JPH11513669A - ジスルフィド安定化抗体フラグメントを含む免疫毒素 - Google Patents

ジスルフィド安定化抗体フラグメントを含む免疫毒素

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JPH11513669A JP9515227A JP51522797A JPH11513669A JP H11513669 A JPH11513669 A JP H11513669A JP 9515227 A JP9515227 A JP 9515227A JP 51522797 A JP51522797 A JP 51522797A JP H11513669 A JPH11513669 A JP H11513669A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は免疫毒素であって可変軽鎖領域に少なくとも一本のジスルフィド結合を介して結合している可変重鎖領域を有するFv抗体フラグメントに付加された細胞障害活性のためにタンパク質分解式活性化を要しないシュードモナス外毒素（PE）を含んで成るものを提供する。タンパク質分解式活性化を要しないPEに融合した「ジスルフィド安定化」結合性因子の組合せは驚くべき細胞障害活性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 ジスルフィド安定化抗体フラグメントを含む免疫毒素 発明の背景 本発明はその毒性及び治療効能を高めるように改変されたシュードモナス(Pse udomonas)由来免疫毒素の製造及び利用に関する。特に、本発明の免疫毒素は、 ジスルフィド安定化（ds）標的結合性因子、例えば抗体分子の可変領域と、細胞 障害活性にとってタンパク質分解式活性化を要しないシュードモナス外毒素とを 含む。 免疫毒素は当初キメラ分子を形成するように抗体を毒素に化学カップリングさ せることにより製造されていた（vitettaら、Cell,41：653-654（1985）；Pasta nらAnn．Rev．Biochem．61：331-354（1992））。これらの分子において、抗体 部分は標的細胞に対する選択的結合を媒介し、一方毒性部分は細胞質ゾルへの転 位及びその後の細胞殺傷を媒介する。いくつかの毒素、例えばリシンＡ鎖、ブロ ックドリシン、サポリン、ポークウィード抗ウィルスタンパク質、ジフテリア毒 素及びシュードモナス外毒素Ａ（PE）が免疫毒素の作成に利用されている（Past anら、Science 254：1173-1177（1991）；Vitettaら、Semin．Cell Biol．２：4 7-58（1991）；Tazzariら、Br．J．Hematol．81：203-211（1992）；Uckunら、B lood, 79：2201-2214(1992)）。 免疫毒素によるいくつかの臨床試験はリンパ腫及びその他の造血幹系由来の癌 に対する活性を示した（vitettaら、Cancer Res．51：4052-4058（1991）；Gros sbardらJ．Clin．Oncol．11：726-737(1993)）。しかしながら、これらの免疫毒 素は不均質であり、そしてそのサイズの大きさは固体腫瘍への侵入を制約してし まう。 第２世代の免疫毒素は抗体の最小機能性モジュールFvフラグメントを細胞結合性 ドメインを欠くトランケーション化毒素と融合させることによって作られた全体 的に組換の分子である（Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：8616-8 620（1991）；Kreitmanら、Blood，80：2344-2352(1992)）。一本鎖Fv免疫毒素 のサイズの小ささは、それを一定の治療用途に関し、まるごとの抗体の化学コン ジュゲートよりもはるかに有用なものとし、なぜならそのサイズの小ささは腫瘍 浸透及び効能を高めるからである（Fukimoriら、Cancer Res．49：5656-5663（1 989）；Jain，Cancer Res.，50：814-819（1990）；Sungら、Cancer Res．50：7 382-7392（1990））。 PEを含むいくつかのタイプの組換Fv−免疫毒素が作られ、そしてin vitro及び 動物モデルにおいて試験されている（Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci．