物可包括至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物包括至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗的核酸分子。

在其它实施例中，药物组合物包括高达并包含15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng疫苗的核酸分子。在一些实施例中，药物组合物可包括高达并包含1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克疫苗核酸分子。在一些实施例中，药物组合物包括高达并包含1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg疫苗的核酸分子。

根据所使用的施用模式，药物组合物可进一步包括用于配制目的的其他试剂。在药物组合物是可注射药物组合物的情况下，它们是无菌的、无热原的和无颗粒的。优选使用等渗制剂。总体上，等渗添加剂可以包含氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液，如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包含明胶和白蛋白。在一些实施例中，将血管收缩剂添加到制剂中。

该药物组合物可以进一步包括如上所述的药学上可接受的赋形剂。例如，药学上可接受的赋形剂可以包括如上所述的功能分子、媒介物、佐剂、载剂、稀释剂或转染促进剂。

疫苗接种方法

本文提供使用上述药物制剂治疗和/或预防表达间皮素的癌症(如但不限于卵巢癌)的方法。本文还描述了在受试者中使用上述药物制剂治疗和/或预防表达间皮素的癌症(如但不限于卵巢癌)的方法。本文还描述了给受试者接种疫苗的方法。本文还描述了向有此需要的受试者施用本文所述的药物制剂的方法。本文所述的方法统称为使用本文所述的药物制剂进行治疗的方法，可以包括向有此需要的受试者施用一种或多种本文所述的疫苗以诱导治疗性和/或预防性免疫应答。可以向受试者施用疫苗以调节受试者的免疫系统的活性并增强免疫应答。疫苗的施用可以是如本文公开的作为在细胞中表达并递送至细胞表面的核酸分子的癌症抗原的转染，于是免疫系统识别并诱导细胞、体液，或细胞和体液反应。通过向受试者施用如本文讨论的疫苗，疫苗的施用可用于在受试者中诱导或诱发针对间皮素的免疫应答。

可以向受试者施用疫苗以调节受试者的免疫系统的活性，因此增强免疫应答。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在将疫苗施用于哺乳动物后，并因此将载体引入哺乳动物的细胞中，转染的细胞将表达并分泌一种或多种如本文公开的癌症抗原。这些分泌的蛋白质或合成抗原将被免疫系统识别为异物，从而引发免疫应答，该免疫应答包含：针对一种或多种癌症抗原的抗体，以及针对一种或多种癌症抗原的T细胞反应。在一些实例中，接种有本文讨论的疫苗的哺乳动物将具有待发的免疫系统，并且当受到本文公开的一种或多种癌症抗原的攻击时，待发的免疫系统将允许快速清除本文公开的后续癌症抗原，无论是否通过体液、细胞或细胞和体液免疫应答。

施用疫苗DNA的方法在美国专利第4,945,050号和第5,036,006号中有所描述，所述两个美国专利均通过引用以其整体并入本文。

可以将疫苗施予哺乳动物以诱发哺乳动物的免疫应答。哺乳动物可以是人类，非人类的灵长类动物、牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛、鹿、刺猬、大象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠，并且优选地人类、牛或猪。疫苗同样可以施用于非哺乳动物受试者，例如鸡、以诱发免疫应答。

随着时间的推移，疫苗剂量可以在每千克(kg)体重1微克与10mg活性组分之间(组分/kg体重/次数)，并且可以在20微克至10mg组分/千克体重/次数之间。疫苗可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。有效治疗的疫苗剂量的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量。

用疫苗产生免疫应答的方法

该疫苗可用于在哺乳动物或非哺乳动物受试者中产生免疫应答，包含治疗性或预防性免疫应答。免疫应答可以产生针对本文公开的一种或多种癌症抗原的抗体和/或杀伤T细胞。此类抗体和T细胞可以被分离。

一些实施例提供了产生针对如本文公开的一种或多种癌症抗原的免疫应答的方法，该实施例包括向受试者施用疫苗。一些实施例提供了为受试者预防性接种针对表达上述一种或多种间皮素抗原的癌症或肿瘤的疫苗的方法，其实施例包括施用疫苗。一些实施例提供了对患有卵巢癌或表达间皮素的肿瘤的患者进行治疗性疫苗接种的方法，其实施例包括施用疫苗。在施用疫苗之前，可以常规进行表达本文公开的一种或多种间皮素抗原的卵巢癌或肿瘤的诊断。

用疫苗治疗癌症的方法

该疫苗可用于在哺乳动物中产生或诱发对表达间皮素的癌症具有反应性或针对性的免疫应答，如但不限于卵巢癌，更具体地上皮性卵巢癌，最具体地浆液性卵巢癌。诱发的免疫应答可以预防卵巢癌或肿瘤生长。

诱发的免疫应答可以预防和/或减少卵巢癌患者中癌细胞或肿瘤细胞的转移。因此，疫苗可以用于治疗和/或预防施用疫苗的患有癌症的哺乳动物或受试者中的癌症或肿瘤的方法。

在一些实施例中，所施用的疫苗可通过诱导(1)经由B细胞应答的体液免疫以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生的抗体，从而延迟髓样来源的抑制细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长而介导清除或预防肿瘤细胞的生长；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞，如CD8⁺(CTL)，以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞反应；(4)并经由IFN-γ和TFN-α或优选地所有前述来增加炎症反应。疫苗可使无瘤生存率提高30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％以及45％。疫苗在免疫后可将肿瘤量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％以及60％。疫苗可以预防和阻止单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的增加，MCP-1是由髓样来源的抑制细胞分泌的细胞因子。疫苗可将肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％以及60％。

在一些实施例中，免疫应答可以产生体液免疫应答和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，其不会在接种疫苗的受试者中引起对各种组织或系统(例如，脑或神经系统等)的损害或炎症。

在一些实施例中，可以将疫苗施用至外周(如下文更详细描述)以建立针对癌细胞或肿瘤细胞或组织的抗原特异性免疫应答，以清除或消除表达一种或多种癌症抗原的癌症或肿瘤，不会在接种疫苗的受试者中造成损害或引起疾病或死亡。

