RU2600067C2 - Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин - Google Patents
Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин Download PDFInfo
- Publication number
- RU2600067C2 RU2600067C2 RU2013148919/10A RU2013148919A RU2600067C2 RU 2600067 C2 RU2600067 C2 RU 2600067C2 RU 2013148919/10 A RU2013148919/10 A RU 2013148919/10A RU 2013148919 A RU2013148919 A RU 2013148919A RU 2600067 C2 RU2600067 C2 RU 2600067C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- antibody
- amino acid
- ss1p
- Prior art date
Links
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 229940051173 recombinant immunotoxin Drugs 0.000 title abstract description 31
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 50
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 claims abstract description 33
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 claims abstract description 33
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 33
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 20
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims description 111
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims description 110
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 87
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 87
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 70
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 68
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 66
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 61
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 55
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 38
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 38
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 claims description 29
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 28
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 26
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 25
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 24
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 19
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 19
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 16
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 claims description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Chemical group CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001132 aluminium potassium sulphate Substances 0.000 claims description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 239000001194 polyoxyethylene (40) stearate Substances 0.000 claims description 4
- 235000011185 polyoxyethylene (40) stearate Nutrition 0.000 claims description 4
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims 3
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 claims 2
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 claims 2
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 claims 2
- JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N (2r)-2-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrobromide Chemical compound Br.OC(=O)[C@H](N)CCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCC(O)=O JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N 0.000 claims 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 108010044804 gamma-glutamyl-seryl-glycine Proteins 0.000 claims 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 83
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 57
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 57
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 46
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 14
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 10
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 246
- 229940127180 SS1P Drugs 0.000 description 148
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 142
- 102100025477 GTP-binding protein Rit1 Human genes 0.000 description 85
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 79
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 63
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 40
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 38
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 33
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 31
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 31
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 31
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 31
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 31
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 27
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 25
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 22
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 22
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 18
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 18
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 15
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 13
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 12
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 230000004856 capillary permeability Effects 0.000 description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 8
- -1 for example Substances 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 6
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 101100321445 Arabidopsis thaliana ZHD3 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 5
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 5
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 5
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 4
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 description 3
- 101001070329 Geobacillus stearothermophilus 50S ribosomal protein L18 Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001022148 Homo sapiens Furin Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 3
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 3
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 2
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000576802 Homo sapiens Mesothelin Proteins 0.000 description 2
- 101000679903 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical class CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 2
- 102100022203 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Human genes 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 2
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000019489 Almond oil Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000013452 Fallopian tube neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101001051709 Homo sapiens Ribosomal protein S6 kinase-related protein Proteins 0.000 description 1
- 101100256651 Homo sapiens SENP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010048612 Hydrothorax Diseases 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010060408 Member 25 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000008166 Member 25 Tumor Necrosis Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 1
- 241000204025 Mycoplasma capricolum Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006437 Proprotein Convertases Human genes 0.000 description 1
- 108010044159 Proprotein Convertases Proteins 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100024914 Ribosomal protein S6 kinase-related protein Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 101150038317 SSP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100125020 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pss1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100018019 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ssc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023713 Sentrin-specific protease 6 Human genes 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- HZVVJJIYJKGMFL-UHFFFAOYSA-N almasilate Chemical compound O.[Mg+2].[Al+3].[Al+3].O[Si](O)=O.O[Si](O)=O HZVVJJIYJKGMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008168 almond oil Substances 0.000 description 1
- 229950001537 amatuximab Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000009118 appropriate response Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 235000019846 buffering salt Nutrition 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 229920006237 degradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 229940042935 dichlorodifluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 229940087091 dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000011549 displacement method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 201000001343 fallopian tube carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000002060 fluorescence correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000008172 hydrogenated vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000008316 intracellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000002231 macronucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O methylsulfide anion Chemical compound [SH2+]C LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 238000005036 potential barrier Methods 0.000 description 1
- 238000012910 preclinical development Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical class CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007441 retrograde transport Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000279 safety data Toxicity 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical class [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 210000000779 thoracic wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 210000003412 trans-golgi network Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 238000013042 tunel staining Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 231100000402 unacceptable toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
- A61K39/001168—Mesothelin [MSLN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к усовершенствованному рекомбинантному иммунотоксину для клеток, экспрессирующих мезотелин. Заявленный иммунотоксин представляет собой слитый белок, включающий антитело к мезотелину и фрагмент экзотоксина Pseudomonas, который модифицирован так, чтобы снизить его иммуногенность и чувствительность к протеазам. Иммунотоксин может быть использован в способе лечения рака, сверхэкспрессирующего мезотелин. Изобретение обеспечивает повышенную цитотоксичность иммунотоксина в отношении клеток, которые экспрессируют мезотелин. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 2 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №61/483531, поданной 6 мая 2011 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.
ЗАЯВЛЕНИЕ О ПРАВАХ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ, СДЕЛАННОЕ В РАМКАХ НИОКР, ФИНАНСИРУЕМЫХ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА
НЕТ ДАННЫХ
ССЫЛКА НА ПРИЛОЖЕНИЕ «ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ», ТАБЛИЦУ ИЛИ СПИСОК КОМПЬЮТЕРНЫХ ПРОГРАММ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЕ НА КОМПАКТ-ДИСКЕ
НЕТ ДАННЫХ
ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Рекомбинантные иммунотоксины (RIT) - это искусственно созданные лечебные белки, в которых соединены фрагмент антитела и цитотоксический белок, полученный из бактериального или растительного источника. RIT созданы в качестве селективных агентов для целенаправленного уничтожения клеток без проявления множественной вторичной токсичности, характерной для химиотерапевтических стратегий. RIT для лечения раковых заболеваний могут быть сконструированы путем слияния вариабельного фрагмента (Fv) антител против опухолевых антигенов клеточной поверхности с фрагментом экзотоксина А Pseudomonas (РЕ). RIT с использованием 38-кДа фрагмента экзотоксина А Pseudomonas (PE38) имели определенный успех в клинических испытаниях, но имели также ограничения, которые включали плохое проникновение в твердые опухоли, высокую иммуногенность и неспецифическую токсичность (Kreitman RJ et al., Clin Cancer Res., 15(16):5274-9 (2009; Hassan R et al., Clin Cancer Res., 13(17):5144-9 (2007); Wayne AS et al., Clin Cancer Res., 16(6):1894-903 (2010); Kreitman RJ et al., J Clin Oncol., 27(18):2983-90 (2009); Sampson JH et al., Neuro Oncol., 10(3):320-9 (2008); Powell DJ Jr et al., J Immunol., 179(7):4919-28 (2007); Kreitman RJ, J Clin Oncol., 23(27):6719-29 (2005); Pal LH et al., Nat Med., 2(3):350-3 (1996)).
В стремлении улучшить результат лечения с использованием RIT важную роль для понимания строения этих белков играет знание пути токсического действия РЕ. RIT проникают в клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и транспортируются через эндолизосомальную систему в аппарат Гольджи, где они подвергаются обратному транспорту в эндоплазматический ретикулум (ER). Во время этого этапа токсин активируется за счет восстановления дисульфидной связи и расщепления протеазой фурином в определенном участке РЕ38, который отделяет Fv от фрагмента РЕ. Впоследствии активированный РЕ должен перемещаться в цитозоль, где он осуществляет АДФ-рибозилирование и инактивацию фактора элонгации 2, необходимого элемента трансляционного аппарата. Это останавливает синтез белка и в конечном итоге приводит к гибели клетки (обзор о пути токсического действия РЕ см. в 9). Предыдущие стратегии, направленные на улучшение цитотоксической активности RIT на основе РЕ, включали замену C-концевых остатков РЕ, REDLK (SEQ ID NO:15), на канонический сигнал возвращения в ER KDEL (SEQ ID NO:16) (Seetharam S et al., J Biol Chem., 266(26):17376-81 (1991); Du X, Но M, and Pastan I, J Immunother., 30(6):607-13 (2007); Rozemuller H. et al., Int J Cancer., 92(6):861-70 (2001); Kreitman RJ and Pastan I., Biochem J., 307 (Pt 1):29-37 (1995)). Известно, что это изменение повышает цитотоксичность РЕ, предположительно, за счет повышения эффективности ретроградного транспорта в ER из аппарата Гольджи. Эта стратегия эффективна, но, как правило, повышает также и неспецифическую токсичность RIT. Еще одна стратегия заключается в повышении эффективной интернализации комплекса RIT-рецептор, и увеличении тем самым количества токсина в клетке, за счет улучшения сродства между Fv и его мишенью (Salvatore G et al., Chn Cancer Res., 8(4):995-1002 (2002); Decker Т et al., Blood., 103(7):2718-26 (2004)).
Недавно был разработан протеазоустойчивый RIT, выдерживающий деградацию в эндолизосомальной системе, потенциальный барьер для эффективного лечения иммунотоксинами (Johannes L and Decaudin D, Gene Ther., 12(18):1360-8 (2005); Fitzgerald D. Why toxins Semin Cancer Biol., 7(2):87-95 (1996)). Этот «устойчивый к лизосомальной деградации» (LR) вариант RIT был получен путем удаления протеазочувствительных районов РЕ38 и направлением их на B-клеточный рецептор CD22 с использованием высокоаффинного Fv против CD22, полученного из RIT HA22 (Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009)). Мутация LR практически не влияла на активность in vitro на клеточных линиях, но значительно понизила неспецифическую токсичность на мышах и резко повысила активность in vitro на клетках, полученных от пациента с хроническим лимфолейкозом (CLL). Кроме того, в варианте LR устранены две основные группы B-клеточных эпитопов у мышей (Onda M et al., J Immunol., 177(12):8822-34 (2006)) и участки процессинга антигена из РЕ38, что помогает уменьшить его иммуногенность у мышей (Hansen JK et al., J Immunother., 33(3):297-304 (2010)). Благодаря модульной природе RIT, вариант LR из РЕ может быть направлен на другие ассоциированные с опухолью антигены путем замены одного Fv на другой. Соответственно, предшествующий уровень техники, описывающий уменьшение доменов II и Ib РЕ, в общем показывает преимущества удаления протеазочувствительных и антигенных сайтов из молекулы. Уровень техники также демонстрирует фармакокинетические преимущества меньших RIT, что является следствием этих изменений.
Клинически значимым кандидатом-мишенью является ассоциированный с опухолью антиген мезотелин, который часто экспрессируется на высоком уровне при раковых заболеваниях, которые включают мезотелиомы и рак легких, яичников и поджелудочной железы. Соответственно, существует потребность в усовершенствованных RIT, которые специфически поражают раковые клетки, которые экспрессируют мезотелин на их поверхности. Данное изобретение обеспечивает эти и другие потребности, предоставляя RIT, фармацевтические композиции и способы лечения раковых опухолей, которые экспрессируют или сверхэкспрессируют мезотелин.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает усовершенствованный экзотоксин А Pseudomonas («РЕ») с уменьшенной иммуногенностью, улучшенной устойчивостью к лизосомальным протеазам и повышенной цитотоксичностью для клеток, экспрессирующих мезотелин. Структурно у усовершенствованного РЕ изобретения удален домен I РЕ, удалена большая часть домена II РЕ, и имеется функциональный домен III РЕ необязательно с замещением а) аминокислотных остатков домена III РЕ в позициях D406, R432, R467, R490, R513, Е548, K590 и/или Q592 на глицин, аланин или серин, и/или б) аминокислотных остатков домена III РЕ в позициях D403, R412, R427, Е431, R458, D461, R505, Е522, R538, R551, R576 и/или L597 на глицин, серин или аланин. Усовершенствование заключается во введении короткого и гибкого пептидного линкера («FL») от 3 до 8 аминокислот в длину, состоящего из остатков глицина и/или серина, введенного между сайтом расщепления фурином и функциональным доменом III РЕ улучшенного РЕ. Соответственно, короткий линкер состоит из остатков глицина и/или серина. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер представляет собой пептид формулы (Хаа1)n, где каждый Хаа1 независимо выбирают из глицина и серина, и n составляет от 3 до 8. Усовершенствованные молекулы РЕ изобретения сохраняют высокую цитотоксическую активность с удалением B-клеточных эпитопов. Неожиданно оказалось, что включение короткого гибкого линкера повышает цитотоксичность молекулы без существенного изменения расщепления молекулы фурином. Усовершенствованные молекулы РЕ проиллюстрированы частными вариантами осуществления изобретения, представленными здесь как (LR/FL/8X, SEQ ID NO:4) и LR/FL/8M (SEQ ID NO:5). Кроме того, существуют варианты осуществления, в которых молекулы РЕ имеют одну или более мутаций в их функциональном домене III, как показано в SEQ ID NO:4 или 5, по сравнению с функциональным доменом РЕ из SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления имеются дополнительные замены в одном или более остатках, соответствующих 609-613 из SEQ ID NO:1, которые, как предполагают, также функционируют для удержания в эндоплазматическом ретикулуме нативной последовательности. В других вариантах осуществления сайт расщепления фурином домена II РЕ модифицирован или заменен другим сайтом расщепления фурина.
В некоторых вариантах осуществления также в соответствии со всем вышеописанным РЕ содержит функциональный домен III, который имеет одну или более мутаций в функциональной области токсина РЕ из SEQ ID NO:2 (позиции с 12 до 230), или выбранных из следующей таблицы, которые удаляют один или несколько эпитопов домена III РЕ:
Удаляемый эпитоп | Мутации |
2 | R467A |
4 | R432G, D406A |
5 | R490A |
6 | Е548А, R513A |
7 | K590S, Q592A |
*Эпитопы описаны, например, в работе Onda, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105(32):11311-6 и в WO 2007/016150. |
В близком аспекте изобретения предложены рекомбинантные иммунотоксины («RIT изобретения»), которые являются химерными молекулами, включающими (а) группу, направленную на мезотелин, конъюгированную или слившуюся с (б) модифицированным экзотоксином A Pseudomonas («РЕ»), как указано выше. В некоторых вариантах осуществления группа представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из scFv, dsFv, Fab, однодоменного антитела и F(ab′)2, или полипептид, включающий CDR антитела. SS1 и MORab-009 являются предпочтительными направляющими группами. Кроме того, антитело к мезотелину может содержать вариабельную тяжелую цепь («VH») и вариабельную легкую цепь («VL»), причем каждая из цепей VH и VL содержит первую, вторую и третью области, определяющие комплементарность («CDR»), в которых первая CDR («CDR1»), вторая CDR («CDR2»), и третья CDR («CDR3») указанной тяжелой цепи соответственно имеют последовательность аминокислотных остатков, показанную для CDR1 (GYTMN, SEQ ID NO:51), CDR2 (LITPYNGASSYNQKFRG; SEQ ID NO:52), и CDR3 (GGYDGRGFDY; SEQ ID NO:53), и в которых CDR1, CDR2 и CDR3 указанной VL цепи соответственно имеют последовательность аминокислотных остатков, показанную для CDR1 (SASSSVSYMH; SEQ ID NO:54), CDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO:55), и CDR3 (QQWSGYPLT; SEQ ID NO:56). В некоторых вариантах осуществления CDR3 легкой цепи модифицирована и имеет последовательность QQWSKHPLT (SEQ ID NO:57), QQWSGHPLT (SEQ ID NO:58), QQWSAHPLT (SEQ ID NO:59), QQWSQIPLT (SEQ ID NO:60), QQWGFNPLT (SEQ ID NO:61), QQWGTNPLT (SEQ ID NO:62), QQWGSHPLT (SEQ ID NO:63), QQWGDFPLT (SEQ ID NO:64), QQWGDHPLT (SEQ ID NO:65), QQWSAHPLT (SEQ ID NO:66) или QQWSGYPTT (SEQ ID NO:67). В некоторых других вариантах осуществления антитело к мезотелину представляет собой scFv, dsFv, Fab или F(ab′)2. В некоторых других вариантах осуществления изобретения антитело к мезотелину для использования в RIT включает аминокислотную замену по меньшей мере одной аминокислоты в CDR, выбранной из группы, состоящей из VL CDR1, VL CDR2, VH CDR1 и VH CDR2, причем указанная аминокислота кодируется кодоном, который содержит нуклеотид, принадлежащий мотиву «горячей точки», выбранный из группы AGY или RGYW, где R представляет собой А или G, Y представляет собой С или Т, и W представляет собой А или Т.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим
(а) RIT изобретения, как указано выше, и (б) фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим модифицированный экзотоксин А Pseudomonas («РЕ»), FL или RIT, описанным выше. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота далее кодирует все антитело, направленное на мезотелин, или его фрагмент (вариабельную легкую или тяжелую цепь или CDR).
Соответственно, первая группа вариантов осуществления изобретения относится к выделенным модифицированным экзотоксинам A Pseudomonas ("PE"s), содержащим непрерывную полипептидную последовательность со следующей формулой: FCS-FL-функциональный домен III РЕ или L1-FCS-FL-функциональный домен III РЕ, где L1 состоит из непрерывной последовательности пептида от 1 до 10 аминокислотных остатков в длину; FCS представляет собой сайт или последовательность расщепления фурином (например, RHRQPRGWEQL; SEQ ID NO:17), или другую последовательность, которая расщепляется фурином; FL представляет собой последовательность пептида гибкого линкера, содержащую от 3 до 8 аминокислотных остатков, независимо выбранных из глицина и серина; функциональный домен III РЕ включает остатки 395-613 из SEQ ID NO:1, необязательно содержащие (i) замещения в одном или более остатках, соответствующих 609-613 из SEQ ID NO:1, (ii) замещение глицина, аланина, валина, лейцина или изолейцина на аргинин в положении, соответствующем положению 490 в SEQ ID NO:1, (iii) замещение одного или более остатков, соответствующих остаткам SEQ ID NO:1, которые поддерживают иммуногенность эпитопа или субэпитопа домена III РЕ или (iv) комбинацию любого из (i) - (iii). В предпочтительных вариантах осуществления функциональный домен РЕ - это функциональный домен РЕ LR/FL/8X (SEQ ID NO:4) или LR/GGS/8M (SEQ ID NO:3).
В еще одной группе вариантов осуществления изобретения предложены химерные молекулы или RIT, включающие (а) направляющую группу или лиганд, который специфически связывается с мезотелином на поверхности клетки, конъюгированный или слившийся с (б) модифицированным экзотоксином А Pseudomonas (РЕ), как описано выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения лиганд представляет собой антитело или его фрагмент, который сохраняет способность распознавать антиген. В предпочтительных вариантах осуществления антитела являются производными исходного антитела SS1. Предпочтительно, RIT является SS1-LR/GGS/8X, который имеет GGS FL, вставленный между FCS и функциональным доменом III. Эти RIT, соответственно, могут содержать вариабельную легкую цепь SS1 с SEQ ID NO:6 и последовательность вариабельной тяжелой цепи SS1 рекомбинантного иммунотоксина SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9, где вариабельные легкая и тяжелая цепи SS1 образуют стабилизированное дисульфидными связями антитело.
В еще одной группе вариантов осуществления изобретения предложены терапевтические способы уничтожения клеток-мишеней или ингибирования роста клеток-мишеней, которые экспрессируют или сверхэкспрессируют мезотелин на поверхности клеток. Способы включают контактирование клеток с RIT изобретения. Мезотелин - это дифференцировочный антиген, присутствующий на поверхности клеток рака яичника, мезотелиом и некоторых других видов злокачественных новообразований человека. RIT согласно изобретению могут использоваться, например, in vitro или in vivo, чтобы подавить или замедлить рост рака яичников, желудка, клеток плоского эпителия, мезотелиом и других злокачественных клеток, экспрессирующих мезотелин. Предусмотрены способы лечения пациентов, имеющих эти состояния и нуждающихся в лечении с помощью RIT изобретения.
В еще одной группе вариантов осуществления изобретения предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие мутировавшие РЕ и RIT, описанные выше.
В некоторых вариантах осуществления любого из вышеописанного гибкий линкер представляет собой GGS или GGSGGS (SEQ ID NO:18).
В других вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из scFv, dsFv, Fab, однодоменного антитела и F(ab′)2. В некоторых других вариантах осуществления вышеописанного антитело представляет собой SS1 или модифицированное SS1 (scFv, dsFv, Fab, однодоменное антитело или F(ab′)2 антитела SS1 или фрагмент(ы), представляющий(ие) части CDR антитела SS1). В некоторых вариантах осуществления CDR антитела используют в качестве направляющей группы. В некоторых вариантах осуществления антитело является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированный РЕ представляет собой LR/GGS/8M (SEQ ID NO:3) или LR/(Xaa1)n/8X (SEQ ID NO:4) или LR/(Xaa1)n/8M (SEQ ID NO:5). В некоторых других вариантах осуществления химерная молекула представляет собой SS1-LR/GGS/8X (SEQ ID NO:6 и 7) или SS1-LR/GGS/8M (SEQ ID NO:6 и 8), где их соответствующие направляющие группы включают VL и VH части антитела SS1.
Дополнительные варианты осуществления станут очевидными для специалистов и описаны в данном документе.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложена химерная молекула, содержащая фрагмент антитела к мезотелину, напрямую последовательно соединенный с первым пептидным линкером, содержащим от 3 до 8 аминокислот в длину, который непосредственно соединен в последовательности с сайтом расщепления полипептида фурином RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO:17), который непосредственно соединен в последовательности со вторым пептидным линкером, содержащим от 3 до 6 аминокислот, выбранных из Gly и Ser, и который непосредственно соединен в последовательности с N-концевой аминокислотой функционального домена III экзотоксина A Pseudomonas. В некоторых последующих вариантах осуществления функциональный домен - это домен III LR или LR/8M, и фрагментом антитела является dsFv из SS1-LR. В некоторых вариантах осуществления первый пептидный линкер (L1) непосредственно соединен в последовательности с карбоксильным концом участка VH из dsFv. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие химерные молекулы, а также их применение в способе лечения рака, который сверхэкспрессирует мезотелин, у субъекта, нуждающегося в этом. В последующих вариантах осуществления рак представляет собой аденокарциному легкого, рак яичника, мезотелиому или плоскоклеточный рак.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1. Рекомбинантные иммунотоксины. (А) Рекомбинантный иммунотоксин SS1P состоит из стабилизированных дисульфидными связями (ds) тяжелой (VH) и легкой (VL) полипептидных цепей вариабельного фрагмента (Fv) моноклонального антитела к мезотелину SS1, связанных с 38-кДа фрагментом экзотоксина A Pseudomonas (PE38) через короткий пептидный линкер (ASGG; SEQ ID NO:19) из тяжелой цепи. PE38 состоит из домена II, домена III и фрагмента домена Ib из нативного экзотоксина A Pseudomonas. Домен II включает гидрофильную петлю, ограниченную цистеинами, которые образуют дисульфидную связь, которая содержит сайт расщепления протеазой фурин (RHRQPRGWEQL; SEQ ID NO:17). (В) Вариант SS1P, устойчивый к лизосомальной деградации, SS1-LR, не имеет домена Ib и домена II РЕ, за исключением фрагмента из 11 остатков, содержащего сайт расщепления фурином из домена II. Созданы различные конструкции с мутациями (подчеркнуто) вокруг сайта расщепления фурином в SS1-LR (SEQ ID NO:20-24).
Фигура 2. Цитотоксичность SS1-LR на мезотелин-позитивных клеточных линиях. Клеточные линии L55, NCI-H322M, HAY, KB31, М30, А431/K5, OVCAR-8 и А1847 инкубировали с возрастающими концентрациями SS1P (незакрашенные кружки, сплошная линия) или SS1-LR (незакрашенные квадраты, пунктирная линия). Через 3 дня жизнеспособность клеток оценивали методом колориметрического анализа WST-8 и нормализовали между контрольными пробами, не обработанной и обработанной циклогексамидом. Показаны средние значения и стандартные ошибки для шести повторных измерений. SS1-LR содержит стабилизированную дисульфидными связями полипептидную цепь SS1 VL c SEQ ID NO:6 и полипептидную цепь SS1 VH-PE с SEQ ID NO:74.
Фигура 3. Высокие дозы SS1-LR обладают сильной противоопухолевой активностью. Мышам, лишенным волосяного покрова (линии nude), с ксенотрансплантатами опухоли А431/K5 вводили внутривенно на 5, 7 и 9 сутки после имплантации буферный раствор для RIT (0,2% HSA в PBS; кресты, сплошная линия), 0,3 мг/кг SS1P (незакрашенные кружки, сплошная линия) или SS1-LR с дозой 6 мг/кг (незакрашенные квадраты, пунктирная линия) или 15 мг/кг (закрашенные квадраты, пунктирная линия). Стрелки указывают дни, когда проводилось лечение. Размер опухоли измеряли в течение 22 дней. Точки представляют средние размеры опухоли у всех мышей в группе обработки (n=6). Планки погрешностей показывают стандартное отклонение каждого среднего значения.
Фигура 4. Процессинг интернализированного иммунотоксина. Клетки А431/K5 инкубировали непрерывно с (А) SS1P или (В) SS1-LR, лизировали в различные моменты времени от 0 до 24 часов и анализировали методом невосстанавливающего электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга с антителом к РЕ. Отмечены полосы, соответствующие полноразмерным, восстановленным и расщепленным фурином формам. (С) Интенсивность полосы, соответствующей форме, расщепленной фурином, относительно суммарной интенсивности всех полос в каждый момент времени показана для SS1P (незакрашенные кружки, сплошная линия) и SS1-LR (незакрашенные квадраты, пунктирная линия).
Фигура 5. Добавление гибкого линкера повышает цитотоксичность SS1-LR. Клеточные линии (А) KB31 и (В) NCI-H322M инкубировали с возрастающими концентрациями SS1P (незакрашенные кружки, сплошная линия), SS1-LR (незакрашенные квадраты, пунктирная линия), SS1-LR/GGS (незакрашенные ромбы, сплошная линия) или SS1-LR/GGS R279G (закрашенные шестиугольники, без линии). Через 3 дня жизнеспособность клеток оценивали методом колориметрического анализа WST-8 и нормализовали между контрольными пробами, не обработанной и обработанной циклогексамидом. Представлены средние значения и стандартные ошибки для шести повторных измерений.
Фигура 6. Цитотоксичность SS1-LR/GGS/8M на клетках пациентов. Клетки, полученные из плевральной жидкости или асцита пациентов с мезотелиомой, высевали с увеличивающимися концентрациями RIT SS1P (белая полоса) или SS1-LR/GGS/8M (серая полоса). После 4 дней клетки фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым, чтобы обнаружить интактные клетки. Полученное поглощение при 595 нм нормализовали относительно необработанной контрольной пробы. Представлены средние значения и стандартные ошибки для трех повторных измерений. Без звездочки = p>0,05; *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001.