US A 88：8616-8620（1991）；Kreitmanら、Blood，80：2344-2352（1992）；Batra ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89：5867-5871（1992）；Reiterら、Cancer R es．54：2714-2718（1994）；Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：5 47-551(1993)）。当初、免疫毒素のFv領域は、ＶH及びＶLドメインを連結ペプチ ドにより接続した一本鎖形態（scFv−免疫毒素）としてアレンジされていた。よ り近年になって、Fv−免疫毒素のジスルフィド安定化形態（dsFv−免疫毒素）が 作製され、それにおいてはＶH及びＶLドメインはフレームワーク領域の中に導入 されたジスルフィドにより接続されている（例えば、1993年６月14日出願の同時 係属出願USSN 08/077,252号；Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：7 538-7542（1993）；Reiterら、Protein Eng.，７：697-704(1994)を参照のこと ）。ジスルフィド安定化Fv免疫毒素は一本鎖免疫毒素よりもはるかに安定であり 、そし て抗原に対する強められた結合性を示しうる（Reiterら、J．Biol．Chem．269： 18327-18331（1994）；Reiterら、Protein Eng．７：697-704(1994)）。更に、d sfv−免疫毒素はscfv−免疫毒素よりも若干小さく、そしてより良い腫瘍浸透を 発揮しうる。 PEを含む組換免疫毒素はドメインIIの中のアミノ酸279と280との間での切断に より細胞内でタンパク質分解式に活性化されねばならない（Ogataら、J．Biol． Chem.，267：25369-25401(1992)）、細胞内タンパク質分解活性化の必要性をな くすため、組換毒素の毒性成分が改良された。これは当初、ドメインIIIの先端 付近の607位においてTGFαの挿入されたトランケーション型毒素（PE 280-613） を作ることにより、TGFα含有組換毒素でなされた。（Theuerら、J．Urol.，149 ：1626-1632（1993）；Theuerら、Cancer Res.，53：340-347(1993)）。この毒 素は280位で始まるため、細胞内でのタンパク質分解式活性化を要しない（Ogata ら、J．Biol．Chem.，267：25369-25401（1992）；Theuerら、J．Biol．Chem.， 267：16872-16877(1992)）。更に、これらの分子は２つのその他の突然変異を有 する。一つはドメインＩｂ内での不要残基の欠失である(365-380)。他方は細胞 障害活性を高めるためのREDLKからKDELに至るカルボキシ末端の変更である（See tharamら、J．Biol．Chem.，266：17376-17381(1991)）。PE 35/TGFαKDELと称 されるこの分子はいくつかのヒト膀胱癌細胞系に対してTGFα−PE40よりも10〜7 00倍活性が強かった（Theuerら、J．Urol.，149：1626-1632(1993)）。しかしな がら、より特異的且つ反応性な免疫毒素が所望されている。 発明の概要 本発明は、ジスルフィド−安定化結合性因子及び細胞障害性にと ってタンパク質分解式切断を要しないように改変されたシュードモナス外毒素の 双方を含んで成る免疫毒素が、ジスルフィド安定化結合性タンパク質又は改変シ ュードモナス外毒素のいづれかを単独で含んで成る融合タンパク質の性能に基づ き予測されるであろうものよりもはるかに強い細胞障害能を示すことの発見に一 部基づく。 即ち、一の態様において、本発明はFv抗体フラグメントの可変重鎖（ＶH）領 域に付加された細胞障害活性のためにタンパク質分解式活性化を要しないシュー ドモナス外毒素（PE）を含んで成る免疫毒素を提供し、ここでこの可変重鎖領域 は可変軽鎖（ＶL）領域に対して少なくとも一本のジスルフィド結合を介して結 合している。好適な態様において、このシュードモナス外毒素はドメインＩａを 欠くトランケーション化シュードモナス外毒素である。別の態様において、シュ ードモナス外毒素は１から279番目に至る残基を欠く。