所施用的疫苗可以使受试者中的细胞免疫应答增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍、或约300倍至约6000倍。在一些实施例中，与未接种疫苗的受试者体内的细胞免疫应答相比，施用的疫苗可使受试者中的细胞免疫应答增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

所施用的疫苗可以使受试者中的干扰素γ(IFN-γ)水平增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍、或约300倍至约6000倍。在一些实施例中，与未接种疫苗的受试者体内的IFN-γ水平相比，施用的疫苗可使受试者中的IFN-γ水平增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

随着时间的推移，疫苗剂量可以在每千克(kg)体重1微克与10mg活性组分之间(组分/kg体重/次数)，并且可以在20微克至10mg组分/千克体重/次数之间。疫苗可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。有效治疗的疫苗剂量的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量。

施用途径

疫苗或药物组合物可以通过不同途径施用，包含口服、肠胃外、舌下、经皮、直肠、转化粘液质、局部、经由吸入、经由颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内鞘内和/或关节内或其组合。对于兽医用途，可根据正常兽医实践将组合物以适当可接受的制剂形式施用。兽医可以轻松确定最适合特定动物的给药方案和给药途径。可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其他物理方法，如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用疫苗。

疫苗的载体可以通过几种众所周知的技术施用于哺乳动物，包含在有或没有体内电穿孔的情况下进行DNA注射(也称为DNA疫苗接种)、脂质体介导的转染，纳米颗粒促进的转染以及使用重组载体，如重组体腺病毒，重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。疫苗的一种或多种癌症抗原可经由DNA注射和体内电穿孔一起施用。

电穿孔

疫苗或药物组合物可以通过电穿孔施用。可以使用电穿孔装置完成通过电穿孔的疫苗施用，电穿孔装置可以被配置成向哺乳动物的期望组织传递有效地引起在细胞膜中形成可逆孔的能量脉冲，并且优选地，能量脉冲是类似于用户预设的电流输入的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可以包含并结合电穿孔装置的各种元件中的一种或多种，包含：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储部件、电源以及电源开关。可以使用体内电穿孔装置，例如

EP系统(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)，Blue Bell，PA)或Elgen电穿孔器(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)完成电穿孔，以促进质粒对细胞的转染。

可以促进本发明的DNA疫苗的施用的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包含在德拉吉亚-阿克利(Draghia-Akli)等人的美国专利第7,245,963号中描述的那些，由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630，所述美国专利公开的内容通过引用以其整体并入本文。可用于促进DNA疫苗施用的其他电穿孔装置和电穿孔方法包含2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的那些，其要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的35USC 119(e)下的权益，所述所有文献以其整体并入本文。

德拉吉亚-阿克利等人的美国专利第7,245,963号描述了模块化电极系统及其在促进将生物分子引入体内或植物中所选组织的细胞中的用途。模块化电极系统可以包括多个针状电极；皮下注射针头；提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针状电极的导电连接的电连接器；以及电源。操作者可以抓握安装到支撑结构上的所述多个针电极并且将所述多个针电极牢牢插入身体或植物中的所选组织中。然后，经由皮下注射针将生物分子施用到所选组织中。激活可编程恒流脉冲控制器并且向所述多个针电极施加恒流电脉冲。施加的恒流电脉冲促进生物分子在所述多个电极之间引入细胞中。美国专利第7,245,963号的全部内容通过引用以其整体并入本文。

史密斯等人提交的美国专利公开2005/0052630描述了可以用于有效地促进生物分子引入身体或植物中的所选组织的细胞中的电穿孔装置。电穿孔装置包括电动态装置(“EKD装置”)，通过软件或固件来指定所述电动态装置的操作。EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输出以阵列的方式在电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括具有针电极阵列、注射针的中心注射通道以及可移除引导盘的可置换电极盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容通过引用并入本文。

在美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法不仅适宜深入渗透到如肌肉的组织中，而且可以渗透到其他组织或器官中。由于电极阵列的配置，注射针还完全插入到靶器官中，并且插入是在电极预先界定的区域中垂直于靶组织施用的。在美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/005263中描述的电极为20mm长并且规格为21。

另外，在结合电穿孔装置及其用途的某些实施例中，考虑到以下专利中描述的电穿孔装置：1993年12月28日发布的美国专利5,273,525、2000年8月29日发布的美国专利6,110,161、2001年7月17日发布的6,261,281以及2005年10月25日发布的6,958,060和2005年9月6日发布的美国专利6,939,862。进一步地，本文考虑了涵盖2004年2月24日发布的美国专利6,697,669和2008年2月5日发布的美国专利7,328,064中提供的主题，前者涉及使用多种装置中的任何一种进行DNA的施用，后者涉及注射DNA的方法。以上专利通过引用以其整体并入。

疫苗的制备方法

本文提供了制备本文讨论的DNA质粒的方法。使用本领域已知的方法，在最后的亚克隆步骤到哺乳动物表达质粒中之后，可将DNA质粒用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。

可以使用已知装置和技术的组合来配制或制造与本发明的电穿孔装置一起使用的DNA质粒，但优选地使用2007年5月23日申请的美国公开申请第20090004716号中描述的优化的质粒制造技术来生产。在一些实例中，这些研究中使用的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除了在美国序列号60/939792中描述的那些，包含在2007年7月3日发布的许可专利美国专利第7,238,522号中描述的那些之外，制造技术还包含或结合了本领域普通技术人员通常已知的各种装置和协议。上面引用的申请和专利美国序列号60/939,792和美国专利第7,238,522号分别以其整体并入本文。

本发明具有多个方面，由以下非限制性实例说明。

实例

以下实例中进一步说明了本发明。应当理解，尽管这些实例指示本发明的优选实施例，但是它们仅仅为了举例说明。从以上讨论和这些实例，本领域中技术人员可以确定此发明的基本特性，并且可以在不偏离其精神和范围的情况下对本发明进行各种改变和修改，以使其适合各种用途和条件。因此，除了本文示出和描述的那些之外，根据以上描述的本发明的各种修改对于本领域中技术人员将是显而易见的。这种修改旨在也落入所附权利要求的范围内。

