KR20140036216A - 메소텔린을 표적화하는 재조합 면역독소 - Google Patents

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Abstract

메소텔린은 난소암, 중피종 및 다수의 다른 유형의 인간암의 표면상에 존재하는 분화 항원이다. 메소텔린은 정상 조직들 중에서, 중피세포 상에 유일하게 존재하므로, 세포독성제의 항체 매개된 전달에 양호한 표적을 나타낸다. 본 발명은 메소텔린에 특히 높은 친화성을 갖는 Fv 분자를 포함한 항-메소텔린 항체, 및 면역원성 및 프로테아제 민감성을 감소시키도록 변형된 슈도모나스 외독소 부분을 포함하고 메소텔린을 발현하는 세포에 대해 양호한 세포독성을 제공하는 개선된 재조합 면역독소(RIT)에 관한 것이다. 상기 RIT는 난소, 위, 편평 세포의 암, 중피종, 및 메소텔린을 발현하는 다른 악성 세포의 치료에 매우 적합하다.

Description

메소텔린을 표적화하는 재조합 면역독소{RECOMBINANT IMMUNOTOXIN TARGETING MESOTHELIN}
본 발명은 메소텔린을 발현하거나 과발현하는 암을 치료하기 위한 재조합 면역독소(RIT), 약학 조성물 및 방법을 제공한다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2011년 5월 6일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제 61/483531 호의 우선권 이점을 청구하며, 상기 가 출원은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
연방 지원 연구 개발 하에서 수행된 발명에 대한 권리에 관한 진술
적용되지 않음
컴팩트 디스크상에서 제출된 "서열화 목록", 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록 첨부에 대한 참조
적용되지 않음
발명의 배경
재조합 면역독소(RIT)는 세균 또는 식물원으로부터 유래한 세포독성 단백질과 항체 단편이 결합된 조작된 치료 단백질이다. RIT는 화학요법적 전략과 관련된 다수의 2차 독성 없이 세포의 표적화된 제거를 위한 선택적인 작용제로 설계된다. 암 치료용 RIT는 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A(PE)의 단편에, 종양 관련된 세포 표면 항원에 대한 항체의 가변 단편(Fv)을 융합시킴으로써 제작될 수 있다. 슈도모나스 외독소 A의 38-kDa 절두물(PE38)을 사용하는 RIT는 임상 시험에서 주목할만한 성공을 거두었지만, 불충분한 고형 종양 침투, 높은 면역원성, 및 비특이적인 독성을 포함하는 한계들을 갖는다(문헌[Kreitman RJ et al., Clin Cancer Res., 15(16):5274-9 (2009)]; 문헌[Hassan R et al., Clin Cancer Res., 13(17):5144-9 (2007)]; 문헌[Wayne AS et al., Clin Cancer Res., 16(6):1894-903 (2010)]; 문헌[Kreitman RJ et al., J Clin Oncol., 27(18):2983-90 (2009)]; 문헌[Sampson JH et al., Neuro Oncol., 10(3):320-9 (2008)]; 문헌[Powell DJ Jr et al., J lmmunol., 179(7):4919-28 (2007)]; 문헌[Kreitman RJ, J Clin Oncol., 23(27):6719-29 (2005)]; 문헌[Pal LH et al., Nat Med., 2(3):350-3 (1996)]).
RIT에 의한 치료 성과를 개선시키려는 노력으로, 상기 단백질의 설계를 이해하기 위해서 상기 PE 중독 경로에 대한 지식이 중요하다. RIT는 수용체-매개된 세포이물흡수를 통해 내면화되어 엔도라이소솜 시스템을 통해 골지체로 수송되고, 여기에서 소포체(ER)로 후방수송된다. 이러한 수송 단계 동안 상기 독소는 PE38 중의 어느 한 부위에서 다이설파이드 결합의 환원 및 프로테아제 퓨린에 의한 절단(상기 절단은 상기 Fv를 상기 PE 단편으로부터 분리시킨다)을 통해 활성화된다. 후속으로, 상기 활성화된 PE는 시토솔로 전위됨에 틀림없으며, 상기 시토솔에서 상기 PE는 번역 기구의 필수 성분인 신장인자 2를 ADP-리보실화하고 불활성화한다. 이는 단백질 합성을 정지시키고 결국 세포사에 이르게 한다(상기 PE 중독 경로의 재검토를 위해 9를 참조하시오). PE-기재 RIT의 세포독성 활성을 개선시키기 위해 설계된 선행의 전략들은 PE의 C-말단 잔기, REDLK(서열번호 15)의, 표준 ER-점유 신호 KDEL(서열번호 16)에 의한 치환을 포함한다(문헌[Seetharam S et al., J Biol Chem., 266(26):17376-81 (1991)]; 문헌[Du X, Ho M, and Pastan I, J lmmunother., 30(6):607-13 (2007)]; 문헌[Rozemuller H. et al., Int J Cancer., 92(6):861-70 (2001)]; 문헌[Kreitman RJ and Pastan I., Biochem J., 307 (Pt 1):29-37 (1995)]). 이러한 변화는 추정상 상기 골지체로부터 ER로의 후방수송 효율을 개선시킴으로써 PE의 세포독성을 증대시키는 것으로 공지되어 있다. 이러한 전력은 유효하나, 전형적으로는 상기 RIT의 비특이적인 독성을 또한 증대시킨다. 또 다른 전략은 상기 Fv와 그의 표적 간의 친화성을 개선시킴으로써 상기 RIT-수용체 복합체의 생산적인 내면화를 증대시키고 이에 의해 상기 세포 중의 독소의 양을 증가시키는 것이다(문헌[Salvatore G et al., Chn Cancer Res., 8(4):995-1002 (2002)]; 문헌[Decker T et al., Blood., 103(7):2718-26 (2004)]).
보다 최근에, 유효한 면역독소 치료에 대한 잠재적인 장벽인 엔도라이소솜 시스템에서의 분해를 견디는 프로테아제-내성 RIT가 설계되었다(문헌[Johannes L and Decaudin D, Gene Ther., 12(18):1360-8 (2005)]; 문헌[Fitzgerald D. Why toxins Semin Cancer Biol., 7(2):87-95 (1996)]). 상기 "라이소솜 분해 내성"(LR) 변체 RIT는 PE38의 프로테아제-민감성 영역을 제거하고 이를 RIT HA22로부터 유래한 고 친화성 항-CD22 Fv를 갖는 B-세포 CD22 수용체에 표적화함으로써 생성되었다(문헌[Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009)]). 상기 LR 돌연변이는 세포주에 대한 시험관 내 활성에 심하게 영향을 미치지 않았으나, 마우스에서 비특이적인 독성을 크게 감소시켰고 시험관 내에서 환자-유래한 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포에 대한 활성을 대단히 증대시켰다. 또한, 상기 LR 변체는 2 개의 주 마우스 B 세포 에피토프 군(문헌[Onda M et al., J Immunol., 177(12):8822-34 (2006)]) 및 PE38로부터의 항원 프로세싱 부위를 제거하여, 마우스에서 그의 면역원성의 감소를 돕는다(문헌[Hansen JK et al., J Immunother., 33(3):297-304 (2010)]). RIT의 모듈 성질로 인해, 하나의 Fv를 또 다른 것으로 교환함으로써 PE의 LR 변체를 다른 종양-관련된 항원에 대해 표적화할 수 있다. 따라서, PE의 도메인 II 및 Ib의 감소를 기술하는 기술은 일반적으로 상기 분자로부터 프로테아제 민감성 및 항원성 부위의 제거의 이점을 교시한다. 상기 기술은 또한 일반적으로 상기 변화로부터 생성되는 보다 작은 RIT의 약동학적 이점들을 교시한다.
임상적으로 적합한 표적 후보는 종양 관련된 항원 메소텔린이며, 상기 메소텔린은 종종 중피종을 포함하는 암 및 폐, 난소 및 췌장암에서 고도로 발현된다. 따라서, 표면상에서 메소텔린을 발현하는 암세포를 특이적으로 표적화하는 개선된 RIT가 필요하다. 본 발명은 메소텔린을 발현하거나 과발현하는 암을 치료하기 위한 RIT, 약학 조성물 및 방법을 제공함으로써 상기 필요성 및 다른 필요성들에 대비한다.
본 발명은 감소된 면역원성, 개선된 라이소솜 프로테아제 내성, 및 메소텔린을 발현하는 세포에 대한 개선된 세포독성을 갖는 개선된 슈도모나스 외독소 A("PE")를 제공한다. 구조적으로, 본 발명의 개선된 PE는 PE의 도메인 I이 제거되었고, PE의 도메인 II의 대부분이 제거되었으며, 임의로, PE 도메인 III 아미노산 잔기 위치 D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 및/또는 Q592의 글리신, 알라닌 또는 세린에 의한 치환 a) 및/또는 PE 도메인 III 아미노산 잔기 위치 D403, R412, R427, E431, R458, D461, R505, E522, R538, R551, R576 및/또는 L597의 글리신, 세린 또는 알라닌에 의한 치환 b)를 갖는 작용성 PE 도메인 III을 갖는다. 상기 개선은 퓨린 절단 부위와 상기 개선된 PE의 작용성 PE 도메인 III 사이에 차례로 3 내지 8 개의 아미노산 길이를 갖고 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어지는 짧은 가요성 펩타이드 링커("FL")의 삽입에 있다. 따라서, 상기 짧은 링커는 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 링커는 식 (Xaal)n의 펩타이드이며, 여기에서 각각의 Xaa1은 글리신 및 세린으로부터 독립적으로 선택되고 n은 3 내지 8이다. 본 발명의 개선된 PE 분자는 B 세포 에피토프의 제거와 함께 높은 세포독성 활성을 유지한다. 놀랍게도, 상기 짧은 가요성 링커의 포함은 퓨린에 의한 상기 분자의 절단을 실질적으로 변경시키지 않으면서 상기 분자의 세포독성을 개선시킨다. 상기 개선된 PE 분자는 본 발명에서 LR/FL/8X(서열번호 4) 및 LR/FL/8M(서열번호 5)로서 지칭되는 본 발명의 특정 실시태양들에 의해 예시된다. 또한, 상기 PE 분자가 서열번호 1의 PE의 작용성 도메인에 비해 서열번호 4 또는 5에서 발견되는 바와 같은 작용성 도메인 III 중의 하나 이상의 돌연변이를 갖는 실시태양들이 존재한다. 추가의 실시태양에서, 서열번호 1의 609 내지 613에 상응하는 하나 이상의 잔기에 추가적인 치환이 존재하며 고유 서열의 소포체 체류 작용을 또한 가짐이 고려된다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 PE 도메인 II 퓨린 절단 부위는 또 다른 퓨린 절단 부위에 의해 변형되거나 치환된다.
상기 중 어느 하나와 일치하는 바와 같은 추가의 일부 실시태양에서, 상기 PE는 서열번호 2의 PE 독소의 작용성 도메인(12 내지 230번 위치)에 대한 하나 이상의 돌연변이를 갖거나 또는 PE 도메인 III의 하나 이상의 에피토프가 제거된 하기 표 중에서 선택되는 돌연변이를 갖는 작용성 도메인 III을 포함한다:
[표 I]
Figure pct00001
관련된 태양에서, 본 발명은 상기에 제공된 바와 같이 (b) 변형된 슈도모나스 외독소 A("PE")에 접합되거나 또는 융합된 (a) 메소텔린 표적화 부분을 포함하는 키메릭 분자인 RIT("본 발명의 RIT")를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 부분은 scFv, dsFv, Fab, 단일 도메인 항체 및 F(ab')2로 이루어진 군 중에서 선택된 항체, 또는 상기 항체의 CDR을 포함하는 폴리펩타이드이다. SS1 및 MORab-009가 바람직한 표적화 부분이다. 또한, 상기 항-메소텔린 항체는 가변 중("VH")쇄 및 가변 경("VL")쇄를 포함할 수 있으며, 상기 VH 및 VL 쇄는 각각 제 1, 제 2 및 제 3 상보성-결정 영역("CDR")을 가지며, 여기에서 상기 중쇄의 제 1 CDR("CDR1"), 제 2 CDR("CDR2"), 및 제 3 CDR("CDR3")은 각각 CDR1(GYTMN; 서열번호 51), CDR2(LITPYNGASSYNQKFRG; 서열번호 52), 및 CDR3(GGYDGRGFDY; 서열번호 53)에 대해 나타낸 아미노산 잔기 서열을 가지며, 상기 VL 쇄의 CDR 1, 2 및 3은 각각 CDR1(SASSSVSYMH; 서열번호 54), CDR2(DTSKLAS; 서열번호 55), 및 CDR3(QQWSGYPLT; 서열번호 56)에 대해 나타낸 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 경쇄의 CDR3은 변형되고 서열 QQWSKHPLT(서열번호 57), QQWSGHPLT(서열번호 58), QQWSAHPLT(서열번호 59), QQWSQIPLT(서열번호 60), QQWGFNPLT(서열번호 61), QQWGTNPLT(서열번호 62), QQWGSHPLT(서열번호 63), QQWGDFPLT(서열번호 64), QQWGDHPLT(서열번호 65), QQWSAHPLT(서열번호 66), 또는 QQWSGYPTT(서열번호 67)를 갖는다. 일부 추가의 실시태양에서, 상기 항-메소텔린 항체는 scFv, dsFv, a Fab, 또는 a F(ab')2이다. 더욱 일부 추가의 실시태양에서, 상기 RIT에 사용되는 항-메소텔린 항체는 VL CDR1, VL CDR2, VH CDR1, 및 VH CDR2로 이루어진 군 중에서 선택된 CDR 중 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산은 AGY 및 RGYW 중에서 선택된 핫 스팟(hot spot) 동기에 속하는 뉴클레오타이드를 포함하는 코돈에 의해 암호화되며, 이때 R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 (a) 상기에 제공된 바와 같은 본 발명의 RIT 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
관련된 태양에서, 본 발명은 상술한 변형된 슈도모나스 외독소 A("PE") FL 또는 RIT를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 상기 메소텔린 표적화 항체의 전부 또는 단편(가변 경쇄 또는 중쇄 또는 CDR)을 추가로 암호화한다.
따라서, 실시태양의 첫 번째 군에서, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 609 내지 613에 상응하는 하나 이상의 잔기의 치환; (ii) 서열번호 1의 490 번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌 대신 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 아이소류신의 치환, (iii) 서열번호 1의 잔기에 상응하는 하나 이상의 잔기의 치환(이때 서열번호 1의 잔기들은 PE 도메인 III의 에피토프 또는 하위에피토프의 면역원성을 유지한다), 또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 임의의 조합을 임의로 포함하는, 하기 식 FCS-FL-PE 작용성 도메인 III 또는 L1-FCS-FL-PE 작용성 도메인 III[여기에서 L1은 1 내지 10 개의 아미노산 잔기 길이의 연속적인 펩타이드 서열로 이루어지고; FCS는 퓨린 절단 부위 또는 서열(예를 들어 RHRQPRGWEQL; 서열번호 17), 또는 퓨린에 의해 절단 가능한 또 다른 서열을 나타내고; FL은 글리신 및 세린 중에서 독립적으로 선택된 3 내지 8 개의 아미노산 잔기로 이루어진 가요성 링커 펩타이드 서열을 나타내고; PE 작용성 도메인 III은 서열번호 1의 잔기 395 내지 613을 포함한다]의 연속적인 폴리펩타이드 서열을 포함하는 단리된, 변형된 슈도모나스 외독소 A("PE")를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 PE 작용성 도메인은 LR/FL/8X(서열번호 4) 또는 LR/GGS/8M(서열번호 3)의 PE 작용성 도메인이다.
실시태양의 추가의 군에서, 본 발명은 (b) 상술한 바와 같은 변형된 슈도모나스 외독소 A(PE)에 접합되거나 융합된, (a) 세포 표면상의 메소텔린에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 표적화 부분을 포함하는 키메릭 분자 또는 RIT를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 리간드는 항원 인식 능력을 유지하는 항체 또는 그의 단편이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 SS1 모 항체로부터 유래한다. 바람직하게는, 상기 RIT는 FCS와 작용성 도메인 III 사이에 삽입된 GGS FL을 갖는 SS1-LR/GGS/8X이다. 이들 RIT는 상응하게 서열번호 6의 SS1 가변 경쇄 및 서열번호 8 또는 서열번호 9의 SS1 가변 중쇄 재조합 면역독소 서열을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 SS1 가변 경쇄 및 중쇄는 다이설파이드 안정화된 항체를 형성한다.
실시태양의 더욱 추가의 군에서, 본 발명은 세포 외면상의 메소텔린을 발현하거나 과발현하는 표적 세포를 살해하거나 상기 표적 세포의 성장을 억제하는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 RIT와 접촉시킴을 포함한다. 메소텔린은 난소암, 중피종 및 다수의 다른 유형의 인간 암의 표면상에 존재하는 분화 항원이다. 본 발명의 RIT를, 예를 들어 난소, 위, 편평세포의 암, 중피종, 및 메소텔린을 발현하는 다른 악성 세포를 살해하거나 이들의 성장을 억제하기 위해 시험관 내에서 또는 생체 내에서 사용할 수 있다. 이러한 병이 있고 이의 치료가 필요한 환자를 본 발명의 RIT에 의해 치료하는 방법이 고려된다.
실시태양의 더욱 추가의 군에서, 본 발명은 상술한 돌연변이된 PE 및 RIT를 암호화하는 핵산을 제공한다.
상기 중 임의의 것의 일부 실시태양에서, 상기 가요성 링커는 GGS 또는 GGSGGS(서열번호 18)이다.
더욱 다른 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 scFv, dsFv, Fab, 단일 도메인 항체 및 F(ab')2로 이루어진 군 중에서 선택된다. 상기 중 일부 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 SS1 또는 재조작된 SS1(상기 SS1 항체, 또는 상기 SS1 항체의 CDR 부분을 제공하는 단편(들)의 scFv, dsFv, Fab, 단일 도메인 항체, 또는 F(ab')2)이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체의 CDR을 표적화 부분으로서 사용한다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 인간이거나 또는 인간화된 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 변형된 PE는 LR/GGS/8M(서열번호 3) 또는 LR(Xaal)n/8X(서열번호 4) 또는 LR/(Xaa1)n/8M(서열번호 5)이다. 일부 추가의 실시태양에서, 상기 키메릭 분자는 SS1-LR/GGS/8X(서열번호 6 및 7) 또는 SS1-LR/GGS/8M(서열번호 6 및 8)이고, 여기에서 이들 각각의 표적화 부분은 상기 SS1 항체의 VL 및 VH 부분을 포함한다.
추가의 실시태양은 통상적인 숙련가들에게 자명할 것이며 본 발명에 개시된다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 Gly 및 Ser 중에서 선택된 3 내지 6 개의 아미노산으로 이루어진 제 2 펩타이드 링커에 차례로 직접 결합되고 슈도모나스 외독소 A의 작용성 도메인 III의 N-말단 아미노산에 차례로 직접 결합된 퓨린 폴리펩타이드 절단 부위 RHRQPRGWEQL(서열번호 17)에 차례로 직접 결합된, 3 내지 8 개의 아미노산 길이의 제 1 펩타이드 링커에 차례로 직접 결합된 항-메소텔린 항체 단편을 포함하는 키메릭 분자를 제공한다. 일부 추가의 실시태양에서, 상기 작용성 도메인은 LR 또는 LR/8M의 도메인 III이고 상기 항체 단편은 SS1-LR의 sdFv이다. 일부 실시태양에서, 상기 제 1 펩타이드 링커(L1)는 상기 dsFv의 VH 부분의 카복시 말단에 차례로 직접 결합된다. 상기 키메릭 분자의 약학 조성물뿐만 아니라 메소텔린을 과발현하는 암의 치료가 필요한 환자에게서 상기 암을 치료하는 방법에서의 그의 용도를 또한 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기 암은 폐 선암종, 난소 암종, 중피종, 또는 상피암종이다.
도 1은 재조합 면역독소이다. (A) 재조합 면역독소 SS1P는 중쇄로부터 짧은 펩타이드 링커(ASGG; 서열번호 19)를 통해 슈도모나스 외독소 A의 38-kDa 단편(PE38)에 커플링된 항-메소텔린 단클론 항체 SS1으로부터의 가변 단편(Fv)의 다이설파이드-안정화된(ds) 중(VH) 및 경(VL) 폴리펩타이드 쇄로 이루어진다. PE38은 도메인 II, 도메인 III, 및 고유 슈도모나스 외독소 A로부터의 도메인 Ib의 단편으로 구성된다. 도메인 II는 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인들에 의해 경계를 이룬, 용매-노출된 고리를 포함하며, 퓨린 프로테아제 절단 부위(RHRQPRGWEQL; 서열번호 17)를 함유한다. (B) SS1P의 라이소솜 분해 내성 변체, SS1-LR은 도메인 II로부터의 퓨린 절단 부위를 함유하는 11-잔기 신장부를 제외하고, PE의 도메인 Ib 및 도메인 II가 없다. 다양한 구조물들이 SS1-LR의 퓨린 절단 부위(서열번호 20 내지 24) 주변의 돌연변이(밑줄)에 의해 생성되었다.
도 2a 내지 2d는 메소텔린-양성 세포주 상의 SS1-LR의 세포독성이다. 세포주 L55, NCI-H322M, HAY, KB31, M30, A431/K5, OVCAR-8, 및 A1847을 증가하는 농도의 SS1P(빈 원, 실선) 또는 SS1-LR(빈 사각형, 대시선)과 함께 배양하였다. 3일 후에, 세포 생육성을 비색분석에 의한 WST-8 분석에 의해 평가하였으며, 처리되지 않은 것과 사이클로헥스아미드-처리된 대조군 사이에서 표준화하였다. 6회 반복실험으로부터의 평균값 및 표준 오차를 플롯팅하였다. SS1-LR은 서열번호 6의 다이설파이드 안정화된 SS1 VL 폴리펩타이드 쇄 및 서열번호 74의 SS1 VH-PE 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
도 3은 고 용량의 SS1-LR이 효능 있는 항-종양 활성을 가짐을 나타낸다. A431/K5 이종이식 종양을 갖는 누드 마우스를 이식 후 5, 7 및 9일째에 RIT 완충제(PBS 중 0.2% HSA; x표, 실선), 0.3 ㎎/㎏ SS1P(빈 원, 실선), 또는 6(빈 원, 대시선) 또는 15(채워진 사각형, 대시선) ㎎/㎏ 용량의 SS1-LR로 정맥내 처리하였다. 화살표는 처리가 투여된 때의 날짜를 가리킨다. 종양 크기를 22일의 과정에 걸쳐 측정하였다. 점들은 처리 군(n = 6) 중 모든 마우스의 평균 종양 크기를 나타낸다. 오차 막대는 각 평균값의 표준 오차를 가리킨다.
도 4는 내면화된 면역독소 프로세싱을 나타낸다. A431/K5 세포를 (A) SS1P 또는 (B) SS1-LR과 연속 배양하고, 0 내지 24 시간의 다양한 시점에서 용해시키고, 항-PE 항체에 의한 비-환원 SDS-PAGE 웨스턴 블럿(western blot)에 의해 분석하였다. 완전-길이, 환원, 및 퓨린-절단된 밴드들을 나타낸다. (C) 각 시점에서 모든 밴드의 전체 강도에 대한 퓨린-절단된 밴드의 강도를 SS1P(빈 원, 실선) 및 SS1-LR(빈 사각형, 대시선)에 대해 나타낸다.
도 5는 가요성 링커의 첨가가 SS1-LR의 세포독성을 증대시킴을 나타낸다. 세포주 (A) KB31 및 (8) NCI-H322M을 증가하는 농도의 SS1P(빈 원, 실선), SS1-LR(빈 사각형, 대시선), SS1-LR/GGS(빈 다이아몬드, 실선), 또는 SS1-LR/GGS R279G(채워진 육각형, 선 없음)와 함께 배양하였다. 3일 후에, 세포 생육성을 비색분석에 의한 WST-8 분석에 의해 평가하였으며, 처리되지 않은 것과 사이클로헥스아미드-처리된 대조군 사이에서 표준화하였다. 6회 반복실험으로부터의 평균값 및 표준 오차를 플롯팅하였다.
도 6은 환자 세포에 대한 SS1-LR/GGS/8M의 세포독성을 나타낸다. 중피종 환자의 흉수 또는 복수로부터 배양된 세포를 증가하는 농도의 RIT SS1P(흰색 막대) 또는 SS1-LR/GGS/8M(회색 막대)과 함께 도말하였다. 4일 후에, 세포를 고정시키고 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 완전한 세포를 검출하였다. 생성된 595 ㎚에서의 흡광도를 처리되지 않은 대조군에 대해 표준화하였다. 3회 반복실험으로부터의 평균값 및 표준 오차를 플롯팅하였다. 별표 없음 = p>0.05; * = p<0.05; ** = p<0.01; *** = p<0.001.
도 7은 SS1-LR/GGS/8M의 생체 내 양상을 나타낸다. (A) SS1-LR/GGS/8M의 항-종양 활성. L55 이종이식 종양을 갖는 누드 마우스를 이식 후 7, 9 및 12일째에 RIT 완충제(D-PBS 중 0.2% HSA; x표, 실선), 0.4 ㎎/㎏ SS1P(빈 원, 실선), 또는 0.4(빈 원, 대시선) 또는 2.5(채워진 사각형, 대시선) ㎎/㎏ 용량의 SS1-LR/GGS/8M으로 정맥내 처리하였다. 화살표는 처리가 투여된 때의 날짜를 가리킨다. 종양 크기를 30일의 과정에 걸쳐 측정하였다. 점들은 처리 군(n = 7) 중 모든 마우스의 평균 종양 크기를 나타낸다. 오차 막대는 각 평균값의 표준 오차를 가리킨다. (B) 모세혈관 누출 증후군의 래트 모델을 나타낸다. 래트를 PBS, SS1P, 또는 SS1-LR/GGS/8M으로 정맥내 처리하고, 24 시간 후에 관찰하고, 후속으로 죽였다. 상기 안락사된 동물로부터의 흉수를 수거하고 측정하였다. 다수의 래트의 폐를 고정시키고, 절개하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. (C) 200X 배율의 전형적인 사진을 나타낸다. (D) SS1-LR/GGS/8M의 약동학. BalbC 마우스에게 10 ㎍의 SS1P 또는 SS1-LR/GGS/8M을 정맥 내 주사하고 주사 시점으로부터 2 내지 60 분간 여러 간격으로 채혈하였다. 다양한 간격들에서의 상기 혈청 중 면역독소의 농도를 ELISA에 의해 측정하고 단일 지수 붕괴 함수에 대입하였다. 상응하는 반감기(t1/2)를 나타낸다. 각 점은 한 마리 마우스의 혈청 중 면역독소의 농도이고, 각 시간 간격에서의 농도를 2 마리 이상의 상이한 마우스로부터 측정하였다.
도 8은 SS1-LR/GGS/8M의 인간 항원성을 나타낸다. 인간 혈청 중 기존 항체와 SS1P 및 SS1-LR/GGS/8M과의 반응성을 변위 분석을 사용하여 비교하여, 상기 두 RIT가 혈청 항체를 검출하는 ELISA의 신호를 50%까지 감소시키는 농도(IC50)를 측정하였다. 여기에서 SS1P 대 SS1-LR/GGS/8M의 상대적인 IC50 값을 플롯팅하였다. SS1-LR/GGS/8M의 항원성이 모든 혈청들에 대해서 SS1P에 비해 대단히 감소한다.
도 9는 환자 세포에 대한 SS1-LR/GGS/8M의 세포독성의 요약을 나타낸다. 상대적인 생육성 대 처리. 중피종 환자의 흉수 및 복수로부터 배양된 세포를 증가하는 농도의 SS1P(흰색 막대) 또는 SS1-LR/GGS/8M(회색 막대)과 함께 도말하였다. 4일 후에, 세포를 고정시키고 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 완전한 세포를 검출하였다. 생성된 595 ㎚에서의 흡광도를 처리되지 않은 대조군에 대해 표준화하였다. 3회 반복실험으로부터의 평균값 및 표준 오차를 플롯팅하였다. 별표는 p<0.01(**), 또는 p<0.001(***)의 유의수준 차이를 가리킨다.