可変重鎖領域はシュード モナス外毒素のドメインＩｂを実質的に置換していてよく、又はそうでなければ それはシュードモナス外毒素のカルボキシ末端の中に配置されていてよい。重鎖 領域のアミノ末端がペプチドリンカー（例えばSGGGGS）を介してPEに付加されて いることができる。重鎖領域のカルボキシ末端がペプチドリンカー(例えばKASGG PE)を介してPEに付加されていることもできる。好適な態様において、抗体フラ グメントはＢ１，Ｂ３，Ｂ５，ｅ23，BR96，抗−Tac，RFB４又はHB21に由来し、 より好ましくはＢ１，Ｂ３，Ｂ５及びｅ23に由来する。免疫毒素のカルボキシ末 端配列はKDELであってよい。特に好適な免疫毒素にはPE35／ｅ23（dsfv）KDEL及 びＢ１（dsFv）PE23が含まれる。 別の態様においては、可変重鎖領域（ＶH）ではなく可変軽鎖（ＶL）領域がシ ュードモナス外毒素に付加（融合）されており、一方可変重鎖（ＶH）は少なく とも一本のジスルフィド結合を介して 可変軽鎖（ＶL）に結合している。特に好適な態様は、ＶL鎖がＶH鎖を置換して いることにおいて及びその逆においてのみ相違する上記の態様の全てを含む。 本発明は更に上記の免疫毒素の全てをコードする核酸を提供する。即ち、一の 態様において、本発明は細胞障害活性のためにタンパク質分解式活性化を要しな いシュードモナス外毒素に付加されたFv抗体フラグメントの重鎖可変領域を含ん で成る免疫毒素をコードする核酸を提供する。コードされた重鎖可変領域はFvフ ラグメントの可変軽鎖領域とジスルフィド連結を形成するシステイン残基を含み 、そしてこの抗体フラグメントはＢ１，Ｂ３，Ｂ５，ｅ23，BR96，抗−Tac，RBF ４又はHB21の可変軽鎖又は可変重鎖を含んで成る。好適な態様において、この核 酸は重鎖可変領域がシュードモナス外毒素のドメインＩｂを置換している免疫毒 素をコードする。別の態様において、この核酸は重鎖可変領域がシュードモナス 外毒素の607番目の残基以降に位置する免疫毒素をコードする。コードされた免 疫毒素のPE成分は１〜279番目のアミノ酸残基を欠く。別の好適な態様において 、本発明はＶL鎖がＶH鎖を置換している、又はその逆となっている免疫毒素をコ ードする上記の核酸も提供する。 Fvフラグメントの成分ではなく、ＶH又はＶL領域を単独で含んで成る一本鎖免 疫毒素がその標的分子に結合できるということも本発明の発見である。即ち、別 の他の態様において、本発明は可変軽鎖（ＶL）又は可変重鎖（ＶH）領域に付加 された細胞障害活性のためにタンパク質分解式活性化を要しないシュードモナス 外毒素（PE）を含んで成る一本鎖免疫毒素融合タンパク質を提供する。適当な毒 素成分には上記のシュードモナス外毒素のいづれもが含まれる。好適な態様にお いて、シュードモナス外毒素はドメインＩａを欠くトランケーション化シュード モナス外毒素である。別の好適な態 様において、シュードモナス外毒素は１〜279番目の残基を欠く。可変重鎖又は 軽鎖はドメインＩｂを実質的に置換しているか、又はシュードモナス外毒素のカ ルボキシ末端に位置してよい。可変重鎖又は軽鎖領域のアミノ末端はペプチドリ ンカー（例えばSGGGGS）を介してPEに付加されていてよく、一方可変重鎖又は軽 鎖領域のカルボキシ末端はペプチドリンカー(例えばKASGGPE)を介してPEに付加 されていてよい。可変重鎖又は軽鎖は好ましくはＢ１，Ｂ３，Ｂ５，ｅ23，BR96 ，抗−Tac，RFB４又はHB21に由来し、そしてより好ましくはＢ１，Ｂ３，Ｂ５及 びｅ23に由来する。免疫毒素はカルボキシ末端配列KDELを有しうる。 別の態様において、本発明は上記の一本鎖免疫毒素融合タンパク質のいづれか をコードする核酸を提供する。 本発明は更に特徴的なマーカーを抱える細胞を殺傷する方法も提供する。この 方法は上記の免疫毒素のいづれかであって、可変軽鎖領域に少なくとも一本のジ スルフィド結合を介して結合しているFv抗体フラグメントの重鎖領域に付加され た、又はその逆の、可変重鎖領域に少なくとも一本のジスルフィド結合を介して 結合しているFv抗体フラグメントの軽鎖領域に付加された、細胞障害活性のため にタンパク質分解式活性化を要しないシュードモナス外毒素（PE）を含んで成る ものと細胞とを接触させることを含んで成る。 本発明の免疫毒素は薬理組成物における使用にとって適当である。従って、本 発明は薬理学的に許容される賦形剤内に有効量の免疫毒素を含んで成る薬理組成 物を提供する。