实例1：共有间皮素序列的产生

基因库(GenBank)中已报道了三种间皮素变体。变体1和2在核苷酸水平上98％相同，并且变体3是具有选择性地拼接的接破坏GPI锚定区的C末端部分序列。据报道，所有三种转录物变体均由人类癌细胞表达。基于序列分析，靶向变体1的疫苗还将靶向变体2和3中的大部分序列。另外，变体1是在卵巢肿瘤中表达的主要转录物。因此，选择变体1作为疫苗靶标。

为了产生人类共有的间皮素人类，从基因库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中收集了14种间皮素序列。所选间皮素序列的基因库登录号为：NP_005814.2、BAA08419.1、AAH09272.1、AAV87530.1、AAH03512.1、XP_008959182.1、AAC50348.1、XP_009428309.1、XP_007978969.1、XP_011822299.1、XP_011817841.1、XP_011822298.1、XP_009193880.1以及XP_011817843.1。

使用

Lasergene软件包(版本13.0.0.357)生成了共有序列。将来自基因库的间皮素序列导入序列对比(MegAlign)，并使用ClustalW多序列比对程序进行比对。所得间皮素共有序列(SEQ ID NO：1)与天然人间皮素具有95.8％的同源性。

实例2：引入突变来消除间皮素功能

为了消除所得共有间皮素蛋白质的潜在生物学功能，引入了一种突变以消除MUC16/CA125结合。另外，引入了两个突变来破坏GPI附着。下文描述了引入这些突变的原理。

MUC16/CA125结合突变

截短的诱变用于鉴定间皮素上MUC16/CA125的结合位点(图1)。如图1所示，从Glu296开始，间皮素前体(71-kDa)被裂解成两种产物，即30-kDa巨核细胞增强因子(MPF；残基Ser34-Arg286)和41-kDa GPI锚定的膜结合成熟间皮素(浅灰色)。溶蛋白性裂解区(阴影灰色)在Arg295处含有弗林蛋白酶裂解位点，并且在Arg286处含有其他蛋白酶裂解位点，包含胰蛋白酶裂解位点。指示了间皮素上的四个预测的N-连接聚糖(黑色棒棒糖；Asn57、Asn388、Asn488和Asn515)。产生截短的突变体(区I、II、III、IAB、IBC、IA、IB和IC)作为兔Fc融合蛋白质，以依次缩小间皮素的CA125结合域。

如图5中Kaneko等人,J Biol Chem,2009年2月6日；284(6):3739-49所示，位置318处的酪氨酸被丙氨酸(Y318A)取代，完全破坏了与CA125的相互作用。Glu324(E324A；KD42.4nM)和Trp321(W321A；KD 19.5nM)的丙氨酸突变减少了间皮素与CA125的结合。His354(H354A)处的丙氨酸突变并未改变间皮素-CA125相互作用(KD2.71 nM)。

并且如图4中Kaneko等人，J Biol Chem，2009年2月6日；284(6):3739-49所示，区IAB(296-359)中丙氨酸突变体的免疫印迹示出差异结合。Tyr318(Y318A)和Glu324(E324A)的丙氨酸突变消除了间皮素与CA125的结合。Trp321(W321A)处的丙氨酸突变部分地降低了间皮素与CA125的结合。His354处的丙氨酸突变并未改变间皮素-CA125相互作用。

最后，如图6中Kaneko等人，J Biol Chem，2009年2月6日；284(6):3739-49所示，荧光强度(几何平均值)用于定量测量CA125的结合。全长成熟形式的间皮素(FULL)与CA125的结合被确定为100％的结合。I区(296-390)，IAB区(296-359)和与CA125结合的IAB的H354A突变体比列出的任何其他片段或突变体(*,p_0.05)明显更强。与间皮素的全长成熟形式相比，Y318A突变大大降低了结合。基于这些发现，将Y318A突变引入最终的合成共有间皮素序列中。

GPI附着点

GPI锚定信号由一个疏水区组成，该疏水区通过亲水性间隔区与GPI附着点(ω-site)隔开(图2)。附着点是具有短侧链的三个连续氨基酸中的第一个。它后面必须是通常是无结构的短间隔子序列，然后是羧基端的疏水信号序列。Mayor,S.&Riezman,H.Naturereviews。Molecular cell biology 5(2004)。间皮素中的共位点从丝氨酸突变为苏氨酸。间皮素中的ω+2从苏氨酸突变为缬氨酸。

如表1所示，合成的共有间皮素蛋白质序列与人天然间皮素具有95.2％的相同性。

表1

1＝共有间皮素

2＝间皮素NP_085814

实例3：合成共有间皮素构建体的表征

一旦获得合成共有间皮素DNA序列，为了具有更高的表达水平，将上游Kozak序列和IgE前导序列添加至N末端。Yang,J.S.等人，The Journal of infectious diseases184，809-816(2001)。此外，该基因的密码子使用适应了智人基因的密码子偏倚。Andre,S.等人，Journal of virology 72，1497-1503(1998)；Demi,L.等人,Journal of virology75，10991-11001(2001)。还进行了RNA优化，使得避免了GC含量很高(＞80％)或非常低(＜30％)的区以及如内部TATA盒、chi位点和核糖体进入位点的顺式作用序列基序。Muthumani,K.等人，Virology 314，134-146(2003)；Muthumani,K.等人Virology 314，134-146(2003)。

合成共有间皮素构建体的示意图如图3所示。星号(*)表示消除MUC16结合和GPI附着的突变。合成共有间皮素的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)和氨基酸(SEQ ID NO.2)分别示于表16和表17中。表2提供了SEQ ID NO:2的元素的注释和相应的氨基酸位置。

表2

为了更好地理解合成共有设计过程可能产生的蛋白质结构效应，生成了MPF和间皮素分子前体的比较模型。使用多个二级结构元件来对齐并生成模型。预测的糖基化位点在模型表面上正确定向。该模型的间皮素部分是由Sathyanarayana等人所做的工作推断得出的。并被建模为一系列ARM重复。Sathyanarayana,B.K.,Hahn,Y.等人,BMC structuralbiology 9,1(2009)。Sathyanarayana参考文献似乎没有解决二硫键的位置。此功能已在改进的模型中解决，并在本地正确定位。另外，潜在的N-连接配糖类是表面可及的。