Фигура 7. Действие SS1-LR/GGS/8M in vivo. А) Противоопухолевая активность SS1-LR/GGS/8M. Мышам, лишенным волосяного покрова, с ксенотрансплантатом опухоли L55 внутривенно вводили на 7, 9 и 12 сутки после имплантации буферный раствор для RIT (0,2% HSA в D-PBS; кресты, сплошная линия), 0,4 мг/кг SS1P (незакрашенные кружки, сплошная линия), или SS1-LR/GGS/8M в дозе 0,4 мг/кг (незакрашенные квадраты, пунктирная линия) или 2,5 мг/кг (закрашенные квадраты, пунктирная линия). Стрелки указывают дни, когда проводилось лечение. Размер опухоли измеряли в течение 30 дней. Точки представляют средние размеры опухоли у всех мышей в группе обработки (n=7). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение каждого среднего значения. В) Модель синдрома повышенной проницаемости капилляров на крысах. Крысам внутривенно вводили PBS, SS1P или SS1-LR/GGS/8M, наблюдали в течение 24 часов, а затем умерщвляли. Торакальную жидкость из эвтанизированных животных собирали и измеряли. Легкие нескольких крыс фиксировали, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. С) Показаны репрезентативные фотографии при 200-кратном увеличении. D) Фармакокинетика SS1-LR/GGS/8M. Мышам линии BalbC внутривенно вводили 10 мкг либо SS1P, либо SS1-LR/GGS/8M и брали кровь через определенные промежутки времени, от 2 до 60 минут после инъекции. Концентрацию иммунотоксина в сыворотке через различные промежутки времени определяли с использованием ELISA и аппроксимировали одноэкспоненциальной функцией распада. Рассчитывали соответствующий период полураспада (t1/2). Каждая точка представляет собой концентрацию иммунотоксина в сыворотке одной мыши, и концентрацию в каждый промежуток времени определяли по меньшей мере у двух различных мышей.
Фигура 8. Антигенность SS1-LR/GGS/8M для человека. Реакционную способность SS1P и SS1-LR/GGS/8M к существовавшим ранее антителам в сыворотке человека сравнивали, используя метод вытеснения, чтобы определить концентрацию, при которой два RIT уменьшали сигнал ELISA для выявления антител сыворотки на 50% (IC50). Здесь приведены относительные значения IC50 SS1P к SS1-LR/GGS/8M. Антигенность SS1-LR/GGS/8M резко понизилась по отношению к SS1P для всех сывороток.
Фигура 9. Заключение о цитотоксичности SS1-LR/GGS/8M для клеток пациентов. Зависимость относительной жизнеспособности от лечения. Клетки, полученные из плевральной жидкости или асцита у пациентов с мезотелиомой, высевали с увеличивающейся концентрацией SS1P (белая полоса) или SS1-LR/GGS/8M (серая полоса). Через 4 дня клетки фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым, чтобы обнаружить интактные клетки. Полученное поглощение при 595 нм нормализовали относительно необработанной контрольной пробы. Представлены средние значения и стандартные ошибки для трех повторных измерений. Звездочки указывают существенные различия p<0,01 (**) или p<0,001 (***).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложен менее токсичный и менее иммуногенный вариант RIT, направленных на мезотелин, на основе RIT SS1P, направленных на мезотелин, который создан на основе РЕ. Наша первоначальная оценка SS1-LR, произведенная на основе предыдущей работы с анти-CD22 RIT HA22-LR на основе РЕ (Weldon et al., Blood 113(6):3792-3800)(2009)), показала высоковариабельную активность в отношении экспрессирующих мезотелин клеточных линий in vitro. При исследовании ксенотрансплантатов опухоли А431/K5 на мышах SS1-LR (SEQ ID NO:6 и 7) был менее активен, чем SS1P, но SS1-LR мог быть введен в намного более высоких дозах для достижения значительной регрессии опухоли. При исследовании причин его высоковариабельной активности по отношению к SS1P мы изучали интернализацию и процессинг SS1-LR и обнаружили, что доля SS1-LR, расщепленного фурином, была гораздо ниже, чем у SS1P. Это позволило предположить, что пониженное расщепление фурином может ограничивать активность SS1-LR, и мы разработали и создали несколько мутантов, чтобы проверить эту гипотезу. Добавление короткого Gly-Gly-Ser линкера после сайта расщепления фурином повысило активность SS1-LR на клеточных линиях, но, на удивление, увеличенная цитотоксичность не соответствовала увеличенному расщеплению фурином. Настоящее изобретение относится к этому удивительному открытию значимости короткого гибкого линкера для цитотоксичность конструкции RIT, направленного на мезотелин, независимо от какого-либо влияния на расщепление РЕ фурином. В дальнейшей работе в SS1-LR/GGS были включены 8 точечных мутаций, на которых было показано уменьшение иммуногенности РЕ, а затем молекулу тестировали на первичных злокачественных клетках от пациентов с мезотелиомой. Конечная молекула, SS1-LR/GGS/8M (SEQ ID NO:6 и 8) демонстрировала цитотоксичность, аналогичную цитотоксичности SS1P. Кроме того, RIT в соответствии с изобретением могут обеспечить значительно сниженную неспецифическую токсичность (например, синдром повышенной проницаемости капилляров) у млекопитающих.
При использовании in vivo мышиной модели с ксенотрансплантатной опухолью A4311K5 наблюдали примерно 20-кратное различие в противоопухолевом эффекте между SS1-LR и SS1P. Это различие нельзя полностью отнести к цитотоксичности, поскольку данные in vitro указывают на 4-кратное снижение цитотоксичности на А431/K5 клетках. Видимо, остальная часть этой разницы связана с фармакокинетическими свойствами SS1-LR у мышей. Ранее нами было показано, что HA22-LR имеет почти в 2 раза более короткий период полураспада в сыворотке у мышей, чем НА22 (7,8 против 14,6 минут соответственно), и мы предположили, что разница связана с повышенной почечной фильтрации меньшей молекулы LR (Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009)). Изучая площадь под кривой распада, мы обнаружили, что эта разница в полураспаде предполагает приблизительно 4-кратное различие в количестве доступного белка в течение одного часа. Таким образом, различие в активности in vivo можно отнести как к пониженной цитотоксичности, так и к более короткому периоду полураспада.
Хотя SS1-LR демонстрировал in vivo более низкую противоопухолевую активность, чем SS1P, его неспецифическая токсичность была также значительно снижена у мышей. Мы воспользовались этим свойством, чтобы резко увеличить дозу SS1-LR по сравнению с SS1P (в 50 раз) при анализе ксенотрансплантатной опухоли, что привело к значительному увеличению противоопухолевого эффекта. Предыдущие эксперименты показали, что LD50 для однократного внутривенного введения SS1P составляет 1,0 мг/кг для мышей линии Balb/C (Filpula D et al., Bioconjug Chem., 18(3):773-84 (2007)) и 0,75 мг/кг для мышей линии NIH Swiss (Onda M et al., Cancer Res., 61(13):5070-7 (2001)). При использовании графика дозирования QODx3, похожего на клинический график, мыши выносили максимальную дозу 0,3 мг/кг SS1P (неопубликованные наблюдения). SS1-LR, однако, вводили в режиме QODx3 мышам с ксенотрансплантатом опухоли А431/K5 в дозе 15 мг/кг без вредного воздействия. Ранее однократное внутривенное введение дозы HA22-LR 20 мг/кг не показало никакого токсичного эффекта у мышей (Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009)), и мы вводили однократные дозы HA22-LR вплоть до 45 мг/кг мышам, не вызывая смерти (неопубликованные наблюдения). Хотя ни одна LR молекула не была испытана клинически, этот эффект означает, что LR вариант RIT может иметь пониженную токсичность у человека, что позволило бы избежать дозолимитирующей токсичности и вводить более высокие дозы.
Хотя SS1-LR была эффективна in vitro и in vivo, мы были обеспокоены пониженной в большинстве случаев активностью по сравнению с SS1P. Одним из возможных объяснений этого несоответствия является разница во внутриклеточном механизме интоксикации. LR вариант РЕ38 содержит обширные делеции в домене II и Ib РЕ, и эти делеции могли негативно отразиться на способности РЕ к перемещению в цитозоль. Интересно, что наши первоначальные эксперименты по обнаружению полноразмерного и процессированного РЕ в лизатах клеток, обработанных SS1P и SS1-LR, показали существенное различие в количестве обработанного фурином RIT. Большая часть от общего количества RIT в клетках, обработанных SS1P, была процессирована, но только небольшая часть от общего количества RIT была процессирована в обработанных SS1-LR клетках. Этот результат означал, что плохое расщепление фурином могло ограничивать активность SS1-LR, и мы намеревались улучшить этот этап токсического действия РЕ.
Наши усилия по повышению цитотоксичности SS1-LR за счет увеличения доступности сайта расщепления фурином привели к созданию более активного RIT, но мы не смогли продемонстрировать улучшенное расщепление фурином. Добавление короткого Gly-Gly-Ser линкера (SS1-LR/GGS, Фиг.1В), более длинного линкера (SS1-LR/GGSx2, Фиг.1В) или повторение сайта расщепления фурином в окружении коротких Gly-Gly-Ser линкеров (SS1-LR/2хФурин, Фиг.1В) привело к среднему повышению цитотоксичности. Ни у одной из этих молекул, однако, не повышалась доля расщепленного фурином SS1-LR в обработанных клетках А431/K5, а также не увеличивалась скорость расщепления фурином in vitro. Мы пришли к выводу, что добавление линкера должно повышать цитотоксичность через другой механизм, возможно, связанный с внутриклеточной миграцией молекулы в тестируемых клетках.
Эти эксперименты также показали абсолютную необходимость расщепления фурином для сохранения цитотоксичности SS1P. Точечная мутация в SS1-LR/GGS, которая заменяла аргинин, необходимый для расщепления, на глицин (SS1-LR/GGS R279G, Фиг.1В), приводила к получению белка, который не расщеплялся фурином. Такой RIT не проявлял никакой активности на обеих клеточных линиях - NCI-H322M и KB31. Необходимость расщепления фурином в пути интоксикации РЕ недавно была поставлена под сомнение (Morlon-Guyot J et al., Infect Immun., 77(7):3090-9 (2009)), но существует множество доказательств того, что фурин выполняет важную роль во время интоксикации (Ornatowski W et al., J Clin Invest, 117(11):3489-97 (2007); Shiryaev SA et al., J Biol Chem., 282(29):20847-53 (2007); Sarac MS et al., Infect Immun., 70(12):7136-9 (2002); Chiron MF, Fryling CM, and FitzGerald D, J Bid Chem., 272(50):31707-11 (1997); Gu M et al., Infect Immun., 64(2):524-7 (1996); Inocencio NM, Moehring JM, and Moehring TJ, J Biol Chem., 269(50):31831-5 (1994); Moehring JM et al., J Biol Chem., 268(4):2590-4 (1993)). В случае, представленном здесь, интоксикация РЕ нарушается при отсутствии сайта, пригодного для процессинга под действием фурина. Исследования по изучению связи между расщепления фурином и цитотоксичностью продолжаются.
Отдельное направление исследований в нашей лаборатории недавно привело к созданию варианта НА22, HA22-LR-8M, который имеет чрезвычайно низкую иммуногенность из-за ликвидации эпитопов В-клеток (Onda M et al., направлено для публикации в PNAS). HA22-LR-8M содержит те же делеции, что и LR вариант РЕ, но также включает восемь точечных мутаций в домене III РЕ. Эти мутации внесли в SS1P для создания SS1-LR/GGS/8M. Единственными различиями между HA22-LR-8M и SS1-LR/GGS/8M являются антитело Fv и линкер GGS после сайта расщепления фурином. Поскольку подавляющая часть иммунного ответа на RIT направлена на РЕ, SS1-LR/GGS/8M должен обладать аналогично сниженной иммуногенностью.
Цитотоксичность SS1-LR/GGS/8M сравнивали с SS1P на первичных злокачественных клетках от пациентов с мезотелиомой, и результаты показали, что цитотоксичность SS1-LR/GGS/8M была сравнима или лучше, чем SS1P. В дополнение к хорошей активности, SS1-LR/GGS/8M имеет потенциальные преимущества перед SS1P, которые включают пониженную неспецифическую токсичность и низкую иммуногенность. Эксперименты, описанные здесь, показывают, что SS1-LR/GGS/8M был бы превосходным кандидатом для применения в клинике из-за его низкой иммуногенности, низкой неспецифической токсичности и хорошей цитотоксичности.
Определения
Единицы, приставки и символы приведены в форме, принятой в Международной системе единиц (СИ). Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в ориентации от 5′ к 3′; аминокислотные последовательности записаны слева направо от N-конца к С-концу. Заголовки, приведенные здесь, не ограничивают различные аспекты или варианты осуществления изобретения, которые необходимо воспринимать со ссылкой на описание в целом. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно определяются в соответствии с описанием в полном объеме.
Нативный экзотоксин A Pseudomonas («РЕ») является чрезвычайно активным мономерным белком (молекулярная масса 66 кДа), выделяемым синегнойной палочкой, который ингибирует синтез белков в эукариотических клетках. Нативная последовательность РЕ приведена в SEQ ID NO:1 патента США №5602095, включенного в данный документ посредством ссылки. Способ действия заключается в инактивации фактора элонгации 2 (EF-2) путем АДФ-рибозилирования. Экзотоксин состоит из трех структурных доменов, которые действуют совместно, проявляя цитотоксичность. Домен Ia (аминокислоты 1-252) опосредует связывание с клеткой. Домен II (аминокислоты 253-364) отвечает за транслокацию в цитозоль, и домен III (аминокислоты 400-613) опосредует АДФ-рибозилирование фактора элонгации 2. В исходной структуре РЕ домен III классифицировали как остатки 405-613, а не 400-613. Allured VS, Collier RJ, Carroll SF & McKay DB, Proc Natl Acad Sci USA 83, 1320-1324 (1986). Функция домена Ib (аминокислоты 365-399) остается неопределенной, хотя большая его часть, аминокислоты 365-380, могут быть удалены без потери цитотоксичности. См. Siegall, et al., J Biol Chem 264:14256-61 (1989). Многочисленные такие модификации известны в данной области техники и включают, без ограничения, удаление домена la, различные аминокислотные делеции в доменах Ib, II и III, единичные аминокислотные замены и добавление одной или более последовательностей к карбоксильному концу, таких как KDEL (SEQ ID NO:16) и REDL (SEQ ID NO:26). См. Siegall, et al., J. Biol. Chem. 264:14256-14261 (1989). Иммунотоксины данного изобретения способны к транслокации и рибозилированию EF-2 в клетке-мишени.
Мутации РЕ описаны в данном документе с указанием аминокислотного остатка, присутствующего в конкретном положении в 613-аминокислотной последовательности нативного РЕ (SEQ ID NO:1), с последующей аминокислотой, которой этот остаток был замещен в конкретной рассматриваемой мутации. Так, например, термин «R490A» указывает, что «R» (аргинин, стандартный однобуквенный код) в положении 490 в указанной молекуле замещен на «А» (аланин, стандартный однобуквенный код), a «K590Q» означает, что лизин, обычно присутствующий в положении 590, был замещен на глутамин. Стандартный однобуквенный код для распространенных аминокислот представлен ниже.
Термин «функциональный домен III РЕ» или «функциональный домен РЕ III» относится к остаткам 395-613 нативного РЕ (нативной последовательностью является SEQ ID NO:1). Хотя структурные границы домена III установлены как остатки 405-613, функциональный анализ показал, что домен III требует сегмент домена Ib для сохранения активности АДФ-рибозилирования (Hwang, J. et al., Cell, 48:129-136 (1987); Siegall, C.B. et al., J Biol Chem, 264:14256-14261 (1989)). Функциональный домен III РЕ, таким образом, определяют остатками 395-613 из РЕ (Kihara, A. and Pastan, I., Bioconjug Chem, 5:532-538 (1994)). В данном документе последовательность функционального домена III РЕ включает в себя необязательные модификации для снижения антигенности и необязательные альтернативные последовательности удержания в эндоплазматическом ретикулуме.
Концевые остатки домена III РЕ, REDLK (SEQ ID NO:15), могут меняться так, чтобы повысить цитотоксичность RIT, получающихся в соответствии с данным изобретением. Например, иммунотоксины, полученные с мутированным окончанием РЕ в виде последовательностей KDEL (SEQ ID NO:16), REEL (SEQ ID NO:27) или RDEL (SEQ ID NO:28), могут обладать гораздо более сильным цитотоксическим действием на клетки-мишени, чем иммунотоксины, полученные из РЕ38 с нативной концевой последовательностью. См. Kreitman and Pastan, Biochem J, 307(Pt 1):29-37 (1995). Повторы этих последовательностей также могут быть использованы в данных RIT. См., например, патенты США 5854044; 5821238 и 5602095, и международную публикацию WO 99/51643. В то время как РЕ, заканчивающиеся на KDEL (SEQ ID NO:16), полезны для исследований in vitro, они могут иметь большую неспецифическую токсичность у животных и являются менее предпочтительными для применения in vivo.
Термин «мезотелин» относится к белку и его фрагментам, присутствующим на поверхности некоторых клеток человека и связываемым, например, антителом K1. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности мезотелина приведены, например, в опубликованной заявке РСТ WO 97/25068 и в патентах США 6083502 и 6153430. См. также Chang, K. & Pastan, I., Int. J. Cancer 57:90 (1994); Chang, K. & Pastan, I., Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 93:136 (1996); Brinkmann U., et al., Int. J. Cancer 71:638 (1997); Chowdhury, P.S., et al., Mol. Immunol. 34:9 (1997), и патент США №6809184. Мезотелин экспрессируется в виде белка-предшественника примерно 69 кДа, который затем подвергается процессингу с выделением белка 30 кДа, оставляя прикрепленным к клеточной поверхности описанный в уровне техники гликопротеин клеточной поверхности, связанный с 40 кДа гликозилфосфатидилинозитолом. 40 кДа гликопротеин является гликопротеином, который в данном документе называется термином «мезотелин». Нуклеотидные и аминокислотные последовательности мезотелина известны для нескольких биологических видов, например, человека (NM_005823.4→NP_005814.2 и NM_013404.3→NP_037536.2), мыши (NM_018857.1→NP_061345.1), крысы (NM_031658.1→NP_113846.1), коровы (NM_001100374.1→NP_001093844).
Для удобства пользования ссылками используемый в данном документе термин «антитело» включает целые антитела (иногда называемые здесь «интактные»), фрагменты антител, которые сохраняют способность к распознаванию антигена и связыванию, будучи полученными либо путем модификации целых антител либо синтезированными de novo с использованием методик на основе рекомбинантной ДНК, моноклональные антитела, поликлональные антитела и имитаторы антител, если иное не следует из контекста. Антитело может быть IgM, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgD, IgA или IgE.
Последовательности константных областей подклассов IgG хорошо известны в этой области техники в течение многих лет (например, Honjo et al., Cell, 18:559-68 (1979); Tucker et al., Science, 206:1303-6 (1979); Yamawaki et al., Nature 283:786-9 (1980); Ellison et al., Nucl Acids Res 10:4071-9 (1982); Ellison et al., DNA 1:11-8 (1981); Ellison and Hood, Proc Natl Acad Sci USA 79:1984-8 (1982)). Поскольку CDR вариабельных районов определяют специфичность антител, CDR или Fv антител против поверхностного антигена клетки-мишени могут быть привиты или встроены в выбранное антитело для придания специфичности в отношении поверхностного антигена клетки-мишени этому антителу. Например, CDR антитела против поверхностного антигена клетки-мишени могут быть соединены с каркасными районами человеческого антитела с известной трехмерной структурой (см., например, W098/45322, WO 87/02671; патенты США №5859205, 5585089 и 4816567; заявка ЕР 0173494; Jones, et al. Nature 321:522 (1986); Verhoeyen, et al., Science 239:1534 (1988), Riechmann, et al. Nature 332:323 (1988); и Winter & Milstein, Nature 349:293 (1991)) с образованием антитела, которое вызовет незначительный иммуногенный ответ или вообще его не вызовет при введении в организм человека. Альтернативно, константные области антител можно сконструировать, заменив остатки, обнаруженные у животных (не у человека), таких как мыши, на остатки, обычно встречающиеся у людей. Антитела, полученные таким образом, называют «гуманизированными антителами», и они являются предпочтительными, так как характеризуются меньшим риском появления побочных эффектов и могут дольше оставаться в кровотоке. Методы гуманизации антител известны в данной области техники и изложены, например, в патентах США 6180377, 6407213, 5693762, 5585089 и 5530101.
Термин «фрагменты антител» означает молекулы, которые включают часть интактного антитела, как правило, область, связывающую антиген, или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab′, F(ab′)2, и Fv фрагменты, однодоменные антитела (см., например, Wesolowski, Med Microbiol Immunol. (2009) 198(3):157-74; Saerens, et al., Curr Opin Pharmacol. (2008) 8(5):600-8; Harmsen and de Haard, Appl Microbiol Biotechnol. (2007) 77(1):13-22); антитела, стабилизированные спиралями (см., например, Arndt et al., J Mol Biol 312:221-228 (2001); диатела (см. ниже); молекулы одноцепочечных антител («scFv», см., например, патент США №5888773); антитела, стабилизированные дисульфидными связями («dsFv», см., например, патент США №5747654 и 6558672) и доменные антитела («dAb», см., например, Holt et al., Trends Biotech 21(11):484-490 (2003), Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521-526 (1997), Lauwereys et al., EMBO J 17:3512-3520 (1998), Reiter et al., J. Mol. Biol. 290:685-698 (1999), Davies and Riechmann, Biotechnology, 13:475-479 (2001)).
Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, где фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи («VH» или «VH»), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи («VL» или «VL») в той же полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между этими двумя доменами одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела и их получение описано более подробно, например, в ЕР 404,097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Термин «исходное антитело» означает любое антитело, представляющее интерес, которое должно быть мутировано или изменено для получения антител или их фрагментов, которые связываются с тем же эпитопом, что и исходное антитело, но с более высоким сродством.
«Направляющей группой» является часть иммуноконъюгата, предназначенная для нацеливания иммуноконъюгата на клетку, представляющую интерес. Как правило, направляющей группой является антитело или фрагмент антитела, которые сохраняют способность распознавать антиген, такие как scFv, dsFv, Fab, или F(ab′)2.
«Токсический фрагмент» - это часть иммунотоксина, которая делает иммунотоксин цитотоксичным для клеток, представляющих интерес. Что касается иммунотоксинов, которые являются предметом настоящего изобретения, токсический фрагмент представляет собой экзотоксин A Pseudomonas, который был модифицирован/мутирован для уменьшения его неспецифической цитотоксичности, как более подробно описано ниже.
Как правило, иммуноглобулин имеет тяжелую и легкую цепи. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область (области также известны как «домены»). Вариабельные области легких и тяжелых цепей содержат «каркасные» участки, прерывающиеся тремя гипервариабельными областями, называемыми также «областями, определяющими комплементарность» или «CDR». Определена протяженность каркасного участка и CDR. Последовательности каркасных участков различных легких и тяжелых цепей относительно стабильны в пределах биологического вида. Каркасные участки антитела, то есть объединенные каркасные участки образующих легких и тяжелых цепей, служат для размещения и выравнивания CDR в трехмерном пространстве.
CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. CDR каждой цепи обычно называют CDR1, CDR2 и CDR3, с последовательной нумерацией, начиная с N-конца, а также обычно идентифицируют по цепи, в которой конкретная CDR находится. Так, VH CDR3 находится в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в котором она обнаружена, в то время как VL CDR1 является CDR1 из вариабельного домена легкой цепи антитела, в котором она обнаружена.
Ссылки на «VH» или «VH» относятся к вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fv, scFv, dsFv или Fab. Ссылки на «VL» или «VL» относятся к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, включая Fv, scFv, dsFv или Fab.
Фраза «одноцепочечный Fv» или «scFv» относится к антителу, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи традиционного двуцепочечного антитела объединены с образованием одной цепи. Как правило, линкерный пептид вставляют между двумя цепями для обеспечения надлежащей укладки и создания активного сайта связывания.
Фразы «дисульфидная связь» или «цистеин-цистеин дисульфидная связь» относятся к ковалентному взаимодействию между двумя остатками цистеина, в которых атомы серы цистеина окисляются с образованием дисульфидной связи. Средняя энергия дисульфидной связи составляет около 60 ккал/моль по сравнению с 1-2 ккал/моль для водородной связи.
Фраза «стабилизированный дисульфидными связями Fv» или «dsFv» относится к вариабельному фрагменту иммуноглобулина, в котором есть дисульфидная связь между легкой и тяжелой цепями. В контексте настоящего изобретения цистеины, которые образуют дисульфидную связь, находятся в каркасных участках цепей антитела и служат для стабилизации конформации антитела. Как правило, антитело сконструировано таким образом, чтобы вводить в каркасный участок цистеиновые остатки в такое положение, где замена не будет мешать связыванию антигена.
Под термином «линкерный пептид» подразумевается пептид, находящийся в пределах связывающего фрагмента антитела (например, фрагмента Fv), который служит для непрямого связывания вариабельного домена тяжелой цепи с вариабельным доменом легкой цепи.
Термин «горячая точка» означает часть нуклеотидной последовательности CDR или каркасного участка вариабельного домена, которая является местом особенно высокой естественной изменчивости. Хотя CDR сами по себе считаются участками гипервариабельности, было обнаружено, что мутации распределены неравномерно по всем CDR. Особые сайты, или горячие точки, были определены как места, в которых сконцентрированы мутации. Горячие точки характеризуются рядом структурных особенностей и последовательностей. Такие «мотивы горячих точек» могут быть использованы для идентификации горячих точек. Двумя мотивами консенсусных последовательностей, которые особенно хорошо охарактеризованы, являются последовательность тетрануклеотида RGYW и последовательность серина AGY, где R представляет собой А или G, Y представляет собой С или Т, и W представляет собой А или Т.
Антитело, иммунологически активное к конкретному антигену, может быть получено рекомбинантными методами, такими как отбор из библиотек рекомбинантных антител в фаговых или подобных векторах, см., например, Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward, et al., Nature 341:544-546 (1989); and Vaughan, et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996), или путем иммунизации животного антигеном или ДНК, кодирующей антиген.
Термин «эффекторная группа» означает часть иммуноконъюгата, предназначенную оказывать эффект на клетку-мишень, определенную направляющей группой, или идентифицировать присутствие иммуноконъюгата. В контексте настоящего изобретения эффекторная группа представляет собой модифицированный или мутированный экзотоксин A Pseudomonas.
Под термином «иммуноконъюгат» подразумевается ковалентная связь эффекторной молекулы с антителом.
Термины «эффективное количество» или «количество, эффективное для» или «терапевтически эффективное количество» относятся к дозе терапевтического агента, достаточной для получения желаемого результата, такого как ингибирование синтеза клеточного белка, по меньшей мере, на 50% или распад клетки.
В контексте настоящего изобретения токсин является мутированным экзотоксином A Pseudomonas.
Термин «контактирование» означает расположение в непосредственной физической близости.
«Экспрессионная плазмида» включает нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу, представляющую интерес, которая функционально связана с промотором.
Используемые в данном документе термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к полимеру из аминокислотных остатков. Эти термины применимы к полимерам аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков представляет собой искусственный химический аналог соответствующей аминокислоты природного происхождения, а также к полимерам аминокислот, встречающихся в природе. Эти термины распространяются также на полимеры, содержащие консервативные аминокислотные замены, в результате которых белок остается функциональным.
Термин «остаток» или «аминокислотный остаток» или «аминокислота» означает аминокислоту, которая включена в белок, полипептид или пептид (вместе обозначаемым «пептид»). Аминокислота может быть встречающейся в природе аминокислотой и, если не ограничено иначе, может включать известные аналоги природных аминокислот, которые могут функционировать таким же образом, как природные аминокислоты.