好適な免疫毒素には、上記の免疫毒素のいづれかであって、可変 軽鎖領域に少なくとも一本のジスルフィド結合を介して結合しているFv抗体フラ グメントの重鎖領域に付加された、又はその逆の、可変重鎖領域に少なくとも一 本のジスルフィド結合を介して結合しているFv抗体フラグメントの 軽鎖領域に付加された。細胞障害活性のためにタンパク質分解式活性化を要しな いシュードモナス外毒素（PE）を含んで成るものが含まれる。 最後に、本発明は細胞の細胞質ゾルに抗体を輸送する方法も提供する。この方 法は細胞を、その細胞の細胞質ゾルへの転位のためにタンパク質分解式切断を要 しないシュードモナス外毒素に付加された抗体を含んで成るキメラ分子と接触さ せることを含む。このキメラ分子は好ましくは、抗体（例えばＶH又はＶL領域） がドメインＩｂの、ドメインII、又はドメインIIIのカルボキシ末端に置換して いる融合タンパク質である。ドメインIIIは好ましくは異種ペプチド配列のトラ ンケーション、突然変異又は挿入により不活性化される（その細胞障害活性を実 質的に失わせる）。定義 20種類の天然アミノ酸についての略語は慣用の用法に従う（第２版、E．S．Go lub and D．R．Gren、編、Sinauer Associates，Sunderland，MA，1991）。20種 の慣用アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、異常アミノ酸、例えばα ，α−ジ置換化アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の異常アミ ノ酸も本発明のポリペプチドにとって適当な成分である。異常アミノ酸の例には 、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ト リメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセ リン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシルリジ ン、ω−Ｎ−メチルアルギニン並びにその他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例 えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書において用いるポリペプチ ド表示では、標準の用法及び便宜に従い、左方向がアミノ末端方向であり、そし て右方向がカルボキシ末端方向である。同様に、何ら かのことわりのない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左末端は５’末端であ り；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と称する。新生RNA転写体 の５’から３’に至る付加の方向を転写方向と称する；RNAと同一の配列を有し 、そしてRNA転写体の５’先端の５’側にあるDNA鎖上の配列領域を「上流配列」 と呼ぶ；RNAと同一の配列を有し、そしてRNA転写体の３’末端の３’側にあるDN A鎖上の配列領域を「下流配列」と呼ぶ。 「核酸」なる語は５’から３’末端へと読んだデオキシリボヌクレオチド又は リボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを意味する。それは自己複製 式プラスミド、DNA又はRNAの感染性ポリマー、及び非機能性DNA又はRNAを含む。 「タンパク質に対して特異的に結合」又は「特異的に免疫反応する」なる表現 は、抗体又は「結合性因子」について言及しているとき、不均質なタンパク質及 びその他の生体物質の集団の存在下で標的分子（例えばタンパク質）の存在に限 定される結合反応を意味する。即ち、表示のイムノアッセイ条件下で、特定の結 合性因子又は特定の結合性因子を含んで成る融合タンパク質は特定のタンパク質 又はその他の標的分子に結合し、そしてサンプル中に存在するその他のタンパク 質には有意に結合しない。かかる条件下でのタンパク質に対する特異的な結合は 、特定の標的分子に対するその特異性について選定された結合性因子を要しうる 。例えば、抗体Ｂ１，Ｂ３，Ｂ５及びBR96はルイスy炭水化物抗原に結合し、そ して生物サンプル中に存在するその他のいづれの標的分子にも結合しない。特定 の標的分子に特異的に反応性である結合性因子を選定するのに様々なイムノアッ セイ方式が利用されうる。