表3总结了合成共有间皮素的特征。

表3

特征	合成共有间皮素
		与天然人类间皮素的相同性	95.2％
与天然恒河猴间皮素的相同性	90.3％
		与天然小鼠间皮素的相同性	58.1％
氨基酸突变数(相对于天然人类)的数量	28
		插入的突变数(非共识得出)	3
分子量	609aa(67KDa)
		编码序列长度(bp)	1827

实例4：质粒的构建与结构

载体主链是pGX0001，在人巨细胞病毒立即早期启动子(hCMV启动子)的控制下，是一个2998bp修饰的pVAX1表达载体。原始的pVAX1从Thermo Fisher Scientific获得。pGX0001主链包含卡那霉素抗性基因(KanR)和用于生产目的的质粒复制起点(pUC ori)。这些元素在真核细胞中不起作用。修饰的表达载体pVAX1(pGX0001)的图谱和描述在图4中示出。

将修饰引入pVAX1以创建pGX0001。这些修饰在表4中列出，并且没有发现关于质粒扩增以及抗原转录和翻译的问题。迄今为止，使用pGX0001作为主链没有观察到pGX0001序列的进一步变化。在CMV启动子上游的主链中，碱基对2、3和4从ACT变为CTG。

表4

修饰	碱基对	描述
			C>G	241	在CMV启动子中
C>T	1158	牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH poly A)下游的主链
			A>-	2092	卡那霉素抗性基因的下游的主链
C>T	2493	在pUC复制起点(pUC ori)中
			G>C	2969	在RNASeH位点上游的pUC Ori末端

用BamHI和Xhol来消化合成的合成共有间皮素，并将其表达盒置于巨细胞病毒立即早期启动子的转录控制下，克隆到pGX0001中。所得质粒指定为pGX1430。进行全长测序，并且然后由两名分析人员进行分析和确认是正确的。pGX1430的示意图如图5所展现。

实例5：体外抗原表达

通过免疫印迹证实pGX1430表达抗原蛋白质。使用Turbofectin 8(Origene)将维持在含10％FBS(ThermoFisher)的DMEM培养基中的人横纹肌肉瘤(RD)细胞(ATCC，CCL-136)转染pGX1430或pGX0001(6μg/10cm2皿)。转染后48小时，使用RIPA细胞溶解缓冲液(ThermoFisher)溶解细胞，并收集细胞溶解产物。按照BCA化验(ThermoFisher)确定总蛋白质浓度后，将15μg细胞溶解产物在4-12％SDS-PAGE凝胶(ThermoFisher)上电泳，并使用市售抗间皮素抗体(Cell Signaling Technology克隆D4X7M)进行检测然后使用ECL免疫印迹分析系统(GE Healthcare)，用辣根过氧化物酶(HRP)共轭的抗兔IgG(Santa CruzBiotech#sc-2004))将其可视化。作为装载控制，使用抗β-actin单克隆抗体(Santa CruzBiotech，克隆，C4)针对肌动蛋白的表达重新探测印迹。

人类皮素前体为70kDa，其裂解的糖基化形式为46-48kDa，而合成共有间皮素前体为64.28kDa，其裂解的糖基化形式为35-37kDa。如图6所示，检测到pGX1430(64.28kD)的预期分子量的蛋白质带。在pGX0001泳道中未检测到蛋白质带。检测到了类似强度的抗β-肌动蛋白带，表明每个泳道中均装载了等量的蛋白质。

实例6：合成共有间皮素疫苗构建体的免疫原性。

动物与免疫

购自Jackson实验室的8周大的CB6F1雌性小鼠。将所有动物圈养在BTS研究(BTSResearch)(加利福尼亚州圣地亚哥)的温度可控的、有光循环的设施中。根据美国国立卫生研究院和动物护理与使用提案(ACUP)(BTS ACUP#15-091)的准则进行动物护理。小鼠分为五组，如表5所详细说明。

表5

组	n	构建体	构建体计量(μg)	注射量(μl)
					1	4	pGX0001	30	30
2	8	pGX1430	10	30
					3	8	pGX1430	20	30
4	8	pGX1430	30	30
					5	8	pGX1430	50	30

根据SOP R20-003147

3P小鼠治疗，对免疫组中的小鼠接种pGX0001或pGX1430指示的剂量。简而言之，将质粒在无菌注射用水(VetOne)中进行配制，使得指示剂量通过肌内注射以30μL的注射量递送至胫骨前肌。每次肌肉注射后，立即使用带有3P阵列的

2000自适应恒流电穿孔装置进行电穿孔(EP)(InovioPharmaceuticals)。该装置被配置成可递送两个脉冲宽度为52ms的0.1Amp脉冲，间隔为1秒的延迟。小鼠接受3次免疫，间隔3周。在最后一次免疫的三周后处死小鼠，并收集脾脏以进行细胞免疫读数。没有收集到其他组织。

脾淋巴细胞分离

无菌分离脾细胞，并将其置于5mL R10培养基(罗斯福公园纪念学院培养基1640，其中补充了10％的胎牛血清和1％的抗生素-抗真菌药)。使用Stomacher机器(SewardLaboratory Systems Inc.)通过机械破坏脾脏分离脾细胞，并使用40μm细胞过滤器(BDFalcon)过滤所得产物。将所得产物离心，并将沉淀用ACK溶解缓冲液(Lonza)处理5分钟以溶解RBC。然后将脾细胞离心，在PBS中洗涤，然后重悬在R10培养基中，并立即用于进一步分析。