Аминокислоты и аналоги, упоминаемые в данном документе, описываются сокращенными обозначениями, как следует из Таблицы А:
Таблица А: | ||
Номенклатура аминокислот | ||
Название | 3-буквенное | 1-буквенное |
Аланин | Ala | A |
Аргинин | Arg | R |
Аспарагин | Asn | N |
Аспарагиновая кислота | Asp | D |
Цистеин | Cys | С |
Глутаминовая кислота | Glu | E |
Глутамин | Gln | Q |
Глицин | Gly | G |
Гистидин | His | H |
Гомосерин | Hse | - |
Изолейцин | Ile | I |
Лейцин | Leu | L |
Лизин | Lys | K |
Метионин | Met | M |
Метионин сульфоксид | Met (O) | - |
Метионин | ||
метилсульфоний | Met (S-Me) | - |
Норлейцин | Nle | - |
Фенилаланин | Phe | F |
Пролин | Pro | P |
Серин | Ser | S |
Треонин | Thr | Т |
Триптофан | Trp | W |
Тирозин | Tyr | Y |
Валин | Val | V |
«Консервативная замена» при описании белка относится к изменению в аминокислотном составе белка, которое по существу не изменяет активность белка. Так, «консервативно модифицированные варианты» конкретной аминокислотной последовательности относятся к аминокислотным заменам тех аминокислот, которые не являются особо важными для активности белка, или замене аминокислот другими аминокислотами, имеющими аналогичные свойства (например, кислые, основные, положительно или отрицательно заряженные, полярные или неполярные и т.д.), так что замещение даже ключевых аминокислот существенно не отразится на активности. Таблицы консервативных замен, представляющие функционально похожие аминокислоты, хорошо известны в данной области техники. Следующие шесть групп в Таблице В содержат аминокислоты, которые являются консервативными заменами по отношению друг к другу:
Таблица В
1) Аланин (А), Серин (S), Треонин (Т);
2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (Е);
3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);
4) Аргинин (R), Лизин (K);
5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (М), Валин (V); и
6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W).
Смотри также Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Company, New York (2nd Ed., 1992).
Термины «конъюгация», «соединение», «связь» или «связывание» относятся к объединению двух полипептидов в одну непрерывную полипептидную молекулы. В контексте настоящего изобретения эти термины означают присоединение фрагмента антитела к эффекторной молекуле (ЭМ). Связь может быть создана химическими или рекомбинантными средствами. Химические средства относятся к реакции между фрагментом антитела и эффекторной молекулой, приводящей к образованию между двух молекул ковалентной связи, формирующей одну молекулу.
Используемый в данном документе термин «рекомбинантный» относится к белку, полученному с использованием клеток, которые не имеют в своем нативном состоянии эндогенной копии ДНК, способной к экспрессии белка. Клетки продуцируют рекомбинантный белок, потому что они были генетически изменены путем введения соответствующей выделенной последовательности нуклеиновых кислот. Этот термин также относится к клетке, или нуклеиновой кислоте, или вектору, которые были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или изменения нативной нуклеиновой кислоты до формы, не являющейся нативной для этой клетки, или к тому, что клетка получена из клетки, модифицированной таким образом. Так, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не встречаются в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, экспрессируют мутантные гены, которые находятся в нативной форме, или экспрессируют нативные гены, которые в других обстоятельствах эскпрессируются аномально, не в полной мере или вообще не экспрессируются.
Используемые в данном документе термины «нуклеиновая кислота» или «последовательность нуклеиновых кислот» относятся к полимерам дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме, и, если не ограничено иначе, охватывают известные аналоги природных нуклеотидов, которые создают гибриды с нуклеиновыми кислотами аналогично нуклеотидам природного происхождения. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновых кислот включает комплементарную последовательность нуклеиновых кислот, а также консервативные варианты, т.е. нуклеиновые кислоты присутствуют в неоднозначных позициях кодонов и вариантов, что при трансляции белка приводит к консервативной замене аминокислоты.
Используемый в данном документе термин «кодирование» применительно к определенной нуклеиновой кислоте относится к нуклеиновым кислотам, которые содержат информацию для трансляции в специфический белок. Информация задается использованием кодонов. Как правило, аминокислотная последовательность кодируется нуклеиновой кислотой с использованием «универсального» генетического кода. Однако могут быть использованы варианты универсального кода, такие как присутствующие в митохондриях некоторых растений, животных и грибов бактерии Mycoplasma capricolum (Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 82:2306-2309 (1985) или инфузории Macronucleus, когда нуклеиновая кислота экспрессируется с использованием трансляционного аппарата этих организмов.
Фраза «слияние в рамке» относится к соединению двух или более последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, так что соединенная последовательность нуклеиновых кислот транслируется в одноцепочечный белок («слитый белок»), который включает первоначальные полипептидные цепи.
Используемый в данном документе термин «экспрессируемый» относится к трансляции нуклеиновой кислоты в белок. Белки могут быть экспрессированы и оставаться внутри клетки, стать составной частью поверхностной мембраны клетки или секретироваться во внеклеточный матрикс или среду.
Термин «клетка-хозяин» означает клетку, которая может поддерживать репликацию или экспрессию экспрессионного вектора. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками, такими как E.coli, или эукариотическими клетками, такими как клетки дрожжей, насекомых, амфибий или млекопитающих.
Термины «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как можно измерить с помощью одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной проверки.
Фраза «по существу идентичные» в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые имеют по меньшей мере 60%, более предпочтительно 65%, еще более предпочтительно 70%, еще более предпочтительно 75%, еще более предпочтительно 80% и наиболее предпочтительно 90-95% идентичных нуклеотидных или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как измерено с помощью одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной проверки. Предпочтительно, идентичность по существу имеет место на протяжении области последовательностей, по меньшей мере, из приблизительно 50 остатков в длину, более предпочтительно, области, по меньшей мере, из приблизительно 100 остатков, и наиболее предпочтительно, области, в которой последовательности по существу идентичны, по меньшей мере, из приблизительно 150 остатков. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности являются по существу идентичными по всей длине пептида сравнения или кодирующих областей.
Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, задают координаты подпоследовательности, если необходимо, и выбирают программные параметры алгоритма. Затем, на основании заданных программных параметров алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности для тестируемой(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности.
Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), алгоритма гомологичного выравнивания Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), методом поиска сходства Pearson & Lipman, Proc. Nat′l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в комплекте программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), либо путем визуального осмотра (см. Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et at., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)).
Примерами алгоритмов, которые пригодны для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 и Altschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST является общедоступным через Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм предполагает в первую очередь выявление сильно совпадающих пар последовательностей (HSP) путем идентификации коротких слов длины W в запрашиваемой последовательности, которые соответствуют или удовлетворяют некоторому положительному пороговому значению Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т называют пороговым значением соседних слов (Altschul et al, см. выше). Эти первые соседние совпадающие слова выступают в качестве стартовых точек для начала поисков, чтобы найти более длинные HSP, содержащие их. Совпадение слов затем распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока общий счет выравнивания может увеличиваться. Общий счет выравнивания рассчитывают для нуклеотидных последовательностей с использованием параметров М (поощрительный балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для последовательностей аминокислот используют матрицу замен для расчета общего балла. Расширение слов в каждом направлении прекращают, когда: общий счет выравнивания снижается на величину Х от его максимального достигнутого значения; общий счет выравнивания падает до нуля или ниже вследствие накопления одного или более отрицательных баллов при выравнивании остатков; или при достижении конца любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и Х определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP по умолчанию использует длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10 и матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
В дополнение к расчету процента идентичности последовательностей, алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat′l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Одной мерой сходства, оцениваемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (Р(N)), которая указывает на вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайно. Например, нуклеиновая кислота считается сходной с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее чем приблизительно 0,1, более предпочтительно - менее чем приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно - менее чем приблизительно 0,001.
Еще один признак того, что две последовательности нуклеиновых кислот или полипептиды по существу идентичны, заключается в том, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, иммунологически перекрестно реагирует с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид, как правило, по существу идентичен второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим признаком того, что две последовательности нуклеиновых кислот по существу идентичны, является то, что две молекулы гибридизуются друг с другом в жестких условиях, как описано ниже.
Термин «in vivo» означает внутри тела организма, из которого клетка была получена. «Ex vivo» и «in vitro» означает вне тела организма, из которого клетка была получена.
Фразы «злокачественная клетка» или «злокачественность» относятся к опухолям или опухолевым клеткам, которые являются инвазивными и/или способными подвергаться метастазированию, то есть раковым клеткам.
Используемый в данном документе термин «клетки млекопитающих» включает клетки, полученные из млекопитающих, включая человека, крыс, мышей, морских свинок, шимпанзе или макак. Эти клетки могут быть культивированы in vivo или in vitro.
Термин «селективно реагирующий» по отношению к антигену означает преимущественное связывание антитела, целого или части, с несущей этот антиген клеткой или тканью, а не с клетками или тканями, у которых этот антиген отсутствует. Разумеется, определенная степень неспецифического взаимодействия может иметь место между молекулой и нецелевой клеткой или тканью. Тем не менее, селективная активность может быть охарактеризована как опосредованная через специфическое распознавание антигена. Хотя селективно реагирующие антитела связываются с антигеном, они могут делать это с низким сродством. С другой стороны, специфическое связывание приводит к гораздо более сильной ассоциации между антителом и клетками, несущими антиген, чем между связанным антителом и клетками, не содержащими антиген. Специфическое связывание обычно приводит к более чем 5-кратному, предпочтительно - более чем 10-кратному, и наиболее предпочтительно - более чем 100-кратному увеличению количества связанного антитела (в единицу времени) с клеткой или тканью, несущей антиген-мишень, по сравнению с клеткой или тканью, не имеющей антигена-мишени. Специфическое связывание с белком в таких условиях требует антитела, которое выбрано по его специфичности в отношении конкретного белка. Различные иммунологические анализы подходят для отбора антител, специфически иммунореактивных к конкретному белку. Например, твердофазный иммунологический анализ ELISA, который обычно используют для выбора моноклональных антител, специфически иммунореактивных к белку. См. Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988), для описания форматов иммунологического анализа и условий, которые могут использоваться для определения специфической иммунореактивности.
Термин «иммунологически активные условия» относится к условиям, которые позволяют антителу, созданному для конкретного эпитопа, связываться с этим эпитопом в заметно большей степени, чем практически со всеми другими эпитопами, и/или по существу исключая связывание практически со всеми другими эпитопами. Иммунологически активные условия зависят от формата реакции связывания антитела и обычно являются такими условиями, что используются в протоколах иммунологических анализов, или такими условиями, что встречаются in vivo. См. Harlow & Lane, выше, для описания форматов и условий иммунологических анализов. Предпочтительно, иммунологически активными условиями, используемыми в способах по настоящему изобретению, являются «физиологические условия», которые относятся к условиям (например, температуре, осмолярности, рН), которые являются типичными в организме млекопитающего или внутри живой клетки млекопитающего. Хотя общепризнанно, что некоторые органы могут иметь экстремальные условия, среда внутри организма и внутри клеток обычно имеет рН около 7 (т.е. от рН 6,0 до рН 8,0, более типично от рН 6,5 до 7,5), содержит воду в качестве основного растворителя и имеет температуру выше 0°С и ниже 50°С. Осмолярность находится в пределах, способствующих жизнеспособности клеток и пролиферации.
Термины «пациент», «субъект», «индивидуум» взаимозаменяемы и относятся к млекопитающим, например, человеку или отличным от человека приматам, домашним млекопитающим (например, собакам или кошкам), сельскохозяйственным млекопитающим (например, крупному рогатому скоту, свиньям, овцам, лошадям), лабораторным млекопитающим (мышам, крысам, хомякам, кроликам).
Термин «совместно вводимый» относится к одновременному присутствию двух активных агентов в крови индивидуума. Активные агенты, которые вводятся совместно, могут доставляться одновременно или последовательно.
Используемые в данном документе термины «лечение» и «обработка» относятся к задержке начала, замедлению или реверсии развития, или облегчению, или предупреждению либо заболевания, либо состояния, к которому эти термины применяются, или одного или нескольких симптомов такого заболевания или состояния.
Термины «ингибирование», «снижение», «уменьшение» в отношении опухоли или роста или развития рака относятся к ингибированию роста, распространения, метастазирования опухоли или рака у субъекта, измеренному с использованием любого способа, известного в этой области техники. Рост, развитие или распространение опухоли или рака ингибируется, снижается или уменьшается, если опухолевая масса уменьшается по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 50%, 80% или 100% по сравнению с опухолевой массой до введения РЕ настоящего изобретения, например, в составе химерной молекулы. В некоторых вариантах осуществления рост, развитие или распространение опухоли или рака ингибируется, снижается или уменьшается по меньшей мере примерно в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или более по сравнению с опухолевой массой до введения РЕ.
Компоненты рекомбинантных иммунотоксинов
А. Сайты расщепления фурином (FCS)
Сайтом расщепления фурином может быть любой полипептидный сайт, расщепляемый фурином. Как сообщается в статье Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection 17(1):107-112 (2004) (далее - «Duckert et al.», которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме и особенно в отношении расщепляемых фурином последовательностей и мотивов, раскрытых в ней), фурин является ферментом из «семейства эволюционно стабильных специфичных к одиночным и парным основным остаткам Са2+-зависимых сериновых протеаз, называемых субтилизин/кексин-подобными конвертазами пропротеинов». Там же, с.107. Фурин, также известный как «фермент, расщепляющий белок у парных основных аминокислот» или «РАСЕ», является одним из семи белков млекопитающих из этого семейства и участвует в процессинге нескольких эндогенных белков человека. См. в широком плане, например, Thomas G, Nat Rev Mol Cell Biol, (10):753-66 (2002). Это ассоциированный с мембраной белок, содержащийся в основном в транс-Гольджи сети. Последовательность человеческого фурина известна с начала 1990-х годов. Смотри, например, Hatsuzawa, K. et al., J. Biol Chem., 267:16094-16099 (1992); Molloy, S. et al., J. Biol. Chem., 267:16396-16402 (1992).
Минимальный сайт расщепления, записанный с помощью однобуквенного кода для аминокислотных остатков, - это обычно R-X-X-R, с расщеплением после второго «R». Duckert et al. обобщили информацию о последовательностях 38 белков, описанных в литературе как имеющих сайты расщепления фурином, в том числе белков млекопитающих, белков патогенных бактерий и вирусных белков. В статье сообщается, что 31 из рассмотренных мотивов расщепления, или 81%, имели консенсусную последовательность R-X-[R/K]-R, из которых 11, или 29%, имели последовательность R-X-R-R, и 20, или 52%, были R-X-K-R. Три из мотивов расщепления содержали только минимальную последовательность расщепления. Duckert et al. затем выровняли мотивы и идентифицировали остатки, находящиеся в каждой позиции в каждом фурине, как для самого мотива расщепления, так и в окружающих остатках. Фиг.1А в статье Duckert et al. показывает в относительных величинах остатки, наиболее часто встречающиеся в каждой позиции. По традиции остатки, окружающие сайт расщепления фурином, нумеруют от неустойчивой химической связи (которая обычно обозначается символом «↓»). Считая в направлении к N-концу, остатки субстрата обозначают Р1, Р2 и так далее, в то время как, считая в направлении к C-концу, остатки обозначают Р1′, Р2′ и так далее. См., например, Rockwell, N.C., and J.W. Thorner, Trends Biochem. Sci., 29:80-87 (2004); Thomas G., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 3:753-766 (2002). Таким образом, следуя традиции, можно использовать следующую последовательность для выравнивания и нумерации остатков минимальной последовательности расщепления и окружающих остатков:
Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1-Р1′-Р2′-Р3′-Р4′-Р5′,
где минимальная последовательность расщепления фурином пронумерована как Р4-Р1. Согласно Duckert et al. выравнивание 38 последовательностей, расщепляемых фурином, определяет вариации, допускаемые в зависимости от остатков, присутствующих в различных положениях. Например, если остаток в Р4 не является R, это может быть компенсировано наличием остатков аргинина или лизина в Р2 и Р6. Там же, с.109.
В нативном РЕ расщепление фурином происходит между аргинином 279 и глицином 280 в богатой аргинином петле, расположенной в домене II токсина. Нативная последовательность расщепления фурином в домене II РЕ приведена ниже (с числами, указывающими положения остатков в 613-аминокислотной нативной последовательности РЕ) и выровнена, чтобы показать ее нумерацию в соответствии с приведенной выше традицией:
В исследованиях, лежащих в основе настоящего изобретения, были сделаны замены в положениях РЗ и Р2 для формирования следующей последовательности, с подчеркнутыми заменами:
Эта последовательность показала более быстрое расщепление, чем нативная последовательность, и ее использование в образце иммунотоксина вызвало приблизительно такую же цитотоксичность в клетках-мишенях, как и использование нативной последовательности.
На основе этого и наших предыдущих исследований можно заключить, что последовательность расщепления фурином, используемая для прикрепления направляющей молекулы к домену III РЕ, может быть минимальной последовательностью расщепления фурином, R-X-X-R, или любой другой последовательностью расщепления фурином, известной в данной области или допускаемой Фиг.1А статьи Duckert et al., при условии, что, если есть остаток, присутствующий в положении, определенном как Р2′, то это должен быть триптофан или, если этот остаток не является триптофаном, он не должен быть валином или аланином. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность может представлять собой RKKR (SEQ ID NO:30), RRRR (SEQ ID NO:31), RKAR (SEQ ID NO:32), SRVARS (SEQ ID NO:33), TSSRKRRFW (SEQ ID NO:34) или ASRRKARSW (SEQ ID NO:35).
Как отмечено в статье Duckert et al., в положении Р4 может быть использован остаток менее предпочтительный, чем R (прежде всего валин), если это скомпенсировано остатками аргинина или лизина в положениях Р2 и Р6, так что по меньшей мере два из трех остатков в Р2, Р4 и Р6 являются основными. Так, в некоторых вариантах осуществления последовательность расщепления фурином представляет собой RRVKKRFW (SEQ ID NO:36), RNWRRDW (SEQ ID NO:37), или TRAVRRRSW (SEQ ID NO:38). Остаток в положении Р1 может быть аргинином, присутствующим в нативной последовательности, или лизином. Таким образом, лизин может быть заменен на аргинин в положении Р1, например, в любой из последовательностей, приведенных выше.
В некоторых вариантах осуществления за последовательностью расщепления фурином следует последовательность расщепления фурином РЕ: R-H-R-Q-P-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:15), или укороченный вариант нативной последовательности, при условии, что он содержит минимальную последовательность расщепления фурином и расщепляется фурином. Так, в некоторых вариантах осуществления последовательность расщепления фурином может представлять собой R-Q-P-R (SEQ ID NO:39), R-H-R-Q-P-R-G-W (SEQ ID NO:40), R-H-R-Q-P-R-G-W-E (SEQ ID NO:41), H-R-Q-P-R-G-W-E-Q (SEQ ID NO:42) или R-Q-P-R-G-W-E (SEQ ID NO:43). В некоторых вариантах осуществления последовательность представляет собой R-H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:29) или укороченный вариант этой последовательности, при условии, что он содержит минимальную последовательность расщепления фурином и расщепляется фурином. Так, в некоторых вариантах осуществления последовательность расщепления фурином может представлять собой R-S-K-R (SEQ ID NO:44), R-H-R-S-K-R-G-W (SEQ ID NO:45), H-R-S-K-R-G-W-E (SEQ ID NO:46), R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:47), H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:48) или R-H-R-S-K-R (SEQ ID NO:49). Любая конкретная последовательность расщепления фурином может быть легко протестирована путем превращения ее в иммунотоксин с антителом, используемым в SS1-LR, и исследования полученного иммунотоксина in vitro на экспрессирующей мезотелин клеточной линии.
Подвержена ли какая-либо конкретная последовательность расщеплению фурином или нет, может быть определено способами, известными в данной области. Например, расщепление последовательности фурином может быть проверено путем инкубации последовательности с фурином в буфере для фурина (0,2 М NaOAc (pH 5,5), 5 мМ CaCl2) в молярном соотношении фермент: субстрат 1:10 при 25°С в течение 16 часов. Эти условия ранее были признаны оптимальными для расщепления фурином РЕ. Предпочтительно в качестве фурина использовать фурин человека. Рекомбинантный укороченный фурин человека является коммерчески доступным, например, от New England Biolabs (Beverly, MA). См. также Bravo et al., J Biol Chem, 269(14):25830-25837 (1994). Подходящие FCS также приведены в публикации патента РСТ WO 2009/032954, опубликованной 12 марта 2009 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки, особенно в отношении последовательностей расщепления фурином, раскрытых в ней.
В. Функциональный домен III
Подразумевается, что в структуру домена Ib включены остатки 365-399. Как обсуждается в данном документе далее, в то время как считается, что структурная граница домена III РЕ начинается с остатка 405, функциональные анализы показали, что домену III нужен сегмент структурного домена 1b, чтобы сохранить АДФ-рибозилирующую активность. Соответственно, функциональный домен III определяют как остатки 395-613 РЕ, и, таким образом, предпочтительно, чтобы токсины настоящего изобретения содержали остатки 395-613 РЕ, с некоторыми допустимыми вариантами, описанными ниже. Желательно удаление остатков 365-394, кроме тех, что содержатся в последовательности расщепления фурином, так как делеции устраняют любые иммуногенные эпитопы, присутствующие в этих частях молекулы РЕ. В РЕ настоящего изобретения последовательность расщепления фурином (или ее укороченный или модифицированный вариант) прикреплена своим карбоксильным концом к домену III, с внедренным между ними гибким линкером от 3 до 8 аминокислот, независимо выбранных из глицина и серина.
В предпочтительных вариантах осуществления функциональный домен молекул РЕ модифицирован так, чтобы заменить на аланин, глицин, серин или глутамин аминокислотные остатки, обычно присутствующие в положениях D406 и Q592 в пределах домена III. Замены в положениях D406 и Q592 можно совместить с заменами на аланин, глицин, серин или глутамин в положениях R432, R467, R490, R513, Е548 и K590 в пределах домена III. В некоторых вариантах осуществления, кроме того, по меньшей мере один аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотному остатку в положении, выбранному из D403, R412, R427, Е431, R458, D461, R505, Е522, R538, R551, R576 и L597, заменен на аланин, глицин, серин или глутамин. Замены на эти остатки в положениях D406, R432, R467, R490, R513, Е548, K590 и Q592 домена III. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен III РЕ является по существу идентичным или идентичным аминокислотной последовательности функционального домена РЕ SS1-LR/GGS/8M. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен III РЕ по существу идентичен или идентичен аминокислотной последовательности функционального домена РЕ SS1-LR/GGS/8X.
Подразумевается, что последовательность нативного РЕ и варианты, описанные выше, могут иметь консервативные замены и сохранять цитотоксическую способность и, желательно, пониженную антигенность по сравнению с нативной последовательностью РЕ. В предпочтительных вариантах осуществления модифицированные варианты РЕ или их цитотоксические фрагменты имеют по меньшей мере 80% сходства последовательностей, предпочтительно - по меньшей мере 85% сходства последовательностей, более предпочтительно - по меньшей мере 90% сходства последовательностей, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере 95% сходства последовательностей на уровне аминокислот, с представляющим интерес функциональным доменом III РЕ SS1-LR/GGS/8M или SS1-LR/GGS/8M. Публикация РСТ WO/2011/032022, опубликованная 17 марта 2011 г. и соответствующая PCT/US2010/048504, поданной 10 сентября 2010 г., раскрывает подходящие мутации, которые снижают антигенность функционального домена II РЕ. Эта опубликованная заявка включена посредством ссылки в полном объеме в отношении мутаций, замен и молекул, описанных в ней, которые обеспечивают пониженную иммуногенность функционального домена III.
Термин «консервативно модифицированные варианты» применяется как к аминокислотным, так и нуклеотидным последовательностям. Что касается конкретных нуклеотидных последовательностей, консервативно модифицированные варианты относятся к тем последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, - к по существу идентичным последовательностям нуклеиновых кислот. Из-за вырожденности генетического кода любой взятый полипептид кодируется большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждой позиции, где находится кодон, задающий аланин, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновых кислот являются «молчащими вариантами», которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариантов. Каждая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, упомянутая здесь, также описывает каждый возможный молчащий вариант нуклеиновой кислоты. Специалисту будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который является обычно единственным кодоном для метионина) может быть модифицирован с образованием функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждый молчащий вариант нуклеиновой кислоты, кодирующий полипептид, предполагается в каждой описанной последовательности.
Что касается аминокислотных последовательностей, специалисту в данной области будет понятно, что отдельные замены, делеции или добавления к последовательности нуклеиновых кислот, пептидов, полипептидов или белков, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в закодированной последовательности, являются «консервативно модифицированными вариантами», в которых изменение приводит к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту.
Анализ цитотоксичности или антигенности РЕ
Экзотоксины Pseudomonas, используемые в изобретении, могут быть исследованы на желаемый уровень цитотоксичности с помощью анализов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Так, цитотоксические фрагменты РЕ и консервативно модифицированные варианты таких фрагментов могут быть легко проанализированы на цитотоксичность. Большое количество молекул-кандидатов РЕ может быть одновременно проанализировано на цитотоксичность способами, хорошо известными в данной области. Например, подгруппы молекул-кандидатов могут быть проанализированы на цитотоксичность. Положительно реагирующие подгруппы молекул-кандидатов можно далее разделить и снова проанализировать, до тех пор пока желаемый(ые) цитотоксический(ие) фрагмент(ы) не будет(будут) идентифицирован(ы). Такие способы позволяют провести быстрый скрининг большого числа цитотоксических фрагментов или консервативных вариантов РЕ. Антигенность может быть проанализирована любым способом, известным в данной области, включая анализы, приведенные в WO 2007/016150.
С. Антитела к мезотелину
Направляющий компонент химерной молекулы специфически связывается с маркером клеточной поверхности мезотелином. Антигены на поверхности клеток, которые являются мишенями для химерных молекул, хорошо известны в данной области техники и приведены, например, в работах Mufson, Front Biosci (2006) 11:337-43; Frankel, Clin Cancer Res (2000) 6:326-334 и Kreitman, AAPS Journal (2006) 8(3):Е532-Е551. Злокачественные новообразования, приводимые в качестве примера, рост, распространение и/или развитие которых могут быть уменьшены или подавлены при использовании мезотелина в качестве мишени, включают рак яичников, мезотелиомы, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легких, рак фаллопиевых труб, рак головы и шеи, рак шейки матки и рак поджелудочной железы. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения направляющая группа представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно фрагмент антитела, специфически связывающийся с поверхностным маркером на клетке. Предпочтительный фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный Fv. В данном документе описаны конструкции и характеристики иммунотоксинов на основе цитотоксина, в которых цитотоксин связан с scFv. Другие предпочтительные фрагменты антител, с которыми может быть соединен токсин или цитотоксический фрагмент, включают Fab, Fab′, F(ab′)2, Fv фрагмент, стабилизированное спиралями антитело, диатело, стабилизированное дисульфидными связями антитело и однодоменное антитело (например, верблюжье антитело). Антитела к мезотелину включают SS1, SSP1, HN1, HN2, MN, K1 и их варианты. MORAb-009 (гуманизированная версия SS1) является особенно подходящим антителом.