例えば、固相ELISAイムノアッセイはタンパク質に特 異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選定するのに日常的に利用されて いる。特異的な免疫反応性 を決定するのに利用されうるイムノアッセイ方式の説明及び条件についてはHarl ow and Lane（1988）Antibodied，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor P ublications，New Yorkを参照のこと。 「ペプチド」及び「ポリペプチド」はアミノ酸鎖であって、そのα炭素が一個 のアミノ酸のａ’炭素カルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基との間での縮合 反応により形成されるペプチド結合を介して連結されているものである。従って 、この鎖の一端（アミノ末端）による末端アミノ酸は遊離アミノ基を有し、一方 、この鎖の他端（カルボキシ末端）にある末端アミノ酸は遊離カルボキシル基を 有する。 一般に、ポリペプチドを構成するアミノ酸はポリペプチドのアミノ末端からカ ルボキシ端へと上昇する順序で番号付けされる。即ち、一のアミノ酸が別のアミ ノ酸の「後」であると言ったとき、そのアミノ酸は「先行」するアミノ酸よりも ポリペプチドのカルボキシ末端に近く位置する。 本明細書で用いる語「残基」とはペプチドの中に組込まれているアミノ酸を意 味する。このアミノ酸は天然アミノ酸であってよく、そして何らかのことわりの ない限り天然アミノ酸と同じように機能しうる天然アミノ酸の公知の類似体を包 括しうる。 「ドメイン」なる語はポリペプチドの特徴的な領域を意味する。このドメイン は特定の構造的特徴、例えばαヘリックスもしくはβプリーテッドシートにより 、特徴的な構成アミノ酸により（例えば主に疎水性もしくは親水性のアミノ酸、 又は反復アミノ酸配列）、又は折りたたみ三次元ポリペプチドの特定領域におけ るその位置により特徴付けられうる。ドメインは一連の連続アミノ酸より成るか 、又は鎖内で他とは隔離されているが、ポリペプチドの折りたたみにより近づく アミノ酸配列より成りうる。 「融合タンパク質」は一のポリペプチドのアミノ末端と他のポリペプチドのカ ルボキシル末端との間で形成されるペプチド結合を介して２本以上のポリペプチ ドを連結することにより形成されたポリペプチドを意味する。融合タンパク質は 構成ポリペプチドの化学カップリングにより形成し得るか、又は一本の連続融合 タンパク質をコードする核酸由来の一本鎖ポリペプチドとして発現されうる。一 本鎖融合タンパク質は一本の連続ポリペプチド骨格を有する融合タンパク質であ る。 本明細書で用いる「スペーサー」又は「リンカー」は融合タンパク質を構成す るタンパク質を連結するペプチドを意味する。一般に、スペーサーはタンパク質 を連結する又はそれらの間に一定の最小距離もしくはその他の立体関係を保持せ しめる以外に何ら特定の生物活性をもたない。しかしながら、スペーサーの構成 アミノ酸は分子の折りたたみ、正味電荷又は疎水性の如き分子の一定の特性を左 右するように選定されることができうる。 本明細書で用いる「標的分子」とは、結合性因子が特異的に結合する分子を意 味する。一般に標的分子は特定の細胞タイプ又は生理学的状態の特徴である。即 ち、例えば、ルイスy抗原又はｃ−erbB２の如き標的分子が一般に様々な癌細胞 上に見い出されている。このような標的分子に特異的な結合性因子は従って免疫 毒素を標的分子をもつ細胞へと誘導する。 図面の簡単な説明 図１はジスルフィド安定化結合性因子がアミノ末端に配置された又はドメイン Ｉｂの代わりに挿入されたＢ１免疫毒素の模式図を示す。PE配列に広がるアミノ 酸の位置に番号を付けている。矢印は活性化のためのPEのタンパク質分解部位を 示す。Ｓ−ＳはFvフラグメ ント間のジスルフィド結合連鎖を示す。Ｌ：ペプチドリンカー；ＶH：可変重鎖 ；ＶL：可変軽鎖；II：転位のためのPEドメインII；Ｉｂ：PEドメインＩｂ（機 能未知）；III：EF２のADP−リボシル化のためのPEドメインIII。 図２はカルボキシルジスルフィド−安定化結合性因子を有するｅ23免疫毒素の 模式図を示す。PE配列に広がるアミノ酸の位置に番号を付けている。一文字コー ドで列挙したアミノ酸はＣ末端残基である。矢印は活性化のためのPEのタンパク 質分解部位を示す。