IFNγELISpot

进行了小鼠IFNγELISpot化验(MabTech)以评估抗原特异性细胞应答。将预先涂有抗小鼠IFNγ抗体的96孔板在PBS中洗涤，并在室温下用完全培养基(补充10％FBS和抗生素的RPMI 1640)封闭2小时。将脾脏淋巴细胞重悬于R10培养基中(然后一式三份以每孔2x10⁵个细胞的输入细胞数添加。合成了一组肽(GenScript)，每个肽含有15个氨基酸残基，这些残基与代表了整个合成共有间皮素蛋白质序列的11个氨基酸重叠。将这些肽组重悬于DMSO(Sigma)中，并以～2μg/ml肽的浓度合并到两个肽库中。肽库含有对应于合成共有间皮素抗原蛋白质的肽。以5μg/ml的Concavalin A(Sigma)作为阳性对照，并以完全培养基作为阴性对照。将板在5％CCh大气培养箱中在37℃下培养18小时。然后，加入生物素化的抗小鼠IFNγ检测抗体(MabTech)，并将板在室温下孵育2小时。将板进行洗涤，并加入抗生蛋白链菌素-ALP抗体(MabTech)，并将板在室温下孵育1小时。

斑点检测已按照试剂盒制造商的说明(MabTech)完成。使用自动ELISPOT读取器(Cellular Technology)对平板上的斑点进行计数。将斑点形成单位(SFU)的平均数量调整为1x 10⁶个脾细胞以进行数据显示。IFNγELISpot产生的抗原特异性反应报道为每1x 10⁶个脾细胞中的IFNγ点形成单位(SFU)数量大于仅培养基对照中的SFU。

通过IFNγELISpot和流式细胞术(n＝8/组)以四种剂量(10μg、20μg、30μg以及50μg)评估了合成共有间皮素构建体的免疫原性。用空质粒主链(pGX0001)作为阴性对照(n＝4/组)对小鼠进行免疫。与阴性对照疫苗接种小鼠相比，合成共有间皮素(pGX1430)疫苗接种可诱导细胞免疫应答。如通过ELISpot确定的，合成共有间皮素特异性IFNγ的量值在10和20μg剂量下呈剂量依赖性(图7A和图7B)在30和50μg两种剂量下均达到了类似的最大响应。具体而言，合成共有间皮素IFNγSFU在10μg、20μg、30μg和50μg分别为1345±1290、2241±1721、2242±1932和2004±674。在10μg(p＝0.004)、20μg(p＝0.004)、30μg(p＝0.004)以及50μg(p＝0.004)剂量的pGX1430中，合成共有间皮素IFNγ反应显着高于未接种的。表6总结了IFNγ反应。

表6

流式细胞术

流式细胞术进一步表征了合成共有间皮素诱导的细胞免疫应答。在布雷菲德菌素A(BD Biosciences)、莫能菌素(BD Biosciences)以及FITC抗鼠CD107A抗体(BDBiosciences)的存在下，用合成共有间皮蛋白肽分离6小时后，立即刺激接种和未接种小鼠的2x 10⁶脾细胞。用肽刺激后，将脾细胞离心分离并重悬于每孔20μL的小鼠BD Fc阻断剂(BD Biosciences)溶液中。Fc阻断剂在PBS中以1:40的初始稀释度使用，并在4℃下孵育5分钟。

孵育后，以每孔30μL添入剩余的细胞外抗体(在PBS中)，并允许在4℃孵育30分钟。添加细胞外染色剂后，每个孔中的最终体积为50μL，由最终稀释度为1:100的Fc阻断剂和适当工作稀释度的细胞外抗体组成。然后将细胞用存活力染料(Vivid，Thermo-Fisher)和以下细胞外抗体染色：APC-Cy7抗小鼠CD3e、PerCP-Cy5.5抗小鼠CD4以及APC抗小鼠CD8a(BDBiosciences)。随后用以下抗体对细胞内细胞因子进行染色：BV605抗小鼠IFNγ、APC-R700抗小鼠IL-2以及PE抗小鼠TNF-α(BD Biosciences)。

在10色FACS CANTO(BD Biosciences)上收集ICS数据，并使用FlowJo完成分析。流式细胞术门控策略示出在图8中。对于通过流式细胞术称为抗原特异性的细胞，报告参数的频率必须超过仅培养基对照的频率。对于被鉴定为产生抗原特异性CD107a的细胞，还必须鉴定该细胞对于通过布尔门控(Boolean gating)鉴定的IFNγ和/或IL-2和/或TNFα的抗原特异性产生为阳性。

相对于CD4⁺ T细胞区室中的反应，合成共有间皮素在CD8⁺ T细胞区室中引起了更强烈的反应(图9A-9D)。合成共有间皮素诱导的抗原特异性CD4⁺ T细胞反应频率在10μg(0.29％±0.20％)(p＜0.004)、20μg(0.50％±0.30)％)(p＜0.004)、30μg(0.42％±0.24％)(p＜0.004)以及50μg(0.38％±0.17％)(p＜0.004)剂量组中比未接种的(0.09％±0.07％)明显更强(图9A)。合成共有间皮素特异性CD4⁺ T细胞反应在10和20μg剂量下呈剂量依赖性，但在30和50μg剂量下不依赖性，主要由产生CD4⁺ T细胞的IFNγ-IL-2-TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα-、IFNγ-IL-2+TNFα+或IFNγ+IL-2+TNFα+组成(图9C)。抗原特异性CD4⁺T细胞的频率在表7中进一步详述。

表7

在所有剂量组中，由合成共有间皮素诱导的抗原特异性CD8⁺ T细胞的频率均相对于对照升高(图9B)。具体而言，在较高的剂量下，与未接种的(0.15％±0.04％)相比，在分别用10μg(0.64％±0.42％)(p＝0.016)、20μg(0.70％±0.48％)(p＝0.028)、30μg(0.97％±0.96％)(p＝0.008)和50μg(1.00％±0.22％)(p＝0.004)的pGX1430免疫的组中抗原特异性CD8+T反应的频率明显更强。合成共有间皮素特异性CD8⁺ T细胞应答随剂量增加，并且主要由产生IFNγ+IL-2-TNFα的CD8⁺ T细胞组成(图9D)。抗原特异性CD8⁺ T细胞的频率在表8中进一步详述。