본 발명은 PE-기재 항-메소텔린 RIT SS1P를 기본으로 하는 항-메소텔린 RIT의 덜 독성이고 덜 면역원성인 변체를 제공한다. 상기 PE-기재 항-CD22 RIT HA22-LR에 대한 선행 연구(문헌[Weldon et al., Blood 113(6):3792-3800 (2009)])를 토대로 생성된, 우리의 SS1-LR에 대한 초기 평가는 시험관 내에서 메소텔린-발현 세포주의 선택에 있어서 고도로 가변적인 활성을 보였다. 마우스 A431/K5 이종이식 종양 분석에서, SS1-LR(서열번호 6 및 7)은 SS1P보다 덜 활성이었으나, SS1-LR을 훨씬 더 많은 용량으로 투여하여 현저한 종양 퇴화를 성취할 수 있었다. 본 발명자들은 SS1P에 비해 상기 SS1-LR의 고도로 가변적인 활성에 대한 이유를 조사하면서, 상기 SS1-LR의 내면화 및 프로세싱을 연구하였고 퓨린-절단된 SS1-LR의 비율이 SS1P의 경우보다 훨씬 더 낮음을 발견하였다. 이는 감소된 퓨린 절단이 SS1-LR의 활성을 제한할 수 있음을 암시하였으며, 본 발명자들은 상기 가설을 시험하기 위해서 다수의 돌연변이체를 설계하고 생산하였다. 상기 퓨린 절단 부위 뒤에 짧은 Gly-Gly-Ser 링커의 첨가는 세포주에 대한 SS1-LR의 활성을 증대시켰으나, 놀랍게도 상기 증대된 세포독성은 증대된 퓨린 절단에 상응하지 않았다. 본 발명은 퓨린에 의한 PE의 절단에 대한 임의의 영향과 독립적으로 이러한 항-메소텔린 RIT 구조물의 세포독성에 대한 짧은 가요성 링커의 중요성에 대한 놀라운 발견에 관한 것이다. 추가의 연구에서, SS1-LR/GGS 내에, PE의 면역원성을 감소시키는 것으로 나타난 8 개의 점 돌연변이를 포함시켰으며 이어서 중피종 환자로부터의 1차 암 세포에 대해 상기 분자를 시험하였다. 최종 분자, SS1-LR/GGS/8M(서열번호 6 및 8)은 SS1P와 유사한 세포독성을 나타내었다. 또한, 본 발명에 따른 RIT는 포유동물에서 현저하게 감소된 비-특이적 독성(예를 들어 모세혈관 누출 증후군)을 제공할 수 있다.
SS1-LR과 SS1P 간의 항-종양 효과에 있어서 약 20 배의 차이가 생체 내 A4311K5 이종이식 종양 마우스 모델을 사용하여 관찰되었다. 상기 차이는 세포독성에 전적으로 기인할 수 없는데, 그 이유는 시험관 내 세포독성 데이터가 A431/K5 세포에 대한 세포독성의 4 배 감소를 가리키기 때문이다. 대신에, 상기 차이의 나머지는 마우스에서 SS1-LR의 약동학적 성질에 기인하는 듯하다. 본 발명자들은 앞서 HA22-LR이 마우스에서 HA22보다 거의 2배 더 짧은 혈청 반감기(각각 7.8 대 14.6)를 가짐을 입증하였으며, 상기 차이는 보다 작은 LR 분자의 증가된 신장 여과에 기인함을 가정하였다(문헌[Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009)]). 상기 붕괴 곡선 아래 면적을 조사함으로써, 이러한 반감기 차이는 1 시간의 과정에 걸쳐 이용 가능한 단백질의 대략 4 배 차이를 암시한다. 따라서, 상기 생체 내 활성 차이는 감소된 세포독성 및 보다 짧은 반감기 모두에 기인할 수 있다.
SS1-LR은 생체 내에서 SS1P보다 더 낮은 항-종양 활성을 나타내었지만, 그의 비특이적 독성이 또한 마우스에서 크게 감소하였다. 본 발명자들은 이러한 성질을 이용하여 상기 이종이식 종양 분석에서 SS1P에 비해 SS1-LR의 용량을 대단히 증가시켜(50 배), 크게 증대된 항-종양 효과를 도출하였다. 선행의 실험들은 SS1P의 단일-용량 정맥내 LD50이 Balb/C 마우스에서 1.0 ㎎/㎏이고(문헌[Filpula D et al., Bioconjug Chem., 18(3):773-84 (2007)]) NIH 스위스 마우스에서 0.75 ㎎/㎏(문헌[Onda M et al., Cancer Res., 61(13):5070-7 (2001)])임을 다양하게 입증하였다. 상기 임상 스케줄과 유사한 QODx3 투여 스케줄을 사용한 경우, 마우스는 0.3 ㎎/㎏ SS1P의 최대 용량을 허용하였다(공개되지 않은 관찰). 그러나, SS1-LR은 상기 A431/K5 이종이식 항-종양 실험에서 부작용 없이 15 ㎎/㎏의 용량으로 QODx3 투여되었다. 앞서, 20 ㎎/㎏의 HA22-LR의 단일 정맥 내 용량은 마우스에게 독성을 나타내지 않았으며(문헌[(Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009)]), 본 발명자들은 사망을 유발하지 않고 마우스에게 45 ㎎/㎏ 정도로 높은 HA22·LR의 단일 용량을 제공하였다(공개되지 않은 관찰). LR 분자가 임상적으로 시험되지는 않았지만, 이러한 효과는, 상기 LR 변형 RIT가 인간 환자에서 감소된 독성을 가질 수 있으며, 이는 용량-제한 독성을 방지하고 보다 많은 용량을 투여할 수 있게 할 수 있음을 암시한다.
SS1-LR은 시험관 내 및 생체 내에서 유효하였지만, 본 발명자들은 SS1P에 비해 일반적으로 감소된 활성이 우려되었다. 이러한 불균형에 대한 한 가지 가능한 설명은 세포 내 중독 경로의 차이이다. 상기 PE38의 LR 변체는 PE의 도메인 II 및 Ib의 광범위한 결실을 함유하며, 이러한 결실은 PE의 시토솔로의 수송 능력에 부정적인 영향을 미칠 수도 있다. 흥미롭게도, SS1P 및 SS1-LR로 처리된 세포의 용해물 중에서 완전길이 및 프로세싱된 PE를 검출하기 위한 우리의 초기 실험들은 퓨린-프로세싱된 RIT 량의 현저한 차이를 입증하였다. SS1P-처리된 세포에서 전체 RIT의 대부분이 프로세싱되었으나, SS1-LR-처리된 세포에서는 전체 RIT의 작은 분획만이 처리되었다. 이러한 결과는 불충분한 퓨린 절단이 SS1-LR의 활성을 제한할 수도 있음을 암시하였으며, 우리는 이러한 PE 중독 경로 단계의 개선에 착수하였다.
상기 퓨린 절단 부위의 접근성을 증가시킴으로써 SS1-LR의 세포독성을 증대시키고자 하는 우리의 노력은 보다 활성인 RIT를 생성시켰으나, 우리는 증대된 퓨린 절단을 입증할 수 없었다. 짧은 Gly-Gly-Ser 링커(SS1-LR/GGS, 도 1B), 보다 긴 링커(SS1-LR/GGSx2, 도 1B), 또는 짧은 Gly-Gly-Ser 링커가 측면에 인접한 상기 퓨린 부위의 반복부(SS1-LR/2x퓨린, 도 1B)의 첨가는 모두 적당한 세포독성 증가를 허용하였다. 그러나, 이들 분자 중 어느 것도, 처리된 A431/K5 세포에서 퓨린-절단된 SS1-LR의 비율을 증대시키거나 시험관 내에서 퓨린 절단 비율을 증가시키지 않았다. 본 발명자들은 링커의 첨가가 또 다른 기전, 추정상 시험된 세포 중 상기 분자의 세포내 수송과 관련된 기전을 통해 세포독성을 증대시킴에 틀림없다는 결론을 내렸다.
이들 실험은 또한 SS1P의 세포독성을 유지시키기 위한 퓨린 절단의 절대적인 필요성을 입증하였다. 절단에 필수적인 아르기닌을 글리신으로 변화시키는 SS1-LR/GGS의 점 돌연변이(SS1-LR/GGS R279G, 도 1B)는 퓨린에 의해 절단되지 않는 단백질을 생성시켰다. 상기 RIT는 NCI-H322M 및 KB31 세포 모두에 대해 활성을 보이지 않았다. 상기 PE 중독 경로에서 퓨린 절단의 필요성이 최근에 의문시되었으나(문헌[Morlon-Guyot J et al., Infect Immun., 77(7):3090-9 (2009)]), 퓨린이 중독 중 중요한 역할을 수행한다는 많은 증거가 존재한다(문헌[Ornatowski W et al., J Clin Invest., 117(11):3489-97 (2007)]; 문헌[Shiryaev SA et al., J Biol Chem., 282(29):20847-53 (2007)]; 문헌[Sarac MS et al., Infect Immun., 70(12):7136-9 (2002)]; 문헌[Chiron MF, Fryling CM, and FitzGerald D, J Biol Chem., 272(50):31707-11 (1997)]; 문헌[Gu M et al., Infect Immun., 64(2):524-7 (1996)]; 문헌[Inocencio NM, Moehring JM, and Moehring TJ, J Biol Chem., 269(50):31831-5 (1994)]; 문헌[Moehring JM et al., J Biol Chem., 268(4):2590-4 (1993)]). 여기에 제공된 경우에서, PE 중독은 퓨린 처리에 적합한 부위를 함유하지 않아 실패한다. 퓨린 절단과 세포독성간의 관계를 조사하기 위한 연구가 진행 중이다.
본 발명자들의 실험실의 별도의 연구 라인은 최근에 B 세포 에피토프의 제거로 인해 매우 낮은 면역원성을 갖는, HA22의 변체, HA22-LR-8M을 생성시켰다(문헌[Onda M et al., Submitted for publication to PNAS.]). HA22-LR-8M은 PE의 LR 변체와 동일한 결실을 함유하나, PE의 도메인 중 8 개의 점 돌연변이를 포함한다. 이들 돌연변이를 SS1P 내에 놓아 SS1-LR/GGS/8M을 생성시켰다. HA22-LR-8M과 SS1-LR/GGS/8M 간의 유일한 차이는 항체 Fv 및 퓨린 절단 부위 뒤의 GGS 링커이다. RIT에 대한 면역 반응의 대다수는 PE를 겨냥하므로, SS1-LR/GGS/8M은 유사하게 감소된 면역원성을 나타내어야 한다.
SS1-LR/GGS/8M의 세포독성을 중피종 환자로부터의 1차 암 세포 상의 SS1P와 비교하였으며, 그 결과는 SS1-LR/GGS/8M이 SS1P에 필적하거나 이보다 양호한 세포독성을 가짐을 보였다. 양호한 활성 외에, SS1-LR/GGS/8M은 SS1P에 비해 감소된 비특이적 독성 및 낮은 면역원성을 포함하는 잠재적인 이점들을 갖는다. 본 발명에 개시된 실험들은 SS1-LR/GGS/8M이 그의 낮은 면역원성, 낮은 비특이적 독성, 및 양호한 세포독성으로 인해 임상에 탁월한 후보일 것임을 암시한다.
정의
단위, 접두사, 및 기호들은 SI 단위계(SI) 승인된 형태로 나타낸다. 숫자 범위는 상기 범위를 한정하는 숫자들을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록되며; 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 본 발명에 제공된 표제들은 본 발명의 다양한 태양 또는 실시태양들의 제한이 아니며, 전체로서 명세서에 참조될 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 전체가 명세서에 참고로 보다 충분히 정의된다.
고유 슈도모나스 외독소 A("PE")는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 분비되는, 매우 활성인 단량체성 단백질(분자량 66 kDa)이며, 진핵생물 세포에서 단백질 합성을 억제한다. 상기 고유 PE 서열은 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제 5,602,095 호에 서열번호 1로 나열된다. 작용 방법은 ADP-리보실화에 의한 신장인자 2(EF-2)의 불활성화이다. 상기 외독소는 협력하여 세포독성을 유발하는 작용을 하는 3 개의 구조 도메인들을 함유한다. 도메인 Ia(아미노산 1 내지 252)는 세포 결합을 매개한다. 도메인 II(아미노산 253 내지 364)는 시토솔로의 전좌에 기여하고 도메인 III(아미노산 400 내지 613)은 신장인자 2의 ADP 리보실화를 매개한다. PE의 원래 구조는 도메인 III을 400 내지 613이 아닌, 잔기 405 내지 613으로서 분류한다(문헌[Allured VS, Collier RJ, Carroll SF & McKay DB, Proc Natl Acad Sci USA 83, 1320-1324 (1986)]). 도메인 Ib(아미노산 365 내지 399)의 작용은 미확인된 채로 있지만, 그의 큰 부분인 아미노산 365 내지 380이 세포독성의 상실 없이 결실될 수 있다. 문헌[Siegall, et al., J Biol Chem 264:14256-61 (1989)]을 참조하시오. 다수의 상기와 같은 변형들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 비제한적으로 도메인 Ia의 제거, 도메인 Ib, II 및 III에서 다양한 아미노산 결실, 단일 아미노산 치환, 및 카복실 말단에서 하나 이상의 서열, 예를 들어 KDEL(서열번호 16) 및 REDL(서열번호 26)의 첨가를 포함한다. 문헌[Siegall, et al., J Biol Chem 264:14256-14261 (1989)]을 참조하시오. 본 발명의 면역독소는 표적화된 세포에서 전좌 및 EF-2 리보실화가 가능하다.
PE의 돌연변이를 본 발명에서 고유 PE(서열번호 1)의 613-아미노산 서열의 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기, 이어서 논의 중인 특정 돌연변이에서 잔기가 치환된 아미노산을 참조로 개시한다. 따라서, 예를 들어 "R490A"란 용어는 참조되는 분자의 490 번 위치에서 "R"(아르기닌, 표준 단일 문자 코드로)이 "A"(알라닌, 표준 단일 문자 코드로)에 의해 치환된 것을 가리키는 반면, "K590Q"는 590 번 위치에 통상적으로 존재하는 리신이 글루타민으로 치환된 것을 가리킨다. 통상적인 아미노산에 대한 상기 표준 단일 문자 코드를 하기에 나타낸다.
"PE 작용성 도메인 III" 또는 "작용성 PE 도메인 III"이란 용어는 고유 PE(상기 고유 서열은 서열번호 1이다)의 잔기 395 내지 613을 지칭한다. 도메인 III의 구조적 경계는 잔기 405 내지 613으로 지정되었지만, 작용 분석은 도메인 III이 ADP-리보실화 활성을 유지하기 위해서 도메인 Ib의 분절을 필요로 함을 입증하였다(문헌[Hwang, J. et al., Cell, 48:129-136 (1987)]; 문헌[Siegall, C.B. et al., J Biol Chem, 264:14256-14261 (1989)]). 따라서 상기 PE 작용성 도메인 III은 PE의 잔기 395 내지 613에 의해 한정된다(문헌[Kihara, A. and Pastan, I., Bioconjug Chem, 5:532-538 (1994)]). 본 발명에서, 상기 작용성 PE 도메인 III 서열은 항원성 및 임의의 또 다른 소포체 점유 서열을 감소시키기 위한 임의의 변형들을 포함한다.
PE 도메인 III의 말단 잔기, REDLK(서열번호 15)를 본 발명에 따라 생성되는 RIT의 세포독성을 증가시키는 방식으로 변화시킬 수 있다. 예를 들어, KDEL(서열번호 16), REEL(서열번호 27) 또는 RDEL(서열번호 28) 서열들로 끝나는 돌연변이된 PE에 의해 제조된 면역독소는 고유 말단 서열을 갖는 PE38에 의해 제조된 면역독소보다 표적 세포에 대해 훨씬 더 세포독성일 수 있다. 문헌[Kreitman and Pastan, Biochem J, 307(Pt 1):29-37 (1995)]을 참조하시오. 이들 서열의 반복부를 또한 본 발명의 RIT에 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,854,044 호; 미국특허 제 5,821,238 호; 및 미국특허 제 5,602,095 호 및 국제 공보 WO 99/51643을 참조하시오. KDEL(서열번호 16)로 종결되는 PE는 시험관 내 목적에 유용한 반면, 상기 PE는 동물에서 보다 비특이적 독성을 가질 수도 있으며 생체 내 용도에 덜 바람직하다.
"메소텔린"이란 용어는 일부 인간 세포의 표면상에 존재하고, 예를 들어 K1 항체에 의해 결합된 단백질 및 그의 단편을 지칭한다. 메소텔린의 핵산 및 아미노산 서열은 예를 들어 PCT 공개된 출원 WO 97/25,068 및 미국특허 제 6,083,502 호 및 미국특허 제 6,153,430 호에 나열되어 있다. 또한 문헌[Chang, K. & Pastan, I., Int. J. Cancer 57:90 (1994)]; 문헌[Chang, K. & Pastan, I., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 93:136 (1996)]; 문헌[Brinkmann U., et al., Int. J. Cancer 71:638 (1997)]; 문헌[Chowdhury, P.S., et al., Mol. Immunol. 34:9 (1997)] 및 미국특허 제 6,809,184 호를 참조하시오. 메소텔린은 대략 69 kDa의 전구체 단백질로서 발현되며, 이어서 상기 발명의 배경에 개시된 40 kDa 글리코실포스파티딜이노시톨 결합된 세포 표면 당단백질을 세포 표면에 부착된 채로 남기면서, 30 kDa 단백질을 방출하도록 프로세싱된다. 상기 40 kDa 당단백질이 본 발명에서 "메소텔린"이란 용어에 의해 지칭되는 것이다. 메소텔린의 핵산 및 아미노산 서열들이 여러 종들, 예를 들어 인간(NM_005823.4→NP_005814.2; 및 NM_013404.3→NP_037536.2), 마우스(NM_018857.1→NP_061345.1), 래트(NM_031658.1→NP_113846.1), 소(NM_001100374.1→NP_001093844)로부터 기록되었다.
참조의 편의를 위해서, 본 발명에 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 전체(때때로 본 발명에서 "완전한"으로서 지칭된다) 항체, 항원 인식 및 결합 능력을 보유하는 항체 단편, 전체 항체의 변형에 의해 생성되었든지 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 데노보 합성되었든지 간에, 단클론 항체, 다클론 항체, 및 항체 유사물질을 포함한다. 상기 항체는 IgM, IgG(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgD, IgA 또는 IgE일 수 있다.
IgG 하위부류의 불변 영역들의 서열은 수년간 당해 분야에 널리 공지되어 왔다(예를 들어 문헌[Honjo et al., Cell, 18:559-68 (1979)]; 문헌[Tucker et al., Science, 206:1303-6 (1979)]; 문헌[Yamawaki et al., Nature 283:786-9 (1980)]; 문헌[Ellison et al., Nucl Acids Res 10:4071-9 (1982)]; 문헌[Ellison et al., DNA 1:11-8 (1981)]; 문헌[Ellison and Hood, Proc Natl Acad Sci USA 79:1984-8 (1982)]). 상기 가변 영역의 CDR은 항체 특이성을 결정하기 때문에, 표적 세포 표면 항원에 대한 항체의 CDR 또는 Fv을 선택 항체 내로 이식하거나 조작하여 상기 항체상에 상기 표적 세포 표면 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 표면 항원에 대한 항체의 CDR을 공지된 3차원 구조의 인간 항체 프레임워크상에 이식시켜(예를 들어 WO98/45322; WO 87/02671; 미국특허 제 5,859,205 호; 미국특허 제 5,585,089 호; 및 미국특허 제 4,816,567 호; EP 특허 출원 0173494; 문헌[Jones, et al. Nature 321:522 (1986)]; 문헌[Verhoeyen, et al., Science 239:1534 (1988)], 문헌[Riechmann, et al. Nature 332:323 (1988)]; 및 문헌[Winter & Milstein, Nature 349:293 (1991)]을 참조하시오), 인간에게 투여 시 면역원 반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않는 항체를 형성시킬 수 있다. 한편으로, 상기 항체의 불변 영역을, 인간에서 전형적으로 발견되는 잔기로 마우스와 같은 비-인간 동물에서 발견되는 잔기를 대체함으로써 조작할 수 있다. 이렇게 조작된 항체를 "인간화된 항체"라 칭하며, 상기 항체는 부작용을 유발할 위험성이 낮고 보다 오래 순환을 유지할 수 있으므로 바람직하다. 항체 인간화 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 미국특허 제 6,180,377 호; 미국특허 제 6,407,213 호; 미국특허 제 5,693,762 호; 미국특허 제 5,585,089 호; 및 미국특허 제 5,530,101 호에 나열되어 있다.
"항체 단편"이란 용어는 완전한 항체의 일부, 일반적으로 상기 완전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하는 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단일 도메인 항체(예를 들어 문헌[Wesolowski, Med Microbiol Immunol. (2009) 198(3):157-74]; 문헌[Saerens, et al., Curr Opin Pharmacol. (2008) 8(5):600-8]; 문헌[Harmsen and de Haard, Appl Microbiol Biotechnol. (2007) 77(1):13-22]을 참조하시오); 나선-안정화된 항체(예를 들어 문헌[Arndt et al., J Mol Biol 312:221-228 (2001)]을 참조하시오); 다이아바디(하기를 참조하시오); 단일-쇄 항체 분자("scFv," 예를 들어 미국특허 제 5,888,773 호를 참조하시오); 다이설파이드 안정화된 항체("dsFv", 예를 들어 미국특허 제 5,747,654 호 및 미국특허 제 6,558,672 호를 참조하시오), 및 도메인 항체("dAb," 예를 들어 문헌[Holt et al., Trends Biotech 21(11):484-490 (2003)], 문헌[Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521-526 (1997)], 문헌[Lauwereys et al., EMBO J 17:3512-3520 (1998)], 문헌[Reiter et al., J. Mol. Biol. 290:685-698 (1999)], 문헌[Davies and Riechmann, Biotechnology, 13:475-479 (2001)]을 참조하시오)를 포함한다.
"다이아바디"란 용어는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄(VH-VL) 중에 가변 경 도메인("VL" 또는 "VL")에 연결된 가변 중 도메인("VH" 또는 "VH")을 포함한다. 상기 동일한 쇄 상의 2 개의 도메인 간의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인들을 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 짝짓게 하고 2 개의 항원-결합 부위를 생성시킨다. 다이아바디 및 그의 제조는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 개시되어 있다.
"모 항체"란 용어는, 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하지만 보다 높은 친화성으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 수득하기 위해서 돌연변이되거나 변화되어야 하는 임의의 관심 항체를 의미한다.
"표적화 부분"은 면역접합체를 관심 세포에 표적화하도록 의도된 상기 면역접합체의 부분이다. 전형적으로, 상기 표적화 부분은 항체, 또는 항원 인식 능력을 유지하는 항체의 단편, 예를 들어 scFv, dsFv, Fab 또는 F(ab')2이다.
"독성 부분"은 면역독소를 관심 세포에 대해 세포독성으로 만드는 상기 면역독소의 부분이다. 본 발명의 주제인 면역독소에 관하여, 상기 독성 부분은 슈도모나스 외독소 A이며 이는 하기에 일부 상세히 개시하는 바와 같이, 그의 비특이적 세포독성을 감소시키기 위해 변형/돌연변이되었다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 갖는다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역과 가변 영역을 함유한다(상기 영역들은 또한 "도메인"으로서 공지되어 있다). 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3 개의 초가변 영역(또한 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"이라 지칭된다)에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. 상기 프레임워크 영역 및 CDR의 정도는 한정되어 있다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종들 내에 비교적 보존되어 있다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역은 상기 CDR을 3차원 공간 내에 배치하고 정렬시키는 작용을 한다.
상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 맡고 있다. 각 쇄의 CDR들을 전형적으로는 CDR1, CDR2 및 CDR3이라 칭하며, N-말단으로부터 순차적으로 출발하여 번호를 매기고, 또한 전형적으로는 특정 CDR이 배치되는 쇄에 의해 확인된다. 따라서, VH CDR3은 상기가 발견되는 항체의 중쇄의 가변 도메인 중에 배치되는 반면, VL CDR1은 상기가 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인으로부터의 CDR1이다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하여, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하여, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv"란 어구는 전통적인 2 쇄 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들이 결합하여 하나의 쇄를 형성하는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 링커 펩타이드가 상기 두 쇄 사이에 삽입되어 적합한 폴딩 및 활성 결합 부위의 생성을 허용한다.
"다이설파이드 결합" 또는 "시스테인-시스테인 다이설파이드 결합"이란 어구는 상기 시스테인의 황 원자들이 산화되어 다이설파이드 결합을 형성하는 2 개의 시스테인 간의 공유적인 상호작용을 지칭한다. 다이설파이드 결합의 평균 결합 에너지는 수소 결합의 1 내지 2 kcal/mol에 비해 약 60 kcal/mol이다.
"다이설파이드 안정화된 Fv" 또는 "dsFv"란 어구는 경쇄와 중쇄 사이에 다이설파이드 결합이 존재하는 면역글로불린의 가변 영역을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 상기 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인은 항체 쇄의 프레임워크 영역 내에 있으며 상기 항체의 형태를 안정화시키는 작용을 한다. 전형적으로, 상기 항체는 치환이 항원 결합을 방해하지 않는 위치에서 상기 프레임워크 영역 중에 시스테인을 도입하도록 조작된다.
"링커 펩타이드"란 용어는 중쇄의 가변 도메인을 경쇄의 가변 도메인에 간접적으로 결합시키는 작용을 하는 항체 결합 단편(예를 들어 Fv 단편) 내의 펩타이드에 대한 언급을 포함한다.
"핫 스팟"이란 용어는 특별히 높은 천연 변이의 부위인 가변 도메인의 프레임워크 영역 또는 CDR의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 의미한다. CDR은 자체가 초가변성 영역인 것으로 간주되지만, 상기 CDR 전체를 통해 돌연변이가 고르게 분포되지 않음을 알고 있다. 특정 부위, 또는 핫 스팟은 집중된 돌연변이를 겪는 이들 위치로서 확인되었다. 상기 핫 스팟은 다수의 구조적 특징 및 서열을 특징으로 한다. 상기 "핫 스팟 동기"를 사용하여 핫 스팟을 확인할 수 있다. 특히 잘 특성화된 2 개의 공통서열 동기는 테트라뉴클레오타이드 서열 RGYW 및 세린 서열 AGY이며, 이때 R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이다.
특정 항원과 면역학적으로 반응성인 항체를 재조합 방법, 예를 들어 파지 또는 유사한 벡터 중의 재조합 항체 라이브러리의 선택(예를 들어 문헌[Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)]; 문헌[Ward, et al., Nature 341:544-546 (1989)]; 및 문헌[Vaughan, et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996)])에 의해서 또는 동물을 항원 또는 상기 항원을 암호화하는 DNA로 면역시킴으로써 생성시킬 수 있다.
"효과기 부분"이란 용어는 표적화 부분에 의해 표적화된 세포에 대해 영향을 미치도록 의도되거나 또는 면역접합체의 존재를 확인하도록 의도된 상기 면역접합체의 부분을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 상기 효과기 부분은 변형되거나 또는 돌연변이된 슈도모나스 외독소 A이다.
"면역접합체"란 용어는 항체에 대한 효과기 분자의 공유 결합에 대한 언급을 포함한다.
"유효량" 또는 "에 유효한 양" 또는 "치료 유효량"이란 용어들은 목적하는 결과를 생성시키기에, 예를 들어 세포 단백질 합성을 50% 이상까지 억제하거나 또는 상기 세포를 살해하기에 충분한 치료제의 투여량에 대한 언급을 포함한다.
본 발명과 관련하여, 상기 독소는 돌연변이된 슈도모나스 외독소 A이다.
"접촉하는"이란 용어는 직접적인 물리적 회합의 배치에 대한 언급을 포함한다.
"발현 플라스미드"는 프로모터에 작동적으로 결합되는 관심 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 호환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체에 대한 언급을 포함한다. 상기 용어들을 천연 아미노산 중합체들뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체들에 적용한다. 상기 용어들을 또한 단백질이 작용성으로 남아있도록 보존적인 아미노산 치환을 함유하는 상기 중합체들에 적용한다.