Показано, что SS1P специфически убивает экспрессирующие мезотелин клеточные линии и вызывает регрессию экспрессирующих мезотелин опухолей у мышей (Hassan, R. et al., Clin Cancer Res 8:3520-6 (2002); Onda, M. et al., Cancer Res 61:5070-7 (2001)). На основе этих исследований и соответствующих данных по безопасности в Национальном институте рака проводили 2 клинических испытания I фазы с SS1P у пациентов со злокачественными новообразованиями, экспрессирующими мезотелин (Chowdhury, P. S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:669-74 (1998); Hassan, R. et al., Proc Am Soc Clin Oncol 21:29a (2002)), каждое из которых включено в данный документ посредством ссылки относительно объекта SS1P, раскрытого в них). Кроме того, другие виды терапии, направленные на мезотелин, находятся в стадии доклинической разработки (Thomas, A.M. et al., J Exp Med 200:297-306 (2004)). HN1 и HN2 являются человеческими антителами к мезотелину, описанными, например, в работе Feng, et al., Mol Cancer Ther (2009) 8(5):1113-8. Описаны иммунотоксины SS1P, в которых удалены кластеры расщепления для лизосомальных протеаз. Эти варианты описаны, например, в работе Weldon, et al., Blood, (2009) 113(16):3792-800 и в WO 2009/032954, которые включены в данный документ в полном объеме в отношении антител, FCS и функциональных доменов III, описанных в них.
RIT изобретения включают, без ограничения, молекулы, в которых имеется ковалентная связь молекулы РЕ с антителом или другим направляющим агентом. Цитотоксин соединяют с антителом или фрагментом антитела, как правило, через С-конец антитела или фрагмента антитела. Такое слияние обычно достигается с использованием методик рекомбинантной ДНК. Выбор конкретного направляющего агента зависит от конкретной клетки-мишени. Антитела, которые направляют иммунотоксин, могут быть поликлональными, моноклональными или рекомбинантными антителами, такими как химерные антитела или фрагменты вариабельных областей. Если антитело не является рекомбинантным, иммунотоксин должен быть образован путем химической конъюгации антитела с токсическим фрагментом. Если антитело получают рекомбинантным способом, антитело может быть присоединено к токсину посредством химического связывания или через рекомбинантное слияние. При рекомбинантном слиянии кДНК, кодирующая антитело, вставлена в рамке в плазмиду, которая уже содержит кДНК, которая кодирует токсин. Конечно, также может быть сделано обратное;
кДНК токсина может быть вставлена в плазмиду, несущую кДНК, которая кодирует антитело. Из-за возможного большого размера иммунотоксина иногда желательно присоединять только фрагмент антитела к токсическому фрагменту. Фрагменты Fab, Fab′ и F(ab)2 могут быть получены из поликлональных, моноклональных или химерных антител, а затем присоединены к токсину путем химического связывания. Альтернативно, может быть получена кДНК, в которой вариабельные области антитела соединены с необходимыми каркасными участками. Эти меньшие антитела затем секретируются в виде двухцепочечных антител Fv, или, если участки тяжелой и легкой цепей соединены непосредственно или через пептидный линкер, - как одноцепочечные антитела Fv (scFv). Особенно предпочтительны антитела к мезотелину и их фрагменты, в которых удалены кластеры расщепления для лизосомальных протеаз, как раскрыто в патентной публикации РСТ WO/2000/073346, опубликованной 12 июля 2000 г., которая соответствует PCT/US2009/014829, поданной 26 мая 2000 г., принадлежащей тому же заявителю, что и настоящее изобретение, и которая включена в настоящее изобретение посредством ссылки в полном объеме, в частности, в отношении объекта антитела, раскрытого в ней.
Один из способов создания scFv - это использование библиотек фагового отображения, полученных из мРНК селезенки мышей, иммунизированных иммуногеном (Chowdhury, et al., Mol. Immunol. 34:9-20 (1997)). Если белковый иммуноген в естественных условиях находится в млекопитающих, но его рекомбинантно экспрессировали в прокариотах, белок не будет иметь правильный профиль гликозилирования и может иметь неправильную конформацию. Антитела, вырабатываемые мышью в ответ на этот иммуноген, могут не распознать белок в его нативном состоянии. Одним из решений этой проблемы является иммунизация животных нативным белком, полученным в клетках млекопитающих, но очистка из клеток млекопитающих достаточного количества некоторых белков, в частности, белков клеточной поверхности, может оказаться невозможной. Другим решением, хотя и более редким, является иммунизация животных кДНК, которая кодирует иммуноген. Животному вводят кДНК под контролем соответствующего промотора. После повторных инъекций, когда титр антител достигает максимума, животных умерщвляют и, чтобы создать библиотеку фагового отображения, удаляют селезенку. Путем иммунизации мышей плазмидами, содержащими ДНК, кодирующую мезотелин, мы можем добиться высоких титров антител к мезотелину. Используя РНК из селезенки и технологию фагового отображения, можно выделить одноцепочечные Fv («scFv»), названные нами SS scFv, которые с высоким сродством связываются с мезотелином.
Антитела к мезотелину для применения в настоящем изобретении могут быть связаны с FCS через амино-конец FCS. Аналогично, FCS может быть непосредственно связан с тяжелым, легким, Fc (константной областью) или каркасным участками антитела. Связь может осуществляться через амино- или карбоксильные концы антитела, или через внутренний аминокислотный остаток. Антитела, используемые в композиции поливалентных иммуноконъюгатов настоящего изобретения, могут быть направлены на одинаковые или различные эпитопы мезотелина.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к мезотелину представляет собой рекомбинантное антитело, такое как scFv или стабилизированное дисульфидными связями антитело Fv. Антитела Fv обычно имеют массу около 25 кДа и содержат полный антигенсвязывающий сайт с тремя CDR в каждой тяжелой и легкой цепи. Если цепи VH и VL экспрессируют отдельно, цепи антитела Fv, как правило, соединены за счет нековалентных взаимодействий. Тем не менее, эти цепи, как правило, диссоциируют при разбавлении, поэтому были разработаны методы для сшивания цепей с помощью глутаральдегида, межмолекулярных дисульфидных связей или пептидного линкера.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой одноцепочечный Fv (scFv). Области VH и VL антитела scFv составляют одну цепь, которая уложена таким образом, что образует антигенсвязывающий сайт, подобный тем, что имеются в двухцепочечных антителах. После укладки нековалентные взаимодействия стабилизируют одноцепочечное антитело. В более предпочтительном варианте осуществления scFv получают рекомбинантным способом. Специалисту будет понятно, что могут быть получены консервативные варианты антител настоящего изобретения. Такие консервативные варианты применительно к фрагментам scFv будут сохранять критические аминокислотные остатки, необходимые для правильной укладки и стабилизации между областями VH и VL. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело scFv непосредственно связано с FCS через легкую цепь.
Хотя области VH и VL антитела в некоторых вариантах осуществления могут быть непосредственно соединены вместе, специалисту будет понятно, что эти области могут быть отделены друг от друга пептидным линкером, состоящим из одной или более аминокислот. Пептидные линкеры и их применение хорошо известны в данной области. Смотри, например, работы Huston, et al., Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 8:5879 (1988); Bird, et al., Science 242:4236 (1988); Glockshuber, et al., Biochemistry 29:1362 (1990), патент США №4946778, патент США №5132405 и Stemmer, et al., Biotechniques 14:256-265 (1993), каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. Как правило, пептидный линкер не имеет специфической биологической активности, кроме соединения областей или сохранения некоторого минимального расстояния или других пространственных отношений между ними. Тем не менее, составляющие пептидный линкер аминокислоты могут быть выбраны, чтобы воздействовать на некоторые свойства молекулы, такие как укладка, суммарный заряд или гидрофобность. Одноцепочечные антитела Fv (scFv) необязательно включают пептидный линкер из не более чем 50 аминокислот, обычно не более чем 40 аминокислот, предпочтительно не более чем 30 аминокислот и более предпочтительно не более чем 20 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер является конкатемером последовательности Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:50), предпочтительно 2, 3, 4, 5 или 6 таких последовательностей. Тем не менее, следует понимать, что в пределах линкера могут быть сделаны некоторые аминокислотные замены. Например, вместо глицина может быть использован валин.
Предпочтительно, когда антитело или его фрагмент включает мутированную вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи антитела, причем полипептид имеет аффинность связывания с антигеном по меньшей мере в 5 раз выше, чем исходное антитело, полипептид имеет последовательность, которая отличается от исходного антитела заменой по меньшей мере одной аминокислоты в области, определяющей комплементарность (CDR), где аминокислота закодирована кодоном, который включает нуклеотид, принадлежащий мотиву горячей точки, выбранному из AGY или RGYW, в котором R представляет собой А или G, Y представляет собой С или Т, и W представляет собой А или Т. Замена может иметь место в CDR3 вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Замена может быть в CDR1 или CDR2 вариабельной области легкой или тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело к мезотелину представляет собой антитело, описанное в патенте США №7081518, выданном 25 июля 2006 г., который включен посредством ссылки в отношении таких антител, их нуклеотидных последовательностей, применения и способов получения.
Антитело к мезотелину может содержать вариабельную тяжелую цепь («VH») и вариабельную легкую цепь («VL»), причем каждая из цепей VH и VL имеет первую, вторую и третью область, определяющую комплементарность («CDR»), где первая CDR («CDR1»), вторая CDR («CDR2») и третья CDR («CDR3») тяжелой цепи имеют соответственно последовательности аминокислотных остатков, указанную для CDR1 (GYTMN; SEQ ID NO:51), CDR2 (LITPYNGASSYNQKFRG; SEQ ID NO:52) и CDR3 (GGYDGRGFDY; SEQ ID NO:53), и где области CDR 1, 2 и 3 цепи VL имеют соответственно последовательности аминокислотные остатков, указанные для CDR1 (SASSSVSYMH; SEQ ID NO:54), CDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO:55) и CDR3 (QQWSGYPLT; SEQ ID NO:56). В некоторых вариантах осуществления CDR3 легкой цепи модифицирована и имеет последовательность QQWSKHPLT (SEQ ID NO:57), QQWSGHPLT (SEQ ID NO:58), QQWSAHPLT (SEQ ID NO:59), QQWSQIPLT (SEQ ID NO:60), QQWGFNPLT (SEQ ID NO:61), QQWGTNPLT (SEQ ID NO:62), QQWGSHPLT (SEQ ID NO:63), QQWGDFPLT (SEQ ID NO:64), QQWGDHPLT (SEQ ID NO:65), QQWSAHPLT (SEQ ID NO:66) или QQWSGYPTT (SEQ ID NO:67). В некоторых вариантах осуществления VH связана с VL линкерным пептидом GVGGSG4SG4S (SEQ ID NO:25). В некоторых других вариантах осуществления антитело к мезотелину представляет собой scFv, dsFv, Fab или F(ab′)2. В некоторых других вариантах осуществления изобретения антитело к мезотелину для использования в RIT содержит замену по меньшей мере одной аминокислоты в CDR, выбранной из группы, состоящей из CDR1 VL, CDR2 VL, CDR1 VH и CDR2 VH, причем эта аминокислота кодируется кодоном, который содержит нуклеотид, принадлежащий мотиву горячей точки, выбранному из AGY или RGYW, где R представляет собой А или G, Y представляет собой С или Т, и W представляет собой А или Т.
D. L1
Антитело связывается с FCS дополнительным линкером, который предпочтительно представляет собой связь или полипептид от 1 до 10 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления этот линкер имеет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 аминокислот в длину. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления линкер состоит из остатков глицина и серина. В некоторых других вариантах осуществления линкер имеет последовательность ASGG (SEQ ID NO:19) или ASGGSGGG (SEQ ID NO:68). В предпочтительных вариантах осуществления линкер образует непрерывную полипептидную цепь, которая непосредственно соединяет карбоксильный конец антитела с N-концом FCS.
Е. Гибкий линкер
Гибкий линкер непосредственно соединяет FCS и функциональный домен III РЕ. Гибкий линкер является непрерывным пептидом формулы (Хаа1)n, где каждый Хаа1 независимо выбран из глицина и серина, и n составляет от 3 до 8. В предпочтительных вариантах осуществления n равно 3. В наиболее предпочтительном варианте осуществления линкер является GGS. В других вариантах осуществления n составляет 4, 5, 6 или 7. В других вариантах осуществления гибкий линкер представляет собой последовательность GGGS (SEQ ID NO:50), GGGSG (SEQ ID NO:69), GGGGSG (SEQ ID NO:70) или GGSGGS (SEQ ID NO:18).
Гибкий линкер слит в последовательности с С-концом FCS и непосредственно слит в последовательности с функциональным доменом III РЕ и, соответственно, образует одну непрерывную полипептидную цепь с FCS и функциональным доменом III.
Получение иммуноконъюгатов
I. Нерекомбинантные методы
В нерекомбинантном варианте осуществления изобретения направляющую молекулу, такую как антитело, связывают с молекулой РЕ настоящего изобретения, используя любое количество средств, известных специалистам в данной области. Могут быть применены как ковалентное, так и нековалентное связывание с молекулами РЕ настоящего изобретения.
Процедура связывания молекулы РЕ с антителом или другой направляющей молекулой («ТМ») будет изменяться в зависимости от химической структуры ТМ. Полипептиды обычно содержат разнообразные функциональные группы, например, карбоксильную группу (СООН), свободную аминогруппу (-NH2) или сульфгидрильную группу (-SH), которые доступны для реакции с подходящей функциональной группой на антителе, что приводит, например, к связыванию молекулы РЕ.
Альтернативно, антитело или другие ТМ подвергают дериватизации или к ним прикрепляют дополнительные реакционноспособные функциональные группы. Дериватизация может включать присоединение любого количества линкерных молекул, таких как те, что поставляет Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.
«Линкер», используемый здесь, представляет собой молекулу, которая используется, чтобы присоединить ТМ к молекуле РЕ. Линкер способен образовывать ковалентные связи как с антителом, так и с эффекторной молекулой. Подходящие линкеры хорошо известны специалистам в данной области и включают, без ограничения, линкеры с прямой или разветвленной углеродной цепью, гетероциклические линкеры или пептидные линкеры. Если антитело и эффекторная молекула представляют собой полипептиды, линкеры могут быть присоединены к входящим в их состав аминокислотам через их боковые группы (например, посредством дисульфидной связи с цистеином). Однако, в предпочтительном варианте осуществления линкеры будут присоединены к амино- и карбоксильным группам концевых аминокислот у альфа-атомов углерода.
В некоторых случаях желательно освободить молекулу РЕ от ТМ, когда иммуноконъюгат достигнет своего сайта-мишени. Тогда в этих условиях иммуноконъюгаты будут содержать связи, которые расщепляются в непосредственной близости от сайта-мишени. Расщепление линкера, чтобы освободить молекулу РЕ от ТМ, может быть вызвано ферментативной активностью или условиями, которым подвергается иммуноконъюгат либо внутри клетки-мишени, либо в непосредственной близости от сайта-мишени. Когда сайтом-мишенью является опухоль, может быть использован линкер, который расщепляется в условиях, существующих в месте локализации опухоли (например, при воздействии опухолеассоциированных ферментов или кислых значений рН).
II. Рекомбинантные методы
Последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом, включая, например, клонирование соответствующих последовательностей или прямой химический синтез с помощью таких методов, как фосфотриэфирный метод, описанный Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979); фосфодиэфирный метод, описанный Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); диэтилфосфорамидитный метод, описанный Beaucage, et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981), твердофазный фосфорамидиттриэфирный метод, описанный Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862 (1981), например, с использованием автоматизированного синтезатора, как описано, например, Needham-VanDevanter, et al. Nucl. Acids Res. 12:6159-6168 (1984); и метод с твердой подложкой, описанный в патенте США №4458066. Химический синтез дает одноцепочечный олигонуклеотид. Он может быть преобразован в двухцепочечную ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью или путем полимеризации с участием ДНК-полимеразы при использовании одной цепи в качестве матрицы. Специалисту будет понятно, что, так как химический синтез ДНК ограничен последовательностью из приблизительно 100 оснований, более длинные последовательности могут быть получены путем лигирования коротких последовательностей.
В предпочтительном варианте осуществления последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению получают с помощью методов клонирования. Примеры подходящих методов клонирования и секвенирования, а также достаточные инструкции для специалистов в данной области, осуществляющих эксперименты по клонированию, имеются в Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego CA (1987)), или Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY (1987). Данные о продукте от производителей биологических реагентов и экспериментального оборудования также предоставляют полезную информацию. К таким производителям относятся химическая компания SIGMA (Сент-Луис, Миссури), R&D systems (Миннеаполис, Миннесота), Pharmacia LKB Biotechnology (Пискатауэй, Нью-Джерси), CLONTECH Laboratories, Inc. (Пало-Альто, Калифорния), Chem Genes Corp., химическая компания Aldrich (Милуоки, Висконсин), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Гейтерсберг, Мэриленд), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Букс, Швейцария), Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния, и Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния), а также многие другие коммерческие источники, известные специалистам.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие нативный РЕ, также могут быть модифицированы с образованием иммуноконъюгатов согласно настоящему изобретению. Модификация путем сайт-направленного мутагенеза хорошо известна в данной области. Нуклеиновые кислоты, кодирующие РЕ, могут быть амплифицированы с помощью методов in vitro. Методы амплификации включают полимеразную цепную реакцию (PCR), лигазную цепную реакцию (LCR), транскрипционную систему амплификации (TAS), самоподдерживаемую систему репликации последовательности (3SR). Широкое разнообразие методов клонирования, клеток-хозяев и методов амплификации in vitro хорошо известно специалистам в данной области.
В предпочтительном варианте осуществления иммуноконъюгаты получают путем вставки кДНК, которая кодирует антитело или другую ТМ по выбору, в вектор, который содержит кДНК, кодирующую желаемый РЕ настоящего изобретения. Вставку выполняют таким образом, чтобы направляющий агент (для простоты обсуждения в этом документе примем, что направляющий агент представляет собой Fv, хотя другие направляющие агенты могут быть использованы с равным эффектом) и РЕ считывались в рамке, то есть в виде одного непрерывного полипептида, который содержит функциональную область Fv и функциональную область РЕ. В особенно предпочтительном варианте осуществления кДНК, кодирующую РЕ изобретения, лигируют с scFv так, чтобы токсин находился на карбоксильном конце scFv. В других предпочтительных вариантах осуществления кДНК, кодирующую РЕ изобретения, лигируют с scFv так, чтобы токсин находился на аминоконце scFv.
Как только нуклеиновые кислоты, кодирующие РЕ, антитело или иммуноконъюгат согласно настоящему изобретению, выделяют и клонируют, можно экспрессировать желаемый белок в рекомбинантно сконструированные клетки, такие как клетки бактерий, растений, дрожжей, насекомых и клетки млекопитающих. Предполагается, что специалисты в данной области осведомлены о многочисленных системах экспрессии, пригодных для экспрессии белков, в том числе в E.coli, других бактериях, дрожжах и различных высших эукариотических клетках, таких как COS, CHO, HeLa и линии клеток миеломы. Не будет попыток подробно описывать различные известные методы экспрессии белков в клетках прокариот или эукариот. Если коротко, экспрессия природных или синтетических нуклеиновых кислот, кодирующих выделенные белки настоящего изобретения, обычно достигается путем функционального связывания ДНК или кДНК с промотором (который является либо конститутивным, либо индуцибельным), с последующим включением конструкции в состав экспрессионной кассеты. Кассеты могут быть пригодны для репликации и интеграции в клетки прокариот или эукариот. Типичные кассеты экспрессии содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициирующие последовательности и промоторы, нужные для регуляции экспрессии ДНК, кодирующей белок. Для получения высокого уровня экспрессии клонированного гена желательно создать кассеты экспрессии, которые содержат, как минимум, сильный промотор для направления транскрипции, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции/трансляции. Для E.coli кассета включает промотор, такой как Т7, trp, lac или лямбда-промоторы, сайт связывания рибосомы и предпочтительно сигнал терминации транскрипции. Для эукариотических клеток контролирующие последовательности могут включать промотор и предпочтительно энхансер, полученный из генов иммуноглобулинов, SV40, цитомегаловируса, и последовательность полиаденилирования, и могут включать последовательности донора и акцептора сплайсинга. Кассеты согласно изобретению могут быть перенесены в выбранную клетку-хозяина хорошо известными методами, такими как трансформация с помощью хлорида кальция или электропорация для E.coli и обработка с фосфатом кальция, электропорация или липофекция для клеток млекопитающих. Клетки, трансформированные кассетами, могут быть отсортированы по резистентности к антибиотикам, предоставляемой генами, содержащимися в кассетах, такими как гены amp, gpt, neo и hyg.
Специалисту будет понятно, что могут быть сделаны модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид согласно настоящему изобретению (т.е. РЕ или иммуноконъюгат, образованный из РЕ по изобретению), без снижения его биологической активности. Некоторые модификации могут быть сделаны, чтобы облегчить клонирование, экспрессию или включение направляющей молекулы в белок слияния. Такие модификации хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, кодоны терминации, метионин, добавленный на аминоконце, чтобы обеспечить сайт инициации, дополнительные аминокислоты, размещенные по обоим концам последовательности, чтобы создать удобно расположенные сайты рестрикции, или дополнительные аминокислоты (такие как поли-His), чтобы содействовать стадиям очистки.
В дополнение к рекомбинантным методам иммуноконъюгаты и РЕ по настоящему изобретению также могут быть сконструированы полностью или частично с помощью стандартного пептидного синтеза. Твердофазный синтез полипептидов по настоящему изобретению из менее чем приблизительно 50 аминокислот в длину может быть осуществлен путем присоединения C-концевой аминокислоты последовательности к нерастворимой подложке с последующим последовательным добавлением остальных аминокислот в последовательность. Методы твердофазного синтеза описаны Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. pp.3-284; Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), and Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ND ED., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984). Белки большей длины могут быть синтезированы путем конденсации амино- и карбоксильного концов коротких фрагментов. Способы образования пептидных связей активацией карбоксильной концевой группы (например, путем использования связующего реагента N,N′-дициклогексилкарбодиимида) известны специалистам в данной области.
III. Очистка
Сразу после экспрессии рекомбинантные иммуноконъюгаты и РЕ по настоящему изобретению могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области, в том числе осаждением сульфатом аммония, аффинной колоночной хроматографией, колоночной хроматографией и т.п. (см., в общем, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Предпочтительны по существу чистые композиции с гомогенностью по меньшей мере приблизительно от 90 до 95%, и для фармацевтических целей наиболее предпочтительны композиции с гомогенностью от 98 до 99% или более. Затем полипептиды, очищенные частично или до гомогенности, по желанию, в случае терапевтического использования, должны фактически быть освобождены от эндотоксина.
Методы экспрессии одноцепочечных антител и/или рефолдинга в соответствующую активную форму, в том числе одноцепочечных антител, из бактерий, таких как E.coli, описаны и хорошо известны и применимы к антителам настоящего изобретения. См. Buchner, et al., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989) и Ward, et al., Nature 341:544 (1989), которые включены в данный документ посредством ссылки.
Зачастую функциональные гетерологичные белки из E.coli или других бактерий выделяют из телец включения, после чего они требуют растворения с использованием сильных денатурирующих агентов и последующего рефолдинга. На этапе солюбилизации, как хорошо известно в данной области, для разрушения дисульфидных связей должен присутствовать восстанавливающий агент. Буфер с восстанавливающим агентом, приводимый в качестве примера, содержит 0,1 М Трис с рН 8, 6 М гуанидина, 2 мМ ЭДТА, 0,3 М DTE (дитиоэритритол). Повторное окисление дисульфидных связей может происходить в присутствии низкомолекулярных тиоловых реагентов в восстановленной и окисленной форме, как описано в Saxena, et al., Biochemistry 9:5015-5021 (1970), включенной в данный документ посредством ссылки, и особенно, как описано в Buchner, et al., см. выше.
Ренатурацию обычно осуществляют путем разбавления (например, в 100 раз) денатурированного и восстановленного белка в буфере для рефолдинга. Буфер, приводимый в качестве примера, содержит 0,1 М Трис, рН 8,0, 0,5 М L-аргинина, 8 мМ окисленный глутатиона и 2 мМ EDTA.
В качестве модификации к протоколу очистки двухцепочечного антитела области тяжелой и легкой цепей отдельно растворяют и восстанавливают, а затем объединяют в растворе для рефолдинга. Предпочтительный выход получают, когда эти два белка смешивают в молярном отношении таким образом, чтобы не был превышен 5-кратный молярный избыток одного белка над другим. Желательно добавить в раствор для рефолдинга избыток окисленного глутатиона или других окисляющих низкомолекулярных соединений после завершения окислительно-восстановительной перестановки.
2. Фармацевтические композиции и введение
В одном аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция или лекарственный препарат, содержащие по меньшей мере один химерный белок по настоящему изобретению, предпочтительно токсин направленного действия, и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическую композицию или лекарственный препарат можно вводить пациенту для лечения состояния, включающего, без ограничения, злокачественное заболевание или рак.
а. Получение композиций
Фармацевтические композиции или лекарственные препараты для использования в настоящем изобретении могут быть получены с помощью стандартных методик с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей или наполнителей. Подходящие фармацевтические носители описаны в данном документе и в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005). Химерные белки по настоящему изобретению могут быть получены для введения любым подходящим способом, в том числе посредством ингаляции, местно, интраназально, перорально, парентерально или ректально. Так, введение фармацевтической композиции может быть осуществлено путем интрадермального, субдермального, внутривенного, внутримышечного, интраназального, ингаляционного, интрацеребрального, внутритрахеального, внутриартериального, внутрибрюшинного, внутрипузырного, внутриплеврального, интракоронарного, подкожного введения или инъекции в опухоль, с помощью шприца или других устройств. Также предполагается трансдермальное введение, как и ингаляционное или аэрозольное введение. Таблетки и капсулы могут быть введены перорально, ректально или вагинально.
Композиции для введения обычно содержат раствор химерного белка, предпочтительно токсина направленного действия, растворенного в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Могут быть использованы различные водные носители, например, буферный солевой раствор и тому подобное. Эти растворы являются стерильными и обычно не содержат нежелательных примесей. Эти композиции могут быть стерилизованы с помощью обычных, хорошо известных способов стерилизации. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для создания физиологических условий, такие как регулирующие рН и буферные вещества, агенты, регулирующие токсичность и т.д., например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и тому подобное. Концентрация слитого белка в этих препаратах может широко варьировать, и будет выбрана в первую очередь на основе объемов жидкости, вязкостей, массы тела и т.д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения и потребностями пациента.
Композиции токсинов направленного действия по данному изобретению пригодны для парентерального введения, в том числе внутривенного введения или введения в полость тела.
Химерные белки, предпочтительно токсины направленного действия, по настоящему изобретению могут быть введены в композиции для парентерального введения путем инъекции, например, болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Композиции для инъекций могут быть представлены в единичной дозированной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах, с добавлением консерванта. Композиции для инъекций предпочтительно представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, а суппозитории предпочтительно получают из жирных эмульсий или суспензий. Композиции могут быть стерилизованы и/или содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие или эмульгирующие агенты, вещества, способствующие растворению, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для разведения перед применением подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой. Кроме того, композиции также могут содержать другие терапевтически полезные вещества. Композиции получают обычным смешиванием, гранулированием или нанесением покрытия, соответственно, и они содержат приблизительно от 0,1 до 75% активного ингредиента, предпочтительно приблизительно от 1 до 50% активного ингредиента.