表8

所有剂量的合成共有间皮素诱导高于未接种的(0.01％±0.01％)的CD4⁺CD107a⁺T细胞频率。具体而言，在10μg(p＝0.004)、20μg(p＝0.004)、30μg(p＝0.016)以及50μg(p＝0.004)剂量组中，抗原特异性CD4⁺CD107a⁺ T细胞的频率分别为0.10％±0.11％、0.20％±0.13％、0.16％±0.13％以及0.15％±0.11％(图10A)。合成共有间皮素特异性CD4⁺CD107a⁺T细胞的细胞因子谱在不同剂量组之间类似，并且主要由IFNγ⁺IL-2⁺TNFα⁺、IFNγ⁺IL-2⁺TNFα^-、IFNγ⁺IL-2^-TNFα^-细胞构成(图10C)。表9进一步详叙了具有溶细胞潜力的抗原特异性CD4⁺ T细胞的频率。

表9

类似于抗原特异性CD8⁺ T细胞的量值，合成合成间皮素诱导的所有组中的CD8⁺CD107a⁺ T细胞的频率与纯净的相比显着变化(0.05％±0.02％)(图10C)。具体而言，在10μg(p＝0.008)、20μg(p＝0.028)、30μg(p＝0.004)以及50μg(p＝0.004)剂量组中，抗原特异性CD8⁺CD107a⁺ T细胞的频率分别为0.27％±0.22％、0.57％±0.43％、0.83％±0.85％以及0.90％±0.24％(图10A)。合成共有间皮素特异性CD8⁺CD107a⁺ T细胞的细胞因子谱在各个剂量组中类似，并且大多数由IFNγ+IL-2-TNFα-构成(图10D)，但10μg剂量组除外，其中大部分由IFNγ^-IL-2^-TNFα⁺以及IFNγ⁺IL-2⁺TNFα⁺构成。表10进一步详叙了具有溶细胞潜力的抗原特异性CD8⁺ T细胞的频率。

表10

总体而言，对于任何报告的数据，免疫组之间的反应均无显着差异(即10μg不会显着低于50μg等)

统计分析

统计分析使用IBM SPSS Statistics 22(IBM Corporation)完成。对于许多比较而言，该数据不是正态分布的。因此，Mann-Whitney U检验用于所有分析，并采用事后Bonferroni校正进行多次比较。假设统计显着性为p≤0.013(0.05/4个比较＝0.0125)。

结论

与未接种相比，合成的间皮素增加了抗原特异性CD4⁺、CD4⁺CD107a⁺以及CD8⁺、CD8⁺CD107a⁺ T细胞的频率，尽管在CD8⁺ T细胞区室中反应的量值要强得多。

实例7：合成共有间皮素单价非人类灵长类动物研究

为了研究单独合成共有间皮素与低剂量和高剂量IL-12结合的潜力，将18只成年恒河猴(每只由唯一的NHP ID编号标识)分成3组，每组6只，并按以下方法用pGX1430免疫。用3.0mg pGX1430(组1)免疫六只动物，用3.0mg pGX1430加0.04mg pGX6006(opt rh IL-12)作为佐剂免疫六只(组2)，并且用3.0mg pGX1430加0.20mg pGX6006(opt rh IL-12)作为佐剂免疫六只(第3组)，在SSC中以1.0mL注射量配制。在第0、4、8和12周施用免疫注射，并选择性地进行第五次免疫接种。所有免疫均使用

2000 5P-IM EP装置以1ml注射量在无菌WFI中按IM按相应的交替对侧四肢进行。EP条件如下：OpBlock 0070-IM，0.5Amp，3个脉冲，52毫秒，脉冲之间0.2秒。在第2、6、10和14周评估间皮素的免疫原性。

表11提供了1-3组的动物识别、来源、性别和体重。

表11

PBMC隔离

将非人类灵长类动物全血收集在含有抗凝剂和凝胶屏障的柠檬酸钠细胞制备试管(CPT CPT's BD Biosciences)中。在过夜运输之前，全血在收集后不久(2小时内)旋转以分离和浓缩PMBC。红细胞和中性粒细胞在试管底部形成颗粒，并通过凝胶屏障固定到位。血浆和淋巴细胞保留在凝胶屏障上方。每个CPT可以容纳约8mL的血液，并在室温下运输。到达圣地亚哥的临床前实验室后，对旋转的CPT管进行了处理以进行PBMC分离。用氯化铵-钾(ACK)缓冲液溶解红细胞后，使用英杰公司CountessTM自动细胞计数器对活细胞进行计数，然后重悬在完全培养基中(RPMI 1640补充了10％FBS，抗生素和β巯基乙醇)。如本报告所述完成化验后，将PBMC冷冻并且保持在冷冻管的冷冻介质中(来自Sigma的10％DMSO和来自Seradigm的90％FBS)，并长期保存在液氮中。

IFNγELISpot

为了评估疫苗诱导的抗原特异性细胞应答，在每个时间点使用试剂盒(MabTechIFNγELISpotPro，#3421M-2APW-10)在分离的PMBC上进行Monkey IFNγELISpot化验。简单地说，将预先涂有抗猴子IFNγ抗体(mAb MT126L)的96孔板在PBS中洗涤，并在室温下用完全培养基(补充10％FBS、抗生素和3巯基乙醇的RPMI 1640)封闭2小时。将NHP PBMC重悬于RIO培养基中(然后一式三份以每孔2x 105个细胞的输入细胞数添加。合成了一组肽(GenScript)，每个肽含有15个氨基酸残基，这些残基与代表了整个合成共有蛋白质序列的11个氨基酸重叠。将这些肽组重悬于DMSO(Sigma)中，并以每种各自肽约2μg/mL的浓度合并到库中。所有抗原特异性合并的肽以1:100稀释度使用，从而与PBMC结合时得到每孔1:200的最终稀释度。为间皮素生成了四个库。