"잔기" 또는 "아미노산 잔기" 또는 "아미노산"이란 용어는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드(집합적으로 "펩타이드")로 통합되는 아미노산에 대한 언급을 포함한다. 상기 아미노산은 천연 아미노산일 수 있으며, 달리 제한되지 않는 한, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 작용할 수 있는 천연 아미노산의 공지된 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 지칭되는 아미노산 및 유사체를 표 A에서 하기와 같은 속기 명칭에 의해 개시한다:
[표 A]
아미노산 명명법
명칭 3-글자 1-글자
____________________________________________________________
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라진 Asn N
아스파트산 Asp D
시스테인 Cys C
글루탐산 Glu E
글루타민 Gln Q
글리신 Gly G
히스티딘 His H
호모세린 Hse -
아이소류신 Ile I
류신 Leu L
리신 Lys K
메티오닌 Met M
메티오닌 설폭사이드 Met (O) -
메티오닌
메틸설포늄 Met (S-Me) -
노르류신 Nle -
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
쓰레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
타이로신 Tyr Y
발린 Val V
"보존적인 치환"은, 단백질을 기술할 때, 상기 단백질의 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 상기 단백질의 아미노산 조성의 변화를 지칭한다. 따라서, 특정 아미노산 서열의 "보존적으로 변형된 변화"는 단백질 활성에 중요하지 않은 상기 아미노산의 아미노산 치환, 또는 심지어 중요한 아미노산의 치환이 활성을 실질적으로 변경시키지 않도록 유사한 성질들(예를 들어 산성, 염기성, 양 또는 음으로 하전된, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 지칭한다. 작용적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적인 치환 표는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 하기 표 B의 여섯 개의 군들은 각각 서로에 대해 보존적인 치환인 아미노산들을 함유한다:
[표 B]
1) 알라닌(A), 세린(S), 쓰레오닌(T);
2) 아스파트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라진(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W).
또한 문헌[Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Company, New York (2nd Ed., 1992)]을 참조하시오.
"접합하는", "결합하는", "결합" 또는 "연결"이란 용어들은 2 개의 폴리펩타이드를 하나의 연속적인 폴리펩타이드 분자로 만드는 것을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 상기 용어들은 항체 부분을 효과기 분자(EM)에 결합시킴에 대한 언급을 포함한다. 상기 결합은 화학적 또는 재조합적 수단에 의한 것일 수 있다. 화학적 수단은 하나의 분자를 형성시키기 위해 상기 항체 부분과 상기 효과기 분자 간에 형성된 공유 결합이 존재하도록 하는 상기 두 분자 간의 반응을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "재조합체"는 고유 상태에서 단백질을 발현할 수 있는 DNA의 내생적인 사본을 갖지 않는 세포를 사용하여 생성시킨 단백질에 대한 언급을 포함한다. 상기 세포는 적합한 단리된 핵산 서열의 도입에 의해 유전적으로 변경되었기 때문에 상기 재조합 단백질을 생성시킨다. 상기 용어는 또한 이종 핵산의 도입에 의해서 또는 고유 핵산의 변경에 의해서 상기 세포에 고유하지 않은 형태로 변형되었거나, 또는 상기 세포가 상기와 같이 변형된 세포로부터 유래되는, 세포 또는 핵산 또는 벡터에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 고유(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 상기 고유 형태 내에서 발견되는 유전자의 돌연변이체를 발현하거나, 또는 발현 하에서 달리 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않은 고유 유전자를 발현한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 서열"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체에 대한 언급을 포함하며, 달리 제한되지 않는 한 천연 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 핵산에 하이브리드화하는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체들을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 그의 상보성 서열뿐만 아니라 보존적인 변체, 즉 단백질로 번역 시, 아미노산의 보존적인 치환을 생성시키는 코돈 및 변체의 불안정한 위치에 존재하는 핵산을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 명시된 핵산에 관하여 "암호화하는"은 명시된 단백질로의 번역에 대한 정보를 포함하는 핵산에 대한 언급을 포함한다. 상기 정보는 코돈의 사용에 의해 명시된다. 전형적으로, 아미노산 서열은 "국제" 유전자 암호를 사용하여 핵산에 의해 암호화된다. 그러나, 일부 식물, 동물 및 진균 미토콘드리아, 세균 마이코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum)(문헌[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:2306-2309 (1985)]), 또는 섬모충 마크로뉴클레우스(Macronucleus) 중에 존재하는 바와 같은 상기 국제 암호의 변형들을, 상기 핵산이 이들 유기체의 번역 기구를 사용하여 발현되는 경우 사용할 수 있다.
"인프레임 융합하는"이란 어구는 결합된 핵산 서열이 원래 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 단일 쇄 단백질("융합 단백질")로 번역되도록 폴리펩타이드를 암호화하는 2 개 이상의 핵산 서열들을 결합시킴을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "발현된"은 핵산의 단백질로의 번역에 대한 언급을 포함한다. 단백질들은 세포 내 발현되어 유지되거나, 세포 표면막의 성분이 되거나, 또는 세포외 기질 또는 배지 내로 분비될 수 있다.
"숙주 세포"는 상기 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지할 수 있는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 또는 진핵생물 세포, 예를 들어 효모, 곤충, 양서류 또는 포유동물 세포일 수 있다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "일치하는" 또는 "일치" 퍼센트란 용어는 하기의 서열 비교 연산들 중 하나를 사용하거나 또는 가시적인 검사에 의해 측정되는 바와 같이, 비교 및 최대로 상응하게 정렬시, 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 명시된 백분율을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.
2 개의 핵산 또는 폴리펩타이드와 관련하여 "실질적으로 일치하는"이란 어구는 하기의 서열 비교 연산들 중 하나를 사용하거나 또는 가시적인 검사에 의해 측정되는 바와 같이, 비교 및 최대로 상응하게 정렬시, 60% 이상, 보다 바람직하게는 65% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 70% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 75% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 80% 이상, 및 가장 바람직하게는 90 내지 95%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 일치성을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 실질적인 일치성은 약 50 개 잔기 이상의 길이의 서열 범위에 걸쳐, 보다 바람직하게는 약 100 개 잔기 이상의 범위에 걸쳐 존재하며, 가장 바람직하게는 상기 서열들은 약 150 개 잔기 이상의 범위에 걸쳐 실질적으로 일치한다. 가장 바람직한 실시태양에서, 상기 서열들은 비교 펩타이드 또는 암호화 영역의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 일치한다.
서열 비교를 위해서, 전형적으로는 하나의 서열은 기준 서열로서 작용하며, 상기 기준 서열에 대해 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 연산을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 후속 좌표를 지정하고, 서열 연산 프로그램 매개변수를 지정한다. 이어서 상기 서열 비교 연산은 상기 지정된 프로그램 매개변수를 기준으로, 상기 기준 서열에 대한 상기 시험 서열(들)의 서열 일치성 퍼센트를 계산한다.
비교를 위한 서열들의 최적의 정렬을, 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 연산에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 연산에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 탐색 방법에 의해, 이들 연산의 컴퓨터 처리된 실행에 의해(더 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지, 제네틱스 컴퓨터 그룹(the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group)(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 가시적인 검사(일반적으로 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)]을 참조하시오)에 의해 수행할 수 있다.
서열 일치성 퍼센트 및 서열 유사성의 측정에 적합한 연산들의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 연산이며, 이들 연산은 각각 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 문헌[Altschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 개시되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))를 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 상기 연산은 먼저, 데이터베이스 서열 중 동일한 길이의 단어와 정렬 시 일부 양의 값의 한계 점수 T와 합치되거나 이를 충족하는 조회 서열 중 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고득점 서열 쌍(HSP)을 확인함을 포함한다. T는 이웃하는 단어 점수 한계로서 지칭된다(상기 문헌[Altschul et al.]). 상기 초기 이웃 단어 적중은 상기 단어들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 연구를 개시시키는 시드로서 작용한다. 이어서 상기 단어 적중을 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 많이 각 서열에 따라 양쪽방향으로 연장시킨다. 누적 점수를, 뉴클레오타이드 서열의 경우, 매개변수 M(합치하는 잔기들의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(합치하지 않는 잔기들에 대한 벌점; 항상 <0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열들의 경우, 득점 행렬을 사용하여 상기 누적 점수를 계산한다. 각 방향에서 단어 적중의 연장은 상기 누적 정렬 점수가 그의 최대로 성취된 값으로부터 양 X만큼 떨어질 때; 상기 누적 점수가 하나 이상의 음의 득점 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 갈 때; 또는 상기 중 어느 한 서열의 끝에 도달할 때 멈춘다. 상기 BLAST 연산 매개변수 W, T 및 X는 상기 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. 상기 BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어길이(W), 10의 기대값(E), M = 5, N = -4, 및 상기 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, 상기 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이(W), 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 득점 행렬을 사용한다(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)]을 참조하시오).
서열 일치성 퍼센트를 계산하는 것 외에, 상기 BLAST 연산은 또한 2 개 서열 간의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)]을 참조하시오). 상기 BLAST 연산에 의해 제공된 유사성의 한 가지 척도는 최소 합 확률(P(N))이며, 이는 2 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들 간의 합치가 우연히 발생하게 되는 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 시험 핵산을 기준 핵산에 비교 시 상기 최소 합 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2 개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 일치한다는 추가의 표시는 하기에 개시되는 바와 같이, 첫 번째 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 두 번째 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 하나의 폴리펩타이드는, 예를 들어 2 개의 펩타이드가 단지 보존적인 치환에 의해서만 상이한 경우, 전형적으로는 제 2 폴리펩타이드와 실질적으로 일치한다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 일치한다는 또 다른 표시는 2 개의 분자가 하기에 개시되는 바와 같이, 엄격한 조건 하에서 서로 하이브리드화한다는 것이다.
"생체 내"란 용어는 세포가 수득된 유기체의 몸 내부에 대한 언급을 포함한다. "생체 외" 및 "시험관 내"는 세포가 수득된 유기체의 몸 밖을 의미한다.
"악성 세포" 또는 "악성"이란 어구는 침습성이고/이거나 전이를 겪을 수 있는 종양 또는 종양 세포, 즉 암세포를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "포유동물 세포"는 인간, 래트, 마우스, 기니 피그, 침팬지, 또는 짧은꼬리 원숭이를 포함한 포유동물로부터 유래하는 세포에 대한 언급을 포함한다. 상기 세포를 생체 내에서 또는 시험관 내에서 배양할 수 있다.
항원에 관하여, "선택적으로 반응성"이란 용어는 상기 항원을 갖는 세포 또는 조직과, 상기 항원이 결여된 세포 또는 조직과는 아닌, 전체 또는 부분으로 항체와의 우선적인 회합을 지칭한다. 물론, 어느 정도의 비특이적인 상호작용이 분자와 비-표적 세포 또는 조직 간에 발생할 수도 있음은 인정된다. 그럼에도 불구하고, 선택적인 반응성은 상기 항원의 특이적인 인식을 통해 매개되므로 구분될 수 있다. 선택적으로 반응성인 항체는 항원에 결합하지만, 낮은 친화성으로 결합할 수도 있다. 다른 한편으로, 특이적인 결합은 상기 결합된 항체와 상기 항원이 결여된 세포 사이보다 상기 항체와 상기 항원을 갖는 세포 사이에 훨씬 더 강한 회합을 생성시킨다. 특이적인 결합은 전형적으로, 상기 표적 항원이 결여된 세포 또는 조직에 비해, 상기 표적 항원을 갖는 세포 또는 조직에 결합된 항체 량(단위 시간당)의 5 배 초과, 보다 바람직하게는 10 배 초과 및 가장 바람직하게는 100 배 초과의 증가를 생성시킨다. 상기와 같은 조건 하에서 단백질에의 특이적인 결합은 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 대해서 선택되는 항체를 필요로 한다. 다양한 면역분석 포맷들이 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하는데 적합하다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역분석은 단백질과 특이적으로 면역반응성인 단클론 항체를 선택하는데 통상적으로 사용된다. 특이적인 면역반응성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 면역분석 포맷 및 조건에 대한 설명에 대해서 문헌[Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)]을 참조하시오.
"면역학적으로 반응성인 조건"이란 용어는 특정 에피토프에 대해 발생된 항체가 상기 에피토프에, 실질적으로 모든 다른 에피토프에 대한 결합보다 검출 가능하게 더 큰 정도로 및/또는 상기 결합을 실질적으로 제외하도록 할 만큼 결합할 수 있게 하는 조건에 대한 언급을 포함한다. 면역학적으로 반응성인 조건은 상기 항체 결합 반응의 포맷에 따라 변하며, 전형적으로는 면역분석 프로토콜에 사용되는 것들 또는 생체 내에서 접하게 되는 조건들이다. 면역분석 포맷 및 조건에 대한 설명에 대해서 상기 문헌[Harlow & Lane]을 참조하시오. 바람직하게는, 본 발명의 방법들에 사용되는 면역학적으로 반응성인 조건은 살아있는 포유동물 또는 포유동물 세포 내부의 전형적인 조건들(예를 들어 온도, 오스몰 농도, pH)에 대한 언급을 포함하는 "생리학적 조건"이다. 일부 기관들에 심한 조건이 가해지는 것은 인정되지만, 기관-내 및 세포내 환경은 통상적으로 pH 7 주변(즉 pH 6.0 내지 pH 8.0, 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5)에 있으며, 우세한 용매로서 물을 함유하고, 0 ℃ 이상 50 ℃ 이하의 온도에서 존재한다. 오스몰 농도는 세포 생육성 및 증식에 협력적인 범위 내에 있다.
"환자", "피실험자", "개인"이란 용어들은 호환적으로 포유동물, 예를 들어 인간 또는 비-인간 영장류, 반려 포유동물(예를 들어 개 또는 고양이), 가축(예를 들어 소, 돼지, 양, 말), 실험용 포유동물(마우스, 래트, 햄스터, 토끼)을 지칭한다.
"공-투여한다"란 용어는 개인의 혈액 중에 2 개의 활성제의 동시적인 존재를 지칭한다. 공-투여되는 활성제는 동시에 또는 연속적으로 전달될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치료하는" 및 "치료"란 용어들은 질병 또는 상기 용어가 적용되는 상태, 또는 상기와 같은 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상의 개시를 지연하거나, 진행을 늦추거나 역전시키거나, 또는 완화시키거나 예방함을 지칭한다.
종양 또는 암 성장 또는 진행에 관하여 "억제하는", "감소시키는", "줄이는"이란 용어들은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정 가능한 양까지 환자의 종양 또는 암의 성장, 확산, 전이를 억제시킴을 지칭한다. 종양 또는 암의 성장, 진행 또는 확산은, 상기 종양 크기가 예를 들어 키메릭 분자의 부분으로서 본 발명의 PE의 공-투여 전 종양 크기에 비해 약 10%, 20%, 30%, 50%, 80% 또는 100% 이상 감소하는 경우 억제되거나, 감소되거나 줄어든다. 일부 실시태양에서, 종양 또는 암의 성장, 진행 또는 확산은 상기 PE 투여 전 종양 크기에 비해 약 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 이상까지 억제되거나, 감소되거나 줄어든다.
재조합 면역독소의 성분
A. 퓨린 절단 부위(FCS)
퓨린 절단 부위는 퓨린에 의해 절단 가능한 임의의 폴리펩타이드 부위일 수 있다. 듀커트(Duckert) 등(문헌[Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection 17(1):107-112 (2004)])(이후에, "듀커트 등"이라 칭하며, 상기 문헌은 내용 전체가, 특히 상기 문헌이 개시하는 퓨린 절단 가능한 서열 및 동기에 관하여 본 발명에 참고로 인용된다)에 의해 보고된 바와 같이, 퓨린은 "서브스틸리신/켁신-유사 프로단백질 전환효소라 지칭되는 진화상 보존된 이염기- 및 일염기-특이적 CA2+-의존성 세린 프로테아제 계열"의 효소이다(상기 문헌, 107 페이지). "짝을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소" 또는 "PACE"로서 또한 공지된 퓨린은 상기 계열의 7 개의 포유동물 구성원 중 하나이며, 다수의 내생적인 인간 단백질의 프로세싱에 관여한다. 일반적으로, 예를 들어 문헌[Thomas G, Nat Rev Mol Cell Biol, (10):753 66 (2002)]을 참조하시오. 상기 퓨린은 트랜스-골지 망상조직에서 주로 발견되는 막-결합된 단백질이다. 인간 퓨린의 서열은 1990년대 초 이래로 공지되었다. 예를 들어 문헌[Hatsuzawa, K. et al., J. Biol Chem., 267:16094-16099 (1992)]; 문헌[Molloy, S. et al., J. Biol. Chem., 267:16396-16402 (1992)]을 참조하시오.
최소 절단 부위는 전형적으로 아미노산 잔기에 대한 단일 문자 암호로 R-X-X-R이며, 이때 상기 두 번째 "R" 뒤에서 절단이 발생한다. 듀커트 등은 포유동물 단백질, 병원성 세균의 단백질, 및 바이러스 단백질을 포함하여, 퓨린 절단 부위를 갖는, 상기 문헌에 보고된 38 개의 단백질의 서열에 대해 입수할 수 있는 정보를 요약한다. 상기 문헌은 상기 고찰된 절단 동기의 31 또는 81%가 R-X-[R/K]-R 공통 서열을 가지며, 이 중 11 또는 29%는 R-X-R-R을 갖고, 20 또는 52%는 R-X-K-R임을 보고한다. 상기 절단 동기들 중 3 개는 오직 최소 절단 서열만을 함유하였다. 듀커트 등은 상기 동기들을 추가로 정렬시켰으며 상기 절단 동기 자체 및 주변 잔기들에서 각각의 퓨린의 각각의 위치에서 발견되는 잔기들을 확인하였다. 듀커트 등의 도 1A는 각각의 위치에서 가장 흔하게 발견되는 잔기들을 상대적인 크기에 의해 나타낸다. 규약에 의해, 상기 퓨린 절단 부위를 둘러싸는 잔기들을 절단되기 쉬운 결합(이를 전형적으로는 기호 "↓"에 의해 나타낸다)으로부터 번호를 매긴다. N 말단쪽으로 세어, 기질 잔기를 P1, P2 등으로 나타내는 반면, C-말단쪽으로 세어, 상기 잔기들을 P1', P2' 등으로 나타낸다. 예를 들어 문헌[Rockwell, N. C., and J. W. Thorner, Trends Biochem. Sci., 29:80-87 (2004)]; 문헌[Thomas G., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 3:753-766 (2002)]을 참조하시오. 따라서, 상기 규약에 따라, 하기의 서열을 상기 최소 절단 서열의 잔기 및 주변 잔기들을 정렬시키고 번호를 매기는데 사용할 수 있다:
P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5',
상기에서 최소 퓨린 절단 서열을 P4-P1으로서 번호를 매긴다. 퓨린에 의해 절단된 38 개 서열의 듀커트 등의 정렬은 다양한 위치들에서 존재하는 잔기들에 따라 허용되는 변이들을 밝혀내었다. 예를 들어, P4의 잔기가 R이 아닌 경우, 이를 P2 및 P6에 아르기닌 또는 리신 잔기를 갖게 함으로써 보상할 수 있다(상기 문헌, p.109).
고유 PE에서, 퓨린 절단은 상기 독소의 도메인 II 중에 배치된 아르기닌-풍부 고리에서 아르기닌 279와 글리신 280 사이에서 발생한다. PE의 도메인 II 중의 고유 퓨린 절단 서열을 하기에 열거하며(이때 번호들은 613-아미노산 고유 PE 서열 중 잔기들의 위치를 가리킨다), 상기에 나타낸 규약 하의 그의 넘버링을 나타내도록 정렬시킨다:
274- R H R Q P R G W E Q L -284 (서열번호 17)
P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5;
본 발명에 기초가 되는 연구들에서, P3 및 P2에서 치환이 이루어져 하기의 서열을 형성하며, 이때 치환은 밑줄을 그었다:
274- R H R S K R G W E Q L -284(서열번호 29)
상기 서열은 고유 서열의 경우보다 더 빠른 절단 속도를 나타내었으며, 표본 면역독소에 사용 시 상기 고유 서열의 경우와 대략적으로 동일한 표적 세포에 대한 세포독성을 생성시켰다.
상기 및 본 발명자들의 선행 연구들을 기초로, PE 도메인 III에 상기 표적화 분자를 부착시키기 위해 사용된 퓨린 절단 서열은 최소 퓨린 절단 서열, R-X-X-R, 또는 당해 분야에 공지되거나 듀커트 등의 도 1A에 의해 허용된 다른 퓨린 절단 서열들 중 임의의 것일 수 있으나, 단 P2'로서 나타낸 위치에 존재하는 잔기가 있는 경우, 이는 트립토판이어야 하거나, 또는 트립토판이 아닌 경우, 발린 또는 알라닌이어서는 안 된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 서열은 RKKR(서열번호 30), RRRR(서열번호 31), RKAR(서열번호 32), SRVARS(서열번호 33), TSSRKRRFW(서열번호 34), 또는 ASRRKARSW(서열번호 35)일 수 있다.
듀커트 등에 나타낸 바와 같이, P2, P4 및 P6에서의 3 개 잔기 중 2 개 이상이 염기성이도록, 위치 P4가 위치 P2 및 P6에서의 아르기닌 또는 리신 잔기에 의해 보상되는 경우, R(주로 발린)보다 덜 유리한 잔기가 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 퓨린 절단 가능한 서열은 RRVKKRFW(서열번호 36), RNVVRRDW(서열번호 37), 또는 TRAVRRRSW(서열번호 38)이다. P1 위치에서의 잔기는 고유 서열 중에 존재하는 아르기닌이거나 또는 리신일 수 있다. 따라서, 리신은, 예를 들어 상기 나타낸 임의의 서열들 중 P1 위치에서 아르기닌을 대체할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 퓨린 절단 가능한 서열의 서열은, 상기 서열이 최소 퓨린 절단 서열을 함유하고 퓨린에 의해 절단될 수 있는 한, PE의 퓨린 절단 서열: R-H-R-Q-P-R-G-W-E-Q-L(서열번호 15) 또는 고유 서열의 절두된 변형의 서열에 따른다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 퓨린 절단 가능한 서열은 R-Q-P-R(서열번호 39), R-H-R-Q-P-R-G-W(서열번호 40), R-H-R-Q-P-R-G-W-E(서열번호 41), H-R-Q-P-R-G-W-E-Q(서열번호 42), 또는 R-Q-P-R-G-W-E(서열번호 43)일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 서열은 최소 퓨린 절단 서열을 함유하고 퓨린에 의해 절단될 수 있는 한, R-H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L(서열번호 29) 또는 상기 서열의 절두된 변형이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 퓨린 절단 가능한 서열은 R-S-K-R(서열번호 44), R-H-R-S-K-R-G-W(서열번호 45), H-R-S-K-R-G-W-E(서열번호 46), R-S-K-R-G-W-E-Q-L(서열번호 47), H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L(서열번호 48), 또는 R-H-R-S-K-R(서열번호 49)일 수 있다. 임의의 특정한 퓨린 절단 가능한 서열을 SS1-LR에 사용된 항체에 의해 면역독소로 만들고 생성되는 면역독소를 시험관 내에서 메소텔린+ 세포주 상에서 시험함으로써 상기 서열을 쉽게 시험할 수 있다.
임의의 특정 서열이 퓨린에 의해 절단될 수 있는지의 여부를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 서열이 퓨린에 의해 절단될 수 있는지의 여부를, 상기 서열을 퓨린 완충제(0.2 M NaOAc(pH 5.5), 5 mM CaCl2) 중에서 퓨린과 25 ℃에서 16 시간 동안 1:10의 효소:기질 몰비로 배양함으로써 시험할 수 있다. 이러한 조건은 앞서 PE의 퓨린 절단에 최적인 것으로서 확립되었다. 바람직하게는, 상기 사용된 퓨린은 인간 퓨린이다. 재조합 절두된 인간 퓨린을 예를 들어 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(미국 메릴랜드주 베벌리 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 또한 문헌[Bravo et al., J Biol Chem, 269(14):25830-25837 (1994)]을 참조하시오. 적합한 FCS는 또한 PCT 특허 공보 제 WO 2009/032954 호(2009년 3월 12일자로 공개됨)에 교시되어 있으며, 상기 공보는 특히 상기 공보 중에 개시된 퓨린 절단 서열에 대해 본 발명에 참고로 인용된다.
B. 작용성 도메인 III
구조적으로, 도메인 Ib는 잔기 365 내지 399를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에서 추가로 논의되는 바와 같이, PE의 도메인 III의 구조적 경계가 405 잔기에서 출발하는 것으로 간주되는 반면, 작용성 분석은 도메인 III이 ADP-리보실화 활성을 유지하기 위해서 구조적 도메인 Ib의 분절을 필요로 함을 입증하였다. 따라서, 상기 작용성 도메인 III은 PE의 잔기 395 내지 613으로서 한정되며, 따라서 본 발명의 독소는 PE의 잔기 395 내지 613을 포함하는 것이 바람직하고, 이때 일부 허용되는 변화들을 하기에 추가로 개시한다. 상기 퓨린 절단 서열 중의 잔기들 이외에 잔기 365 내지 394의 결실은, 상기 결실이 상기 PE 분자의 상기 부분 중에 존재하는 임의의 면역원성 에피토프들을 제거하므로 바람직하다. 본 발명의 PE에서, 퓨린 절단 서열, 또는 절두되거나 변형된 그의 변체들이 그의 카복실 단부에서, 글리신 및 세린 중에서 독립적으로 선택된 3 내지 8 개 아미노산의 2 개의 가요성 링커 사이에 삽입된 도메인 III에 부착된다.
바람직한 실시태양에서, 상기 PE 분자의 작용성 도메인을 도메인 III 내의 위치 D406 및 Q592에 통상적으로 존재하는 아미노산 잔기들 대신에 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민의 치환을 갖도록 변형시킨다. 위치 D406 및 Q592에서의 치환을 도메인 III 내의 위치 R432, R467, R490, R513, E548 및 K590에서의 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민의 치환과 겸할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 또한, D403, R412, R427, E431, R458, D461, R505, E522, R538, R551, R576 및 L597 중에서 선택된 위치에서의 아미노산 잔기에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 알라닌, 글리신, 세린 또는 글루타민으로 치환시킨다. 도메인 III 내의 치환 위치들에서의 잔기들에 대한 치환은 도메인 III의 아미노산 잔기 위치 D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 및 Q592에 상응한다. 일부 실시태양에서, 상기 PE 작용성 도메인 III은 SS1-LR/GGS/8M의 PE 작용성 도메인의 아미노산 서열에 실질적으로 일치하거나 또는 일치한다. 일부 실시태양에서, 상기 PE 작용성 도메인 III은 SS1-LR/GGS/8M의 PE 작용성 도메인의 아미노산 서열에 실질적으로 일치하거나 또는 일치한다.
고유 PE 및 상기 논의된 변체들의 서열은 보존적인 치환을 가질 수 있으며 세포독성 능력, 및 바람직하게는 PE의 고유 서열에 비해 감소된 항원성을 유지할 수 있는 것으로 생각된다. 바람직한 실시태양에서, PE의 변형된 변체 또는 그의 세포독성 단편은 상기 관심 PE 작용성 도메인 III, SS1-LR/GGS/8M의 상기 도메인 또는 SS1-LR/GGS/8M과, 아미노산 수준으로 80% 이상의 서열 유사성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 유사성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 유사성, 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 유사성을 갖는다. 2011년 3월 17일자로 공개되고 2010년 9월 10일자로 출원된 PCT/US2010/048504에 상응하는 PCT 공보 제 WO/2011/032022 호는 PE의 작용성 도메인 II의 항원성을 감소시키는 적합한 돌연변이들을 개시한다. 상기 공개된 출원은 작용성 도메인 III의 감소된 면역원성을 제공하는, 상기 출원 중에 개시된 돌연변이 및 치환 및 분자에 대해서 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
"보존적으로 변형된 변체"란 용어를 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용한다. 특정한 핵산 서열에 관하여, 보존적으로 변형된 변체는 동일하거나 또는 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 필수적으로 동일한 핵산 서열을 지칭한다. 상기 유전자 암호의 퇴화로 인해, 다수의 작용적으로 동일한 핵산들이 임의의 주어진 폴리펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 명시되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 암호화된 폴리펩타이드의 변경 없이 개시된 상응하는 코돈들 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 상기와 같은 핵산 변이는 "잠재성 변이"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이들 중 한 종이다. 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명의 모든 핵산 서열은 또한 상기 핵산의 모든 가능한 잠재성 변이를 나타낸다. 숙련가는 핵산 중 각각의 코돈(통상적으로 오직 메티오닌만에 대한 코돈인 AUG는 제외한다)을 작용적으로 일치하는 분자를 제공하기 위해서 변형시킬 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각각의 잠재성 변이가 각각의 개시된 서열 중에 내재한다.