Ｓ−ＳはFvフラグメント間のジスルフィド結合連結を示す。 図３はｅ23 dsfv免疫毒素の発現のために用いたプラスミドを示す。ｅ23（Fv ）のフレームワーク領域内のシステイン置換の位置（星印として示す）はＶHで はAsn44→Cys、そしてＶLではGly99→Cysである。プラスミドpCT12はPEの280位 においてMetで始まり、そしてアミノ酸281〜364及び381〜607を含むタンパク質P E35/TGFαKDELをコードし、ここでPEのアミノ酸607と604との間に挿入されたTGF αをコードする遺伝子があり、そしてこのタンパク質のKDELは天然REDLK配列を 置換している。PE35/ｅ23（ＶH Cys44）KDEL及びPE35/ｅ23(ＶHCys44)のそれぞ れをコードするプラスミドpCTK101及びpCTK103はdsfv免疫毒素PE/ｅ23（dsfv）K DELの毒素−ＶH成分についての発現プラスミドである。プラスミドpCTK102はPE アミノ酸604-608に融合されたｅ23（ＶL）Cys99及びカルボキシル末端配列KDEL をコードする。プラスミドpYR39及びpYR40はｅ23（ＶHCys44）PE38KDEL及びｅ23 (ＶLCys99)のそれぞれをコードする。 図４はヌードマウスモデルにおいてＢ１（dsfv）PE33及びＢ１（dsFv）PE38に より引き起こされる抗腫瘍効果及び完全退縮の持続性を示す。５匹のマウスのグ ループに０日目に３×106個s.c.注射を 施し、そして腫瘍が樹立される５，７及び９日目（垂直矢印で表示）に（Ａ）Ｂ １（dsFv）PE33及び（Ｂ）Ｂ１（dsFv）PE38の注射により処置した。コントロー ルマウスはPBS-HSAで処置した。誤差バーはデーターの標準誤差を示す。（○） コントロール；（□）400pmole／kg；（▲）200pmole／kg；（△）100pmole／kg 。 図５はジスルフィド安定化結合性因子がカルボキシ末端に配置された、又はド メインＩｂの代わりに挿入されたＢ３免疫毒素の模式図を示す。PE配列に広がる アミノ酸の位置に番号を付してある。Ｓ−ＳはFvフラグメント間のジスルフィド 結合連結を示す。ＶH：可変重鎖；ＶL：可変軽鎖；II：転位のためのPEドメイン II；III：EF２のADP−リボシル化のためのPEドメインIII。 詳細な説明 本発明は強まった細胞障害活性を有するシュードモナス外毒素（PE）を基礎と する免疫毒素に関する。細胞障害活性にとってタンパク質分解式切断を要しない ように改変されたシュードモナス外毒素に付加されたジスルフィド安定化結合性 因子を含んで成る免疫毒素が予測し得なかった高レベルの細胞障害能、詳しくは 標的細胞に対して10倍増強された細胞障害能を示すことは本発明の驚くべき発見 であった。この細胞障害能と、固体腫瘍へのより良い浸透を司る免疫毒素のサイ ズの小ささとの組合せは改善された薬理効能の免疫毒素をもたらす。本明細書に おいて用いる語結合性因子とは、特定の所定の標的分子を特異的に認識してそれ に結合する分子を意味する。従って、この結合性因子は所定の標的分子を発現す る細胞を特異的に標的とすることができる。即ち、結合性因子を含むキメラ免疫 毒素はこの結合性因子により認識される標的分子を抱える細胞に特異的に結合し 、そしてそれを殺傷するか又はその増殖を阻害する。 好適な結合性因子はイムノグロブリン、イムノグロブリン科の構成員、又は下 記章II（Ａ）に記載の如きイムノグロブリン又はイムノグロブリン科の構成員に 由来する分子である。特に好適な結合性因子にはイムノグロブリン（又はイムノ グロブリン科）分子の認識ドメインの組込まれた（例えば抗体の可変領域の組込 まれた）イムノグロブリンフラグメントが含まれる。 好適な結合性因子は、リンカーにより、最も好ましくはジスルフィド連結（例 えば各鎖内の対応のシステイン間で形成）により連結し合った少なくとも２本の 異なるポリペプチドを含む。ジスルフィド連結により連結された２本のポリペプ チド鎖を含んで成る結合性因子は凝集する傾向が抑えられ、一般に長い血清半減 期を示し、そして「安定化」されたものと言える。即ち、本明細書で用いるジス ルフィド安定化結合性因子は少なくとも一本のジスルフィド結合により連結され た少なくとも２本のポリペプチドを含んで成る結合性因子を意味する。しかしな がら、ジスルフィド結合がポリペプチドを連結する唯一の連結である必要はない 。