Парентеральные композиции токсина направленного действия по настоящему изобретению с контролируемым высвобождением могут быть получены в виде имплантатов, масляных инъекций или систем, состоящих из частиц. Для широкого представления о системах доставки белков см. Banga, A.J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA (1995), приведенную в данном документе посредством ссылки. Системы, состоящие из частиц, включают микросферы, микрочастицы, микрокапсулы, нанокапсулы, наносферы и наночастицы. Микрокапсулы содержат терапевтический белок в качестве центрального ядра. В микросферах терапевтический агент диспергирован по всему объему частицы. Частицы, микросферы и микрокапсулы размером меньше чем приблизительно 1 мкм обычно называют наночастицами, наносферами и нанокапсулами, соответственно. Капилляры имеют диаметр приблизительно 5 мкм, так что только наночастицы вводят внутривенно. Микрочастицы, как правило, имеют около 100 мкм в диаметре, и их вводят подкожно или внутримышечно. См., например Kreuter J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp.219-342 (1994); и Tice & Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp.315-339 (1992), обе публикации включены в данный документ посредством ссылки.
Для ионно-контролируемого высвобождения композиций с токсином направленного действия по настоящему изобретению могут быть использованы полимеры. В данной области известны различные разлагаемые и неразлагающиеся полимерные матрицы, применяемые для контролируемой доставки лекарственных средств (Langer R., Accounts Chem. Res., 26:537-542 (1993)). Например, блок-сополимер полаксамер 407 существует в виде вязкой, но еще подвижной жидкости при низких температурах, но образует полутвердый гель при температуре тела. Показано, что он является эффективным носителем для получения композиций и устойчивой доставки рекомбинантного интерлейкина-2 и уреазы (Johnston et al., Pharm. Res., 9:425-434 (1992); and Pec et al., J. Parent. Sci. Tech., 44(2):58 65 (1990)). В качестве микроносителя для контролируемого высвобождения белков альтернативно был использован гидроксиапатит (Ijntema et al., Int. J. Pharm., 112:215-224 (1994)). В еще одном аспекте для контролируемого высвобождения, а также направленной доставки инкапсулированного в липиды лекарственного средства используют липосомы (Betageri et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Известны многочисленные дополнительные системы для контролируемой доставки терапевтических белков. См., например, патенты США №5055303, 5188837, 4235871, 4501728, 4837028, 4957735, 5019369, 5055303, 5514670, 5413797 5268164, 5004697, 4902505, 5506206, 5271961, 5254342 и 5534496, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.
Подходящие для трансдермального введения составы содержат эффективное количество композиции по настоящему изобретению с носителем. Предпочтительные носители включают абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители, способствующие проникновению через кожу хозяина. Например, трансдермальные устройства в виде бандажа включают опорный элемент, резервуар, содержащий композицию, необязательно, с носителями, необязательно, контролирующий скорость барьер для доставки композиции на кожу хозяина с контролируемой и предварительно определенной скоростью в течение продолжительного периода времени, и средства для закрепления устройства на коже. Также могут быть использованы матричные трансдермальные рецептуры.
Составы, подходящие для местного применения, например, для нанесения на кожу и глаза, предпочтительно представляют собой водные растворы, мази, кремы или гели, хорошо известные в данной области. Они могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, агенты, повышающие тоничность, буферы и консерванты.
Для перорального введения фармацевтическая композиция или лекарственный препарат может иметь форму, например, таблетки или капсулы, полученных известными способами с фармацевтически приемлемым наполнителем. Предпочтительными являются таблетки и желатиновые капсулы, включающие активный ингредиент, т.е. композицию по настоящему изобретению, вместе с (а) разбавителями или наполнителями, такими как лактоза, декстроза, сахароза, маннит, сорбит, целлюлоза (например, этилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза), глицин, пектин, полиакрилаты и/или гидрофосфат кальция, сульфат кальция, (b) смазывающими материалами, такими как диоксид кремния, тальк, стеариновая кислота, ее магниевая или кальциевая соль, стеараты металлов, коллоидный диоксид кремния, гидрогенизированное растительное масло, кукурузный крахмал, бензоат натрия, ацетат натрия и/или полиэтиленгликоль; для таблеток также (с) связующими веществами, такими как алюмосиликат магния, крахмальная паста, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и/или гидроксипропилметилцеллюлоза; при желании (d) разрыхляющими веществами, такими как крахмалы (например, картофельный крахмал или натрия карбоксиметилкрахмал), агар, альгиновая кислота или ее натриевая соль, или шипучие смеси; (е) смачивающими агентами, такими как лаурилсульфат натрия, и/или (f) абсорбентами, красителями, ароматизаторами и подсластителями.
Таблетки могут быть покрыты либо пленкой, либо энтеросолюбильной оболочкой способами, известными в данной области. Жидкие препараты для перорального введения могут быть в форме, например, растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены в виде сухого продукта для смешивания с водой или другим подходящим носителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут быть получены обычными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, например, суспендирующими агентами, например, сиропом сорбита, производными целлюлозы или гидрогенизированных пищевых жиров; эмульгирующими агентами например, лецитином или гуаровой камедью; неводными носителями, например, миндальным маслом, жирными сложными эфирами, этиловым спиртом или фракционированными растительными маслами; и консервантами, например, метил- или пропил-п-гидроксибензоатами или сорбиновой кислотой. Препараты также могут содержать буферные соли, ароматизирующие, красящие и/или подслащивающие агенты при необходимости. Если желательно, препараты для перорального введения могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечивать контролируемое высвобождение активной субстанции.
Для введения путем ингаляции химерный белок, предпочтительно антитело и/или токсин направленного действия, может доставляться в виде аэрозольного спрея из упаковок под давлением или распылителя с применением подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, 1,1,1,2-тетрафторэтана, двуокиси углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением единичная доза может быть определена с помощью клапана для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина, для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут содержать порошкообразную смесь химерного белка, предпочтительно антитела и/или токсина направленного действия, и подходящей порошковой основы, например, лактозы или крахмала.
Композиции также могут быть составлены в виде ректальных композиций, например, суппозиториев или удерживающих клизм, например, содержащих обычные основы для суппозиториев, например, масло какао или другие глицериды.
Кроме того, композиции могут быть составлены в виде депо-препарата. Такие длительно действующие композиции можно вводить имплантацией (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Так, например, композиция может быть составлена с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли.
При желании композиции могут быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которое может содержать одну или более единичных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, например, блистерную упаковку. Упаковка или дозирующее устройство может сопровождаться инструкциями по применению.
b. Дозировка
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию или лекарственный препарат вводят пациенту в терапевтически эффективной дозе для профилактики, лечения или контроля заболевания или злокачественного состояния, такого как рак. Фармацевтическую композицию или лекарственный препарат вводят пациенту в количестве, достаточном, чтобы вызвать эффективный терапевтический или диагностический ответ у пациента. Эффективный терапевтический или диагностический ответ - это ответ, который по меньшей мере частично подавляет или замедляет симптомы или осложнения болезни или злокачественного состояния. Количество, соответствующее достижению этой цели, определяется как «терапевтически эффективная доза».
Дозировка химерных белков, предпочтительно вводимых токсинов направленного действия или композиций, зависит от вида теплокровного животного (млекопитающего), массы тела, возраста, индивидуального состояния, площади поверхности зоны, которая подлежит обработке, и от формы введения. Размер дозы также будет определяться наличием, природой и степенью любых негативных последствий, которые сопровождают введение конкретной композиции определенному субъекту. Стандартная лекарственная доза для введения млекопитающему массой приблизительно от 50 до 70 кг может содержать приблизительно от 5 до 500 мг активного ингредиента. Как правило, дозой композиции по настоящему изобретению является доза, достаточная для достижения желаемого эффекта.
Оптимальные схемы дозирования могут быть рассчитаны из измерений накопления химерного белка, предпочтительно токсина направленного действия, в организме субъекта. В большинстве случаев доза составляет от 1 нг до 1000 мг на кг массы тела и может вводиться один или несколько раз в день, неделю, месяц или год. Специалисты в данной области могут легко определить оптимальные дозировки, методики дозирования и частоту повторения. Специалист в данной области сможет определить оптимальную дозировку для введения химерного белка, предпочтительно токсина направленного действия, человеку в соответствии с установленными протоколами, известными в данной области, и описанием, приведенным в данном документе.
Оптимальные дозировки, токсичность и терапевтическая эффективность композиций могут меняться в зависимости от относительной эффективности отдельных композиций и могут быть определены с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, путем определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено как отношение LD50/ED50. Предпочтительными являются композиции, которые обладают большими терапевтическими индексами. В тех случаях, когда могут быть использованы композиции, демонстрирующие токсические побочные эффекты, следует уделить внимание разработке системы доставки, которая бы направляла такие композиции точно в область локализации пораженной ткани, чтобы минимизировать возможность повреждения нормальных клеток и тем самым уменьшить побочные эффекты.
Данные, полученные в результате, например, исследований на животных (например, грызунах и обезьянах) могут использоваться для определения диапазона доз, назначаемых людям. Дозировка композиций по настоящему изобретению лежит предпочтительно в пределах диапазона концентраций в кровотоке, который включает ED50 при небольшой токсичности или отсутствии токсичности. Дозировка может меняться в пределах этого диапазона в зависимости от применяемой дозированной формы и способа введения. Для применения любой композиции в способах согласно данному изобретению терапевтически эффективная доза может быть оценена первоначально из анализов на клеточных культурах. Доза может быть определена на моделях животных, чтобы получить диапазон концентраций в циркулирующей плазме, который включает IC50 (концентрацию тестируемого соединения, которая обеспечивает полумаксимальное ингибирование симптомов), как определено в клеточной культуре. Такая информация может быть использована для более точного определения полезных доз для человека. Уровни в плазме могут быть измерены, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Как правило, эквивалент дозы химерного белка, предпочтительно токсина направленного действия, составляет приблизительно от 1 нг/кг до 100 мг/кг для среднестатистического субъекта.
Стандартная доза композиции токсина направленного действия согласно настоящему изобретению для внутривенного введения составляет приблизительно от 0,1 до 10 мг на пациента в день. Могут быть использованы дозы от 0,1 до приблизительно 100 мг на пациента в день. Существующие в настоящее время методы получения вводимых композиций будут известны или очевидны специалистам в данной области, и описаны более подробно в таких публикациях как Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005).
Приводимые в данном документе в качестве примеров дозы композиций включают миллиграммовые или микрограммовые количества композиции на килограмм массы субъекта или образца (например, от приблизительно 1 мкг на килограмм до приблизительно 500 миллиграммов на килограмм, от приблизительно 100 микрограммов на килограмм до приблизительно 5 мг на килограмм, или от приблизительно 1 микрограмма на килограмм до приблизительно 50 микрограммов на килограмм). Кроме того, понятно, что соответствующие дозы композиции зависят от активности композиции по отношению к желаемому эффекту, который должен быть достигнут. Когда одну или более из этих композиций должна быть введена млекопитающему, врач, ветеринар или исследователь может, например, предписать относительно низкую дозу в начале, затем увеличить дозу, пока не будет получен соответствующий ответ. Кроме того, следует понимать, что специфическая величина дозы для какой-либо отдельной особи млекопитающего будет зависеть от множества факторов, в том числе активности конкретной применяемой композиции, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и диеты субъекта, времени введения, пути введения, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств и степени экспрессии или активности, которые необходимо модулировать.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию или лекарственный препарат, содержащие химерный белок, предпочтительно токсин направленного действия, по настоящему изобретению вводят, например, в суточной дозе в интервале от приблизительно 1 мг композиции на килограмм массы субъекта (1 мг/кг) до приблизительно 1 г/кг. В другом варианте осуществления доза представляет собой дозу в диапазоне от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 500 мг/кг. В еще одном варианте осуществления доза составляет от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 250 мг/кг. В другом варианте осуществления доза составляет от приблизительно 25 мг/кг до приблизительно 150 мг/кг. Предпочтительная доза составляет приблизительно 10 мг/кг. Суточную дозу можно вводить один раз в день или разделить на меньшие дозы и вводить в виде многократных доз, например, два, три или четыре раза в день. Однако, как будет понятно специалисту в данной области, композиции, описанные в данном документе, могут быть введены в разных количествах и в разное время. Специалисту будет также понятно, что определенные факторы могут оказывать влияние на дозировку и время, необходимое для эффективного лечения субъекта, включая, без ограничения, тяжесть заболевания или злокачественного состояния, предшествующие виды лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта, и другие присутствующие заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать одну лечебную процедуру или, предпочтительно, серию лечебных процедур.
После успешного лечения субъекту желательно пройти поддерживающую терапию для предотвращения рецидива излеченного заболевания или злокачественного состояния.
c. Введение
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены для терапевтического лечения. При применении в терапевтических целях композиции вводят пациенту, страдающему от заболевания или злокачественного состояния, такого как рак, в количестве, достаточном для лечения или по меньшей мере частичной остановки развития заболевания и его осложнений. Количество, подходящее для достижения этой цели, определяется как «терапевтически эффективная доза». Количества, эффективные для такого использования, зависят от тяжести заболевания и общего состояния здоровья пациента. Эффективным количеством соединения является количество, которое обеспечивает либо субъективное облегчение симптома(ов), либо объективно определяемое улучшение, отмечаемое врачом или другим квалифицированным наблюдателем.
Определение эффективного количества находится в рамках возможностей специалистов в данной области, особенно в свете приведенного здесь подробного описания. Как правило, действующее или эффективное количество иммуноконъюгата определяют при введении сначала низкой дозы или небольшого количества иммуноконъюгата, затем постепенно увеличивая вводимую дозу или дозировку, добавляя, если необходимо, второй или третий лекарственный препарат, до тех пор, пока не будет наблюдаться желаемый эффект у подвергаемого лечению субъекта с минимальными или нулевыми токсическими побочными эффектами.
Введение композиций производят однократно или многократно в зависимости от дозы и частоты, которые требуются и переносимы пациентом. В любом случае композиция должна обеспечивать достаточное количество белков по настоящему изобретению, чтобы эффективно лечить пациента. Предпочтительно, дозу вводят один раз, но она может применяться периодически до тех пор, пока либо не будет достигнут терапевтический результат, либо побочные эффекты не станут основанием для прекращения терапии. Обычно доза является достаточной для лечения или облегчения симптомов или признаков болезни, не вызывая неприемлемой токсичности для пациента.
Для достижения желаемого терапевтического эффекта композиции могут вводиться в течение нескольких дней в терапевтически эффективных суточных дозах. Так, терапевтически эффективное введение композиции для лечения заболевания или злокачественного состояния, описанного в данном документе, у субъекта, может потребовать периодического (например, ежедневного) введения, которое продолжается от трех дней до двух недель или дольше. Как правило, композиции могут вводиться в течение по меньшей мере трех дней подряд, часто - по меньшей мере пяти дней подряд, чаще - по меньшей мере десяти дней, а иногда и в течение 20, 30, 40 и более дней подряд. Хотя последовательные ежедневные дозы предпочтительны для достижения терапевтически эффективной дозы, терапевтически полезный эффект можно достигнуть, даже если соединения или композиции не вводить ежедневно, при условии, что введение повторяется достаточно часто, чтобы поддерживать терапевтически эффективную концентрацию композиции у субъекта. Например, можно вводить композицию через день, каждый третий день или один раз в неделю, если применяются более высокие дозы и они хорошо переносятся субъектом.
3. Способы ингибирования роста опухоли
Композиции согласно настоящему изобретению находят применение для различных задач. Например, молекулы РЕ настоящего изобретения, например, как часть химерной молекулы, находят применение для (i) индуцирования апоптоза в клетке, несущей один или более поверхностный маркер, (ii) ингибирования нежелательного роста, гиперпролиферации или выживания клетки, несущей один или несколько маркеров клеточной поверхности, (iii) лечения состояний, таких как рак, и (iv) обеспечения терапии млекопитающего с развившимся заболеванием, вызванным наличием клеток, несущих один или несколько маркеров клеточной поверхности.
Любая клетка или опухолевая клетка, экспрессирующая мезотелин как маркер клеточной поверхности, может быть использована для практической реализации способа по настоящему изобретению. Способы настоящего изобретения могут быть осуществлены in vitro или in vivo. При упоминании клетки следует понимать, что этот термин также включает в себя популяцию клеток, то есть более чем одну клетку.
Применение композиций для индуцирования апоптоза в клетке. несущей один или несколько маркеров клеточной поверхности
Апоптоз играет центральную роль как в развитии, так и в гомеостазе многоклеточных организмов. «Апоптоз» относится к программируемой смерти клеток и характеризуется определенными клеточными особенностями, такими как блеббинг мембраны, конденсация и фрагментация хроматина, образование апоптотических тел и положительным окрашиванием «TUNEL» (опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой мечение UTP концов однонитевых разрывов). Более поздней стадией в апоптозе является деградация плазматической мембраны, что делает апоптотические клетки чувствительными к различным красителям (например, пропидийиодиду).
Апоптоз может быть вызван несколькими независимыми сигнальными путями, которые сходятся на конечном эффекторном механизме, состоящем из множественных взаимодействий между несколькими рецепторами смерти и их лигандами, которые принадлежат к надсемейству рецепторов/лигандов фактора некроза опухоли (TNF). Наиболее охарактеризованными рецепторами смерти являются CD95 («Fas»), TNFR1 (р55), рецептор гибели 3 (DR3 или Аро3/TRAMO), DR4 и DR5 (apo2-TRAIL-R2). Конечным эффекторным механизмом апоптоза является активация серии протеиназ, обозначаемых как каспазы. Активация этих каспаз приводит к расщеплению серии жизненно важных клеточных белков и гибели клеток.
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования апоптоза в клетке, экспрессирующей мезотелин. В одном аспекте способ индуцирования апоптоза в клетке включает стадию воздействия или контакта клетки, экспрессирующей мезотелин как маркер клеточной поверхности, с RIT настоящего изобретения. Как правило, клетки подвергают воздействию или вводят в контакт с эффективными количествами иммуноконъюгата, в результате чего происходит индуцирование апоптоза.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ индуцирования апоптоза у опухолевых клеток, экспрессирующих мезотелин на их поверхности, включающий стадию введения субъекту RIT настоящего изобретения.
Применение композиций для ингибирования роста, гиперпролиферации или выживания клетки, несущей один или несколько маркеров клеточной поверхности
Целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенной терапевтической стратегии для лечения злокачественных образований с применением композиций согласно изобретению. В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ ингибирования по меньшей мере одного из следующих явлений: нежелательного роста, гиперпролиферации или выживания клетки. Этот способ включает стадию контакта клетки, экспрессирующей мезотелин в качестве поверхностного маркера, с эффективным количеством РЕ настоящего изобретения, например, в качестве части химерной молекулы, как описано в данном документе, отличающийся тем, что стадия контакта приводит к ингибированию по меньшей мере одного из следующих явлений: нежелательного роста, гиперпролиферации или выживания клетки. В одном варианте этот способ включает стадию определения, экспрессирует ли клетка один или несколько маркеров клеточной поверхности, например, рецептор клеточной поверхности. Как правило, клетки подвергают воздействию или вводят в контакт с эффективным количеством иммуноконъюгата, в результате чего происходит ингибирование по меньшей мере одного из следующих явлений: нежелательного роста, гиперпролиферации или выживания клетки.
Так, в одном аспекте настоящего изобретения предложены способы ингибирования роста популяции клеток, несущих мезотелин. В предпочтительном варианте осуществления этот способ включает следующие стадии: (а) контакт популяции клеток с химерным белком согласно изобретению. Многие опухоли образуют метастазы. Так, в другом аспекте настоящего изобретения используют композиции настоящего изобретения, чтобы предотвратить образование метастазов. Этот способ включает стадию введения композиции по настоящему изобретению к опухолевой клетке, в которой введение композиции ведет к предотвращению образования метастаз. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит токсин направленного действия, содержащий антитело против антигена клеточной поверхности, и РЕ настоящего изобретения. Как правило, клетки подвергают воздействию или вводят в контакт с эффективными количествами иммуноконъюгата, следствием которого является предотвращение образования метастаз. Приводимые в качестве примеров злокачественные образования, чей рост, распространение и/или развитие могут быть ингибированы, включают рак яичников, мезотелиомы, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и рак поджелудочной железы.
Применение композиций для лечения рака
Способы настоящего изобретения могут быть осуществлены in vitro и in vivo. Так, в еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта, страдающего от злокачественного состояния. Этот способ включает в себя стадию введения субъекту с диагнозом рак терапевтически эффективных количеств RIT изобретения, как описано в данном документе, в котором злокачественное состояние характеризуется нежелательным ростом или пролиферацией клетки, экспрессирующей один или более маркеров клеточной поверхности, и в котором стадия введения приводит к излечению субъекта. Как правило, клетки подвергают воздействию или вводят в контакт с эффективными количествами иммунотоксина, результатом чего является излечение субъекта.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммунотоксин, содержащий РЕ по настоящему изобретению, используют для лечения субъекта, страдающего от рака, опосредованного взаимодействием мезотелин-СА125. Приводимые в качестве примеров злокачественные образования, чей рост, распространение и/или развитие, по меньшей мере, частично опосредованы связыванием СА125/мезотелин, включают рак яичников, мезотелиомы, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и рак поджелудочной железы.
Способы лечения рака могут необязательно содержать одну или более из следующих стадий: получение биологического образца ткани или жидкости от индивидуума; скрининг биологического образца на экспрессию мезотелина путем приведения в контакт биологического образца с антителом к поверхностному маркеру или скрининг биологического образца на экспрессию полинуклеотида поверхностного маркера посредством обнаружения мРНК поверхностного маркера. Это может быть сделано с помощью стандартных методик, известных в данной области, например, Вестерн-блоттинга, Нозерн-блоттинга или ПЦР.
Применение композиций для лечения субъекта, имеющего развившееся заболевание, вызванное наличием клеток, несущих один или несколько маркеров клеточной поверхности
Также предусмотрен способ терапии млекопитающего с развившимся заболеванием, вызванным наличием или аберрантной пролиферацией клеток, преимущественно несущих мезотелин или свехрэкспрессирующих мезотелин. В предпочтительном варианте осуществления этот способ включает стадию введения указанному млекопитающему RIT изобретения. Как правило, клетки подвергают воздействию или вводят в контакт с эффективными количествами иммунотоксина, результатом чего является излечение субъекта.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к устранению клеток-мишеней in vitro или ex vivo с помощью RIT настоящего изобретения. Например, химерные молекулы, содержащие RIT по изобретению, могут быть использованы для удаления клеток-мишеней из популяции клеток в культуре. Так, например, клетки, взятые от пациента, имеющего рак, экспрессирующий мезотелин, могут быть очищены от раковых клеток путем контакта культуры с химерными молекулами, направленными против мезотелина, как описано в данном документе.
В некоторых случаях клетки-мишени могут содержаться в биологическом образце. «Биологический образец» в настоящем документе представляет собой образец биологической ткани или жидкости, содержащий клетки-мишени и клетки, не являющиеся мишенями. Такие образцы включают, без ограничения, ткани из биопсии, кровь и клетки крови (например, лейкоциты). Биологический образец обычно получают из многоклеточных эукариот, предпочтительно млекопитающих, таких как крысы, мыши, коровы, собаки, морские свинки, кролики или, более предпочтительно, приматы, например, макаки, шимпанзе или человек. Наиболее предпочтительны образцы от человека.
Способы мониторинга реакции на лечение с помощью RIT изобретения
Изобретение предусматривает способы обнаружения ингибирования роста опухоли у пациента, страдающего от рака или предрасположенного к раку, который можно лечить с помощью RIT изобретения. Эти способы особенно полезны для мониторинга курса лечения, который проводят пациенту с использованием RIT настоящего изобретения. Способы могут быть использованы для мониторинга как терапевтического лечения пациентов с клиническими проявлениями заболевания, так и профилактического лечения пациентов без симптомов заболевания.
Способы мониторинга включают определение базового уровня опухолевой массы у пациента до введения дозы RIT настоящего изобретения и сравнение этого уровня с уровнем опухолевой массой после лечения или с опухолевой массой у пациента, не получающего лечение.
Значительное снижение (то есть, больше, чем типичная граница экспериментальной ошибки в повторных измерениях одного и того же образца, выраженная в виде одного стандартного отклонения от среднего значения таких измерений) уровня опухолевой массы сигнализирует о положительном результате лечения (то есть, что введение RIT настоящего изобретения остановило прогрессирование роста опухоли и/или метастазов).
В других способах контрольное значение (т.е. среднее значение и стандартное отклонение) опухолевой массы определяют для контрольной популяции или нормальной популяции (например, масса = ноль). Как правило, индивидуумы в контрольной популяции ранее не получали лечение. Измеренные значения опухолевой массы у пациента после введения RIT по настоящему изобретению затем сравнивают с контрольным значением. Значительное снижение опухолевой массы по отношению к контрольной величине (например, более чем на одно стандартное отклонение от среднего) сигнализирует о положительном результате лечения. Отсутствие значительного снижения или увеличение сигнализирует о негативном результате лечения.
В других способах контрольное значение опухолевой массы (например, среднее и стандартное отклонение) определяют в контрольной популяции индивидуумов, которые подверглись лечению, принимая по схеме RIT по настоящему изобретению, например, как части химерной молекулы, как описано в данном документе. Измеренные значения опухолевой массы у пациента сравнивают с контрольным значением. Если измеренный уровень у пациента существенно не отличается (например, более чем на одно стандартное отклонение) от контрольного значения, лечение может быть прекращено. Если уровень опухолевой массы у пациента значительно выше контрольного значения, продолжение введения агента является оправданным.
В других способах пациента, который в настоящее время не получает лечение, но прошел курс лечения ранее, наблюдают на предмет опухолевой массы, чтобы определить, требуется ли возобновление лечения. Измеренное значение опухолевой массы у пациента можно сравнить со значением опухолевой массы, ранее достигнутым у пациента после предыдущего курса лечения. Значительное увеличение опухолевой массы по сравнению с предыдущим измерением (т.е. больше, чем типичная погрешность повторных измерений одного и того же образца) является свидетельством того, что лечение может быть возобновлено. С другой стороны, значение, измеренное у пациента, можно сравнить с контрольным значением (среднее плюс стандартное отклонение), определенным в популяции пациентов после прохождения курса лечения. Альтернативно, измеренное значение у пациента можно сравнить с контрольным значением в популяциях пациентов, подвергшихся профилактическому лечению, которые остаются без симптомов заболевания, или в популяциях пациентов, подвергшихся терапевтическому лечению, которые демонстрируют улучшение характеристик заболевания. Во всех этих случаях увеличение опухолевой массы по отношению к контрольному уровню (т.е. больше, чем стандартное отклонение) является показателем того, что лечение пациента должно быть возобновлено.