아미노산 서열에 관하여, 숙련가는, 암호화된 서열 중의 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산을 변경시키거나, 첨가하거나 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 첨가가, 상기 변경이 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 생성시키는 경우 "보존적으로 변형된 변체"임을 알 것이다.
PE의 세포독성 또는 항원성에 대한 분석
본 발명에 사용된 슈도모나스 외독소를, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 분석에 의해 목적하는 세포독성 수준에 대해 분석할 수 있다. 따라서, PE의 세포독성 단편 및 상기와 같은 단편의 보존적으로 변형된 변체를 세포독성에 대해서 쉽게 분석할 수 있다. 다수의 후보 PE 분자들을 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 세포독성에 대해 동시에 분석할 수 있다. 예를 들어, 상기 후보 분자들의 하위군들을 세포독성에 대해 분석할 수있다. 상기 후보 분자들의 양으로 반응하는 하위군들을 목적하는 세포독성 단편(들)이 확인될 때까지 연속적으로 세분하고 재분석할 수 있다. 상기와 같은 방법은 PE의 다수의 세포독성 단편 또는 보존적인 변형들의 신속한 선별을 허용한다. 항원성을, WO 2007/016150에 교시된 분석들을 포함하여, 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 분석할 수 있다.
C. 항-메소텔린 항체
상기 키메릭 분자의 표적화 성분은 세포 표면 마커 메소텔린에 특이적으로 결합한다. 키메릭 분자에 대한 표적인 세포 표면 항원은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Mufson, Front Biosci (2006) 11:337-43]; 문헌[Frankel, Clin Cancer Res (2000) 6:326-334] 및 문헌[Kreitman, AAPS Journal (2006) 8(3):E532-E551]에 요약되어 있다. 메소텔린을 표적화함으로써 성장, 확산 및/또는 진행이 감소되거나 억제될 수 있는 예시적인 암은 난소암, 중피종, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 난관암, 두경부암, 경부암 및 췌장암을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 표적화 부분은 항체 단편, 바람직하게는 세포상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 항체 단편이다. 바람직한 항체 단편은 단일 쇄 Fv이다. 본 발명에서 세포독소-기재 면역독소(여기에서 상기 세포독소는 scFv에 융합된다)의 구조 및 특성화를 개시한다. 독소 또는 세포독성 단편이 융합될 수 있는 다른 바람직한 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 나선-안정화된 항체, 다이아바디, 다이설파이드 안정화된 항체, 및 단일 도메인 항체(예를들어 카멜리드 항체)를 포함한다. 메소텔린에 대한 항체는 SS1, SSP1, HN1, HN2, MN, K1 및 이들의 변체를 포함한다. MORAb-009(SS1의 인간화된 형태)가 특히 적합한 항체이다.
SS1P는 메소텔린 발현 세포주를 특이적으로 살해하고 마우스에서 메소텔린 발현 종양의 퇴화를 유발하는 것으로 나타났다(문헌[Hassan, R. et al., Clin Cancer Res 8:3520-6 (2002)]; 문헌[Onda, M. et al., Cancer Res 61:5070-7 (2001)]). 이러한 연구 및 적합한 안전성 데이터를 근거로, SS1P에 대한 2 개의 I 단계 시험이 국립 암 연구소에서 메소텔린 발현 암 환자에게서 수행되고 있다(문헌[Chowdhury, P. S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:669-74 (1998)]; 문헌[Hassan, R. et al., Proc Am Soc Clin Oncol 21:29a (2002)], 이들 문헌은 각각 상기 문헌 중에 개시된 SS1P 주제에 관하여 본 발명에 참고로 인용된다). 또한, 메소텔린을 표적화하는 다른 요법들이 전임상 개발 중에 있다(문헌[Thomas, A.M. et al., J Exp Med 200:297-306 (2004)]). HN1 및 HN2는 인간 항-메소텔린 항체들이며, 이들은 예를 들어 문헌[Feng, et al., Mol Cancer Ther (2009) 8(5):1113-8]에 개시되어 있다. 라이소솜 프로테아제에 대한 절단 집단이 제거된 SS1P 면역독소. 상기 변체는 예를 들어 문헌[Weldon, et al., Blood, (2009) 113(16):3792-800] 및 WO 2009/032954에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 상기 문헌 중에 개시된 항체, FCS 및 작용성 도메인 III에 관하여 내용 전체가 본 발명에 인용된다.
본 발명의 RIT는 비제한적으로 항체 또는 다른 표적화제에 대한 PE 분자의 공유 결합이 존재하는 분자를 포함한다. 항체 또는 항체 단편에 대한 세포독소의 융합은 전형적으로는 상기 항체 또는 항체 단편의 C-말단에 대한 것이다. 상기와 같은 융합은 전형적으로 재조합 DNA 기술을 사용하여 수행된다. 특정 표적화제의 선택은 표적화되는 특정 세포에 따라 변한다. 상기 면역독소를 표적화하는 항체는 다클론, 단클론 또는 재조합 항체, 예를 들어 키메라 또는 가변 영역 단편일 수 있다. 상기 항체가 비-재조합체인 경우, 상기 면역독소는 상기 항체의 상기 독성 부분에의 화학적 접합에 의해 형성됨에 틀림없다. 상기 항체를 재조합적으로 생산하는 경우, 상기 항체를 화학 결합을 통해 또는 재조합 융합을 통해 독소에 결합시킬 수 있다. 재조합 융합에서, 상기 항체를 암호화하는 cDNA를, 이미 상기 독소를 암호화하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 내에 인프레임 삽입시킨다. 물론, 이의 역도 또한 수행될 수 있으며; 상기 독소 cDNA를 상기 항체를 암호화하는 cDNA를 지니는 플라스미드 내에 삽입시킬 수 있다. 상기 면역독소의 잠재적인 큰 크기로 인해, 때때로 단지 항체의 단편만을 독성 부분에 결합시키는 것이 요구된다. Fab, Fab' 및 F(ab)2 단편을 다클론, 단클론 및 키메릭 항체로부터 제조할 수 있으며 이어서 화학 결합을 통해 상기 독소에 결합시킬 수 있다. 한편으로, 항체의 가변 영역이 필수적인 프레임워크 영역에 결합된 cDNA를 생성시킬 수 있다. 이어서 상기 보다 작은 항체들은 이중 쇄 Fv 항체로서 분비되거나, 또는 중쇄 및 경쇄 영역이 직접 또는 펩타이드 링커를 통해 결합되는 경우, 단일 쇄 Fv 항체(scFv)로서 분비된다. 특히 바람직한 메소텔린 항체 및 단편(이때 라이소솜 프로테아제에 대한 절단 집단이 제거되어 있다)이 2000년 7월 12일자로 공개된 PCT 특허 공보 제 WO/2000/073346에 개시되어 있으며, 상기 공보는 본 발명과 동일한 양수인에게 양도되고 특히 상기 공보 중에 개시된 항체 주제에 관하여 내용 전체가 참고로 인용된, 2000년 5월 26일자로 출원된 PCT/US2009/014829에 상응한다.
scFv를 생성시키는 한 가지 방법은 면역원으로 면역시킨 마우스의 비장 mRNA로부터 제조된 파지 디스플레이 라이브러리를 통해서이다(문헌[Chowdhury, et al., Mol. Immunol. 34:9-20 (1997)]). 단백질 면역원이 포유동물에서 천연으로 발견되지만 원핵생물에서는 재조합에 의해 발현되는 경우, 상기 단백질은 정확한 글리코실화 패턴을 갖지 않을 것이며 정확한 형태를 갖지 않을 수도 있다. 상기 면역원에 반응하여 상기 마우스에 의해 발생된 항체는 그의 고유 상태에서 상기 단백질을 인식할 수 없을 수도 있다. 상기 문제에 대한 한 가지 해법은 포유동물 세포에서 제조된 고유 단백질로 동물을 면역시키는 것이나, 포유동물 세포로부터 충분량의 일부 단백질, 특히 세포 표면 단백질을 정제하는 것은 가능하지 않을 수도 있다. 또 다른 해법은, 통상적이지는 않지만, 상기 면역원을 암호화하는 cDNA로 동물을 면역시키는 것이다. 상기 cDNA를 적합한 프로모터의 조절 하에서 동물 내에 도입시킨다. 추가 접종 후에 상기 항체 역가가 최대에 도달하면, 상기 동물들을 죽이고 비장을 제거하여 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시킨다. 마우스를 메소텔린을 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드로 면역시킴으로써, 본 발명자들은 높은 역가의 항-메소텔린 항체를 이끌어낼 수 있다. 비장 RNA 및 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 우리는 메소텔린에 높은 친화성으로 결합하는 단일-쇄 Fv("scFv")(여기서 SS scFv라 칭하였다)를 단리할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 항-메소텔린 항체를 FCS 아미노 말단을 통해 상기 FCS에 결합시킬 수 있다. 유사하게, 상기 FCS를 상기 항체의 중쇄, 경쇄, Fc(불변 영역) 또는 프레임워크 영역들에 직접 결합시킬 수 있다. 결합은 상기 항체의 아미노 또는 카복실 말단을 통해서, 또는 내부 아미노산 잔기를 통해서 발생할 수 있다. 본 발명의 다가 면역접합체 조성물에 사용되는 항체는 동일하거나 상이한 메소텔린 에피토프를 향할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 항-메소텔린 항체는 scFv 또는 다이설파이드 안정화된 Fv 항체와 같은 재조합 항체이다. Fv 항체는 전형적으로는 약 25 kDa이며 중쇄 및 경쇄당 3 개의 CDR을 갖는 완전한 항원-결합 부위를 함유한다. V H 및 VL 쇄가 인접하지 않고 발현되는 경우, 상기 Fv 항체의 쇄들은 전형적으로는 비공유 상호작용에 의해 함께 유지된다. 그러나, 이들 쇄는 희석 시 해리되는 경향이 있으며, 따라서 상기 쇄들을 글루타르알데하이드, 분자간 다이설파이드, 또는 펩타이드 링커를 통해 가교결합시키는 방법들이 개발되었다.
특히 바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 단일 쇄 Fv(scFv)이다. scFv 항체의 VH 및 VL 영역은, 폴딩되어 2 쇄 항체 중에서 발견되는 것과 유사한 항원 결합 부위를 생성시키는 단일 쇄를 포함한다. 일단 폴딩되면, 비공유 상호작용이 상기 단일 쇄 항체를 안정화시킨다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 scFv를 재조합에 의해 생성시킨다. 숙련가는 본 발명의 항체의 보존적인 변체를 제조할 수 있음을 알 것이다. scFv 단편에 사용되는 상기와 같은 보존적인 변체는 상기 VH 및 VL 영역들 간의 정확한 폴딩 및 안정화에 필요한 중요한 아미노산 잔기를 유지할 것이다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 scFv 항체를 경쇄를 통해 상기 FCS에 직접 결합시킨다.
일부 항체 실시태양의 상기 VH 및 VL 영역들을 함께 직접 결합시킬 수 있는 반면, 숙련가는 상기 영역들이 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커에 의해 분리될 수도 있음을 알 것이다. 펩타이드 링커 및 그의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Huston, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8:5879 (1988)]; 문헌[Bird, et al., Science 242:4236 (1988)]; 문헌[Glockshuber, et al., Biochemistry 29:1362 (1990)]; 미국특허 제 4,946,778 호, 미국특허 제 5,132,405 호 및 문헌[Stemmer, et al., Biotechniques 14:256-265 (1993)]을 참조하시오(상기 모든 문헌들은 본 발명에 참고로 인용된다). 일반적으로, 상기 펩타이드 링커는, 상기 영역들을 결합시키거나 또는 이들 간의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외에 특정한 생물 활성을 갖지 않을 것이다. 그러나, 상기 펩타이드 링커의 구성 아미노산들은 상기 분자의 일부 성질, 예를 들어 폴딩, 순 전하, 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 단일 쇄 Fv(scFv) 항체는 50 개 이하 아미노산, 일반적으로 40 개 이하 아미노산, 바람직하게는 30 개 이하 아미노산, 및 보다 바람직하게는 20 개 이하 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드 링커를 임의로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 펩타이드 링커는 서열 Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 50), 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 상기와 같은 서열의 콘카타머(concatamer)이다. 그러나, 상기 링커 내에 일부 아미노산 치환이 이루어질 수 있음을 알아야 한다. 예를 들어 발린이 글리신을 대신할 수 있다.
바람직하게는, 항체 또는 그의 단편은 돌연변이된 항체 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 모 항체의 경우보다 항원에 대해 5 배 이상 더 큰 결합 친화성을 갖고, 상기 폴리펩타이드는 상보성 결정 영역(CDR)에서 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환에 의해 상기 모 항체와 상이한 서열을 가지며, 상기 아미노산은 AGY 및 RGYW(여기에서 R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이다) 중에서 선택된 핫 스팟 동기에 속하는 뉴클레오타이드를 포함하는 코돈에 의해 암호화된다. 상기 치환은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 CDR3에서 발생할 수 있다. 상기 치환은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 CDR1 또는 CDR2에서 발생할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 항-메소텔린 항체는 2006년 7월 25일자로 허여된 미국특허 제 7,081,518 호에 개시된 항체 물질이며, 상기 특허는 상기와 같은 항체, 그의 핵산 서열, 용도 및 제조 방법에 관하여 참고로 인용된다.
상기 항-메소텔린 항체는 가변 중("VH")쇄 및 가변 경("VL") 쇄를 포함할 수 있으며, 상기 VH 및 VL 쇄는 각각 제 1, 제 2 및 제 3 상보성-결정 영역("CDR")을 갖고, 여기에서 상기 중쇄의 제 1 CDR("CDR1"), 제 2 CDR("CDR2") 및 제 3 CDR("CDR3")은 각각, CDR1(GYTMN; 서열번호 51), CDR2(LITPYNGASSYNQKFRG; 서열번호 52), 및 CDR3(GGYDGRGFDY; 서열번호 53)에 대해 나타낸 아미노산 잔기 서열을 가지며, 여기에서 상기 VL 쇄의 각각의 CDR1, 2 및 3은 CDR1(SASSSVSYMH; 서열번호 54) , CDR2(DTSKLAS; 서열번호 55), 및 CDR3(QQWSGYPLT; 서열번호 56)에 대해 나타낸 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 경쇄의 CDR3은 변형되며 서열 QQWSKHPLT(서열번호 57), QQWSGHPLT(서열번호 58), QQWSAHPLT(서열번호 59), QQWSQIPLT(서열번호 60), QQWGFNPLT(서열번호 61), QQWGTNPLT(서열번호 62), QQWGSHPLT(서열번호 63), QQWGDFPLT(서열번호 64), QQWGDHPLT(서열번호 65), QQWSAHPLT(서열번호 66), 또는 QQWSGYPTT(서열번호 67)를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 VH는 링커 펩타이드, GVGGSG4SG4S(서열번호 25)에 의해 VL에 결합된다. 일부 추가의 실시태양에서, 상기 항-메소텔린 항체는 scFv, dsFv, Fab 또는 F(ab')2이다. 더욱 일부의 추가의 실시태양에서, 상기 RIT에 사용되는 항-메소텔린 항체는 VL CDR1, VL CDR2, VH CDR1, 및 VH CDR2로 이루어진 군 중에서 선택된 CDR 중에 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산은 AGY 및 RGYW(여기에서 R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이다) 중에서 선택된 핫 스팟 동기에 속하는 뉴클레오타이드를 포함하는 코돈에 의해 암호화된다.
D. L1
상기 항체는 바람직하게는 1 내지 10 개의 연속적인 아미노산 길이의 결합 또는 폴리펩타이드인 추가의 링커에 의해 FCS에 결합된다. 일부 실시태양에서, 상기 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개 아미노산 길이이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 링커는 글리신 및 세린 잔기로 이루어진다. 일부 추가의 실시태양에서, 상기 링커는 ASGG(서열번호 19) 또는 ASGGSGGG(서열번호 68)이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 링커는 상기 항체의 카복실 말단을 상기 FCS의 N-말단에 직접 결합시키는 연속적인 폴리펩타이드 쇄를 형성한다.
E. 가요성 링커
상기 가요성 링커는 FCS를 PE 작용성 도메인 III에 직접 결합시킨다. 상기 가요성 링커는 식 (Xaa1)n(여기에서 각각의 Xaal은 글리신 및 세린 중에서 독립적으로 선택되며 n은 3 내지 8이다)의 연속적인 펩타이드이다. 바람직한 실시태양에서, n은 3이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 링커는 GGS이다. 다른 실시태양에서, n은 4, 5, 6 또는 7이다. 다른 실시태양에서, 상기 가요성 링커는 GGGS(서열번호 50), GGGSG(서열번호 69), GGGGSG(서열번호 70) 또는 GGSGGS(서열번호 18)이다.
상기 가요성 링커를 차례로 상기 FCS의 C-말단에 융합시키고 차례로 PE의 작용성 도메인 III에 직접 융합시키며, 따라서 상기 FCS와 작용성 도메인 III을 갖는 하나의 연속적인 펩타이드 쇄를 형성시킨다.
면역접합체의 생산
i. 비-재조합 방법
본 발명의 비-재조합체 실시태양에서, 표적 분자, 예를 들어 항체를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 수의 수단들을 사용하여 본 발명의 PE 분자에 결합시킨다. 공유 및 비공유 결합이 모두 본 발명의 PE 분자에 대해 사용될 수 있다.
PE 분자를 항체 또는 다른 표적화 분자("TM")에 결합시키기 위한 과정은 상기 TM의 화학 구조에 따라 변할 것이다. 폴리펩타이드는 전형적으로 여러 가지 작용성 군들, 예를 들어 카복실산(COOH), 유리 아민(-NH2) 또는 설프하이드릴(-SH) 군을 함유하며, 이들 군은, 예를 들어 상기 PE 분자의 결합을 생성시키기 위해 항체상의 적합한 작용기와의 반응에 이용될 수 있다.
한편으로, 상기 항체 또는 다른 TM을, 노출하거나 또는 추가의 반응성 작용기를 결합시키기 위해서 유도체화한다. 상기 유도체화는 다수의 링커 분자들 중 임의의 것, 예를 들어 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Company, 미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수할 수 있는 것들의 결합을 수반할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "링커"는 상기 TM을 상기 PE 분자에 결합시키기 위해 사용되는 분자이다. 상기 링커는 상기 항체 및 효과기 분자 모두에 대해 공유 결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커 또는 펩타이드 링커를 포함한다. 상기 항체 및 효과기 분자가 폴리펩타이드인 경우, 상기 링커를 그의 측 군을 통해서 구성 아미노산에(예를 들어 다이설파이드 결합을 통해서 시스테인에) 결합시킬 수도 있다. 그러나, 바람직한 실시태양에서, 상기 링커는 말단 아미노산의 카복실 군 및 알파 탄소 아미노에 결합될 것이다.
일부 상황에서, 면역접합체가 그의 표적 부위에 도달했을 때 상기 PE 분자가 상기 TM으로부터 자유롭게 되는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 상황에서, 면역접합체는 상기 표적 부위의 부근에서 절단 가능한 결합을 포함할 것이다. 상기 PE 분자를 상기 TM으로부터 해방시키는 상기 링커의 절단은 효소 활성에 의해 또는 상기 표적 세포 내부에서 또는 상기 표적 부위의 부근에서 상기 면역접합체에 가해지는 조건에 의해 촉구될 수 있다. 상기 표적 부위가 종양인 경우, 상기 종양 부위에 존재하는 조건 하에서(예를 들어 종양-관련된 효소 또는 산성 pH에 노출될 때) 절단 가능한 링커가 사용될 수 있다.
ii. 재조합 방법
본 발명의 핵산 서열을, 예를 들어 적합한 서열의 클로닝을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해서 또는 문헌[Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979)]의 포스포트라이에스터 방법; 문헌[Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979)]의 포스포다이에스터 방법; 문헌[Beaucage, et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981)]의 다이에틸포스포아미다이트 방법; 예를 들어 문헌[Needham-VanDevanter, et al. Nucl. Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에 개시된 바와 같은 자동화된 합성기를 사용하는, 문헌[Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862 (1981)]에 개시된 고상 포스포아미다이트 트라이에스터 방법; 및 미국특허 제 4,458,066 호의 고체 지지체 방법과 같은 방법들에 의한 직접적인 화학 합성에 의해 제조할 수 있다. 화학 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 생산한다. 이를 상보성 서열과의 하이브리드화에 의해서 또는 주형으로서 상기 단일 가닥을 사용하는 DNA 폴리머라제와의 중합에 의해서 이중 가닥 DNA로 전환시킬 수 있다. 숙련가는 DNA의 화학 합성이 약 100 염기의 서열로 제한되는 반면, 보다 짧은 서열들의 연결에 의해서 보다 긴 서열을 수득할 수도 있음을 알 것이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 핵산 서열을 클로닝 기법에 의해 제조한다. 적합한 클로닝 및 서열화 기법의 예, 및 다수의 클로닝 실행을 통해 숙련가들을 지시하기에 충분한 설명서가 문헌[Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)], 문헌[Berger and Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego CA (1987)], 또는 문헌[Ausubel, et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY (1987)]에서 발견된다. 생물학적 시약 및 실험 장비의 제조사로부터의 제품 정보가 또한 유용한 정보를 제공한다. 상기와 같은 제조사는 더 시그마 케미칼 캄파니(the SIGMA chemical company)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재), R&D 시스템스(systems)(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재), 파마시아 LKB 바이오테크놀로지(Pharmacia LKB Biotechnology)(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 클론테크 레보라토리즈 인코포레이티드(CLONTECH Laboratories, Inc.)(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), 켐 진스 코포레이션, 알드리치 케미칼 캄파니(Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company)(미국 위스콘신주 밀워키 소재), 글렌 리써치 인코포레이티드, GIBCO BRL 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.)(미국 메릴랜드주 게더스버그 소재), 플루카 케미카-바이오케미카 어낼리티카 플루카 케미 아게(Fluka Chemica-Biochemika Analytika, Fluka Chemie AG)(스위스 부흐스 소재), 인비트로젠(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)뿐만 아니라 숙련가에게 공지된 다수의 다른 상업적인 출처들을 포함한다.
고유 PE를 암호화하는 핵산을 또한 본 발명의 면역접합체를 형성하도록 변형시킬 수 있다. 부위-특이적 돌연변이에 의한 변형은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. PE를 암호화하는 핵산을 시험관 내 방법에 의해 증폭시킬 수 있다. 증폭 방법은 폴리머라제 쇄 반응(PCR), 리가제 쇄 반응(LCR), 전사-기재 증폭 시스템(TAS), 자활(self-sustained) 서열 복제 시스템(3SR)을 포함한다. 광범위하게 다양한 클로닝 방법, 숙주 세포, 및 시험관 내 증폭 방법은 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
바람직한 실시태양에서, 면역접합체를, 선택된 항체 또는 다른 TM을 암호화하는 cDNA를, 본 발명의 목적하는 PE를 암호화하는 cDNA를 포함하는 벡터에 삽입함으로써 제조한다. 상기 삽입은 표적화제(논의를 쉽게 하기 위해서, 본 발명의 논의는 상기 표적화제가 Fv인 것으로 가정할 것이지만, 다른 표적화제들도 동등한 효과로 대체될 수 있다) 및 PE가 인프레임, 즉 작용성 Fv 영역과 작용성 PE 영역을 함유하는 하나의 연속적인 폴리펩타이드 중에서 판독되도록 수행된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 PE를 암호화하는 cDNA를, 상기 독소가 scFv의 카복실 말단에 위치하도록 상기 scFv에 연결시킨다. 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 PE를 암호화하는 cDNA를, 상기 독소가 scFv의 아미노 말단에 위치하도록 상기 scFv에 연결시킨다.
일단 PE, 항체, 또는 본 발명의 면역접합체를 암호화하는 핵산이 단리되고 클로닝되면, 목적하는 단백질을 재조합에 의해 조작된 세포, 예를 들어 세균, 식물, 효모, 곤충 및 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 에스케리키아 콜라이, 다른 세균 숙주, 효모 및 다양한 고등 진핵생물 세포, 예를 들어 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 포함하여 단백질 발현에 이용될 수 있는 다수의 발현 시스템들을 알 것으로 예상된다. 원핵생물 또는 진핵생물에서의 단백질 발현에 대해 공지된 다양한 방법들을 상세히 개시하고자 하지 않을 것이다. 간단히, 본 발명의 단리된 단백질을 암호화하는 천연 또는 합성 핵산의 발현이 전형적으로는 상기 DNA 또는 cDNA를 프로모터(구성적이거나 유도성이다)에 작동적으로 결합시킨 다음 발현 카세트에 통합시킴으로써 성취될 것이다. 상기 카세트는 원핵생물 또는 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 발현 카세트는 단백질을 암호화하는 DNA의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다. 클로닝된 유전자의 높은 수준의 발현을 획득하기 위해서, 최소한 전사를 지시하는 강한 프로모터, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 및 전사/번역 종결자를 함유하는 발현 카세트를 제작하는 것이 바람직하다. 에스케리키아 콜라이의 경우, 상기는 프로모터, 예를 들어 T7, trp, lac, 또는 람다 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 바람직하게는 전사 종결 신호를 포함한다. 진핵생물 세포의 경우, 상기 조절 서열은 프로모터 및 바람직하게는 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 인헨서, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있으며, 연접 공여체 및 수용체 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명의 카세트를 널리-공지된 방법, 예를 들어 에스케리키아 콜라이의 경우 염화 칼슘 형질전환 또는 일렉트로포레이션, 및 포유동물 세포의 경우 칼슘 포스페이트 처리, 일렉트로포레이션 또는 리포펙션에 의해 상기 선택된 숙주 세포 내로 이동시킬 수 있다. 상기 카세트에 의해 형질전환된 세포를 상기 카세트 중에 함유된 유전자, 예를 들어 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여된 항생제 내성에 의해 선택할 수 있다.
숙련가는 본 발명의 폴리펩타이드(즉 PE 또는 본 발명의 PE로부터 형성된 면역접합체)를 암호화하는 핵산에 대해 그의 생물 활성의 감소 없이 변형을 수행할 수 있음을 알 것이다. 상기 표적화 분자의 클로닝, 발현 또는 융합 단백질 내로의 통합을 촉진하기 위한 일부의 변형을 수행할 수도 있다. 상기와 같은 변형은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 종결 코돈, 개시를 제공하기 위해 아미노 말단에 첨가된 메티오닌, 부위, 편의상 배치된 제한 부위를 생성시키기 위해 어느 한 말단 상에 놓인 추가의 아미노산, 또는 정제 단계를 돕기 위한 추가의 아미노산(예를 들어 폴리 His)을 포함한다.
재조합 방법 외에, 본 발명의 면역접합체 및 PE를 또한 표준 펩타이드 합성을 사용하여 전체로서 또는 부분으로 제작할 수 있다. 약 50 개 아미노산 미만 길이의 본 발명의 폴리펩타이드의 고상 합성은, 상기 서열의 C-말단 아미노산을 불용성 지지체에 부착시킨 다음 상기 서열 중의 나머지 아미노산의 연속적인 첨가에 의해 수행될 수 있다. 고상 합성을 위한 기법들은 문헌[Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. pp. 3-284]; 문헌[Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963)], 및 문헌[Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ND ED., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984)]에 개시되어 있다. 더 큰 길이의 단백질을 보다 짧은 단편의 아미노 및 카복실 말단의 축합에 의해 합성할 수 있다. 카복실 말단 단부의 활성화(예를 들어 커플링 시약 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드의 사용에 의해)에 의한 펩타이드 결합의 형성 방법은 숙련가들에게 공지되어 있다.
iii. 정제
일단 발현되면, 본 발명의 재조합 면역접합체 및 PE를, 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피 등을 포함한 당해 분야의 표준 과정에 따라 정제할 수 있다(일반적으로 문헌[R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982)]을 참조하시오). 약 90 내지 95% 이상의 동종성을 갖는 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하며, 98 내지 99% 이상의 동종성이 약학적 용도에 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 목적하는 동종성으로 정제되면, 치료학적으로 사용하고자 하는 경우, 상기 폴리펩타이드는 내독소가 실질적으로 없어야 한다.