即ち、例えば、抗体の可変軽鎖及び可変重鎖はジスルフィド連結により連結さ れ、そして末端ペプチドリンカーにより更に連結されていてよい。かかる分子は それ故一本鎖融合タンパク質（例えばＶH−ペプチド−ＶL）として発現され得、 ここでＶH及びＶLポリペプチドはジスルフィド連結の形成によりその後橋渡しさ れたものである。ジスルフィド安定化結合性因子の製法は1993年６月14日提出の 同時係属特許出願USSN 08/077,252号に見い出せうる。 前記の通り、ジスルフィド−安定化結合性因子はタンパク質分解式活性化を要 せずに細胞障害性となるように改変されたシュードモナス外毒素に付加されてい る。下記の章IIIに説明の通り、これは一般にアミノ酸末端から少なくとも279位 までのトランケーションを 包括する。活性化にとってタンパク質分解式切断を要しないシュードモナス外毒 素の製法は、1992年６月18日提出の第07/901,709の継続出願である1995年３月15 日提出の同時係属特許出願第08/405,615号に記載されている。 ジスルフィド安定化結合性因子は改変シュードモナス外毒素内の本質的に任意 の位置に配置されていてよい。一の好適な態様において、Heimbrookら、Proc．N atl．Acad．Sci.，USA，87：4697-4701(1990)並びに共譲渡された1992年４月８ 日出願のU.S.S.N.07/865,722号及び1990年５月14日出願のU.S.S.N.07/522,563号 の記載に従いTGFα／PE40分子（TP40とも称される）について知られているよう に成し遂げられるよう、この結合性因子はドメインＩａを置換するように挿入さ れる。 ジスルフィド安定化結合性因子はドメインＩｂ全体又はその一部を更に置換し てよい。即ち、例えばドメインIIｂ内の残基343〜394を排除するか、又はジスル フィド安定化結合性因子の２本の鎖のうちの一本と置き換えてよい。 ジスルフィド安定化結合性因子は他にカルボキシル末端又はその近くに位置し てよい。ジスルフィド安定化結合性因子がカルボキシル末端にあるとき、それは アミノ酸604の後に位置するのが好ましく、アミノ酸604と608との間の位置がよ り好ましく、そしてアミノ酸607あたりよりも後が最も好ましい。PEの適当なカ ルボキシル末端は結合性因子の後のPEのアミノ酸604〜613あたりを置き換えるこ とにより再生し得る。即ち、このジスルフィド安定化結合性因子は好ましくはア ミノ酸607あたりの後の組換PE分子内に挿入され、そしてPEのドメインIIIのアミ ノ酸604〜613が後続する。新たなカルボキシル末端は小胞体配列REDLK及びKDEL も含み、KDELが最も好ましい。その末端は末端PEアミノ酸も含んでよい。即ち、 一の特 定の好適な態様において、ジスルフィド安定化結合性因子は残基607の後に位置 する抗体であり、それにPE残基604-608が後続し、それにKDELが続く。所望の抗 体に由来するＶL又はＶH領域はドメインIII内に一本鎖形態で挿入してもよい。 ジスルフィド安定化結合性因子は抗体、より詳しくは抗体のFv領域であり、改 変PEは上記の通りPEの任意の領域においてFvのＶH又はＶLドメインのいづれかに 融合し得る。PEとＶL又はＶHとの融合は直接的か、１又は複数のペプチドリンカ ーを介してよい。かかるリンカーは可変鎖のカルボキシル末端、可変鎖のアミノ 末端、又はその両端においてＶH又はＶLに付加されうる。 可変重鎖（ＶH）がPEに融合しているとき、可変軽鎖（ＶL）は１又は複数のジ スルフィド連結により融合可変重鎖に連結されている。逆に、可変軽鎖（ＶL） がPEが融合しているとき、可変重鎖（ＶH）は１又は複数のジスルフィド連結に より融合可変軽鎖に連結されている。 更に、Fv領域の成分ではなく、可変重鎖又は軽鎖領域が単独でその標的分子に 特異的に結合できることが本発明の発見である。即ち、一の態様において、本発 明は可変軽鎖（ＶL）又は可変重鎖（ＶH）領域に付加された細胞障害活性のため にタンパク質分解式活性化を要しないシュードモナス外毒素（PE）を含んで成る 一本鎖免疫毒素融合タンパク質を提供する。実際には、これらの融合タンパク質 は上記のジスルフィド安定化融合タンパク質と同じようにして作られるが、対応 の可変領域をジスルフィド連結により連結する工程は省略する。更に、ジスルフ ィド連結を形成する必要がないため、いづれかの可変領域にシステインを導入す る、又はPEに存在するシステインを排除する必要はない。