Образец ткани для анализа, как правило, представляет собой кровь, плазму, сыворотку, слизь, биопсию тканей, опухоль, асцитную или спинномозговую жидкость пациента. Образец можно проанализировать для обнаружения неоплазии. Неоплазия или опухолевая масса могут быть обнаружены с помощью любого способа, известного в данной области, например, визуального наблюдения биопсии квалифицированным патологоанатомом или других способов визуализации, например, рентгенографией, УЗИ, магнитно-резонансной томографией (МРТ).
НАБОРЫ, КОНТЕЙНЕРЫ, ПРИБОРЫ И СИСТЕМЫ
Для применения в диагностических, исследовательских и терапевтических целях, описанных выше, в изобретении также предусмотрены наборы и системы. Наборы по настоящему изобретению включают RIT по настоящему изобретению, например, как часть химерной молекулы. Кроме того, наборы и системы могут включать инструкции, содержащие указания (т.е. протоколы) для осуществления на практике способов настоящего изобретения. Эти инструкции могут присутствовать в наборах в различных формах, одна или более из которых могут присутствовать в наборе. Хотя инструкции обычно содержат письменные или печатные материалы, они не ограничиваются таковыми. Любой носитель, пригодный для хранения таких инструкций и передачи их конечному пользователю, предусмотрен в настоящем изобретении. К таким носителям относятся, без ограничения, электронные носители информации (например, магнитные диски, ленты, кассеты, чипы), оптические носители (например, CD-ROM) и тому подобное. Такие носители могут включать адреса сайтов в сети Интернет, на которых предоставляются такие инструкции.
В зависимости от предполагаемого пользователя набора и системы и особых потребностей этого пользователя могут быть подготовлены разнообразные наборы, системы и композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Предусмотрены наборы с единичными дозами активной композиции, например, в оральной, вагинальной, ректальной, трансдермальной или инъекционной дозированной форме (например, для внутримышечной, внутривенной или подкожной инъекции). В такие наборы в дополнение к контейнерам, содержащим стандартные дозы, будет включен информационный вкладыш в упаковку, описывающий применение и сопутствующие преимущества композиции для лечения заболевания или злокачественного состояния. Подходящие активные композиции и единичные дозы описаны в данном документе выше.
Хотя вышеизложенное изобретение подробно описано с помощью иллюстраций и примеров для ясности и понимания, обычному специалисту в данной области в свете идей настоящего изобретения будет очевидно, что могут быть осуществлены определенные вариации, изменения, модификации и замещения эквивалентов без отхода от сущности и объема настоящего изобретения. В результате варианты осуществления, описанные здесь, могут быть предметом различных модификаций, изменений и т.п., причем объем настоящего изобретения определяется исключительно по формуле изобретения, приложенной к данному документу. Специалисты в данной области легко определят множество некритических параметров, которые могут быть заменены, изменены или модифицированы с получением по существу аналогичных результатов. Кроме того, следует понимать, что терминология, использованная в данном документе, служит только для описания отдельных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только приложенной формулой изобретения.
Хотя каждый из элементов настоящего изобретения описан здесь как содержащий множество вариантов осуществления, следует понимать, что, если не указано иное, каждый из вариантов осуществления рассматриваемого элемента согласно настоящему изобретению может быть использован с каждым из вариантов осуществления других элементов по настоящему изобретению, и каждое такое применение предназначено для формирования отдельного варианта осуществления настоящего изобретения.
Приведенные патенты, патентные заявки и научная литература, в том числе номера доступа к базе данных последовательностей GenBank, о которых говорится здесь, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были особо и индивидуально указаны для включения посредством ссылки. Любое противоречие между любой из упомянутых в данном документе ссылок и приведенным раскрытием этого описания должно быть решено в пользу последнего. Точно так же, любое противоречие между известным из уровня техники определением слова или фразы и определением этого слова или фразы, представленным в данном описании, должно быть решено в пользу последнего.
Как можно понять из приведенного выше описания, настоящее изобретение имеет широкий спектр применений.
Далее изобретение иллюстрируется последующими примерами, которые являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения определения и объема изобретения каким-либо образом.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры приведены в иллюстративных целях, но не для ограничения заявленного изобретения.
Пример 1
Белок
SS1P (SS1 (dsFv)-PE38), и все мутанты, полученные из SS1P, были экспрессированы в Escherichia coli BL21 (λDE3) с векторов для SS1 (VH)-PE и SS1 (VL), и впоследствии подвергнуты рефолдингу и очищены, как описано (Pastan I, Beers R, and Bera TK, Methods Mol Biol., 248:503-18 (2004)). Исходные растворы SS1P были приготовлены Advanced BioScience Laboratories, Inc. (Кенсингтон, Мэриленд). Все остальные RIT были приготовлены в Лаборатории молекулярной биологии Национального института рака (Бетесда, Мэриленд). Мутации в SS1P производились с применением системы сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния) с праймерами из Lofstrand Labs Limited (Гейтерсберг, Мэриленд).
Клеточные линии
Разнообразные мезотелин-положительные клеточные линии человека были использованы в этом исследовании. Линии клеток аденокарциномы легких L55 и мезотелиомы М30 были предоставлены Dr. Steven Albelda, Университет Пенсильвании (Филадельфия, Пенсильвания). Линия клеток мезотелиомы HAY была предоставлена Stehlin Foundation for Cancer Research (Хьюстон, Техас). Линии раковых клеток яичников OVCAR-8 и А1847 были предоставлены Dr. Hisataka Kobayashi и Dr. S. Aaronson, соответственно, из Национального института рака (Бетесда, Мэриленд). Линия клеток аденокарциномы легких NCI-H322M была получена от Dr. Mitchell Но из Национального института рака (Бетесда, Мэриленд). Клеточная линия KB31 является субклоном человеческой клеточной линии эпидермальной карциномы KB (Akiyama S et al., Somat Cell Mol Genet., 11(2):117-26 (1985)). Клеточная линия А431/K5 является производной от клеточной линии плоскоклеточного рака А431, трансфицированной мезотелином человека (Chowdhury PS et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95:669-674 (1998)) и выращенной в модифицированной питательной среде Дульбекко (DMEM), дополненной 10% FBS, 2 мМ L-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 100 ед. пенициллина, 100 мкг стрептомицина и 750 мкг/мл G-418 (генетицина). Если не указано иное, все клеточные линии выращивали при 37°C с 5% СО2 в среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS, 2 мМ L-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 100 ед. пенициллина и 100 мкг стрептомицина (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния).
Анализ цитотоксичности
Жизнеспособность клеточных линий, обработанных иммунотоксинами, измеряли посредством Cell Counting Kit-8 WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд) по существу, как описано в техническом руководстве. Вкратце, от 5000 до 10000 клеток/лунку высевали в 96-луночные планшеты, позволяли прикрепиться и инкубировали с различными концентрациями RIT в течение 72 часов в конечном объеме 0,2 мл, после чего добавляли 10 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку. Планшеты инкубировали при 37°С до тех пор, пока максимум поглощения при 450 нм не достигал значений OD около 1. Значения нормализовали между контрольными показателями циклогексамида (10 мкг/мл) и буфера (0,2% человеческий сывороточный альбумин в PBS) и аппроксимировали стандартным 4-параметрическим сигмоидальным уравнением с переменным наклоном с помощью программы GraphPad PRISM, чтобы получить концентрацию иммунотоксина, при которой достигалась гибель 50% клеток (EC50).
Анализ жизнеспособности клеток от пациентов с мезотелиомой проводили, как описано ниже. Вкратце, клетки были получены из плевральной жидкости или асцита у пациентов с мезотелиомой и высеяны при плотности 5×104 клеток/лунку в 24-луночный планшет с различными концентрациями RIT SS1P, SS1-LR, BL22 (анти-CD22/РЕ38) в качестве отрицательного контроля, и НВ21 (анти-рецептор трансферрина/РЕ38) в качестве положительного контроля. Клетки инкубировали в течение 96 часов, фиксировали и окрашивали красителем кристаллическим фиолетовым. Интенсивность окраски каждой лунки определяли с помощью планшетного спектрофотометра Versamax (Molecular Devices, Inc., Саннивейл, Калифорния) при длине волны 595 нм. Каждое значение определяли в трех параллельных анализах. Статистический анализ полученных данных по ANOVA проводили с применением программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния).
Анализ противоопухолевой активности на ксенотрансплантатах у мышей
Двадцати четырем женским особям мышей, лишенных волосяного покрова, в день 0 вводили подкожно в бок клетки А431/K5, как описано ранее (Zhang Y, Clin Cancer Res., 12(15):4695-701 (2006)). Объем опухоли регулярно измеряли штангенциркулем в течение следующих 6 недель. Когда средний размер опухоли достигал -100 мм3, через 5 дней после имплантации мышей разделили на четыре группы по шесть особей и вводили согласно графику QODX3 0,2 мл 0,2% MSA в PBS (только носитель) или носитель, содержащий SS1P (0,3 мг/кг) или SS1-LR (6,0 или 15 мг/кг). Мышей умерщвляли, если их опухоль превышала 1000 мм3, или в конце эксперимента. С животными обращались в соответствии с руководством Национального института здравоохранения, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных Национального института рака.
Анализ интернализации RIT
Клетки А431/K5 (106/лунка) высевали в 6-луночный планшет (10 см2/лунка) и инкубировали в течение ночи. На следующий день среду в каждой лунке меняли на 1 мл свежей среды, содержащей 1 мкг RIT, подлежащего оценке. Клетки инкубировали при 37°С в течение различных интервалов времени, после чего лунку быстро ополаскивали 2 мл холодного PBS, 1 мл холодного буфера для очистки (1 мг/мл BSA в 0,2 М глицине, рН 2,5), и снова 2 мл холодного PBS. Клетки затем лизировали 200 мкл буфера RIPA (150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 50 мМ Трис-Cl, рН 8,0), содержащего коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Образцы анализировали методом невосстанавливающего Трис-глицин SDS-PAGE Вестерн-блоттинга с применением кроличьих анти-РЕ38 поликлональных антител.
Вариабельная цитотоксичность SS1-LR
Первоначальные эксперименты с SS1-LR показали, что он имел высоковариабельную цитотоксичность относительно SS1P на выбранных мезотелин-экспрессирующих клеточных линиях, от более чем в 4 раза большей активности до в 20 раз меньшей активности. Общая тенденция, однако, свидетельствовала о меньшей активности молекулы. SS1-LR был более чем на 20% менее активен по сравнению с SS1P на 5 клеточных линиях из 8 испытанных, и более чем на 20% более активен только на одной клеточной линии. Эта тенденция заметно отличается от версии анти-CD22 молекулы LR, HA22-LR, которая, как правило, демонстрировала аналогичную или повышенную цитотоксичность как на клеточных линиях, так и на клетках пациента (Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009)). Эти наблюдения показывают, что существует значительная разница между путем токсического действия РЕ в эпителиальных клетках, экспрессирующих мезотелин, и в B-клетках, экспрессирующих CD22.
Таблица 1 | |||
Сводные данные о цитотоксичности SS1-LR | |||
ЕС50 (нг/мл) | |||
Клеточная линия | SS1P | SS1-LR | Относительная активность |
L55 | 5,32 | 4,66 | 1,14 |
NCI-H322M | 0,63 | 1,80 | 0,35 |
HAY | 4,79 | 1,05 | 4,56 |
KB31 | 0,47 | 9,34 | 0,05 |
М30 | 2,56 | 3,23 | 0,79 |
А431/K5 | 0,17 | 0,72 | 0,24 |
OVACR-8 | 1,40 | 4,13 | 0,34 |
А1847 | 4,59 | 4,70 | 0,98 |
Активность SS1-LR in vitro
Иммунотоксин SS1P (Фиг.1А) состоит из стабилизированной дисульфидными связями двойной цепи антимезотелинового фрагмента Fv SS1, присоединенного к РЕ38 (Chowdhury PS et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95:669-674 (1998); Chowdhury PS and Pastan I., Nat Biotechnol., 17:568-572 (1999); Reiter Y and Pastan I., Clin. Cancer Res., 2:245-252 (1996)). Мы ввели мутацию LR (Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009); РЕ Δ251-273 & Δ285-394) в SS1P, чтобы создать вариант SS1-LR (Фиг.1В), и оценили его активность по сравнению с SS1P против нескольких мезотелин-экспрессирующих клеточных линий in vitro. Фигура 2 показывает репрезентативную цитотоксичность по отношению к восьми различным клеточным линиям.
Линия клеток рака легких L55 (А) показала сходную чувствительность к обоим RIT. В противоположность этому, линия рака легких NCI-H322M (Pal LH et al., Nat Med., 2(3):350-3 (1996)) была приблизительно в 3 раза менее чувствительна к SS1-LR, чем к SS1P. Клеточная линия мезотелиомы HAY (G) была более чем в 4 раза более чувствительна к SS1-LR, чем к SS1P, но линия мезотелиомы М30 (D) была приблизительно на 20% менее чувствительна к SS1P, чем к SS1-LR. Клеточная линия А431/K5 (Н), линия эпителиальных клеток, стабильно трансфицированная мезотелином (Chowdhury PS et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95:669-674 (1998); Chang K and Pastan I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 136-140 (1996)), была приблизительно в 4 раза менее чувствительна к SS1-LR по сравнению с SS1P. Кроме того, линия цервикального рака KB31 (С) чувствительна к уничтожению SS1P, но его EC50 в 20 раз меньше по сравнению с SS1-LR. Также были оценены чувствительности клеточных линий рака яичников А1847 (F) и OVCAR-8 (Е) к SS1-LR. SS1-LR показал EC50, аналогичную SS1P, на линии А1847, но в 2 раза сниженную EC50 на линии OVCAR-8. Таблица 1 суммирует эти данные и представляет относительные значения ЕС50, сравнивающие SS1P и SS1-LR. Активность SS1-LR относительно SS1P меняется в широких пределах среди различных клеточных линий.
Анализируя данные, мы заметили, что SS1-LR не удалось полностью уменьшить жизнеспособность многих клеточных линий, которые мы оценивали (NCI-H322M, KB31, М30, OVCAR-8 и А1847), до контрольных уровней, как определено в клетках, обработанных 10 мкг/мл циклогексамида. Это позволяет предположить, что субпопуляция клеток может быть чувствительна к SS1P, но устойчива к SS1-LR. Мы оценивали эту возможность, инкубируя клетки OVCAR-8 и А1847 в течение 4 дней с 10 нг/мл SS1-LR и пытаясь культивировать любые выжившие клетки. Никакого дальнейшего роста клеток не наблюдалось после обработки RIT. Мы пришли к выводу, что, хотя в нашем анализе не было достигнуто полное метаболическое подавление, в этих клеточных линиях отсутствует субпопуляция, резистентная к SS1-LR.
Активность SS1-LR in vivo
Затем мы оценивали эффективность SS1-LR, используя модель ксенотрансплантатной опухоли на мышах. Из клеточных линий, что мы тестировали in vitro, только А431/K5 стабильно росла в нашей ксенотрансплантатной модели. Мышам, лишенным волосяного покрова, с ксенотрансплантатными опухолями А431/K5 размером в среднем -100 мм3 вводили внутривенно согласно графику QODX3 (через день, три дозы) SS1-LR в дозе 6,0 или 15 мг/кг. Для сравнения дополнительным группам вводили внутривенно согласно графику QODX3 либо буфер (0,2% HSA в PBS), либо 0,3 мг/кг SS1P, максимально переносимую дозу SS1P в соответствии с приведенным графиком дозирования. Размер опухоли каждой мыши регулярно измеряли в течение 22 дней после имплантации (Фиг.3).
Опухоли PBS-обработанных мышей быстро выросли до среднего размера более чем 1000 мм3 на 14 день после имплантации. Мыши, получавшие в дни 5, 7 и 9 0,3 мг/кг SS1P продемонстрировали регрессию опухоли, которая привела средний размер опухоли к минимуму около 53 мм3 на 12 день. На 20 день возобновился быстрый рост всех опухолей. Доза SS1-LR 6,0 мг/кг была немного менее активна, чем 0,3 мг/кг SS1P. Опухоли у мышей, получавших 6,0 мг/кг SS1-LR, достигли среднего минимального размера 92 мм3 в дни 7 и 9, и все возобновили быстрый рост к 18 дню. Доза 15 мг/кг SS1-LR продемонстрировала значительно лучшую противоопухолевую активность, чем 0,3 мг/кг SS1P. Опухоли у мышей, которым вводили 15 мг/кг SS1-LR, регрессировали в среднем до минимального размера 17 мм3. На 22 день четыре из шести опухолей возобновили рост, одна опухоль была неизменной на уровне 10 мм3 с 18 дня, и одна опухоль не обнаруживалась после 15 дня. Хотя SS1-LR приблизительно в 20 раз менее активен, чем SS1P в этой модели, его низкая неспецифическая токсичность позволяет вводить мышам высокие дозы и достичь лучшего противоопухолевого эффекта.
Процессинг интернализованных RIT
Различия во внутриклеточном транспорте и процессинге между SS1P и SS1-LR лежат в основе вариативности активности, наблюдаемой между этими двумя RIT. Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали интернализацию и процессинг SS1P и SS1-LR в клетках А431/K5 методом Вестерн-блоттинга (Фиг.4). Клетки А431/K5 были выбраны потому, что они экспрессируют мезотелин на высоком уровне (около 106 сайтов/клетка) и интернализуют большие количества RIT для визуализации. Мы провели невосстанавливающий SDS-PAGE Вестерн-блоттинг на клеточных лизатах целых клеток А431/K5, обработанных непрерывной инкубацией с 1 мкг/мл либо SS1P, либо SS1-LR при различных временных интервалах. На Фигуре 4А показана динамика обработки SS1P, в то время как на Фигуре 4В показана динамика обработки SS1-LR.
Как и ожидалось, клетки А431/K5, обработанные либо SS1P, либо SS1-LR, имеют характерные полосы в положениях, указывающих на полноразмерную (62 кДа и 50 кДа, соответственно) и фрагментированную (51 кДа и 39 кДа, соответственно) формы этих двух RIT. Оба RIT содержат три дисульфидные связи в области Fv: одна внутрицепочечная связь в каждом из фрагментов VH и VL, и одна межцепочечная связь между VH и VL (Фиг.1). SS1P содержит дополнительную дисульфидную связь в домене II между остатками цистеина, фланкирующими сайт расщепления фурином (Cys265 и Cys287). Степень окисления дополнительной дисульфидной связи в SS1P проявляется в изменении миграции SS1P в SDS-PAGE, вызывая появление наблюдаемого дублета (Фиг.4А, восстановленная). Эти полосы сливаются в одну полосу при обработке восстановителем (данные не показаны).
Мы также ожидали увидеть полосы, соответствующие C-концевым фрагментам расщепления фурином SS1P и SS1-LR (34 кДа и 24 кДа, соответственно). Лизаты обработанных SS1P клеток показывают заметную полосу вблизи 34 кДа, свидетельствующую о фрагменте расщепления фурином. В противоположность этому, лизаты клеток, обработанных SS1-LR, показывают только слабую полосу, соответствующую 24 кДа. Интенсивность каждой полосы оценивали количественно с помощью программного обеспечения ImageQuant (GE Healthcare). На Фиг.4С показан процент интенсивности полосы фрагмента расщепления фурином к полной интенсивности в каждый момент времени. Расщепление SS1P фурином достигает максимума немного более 30% от суммы интенсивностей всех полос, в то время как расщепление SS1-LR достигает максимума 6% от общей интенсивности. Существует более чем 5-кратное различие между долями расщепленного SS1P и расщепленного SS1-LR в каждый момент времени, что позволяет предположить, что SS1-LR может процессироваться фурином менее эффективно, чем SS1P.
Мутанты с гибким линкером
Так как наши данные позволяют предположить, что SS1-LR процессируется фурином менее эффективно, чем SS1P, мы попытались повысить активность SS1-LR за счет повышения эффективности его расщепления фурином. Мы создали несколько мутантов, чтобы исследовать, могут ли изменения сайта расщепления фурином повысить активность SS1-LR за счет повышения эффективности внутриклеточного расщепления фурином. Наша стратегия состояла в том, чтобы увеличить гибкость сайта расщепления фурином, и, таким образом, увеличить его доступность для фурина, путем добавления коротких неструктурированных Gly/Ser линкеров. SS1-LR/GGS (Фиг.1В) включает линкер Gly-Gly-Ser на С-конце сайта расщепления фурином из 11 остатков и имеет повышенную активность на обоих клеточных линиях NCIH322M и KB31 (Фиг.5). Увеличение длины линкера (SS1-LR/GGSx2, Фиг.1B) не повышает активность далее (данные не показаны). Дублирование сайта расщепления фурином с дополнительными областями линкеров (SS1-2 x фурин; Фиг.1B) также не повышает активность относительно SS1-LR/GGS (данные не показаны). В отличие от SS1-LR, все мутанты с удлиненным линкером демонстрируют полное подавление метаболизма, эквивалентное контролю циклогексамидом. Кроме того, для подтверждения важности расщепления фурином мы получили мутантный SS1-LR/GGS R279G, который включает мутацию R279G, которая делает сайт нерасщепляемым для фурина. Этот мутант был совсем неактивным в отношении как клеток NCI-H322M, так и KB31 (Фиг.5), что свидетельствует о необходимости расщепления фурином для активности.
Затем мы проверили нашу гипотезу, что линкер GGS повысил эффективность расщепления SS1-LR фурином. Вестерн-блоттинг клеток А431/K5, обработанных SS1-LR/GGS, однако, не показал улучшения в соотношении расщепленного RIT по отношению к общему RIT (данные не показаны). Расщепление SS1-LR/GGS фурином in vitro также не показало улучшения в скорости расщепления фурином (данные не показаны). Эти результаты показывают, что улучшенная цитотоксичность SS1-LR/GGS не связана с повышенным расщеплением фурином, но вместо этого является результатом другого механизма. Возможные объяснения включают повышенную транслокацию токсина во время внутриклеточного транспорта.
Активность на клетках пациентов
В продолжение этого исследования была проведена серия из 8 точечных мутаций в домене III, чтобы уменьшить иммуногенность РЕ у пациентов, подвергающихся лечению RIT, путем устранения известных эпитопов В-клеток (Onda M et al., направлена для публикации в PNAS.). Эти мутации (D406A, R432G, R467, R490A, R513A, E548S, Q592A и K590S) не влияют на активность RIT, но вместо этого снижают иммуногенность белка. Мы включили эти восемь мутаций в SS1-LR/GGS, создав новый вариант, называемый SS1-LR/GGS/8M, и испытали его цитотоксичность против первичных клеток, взятых из плевральной жидкости или асцита у пациентов с мезотелиомой. Жидкость, взятая у пациентов, содержит смесь клеток, не все из которых являются злокачественными, и они не экспрессируют мезотелин равномерно. Тем самым анализ обеспечивает хорошую оценку относительной активности, но это лишь грубая оценка абсолютной цитотоксичности. Клетки обрабатывали на раннем пассаже различными концентрациями SS1P или SS1-LR/GGS/8M и через четыре дня оценивали жизнеспособность посредством анализа с кристаллическим фиолетовым, как описано. Из нескольких клеток пациентов, которые оценивали на ответ на SS1P, клетки двух линий (NCI-M-02 и NCI-M-03) показали хорошую реакцию на лечение (>65% снижение жизнеспособности при уровне дозы 100 нг/мл). Мы оценивали активность SS1P-LR/GGS/8M на эти две популяции и сравнивали ее с активностью SS1P. Данные представлены на Фигуре 6 в качестве дробных значений относительно необработанного контроля.
Клетки пациентов NCI-M-02 и NCI-M-03 были чувствительны к лечению SS1P или SS1-LR/GGS/8M, демонстрируя более чем 60% снижение жизнеспособности по сравнению с необработанным контролем в дозах 100 нг/мл или ниже. NCI-M-02 и NCI-M-03 были особенно чувствительны к SS1-LR/GGS/8M в дозах 1,0 и 10 нг/мл, что свидетельствует о значительно более высокой цитотоксичности по сравнению с SS1P при этих концентрациях (p<0,05). В качестве контроля клетки пациентов были также обработаны RIT BL22 и НВ21 (данные не показаны). BL22, который направлен на специфический маркер CD22 В-клеток, не влиял на жизнеспособность каждой клеточной популяции в дозе 100 нг/мл. НВ21, который направлен на повсеместный рецептор трансферрина, и, как известно, очень активен по отношению к почти всем клеткам, снижал жизнеспособность обеих клеточных линий почти на 90% при дозе 10 нг/мл. В целом, данные показывают, что SS1-LR/GGS/8M обладал цитотоксичностью, аналогичной или лучшей, чем SS1P, в двух различных клеточных популяциях пациентов. Мы пришли к выводу, что эти два антимезотелиновых иммунотоксина, ведущих себя неодинаково, имеют сравнимую цитотоксическую активность.
Пример 2
Далее представлен отчет о создании, оценке и селективности SS1-LR/GGS/8M, варианта SS1P с улучшенными терапевтическими свойствами. Как уже говорилось выше, SS1-LR/GGS/8M включает мутации, которые, как ранее показано, улучшают RIT, а также новую мутацию, которая повышает его активность. SS1-LR представляет собой укороченный вариант SS1P, который содержит каталитический фрагмент РЕ, присоединенный к Fv SS1 посредством сайта расщепления фурином РЕ из 11 остатков. Цитотоксичность SS1-LR оценивали на семи клеточных линиях и установили, что она существенно ниже, чем у SS1P. Дальнейший анализ SS1-LR в культивируемых клетках показал, что он плохо процессируется фурином в пути токсического действия. Для улучшения расщепления фурином мы ввели линкер из 3 остатков в SS1-LR, создав SS1-LR7GGS. SS1-LR/GGS был значительно более активен на клеточных линиях, но не показал повышенное расщепление фурином. Мы ввели восемь точечных мутаций в каталитический фрагмент SS1-LR/GGS, которые, как было показано, уменьшают иммуногенность RIT, устраняя B-клеточные эпитопы. Этот новый RIT, SS1-LR/GGS/8M, демонстрирует отличную противоопухолевую активность, низкую неспецифическую токсичность у грызунов, а также сниженную реактивность с анти-SS1P сывороткой крови человека. Кроме того, первичные клетки от пациентов с мезотелиомой показывают повышенные ответы на SS1-LR/GGS/8M относительно SS1P. SS1-LR/GGS/8M является превосходным терапевтическим кандидатом для клинической разработки за счет своей низкой антигенности, низкой неспецифической токсичности и высокой активности.
В этом исследовании были использованы несколько мезотелин-положительных клеточных линий человека. Эти клетки получали и культивировали в большинстве случаев, как описано в Примере 1.
Анализ цитотоксичности
Жизнеспособность клеточных линий, обработанных иммунотоксинами, измеряли с помощью Cell Counting Kit-8 WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд). Клетки (2000 клеток/лунку) высевали в 96-луночные планшеты, оставляли на ночь для прикрепления и инкубировали с различными концентрациями RIT в течение 72 часов при конечном объеме 0,2 мл. В конце инкубационного периода в каждую лунку добавляли 10 мкл реагента CCK-8 и планшеты инкубировали при 37°С, пока в лунках максимум поглощения при 450 нм не достигал значений ~1 OD. Значения нормализовали между контрольными показателями с циклогексамидом (10 мкг/мл) и буфером (фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко без Са и Mg (D-PBS; Quality Biological, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд), содержащий 0,2% человеческого сывороточного альбумина (HSA)), а затем аппроксимировали сигмоидальным уравнением с переменным углом наклона для плато, базовой линии и наклона Хилла с помощью программного обеспечения GraphPad PRISM (GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния). Уравнение затем использовали для интерполяции концентрации RIT, которая уменьшала жизнеспособность клеток на 50% (ЕС50).