단일 쇄 항체의 발현 및/또는 에스케리키아 콜라이와 같은 세균으로부터의 단일 쇄 항체를 포함한 적합한 활성 형태로의 리폴딩에 대한 방법이 개시되었으며 널리 공지되어 있고 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 문헌[Buchner, et al., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992)]; 문헌[Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989)] 및 문헌[Ward, et al., Nature 341:544 (1989)](이들 문헌은 모두 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
종종, 에스케리키아 콜라이 또는 다른 세균으로부터의 작용성 이종 단백질들이 봉입체로부터 단리되며 상기 단백질들은 강한 변성제를 사용한 용해, 및 후속의 리폴딩을 필요로 한다. 이러한 용해 단계 동안, 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 다이설파이드 결합을 분리시키기 위해서 환원제가 존재해야 한다. 환원제를 갖는 예시적인 완충제는 0.1 M 트리스(pH 8), 6 M 구아니딘, 2 mM EDTA, 0.3 M DTE(다이티오에리쓰리톨)이다. 상기 다이설파이드 결합의 재산화가, 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Saxena, et al., Biochemistry 9: 5015-5021 (1970)]에 개시된 바와 같이, 및 특히 상기 부흐너(Buchner) 등에 의해 개시된 바와 같이 환원 및 산화된 형태로 저 분자량 티올 시약의 존재 하에서 발생할 수 있다.
재생은 전형적으로 변성된 및 환원된 단백질의 리폴딩 완충제 내로의 희석(예를 들어 100 배)에 의해 수행된다. 예시적인 완충제는 0.1 M 트리스(pH 8.0), 0.5 M L-아르기닌, 8 mM 산화된 글루타치온, 및 2 mM EDTA이다.
상기 2 쇄 항체 정제 프로토콜에 대한 변형으로서, 중쇄 및 경쇄 영역을 별도로 용해 및 환원시키고 이어서 상기 리폴딩 용액 중에서 결합시킨다. 바람직한 수율은 이들 두 단백질을, 하나의 단백질의 다른 단백질에 대한 5 배 몰 과잉을 초과하지 않도록 하는 몰비로 혼합하는 경우 획득된다. 과잉의 산화된 글루타치온 또는 다른 산화성 저분자량 화합물을, 상기 산화환원-혼합이 완료된 후에 상기 리폴딩 용액에 첨가하는 것이 바람직하다.
2. 약학 조성물 및 투여
하나의 태양에서 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 키메릭 단백질, 바람직하게는 표적화된 독소, 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물 또는 약제를 제공한다. 약학 조성물 또는 약제를, 비제한적으로 악성 질병 또는 암을 포함한 상태의 치료를 위해 환자에게 투여할 수 있다.
a. 제형
본 발명에 사용하기 위한 약학 조성물 또는 약제를 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 표준 기법에 의해 제형화할 수 있다. 적합한 약학 담체는 본 발명 및 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005)]에 개시된다. 본 발명의 키메릭 단백질을 임의의 적합한 경로, 예를 들어 흡입을 통해, 국소, 코, 경구, 비경구 또는 직장에 의해 투여하기 위해서 제형화할 수 있다. 따라서, 상기 약학 조성물의 투여를 피내, 피하, 정맥 내, 근육 내, 비내, 흡입에 의해, 대뇌 내, 기관 내, 동맥 내, 복강 내, 방광 내, 흉막 내, 관상동맥 내, 피하 또는 종양 내 주사에 의해, 주사기 또는 다른 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여가 또한, 흡입 또는 에어로졸 투여와 같이 고려된다. 정제 및 캡슐을 경구, 직장 또는 질내 투여할 수 있다.
상기 투여용 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 키메릭 단백질, 바람직하게는 표적화된 독소의 용액을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충된 염수 등을 사용할 수 있다. 이들 용액은 살균성이며 바람직하지 못한 물질이 일반적으로 없다. 이들 조성물을 통상적인, 널리 공지된 살균 기법에 의해 살균시킬 수 있다. 상기 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수도 있다. 이들 제형 중 융합 단백질의 농도는 광범위하게 다양할 수 있으며, 선택된 특정한 투여 모드 및 환자의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등을 근거로 선택될 것이다.
본 발명의 표적화된 독소 조성물은 정맥 내 투여 또는 체강 내 투여를 포함하여 비경구 투여에 적합하다.
본 발명의 키메릭 단백질, 바람직하게는 표적화된 독소를 주사, 예를 들어 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화할 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형, 예를 들어 앰풀 또는 수회-용량 용기 중에, 첨가된 보존제와 함께 존재할 수 있다. 주사 가능한 조성물은 바람직하게는 수성 등장성 용액 또는 현탁액이며, 좌약을 바람직하게는 지방 유화액 또는 현탁액으로부터 제조한다. 상기 조성물을 살균하고/하거나 상기 조성물이 보조제, 예를 들어 보존제, 안정제, 습윤 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 활성 성분은 사용 전에, 적합한 비히클, 예를 들어 멸균성의 발열원이 없는 물에 의해 조성되는 분말 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 활성 성분은 또한 다른 치료학적으로 귀중한 물질을 함유할 수도 있다. 상기 조성물들을 통상적인 각각의 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조하며, 이들은 약 0.1 내지 75%, 바람직하게는 약 1 내지 50%의 활성 성분을 함유한다.
본 발명의 표적화된 독소 조성물의 조절된 방출 비경구 제형을 임플란트, 유성 주사액으로서 또는 미립자 시스템으로서 제조할 수 있다. 단백질 전달 시스템에 대한 폭넓은 개략에 대해서, 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Banga, A.J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995)]을 참조하시오. 미립자 시스템은 미소구, 미세입자, 미세캡슐, 나노캡슐, 나노구, 및 나노입자를 포함한다. 미세캡슐은 중심 코어로서 상기 치료 단백질을 함유한다. 미소구에서, 상기 치료제는 상기 입자 전체를 통해 분산된다. 약 1 ㎛ 미만의 입자, 미소구 및 미세캡슐을 일반적으로 각각 나노입자, 나노구 및 나노캡슐이라 칭한다. 모세관은 오직 나노입자만이 정맥 내로 투여되도록 대략 5 ㎛의 직경을 갖는다. 미세입자는 전형적으로 직경이 대략 100 ㎛이며 피하 또는 근육 내로 투여된다. 예를 들어 문헌[Kreuter J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994)]; 및 문헌[Tice & Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 315-339 (1992)](이들은 모두 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
중합체를 본 발명의 표적화된 독소 조성물의 이온-조절된 방출을 위해 사용할 수 있다. 조절된 약물 전달에 사용하기 위한 다양한 분해성 및 비분해성 중합체성 기질이 당해 분야에 공지되어 있다(문헌[Langer R., Accounts Chem. Res., 26:537-542 (1993)]). 예를 들어, 블록 공중합체, 폴락사머 407은 저온에서 점성이지만 여전히 이동성인 액체로서 존재하나 체온에서는 반고형 젤을 형성한다. 상기 공중합체는 재조합 인터류킨-2 및 유레아제의 제형화 및 지속된 전달에 유효한 비히클인 것으로 나타났다(문헌[Johnston et al., Pharm. Res., 9:425-434 (1992)]; 및 문헌[Pec et al., J. Parent. Sci. Tech., 44(2):58-65 (1990)]). 한편으로, 하이드록시아파타이트가 단백질의 조절된 방출을 위한 미세담체로서 사용되었다(문헌[Ijntema et al., Int. J. Pharm., 112:215-224 (1994)]). 더욱 또 다른 태양에서, 리포솜이 지질-캡슐화된 약물의 약물 표적화뿐만 아니라 조절된 방출을 위해 사용된다(문헌[Betageri et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)]). 치료 단백질의 조절된 전달을 위한 다수의 추가적인 시스템들이 공지되어 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,055,303 호, 미국특허 제 5,188,837 호, 미국특허 제 4,235,871 호, 미국특허 제 4,501,728 호, 미국특허 제 4,837,028 호, 미국특허 제 4,957,735 호, 및 미국특허 제 5,019,369 호, 미국특허 제 5,055,303 호; 미국특허 제 5,514,670 호; 미국특허 제 5,413,797 호; 미국특허 제 5,268,164 호; 미국특허 제 5,004,697 호; 미국특허 제 4,902,505 호; 미국특허 제 5,506,206 호, 미국특허 제 5,271,961 호; 미국특허 제 5,254,342 호 및 미국특허 제 5,534,496 호를 참조하시오(이들 특허는 각각 본 발명에 참고로 인용된다).
경피 적용에 적합한 제형은 유효량의 본 발명의 조성물을 담체와 함께 포함한다. 바람직한 담체는 숙주의 피부를 통한 통과를 지원하는 흡수 가능한 약물학적으로 허용 가능한 용매를 포함한다. 예를 들어 경피 장치는 배면 부재를 포함하는 붕대, 임의로 담체와 함께 상기 조성물을 함유하는 저장용기, 임의로 연장된 기간에 걸쳐 조절된 속도 및 소정의 속도로 숙주의 피부에 상기 조성물을 전달하기 위한 속도 조절 차단층, 및 상기 장치를 상기 피부에 고정시키기 위한 수단의 형태로 존재한다. 기질 경피 제형이 또한 사용될 수 있다.
국소 적용에, 예를 들어 피부 및 눈에 대한 국소 적용에 적합한 제형은 바람직하게는 당해 분야에 널리 공지된 수용액, 연고, 크림 또는 젤이다. 상기와 같은 제형은 용해제, 안정제, 탄력성 향상제, 완충제 및 보존제를 함유할 수 있다.
경구 투여의 경우, 약학 조성물 또는 약제는 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께, 예를 들어 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 활성 성분, 즉 본 발명의 조성물을 (a) 희석제 또는 충전제, 예를 들어 락토오스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스(예를 들어 에틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스), 글리신, 펙틴, 폴리아크릴레이트 및/또는 칼슘 수소 포스페이트, 칼슘 설페이트, (b) 윤활제, 예를 들어 실리카, 탤컴, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염, 금속성 스테아레이트, 콜로이드성 이산화 규소, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및/또는 폴리에틸렌글리콜과 함께; 정제의 경우 또한 (c) 결합제, 예를 들어 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스; 경우에 따라 (d) 붕해제, 예를 들어 전분(예를 들어 감자 전분 또는 나트륨 전분), 글리콜레이트, 아가, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물; (e) 습윤제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 및/또는 (f) 흡수제, 착색제, 풍미제 및 감미제와 함께 포함하는 정제 및 젤라틴 캡슐이 바람직하다.
정제는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 필름 코팅되거나 또는 장용 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 예를 들어 용액, 시럽, 또는 현탁액의 형태를 취하거나, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클에 의해 조성되는 건조한 생성물로서 존재할 수 있다. 상기와 같은 액체 제제는 약학적으로 허용 가능함 첨가제, 예를 들어 현탁제, 예를 들어 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 또는 수소화된 식용 지방; 유화제, 예를 들어 레시틴 또는 아카시아; 비-수성 비히클, 예를 들어 아몬드 오일, 유성 에스터, 에틸 알콜, 또는 분류된 식물성 오일; 및 보존제, 예를 들어 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산과 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 상기 제제는 또한 적합한 경우, 완충 염, 풍미제, 착색제 및/또는 감미제를 함유할 수 있다. 경우에 따라, 경구 투여용 제제를 상기 활성 조성물의 조절된 방출을 제공하도록 적합하게 제형화할 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 키메릭 단백질, 바람직하게는 항체 및/또는 표적화된 독소를 편의상, 적합한 추진제, 예를 들어 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄, 1,1,1,2-테트라플루오르에탄, 이산화 탄소, 또는 다른 적합한 가스를 사용하여, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 모양의 형태로 전달할 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 상기 투여 단위를, 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 정할 수 있다. 상기 키메릭 단백질, 바람직하게는 항체 및/또는 표적화된 독소 및 적합한 분말 베이스, 예를 들어 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 예를 들어 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지를 제형화할 수 있다.
상기 조성물을 또한, 예를 들어 통상적인 좌약 베이스, 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 함유하는 직장 조성물, 예를 들어 좌약 또는 정체 관장약으로 제형화할 수 있다.
더욱 또한, 상기 조성물을 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 상기와 같은 장시간-작용 제형을 이식(예를 들어 피하 또는 근육 내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물을 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어 허용 가능한 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 약간 용해성인 유도체로서, 예를 들어 약간 용해성인 염으로서 제형화할 수 있다.
상기 조성물은, 경우에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 함유할 수 있는 팩 또는 분배 장치 중에 존재할 수 있다. 상기 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들어 발포팩을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여 설명서를 동반할 수 있다.
b. 투여량
본 발명의 하나의 실시태양에서, 약학 조성물 또는 약제를 암과 같은 질병 또는 악성 상태를 예방하거나, 치료하거나 또는 억제하기 위한 치료 유효 용량으로 환자에게 투여한다. 상기 약학 조성물 또는 약제를 환자에게서 유효한 치료 또는 진단 반응을 이끌어내기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여한다. 유효한 치료 또는 진단 반응은 상기 병 또는 악성 상태의 증상 또는 합병증을 적어도 부분적으로 저지하거나 늦추는 반응이다. 이를 수행하기에 적합한 양을 "치료 유효 용량"으로서 정의한다.
투여되는 키메릭 단백질, 바람직하게는 표적화된 독소 또는 조성물의 투여량은 온혈 동물(포유동물)의 종, 체중, 연령, 개별적인 조건, 치료하려는 영역의 표면적 및 투여 형태에 따라 다르다. 상기 용량의 크기는 또한 특정 환자에게서 특정 화합물의 투여에 동반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다. 약 50 내지 70 ㎏의 포유동물에게 투여하기 위한 단위 투여량은 약 5 내지 500 ㎎의 활성 성분을 함유할 수 있다. 전형적으로, 본 발명 화합물의 투여량은 목적하는 효과를 성취하기에 충분한 투여량이다.
최적의 투여 스케줄을 키메릭 단백질, 바람직하게는 표적화된 독소의 측정, 환자의 신체 중의 누적으로부터 계산할 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 ㎏당 1 ng 내지 1,000 ㎎이며 하루에, 일주일에, 한달에 또는 1년에 1 회 이상 제공될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 최적 투여량, 투여 방법 및 반복 비율을 쉽게 결정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 당해 분야에 공지되고 본 발명에 개시된 확립된 프로토콜에 따라 인간에게 키메릭 단백질, 바람직하게는 표적화된 독소의 투여를 위한 최적 투여를 결정할 수 있을 것이다.
조성물의 최적 투여량, 독성 및 치료 효능은 개별적인 조성물의 상대적인 효능에 따라 변할 수 있으며 예를 들어 LD50(집단의 50%에 치사적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)을 측정함으로써 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 과정에 의해 측정될 수 있다. 독성과 치료 효과간의 용량비는 치료 지수이며 이를 비, LD50/ED50로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 조성물을 사용할 수 있지만, 상기와 같은 조성물을 병든 조직의 부위에 표적화하여 정상 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고 이에 의해 부작용을 감소시키는 전달 시스템을 설계하도록 주의해야 한다.
예를 들어 동물 연구(예를 들어 설치류 및 원숭이)로부터 획득된 데이터를 사용하여 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화할 수 있다. 본 발명 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없이 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 상기 투여량은 상기 범위 내에서 사용되는 투여형 및 투여 경로에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 임의의 조성물의 경우, 상기 치료 유효 용량을 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정할 수 있다. 1 회 용량을 세포 배양물에서 측정 시 IC50(증상의 최대-절반 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환하는 혈장 농도 범위를 성취하기 위해서 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 상기와 같은 정보를 사용하여 인간에 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 중 수준을 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로, 키메릭 단백질, 바람직하게는 표적화된 독소의 용량 당량은 전형적인 환자의 경우 약 1 ng/㎏ 내지 100 ㎎/㎏이다.
정맥 내 투여를 위한 본 발명의 전형적인 표적화된 독소 조성물은 하루에 환자당 약 0.1 내지 10 ㎎일 수 있다. 하루에 환자당 0.1 내지 약 100 ㎎의 투여량을 사용할 수도 있다. 투여 가능한 조성물의 제조를 위한 실제적인 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되거나 자명할 것이며 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005)]과 같은 발행물에 보다 상세히 개시된다.
본 발명에 개시된 조성물의 예시적인 용량은 환자의 kg당 또는 샘플 중량당 조성물의 mg 또는 μg 양(예를 들어 약 1 μg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 100 μg/kg 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 1 μg/kg 내지 약 50 μg/kg)을 포함한다. 더욱 또한 조성물의 적합한 용량은 성취하고자 하는 목적하는 효과에 관하여 상기 조성물의 효능에 따라 변하는 것으로 생각된다. 이들 조성물 중 하나 이상을 포유동물에게 투여해야 하는 경우, 의사, 수의학자 또는 연구자들은 예를 들어 처음에는 비교적 낮은 용량을 처방하고 후속으로 적합한 반응이 획득될 때까지 상기 용량을 증가시킬 수 있다. 또한, 임의의 특정 포유동물 환자에 대한 특정한 용량 수준은 사용되는 특정 조성물의 활성, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 임의의 약물 조합, 및 조절하고자 하는 발현 또는 활성의 정도를 포함한 다양한 인자들에 따라 변할 것으로 생각된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 키메릭 단백질, 바람직하게는 표적화된 독소를 포함하는 약학 조성물 또는 약제를 예를 들어 환자 체중 ㎏당 화합물 약 1 ㎎(1 ㎎/㎏) 내지 약 1 g/㎏ 범위의 1일 용량으로 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 용량은 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 500 ㎎/㎏ 범위의 용량이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 용량은 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 용량은 약 25 ㎎/㎏ 내지 약 150 ㎎/㎏이다. 바람직한 용량은 약 10 ㎎/㎏이다. 상기 1일 용량을 하루에 한 번 또는 하위 용량으로 분할하여 투여하고 수회 용량, 예를 들어 하루에 2 회, 3 회 또는 4 회 투여할 수 있다. 그러나, 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명에 개시된 조성물을 상이한 양 및 상이한 시간으로 투여할 수 있다. 숙련가는 또한 비제한적으로 질병 또는 악성 상태의 중증도, 선행 치료, 환자의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함한 몇몇 인자가 환자를 유효하게 치료하기 위해 요구되는 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수도 있음을 알 것이다. 더욱이, 치료 유효량의 조성물에 의한 환자의 치료는 단일 치료를 포함하거나 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
성공적인 치료에 이어서, 치료된 질병 또는 악성 상태의 재발을 방지하기 위해서 상기 환자가 유지 요법을 받게 하는 것이 바람직할 수도 있다.
c. 투여
본 발명의 조성물을 치료학적 치료를 위해서 투여할 수 있다. 치료학적 적용 시, 조성물을 질병 또는 악성 상태, 예를 들어 암을 앓고 있는 환자에게 상기 질병 및 그의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지시키기에 충분한 양으로 투여한다. 이를 수행하기에 적합한 양을 "치료 유효 용량"으로서 정의한다. 상기 용도에 유효한 양은 상기 질병의 중증도 및 상기 환자의 건강의 일반적인 상태에 따라 변할 것이다. 상기 화합물의 유효량은 의사 또는 다른 자격을 갖춘 관찰자에 의해 언급되는 바와 같이 증상(들)의 주관적인 경감 또는 객관적으로 확인 가능한 개선을 제공하는 것이다.
유효량의 측정은 특히 본 발명에 제공된 상세한 명세에 비추어, 충분히 당해 분야의 숙련가들의 능력 내에 있다. 일반적으로, 면역접합체의 효능 있는 또는 유효한 양은 먼저 낮은 용량 또는 소량의 상기 면역접합체를 투여하고, 이어서 상기 투여되는 용량 또는 투여량을 증분에 의해 증가시키고, 필요한 경우 최소의 부작용으로 또는 독성 부작용 없이 상기 치료된 환자에게서 목적하는 효과가 관찰될 때까지 제 2 또는 제 3 약물을 가함으로써 측정된다.
상기 조성물의 단일 또는 수회 투여를 환자에 의해 요구되고 허용되는 바와 같은 투여량 및 빈도에 따라 투여한다. 어쨌든, 상기 조성물은 상기 환자를 유효하게 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 단백질을 제공해야 한다. 바람직하게는, 상기 투여량을 1 회 투여하나, 치료학적 결과가 성취될 때까지 또는 부작용이 상기 요법의 중단을 정당화할 때까지 주기적으로 적용할 수도 있다. 일반적으로, 상기 용량은 환자에게 허용가능하지 않은 독성을 생성시키지 않으면서 질병의 증상 또는 징후를 치료 또는 개선시키기에 충분하다.
목적하는 치료 효과를 성취하기 위해서, 조성물을 상기 치료학적으로 유효한 1 일 용량으로 수일간 투여할 수 있다. 따라서, 환자에게서 본 발명에 개시된 질병 또는 악성 상태를 치료하기 위한 조성물의 치료학적으로 유효한 투여는 3 일 내지 2 주 이상 범위의 기간 동안 계속되는 주기적인(예를 들어 매일) 투여를 필요로 할 수도 있다. 전형적으로, 조성물을 3 일 이상의 연속일 동안, 종종 5 일 이상의 연속일 동안 , 보다 종종 10 일 이상 및 때때로 20, 30, 40 일 이상의 연속일 동안 투여할 것이다. 연속적인 1 일 용량이 치료 유효 용량을 성취하기에 바람직한 경로이지만, 상기 투여가 상기 환자에게서 상기 조성물의 치료 유효 농도를 유지시키기에 충분히 빈번히 반복되는 한, 상기 화합물 또는 조성물을 매일 투여하지 않은 경우에조차 치료학적으로 유리한 효과가 성취될 수 있다. 예를 들어, 조성물을 2 일 마다, 3 일 마다 투여하거나, 또는 더 높은 용량 범위가 사용되고 환자에 의해 허용되는 경우, 1 주일에 1 회 투여할 수 있다.
3. 종양 성장의 억제 방법
본 발명의 조성물은 다양한 방식으로 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 PE 분자는, 예를 들어 키메릭 분자의 부분으로서, (i) 하나 이상의 표면 마커를 갖는 세포에서 세포사멸을 유도하고, (ii) 하나 이상의 세포 표면 마커를 갖는 세포의 불필요한 성장, 과잉증식 또는 생존을 억제하고, (iii) 암과 같은 상태를 치료하고, (iv) 하나 이상의 세포 표면 마커를 갖는 세포의 존재에 의해 유발된 질병을 나타낸 포유동물에게 치료를 제공하기 위해 사용된다.
세포 표면 마커로서 메소텔린을 발현하는 임의의 세포 또는 종양 세포를 사용하여 본 발명의 방법을 실행할 수 있다. 본 발명의 방법을 시험관 내 또는 생체 내에서 실행할 수 있다. 세포에 대해 언급되는 경우, 상기 용어는 세포의 집단, 즉 하나보다 많은 세포를 포함하는 것으로 이해된다.
하나 이상의 세포 표면 마커를 갖는 세포에서 세포사멸을 유도하기 위한 조성물의 용도
세포사멸은 다세포 유기체의 발생 및 항상성 모두에서 중요한 역할을 한다. "세포사멸"은 프로그램화된 세포사를 지칭하며 몇몇 세포 특성, 예를 들어 막 뭉침, 크로마틴 응축 및 단편화, 세포사멸체의 형성 및 양성 "튜넬(TUNEL)"(말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개된 UTP 닉 단부-표지화) 염색 패턴을 특징으로 한다. 세포사멸 과정의 나중 단계는 상기 혈장막의 분해이며, 이는 세포사멸 세포를 다양한 염료(예를 들어 프로피디움 요오다이드)에 누출되게 한다.
세포사멸은 여러 소멸 수용체와 그의 리간드(종양 괴사 인자(TNF) 수용체/리간드 상과에 속한다) 사이의 다수의 상호작용들로 이루어지는 최종 효과기 기전으로 수렴되는 다수의 독립적인 신호전달 경로에 의해 유도될 수 있다. 가장 잘 특성화된 소멸 수용체는 CD95("Fas"), TNFR1(p55), 소멸 수용체 3(DR3 또는 Apo3/TRAMO), DR4 및 DR5(아포2-TRAIL-R2)이다. 세포사멸의 최종 효과기 기전은 카스파제로서 나타내는 일련의 프로테이나제의 할성화이다. 이들 카스파제의 활성화는 일련의 생명에 필요한 세포 단백질의 절단 및 세포사를 발생시킨다.
본 발명은 메소텔린을 발현하는 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 태양에서, 세포에서의 세포사멸의 유도 방법은 세포 표면 마커로서 메소텔린을 발현하는 세포를 본 발명의 RIT에 노출시키거나 접촉시키는 단계를 포함한다. 전형적으로, 상기 세포를 유효량의 면역접합체에 노출시키거나 접촉시키며, 여기에서 상기 접촉은 세포사멸의 유도를 발생시킨다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 환자에게 본 발명의 RIT를 투여하는 단계를 포함하는, 표면상에서 메소텔린을 발현하는 종양 세포가 세포사멸을 겪도록 유도하는 방법을 제공한다.
하나 이상의 세포 표면 마커를 갖는 세포의 성장, 과잉증식 또는 생존을 억제하기 위한 조성물의 용도
본 발명의 목적은 본 발명의 조성물을 사용하여 암을 치료하기 위한 개선된 치료 전략을 제공하는 것이다. 본 발명의 하나의 태양에서, 세포의 불필요한 성장, 과잉증식, 및 생존 중 하나 이상을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표면 마커로서 메소텔린을 발현하는 세포를, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 키메릭 분자의 부분으로서 유효량의 본 발명의 PE와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 접촉 단계는 상기 세포의 불필요한 성장, 과잉증식 및 생존 중 하나 이상을 억제한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 세포가 하나 이상의 세포 표면 마커, 예를 들어 세포 표면 수용체를 발현하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 상기 세포를 유효량의 면역접합체에 노출시키거나 접촉시키며, 여기에서 상기 접촉은 불필요한 성장, 과잉증식 및 생존 중 하나 이상을 억제한다.
따라서, 본 발명의 하나의 태양에서 메소텔린을 갖는 세포 집단의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 세포 집단을 본 발명에 따른 키메릭 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다수의 종양들이 전이를 형성한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 태양에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 전이의 형성을 예방한다. 상기 방법은 종양 세포에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 투여는 전이를 예방한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 세포 표면 항원에 대한 항체 및 본 발명의 PE를 포함하는 표적화된 독소를 포함한다. 전형적으로, 상기 세포를 유효량의 면역접합체에 노출시키거나 접촉시키며, 여기에서 상기 접촉은 전이를 예방한다. 성장, 확산 및/또는 진행이 억제될 수 있는 예시적인 암은 난소암, 중피종, 비-소세포 폐암, 폐 선암종 및 췌장암을 포함한다.
암을 치료하기 위한 조성물의 용도
본 발명의 방법을 시험관 내 및 생체 내에서 실행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 태양에서, 암성 상태를 앓고 있는 환자의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 암으로 진단된 환자에게 치료 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 RIT를 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 암성 상태는 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현하는 세포의 불필요한 성장 또는 증식을 특징으로 하고, 상기 투여 단계는 상기 환자를 치료한다. 전형적으로, 상기 세포를 유효량의 면역접합체에 노출시키거나 접촉시키며, 여기에서 상기 접촉은 상기 환자를 치료한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 PE를 포함하는 면역독소를 사용하여 메소텔린-CA125 결합 상호작용에 의해 매개된 암을 앓고 있는 환자를 치료한다. 성장, 확산 및/또는 진행이 CA125/메소텔린 결합에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 예시적인 암은 난소암, 중피종, 비-소세포 폐암, 폐 선암종 및 췌장암을 포함한다.