将抗CD3(mAb CD-2Mabtech)和/或PMA(Sigma)与离子霉素(Sigma)用作阳性对照。完全的R10培养基用作阴性对照。将板在5％C02大气培养箱中在37℃下孵育18小时。去除细胞后，加入ALP偶联的抗猴IFNγ检测抗体(MabTech Ab 7-B6-1-ALP)，将板在室温下孵育2小时。然后根据试剂盒制造商的说明(MabTech)，使用BCIP/NBT底物溶液开发三明治免疫酶化验。蓝黑色沉淀物形成斑点，显示出每一个产生IFNγ的细胞。然后用CTL

分析仪和软件(Cellular Technology)对斑点进行扫描和计数，并由经过培训的操作员控制质量。IFNγ应答报道为点形成单位(SFU)到1x10⁶PMBC，大于在仅培养基对照中SFU。

免疫学结果

对于1-3组，间皮素特异性IFNγ应答示出在图11A-11C，其中分别仅用间皮素(图12A)、带有低剂量IL-12(0.04mg)的间皮素(图11B)或带有高剂量IL-12(0.2mg)(图11C)的间皮素进行免疫。结果示出剂量后2周每个时间点的反应。总体而言，与基线预出血相比，到剂量4后2周研究结束时，所有组和个体动物的反应均增加。图11A-11C示出朝向IL-12的趋势，该趋势为通过PD3对合成共有间皮素的IFNγ应答提供佐剂作用。

图12A-12C描绘了平均间皮素特异性IFNγ应答，其中仅用间皮素(图12A)、带有低剂量IL-12(0.04mg)的间皮素(图12B)或带有高剂量IL-12(0.2mg)(图12C)的间皮素进行免疫。图12A-12C示出IL-12针对合成共有间皮素增加了IFNγ应答的量值，但没有广度。

生理参数

如表12、13和14所示，对于1、2和3组，由于免疫而测得的任何生理参数均无差异。对于RBC、HCT、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞，未发现明显差异(数据未示出)。这些值在经过类似实验程序的物种、性别和年龄的动物的预期范围内。偏离正常范围的任何变化都是零星自然的，仅以一种性别存在，并且与剂量水平或时间无关。

表12

注意：正常范围之外*

表13

注意：正常范围之外*表14

表14

注意：正常范围之外*

对于所有组，在研究过程中体重没有显着变化，其中正常范围为4-12，如下表15所示。

表15

总体而言，结果表明，单独施用的合成共有间皮素能够在100％的NHP中诱导免疫应答。加入IL-12佐剂没有明显的改善。

应当理解，前述详细描述和所附实例仅是说明性的，并且不应被视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求及其等同物来限定。

对于所公开的实施例的各种改变和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的实施例进行这样的改变和修改，包含但不限于与本发明的化学结构、取代物、衍生物、中间体、合成、组分、制剂或使用方法有关的那些。

表16：合成共有间皮素DNA编码序列

表17：合成共有间皮素蛋白质序列

序列表

<110> 艾诺奥医药品有限公司（INOVIO PHARMACEUTICALS, INC）

严健（YAN, Jian）

安娜·斯莱格（SLAGER, Anna）

布拉德利·加曼（GARMAN, Bradley）

尼尔·库奇（COOCH, Neil）

<120> 靶向间皮素的癌症疫苗及其使用

<130> INO-1002WO / 104409.000444

<150> US 62/598,289

<151> 2017-12-13

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1827

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共有间皮素DNA编码序列

<400> 1

atggactgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cacgagtgca ttcaagcagg 60

gctctggcag gggagactgg gcaggaagca gccccactgg acggcgtgct ggcaaaccct 120

cccgatatca gctccctgag ccctagacag ctgctgggct tcccatgcgt ggaggtgagc 180

ggcctgtcca ccgagagggt gcgcgagctg gcagtggccc tggcacagaa gaatgtgaag 240

ctgtccgccg agcagctgag gtgcctggca cacaggctgt ctgagccacc cgaggacctg 300

gatgcactgc cactggacct gctgctgttc ctgaaccccg atgcctttag cggccctcag 360

gcctgtacaa ggttcttttc ccgcgtggcc aaggccaatg tggacctgct gcctaggggc 420

gccccagagc ggcagagact gctgccagcc gccctggcat gctggggcgt gaggggctct 480

ctgctgagcg aggcagacgt gcgcgccctg ggcggcctgg cctgtgatct gcctggccgc 540

tttgtggccg agtctgccga ggtgctgctg ccaaggctgg tgagctgcct gggacctctg 600

gaccaggatc agcaggaggc cgtgcgcgcc gccctgcagg gcggcggccc tccctacggc 660

cctccctcta cctggtctat cagcacactg gacgcactga gaggcagcct gccagtgctg 720

ggacagcccg tgatcaggtc catccctcag ggcatcctgg cagcatggag gcagcggagc 780

agccgggacc cctcctggag gcagccagag agaaccgtgc tgaggcctag attccggaga 840

gacgtggaga agacagcctg tccatccggc aagaaggtgc acgagatcga tgagtctctg 900

atctttgcca agaagtggga gctggaggca tgcgtggacg ccgccctgct ggcagcacag 960

atggatagag tgaacgccat ccccttcacc tacgagcagc tggacgtgct gaagcacaag 1020

ctggatgagc tgtaccccca gggctatcct gagagcgtga cacagcacct gggctatctg 1080

tttctgaaga tgtctcctga ggacatcagg aagtggaacg tgaccagcct ggagacactg 1140

aaggccctgc tggaggtcaa taagggccac gagatgtccc cacaggtggc caccctgatc 1200

gacagggtgg tgaagggcag aggccagctg gacaaggata cagtggatac cctgacagcc 1260

ttctacccag gctacctgtg ctccctgtct cccgaggagc tgtcctctgt gccacccagc 1320

tccatcggag ccgtgcggcc tcaggacctg gatacctgcg acccaagaca gctggatgtg 1380

ctgtacccca aggccaggct ggccttccag aacatgaatg gcagcgagta tttcgtgaag 1440

atccagccat ttctgggcgg cgccccaacc gaggacctga aggccctgtc ccagcagaac 1500

gtgtctatgg acctggccac ctttatgaag ctgcgcacag atgccgtgct gccactgaca 1560

gtggcagagg tgcagaagct gctgggacct cacgtggagg gcctgaaggc agaggagagg 1620

cacaggcccg tgcgggactg gattctgcgg cagagacagg acgatctgga taccctggga 1680

ctgggactgc agggcggcat cccaaatggc tatctggtgc tggatctgtc cgtgcgggag 1740

gccctgacag gcgtgccctg cctgctggga cctggacctg tgctgactgt gctggctctg 1800

ctgctggctt caacactggc ttgataa 1827

<210> 2

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共有间皮素蛋白质序列

<400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Ser Arg Ala Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro

20 25 30

Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asp Ile Ser Ser Leu Ser Pro

35 40 45

Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Val Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr

50 55 60

Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys

65 70 75 80

Leu Ser Ala Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro

85 90 95

Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn

100 105 110

Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg

115 120 125

Val Ala Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg

130 135 140

Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser

145 150 155 160

Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp

165 170 175

Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg

180 185 190

Leu Val Ser Cys Leu Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Val

195 200 205

Arg Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr

210 215 220

Trp Ser Ile Ser Thr Leu Asp Ala Leu Arg Gly Ser Leu Pro Val Leu

225 230 235 240

Gly Gln Pro Val Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Leu Ala Ala Trp

245 250 255

Arg Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr

260 265 270

Val Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Asp Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro

275 280 285

Ser Gly Lys Lys Val His Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Ala Lys

290 295 300

Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Gln

305 310 315 320

Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val

325 330 335

Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser

340 345 350

Val Thr Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp

355 360 365

Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu

370 375 380

Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile

385 390 395 400

Asp Arg Val Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Val Asp

405 410 415

Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu

420 425 430

Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Gly Ala Val Arg Pro Gln

435 440 445

Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys

450 455 460

Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys

465 470 475 480

Ile Gln Pro Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu

485 490 495

Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg

500 505 510

Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu

515 520 525

Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val

530 535 540

Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly

545 550 555 560

Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu

565 570 575

Ser Val Arg Glu Ala Leu Thr Gly Val Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly

580 585 590

Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala

595 600 605

Claims (35)

1.一种核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：

(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-607的核酸序列；

(b)编码包括蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列，所述蛋白质包括SEQ IDNO:2的氨基酸19-607；

(c)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％相同的蛋白质的核酸序列；以及

(d)编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

2.一种核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：

(a)核苷酸55-1821SEQ ID NO:1；

(b)包括核酸分子的全长的至少90％的片段，所述核酸分子包括SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821；

(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％相同的片段；

以及

(d)包括与SEQ ID NO:1的核苷酸55-1821至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。

3.一种核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：

(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；

(b)编码包括SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(c)编码与SEQ ID NO:2至少96％相同的蛋白质的核酸序列；以及

(d)编码包括与SEQ ID NO:2至少96％相同的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

4.一种核酸分子，其包括选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：

(a)SEQ ID NO:1；

(b)包括SEQ ID NO:1的全长的至少90％的片段；

(c)与SEQ ID NO:1至少96％相同的片段；以及

(d)包括与SEQ ID NO:1至少96％相同的核酸序列的全长的至少90％的片段。

5.一种核酸分子，其包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

6.一种载体，其包括权利要求1至5中任一项所述的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的载体，其中所述核酸分子与选自启动子和聚腺苷酸化信号的调节元件可操作地连接。

8.根据权利要求7所述的载体，其中所述启动子是人巨细胞病毒立即早期启动子(hCMV启动子)。

9.根据权利要求7所述的载体，其中所述聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH poly A)。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的载体，其中所述载体是质粒或病毒载体。

11.一种组合物，其包括一种或多种权利要求1至5中任一项所述的核酸分子。

12.根据权利要求11所述的组合物，其进一步包括药学上可接受的载剂。

13.一种组合物，其包括一种或多种权利要求6至10中任一项所述的载体。

14.根据权利要求13所述的组合物，其进一步包括药学上可接受的载剂。

15.一种包括选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：

(a)SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；

(b)包括蛋白质的全长的至少90％的片段，所述蛋白质包括SEQ ID NO:2的氨基酸19-607；

(c)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少95％相同的氨基酸序列；以及

(d)包括与SEQ ID NO:2的氨基酸19-607至少95％相同的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。

16.一种包括选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：

(a)SEQ ID NO:2；

(b)包括SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段；

(c)与SEQ ID NO:2至少96％相同的氨基酸序列；以及

(d)包括与SEQ ID NO:2至少96％相同的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。

17.一种蛋白质，其包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

18.一种包括抗原的疫苗，其中所述抗原包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

19.根据权利要求18所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:1编码。

20.一种包括肽的疫苗，其中所述肽包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的全长上具有至少约96％相同性的氨基酸序列。

21.一种包括核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包括在SEQ ID NO:1所示的核酸序列的全长上具有至少约96％相同性的核酸序列。

22.一种包括核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的全长上具有至少约96％相同性的氨基酸序列的肽。

23.根据权利要求21或22所述的疫苗，其中所述核酸分子包括表达载体。

24.根据权利要求21或22所述的疫苗，其进一步包括药学上可接受的赋形剂。

25.根据权利要求21或22所述的疫苗，其进一步包括佐剂。

26.根据权利要求25所述的疫苗，其中所述佐剂为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

27.一种治疗带有表达间皮素的癌细胞的受试者的方法，所述方法包括施予治疗有效量的权利要求18至20中任一项所述的疫苗。

28.一种治疗具有表达间皮素的癌细胞的受试者的方法，所述方法包括施予治疗有效量的权利要求21至26中任一项所述的疫苗。

29.根据权利要求28所述的方法，其中施用包括电穿孔步骤。

30.根据权利要求28所述的方法，其中施用在所述受试者的一个或多个部位发生。

31.一种给受试者接种针对表达间皮素的癌细胞的疫苗的方法，所述方法包括施予有效诱导体液免疫应答的量的权利要求18至26中任一项所述的疫苗。

32.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，用作药物。

33.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，用作治疗癌症的药物。

34.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，用于制备药物。

35.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，用于制备治疗癌症的药物。

Images