Клетки от пациентов с мезотелиомой культивировали и оценивали на их ответ на SS1P и SS1-LR/GGS/8M по существу, как описано (Xiang X, et al., PLoS One 2011; 6: e14640). D-PBS и 10 нг/мл НВ21 (анти-рецептор трансферрина/РЕ40) использовали в качестве отрицательного и положительного контроля гибели клеток. Каждое условие оценивали в трех параллельных анализах. Статистический анализ полученных данных по ANOVA проводили, используя программное обеспечение GraphPad Prism.
Анализ противоопухолевой активности на ксенотрансплантатах у мышей
Двадцати восьми женским особям мышей, лишенных волосяного покрова, вводили подкожно в бок 5×106 клеток L55 в 0,2 мл RPMI с 4 мг/мл матригеля (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) в день 0. Объем опухоли регулярно измеряли штангенциркулем в течение следующих 30 дней. Через семь дней после имплантации (средний размер опухоли ~100 мм3) мыши были разделены на четыре равные группы, и им вводили внутривенно в дни 7, 9 и 12 по 0,2 мл 0,2% HSA в D-PBS (носитель) или носитель, содержащий либо SS1P (0,4 мг/кг), либо SS1-LR/GGS/8M (0,4 или 2,5 мг/кг). Этот эксперимент и все последующие эксперименты на животных проводились в соответствии с руководством Национального института здравоохранения, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных Национального института рака.
Фармакокинетика в мышиной сыворотке
Группам из девяти женских особей мышей линии BALB/c вводили внутривенно 10 мкг SS1P или SS1-LR/GGS/8M в 0,2 мл D-PBS с 0,2% HSA. У групп из трех мышей брали кровь через интервалы времени 2 и 20, 5 и 30, или 10 и 60 минут. Анализировали сыворотки с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), как описано ранее (Bang S, et al., Clin Cancer Res 2005; 11:1545-50.25)).
Анализ повышения проницаемости капилляров у крыс
Описанную ранее модель RIT-индуцированного синдрома повышенной проницаемости капилляров у крыс (Siegall CB, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:9514-8) использовали для оценки неспецифической токсичности SS1-LR/GGS/8M. Вкратце, самкам Wistar Furthand Rowett, nu/nu (бестимусных) крыс (Харлан-Спраг-Доули) возраста шести-восьми недель вводили внутривенно D-PBS, SS1P (0,2 или 0,3 мг/кг) или SS1-LR/GGS/8M (6 или 12 мг/кг). Через 24 часа крыс умерщвляли под воздействием CO2. Жидкость гидроторакса собирали от эвтаназированных животных, помещая тело в спинное положение, удаляя вентральную грудную стенку и аспирируя жидкость с помощью шприца на 3 мл и иглы калибра 27,5. Легкие у нескольких крыс были удалены, фиксированы в течение 3 дней в 10% формалине, из них делали срезы и окрашивали.
Анализ интернализации RIT проводили по существу, как описано выше, образцы были проанализированы с помощью невосстанавливающего вестерн-блоттинга с применением кроличьих анти-РЕ38 поликлональных антител.
Анализ антигенности
Связывание SS1P или SS1-LR/GGS/8M с антителами в сыворотках пациентов анализировали по существу, как описано (Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:5742-7), за исключением того, что для выявления РЕ-специфических антител с помощью El-ISA были использованы CD22-rFc и НА22.
Результаты
Активность SS1-LR in vitro
Иммунотоксин SS1P (Фиг.1) является стабилизированным дисульфидной связью двухцепочечным антимезотелиновым фрагментом Fv SS1, присоединенным к РЕ38. Мы ввели мутацию LR ((Weldon JE, et al. Blood 2009; 113:3792-800); РЕ Δ251-273 & Δ285-394)) в SS1P для создания SS1-LR и оценили его активность на семи экспрессирующих мезотелин клеточных линиях in vitro. В таблице 2 приведены данные, по меньшей мере, 3 отдельных экспериментов по оценке цитотоксичности, в виде средних значений ЕС50 и стандартной ошибки среднего. По сравнению с SS1P, SS1-LR был более активным на клеточной линии HAY, но менее активным на остальных линиях. Активность SS1-LR широко варьировала среди различных клеточных линий, но он был наименее активным на линиях клеток рака яичников.
Таблица 2 | ||||||
EC50±SEM (нг/мл) | ||||||
Линия | Происхождение | SS1P | SS1-LR | SS1- | SS1- | SS1- |
клеток | рака | LR/GGS | LR/GGS/8M | LR/GGS R279G | ||
HAY | Мезотелиома | 2,24±0,21 | 0,52±0,07 | 0,10±0,04 | 0,22±0,02 | >1000 |
М30 | Мезотелиома | 0,57±0,07 | 3,70±0,85 | 0,93±0,18 | 1,46±0,20 | >1000 |
NCl-Н322М | Легочная аденокарцинома | 0,30±0,07 | 1,65±0,23 | 0,18±0,05 | 0,42±0,09 | >1000 |
L55 | Легочная аденокарцинома | 2,89±0,43 | 6,67±1,27 | 1,08±0,17 | 1,73±0,31 | >1000 |
OVCAR-8 | Карцинома яичников | 0,84±0,21 | 49,1±37,9 | 2,84±1,43 | 14,4±8,78 | >1000 |
A1847 | Карцинома яичников | 1,01±0,21 | 27,0±8,70 | 2,73±0,79 | 17,7±7,13 | >1000 |
A431/K5 | Эпидермоидная карцинома | 0,044±0,005 | 0,561±0,198 | 0,199±0,033 | 0,194±0,038 | 15,12±3,625 |
SS1-LR/GGS/8M
Иммуногенность остается серьезной проблемой для RIT на основе РЕ (Weldon JE, et al., FEBS J. 2011 Dec; 278(23):4683-700). Хотя работа по сопоставлению HA22-LR с НА22 (Hansen JK, et al., J Immunother 2010; 33:297-304)) заставляет предполагать, что SS1-LR будет менее иммуногенен, чем SS1P, оставшиеся элементы РЕ будут, тем не менее, быстро вызывать нейтрализующие антитела. Для удаления иммуногенных эпитопов В-клеток в РЕ недавно была разработана серия из восьми точечных мутаций в домене III (Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:5742-7). Эти мутации (D406A, R432G, R467A, R490A, R513A, E548S, Q592A и K590S) резко снизили иммуногенность HA22-LR у мышей, но незначительно снизили цитотоксичность. Мы включили мутации в SS1-LR/GGS, создав новый вариант под названием SS1-LR/GGS/8M, и протестировали RIT против семи экспрессирующих мезотелин клеточных линий. Значения ЕС50 этих экспериментов представлены в таблице 2. SS1-LR/GGS/8M более активен, чем SS1-LR, а иногда и более активен, чем SS1P (HAY, L55), но менее активен, чем SS1-LR/GGS. Снижение активности особенно заметно на линиях рака яичников.
Неспецифическая активность
В предыдущей работе с анти-CD22 RIT HA22 мы обнаружили, что одна внутривенная доза 2 мг/кг HA22 была смертельной для мышей, тогда как доза 20 мг/кг HA22-LR не показала токсичности (Weldon JE, et al., Blood 2009; 113:3792-800). Затем мы давали мышам единичные дозы HA22-LR вплоть до 45 мг/кг, не вызывая их смерть (неопубликованные наблюдения, данные не показаны), и мы ожидали подобное поведение от SS1-LR и его вариантов. Предыдущие эксперименты установили LD50 SS1P при одной дозе внутривенно на уровне 1,0 мг/кг для Balb/C мышей (Filpula D, et al., Bioconjug Chem 2007; 18:773-84) и 0,75 мг/кг для NIH Swiss мышей (Onda M., et al., Cancer Res 2001; 61:5070-7). С применением графика дозирования QODx3 (введения через день три раза), подобного клиническому графику, мыши переносили максимальную дозу 0,4 мг/кг SS1P (неопубликованные наблюдения, данные не показаны), но мыши, которым давали SS1-LR, получали дозы до 15 мг/кг QODx3 без токсичности (данные не показаны).
Хотя сниженная неспецифическая токсичность RIT на основе LR у мышей интригует, она не может иметь отношения к основной токсичности, наблюдаемой в клинических испытаниях. Неспецифическая токсичность RIT у мышей является результатом повреждения печени (Weldon JE, et al., Blood 2009; 113:3792-800; Onda M, et al., J Immunol. 2000:165:7150-6), которую обычно не наблюдают у пациентов. Более релевантной моделью неспецифической токсичности у животных является индуцированный RIT синдром повышенной проницаемости капилляров у крыс (Siegall CB, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:9514-8, Siegall CB, et al., Clin Cancer Res 1997; 3:339-45). Синдром повышенной проницаемости капилляров, при котором жидкость вытекает из кровеносных сосудов в интерстициальное пространство, является проявлением общей токсичности, наблюдаемой в клинических испытаниях RIT на основе РЕ. Используя эту модель, мы заметили, что крысы, получавшие внутривенно 2 мг/кг SS1P, становились больны после 24 часов, у них затруднялось дыхание, и накапливалась жидкость в их грудной полости (Фиг.7А). Увеличение дозы SS1P до 3 мг/кг увеличивало объем жидкости в грудной полости. В противоположность этому, крысы, получавшие либо D-PBS, либо SS1-LR/GGS/8M, не проявляли никаких признаков болезни и не накапливали жидкость. Дозы 6 мг/кг и 12 мг/кг SS1-LR/GGS/8M вводили без наблюдаемого токсического эффекта. Когда легкие крыс, получавших D-PBS, SS1P и SS1-LR/GGS/8M, фиксировали и окрашивали, у животных, получавших D-PBS или SS1-LR/GGS/8M, они оказывались нормальными, в то время как у крыс, получавших SS1P, появлялись признаки серьезного повреждения (Фиг.7B). Хотя ни одна молекула на основе LR не была протестирована клинически, это наблюдение усиливает предположение, что RIT на основе LR могут иметь сниженную токсичность у пациентов.
Активность SS1-LR/GGS/8M in vivo
Затем мы оценивали эффективность SS1-LR/GGS/8M in vivo с помощью модели ксенотрансплантата опухоли у мышей, используя клетки рака легких линии L55. Группам из семи мышей, лишенных волосяного покрова, с опухолями в среднем ~100 мм3 вводили внутривенно на 7, 9 и 12 день SS1-LR/GGS/8M в дозах 0,4 и 2,5 мг/кг. Для сравнения дополнительным группам вводили внутривенно по тому же графику носитель (0,2% HSA в D-PBS) или 0,4 мг/кг SS1P, максимально переносимую дозу SS1P в соответствии с указанным графиком дозирования. Размер опухоли у каждой мыши измеряли регулярно в течение 30 дней после имплантации (Фиг.7С).
Опухоли у мышей, которым вводили носитель, выросли до среднего размера приблизительно 500 мм3 на 16-й день после имплантации. У мышей, которым вводили 0,4 мг/кг SS1P, была небольшая задержка в росте опухоли: для достижения размера опухоли приблизительно 500 мм3 потребовалось 23 дня после имплантации. Мы наблюдали почти идентичный ответ у мышей, получавших 0,4 мг/кг SS1-LR/GGS/8M, предполагая паритет между SS1P и SS1-LR/GGS/8M в этой модели. Хотя SS1P из-за его неспецифической токсичности не может вводиться мышам при этом графике в дозах более высоких, чем 0,4 мг/кг, SS1-LR/GGS/8M может быть введен мышам при значительно более высоких дозах без вредных последствий. В этой модели опухоли была испытана примерно в 6 раз более высокая доза SS1-LR/GGS/8M (2,5 мг/кг). Мы наблюдали достоверную (p<0,01 с применением парного двустороннего t-теста) регрессию опухоли в этой группе мышей, чьи опухоли достигали минимального размера ~73 мм3 на 9 день. Эта группа мышей также испытывала повышенное подавление роста опухоли, которая достигала размера приблизительно 500 мм3 на 30 день после имплантации.
Хотя SS1-LR/GGS/8M имел активность, эквивалентную SS1P в модели ксенотрансплантата опухоли L55 у мышей, он показал повышенную активность по сравнению с SS1P на клетках L55 in vitro. Это расхождение в активности может быть обусловлено разницей во времени полужизни двух молекул в мышиной сыворотке. В предыдущей работе сравнивали время полужизни HA22-LR (~51 кДа) с НА22 (~63 кДа) у мышей (Weldon JE, et al., Blood 2009; 113:3792-800) и показали, что время полужизни у HA22-LR почти в 2 раза короче, чем у НА22 (7,8 и 14,6 минут соответственно). Мы предположили, что эта разница была связана с увеличением почечной фильтрации меньшей молекулы, и ожидали подобного результата при сравнении SS1-LR/GGS/8M (~50 кДа) с SS1P (~63 кДа). Анализ образцов сыворотки, взятых у мышей, которым вводили SS1-LR/GGS/8M, показал время полужизни 13 мин по сравнению с временем полужизни 19 минут для SS1P (Фиг.7D). Мы пришли к выводу, что разница во времени полужизни между SS1-LR/GGS/8M и SS1P лежит в основе расхождения относительной активности между этими двумя молекулами in vitro и in vivo.
Антигенность SS1-LR/GGS/8M
Основываясь на предыдущих исследованиях с RIT НА22 (Onda М, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:5742-7), мы ожидали, что мутации в SS1-LR/GGS/8M удалят B-клеточные эпитопы из SS1P. Для того чтобы оценить это предположение, мы сравнивали реактивность SS1P и SS1-LR/GGS/8M с сывороткой пяти пациентов, которые наработали нейтрализующие антитела в ответ на введение SS1P. Сыворотка пациентов сначала смешивалась с SS1P или SS1-LR/GGS/8M. Впоследствии несвязанные РЕ38-специфические антитела в сыворотке были выявлены с помощью ICC-ELISA (Onda М, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:5742-7). Из этих данных были определены концентрации SS1P и SS1-LR/GGS/8M, при которых сигнал ELISA был уменьшен на 50% (IC50). Как сообщалось ранее (Onda М., et al., J Immunol 2006; 177:8822-34), величины IC50 коррелируют со сродством взаимодействия антитело-антиген. Значения IC50 для SS1P относительно SS1-LR/GGS/8M отложены в процентах на Фигуре 8. Для всех сывороток пациентов соотношения величин IC50 SS1P к SS1-LR/GGS/8M были значительно ниже 10%, указывая, что основная фракция реагирующих с SS1P антител в сыворотке была инертна по отношению к SS1-LR/GGS/8M.
Активность на клетках пациентов
В дополнение к нашей оценке SS1-LR/GGS/8M на клеточных линиях in vitro и in vivo, мы также проверили его активность в отношении первичных клеток, полученных из плевральной жидкости или асцита пациентов с мезотелиомой и поддерживаемых в культуре в течение нескольких пассажей. Так как жидкость, отбираемая у пациентов, содержит смесь клеток, анализ обеспечивает хорошую оценку относительной активности, но это лишь грубая оценка абсолютной цитотоксичности. Клетки от двух дополнительных пациентов обрабатывали различными концентрациями SS1P, и их жизнеспособность оценивали через четыре дня, используя анализ с кристаллическим фиолетовым. Клетки мезотелиомы пациентов на раннем пассаже NCI-M-16 и NCI-M-19 показали четкие реакции на обработку SS1P (>75% снижение жизнеспособности при уровне дозы 100 нг/мл). Мы оценили активность SS1P-LR/GGS/8M на этих двух клеточных популяциях, полученных от дополнительных пациентов. Данные представлены на Фигуре 9 в виде дробных значений, нормализованных между контрольными обработками D-PBS (100% жизнеспособности) и 10 нг/мл антитрансферринового рецептора/РЕ40 RIT HB21 (0% жизнеспособности). Все клеточные популяции пациентов были крайне чувствительны к обработке SS1P-LR/GGS/8M, демонстрируя значительно повышенную цитотоксичность по сравнению с SS1P.
SS1P является антимезотелиновым рекомбинантным иммунотоксином на основе экзотоксина A Pseudomonas, который в настоящее время находится в клинической разработке для лечения мезотелиомы, но имеет потенциал для лечения различных твердых опухолей, которые экспрессируют мезотелин. В клинических испытаниях SS1P добился скромных, но обнадеживающих результатов. Его эффективность, однако, сведена к определенным пределам из-за ограничивающей дозу токсичности и быстрой выработки нейтрализующих антител у пациентов. Здесь мы сообщаем, что SS1-LR/GGS/8M, вариант SS1P с низкой антигенностью, имеет превосходную активность и заметно сниженную неспецифическую токсичность у грызунов.
SS1-LR/GGS/8M является высокоактивным, менее токсичным и менее антигенным вариантом антимезотелинового RIT SS1P на основе РЕ. Наша первоначальная оценка SS1-LR показала сильно варьирующую, но в целом низкую активность на отобранных клеточных линиях, экспрессирующих мезотелин, in vitro (Таблицы 1 и 2). Выясняя причины его низкой активности по сравнению с SS1P, мы изучали интернализацию и процессинг SS1-LR и обнаружили, что доля SS1-LR, расщепленного фурином, было намного ниже, чем у SS1P в клетках, обработанных этими двумя RIT. Это позволило предположить, что пониженное расщепление фурином может ограничивать активность SS1-LR, и для проверки этой гипотезы нами были разработаны и произведены несколько мутантов. Добавление короткого Gly-Gly-Ser линкера после сайта расщепления фурином не усиливало расщепление фурином, но повышало активность SS1-LR на клеточных линиях. Объединив SS1-LR с линкером GGS и еще восемью точечными мутациями, которые, как было показано, уменьшают иммуногенность РЕ, мы получили нашу конечную молекулу, SS1-LR/GGS/8M. По сравнению с SS1P, SS1-LR/GGS/8M демонстрировала значительно сниженную неспецифическую токсичность в модели повышенной проницаемости капилляров у крыс, повышенную цитотоксичность против клеток пациента, а также снижение реактивности с антителами в сыворотках пациентов. Первоначальные эксперименты с SS1-LR демонстрировали вариабельную цитотоксичность по отношению к SS1P на клеточных линиях. Первичное направление, однако, было к менее активной молекуле. SS1-LR была более активна на линии HAY и менее активна на остальных шести линиях. Эта тенденция заметно отличается от анти-CD22 версии молекулы LR, HA22-LR, которая демонстрировала похожую или повышенную цитотоксичность в большинстве клеточных линий и клеток пациентов (Weldon JE, et al., Blood 2009; 113:3792-800). Это расхождение говорит о том, что есть существенная разница между путем токсического действия РЕ, направленного на мезотелин на эпителиальных клетках, и РЕ, направленного на CD22 на В-клетках.
Что касается общего снижения активности SS1-LR относительно SS1P, одним из возможных объяснений для такого несоответствия является разница во внутриклеточном пути токсического действия. Вариант РЕ38 LR содержит обширные делеции в доменах II и Ib РЕ, и эти делеции могут иметь негативное влияние на способность РЕ перемешаться в цитозоле. Наши эксперименты по обнаружению полноразмерных и расщепленных РЕ в лизатах клеток А431/K5, обработанных SS1P и SS1-LR, показали резкое различие в количестве процессированных фурином RIT. Большая часть от общего количества RIT в клетках, обработанных SS1P, была процессирована, но только небольшая часть от общего количества RIT расщеплялась в клетках, обработанных SS1-LR. Этот результат позволил предположить, что слабое расщепление фурином может ограничивать активность SS1-LR, и мы приступили к улучшению этого этапа пути токсического действия РЕ.
Добавляя гибкий линкер к сайту расщепления фурином в SS1-LR, мы получили более активный RIT, но не смогли продемонстрировать повышенное расщепление фурином. Добавление короткого линкера Gly-Gly-Ser (SS1-LR/GGS, Фиг.1), более длинного линкера (SS1-LR/GGSx2, Фиг.1), или повтора сайта расщепления фурином, фланкированного короткими Gly-Gly-Ser линкерами (SS1-LR/2x фурин, Фиг.1) привело к умеренному повышению цитотоксичности. Ни одна из этих молекул, однако, не повышала долю SS1-LR, расщепленного фурином, в обработанных клетках А431/K5 и не увеличивала скорость расщепления фурином in vitro (данные не показаны). Мы пришли к заключению, что добавление линкера должно повышать цитотоксичность через другой механизм, возможно, связанный с внутриклеточным транспортом или повышенной стабильностью токсина, и продолжаем исследовать эти возможности. Наши эксперименты также показали необходимость расщепления фурином для цитотоксичности SS1P. Точечная мутация в SS1-LR/GGS, которая привела к замене аргинина, необходимого для расщепления, на глицин (SS1-LR/GGS R279G, Фиг.1) произвела белок, который не расщеплялся фурином. Этот RIT показал очень слабую активность на всех клетках, с незначительной активностью при концентрации 120 мкг/мл на шести из семи протестированных линий клеток. Нерасщепляемый мутант демонстрирует EC50 ниже 1 мкг/мл только на клетках А431/K5 (Таблица 2), но его активность, тем не менее, была существенно снижена. Кроме того, искусственно высокая экспрессия мезотелина в этой клеточной линии не может быть репрезентативной для тех линий, которые экспрессируют мезотелин на естественном уровне. Необходимость расщепления фурином в пути токсического действия РЕ недавно была поставлена под сомнение (Morlon-Guyot J, et al., Infect Immun 2009; 77:3090-9), но существует гораздо больше доказательств того, что фурин выполняет важную роль во время токсического действия (Ornatowski W, et al.; J Clin Invest 2007; 117:3489-97; Shiryaev SA, et al., J Biol Chem 2007; 282:20847-53; Sarac MS, et al., Infect Immun 2002; 70:7136-9; Chiron MF, et al., J Biol Chem 1997; 272:31707-11; Gu M, et al., Infect Immun 1996; 64:524-7; Inocencio NM, et al., J Biol Chem 1994; 269:31831-5; and Moehring JM, et al., J Biol Chem 1993; 18:2590-4). В случае, представленном здесь, токсическое действие РЕ обычно нарушается без сайта, пригодного для процессинга фурином.
Наша лаборатория недавно получила RIT, HA22-LR-8M, который имеет крайне низкую иммуногенность из-за удаления B-клеточных эпитопов (Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:5742-7). HA22-LR-8M содержит делеции варианта LR РЕ и дополнительные восемь точечных мутаций в домене III. Эти мутации был и в ведены в SS1P, образовав SS1-LR/GGS/8M. Поскольку основная часть иммунного ответа на RIT направлена на РЕ, мы ожидаем, что SS1-LR/GGS/8M продемонстрирует аналогичное снижение иммуногенности. Чтобы подтвердить, что SS1-LR/GGS/8M действительно удаляет эпитопы B-клеток человека из SS1P, мы исследовали реактивность SS1-LR/GGS/8M с сыворотками от пациентов, которые выработали нейтрализующие антитела во время лечения SS1P. В пяти случаях, что мы тестировали, SS1-LR/GGS/8M показал резко сниженную антигенность по сравнению с SS1P. Этот результат согласуется с наблюдениями НА22 и HA22-LR/8M (Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:5742-7), и указывает, что мы идентифицировали и удалили многие из иммуногенных эпитопов в RIT на основе РЕ.
Цитотоксичность SS1-LR/GGS/8M оценивали на нескольких клеточных линиях, в модели опухоли у мышей и на первичных клетках от пациентов с мезотелиомой. SS1-LR/GGS/8M демонстрировал отличную Цитотоксичность по отношению к SS1P в линиях клеток мезотелиомы и рака легких, но был слабо активен на линиях клеток рака яичников. Этот результат является неожиданным, так как линии клеток рака яичников были чувствительны к SS1-LR/GGS, и указывает, что восемь точечных мутаций в каталитическом домене РЕ могут мешать активности SS1-LR/GGS/8M. В модели опухоли у мышей ответы ксенотрансплантатов опухоли L55 на SS1-LR/GGS/8M и SS1P были аналогичными, хотя для усиления противоопухолевого эффекта можно было вводить более высокие дозы SS1-LR/GGS/8M. Наконец, при испытании на первичных злокачественных клетках от пациентов с мезотелиомой SS1-LR/GGS/8M демонстрировал удивительно повышенную Цитотоксичность по сравнению с SS1P. В целом, наша оценка показала отличную цитотоксическую активность SS1-LR/GGS/8M.
В дополнение к высокой активности и низкой антигенности SS1-LR/GGS/8M показал снижение неспецифической токсичности по сравнению с SS1P. Модель индуцированного RIT синдрома повышенной проницаемости капилляров у крыс эффективно демонстрирует эту разницу. Не было никаких существенных различий между крысами, получавшими PBS, и крысами, получавшими SS1-LR/GGS/8M, в то время как у крыс, получавших SS1P, наблюдалось вызывающее слабость накопление жидкости в легких. Синдром повышенной проницаемости капилляров (также называемый синдромом повышенной проницаемости сосудов) появляется, когда жидкость вытекает из капилляров, приводя к падению уровня сывороточного альбумина, задержке жидкости, отекам и набору веса. Эта токсичность часто наблюдалась у пациентов, получавших различные иммунотоксины, в том числе иммунотоксины на основе РЕ, и, предположительно, происходила в результате ненаправленного повреждения эндотелиальных клеток. Ограничение ненаправленной токсичности RIT потенциально может повысить их эффективность, позволяя безопасно вводить более высокие дозы. Этот эксперимент, наряду с другими, описанными здесь, говорит о том, что SS1-LR/GGS/8M был бы отличным кандидатом для клинического применения. Низкая антигенность, низкая неспецифическая токсичность и высокая цитотоксичность SS1-LR/GGS/8M являются многообещающими показателями для дальнейшей разработки антимезотелиновых RIT.
Подразумевается, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, приведены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения в свете этого предлагаются специалистам в данной области и должны быть включены в сущность и объем настоящей заявки и прилагаемой формулы изобретения. Все номера доступа, публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые здесь, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме для любых целей.