암의 치료 방법은 하기의 단계들 중 하나 이상을 임의로 포함할 수 있다: 개인으로부터 조직 또는 체액의 생물학적 샘플을 수득하고; 상기 생물학적 샘플을 상기 표면 마커에 대한 항체와 접촉시킴으로써 상기 생물학적 샘플을 메소텔린의 발현에 대해 선별하거나, 또는 표면 마커 mRNA를 검출함으로써 상기 표면 마커 폴리뉴클레오타이드의 발현에 대해 상기 생물학적 샘플을 선별한다. 이를 당해 분야에 공지된 표준 기술, 예를들어 웨스턴 블럿팅, 노던 블럿팅(northern blot) 또는 PCR을 사용하여 수행할 수 있다.
하나 이상의 세포 표면 마커를 갖는 세포의 존재에 의해 유발되는 질병이 발생된 환자를 치료하기 위한 조성물의 용도
메소텔린을 우선적으로 갖거나 과발현하는 세포의 존재 또는 이상 증식에 의해 유발되는 질병이 발생된 포유동물에 대한 요법을 제공하는 방법을 또한 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 상기 포유동물에게 본 발명의 RIT를 투여하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 상기 세포를 유효량의 면역독소에 노출시키거나 접촉시키며, 여기에서 상기 접촉은 상기 환자를 치료한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 RIT를 사용하여 표적 세포를 시험관 내 또는 생체 외에서 제거함을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 RIT를 포함하는 키메릭 분자를 사용하여 배양물 중의 세포 집단으로부터 표적화된 세포를 제거할 수 있다. 따라서, 예를 들어 메소텔린을 발현하는 암을 갖는 환자로부터 배양된 세포는, 상기 배양물을 본 발명에 개시된 바와 같이 메소텔린을 향한 키메릭 분자와 접촉시킴으로써 암 세포가 제거될 수 있다.
일부 예에서, 상기 표적 세포를 생물학적 샘플 내에 함유시킬 수도 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이 "생물학적 샘플"은 표적 세포 및 비-표적 세포를 함유하는 생물학적 조직 또는 체액의 샘플이다. 상기와 같은 샘플은 비제한적으로 생검으로부터의 조직, 혈액 및 혈액 세포(예를 들어 백혈구)를 포함한다. 생물학적 샘플을 전형적으로는 다세포 진핵생물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 래트, 마우스, 소, 개, 기니 피그, 또는 토끼, 및 보다 바람직하게는 영장류, 예를 들어 마카크, 침팬지, 또는 인간으로부터 수득한다. 가장 바람직하게는, 상기 샘플은 인간으로부터의 것이다.
본 발명의 RIT에 의한 치료에 대한 반응을 모니터하는 방법
본 발명은 본 발명의 RIT에 의해 치료될 수 있는 암을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 환자에게서 종양 성장의 억제를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 RIT를 사용하여 환자에게 투여되는 치료 과정을 모니터링하는데 특히 유용하다. 상기 방법을 사용하여 징후를 나타내는 환자에 대한 치료학적 치료 및 징후를 나타내지 않는 환자에 대한 예방적 치료 모두를 모니터할 수 있다.
상기 모니터링 방법은 본 발명의 RIT의 투여량을 투여하기 전에 환자에서의 종양 크기의 기준값을 측정하고 이를 치료 후 상기 종양 크기에 대한 값, 또는 치료를 받지 않은 환자에서의 종양 크기와 비교함을 수반한다.
상기 종양 크기 값의 현저한 감소(즉 동일한 샘플의 반복 측정에서 실험 오차의 전형적인 한계보다 큰, 상기와 같은 측정의 평균으로부터 1 표준 편차로서 나타낸다)는 양의 치료 결과(즉, 본 발명의 RIT의 투여는 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 차단하였다는 결과)를 나타낸다.
다른 방법들에서, 종양 크기의 대조용 값(즉 평균 및 표준 편차)을 대조용 집단 또는 정상 집단(예를 들어 크기 = 0)에 대해서 측정한다. 전형적으로, 상기 대조용 집단의 개인들은 선행 치료를 받지 않았다. 이어서 본 발명의 RIT를 투여한 후 환자의 종양 크기의 측정값을 상기 대조용 값과 비교한다. 상기 대조용 값에 대한 종양 크기의 현저한 감소(예를 들어 상기 평균으로부터 1 표준 편차보다 큰)는 양의 치료 결과를 나타낸다. 현저한 감소 또는 증가의 결여는 음의 치료 결과를 나타낸다.
다른 방법들에서, 종양 크기의 대조용 값(예를 들어 평균 및 표준 편차)을 본 발명에 개시된 바와 같이, 예를 들어 키메릭 분자의 부분으로서 본 발명의 RIT의 섭생을 받는 치료를 겪은 개인의 대조용 집단으로부터 측정한다. 환자의 종양 크기의 측정값을 상기 대조용 값과 비교한다. 환자에서 상기 측정된 수준이 현저하게 상이하지 않은 경우(예를 들어 1 표준 편차를 초과하는 경우), 치료를 중단할 수 있다. 환자에서의 상기 종양 크기 수준이 현저하게 상기 대조용 값 이상인 경우, 계속되는 작용제의 투여가 정당화된다.
다른 방법들에서, 현재는 치료를 받지 않지만 앞서 치료 과정을 겪은 환자를 종양 크기에 대해 모니터하여 치료의 재개가 필요한 지의 여부를 결정한다. 상기 환자의 종양 크기의 측정된 값을 선행 치료 과정 후 상기 환자에게서 앞서 성취된 종양 크기의 값과 비교할 수 있다. 선행 측정에 대한 종양 크기의 현저한 증가(즉 동일한 샘플의 반복 측정에서 오차의 전형적인 한계보다 큰)는 치료를 재개할 수 있음을 가리킨다. 한편으로, 환자에서 측정된 상기 값을 치료 과정을 겪은 후의 환자 집단에서 측정된 대조용 값(평균 + 표준 편차)과 비교할 수 있다. 한편으로, 환자에서 측정된 값을, 질병의 증상이 없는 채로 남아있는 예방학적으로 치료된 환자 집단 또는 질병 특성의 개선을 보인 치료학적으로 치료된 환자 집단에서의 대조용 값과 비교할 수 있다. 이들 모든 경우에서, 상기 대조용 값에 대한 종양 크기의 증가(즉 표준 편차보다 큰)는 환자에게서 치료를 재개해야 함을 가리킨다.
분석을 위한 조직 샘플은 전형적으로 환자로부터의 혈액, 혈장, 혈청, 점액, 조직 생검, 종양, 복수 또는 뇌척수액이다. 상기 샘플을 종양형성에 대한 표시를 위해서 분석할 수 있다. 종양형성 또는 종양 크기를 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 자격을 갖춘 병리학자에 의한 생검의 가시적인 관찰, 또는 다른 가시화 기법, 예를 들어 방사선 촬영, 초음파, 자기 공명 영상(MRI)을 사용하여 탐지할 수 있다.
키트, 용기, 장치, 및 시스템
상술한 진단, 연구, 및 치료 용도들에 사용하기 위해서, 키트 및 시스템이 본 발명에 의해 또한 제공된다. 본 발명의 키트는 예를 들어 키메릭 분자의 부분으로서 본 발명의 RIT를 포함할 것이다. 또한, 상기 키트 및 시스템은 본 발명 방법의 실시를 위한 지시(즉 프로토콜)를 함유하는 설명 자료를 포함할 수 있다. 상기 설명서는 다양한 형태로 주 키트 중에 존재할 수 있으며, 상기 형태들 중 하나 이상이 상기 키트 중에 존재할 수 있다. 상기 설명 자료는 전형적으로는 서면 또는 인쇄된 자료를 포함하지만, 이와 같은 것들로 제한되지 않는다. 상기와 같은 설명서를 보관할 수 있고 상기 설명서를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에 의해 고려된다. 상기와 같은 매체는 비제한적으로 전자 저장 매체(예를 들어 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어 CD ROM) 등을 포함한다. 상기와 같은 매체는 상기와 같은 설명 자료를 제공하는 인터넷 사이트에 대한 주소를 포함할 수 있다.
광범위하게 다양한 키트, 시스템 및 조성물을 상기 키트 및 시스템의 의도된 사용자 및 상기 사용자의 특정한 필요에 따라, 본 발명에 따라 제조할 수 있다.
상기 활성 조성물의 단위 용량, 예를 들어 경구, 질, 직장, 경피 또는 주사 가능한 용량(예를 들어 근육 내, 정맥 내, 또는 피하 주사)을 갖는 키트를 제공한다. 상기와 같은 키트 중에는, 상기 단위 용량을 함유하는 상기 용기 외에, 질병 또는 악성 상태의 치료에 있어서 상기 조성물의 사용 및 부수적인 이점들을 기술하는 정보 패키지 삽입물이 있을 것이다. 적합한 활성 조성물 및 단위 용량은 본 발명에서 상기에 개시된 것들이다.
상기 발명을 예시, 및 명료성 및 이해를 위한 예에 의해 일부 상세히 개시하였지만, 본 발명의 교시에 비추어 일부 변화, 변이, 변형 및 등가물의 치환이, 본 발명의 진의 및 범위로부터 반드시 이탈되지는 않으면서 수행될 수 있음은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 쉽게 자명할 것이다. 그 결과, 본 발명에 개시된 실시태양들에 다양한 변형, 변화 등이 가해지며, 이때 본 발명의 범위는 오직 본 발명에 첨부된 특허청구범위를 기준으로 결정된다. 당해 분야의 숙련가들은 필수적으로 유사한 결과를 제공하도록 변화, 변경 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수들을 쉽게 알 것이다. 본 발명에 사용된 용어가 단지 특정한 실시태양을 기술하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 단지 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한을 의미하지 않음은 또한 물론이다.
본 발명의 요소들을 각각 본 발명에서 다수의 실시태양들을 함유하는 것으로서 개시하지만, 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 주어진 요소의 실시태양들이 각각 본 발명의 다른 요소들의 각각의 실시태양과 함께 사용될 수 있고 각각의 상기와 같은 사용이 본 발명의 독특한 실시태양을 형성하고자 함은 물론이다.
본 발명에서 지칭된 참고 특허, 특허 출원, 및 진뱅크(GenBank) 데이터베이스 서열의 수탁 번호를 포함한 과학 문헌은, 마치 각각의 개별적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 인용됨을 가리키는 것처럼, 본 발명에 내용 전체가 참고로 인용된다. 본 발명에 인용된 임의의 참고문헌과 본 명세서의 특정한 교시들 간의 임의의 불일치는 본 명세서의 편에서 해결될 것이다. 마찬가지로, 단어 또는 어구의 당해 분야에서 이해되는 정의와 본 명세서에서 구체적으로 교시되는 바와 같은 단어 또는 어구의 정의 간의 임의의 불일치도 본 명세서의 편에서 해결될 것이다.
상기 명세로부터 인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 광범위하게 다양한 용도를 갖는다.
본 발명을 하기의 실시예들에 의해 추가로 예시하며, 이들 실시예는 단지 예시적인 것이고 본 발명의 정의 및 범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않는다.
실시예
하기의 실시예들은 특허청구된 발명을 예시하기 위해 제공되며, 상기 발명을 제한하고자 제공되는 것은 아니다.
실시예 1
단백질
SS1P(SS1(dsFv)-PE38) 및 SS1P로부터 유도된 모든 돌연변이체들을 개시된 바와 같이 SS1(VH)-PE 및 SS1(VL)에 대한 벡터로부터 에스케리키아 콜라이 BL21(λDE3)에서 발현시키고 후속으로 리폴딩하고 정제시켰다(문헌[Pastan I, Beers R, and Bera TK, Methods Mol Biol., 248:503-18 (2004)] 참조). SS1P의 모액은 어드밴스드 바이오사이언스 레보라토리즈 인코포레이티드(Advanced BioScience Laboratories, Inc.)(미국 메릴랜드주 켄싱톤 소재)에 의해 제조되었다. 다른 모든 RIT들은 더 레보라토리 오브 몰레큘라 바이올로지(the Laboratory of Molecular Biology), 국립 암 연구소(미국 메릴랜드주 베데스다 소재)에서 제조되었다. SS1P의 돌연변이는 로프스트랜드 랩스 리미티드(Lofstrand Labs Limited)(미국 메릴랜드주 게더스버그 소재)로부터의 프라이머와 함께 퀵체인지(Quickchange) 부위-특이적 돌연변이(스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 생성되었다.
세포주
다양한 메소텔린-양성 인간-유래된 세포주를 본 연구에 사용하였다. L55 폐 선암종 및 M30 중피종 세포주는 펜실바니아 대학(미국 펜실바니아주 필라델피아 소재)의 스티븐 알벨다 박사(Dr. Steven Albelda)에 의해 제공되었다. HAY 중피종 세포주는 스텔린 암 연구 재단(Stehlin Foundation for Cancer Research)(미국 텍사스주 휴스톤 소재)에 의해 제공되었다. OVCAR-8 및 A1847 난소암 세포주는 각각 국립 암 연구소(미국 메릴랜드주 베데스다 소재)의 히사타카 고바야시 박사(Dr. Hisataka Kobayashi)와 에스 아론슨 박사(Dr. S. Aaronson)에 의해 제공되었다. NCI-H322M 폐 선암종 세포주는 국립 암 연구소(미국 메릴랜드주 베데스다 소재)의 밋첼 호 박사(Dr. Mitchell Ho)로부터 수득되었다. KB31 세포주는 인간 상피 암종 KB 세포주의 서브-클론이다(문헌[Akiyama S et al., Somat Cell Mol Genet., 11(2):117-26 (1985)] 참조). 세포주 A431/K5는 인간 메소텔린으로 형질감염되고(문헌[Chowdhury PS et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95:669-674(1998)] 참조), 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 100 U 페니실린, 100 ㎍ 스트렙토마이신, 및 750 ㎍/㎖ G-418(제네티신)이 보충된 둘베코의 변형된 필수 배지(DMEM)에서 증식시킨 A431 상피암종 세포주의 유도체이다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 세포주들을 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 100 U 페니실린, 및 100 ㎍ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지(인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 5% CO2와 함께 37 ℃에서 증식시켰다.
세포독성 분석
면역독소로 처리된 세포주의 생육력을 필수적으로 기술 매뉴얼에 개시된 바와 같은 세포 카운팅 키트-8 WST-8 분석(도진도 몰레큘라 테크놀로지스 인코포레이티드(Dojindo Molecular Technologies, Inc.), 미국 메릴랜드주 게더스버그 소재)을 사용하여 측정하였다. 간단히, 5,000 내지 10,000 세포/웰을 96-웰 플레이트에 도말하고, 부착시키고, 다양한 농도의 RIT와 함께 0.2 ㎖의 최종 부피로 72 시간 동안 배양하였으며, 그 후에 10 ㎕의 CCK-8 시약을 각 웰에 가하였다. 플레이트를, 450 ㎚에서 최대 흡광도를 갖는 상기 웰이 약 1 OD의 값에 도달할 때까지 37 ℃에서 배양하였다. 값들을 사이클로헥스아미드(10 ㎍/㎖)와 완충제(PBS 중의 0.2% 인간 혈청 알부민) 대조군들 사이에서 표준화하고 그래프패드 프리즘(GraphPad PRISM) 프로그램을 사용하여 가변 기울기를 갖는 표준 4-매개변수 S자 식에 대입하여 면역독소의 농도(상기 농도에서 50% 세포사(EC50)가 존재하였다)를 획득하였다.
중피종 환자로부터의 다양한 세포들에 대한 분석을 개시한 바와 같이 분석하였다. 간단히, 세포를 중피종 환자의 흉수 또는 복수로부터 수득하고 이를 음성 대조군으로서 다양한 농도의 RIT SS1P, SS1-LR, BL22(항-CD22/PE38), 및 양성 대조군으로서 HB21(항-트랜스페린 수용체/PE38)과 함께 24-웰 플레이트에서 5 x 104 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 96 시간 동안 배양하고, 고정시키고 크리스탈 바이올렛 염료로 염색하였다. 각 웰의 색상 강도를 595 ㎚의 파장에서 베르사맥스(Versamax) 미세플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시즈 인코포레이티드(Molecular Devices, Inc.), 미국 캘리포니아주 써니베일 소재)에 의해 측정하였다. 각각의 값을 3 회 중복 측정하였다. ANOVA에 의한 상기 생성 데이터의 통계 분석을 그래프패드 프리듬 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 수행하였다.
마우스 이종이식 항종양 분석
24 마리의 암컷 누드 마우스에게 앞서 개시한 바와 같이 0 일째에 A431/K5 세포를 옆구리에 피하 주사하였다(문헌[Zhang Y, Clin Cancer Res., 12(15):4695-701 (2006)] 참조). 종양 부피를 다음 6 주 동안 캘리퍼스에 의해 규칙적으로 측정하였다. 상기 평균 종양 크기 - 100 ㎣에 도달했을 때, 이식 후 5 일째에, 마우스를 6 마리씩 4 개의 군으로 분할하고 PBS 중의 0.2-㎖의 0.2% MSA(비히클 단독) 또는 SS1P(0.3 ㎎/㎏) 또는 SS1-LR(6.0 또는 15 ㎎/㎏)을 함유하는 비히클을 QODX3으로 주사하였다. 마우스들을 그들의 종양이 1000 ㎣을 초과한 경우 또는 상기 실험의 끝에서 안락사시켰다. 동물들을 국립 암 연구소의 동물 보호관리 위원회에 의해 승인된 국립 보건원 지침에 따라 취급하였다.
RIT 내면화 분석
A431/K5 세포(106/웰)를 6-웰 플레이트(10 ㎠/세포)에 도말하고 밤새 배양시켰다. 다음 날, 각 웰 중의 배지를 평가하려는 RIT 1 ㎍을 함유하는 1 ㎖의 신선한 배지로 대체하였다. 세포를 다양한 시간 간격으로 37 ℃에서 배양하고, 그 후에 상기 웰을 간단히 2 ㎖ 저온 PBS, 1 ㎖ 저온 스트립핑 완충제(0.2 M 글리신 중의 1 ㎎/㎖ BSA, pH 2.5) 및 다시 2 ㎖ 저온 PBS로 간단히 세정하였다. 후속으로 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 함유하는 200 ㎕의 RIPA 완충제(150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.5% Na 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50 mM 트리스-Cl, pH 8.0)로 용해시켰다. 샘플을 토끼 항-PE38 다클론 항체를 사용하여 비-환원 트리스-글리신 SOS-PAGE 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다.
SS1-LR의 가변 세포독성
SS1-LR을 사용한 초기 실험들은 상기 SS1-LR이 메소텔린-발현 세포주의 선택에 대해 SS1P에 비해, 4 배 초과 더 활성 내지 20 배 덜 활성인 범위의 매우 가변적인 세포독성을 가졌음을 입증하였다. 그러나, 일반적인 성향은 덜 활성인 분자쪽이었다. SS1-LR은 시험된 8 개의 세포주 중 5 개에 대해서 SS1P에 비해 20%를 초과하여 덜 활성이었으며, 오직 하나의 세포주에 대해서 20%를 초과하여 더 활성이었다. 이러한 성향은, 전형적으로 상기 두 세포주와 환자 세포 모두에 대해 유사하거나 증가된 세포독성을 나타낸(문헌[Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009)] 참조) 상기 LR 분자의 항-CD22 변형인, HA22-LR과는 현저하게 상이하다. 이러한 관찰은 메소텔린을 발현하는 상피 세포 및 CD22를 발현하는 B 세포에서의 PE의 중독 경로 간에 본질적인 차이가 존재함을 가리킨다.
Figure pct00002
시험관 내 SS1-LR 활성
면역독소 SS1P(도 1A)는 PE38에 결합된 다이설파이드-안정화된 2-쇄 항메소텔린 SS1 Fv로 이루어진다(문헌[Chowdhury PS et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95: 669-674 (1998)]; 문헌[Chowdhury PS and Pastan I., Nat Biotechnol., 17: 568-572 (1999)]; 문헌[Reiter Y and Pastan I., Clin. Cancer Res., 2: 245-252 (1996)] 참조). 본 발명자들은 상기 LR 돌연변이(문헌[Weldon JE, Blood., 113(16):3792-800 (2009); PE Δ251-273 & Δ285-394])를 SS1P에 도입시켜 SS1-LR 변체(도 1B)를 생성시키고 그의 활성을 시험관 내에서 다수의 메소텔린-발현 세포주에 대해 SS1P와 비교하여 평가하였다. 도 2a 내지 2d는 8 개의 상이한 세포주로부터의 전형적인 세포독성 분석을 도시한다.
폐암 세포주 L55(A)는 2 개의 RIT 모두에 대해 유사한 민감성을 보였다. 대조적으로, 폐암 주 NCI-H322M(문헌[Pal LH et al., Nat Med., 2(3):350-3 (1996)])은 SS1P에 대해서보다 SS1-LR에 대해서 대략 3 배 덜 민감하였다. 중피종 세포주 HAY(G)는 SS1P에 대해서보다 SS1-LR에 대해서 4 배를 초과하여 더 민감한 반면, M30 중피종 주(D)는 SS-1 P-LR에 대해서 대략 20% 덜 민감하였다. 메소텔린으로 안정하게 형질감염된 상피 주, A431/K5 세포주(H)(문헌[Chowdhury PS et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95: 669-674 (1998)]; 문헌[Chang K and Pastan I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 136-140 (1996)])는 SS1P에 비해 SS1-LR에 약 4 배 덜 민감하였다. 또한, 경부암 주 KB31(C)은 SS1P에 의한 살해에 민감하지만, 그의 EC50은 SS1-LR에 대해 20 배 적다. SS1-LR에 대한 난소암 세포주 A1847(F) 및 OVCAR-8(E)의 민감성을 또한 평가하였다. SS1-LR은 A1847 주에 대해서 SS1P와 유사한 EC50을 나타내었지만, OVCAR-8 주에 대해서는 2 배 감소된 EC50을 나타내었다. 표 1은 이러한 데이터를 요약하고 SS1P와 SS1-LR을 비교하는 상대적인 EC50 값들을 나타낸다. SS1P에 대한 SS1-LR의 활성은 상이한 세포주들간에 광범위하게 다양하다.
상기 데이터를 분석했을 때, 본 발명자들은 SS1-LR이 10 ㎍/㎖ 사이클로헥스아미드로 처리한 세포에 의해 한정되는 바와 같이, 대조용 수준에 대해 우리가 평가한 다수의 세포주들(NCI-H322M, KB31, M30, OVCAR-8, 및 A1847)의 생육성을 완전히 감소시킬 수 없었음을 알았다. 이는 세포의 아집단이 SS1P에 민감할 수도 있지만, SS1-LR에는 내성일 수도 있음을 암시하였다. 본 발명자들은 OVCAR-8 및 A1847 세포를 4 일 동안 10 ng/㎖의 SS1-LR과 함께 배양하고 임의의 생존 세포를 배양하고자 함으로써 상기 가능성을 평가하였다. RIT 처리 이후에 추가의 세포 성장은 관찰되지 않았다. 본 발명자들은 본 발명의 분석에 의해 완전한 대사 억제가 획득되지 않았지만, SS1-LR에 내성인 이들 세포주의 아집단은 존재하지 않는다는 결론을 내린다.
생체 내 SS1-LR 활성
본 발명자들은 이어서 마우스 이종이식 종양 모델을 사용하여 SS1-LR의 효능을 평가하였다. 시험관 내에서 시험한 세포주들 중에서 오직 A431/K5만이 본 발명의 이종이식 모델에서 일관되게 성장하였다. 평균 100 ㎣의 A431/K5 이종이식 종양을 갖는 누드 마우스를 6.0 또는 15 ㎎/㎏ 용량의 SS1-LR로 정맥 내 QODX3(이틀마다 3 회 용량) 처리하였다. 비교를 위해서, 추가적인 군들을 완충제(PBS 중 0.2% HSA), 또는 상기 투여 스케줄 하에서 SS1P의 최대 허용 용량인 0.3 ㎎/㎏의 SS1P으로 정맥 내 QODX3 처리하였다. 각 마우스의 종양 크기를 이식 후 22 일 동안 규칙적으로 측정하였다(도 3).
PBS-처리된 마우스의 종양은 이식 후 14 일째에 1000 ㎣을 초과하는 평균 크기로 급속히 성장하였다. 5, 7 및 9 일째에 0.3 ㎎/㎏ SS1P로 처리된 마우스는 12 일째에 평균 종양 크기를 최소 약 53 ㎣로 만든 종양 퇴화를 보였다. 6.0 ㎎/㎏ 용량의 SS1-LR은 0.3 ㎎/㎏ SS1P보다 효능이 약간 덜하였다. 6.0 ㎎/㎏의 SS1-LR로 처리한 마우스의 종양은 7 및 9 일째에 92 ㎣의 평균 최소 크기에 달하였으며, 모두 18 일까지 급속한 성장을 다시 시작하였다. 15 ㎎/㎏ 용량의 SS1-LR은 0.3 ㎎/㎏ SS1P보다 현저하게 더 양호한 항종양 활성을 나타내었다. 15 ㎎/㎏ SS1-LR로 처리된 마우스의 종양은 17 ㎣의 평균 최소 크기로 퇴화하였다. 22 일째에, 6 개의 종양 중 4 개가 다시 성장을 시작하였으며, 하나의 종양은 18 일 이래로 10 ㎣에서 변하지 않았고 하나의 종양은 15 일 후에 탐지되지 않았다. SS1-LR이 상기 모델에서 SS1P보다 대략 20 배 덜 활성이지만, 그의 낮은 비특이적인 독성은 본 발명에 따라 마우스를 고 용량으로 처리하게 하며 우수한 항-종양 효과가 성취된다.
내면화된 RIT의 프로세싱
SS1P와 SS1-LR 간의 세포내 수송 및 프로세싱의 차이는 본원의 상기 두 RIT 사이에서 관찰한 활성의 변화를 설명할 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해서, 웨스턴 블럿에 의해 A431/K5 세포에서 SS1P 및 SS1-LR의 내면화 및 프로세싱을 검사하였다(도 4). A431/K5 세포를 선택하였는데, 그 이유는 상기 세포가 높은 수준의 메소텔린을 발현하고(약 106 부위/세포) 가시화를 위해 다량의 RIT를 내면화하기 때문이다. 다양한 시간 간격으로 SS1P 또는 SS1-LR 1 ㎍/㎖의 연속 배양으로 처리한 A431/K5 세포의 전체 세포 용해물 상에서 비-환원 SOS-PAGE 웨스턴 블럿을 수행하였다. 도 4A는 SS1P 처리의 시간 과정을 나타내는 반면, 도 4B는 SS1-LR 처리의 시간 과정을 나타낸다.
예상된 바와 같이, SS1P 또는 SS1-LR로 처리한 A431/K5 세포는 상기 두 RIT의 완전 길이(각각 62 kDa 및 50 kDa) 및 감소된(각각 51 kDa 및 39 kDa) 형태를 가리키는 위치들에서 현저한 밴드를 갖는다. 상기 두 RIT는 모두 Fv 영역에서 3 개의 다이설파이드 결합을 함유한다, 즉 각각 VH 및 VL 단편에서 하나의 쇄 내 결합, 및 VH 및 VL 사이의 하나의 쇄 간 결합(도 1). SS1P는 퓨린 절단 부위에 인접하는 시스테인 잔기들(Cys265 및 Cys287) 사이의 도메인 II에 추가적인 다이설파이드 결합을 함유한다. SS1P 중의 추가적인 다이설파이드 결합의 산화 상태는 SOS-PAGE에서 SS1P의 이동을 변화시키는 것으로 보이며, 이는 이중선이 관찰되게 한다(도 4A, 환원된). 이들 밴드는 환원제로 처리 시 단일 밴드로 붕괴된다(데이터 도시 안 됨).
본 발명자들은 또한 SS1P 및 SS1-LR의 C-말단 퓨린 절단 단편(각각 34-kDa 및 24-kDa)에 상응하는 밴드들의 관찰을 예상하였다. SS1P-처리된 세포로부터의 용해물은 34-kDa 근처에서 현저한 밴드를 보이며, 이는 퓨린 절단 단편을 가리킨다. 대조적으로, SS1-LR 처리된 세포로부터의 용해물은 24-kDa에 상응하는 단지 약한 밴드만을 보인다. 각 밴드의 강도를 이미지콴트(ImageQuant), 소프트웨어(GE 헬쓰케어(Healthcare))로 정량분석하였다. 도 4C는 각 시점에서의 퓨린-절단된 단편의 전체 밴드 강도 퍼센트를 나타낸다. 퓨린 절단된 SS1P는 모든 밴드 강도의 합의 30%보다 약간 더 큰 최대값에 도달하는 반면, SS1-LR은 전체 강도의 6%의 최대값에 도달한다. 각 시점에서 절단된 SS1P 및 절단된 SS1-LR의 비율 사이에 5 배를 초과하는 차이가 존재하며, 이는 SS1-LR이 SS1P보다 덜 효율적으로 퓨린에 의해 처리될 수 있음을 암시한다.
가요성 링커 돌연변이체
본 발명의 데이터가 SS1-LR이 SS1P보다 덜 효율적으로 퓨린에 의해 처리됨을 암시하기 때문에, 상기 SS1-LR의 퓨린 절단 효율을 증가시킴으로써 상기 SS1-LR의 활성을 증대시키고자 하였다. 상기 퓨린 절단 부위에 대한 변화가 세포내 퓨린 절단의 효율을 개선시킴으로써 SS1-LR의 활성을 증대시킬 수 있는지의 여부를 조사하기 위해서 다수의 돌연변이체들을 설계하였다. 본원의 전략은 짧은 조직화되지 않은 Gly/Ser 링커의 첨가에 의해 상기 퓨린 절단 부위의 가요성 및 따라서 퓨린에 대한 그의 접근성을 증가시키는 것이었다. SS1-LR/GGS(도 1B)는 11-잔기 퓨린 절단 부위의 C-말단 단부에 Gly-Gly-Ser 링커를 포함하며, NCIH322M 및 KB31 세포주 모두에 대해 증대된 활성을 갖는다(도 5). 상기 링커(SS1-LR/GGSx2; 도 1B)의 길이를 증가시키는 것은 상기 활성을 추가로 증대시키지 않는다(데이터 도시 안 됨). 추가적인 링커 영역을 갖는 퓨린 절단 부위의 중복(SS1-2x퓨린; 도 1B)도 또한 상기 활성을 SS1-LR/GGS의 활성 이상으로 증대시키지 못한다(데이터 도시 안 됨). SS1-LR과 달리, 연장된 링커 돌연변이체들은 모두 상기 사이클로헥스아미드 대조군에 동등한 완전한 대사 억제를 나타낸다. 또한, 퓨린 절단의 중요성을 확인하기 위해서, 퓨린이 상기 부위를 절단할 수 없게 만드는 R279G 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 SS1-LR/GGS R279G를 제조하였다. 상기 돌연변이체는 NCI-H322M 및 KB31 세포 모두에 대해 완전히 불활성이었으며(도 5), 이는 활성을 위한 퓨린 절단의 필요성을 입증한다.
이어서 상기 GGS 링커가 SS1-LR의 퓨린 절단 효율을 증대시킨다는 가설을 시험하였다. 그러나, SS1-LR/GGS로 처리된 A431/K5 세포의 웨스턴 블럿 분석은 전체 RIT에 비해 절단된 비율의 개선을 보이지 않았다(데이터 도시 안 됨). 마찬가지로 SS1-LR/GGS의 시험관 내 퓨린 절단은 퓨린 절단 비율의 개선을 보이지 않았다(데이터 도시 안 됨). 이러한 결과는 SS1-LR/GGS의 개선된 세포독성이 증대된 퓨린 절단에 기인하는 것이 아니라, 대신에 상이한 기전의 결과임을 가리킨다. 가능한 설명은 세포내 수송 중 상기 독소의 증대된 전좌를 포함한다.
환자 세포에 대한 활성
본 연구를 진행하는 동안, 공지된 B 세포 에피토프를 제거함으로써 RIT로 치료된 환자에서의 PE의 면역원성을 감소시키도록 도메인 III 중에 일련의 8 개의 점 돌연변이를 설계하였다(문헌[Onda M et al., Submitted for publication to PNAS] 참조). 이들 돌연변이(D406A, R432G, R467A, R490A, R513A, E548S, Q592A, & K590S)는 RIT의 활성에 영향을 미치지 않지만, 대신에 상기 단백질의 면역원성을 감소시킨다. 상기 이들 8 개의 돌연변이를 SS1-LR/GGS에 통합시켜, SS1-LR/GGS/8M이라 칭하는 새로운 변체들을 만들고 중피종 환자의 흉수 또는 복수로부터 취한 1차 세포에 대한 그의 세포독성을 시험하였다. 상기 환자로부터 취한 체액은 세포들의 혼합물을 함유하며, 이들 세포는 모두 악성인 것은 아니고 메소텔린을 균일하게 발현하는 것도 아니다. 따라서, 상기 분석은 양호한 상대 활성 평가를 제공하지만 이는 단지 절대 세포독성의 대략적인 평가이다. 세포를 초기 계대배양에서 다양한 농도의 SS1P 또는 SS1-LR/GGS/8M으로 처리하고 생육성을 개시된 바와 같이 크리스탈 바이올렛 분석에 의해 4 일 후에 평가하였다. SS1P에 대한 반응에 대해 평가된 다수의 환자 세포 중에서, 2 개(NCI-M-02 및 NCI-M-03)는 치료에 양호한 반응을 나타내었다(100 ng/㎖ 용량 수준에서 >65% 생육성 감소). 본 발명자들은 이들 두 집단에 대한 SS1P-LR/GGS/8M의 활성을 평가하고 이를 SS1P의 활성에 대해 비교하였다. 상기 데이터를 처리되지 않은 대조용 값의 분수 값들로서 도 6에 나타낸다.
상기 두 환자 세포 NCI-M-02 및 NCI-M-03은 SS1P 또는 SS1-LR/GGS/8M에 의한 처리에 민감하였으며, 이는 100 ng/㎖ 이하의 용량에서 처리되지 않은 대조군에 비해 60% 초과의 생육성의 감소를 나타내었다. NCI-M-02 및 NCI-M-03은 1.0 및 10 ng/㎖ 용량 수준에서 SS1-LR/GGS/8M에 대해 특히 민감하였으며, 이는 이들 농도에서 SS1P에 비해 현저하게 더 높은 세포독성을 나타내었다(p<0.05). 대조군으로서, 상기 환자 세포를 또한 RIT BL22 및 BL21로 처리하였다(데이터 도시 안 됨). B 세포 특이성 마커 CD22를 표적화하는 BL22는 100 ng/㎖의 용량에서 어느 세포 집단의 생육성에도 영향을 미치지 않았다. 편재하는 트랜스페린 수용체를 표적화하고 거의 모든 세포에 대해 대단히 활성인 것으로 공지된 HB21은 10 ng/㎖의 용량에서 상기 두 세포주의 생육성을 거의 90%까지 감소시켰다. 종합하자면, 상기 데이터는 SS1-LR/GGS/8M이 2 개의 상이한 환자 세포 집단에 대해서 SS1P와 유사하거나 또는 이보다 양호한 세포독성을 가졌음을 보인다. 우리는 상기 두 항-메소텔린 면역독소가, 동일하게 작용하지는 않지만, 필적할만한 세포독성 활성을 갖는다는 결론을 내린다.
실시예 2
추가로, 개선된 치료 성질을 갖는 SS1P의 변체인 SS1-LR/GGS/8M의 제작, 평가 및 대조에 대한 보고서를 확장하였다. 상기에 논의된 바와 같이, SS1-LR/GGS/8M은 RIT를 개선시키기 위해 앞서 나타낸 돌연변이뿐만 아니라 그의 활성을 증대시키는 신규의 돌연변이를 포함한다. SS1-LR은 11-잔기 PE 퓨린 절단 부위에 의해 SS1 Fv에 결합된 PE의 촉매 단편을 함유하는 SS1P의 절두된 변체이다. SS1-LR의 세포독성을 7 개의 세포주에 대해서 평가하였으며 상기 독성은 SS1P보다 실질적으로 낮은 것으로 밝혀졌다. 배양된 세포에서 SS1-LR의 추가의 분석은 상기 SS1-LR이 중독 경로 동안 퓨린에 의해 불충분하게 처리됨을 가리켰다. 퓨린 절단을 개선시키기 위해서 3-잔기 링커를 SS1-LR에 도입시켜 SS1-LR/GGS를 생성시켰다. SS1-LR/GGS는 세포주들에 대해서 현저하게 더 활성이었으나, 증대된 퓨린 절단은 보이지 않았다. SS1-LR/GGS의 촉매 단편 내에, B 세포 에피토프를 제거함으로써 RIT 면역원성을 감소시키는 것으로 입증된 8 개의 점 돌연변이를 도입시켰다. 상기 신규의 RIT, SS1-LR/GGS/8M은 본 발명에서 탁월한 항-종양 활성, 설치류에서 낮은 비특이적 독성, 및 항-SS1P 인간 혈청과의 감소된 반응성을 나타낸다. 더욱 또한, 중피종 환자로부터의 1차 세포는 SS1P에 비해 SS1-LR/GGS/8M에 대해 증대된 반응을 나타낸다. SS1-LR/GGS/8M은 그의 낮은 항원성, 낮은 비특이적 독성, 및 높은 활성으로 인해 임상적 개발에 우수한 치료제 후보이다.
다수의 메소텔린-양성 인간-유래한 세포주를 상기 연구에 사용하였다. 이들 세포를 일반적으로 공급받고 실시예 1에 제공된 바와 같이 증식시켰다.
세포독성 분석
면역독소로 처리된 세포주의 생육성을 세포 카운팅 키트-8 WST-8 분석(도진도 몰레큘라 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 메릴랜드주 게더스버그 소재)을 사용하여 측정하였다. 세포(2,000 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 도말하고, 밤새 부착되도록 방치하고, 다양한 농도의 RIT와 함께 0.2 ㎖의 최종 부피로 72 시간 동안 배양하였다. 상기 배양 기간의 끝에서, 10 ㎕의 CCK-8 시약을 각 웰에 가하고 상기 플레이트를, 450 ㎚에서 최대 흡광도를 갖는 웰들이 약 1 OD의 값에 도달할 때까지 37 ℃에서 배양하였다. 값들을 사이클로헥스아미드(10 ㎍/㎖)의 대조군과 완충제(0.2% 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는, Ca 및 Mg가 없는 둘베코의 포스페이트 완충된 염수(D-PBS; 콸러티 바이올로지컬 인코포레이티드(Quality Biological, Inc.), 미국 메릴랜드주 게더스버그 소재)) 사이에서 표준화하고, 이어서 그래프패드 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 평탄역, 기준선 및 힐 기울기에 대한 가변 기울기들을 갖는 S자 식에 대입하였다. 상기 식을 후속으로 사용하여, 세포 생육성을 50% 수준까지 감소시키는 RIT의 농도(EC50)를 보간하였다.
중피종 환자로부터의 세포를 배양하고 필수적으로 개시된 바와 같이(문헌[Xiang X, et al., PLoS One 2011;6:e14640] 참조) SS1P 및 SS1-LR/GGS/8M에 대한 상기 세포의 반응을 평가하였다. D-PBS 및 10 ng/㎖ HB21(항트랜스페린 수용체/PE40)을 세포사에 대한 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 각각의 조건을 3 회 중복 평가하였다. ANOVA에 의한 생성 데이터의 통계분석을 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
마우스 이종이식 항종양 분석
28 마리의 암컷 누드 마우스에게 0 일째에 4 ㎎/㎖의 매트리젤(BD 바이오사이언스즈, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)이 있는 0.2 ㎖ RPMI 중의 5 x 106 L55 세포를 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 부피를 다음 30 일 동안 캘리퍼스에 의해 규칙적으로 측정하였다. 이식(약 100 ㎣ 평균 종양) 후 7 일째에, 마우스들을 4 개의 동등한 군들로 나누고 7, 9 및 12 일째에 0.2 ㎖의 D-PBS 중의 0.2% HSA(비히클) 또는 SS1P(0.4 ㎎/㎏) 또는 SS1-LR/GGS/8M(0.4 또는 2.5 ㎎/㎏)을 함유하는 비히클로 정맥 내 주사하였다. 상기 실험 및 모든 후속 동물 실험을 국립 암 연구소의 동물 보호 관리 위원회에 의해 승인된 국립 보건원 지침에 따라 취급하였다.
마우스 혈청 약동학
9 마리의 암컷 Balb/c 마우스 군들에게 0.2% HSA가 있는 0.2 ㎖ D-PBS 중의 SS1P 또는 SS1-LR/GGS/8M 10 ㎍을 정맥 내 주사하였다. 3 마리 마우스의 군들을 2 및 20, 5 및 30, 또는 10 및 60 분의 시간 간격으로 채혈하였다. 혈청을 앞서 개시된 바와 같이(문헌[Bang S, et al., Clin Cancer Res 2005;11:1545-50.25)] 참조) 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해 분석하였다.
래트 모세혈관 누출 분석
RIT-유도된 모세혈관 누출 증후군의 앞서 개시된 래트 모델(문헌[Siegall CB, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:9514-8] 참조)을 사용하여 SS1-LR/GGS/8M의 비특이적 독성을 평가하였다. 간단히, 6 내지 8 주된 암컷 위스타 퍼트핸드 로웨트(Wistar Furthand Rowett), nu/nu(무흉선) 래트(할란 스프래그 다우리)(Harlan-Sprague-Dawley)에 D-PBS, SS1P(0.2 또는 0.3 ㎎/㎏) 또는 SS-1LR/GGS/8M(6 또는 12 ㎎/㎏)을 정맥 내 주사하였다. 24 시간 후에, 상기 래트를 CO2에 노출시킴으로써 안락사시켰다. 상기 동물 시체를 배면 횡와 위치로 놓고, 복부 가슴벽을 제거하여 체액을 3 ㎖ 주사기 및 27.5 게이지 바늘을 사용하여 흡출함으로써 상기 안락사시킨 동물로부터 흉수를 수거하였다. 다수의 래트로부터 폐를 회수하고, 3 일 동안 10% 포르말린 중에서 고정시키고, 절단하고, 염색하였다.
상기 RIT 내면화 분석을 필수적으로 상술한 바와 같이 수행하였으며, 이때 샘플들을 토끼 항-PE38 다클론 항체를 사용하여 비-환원 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다.
항원성 분석
환자 혈청 중의 항체에 대한 SS1P 또는 SS1-LR/GGS/8M의 결합을 필수적으로 개시된 바와 같이 분석하였으나(문헌[Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:5742-7] 참조), 단 ELISA에 의한 PE-특이 항체의 검출에 CD22-rFc 및 HA22를 사용하였다.
결과
시험관 내 SS1-LR 활성
면역독소 SS1P(도 1)는 PE38에 결합된 다이설파이드-안정화된 2-쇄 항-메소텔린 SS1 Fv이다. LR 돌연변이(문헌[Weldon JE, et al. Blood 2009;113:3792-800] 참조; PE Δ251-273 & Δ285-394])를 SS1P에 도입시켜 SS1-LR을 생성시키고 시험관 내에서 7 개의 메소텔린발현 세포주에 대한 그의 활성을 평가하였다. 표 2는 평균 EC50 값 및 상기 평균에 대한 표준 오차로서 3 개 이상의 별도의 세포독성 실험들로부터의 데이터를 요약한다. SS1P에 비해, SS1-LR은 HAY 세포주에 대해 보다 활성이었으나, 나머지 주들에 대해서는 덜 활성이었다. SS1-LR의 활성은 상이한 세포주들 간에 광범위하게 다양하였으나, 난소암 주에 대해서 최소로 활성이었다.
Figure pct00003
SS1-LR/GGS/8M
면역원성은 PE-기재 RIT에 중요한 문제로 남아있다(문헌[Weldon JE, et al., FEBS J. 2011 Dec;278(23):4683-700] 참조). HA22-LR을 HA22와 비교하는 연구(문헌[Hansen JK, et al., J Immunother 2010;33:297-304] 참조)는 SS1-LR이 SS1P보다 덜 면역원성이며, 그럼에도 불구하고 PE의 나머지 요소들이 중화 항체를 신속히 유도할 것임을 예상케 한다. PE 중의 면역원성 B 세포 에피토프를 제거하기 위해서, 도메인 III에서의 일련의 8 개의 점 돌연변이가 최근에 설계되었다(문헌[Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:5742-7] 참조). 이들 돌연변이(D406A, R432G, R467A, R490A, R513A, E548S, Q592A, 및 K590S)는 마우스에서 HA22-LR의 면역원성을 대단히 감소시키나 그의 세포독성은 크게 감소시키지 않는다. SS1-LR/GGS 내에 상기 돌연변이를 통합시켜, SS1-LR/GGS/8M이라 칭하는 신규의 변체를 제조하였으며, 상기 RIT를 7 개의 메소텔린-발현 세포주에 대해 시험하였다. 이들 실험으로부터의 EC50 값을 표 2에 기록한다. SS1-LR/GGS/8M은 SS1-LR보다 더 활성이며 때때로 SS1P(HAY, L55)보다 더 활성이나, SS1-LR/GGS보다는 덜 활성이다. 상기 활성의 감소는 난소암 주들에 대해서 특히 자명하다.
비-특이적 독성
항-CD22 RIT HA22에 대한 선행 연구에서, 2 ㎎/㎏ HA22의 단일 정맥 내 용량이 마우스에 치명적인 반면, 20 ㎎/㎏ HA22-LR의 용량은 독성을 보이지 않음을 발견하였다(문헌[Weldon JE, et al., Blood 2009;113:3792-800] 참조). 그 후에 45 ㎎/㎏ 정도로 높은 HA22-LR의 단일 용량을 마우스에게 사망을 유발하지 않고(공개되지 않은 관찰, 데이터 도시 안 됨)제공하였으며, SS1-LR 및 그의 변체로부터 유사한 양상을 예상하였다. 선행의 실험들은 SS1P의 단일-용량 정맥 내 LD50을, Balb/C 마우스에서 1.0 ㎎/㎏(문헌[Filpula D, et al., Bioconjug Chem 2007;18:773-84] 참조) 및 NIH 스위스 마우스에서 0.75 ㎎/㎏(문헌[Onda M., et al., Cancer Res 2001;61:5070-7] 참조)으로 평가하였다. 임상적인 스케줄과 유사한 QODx3(이틀마다 3 회 투여) 투여 스케줄을 사용한 경우, 마우스는 0.4 ㎎/㎏ SS1P의 최대 용량(공개되지 않은 관찰, 데이터 도시 안 됨)을 허용하였으나, SS1-LR 제공된 마우스는 15 ㎎/㎏ QODx3 이하의 용량을 독성 없이 수용하였다(데이터 도시 안 됨).
마우스에서 LR-기재 RIT의 감소된 비특이적 독성은 흥미를 자아내지만, 임상 시험에서 관찰된 주요 독성들과 관련되지 않을 수도 있다. 마우스에서 RIT 비특이적 독성은 간 손상의 결과이며(문헌[Weldon JE, et al., Blood 2009;113:3792-800]; 문헌[Onda M, et al., J Immunol. 2000;165:7150-6] 참조), 이는 환자에서 흔하게 관찰되지 않는다. 비특이적 독성의 보다 적합한 동물 모델은 래트에서 RIT-유도된 모세혈관 누출 증후군이다(문헌[Siegall CB, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:9514-8.], 문헌[Siegall CB, et al., Clin Cancer Res 1997;3:339-45] 참조). 혈관으로부터 간질 공간 내로 체액이 누출되는 모세혈관 누출 증후군은 PE-기재 RIT의 임상 시험에서 관찰되는 통상적인 독성이다. 상기 모델을 사용하여, 우리는 2 ㎎/㎏ SS1P로 정맥 내 처리한 래트가 24 시간 후에 병색을 띠는 것을 관찰하였으며; 상기 래트는 숨쉬려고 노력하였고 그의 흉강에 체액이 누적되었다(도 7A). SS1P의 용량을 3 ㎎/㎏으로 증가시키는 것은 흉수의 부피를 증가시켰다. 대조적으로, D-PBS 또는 SS1-LR/GGS/8M으로 처리된 래트는 질병의 징후를 보이지 않았으며 체액을 보유하지 않았다. 6 ㎎/㎏ 및 12 ㎎/㎏ SS1-LR/GGS/8M의 용량이 관찰 가능한 효과 없이 투여되었다. D-PBS, SS1P 및 SS1-LR/GGS/8M으로 처리된 래트의 폐를 고정시키고 염색했을 때, D-PBS 또는 SS1-LR/GGS/8M으로 처리된 것들은 정상으로 보인 반면, SS1P로 처리된 래트로부터의 것은 심한 손상의 징후를 보였다(도 7B). LR-기재 분자를 임상적으로 시험하지는 않았지만, 상기 관찰은 상기 LR-기재 RIT가 환자에서 감소된 독성을 가질 수도 있다는 주장을 강화시킨다.
생체 내 SS1-LR/GGS/8M 활성
이어서 L55 폐암 세포주를 사용하는 마우스 이종이식 종양 모델로 SS1-LR/GGS/8M의 효능을 평가하였다. 평균 약 100 ㎣의 종양을 갖는 7 마리의 누드 마우스 군들을 7, 9 및 12 일째에 0.4 및 2.5 ㎎/㎏ 용량의 SS1-LR/GGS/8M으로 정맥 내 처리하였다. 비교를 위해서, 추가의 군들을 동일한 스케줄로 비히클(D-PBS 중의 0.2% HSA), 또는 상기 투여 스케줄 하에서 SS1P의 최대 허용 용량인 0.4 ㎎/㎏ SS1P로 정맥 내 처리하였다. 각 마우스의 종양 크기를 이식 후 30 일 동안 규칙적으로 측정하였다(도 7C).
비히클-처리된 마우스의 종양은 이식 후 16 일째에 대략 500 ㎣의 평균 크기로 성장하였다. 0.4 ㎎/㎏ SS1P로 처리된 마우스는 종양이 대략 500 ㎣의 크기에 도달하는데 이식 후 23 일까지를 필요로 하는 짧은 종양 성장 지연을 보였다. 0.4 ㎎/㎏ SS1-LR/GGS/8M으로 처리된 마우스에서 거의 동일한 반응을 관찰하였으며, 이는 상기 모델에서 SS1P와 SS1-LR/GGS/8M 간의 평형을 암시한다. SS1P를 그의 비특이적 독성으로 인해 상기 스케줄로 0.4 ㎎/㎏ 보다 높은 용량을 마우스에게 투여할 수 없지만, SS1-LR/GGS/8M은 질병 효과 없이 훨씬 더 높은 용량으로 마우스에게 제공될 수 있다. 약 6 배 더 높은 용량의 SS1-LR/GGS/8M(2.5 ㎎/㎏)을 상기 종양 모델에서 시험하였다. 상기 마우스 군에서, 9 일째에 약 73 ㎣의 최소 크기에 달하는 종양을 갖는, 유의수준(대응 표본, 양방 t-검정을 사용하여, p<0.01) 종양 퇴화를 관찰하였다. 상기 마우스 군은 또한, 이식 후 30 일째에 크기가 대략 500 ㎣에 달하는 증대된 종양 성장 억제를 경험하였다.
SS1-LR/GGS-8M은 마우스 L55 이종이식 종양 모델에서 SS1P와 동등한 활성을 가졌지만, 시험관 내에서 L55 세포에 대해 SS1P에 비해 증대된 활성을 나타내었다. 이러한 활성의 불일치는 상기 두 분자 간의 마우스 혈청 반감기의 차이에 의해 설명될 수 있다. 마우스에서 HA22-LR(약 51 kDa)의 반감기를 HA22(약 63 kDa)와 비교하는 선행의 연구(문헌[Weldon JE, et al., Blood 2009;113:3792-800] 참조)는 HA22-LR이 HA22보다 거의 2 배 더 짧은 반감기(각각 7.8 및 14.6)를 가짐을 보였다. 본 발명자들은 이러한 차이가 보다 작은 분자의 증가된 신장 여과에 기인하는 것으로 가정하였으며 SS1-LR/GGS/8M(약 50 kDa)을 SS1P(약 63 kDa)에 비교했을 때와 유사한 결과를 예상하였다. SS1-LR/GGS/8M을 주사한 마우스로부터 취한 혈청의 분석은 SS1P의 경우 19 분의 반감기에 비해 13 분의 반감기를 나타내었다(도 7D). 본 발명자들은 SS1-LR/GGS/8M과 SS1P 간의 반감기의 차이가 시험관 내 및 생체 내에서 상기 두 분자간의 상대적인 활성의 불일치를 설명한다는 결론에 도달한다.
SS1-LR/GGS/8M의 항원성
RIT HA22에 대한 선행 연구(문헌[Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:5742-7] 참조)를 기초로, SS1-LR/GGS/8M의 돌연변이가 SS1P로부터 B 세포 에피토프를 제거할 것임을 예상하였다. 이러한 주장을 평가하기 위해서, SS1P 및 SS1-LR/GGS/8M과, SS1P에 의한 치료에 반응하여 중화 항체가 발생한 5 명의 환자로부터의 혈청과의 반응성을 비교하였다. 환차 혈청을 처음에 SS1P 또는 SS1-LR/GGS/8M과 혼합하였다. 후속으로, 상기 혈청 중 결합되지 않은 PE83-특이성 항체를 ICC-ELISA를 사용하여 검출하였다(문헌[Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:5742-7] 참조). 상기 데이터로부터, 상기 EILSA 신호가 50%까지 감소한 SS1P 및 SS1-LR/GGS/8M의 농도(IC50)를 측정하였다. 앞서 보고된 바와 같이(문헌[Onda M, et al., J Immunol 2006;177:8822-34] 참조), 상기 IC50 값은 항체-항원 상호작용의 친화성과 상관 있다. SS1-LR/GGS/8M에 대한 SS1P의 IC50 값을 도 8에서 백분율로서 플롯팅한다. 모든 환자 혈청에 대해서, SS1P 대 SS1-LR/GGS/8M IC50 값의 비는 실질적으로 10% 이하였으며, 이는 상기 혈청 중 SS1P-반응성 항체의 대부분이 SS1-LR/GGS/8M과 반응성이 아님을 가리킨다.
환자 세포에 대한 활성
시험관 내 및 생체 내에서 세포주에 대한 SS1-LR/GGS/8M의 평가를 보완하기 위해서, 중피종 환자의 흉수 또는 복수로부터 수득하고 수회 계대 배양을 위해 배양물 중에서 유지시킨 1차 세포에 대한 그의 활성을 추가로 시험하였다. 환자들로부터 취한 체액은 세포들의 혼합물을 함유하므로, 상기 분석은 양호한 상대 활성의 평가를 제공하지만 이는 단지 절대 세포독성의 대략적인 평가이다. 2 명의 추가 환자로부터의 세포를 다양한 농도의 SS1P로 처리하였으며, 상기 세포의 생육성을 크리스탈 바이올렛 분석을 사용하여 4 일 후에 평가하였다. 초기 계대배양 중피종 환자 세포 NCI-M-16, 및 NCI-M-19는 SS1P에 의한 치료에 대해 분명한 반응을 보였다(100 ng/㎖ 용량 수준에서 >75%의 생육성 감소). 이들 두 명의 추가 환자 유래된 세포 집단에 대한 SS1P-LR/GGS/8M의 활성을 평가하였다. 상기 데이터를, D-PBS(100% 생육 가능함)의 대조용 처리와 10 ng/㎖의 항-트랜스페린 수용체/PE40 RIT HB21(0% 생육 가능함) 간에 표준화된 분수 값으로서 도 9에 나타낸다. 모든 환자 세포 집단은 SS1P-LR/GGS/8M에 의한 처리에 대단히 민감하였으며, 이는 SS1P에 대한 현저하게 증대된 세포독성을 입증한다.