Claims (21)
1. Химерная молекула, представляющая собой иммунотоксин для клеток, экспрессирующих мезотелин, содержащая слитый полипептид, имеющий формулу M-L1-FCS-FL-функциональный домен III РЕ, в которой
М представляет собой антитело, которое специфически связывается с мезотелином, или его фрагмент, который специфически связывается с мезотелином, где антитело или фрагмент антитела содержит:
цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность CDR1 GYTMN (SEQ ID NO: 51), аминокислотную последовательность CDR2 LITPYNGASSYNQKFRG (SEQ ID NO: 52) и аминокислотную последовательность CDR3 GGYDGRGFDY (SEQ ID NO: 53), и
цепь VL, содержащую аминокислотную последовательность CDR1 SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 54), аминокислотную последовательность CDR2 DTSKLAS (SEQ ID NO: 55) и аминокислотную последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из QQWSGYPLT (SEQ ID NO: 56), QQWSKHPLT (SEQ ID NO: 57), QQWSGHPLT (SEQ ID NO: 58), QQWSAHPLT (SEQ ID NO: 59), QQWSQIPLT (SEQ ID NO: 60), QQWGFNPLT (SEQ ID NO: 61), QQWGTNPLT (SEQ ID NO: 62), QQWGSHPLT (SEQ ID NO: 63), QQWGDFPLT (SEQ ID NO: 64), QQWGDHPLT (SEQ ID NO: 65), QQWSAHPLT (SEQ ID NO: 66) и QQWSGYPTT (SEQ ID NO: 67);
L1 представляет собой линкер, состоящий из непрерывной последовательности от 1 до 10 аминокислотных остатков;
FCS представляет собой сайт расщепления фурином, состоящий из непрерывной последовательности аминокислотных остатков, способных расщепляться фурином;
FL состоит из непрерывной последовательности от 3 до 8 аминокислотных остатков, независимо выбранных из глицина и серина;
функциональный домен III РЕ состоит из непрерывной последовательности аминокислотных остатков, идентичной последовательности SEQ ID NO: 1 от положения 395 до положения 613, необязательно содержащей (i) замену непрерывной последовательности аминокислотных остатков в положениях 609-613 из SEQ ID NO: 1 на KDEL (SEQ ID NO: 16), REDL (SEQ ID NO: 26), REEL (SEQ ID NO: 27) или RDEL (SEQ ID NO: 28), (ii) замену аргинина на глицин, аланин, валин, лейцин или изолейцин в положении, соответствующем положению 490 в SEQ ID NO: 1, (iii) замену, независимо друг от друга, на аланин, глицин, серии или глутамин одного или более остатков, соответствующих остаткам D403, D406, R412, R427, Е431, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, Е522, R538, Е548, R551, R576, K590, Q592 и L597 последовательности SEQ ID NO: 1, где остатки SEQ ID NO: 1 поддерживают иммуногенность эпитопа или субэпитопа домена III РЕ, или (iv) комбинацию любого из (i)-(iii).
М представляет собой антитело, которое специфически связывается с мезотелином, или его фрагмент, который специфически связывается с мезотелином, где антитело или фрагмент антитела содержит:
цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность CDR1 GYTMN (SEQ ID NO: 51), аминокислотную последовательность CDR2 LITPYNGASSYNQKFRG (SEQ ID NO: 52) и аминокислотную последовательность CDR3 GGYDGRGFDY (SEQ ID NO: 53), и
цепь VL, содержащую аминокислотную последовательность CDR1 SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 54), аминокислотную последовательность CDR2 DTSKLAS (SEQ ID NO: 55) и аминокислотную последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из QQWSGYPLT (SEQ ID NO: 56), QQWSKHPLT (SEQ ID NO: 57), QQWSGHPLT (SEQ ID NO: 58), QQWSAHPLT (SEQ ID NO: 59), QQWSQIPLT (SEQ ID NO: 60), QQWGFNPLT (SEQ ID NO: 61), QQWGTNPLT (SEQ ID NO: 62), QQWGSHPLT (SEQ ID NO: 63), QQWGDFPLT (SEQ ID NO: 64), QQWGDHPLT (SEQ ID NO: 65), QQWSAHPLT (SEQ ID NO: 66) и QQWSGYPTT (SEQ ID NO: 67);
L1 представляет собой линкер, состоящий из непрерывной последовательности от 1 до 10 аминокислотных остатков;
FCS представляет собой сайт расщепления фурином, состоящий из непрерывной последовательности аминокислотных остатков, способных расщепляться фурином;
FL состоит из непрерывной последовательности от 3 до 8 аминокислотных остатков, независимо выбранных из глицина и серина;
функциональный домен III РЕ состоит из непрерывной последовательности аминокислотных остатков, идентичной последовательности SEQ ID NO: 1 от положения 395 до положения 613, необязательно содержащей (i) замену непрерывной последовательности аминокислотных остатков в положениях 609-613 из SEQ ID NO: 1 на KDEL (SEQ ID NO: 16), REDL (SEQ ID NO: 26), REEL (SEQ ID NO: 27) или RDEL (SEQ ID NO: 28), (ii) замену аргинина на глицин, аланин, валин, лейцин или изолейцин в положении, соответствующем положению 490 в SEQ ID NO: 1, (iii) замену, независимо друг от друга, на аланин, глицин, серии или глутамин одного или более остатков, соответствующих остаткам D403, D406, R412, R427, Е431, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, Е522, R538, Е548, R551, R576, K590, Q592 и L597 последовательности SEQ ID NO: 1, где остатки SEQ ID NO: 1 поддерживают иммуногенность эпитопа или субэпитопа домена III РЕ, или (iv) комбинацию любого из (i)-(iii).
2. Молекула по п.1, в которой антитело или фрагмент антитела представляет собой мини-антитело, диатело, триатело, фрагмент Fab′, фрагмент F(ab)′2, одноцепочечный белок Fv («scFv») или стабилизированный дисульфидными связями фрагмент белка Fv («dsFv»).
3. Молекула по п.1, в которой антитело или фрагмент антитела содержит стабилизированные дисульфидными связями вариабельные участки легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, слитые с остальной частью молекулы посредством связывания тяжелой цепи с L1.
4. Молекула по п.1, в которой аминокислотная последовательность CDR3 VL представляет собой QQWSKHPLT (SEQ ID NO: 57).
5. Молекула по п.1, в которой L1 составляет от 3 до 5 аминокислот в длину.
6. Молекула по п.1, в которой L1 представляет собой ASGG (SEQ ID NO: 19).
7. Молекула по п.1, в которой домен III РЕ имеет замену на аланин, глицин или серии по меньшей мере одного аминокислотного остатка, соответствующего аминокислотному остатку из SEQ ID NO: 1, выбранному из группы, состоящей из D403, R412, R427, Е431, R458, D461, R505, Е522, R538, R551, R576 и L597.
8. Молекула по п.1, в которой домен III РЕ имеет замену на аланин, глицин или серии по меньшей мере одного аминокислотного остатка, соответствующего аминокислотному остатку из SEQ ID NO: 1, выбранному из группы, состоящей из D406, R432, R467, R490, R513, Е548, K590 и Q592.
9. Молекула по п.1, в которой FL представляет собой GGS, (GGS)2 (SEQ ID NO: 18), GSGG (SEQ ID NO: 71), GGSGG (SEQ ID NO: 72), GGSG (SEQ ID NO: 73), GSG или GGG.
10. Молекула по п.1, в которой FL представляет собой GGS.
11. Молекула по п.1, в которой последовательность расщепления фурином представляет собой RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO: 17).
12. Молекула по п.1, в которой функциональный домен III РЕ представляет собой функциональный домен III РЕ варианта LR, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 от положения 20 до положения 237 или SEQ ID NO: 5 от положения 20 до положения 237.
13. Молекула по п.1, в которой антитело или фрагмент антитела содержит стабилизированную дисульфидными связями вариабельную легкую цепь SS1 последовательности SEQ ID NO: 6 и вариабельную тяжелую цепь SS1 последовательности SEQ ID NO: 7.
14. Молекула по п.1, в которой молекула содержит вариабельную легкую цепь SS1 последовательности SEQ ID NO: 6 и вариабельную тяжелую цепь SS1 из слитого с РЕ полипептида последовательности SEQ ID NO: 8, где вариабельные легкие и тяжелые цепи образуют стабилизированное дисульфидными связями антитело.
15. Молекула по любому из пп. 1-14, в которой FCS идентичен последовательности SEQ ID NO: 1 от положения 274 до положения 284 или представляет собой аминокислотную последовательность RHRSKRGWEQL (SEQ ID NO: 29).
16. Фармацевтическая композиция для лечения рака, который сверхэкспрессирует мезотелин, у субъекта, нуждающегося в этом, содержащая молекулу по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
17. Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу по любому из пп.1-14.
18. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.17.
19. Клетка-хозяин, продуцирующая химерную молекулу по любому из пп.1-14, содержащая нуклеиновую кислоту по п.17.
20. Способ лечения рака, который сверхэкспрессирует мезотелин, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту химерной молекулы по любому из пп.1-14.
21. Способ по п.20, где рак представляет собой аденокарциному легкого, рак яичников, мезотелиому и/или плоскоклеточный рак.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161483531P | 2011-05-06 | 2011-05-06 | |
US61/483,531 | 2011-05-06 | ||
PCT/US2012/036456 WO2012154530A1 (en) | 2011-05-06 | 2012-05-04 | Recombinant immunotoxin targeting mesothelin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013148919A RU2013148919A (ru) | 2015-06-20 |
RU2600067C2 true RU2600067C2 (ru) | 2016-10-20 |
Family
ID=46147033
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013148919/10A RU2600067C2 (ru) | 2011-05-06 | 2012-05-04 | Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10683362B2 (ru) |
EP (1) | EP2704739B1 (ru) |
JP (2) | JP6169561B2 (ru) |
KR (1) | KR20140036216A (ru) |
CN (1) | CN103648525B (ru) |
AU (1) | AU2012253896B2 (ru) |
BR (1) | BR112013028537A2 (ru) |
CA (1) | CA2835070C (ru) |
CL (1) | CL2013003182A1 (ru) |
CO (1) | CO6862104A2 (ru) |
CR (1) | CR20130571A (ru) |
EC (1) | ECSP13013067A (ru) |
ES (1) | ES2641877T3 (ru) |
IL (1) | IL229198A0 (ru) |
MA (1) | MA35244B1 (ru) |
MX (1) | MX2013012905A (ru) |
PE (1) | PE20141454A1 (ru) |
RU (1) | RU2600067C2 (ru) |
SG (1) | SG194787A1 (ru) |
WO (1) | WO2012154530A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201308270B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11986517B2 (en) | 2017-12-13 | 2024-05-21 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Cancer vaccines targeting mesothelin and uses thereof |
Families Citing this family (52)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20140036216A (ko) | 2011-05-06 | 2014-03-25 | 더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈 | 메소텔린을 표적화하는 재조합 면역독소 |
US8932586B2 (en) | 2011-09-06 | 2015-01-13 | Intrexon Corporation | Modified forms of Pseudomonas exotoxin A |
KR101990341B1 (ko) | 2013-03-12 | 2019-06-19 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 세포 내재화를 유도하기 위한 cd20-결합 면역독소 및 이의 사용 방법 |
WO2014182532A1 (en) * | 2013-05-07 | 2014-11-13 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Mesothelin-specific immunocytokine and use thereof |
CA2926215A1 (en) | 2013-10-06 | 2015-04-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Modified pseudomonas exotoxin a |
IL287490B (en) | 2014-01-27 | 2022-08-01 | Molecular Templates Inc | Shiga toxin nonvaccine effector subunit-containing polypeptides for mammalian applications |
EP3102245B1 (en) * | 2014-02-05 | 2021-09-08 | Molecular Templates, Inc. | Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity |
US11142584B2 (en) | 2014-03-11 | 2021-10-12 | Molecular Templates, Inc. | CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same |
CA2947048C (en) * | 2014-06-11 | 2023-10-17 | Molecular Templates, Inc. | Protease-cleavage resistant, shiga toxin a subunit effector polypeptides and cell-targeted molecules comprising the same |
KR20170110601A (ko) | 2015-02-05 | 2017-10-11 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 시가 독소 a 서브유닛 작동체 영역을 포함하는 다가 cd20 결합 분자 및 이들의 강화된 조성물 |
WO2016146833A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance |
IL292708B1 (en) | 2015-05-30 | 2024-04-01 | Molecular Templates Inc | Vaccine-free Shiga toxin A subunit scaffolds and cell-targeting molecules containing them |
JP7044700B2 (ja) * | 2015-10-02 | 2022-03-30 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性抗ceaxcd3 t細胞活性化抗原結合分子 |
CN108026179A (zh) * | 2015-10-02 | 2018-05-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 结合间皮素和cd3的双特异性t细胞活化性抗原结合分子 |
EP3184547A1 (en) | 2015-10-29 | 2017-06-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-tpbg antibodies and methods of use |
CN115920030A (zh) | 2015-12-09 | 2023-04-07 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | Ii型抗cd20抗体用于降低抗药物抗体形成 |
CN108368179B (zh) | 2016-01-08 | 2022-08-23 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗cea/抗cd3双特异性抗体治疗cea阳性癌症的方法 |
WO2017196847A1 (en) | 2016-05-10 | 2017-11-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Variable new antigen receptor (vnar) antibodies and antibody conjugates targeting tumor and viral antigens |
MX2018014863A (es) | 2016-06-02 | 2019-09-11 | Immunocore Ltd | Régimen de dosificación para proteína de fusión de tcr especifico de gp100 - scfv anti - cd3. |
WO2017211278A1 (en) | 2016-06-06 | 2017-12-14 | Asclepiumm Taiwan Co., Ltd | Antibody fusion proteins for drug delivery |
WO2017214182A1 (en) | 2016-06-07 | 2017-12-14 | The United States Of America. As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Fully human antibody targeting pdi for cancer immunotherapy |
EP3494135A1 (en) | 2016-08-02 | 2019-06-12 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof |
AU2017373962B2 (en) | 2016-12-07 | 2022-03-31 | Molecular Templates, Inc. | Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation |
AU2017382883A1 (en) | 2016-12-21 | 2019-06-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibodies specific for FLT3 and uses thereof |
US20200024312A1 (en) | 2017-01-25 | 2020-01-23 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes |
CN108624607B (zh) * | 2017-03-16 | 2021-11-16 | 上海恒润达生生物科技股份有限公司 | 靶向mesothelin的嵌合抗原受体并对其双重修饰的方法和用途 |
CN108624608B (zh) * | 2017-03-17 | 2021-11-16 | 上海恒润达生生物科技股份有限公司 | 靶向mesothelin的第四代嵌合抗原受体的制备方法和用途 |
CA3058159C (en) | 2017-03-27 | 2021-11-30 | Cidra Corporate Services Llc | Removal of hydrophobic particles using carbon dioxide |
CN108728458B (zh) * | 2017-04-21 | 2021-11-16 | 上海恒润达生生物科技股份有限公司 | 靶向mesothelin的嵌合抗原受体并联合表达IL-15的方法和用途 |
US11390683B2 (en) | 2017-05-18 | 2022-07-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-mesothelin polypeptides and proteins |
EP3625256A1 (en) | 2017-05-19 | 2020-03-25 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Human monoclonal antibody targeting tnfr2 for cancer immunotherapy |
CN109134660B (zh) * | 2017-06-16 | 2022-07-01 | 上海恒润达生生物科技股份有限公司 | 靶向Mesothelin的嵌合抗原受体并联合表达抗PD1抗体的方法及其用途 |
WO2019005208A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | ANTIBODIES TO HUMAN MESOTHELIN AND USES IN ANTICANCER THERAPY |
WO2019055955A1 (en) * | 2017-09-18 | 2019-03-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | IMMUNOTOXINS WITH ALBUMIN BINDING DOMAIN |
IL268443B1 (en) | 2018-04-17 | 2024-03-01 | Molecular Templates Inc | HER2-targeted molecules containing Shiga toxin subunit A scaffolds, without vaccination |
AU2019301675A1 (en) | 2018-07-12 | 2021-01-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Affinity matured CD22-specific monoclonal antibody and uses thereof |
WO2020033430A1 (en) | 2018-08-08 | 2020-02-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-2 and uses thereof |
US20220064324A1 (en) | 2019-01-08 | 2022-03-03 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cross species single domain antibodies targeting mesothelin for treating solid tumors |
WO2020154150A1 (en) | 2019-01-22 | 2020-07-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use |
US20220380471A1 (en) | 2019-10-22 | 2022-12-01 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | High affinity nanobodies targeting b7-h3 (cd276) for treating multiple solid tumors |
WO2022031935A1 (en) | 2020-08-05 | 2022-02-10 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Antibodies targeting egfr and use thereof |
WO2022093745A1 (en) | 2020-10-26 | 2022-05-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof |
CN112574953A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-30 | 南通大学 | 一种间皮素嵌合抗原受体外泌体、及其制备方法和应用 |
WO2022232612A1 (en) | 2021-04-29 | 2022-11-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use |
CA3216228A1 (en) | 2021-06-09 | 2022-12-15 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors |
CN116023501A (zh) * | 2021-10-25 | 2023-04-28 | 三生国健药业(上海)股份有限公司 | 一种抗her2的免疫毒素分子、及其制备方法与应用 |
WO2023076881A1 (en) | 2021-10-26 | 2023-05-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein |
US20230220106A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-07-13 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Antibodies targeting 5t4 and uses thereof |
CA3240254A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-mesothelin polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors |
WO2023131285A1 (zh) * | 2022-01-07 | 2023-07-13 | 原启生物科技(上海)有限责任公司 | 靶向cldn18.2和msln的嵌合抗原受体及其用途 |
WO2024050399A1 (en) | 2022-09-01 | 2024-03-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes |
WO2024104584A1 (en) | 2022-11-17 | 2024-05-23 | University Of Cape Town | Deimmunized pseudomonas exotoxin a |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6074644A (en) * | 1995-10-13 | 2000-06-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleic acids encoding immunotoxins containing a disulfide-stabilized antibody fragment replacing half or more of domain IB of pseudomonas exotoxin, and methods of use of the encoded immunotoxins |
US20020151689A1 (en) * | 1996-03-13 | 2002-10-17 | Oystein Fodstad | Method of killing target cells in harvested cell populations with one or more immuno-toxins |
RU2295329C2 (ru) * | 2001-09-12 | 2007-03-20 | ВиРекс Медикал Корпорейшн | Перекрывающее кровоток твердофазное средство с покрытием из иммобилизованного связывающего средства |
WO2009032954A1 (en) * | 2007-09-04 | 2009-03-12 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Deletions in domain ii of pseudomonas exotoxin a that reduce non-specific toxicity |
Family Cites Families (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4957735A (en) | 1984-06-12 | 1990-09-18 | The University Of Tennessee Research Corporation | Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization |
EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
US5019369A (en) | 1984-10-22 | 1991-05-28 | Vestar, Inc. | Method of targeting tumors in humans |
AU606320B2 (en) | 1985-11-01 | 1991-02-07 | International Genetic Engineering, Inc. | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US4902505A (en) | 1986-07-30 | 1990-02-20 | Alkermes | Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5132405A (en) | 1987-05-21 | 1992-07-21 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
US5004697A (en) | 1987-08-17 | 1991-04-02 | Univ. Of Ca | Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5055303A (en) | 1989-01-31 | 1991-10-08 | Kv Pharmaceutical Company | Solid controlled release bioadherent emulsions |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5271961A (en) | 1989-11-06 | 1993-12-21 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Method for producing protein microspheres |
US5188837A (en) | 1989-11-13 | 1993-02-23 | Nova Pharmaceutical Corporation | Lipsopheres for controlled delivery of substances |
US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
US5268164A (en) | 1990-04-23 | 1993-12-07 | Alkermes, Inc. | Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides |
JP4124480B2 (ja) | 1991-06-14 | 2008-07-23 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫グロブリン変異体 |
US5254342A (en) | 1991-09-30 | 1993-10-19 | University Of Southern California | Compositions and methods for enhanced transepithelial and transendothelial transport or active agents |
EP0617706B1 (en) | 1991-11-25 | 2001-10-17 | Enzon, Inc. | Multivalent antigen-binding proteins |
CA2129514A1 (en) | 1992-03-12 | 1993-09-16 | M. Amin Khan | Controlled released acth containing microspheres |
AU675440B2 (en) | 1992-06-18 | 1997-02-06 | United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Recombinant (pseudomonas) exotoxin with increased activity |
US5534496A (en) | 1992-07-07 | 1996-07-09 | University Of Southern California | Methods and compositions to enhance epithelial drug transport |
US5747654A (en) | 1993-06-14 | 1998-05-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity |
US6180377B1 (en) | 1993-06-16 | 2001-01-30 | Celltech Therapeutics Limited | Humanized antibodies |
US5514670A (en) | 1993-08-13 | 1996-05-07 | Pharmos Corporation | Submicron emulsions for delivery of peptides |
US5888773A (en) | 1994-08-17 | 1999-03-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing single-chain Fv molecules |
CA2241604C (en) | 1996-01-05 | 2010-03-30 | Ira Pastan | Mesothelium antigen and methods and kits for targeting it |
AU7071598A (en) | 1997-04-10 | 1998-10-30 | Erasmus University Rotterdam | Diagnosis method and reagents |
WO1999028482A2 (en) * | 1997-11-28 | 1999-06-10 | Schering Corporation | Single-chain recombinant complexes of hepatitis c virus ns3 protease and ns4a cofactor peptide |
US6809184B1 (en) | 1997-12-01 | 2004-10-26 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Antibodies, including FV molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use |
US6296843B1 (en) | 1998-04-03 | 2001-10-02 | The Penn State Research Foundation | Mutagenized IL 13-based chimeric molecules |
CA2374398C (en) * | 1999-05-27 | 2011-03-15 | Ira Pastan | Immunoconjugates having high binding affinity |
US7317091B2 (en) * | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US20040091503A1 (en) * | 2002-08-20 | 2004-05-13 | Genitrix, Llc | Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen |
US20040223966A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-11-11 | Wolfman Neil M. | ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
EP1828399A2 (en) * | 2004-12-14 | 2007-09-05 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Polymer-linked pseudomonas exotoxin immunotoxin |
AU2006203850A1 (en) | 2005-01-10 | 2006-07-13 | Research Development Foundation | Targeted chimeric molecules for cancer therapy |
ES2429340T3 (es) | 2005-03-10 | 2013-11-14 | Morphotek, Inc. | Anticuerpos anti-mesotelina |
EP2311854B1 (en) | 2005-07-29 | 2013-04-17 | The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of Health and Human Services | Mutated pseudomonas exotoxins with reduced antigenicity |
WO2007097812A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-08-30 | Genentech, Inc. | Therapeutic anti-her2 antibody fusion polypeptides |
JP5775260B2 (ja) | 2006-09-06 | 2015-09-09 | シー3 ジアン インコーポレイテッド | 選択的に標的化された抗菌性ペプチドおよびその使用 |
JP5795765B2 (ja) | 2009-09-11 | 2015-10-14 | アメリカ合衆国 | 低減した免疫原性を有する改良型シュードモナス(Pseudomonas)外毒素A |
KR20140036216A (ko) | 2011-05-06 | 2014-03-25 | 더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈 | 메소텔린을 표적화하는 재조합 면역독소 |
-
2012
- 2012-05-04 KR KR1020137032247A patent/KR20140036216A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-05-04 CN CN201280033583.7A patent/CN103648525B/zh active Active
- 2012-05-04 EP EP12722586.0A patent/EP2704739B1/en active Active
- 2012-05-04 AU AU2012253896A patent/AU2012253896B2/en active Active
- 2012-05-04 RU RU2013148919/10A patent/RU2600067C2/ru active
- 2012-05-04 PE PE2013002456A patent/PE20141454A1/es not_active Application Discontinuation
- 2012-05-04 SG SG2013081799A patent/SG194787A1/en unknown
- 2012-05-04 BR BR112013028537A patent/BR112013028537A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-05-04 WO PCT/US2012/036456 patent/WO2012154530A1/en active Application Filing
- 2012-05-04 ES ES12722586.0T patent/ES2641877T3/es active Active
- 2012-05-04 CA CA2835070A patent/CA2835070C/en active Active
- 2012-05-04 JP JP2014509467A patent/JP6169561B2/ja active Active
- 2012-05-04 US US14/115,131 patent/US10683362B2/en active Active
- 2012-05-04 MX MX2013012905A patent/MX2013012905A/es not_active Application Discontinuation
-
2013
- 2013-10-31 IL IL229198A patent/IL229198A0/en unknown
- 2013-11-05 CR CR20130571A patent/CR20130571A/es unknown
- 2013-11-05 ZA ZA2013/08270A patent/ZA201308270B/en unknown
- 2013-11-06 CL CL2013003182A patent/CL2013003182A1/es unknown
- 2013-11-21 CO CO13274153A patent/CO6862104A2/es unknown
- 2013-12-04 EC ECSP13013067 patent/ECSP13013067A/es unknown
- 2013-12-06 MA MA36534A patent/MA35244B1/fr unknown
-
2017
- 2017-03-08 JP JP2017043879A patent/JP2017140029A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6074644A (en) * | 1995-10-13 | 2000-06-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleic acids encoding immunotoxins containing a disulfide-stabilized antibody fragment replacing half or more of domain IB of pseudomonas exotoxin, and methods of use of the encoded immunotoxins |
US20020151689A1 (en) * | 1996-03-13 | 2002-10-17 | Oystein Fodstad | Method of killing target cells in harvested cell populations with one or more immuno-toxins |
RU2295329C2 (ru) * | 2001-09-12 | 2007-03-20 | ВиРекс Медикал Корпорейшн | Перекрывающее кровоток твердофазное средство с покрытием из иммобилизованного связывающего средства |
WO2009032954A1 (en) * | 2007-09-04 | 2009-03-12 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Deletions in domain ii of pseudomonas exotoxin a that reduce non-specific toxicity |
US20100215656A1 (en) * | 2007-09-04 | 2010-08-26 | Pastan Ira H | Deletions in domain ii of pseudomonas exotoxin a that remove immunogenic epitopes |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11986517B2 (en) | 2017-12-13 | 2024-05-21 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Cancer vaccines targeting mesothelin and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2704739B1 (en) | 2017-07-12 |
EP2704739A1 (en) | 2014-03-12 |
NZ617386A (en) | 2015-05-29 |
CL2013003182A1 (es) | 2014-08-22 |
JP2017140029A (ja) | 2017-08-17 |
MA35244B1 (fr) | 2014-07-03 |
IL229198A0 (en) | 2014-01-30 |
CO6862104A2 (es) | 2014-02-10 |
CR20130571A (es) | 2014-02-27 |
ECSP13013067A (es) | 2015-04-30 |
JP2014515921A (ja) | 2014-07-07 |
CA2835070A1 (en) | 2012-11-15 |
KR20140036216A (ko) | 2014-03-25 |
MX2013012905A (es) | 2014-04-25 |
PE20141454A1 (es) | 2014-10-23 |
SG194787A1 (en) | 2013-12-30 |
AU2012253896B2 (en) | 2016-09-22 |
WO2012154530A1 (en) | 2012-11-15 |
AU2012253896A1 (en) | 2013-11-21 |
ZA201308270B (en) | 2016-08-31 |
BR112013028537A2 (pt) | 2017-01-17 |
CN103648525A (zh) | 2014-03-19 |
US10683362B2 (en) | 2020-06-16 |
JP6169561B2 (ja) | 2017-07-26 |
ES2641877T3 (es) | 2017-11-14 |
CN103648525B (zh) | 2016-08-24 |
US20140154248A1 (en) | 2014-06-05 |
RU2013148919A (ru) | 2015-06-20 |
CA2835070C (en) | 2021-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2600067C2 (ru) | Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин | |
JP5795765B2 (ja) | 低減した免疫原性を有する改良型シュードモナス(Pseudomonas)外毒素A | |
CA2941466C (en) | Mutated pseudomonas exotoxins with reduced antigenicity | |
AU2008296194B2 (en) | Deletions in domain II of Pseudomonas exotoxin A that reduce non-specific toxicity | |
NZ617386B2 (en) | Recombinant immunotoxin targeting mesothelin |