SS1P는 중피종의 치료를 위해 현재 임상 개발 중이나, 메소텔린을 발현하는 다양한 고형 종양을 치료할 가능성을 갖는 슈도모나스 외독소 A를 기본으로 하는 항-메소텔린 재조합 면역독소이다. 임상 시험에서, SS1P는 적당하지만 유망한 성과를 성취하였다. 그러나, 그의 효능은 용량-제한 독성, 및 환자에서 중화 항체의 급속한 발생에 의해 제한된다. 여기에서 낮은 항원성을 갖는 SS1P의 변체인 SS1-LR/GGS/8M이 설치류에서 탁월한 활성, 및 현저하게 감소된 비특이적 독성을 가짐을 보고한다.
SS1-LR/GGS/8M은 PE-기재 항-메소텔린 RIT SS1P의 고도로 활성이고, 덜 독성이며 덜 항원성인 변체이다. SS1-LR에 대한 초기 평가는 시험관 내에서 메소텔린-발현 세포주의 선택에 대해 매우 가변성이나 일반적으로 낮은 활성을 입증하였다(표 1 및 2). SS1P에 대한 그의 낮은 활성에 대한 이유를 조사하면서, SS1-LR의 내면화 및 프로세싱을 연구하였고 2 개의 RIT로 처리된 세포에서 퓨린 절단된 SS1-LR의 비율이 SS1P의 경우보다 훨씬 더 낮음을 발견하였다. 이는 감소된 퓨린 절단이 SS1-LR의 활성을 제한할 수 있음을 암시하며, 상기 가설을 시험하기 위해서 다수의 돌연변이체들을 설계하고 생성시켰다. 퓨린 절단 부위 뒤에 짧은 Gly-Gly-Ser 링커를 첨가하는 것은 퓨린 절단을 증대시킨 것이 아니라, 세포주에 대한 SS1-LR의 활성을 증대시켰다. SS1-LR을 GGS 링커 및 PE의 면역원성을 감소시키는 것으로 입증된 추가의 8 개의 점 돌연변이와 결합시킴으로써, 본원의 최종 분자, SS1-LR/GGS/8M을 생성시켰다. SS1P에 비해, SS1-LR/GGS/8M은 래트 모세혈관 누출 모델에서 크게 감소된 비특이적 독성, 환자 세포에 대해 증대된 세포독성, 및 환자 혈청 중 항체와의 감소된 반응성을 나타내었다. SS1-LR에 대한 초기의 실험들은 세포주에 대해서 SS1P에 비해 가변적인 세포독성을 나타내었다. 그러나, 주요 성향은 덜 활성 분자쪽이었다. SS1-LR은 HAY 주에 대해 보다 활성이고 다른 6 개의 주에 대해서는 덜 활성이었다. 이러한 성향은 대부분의 세포주 및 환자 세포에 대해 유사하거나 증대된 세포독성을 나타낸, LR 분자의 항-CD22 변형인 HA22-LR과 현저하게 상이하다(문헌[Weldon JE, et al., Blood 2009;113:3792-800] 참조). 이러한 불일치는 상피 세포 상의 메소텔린에 대해 표적화된 PE와 B 세포 상의 CD22에 대해 표적화된 PE의 중독 경로간에 본질적인 차이가 존재함을 암시한다.
SS1P에 비해 일반적으로 감소된 SS1-LR의 활성에 관하여, 상기 불균형에 대한 하나의 가능한 설명은 세포내 중독 경로의 차이이다. 상기 PE38의 LR 변체는 PE의 도메인 II 및 Ib에서 광범위한 결실을 함유하며, 이러한 결실은 시토솔로의 수송에 대한 PE의 능력에 부정적으로 영향을 미칠 수도 있다. SS1P 및 SS1-LR로 처리된 A431/K5 세포의 용해물에서 완전 길이 및 프로세싱된 PE를 검출하기 위한 본원의 실험은 퓨린-프로세싱된 RIT의 양에 있어서 극적인 차이를 보였다. SS1P-처리된 세포 중 전체 RIT의 대부분은 프로세싱되었지만, 상기 전체 RIT 중 단지 작은 분획만이 SS1-LR-처리된 세포에서 절단되었다. 이러한 결과는 불충분한 퓨린 절단이 SS1-LR의 활성을 제한할 수도 있음을 암시하였으며, 상기 PE 중독 경로 단계의 개선에 착수하였다.
SS1-LR 퓨린 부위에 가요성 링커를 덧붙임으로써, 보다 활성인 RIT를 생성시켰지만, 증대된 퓨린 절단을 입증할 수는 없었다. 짧은 Gly-Gly-Ser 링커(SS1-LR/GGS, 도 1), 보다 긴 링커(SS1-LR/GGSx2, 도 1), 또는 짧은 Gly-Gly-Ser 링커에 인접한 퓨린 부위의 반복부의 첨가는 모두 적당한 세포독성 증가를 부여하였다. 그러나, 이들 분자 중 어느 것도, 처리된 A431/K5 세포에서 퓨린 절단된 SS1-LR의 비율을 증대시키거나 시험관 내에서 퓨린 절단 속도를 증가시키지 않았다(데이터 도시 안 됨). 본 발명자들은 링커의 첨가가, 추정상 세포내 수송 또는 증대된 독성 안정성과 관련된 또 다른 기전을 통해 세포독성을 증대시킴에 틀림없다는 결론을 내렸으며, 계속해서 이러한 가능성들을 조사하고 있다. 본 발명은 또한 SS1P의 세포독성에서 퓨린 절단의 필요성을 입증하였다. 절단에 필수적인 아르기닌을 글리신으로 변화시킨 SS1-LR/GGS에서의 점 돌연변이(SS1-LR/GGS R279G, 도 1)는 퓨린에 의해 절단되지 않은 단백질을 생성시켰다. 상기 RIT는 모든 세포에 대해, 시험된 7 개의 세포주 중 6 개에 대해 120 ㎍/㎖의 농도에서 무시할만한 활성으로 매우 불량한 활성을 보였다. 상기 절단될 수 없는 돌연변이체는 오직 A431/K5 세포에 대해서만 1 ㎍/㎖ 이하의 EC50을 보이나, 그럼에도 불구하고 그의 활성은 대단히 손상되었다. 또한, 상기 세포주에서 메소텔린의 인위적으로 높은 발현은 메소텔린을 천연으로 발현하는 세포주들의 전형이 아닐 수도 있다. PE 중독 경로에서 퓨린 절단의 필요성이 최근에 의문시되었으나(문헌[Morlon-Guyot J, et al., Infect Immun 2009;77:3090-9] 참조), 퓨린이 중독 중 중요한 역할을 수행한다는 많은 증거들이 존재한다(문헌[Ornatowski W, et al.;J Clin Invest 2007;117:3489-97]; 문헌[Shiryaev SA, et al., J Biol Chem 2007;282:20847-53]; 문헌[Sarac MS, et al., Infect Immun 2002;70:7136-9]; 문헌[Chiron MF, et al., J Biol Chem 1997;272:31707-11]; 문헌[Gu M, et al., Infect Immun 1996;64:524-7]; 문헌[Inocencio NM, et al., J Biol Chem 1994;269:31831-5]; 및 문헌[Moehring JM, et al., J Biol Chem 1993;18:2590-4] 참조). 여기에 제공된 경우에, PE 중독은 일반적으로 퓨린 프로세싱에 적합한 부위의 부재 하에서 실패한다.
본 발명자들은 최근에 B 세포 에피토프의 제거로 인해 매우 낮은 면역원성을 갖는 RIT, HA22-LR-8M을 생성시켰다(문헌[Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:5742-7] 참조). HA22-LR-8M은 PE의 LR 변체 결실 및 도메인 III에서 추가적인 8 개의 점 돌연변이를 함유한다. 이들 돌연변이를 SS1P 내에 놓아, SS1-LR/GGS/8M을 생성시켰다. RIT에 대한 면역 반응의 대부분은 PE를 향하기 때문에, SS1-LR/GGS/8M이 유사하게 감소된 면역원성을 보일 것을 예상한다. SS1-LR/GGS/8M이 SS1P로부터 인간 B 세포 에피토프를 제거함을 확인하기 위해서, SS1-LR/GGS/8M과, SS1P 치료를 겪는 동안 중화 항체를 나타낸 환자로부터의 혈청과의 반응성을 조사하였다. 본 발명이 시험한 5 개의 사례 중에서, SS1-LR/GGS/8M은 SS1P에 비해 대단히 감소된 항원성을 나타냈다. 상기 결과는 HA22 및 HA22-LR/8M의 관찰과 일치하며(문헌[Onda M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:5742-7] 참조), PE-기재 RIT에서 면역원성 에피토프들 중 다수를 확인하여 제거하였음을 가리킨다.
SS1-LR/GGS/8M의 세포독성을 여러 세포주, 마우스 종양 모델, 및 중피종 환자로부터의 1차 세포에서 평가하였다. SS1-LR/GGS/8M은 폐암 및 중피종 세포주에서 SS1P에 비해 탁월한 세포독성을 나타내었으나, 난소암 주에 대해서는 불량하게 활성이었다. 상기 결과는, 상기 난소주가 SS1-LR/GGS에 민감하기 때문에 예상 밖이며, 이는 PE의 촉매 도메인 중 8 개의 점 돌연변이가 SS1-LR/GGS/8M의 활성을 방해할 수도 있음을 가리킨다. 마우스 종양 모델에서, L55 이종이식 종양은 SS1-LR/GGS/8M 및 SS1P에 유사하게 반응하였지만, 더 높은 용량의 SS1-LR/GGS/8M을 투여하여 항-종양 효과를 증대시킬 수 있었다. 최종적으로, 중피종 환자로부터의 1차 악성 세포에 대해 시험 시, SS1-LR/GGS/8M은 SS1P보다 현저하게 증대된 세포독성을 나타내었다. 종합하면, SS1-LR/GGS/8M에 대한 본 발명은 탁월한 세포독성 활성을 입증하였다.
높은 활성 및 낮은 항원성 외에, SS1-LR/GGS/8M은 SS1P에 비해 감소된 비특이적 독성을 나타내었다. RIT-유도된 모세혈관 누출 증후군에 대한 래트 모델이 이러한 차이를 효과적으로 설명한다. PBS로 처리된 래트와 SS1-LR/GGS/8M으로 처리된 것들 간에는 현저한 차이가 존재하지 않은 반면, SS1P로 처리된 래트는 폐에서 감소하는 체액 축적을 나타내었다. 모세혈관 누출 증후군(또한 혈관 누출 증후군이라 칭함)은 모세혈관으로부터 체액이 누출될 때 발생하며 혈청 알부민 감소, 체액 정체, 부종 및 체중 증가에 이르게 된다. 상기 독성은 PE를 기본으로 하는 것들을 포함하여 다양한 면역독소로 치료된 환자에게서 빈번하게 관찰되며, 추정상 표적에서 벗어난 내피 세포 손상으로부터 발생한다. RIT의 표적화되지 않은 독성을 제한하는 것은 더 높은 용량이 안전하게 투여되게 함으로써 그의 유효성을 잠재적으로 증대시킬 수 있다. 상기 실험은 본 발명에 개시된 다른 것들과 함께, SS1-LR/GGS/8M이 임상에 탁월한 후보일 수 있음을 암시한다. SS1-LR/GGS/8M의 낮은 항원성, 낮은 비특이적 독성, 및 높은 세포독성은 차후 항메소텔린 RIT의 개발에 매우 유망하다.
본 발명에 개시된 실시예 및 실시태양은 단지 예시를 목적으로 하고 이들에 비추어 다양한 변경 또는 변화가 당해 분야의 숙련가들에게 연상될 것이며 이는 본 출원 및 첨부된 특허청구범위의 진의 및 이해 내에 포함되어야 하는 것으로 여겨진다. 본 발명에 인용된 모든 수탁 번호, 공보, 특허 및 특허 출원들은 모든 목적을 위해서 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
<110> THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> RECOMBINANT IMMUNOTOXIN TARGETING MESOTHELIN <130> 714453 <140> PCT/US2012/036456 <141> 2012-05-04 <150> US 61/483,531 <151> 2011-05-06 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 613 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val 1 5 10 15 Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val 35 40 45 Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu 50 55 60 Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu 65 70 75 80 Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser 85 90 95 Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn 100 105 110 Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His 115 120 125 Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu 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<221> VARIANT <222> (15)..(19) <223> Xaa = Gly or Ser, may be present or absent <220> <221> VARIANT <222> (20)..(230) <223> Xaa = Gly, Ala or Ser <400> 4 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Xaa Val 20 25 30 Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu 35 40 45 Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Xaa Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr 50 55 60 His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val 65 70 75 80 Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Xaa Gly Phe Tyr Ile 85 90 95 Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro 100 105 110 Asp Ala Xaa Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val 115 120 125 Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Xaa Thr Ser Leu Thr Leu Ala 130 135 140 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu 145 150 155 160 Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Xaa Gly Gly Arg 165 170 175 Leu Glu Thr Ile Leu 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Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro 100 105 110 Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val 115 120 125 Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala 130 135 140 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu 145 150 155 160 Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg 165 170 175 Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile 180 185 190 Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ser Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp 210 215 220 Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 225 230 235 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody SS1 variable light chain (VL) <400> 6 Met Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody recombinant immunotoxin SS1-LR variable heavy chain (VH-PE) <400> 7 Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Cys Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys 50 55 60 Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 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<220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody SS1 variable light chain (V-L) <400> 10 atggacatcg agctcactca gtctccagca atcatgtctg catctccagg ggagaaggtc 60 accatgacct gcagtgccag ctcaagtgta agttacatgc actggtacca gcagaagtca 120 ggcacctccc ccaaaagatg gatttatgac acatccaaac tggcttctgg agtcccaggt 180 cgcttcagtg gcagtgggtc tggaaactct tactctctca caatcagcag cgtggaggct 240 gaagatgatg caacttatta ctgccagcag tggtccaagc accctctcac gttcggttgc 300 gggacaaagt tggaaataaa ataa 324 <210> 11 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody recombinant immunotoxin SS1-LR variable heavy chain (VH-PE) <400> 11 atgcaggtac aactgcagca gtctgggcct gagctggaga agcctggcgc ttcagtgaag 60 atatcctgca aggcatctgg ttactcattc actggctaca ccatgaactg ggtgaagcag 120 agtcatggaa agtgccttga gtggattgga cttattactc cttacaatgg tgcttctagc 180 tacaaccaga agttcagggg caaggccaca ttaactgtag acaagtcatc cagcacagcc 240 tacatggacc tcctcagtct gacatctgaa gactctgcag tctatttctg tgcaaggggg 300 ggttacgacg ggaggggttt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 aaagcttccg gaggtcgtca ccgtcaacca cgcggttggg aacagctgcc aaccggtgcc 420 gagttcctgg gcgacggtgg cgatgtgtcc tttagcaccc gtggtaccca gaactggacg 480 gtagagcgcc tgctgcaggc acatcgtcag ctggaagagc gtggctatgt attcgttggc 540 taccacggca cttttctgga agcagctcag tccatcgtgt ttggtggtgt ccgtgcccgt 600 tctcaagacc tggatgcgat ttggcgtggt ttctacattg caggcgatcc agcgctggca 660 tacggttatg cgcaggacca ggaaccggat gctcgcggtc gcattcgtaa tggtgcgctg 720 ctgcgcgtat atgtgccgcg ttccagcctg ccgggcttct accgcactag cctgaccctg 780 gccgcgccgg aggcggcggg tgaagtggaa cgtctgattg gtcatcctct gcctctgcgc 840 ctggatgcca tcaccggccc agaggaggag ggcggtcgtc tggaaaccat tctgggctgg 900 ccgctggctg aacgtacggt cgttattccg agcgcgattc ctaccgatcc tcgtaacgtt 960 ggcggcgatc tggacccatc ttctattcca gataaggagc aggcaatctc cgcgctgccg 1020 gattatgcaa gccaaccggg taaaccacct cgtgaagatc tgaaataa 1068 <210> 12 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody recombinant immunotoxin SS1-LR/GGS/8M variable heavy chain (VH-PE) <400> 12 atgcaggtac aactgcagca gtctgggcct gagctggaga agcctggcgc ttcagtgaag 60 atatcctgca aggcatctgg ttactcattc actggctaca ccatgaactg ggtgaagcag 120 agtcatggaa agtgccttga gtggattgga cttattactc cttacaatgg tgcttctagc 180 tacaaccaga agttcagggg caaggccaca ttaactgtag acaagtcatc cagcacagcc 240 tacatggacc tcctcagtct gacatctgaa gactctgcag tctatttctg tgcaaggggg 300 ggttacgacg ggaggggttt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 aaagcttccg gaggtcgtca tcgccagccg cgcggctggg aacaactggg tggaagtccc 420 actggcgcgg agttcctcgg cgacggcggc gcagtcagct tcagcacccg cggcacgcag 480 aactggacgg tggagcggct gctccaggcg caccgccaac tggaggaggg cggctatgtg 540 ttcgtcggct accacggcac cttcctcgaa gcggcgcaaa gcatcgtctt cggcggggtg 600 cgcgcgcgca gccaggacct cgacgcgatc tgggccggtt tctatatcgc cggcgatccg 660 gcgctggcct acggctacgc ccaggaccag gaacccgacg cagccggccg tatccgcaac 720 ggtgccctgc tgcgggtcta tgtgccgcgc tcgagcctgc 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gaggtcgtca tcgccagccg cgcggctggg aacaactgcc cactggcgcg 420 gagttcctcg gcgacggcgg cgcagtcagc ttcagcaccc gcggcacgca gaactggacg 480 gtggagcggc tgctccaggc gcaccgccaa ctggaggagg gcggctatgt gttcgtcggc 540 taccacggca ccttcctcga agcggcgcaa agcatcgtct tcggcggggt gcgcgcgcgc 600 agccaggacc tcgacgcgat ctgggccggt ttctatatcg ccggcgatcc ggcgctggcc 660 tacggctacg cccaggacca ggaacccgac gcagccggcc gtatccgcaa cggtgccctg 720 ctgcgggtct atgtgccgcg ctcgagcctg ccgggcttct acgccaccag cctgaccctg 780 gccgcgccgg aggcggcggg cgaggtcgaa cggctgatcg gccatccgct gccgctgcgc 840 ctggacgcca tcaccggccc cgaggagtca ggcgggcgcc tggagaccat tctcggctgg 900 ccgctggccg agcgcaccgt ggtgattccc tcggcgatcc ccaccgaccc gcgcaacgtc 960 ggcggcgacc tcgacccgtc cagcatcccc gacagcgaag cagcgatcag cgccctgccg 1020 gactacgcca gccagcccgg caaaccgccg cgcgaggacc tgaagtaa 1068 <210> 14 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin Fv antibody (SS scFv) <400> 14 Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys 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minimal furin cleavage site <400> 31 Arg Arg Arg Arg 1 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic minimal furin cleavage site <400> 32 Arg Lys Ala Arg 1 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 33 Ser Arg Val Ala Arg Ser 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 34 Thr Ser Ser Arg Lys Arg Arg Phe Trp 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 35 Ala Ser Arg Arg Lys Ala Arg Ser Trp 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 36 Arg Arg Val Lys Lys Arg Phe Trp 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 37 Arg Asn Val Val Arg Arg Asp Trp 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 38 Thr Arg Ala Val Arg Arg Arg Ser Trp 1 5 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 39 Arg Gln Pro Arg 1 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 40 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 41 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 42 His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 43 Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 1 5 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 44 Arg Ser Lys Arg 1 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 45 Arg His Arg Ser Lys Arg Gly Trp 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 46 His Arg Ser Lys Arg Gly Trp Glu 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 47 Arg Ser Lys Arg Gly Trp Glu Gln Leu 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 48 His Arg Ser Lys Arg Gly Trp Glu Gln Leu 1 5 10 <210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic furin cleavage site <400> 49 Arg His Arg Ser Lys Arg 1 5 <210> 50 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic scFv peptide linker <400> 50 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable heavy chain CDR1 <400> 51 Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable heavy chain CDR2 <400> 52 Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable heavy chain CDR3 <400> 53 Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR1 <400> 54 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR2 <400> 55 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 56 Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 57 Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 58 Gln Gln Trp Ser Gly His Pro Leu Thr 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 59 Gln Gln Trp Ser Ala His Pro Leu Thr 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 60 Gln Gln Trp Ser Gln Ile Pro Leu Thr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 61 Gln Gln Trp Gly Phe Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 62 Gln Gln Trp Gly Thr Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 63 Gln Gln Trp Gly Ser His Pro Leu Thr 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 64 Gln Gln Trp Gly Asp Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 65 Gln Gln Trp Gly Asp His Pro Leu Thr 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 66 Gln Gln Trp Ser Ala His Pro Leu Thr 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody variable light chain CDR3 <400> 67 Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Thr Thr 1 5 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic linker joining carboxyl terminus of antibody to N-terminus of the furin cleavage site <400> 68 Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic flexible linker <400> 69 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 70 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic flexible linker <400> 70 Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic flexible linker (FL) <400> 71 Gly Ser Gly Gly 1 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic flexible linker (FL) <400> 72 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 73 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic flexible linker (FL) <400> 73 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 74 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-mesothelin monoclonal antibody recombinant immunotoxin SSl-LR variable heavy chain (VH-PE) <400> 74 Met GIn Val GIn Leu GIn GIn Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys GIn Ser His Gly Lys Cys Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn GIn Lys 50 55 60 Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly GIn 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Ala Ser Gly Gly Arg His Arg 115 120 125 GIn Pro Arg Gly Trp Glu GIn Leu Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly 130 135 140 Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr GIn Asn Trp Thr 145 150 155 160 Val Glu Arg Leu Leu GIn Ala His Arg GIn Leu Glu Glu Arg Gly Tyr 165 170 175 Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala GIn Ser lIe 180 185 190 Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser GIn Asp Leu Asp Ala lIe Trp 195 200 205 Arg Gly Phe Tyr lIe Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala 210 215 220 GIn Asp GIn Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg lIe Arg Asn Gly Ala Leu 225 230 235 240 Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr 245 250 255 Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu 260 265 270 lIe Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala lIe Thr Gly Pro Glu 275 280 285 Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr lIe Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu 290 295 300 Arg Thr Val Val lIe Pro Ser Ala lIe Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val 305 310 315 320 Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser lIe Pro Asp Lys Glu GIn Ala lIe 325 330 335 Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser GIn Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu 340 345 350 Asp Leu Lys 355

Claims (24)

  1. 식 M-L1-FCS-FL-작용성 PE 도메인 III을 갖는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 키메릭 분자로,
    M이 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 단편이고;
    L1이 1 내지 10 개의 연속적인 아미노산 잔기들로 이루어지고;
    FCS가 퓨린에 의해 절단될 수 있는 연속적인 아미노산 잔기들로 이루어지는 퓨린 절단 부위이고;
    FL이 글리신 및 세린 중에서 독립적으로 선택된 3 내지 8 개의 연속적인 아미노산 잔기들로 이루어지고;
    작용성 PE 도메인 III이, (i) 서열번호 1의 609 내지 613에 상응하는 하나 이상의 잔기의 치환, (ii) 서열번호 1의 490번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌 대신 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 또는 아이소류신의 치환, (iii) 서열번호 1의 잔기에 상응하는 하나 이상의 잔기의 치환(이때 상기 서열번호 1의 잔기는 PE 도메인 III의 에피토프 또는 하위에피토프의 면역원성을 유지한다), 또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 임의의 조합을 임의로 포함하는, 서열번호 1의 395 내지 613번 위치의 서열에 일치하는 연속적인 아미노산 잔기들로 이루어지는
    분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체가 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, 단일 쇄 Fv 단백질("scFv"), 또는 다이설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv") 단편인 분자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    항체 단편이 L1에 대한 중쇄의 결합을 통해 분자의 나머지에 융합된 다이설파이드 안정화된 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 분자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    항체가
    GYTMN(서열번호 51)의 CDR1 아미노산 서열, LITPYNGASSYNQKFRG(서열번호 52)의 CDR2 아미노산 서열, 및 GGYDGRGFDY(서열번호 53)의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 쇄, 및
    SASSSVSYMH(서열번호 54)의 CDR1 아미노산 서열, DTSKLAS(서열번호 55)의 CDR2 아미노산 서열, 및 QQWSGYPLT(서열번호 56), QQWSKHPLT(서열번호 57), QQWSGHPLT(서열번호 58), QQWSAHPLT(서열번호 59), QQWSQIPLT(서열번호 60), QQWGFNPLT(서열번호 61), QQWGTNPLT(서열번호 62), QQWGSHPLT(서열번호 63), QQWGDFPLT(서열번호 64), QQWGDHPLT(서열번호 65), QQWSAHPLT(서열번호 66), 및 QQWSGYPTT(서열번호 67)로 이루어진 군 중에서 선택된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 쇄
    를 포함하는 분자.
  5. 제 4 항에 있어서,
    VL CDR3 아미노산 서열이 QQWSKHPLT(서열번호 57)인 분자.
  6. 제 1 항에 있어서,
    L1이 3 내지 5 개의 아미노산 길이인 분자.
  7. 제 1 항에 있어서,
    L1이 ASGG(서열번호 19)인 분자.
  8. 제 1 항에 있어서,
    PE 도메인 III이 D403, R412, R427, E431, R458, D461, R505, E522, R538, R551, R576 및 L597로 이루어진 군 중에서 선택된 서열번호 1의 아미노산 잔기에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 알라닌, 글리신 또는 세린의 치환을 갖는 분자.
  9. 제 1 항에 있어서,
    PE 도메인 III이 D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 및 Q592로 이루어진 군 중에서 선택된 서열번호 1의 아미노산 잔기에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 알라닌, 글리신 또는 세린의 치환을 갖는 분자.
  10. 제 1 항에 있어서,
    FL이 GGS, (GGS)2(서열번호 18), GSGG(서열번호 71), GGSGG(서열번호 72), GGSG(서열번호 73), GSG, 또는 GGG인 분자.
  11. 제 1 항에 있어서,
    FL이 GGS인 분자.
  12. 제 1 항에 있어서,
    퓨린 절단 서열이 RHRQPRGWEQL(서열번호 17)인 분자.
  13. 제 1 항에 있어서,
    PE 작용성 도메인 III이 서열번호 4의 20 내지 237번 위치 또는 서열번호 5의 20 내지 237번 위치의 아미노산 서열을 갖는 LR의 PE 작용성 도메인 도메인 III인 분자.
  14. 제 1 항에 있어서,
    표적화 부분이 서열번호 6의 다이설파이드 안정화된 SS1 가변 경쇄 및 서열번호 7의 서열의 SS1 가변 중쇄를 포함하는 분자.
  15. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 6의 SS1 가변 경쇄 및 서열번호 8의 SS1 가변 중쇄-PE 융합 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 가변 경쇄 및 중쇄가 다이설파이드 안정화된 항체를 형성하는 분자.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    FCS가 서열번호 1의 274 내지 284번 위치의 서열에 일치하거나 또는 아미노산 서열 RHRSKRGWEQL(서열번호 29)을 갖는 분자.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 분자 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 분자를 암호화하는 핵산.
  19. 제 18 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  20. 제 18 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  21. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 키메릭 분자를, 메소텔린을 과발현하는 암의 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 상기 암을 치료하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    암이 폐 선암종, 난소 암종, 중피종 및/또는 상피 암종인 방법.
  23. 식 FCS-FL-PE 작용성 도메인 III을 갖는 융합 폴리펩타이드로,
    FCS가 서열번호 1의 274 내지 284번 위치의 서열에 일치하거나 또는 아미노산 서열 RHRSKRGWEQL(서열번호 17)을 갖는 연속적인 아미노산 잔기들로 이루어지고;
    FL이 글리신 및 세린 중에서 독립적으로 선택된 3 내지 8 개의 연속적인 아미노산 잔기들로 이루어지고;
    PE 작용성 도메인 III이, (i) 서열번호 1의 609 내지 613에 상응하는 하나 이상의 잔기의 치환, (ii) 서열번호 1의 490번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌 대신 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 또는 아이소류신의 치환, (iii) 서열번호 1의 잔기에 상응하는 하나 이상의 잔기의 치환(이때 상기 서열번호 1의 잔기는 PE 도메인 III의 에피토프 또는 하위에피토프의 면역원성을 유지한다), 또는 (iv) (i) 내지 (iii) 중 임의의 조합을 임의로 포함하는, 서열번호 1의 395 내지 613번 위치의 서열에 일치하는 연속적인 아미노산 잔기들로 이루어지는
    융합 폴리펩타이드.
  24. 제 19 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
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