可変軽鎖又は可変重鎖 はいづれも改変PEと融合して発現されうる。 当業者は追加の改変、欠失、挿入等をジスルフィド安定化結合性因子及びPEに 施してよいことを認識するであろう。特に、欠失又は変更をPEの中に、又は抗体 遺伝子をPEに連結するリンカーの中に施し、標的細胞に対する融合タンパク質の 細胞障害能を強める、又は抗体に対する抗原抜きで細胞に対する非特異的な細胞 障害能を弱めることができる。典型的な改変には、限定することなく、転写開始 用上流メチオンの挿入、ジスルフィド連結の作成のためのＶH又はＶL領域内での システインに至る残基の突然変異、不要なジスルフィド連結形成の阻止のための PE内の287位のシステインのセリンに至る突然変異、上流（アミノ）ペプチドリ ンカー(例えばGGGGS)、下流（カルボキシル）ペプチドリンカー(例えばKASGGPE) 、等が含まれる。かかる構築体は全て当業者に公知の遺伝子操作法により作られ うる（一般的には、Berger and Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniqu es，Methods in Enzymology Volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA （Berger）；Sambrookら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual（2nd版）Vo l．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，（1 989）；及びCurrent Protocols in Molecular Biology，F．M．Ausubelら編、Gr eene Publishing Associates，Inc.とJohn Wiley & Sons，Inc.,とのジョイント ベンチャー（1994付録）（Ausubel）を参照のこと。組換イムノグロブリンの製 法も当業界において公知である。Cabilly，U．S．Patent No．4,816,567；及びQ ueenら、Proc．Nat’l．Acad．Sci．USA，86：10029-10033(1989)を参照のこと ）。Ｉ．ジスルフィド安定化結合性タンパク質 Ａ）一般イムノグロブリン構造 本明細書において利用する語「イムノグロブリン結合」及び「免疫学的結合特 性」はイムノグロブリン分子と、そのイムノグロブリ ンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有相互作用を意味する。免疫学的 結合相互作用の強度又は親和力は相互作用の解離定数（Kd）で表わすことができ 、ここで小さいKdは強い親和力を意味する。選定のポリペプチドの免疫学的結合 特性は当業界公知の方法を利用して定量できる。一のかかる方法は抗原結合性部 位／抗原複合体の形成及び解離の速度の測定を含み、ここでその速度は複合体パ ートナーの濃度、相互作用の親和力、及び両方向における速度に同等に影響を及 ぼす幾何学的パラメーターに依存する。「正反応定数」（Ｋon）及び「逆反応定 数」（Ｋoff）は共に濃度並びに会合及び解離の実際の速度の計算により決定で きうる。Ｋoff／Ｋonの比は親和に無関係な全てのパラメーターの排除を可能に し、それ故解離定数Kdに等しい（一般には、Daviesら、Ann．Rev．Biochem.，59 ：439-473（1990）を参照のこと）。 本明細書に用いる「抗体」はイムノグロブリン遺伝子又はイムノグロブリン遺 伝子のフラグメントにより実質的にコードされる１又は複数のポリペプチドより 成るタンパク質を意味する。認識されているイムノグロブリン遺伝子には、カッ パー、ラムダ、アルファー、ガンマー、デルタ、エプシロン及びミュー定常領域 遺伝子、並びにミリアドイムノグロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカ ッパー又はラムダのいづれかに分類される。重鎖はガンマー、ミュー、アルファ ー、デルタ又はエプシロンに分類され、それらはイムノグロブリンクラスIgG，I gM，IgA，IgD及びIgEのそれぞれを規定する。 典型的なイムノグロブリン（抗体）構造単位は四量体を含んで成ることで知ら れる。各四量体はポリペプチド鎖の２組の同一のペアーより成り、各ペアーは一 本の「軽鎖」（約25kD又は約214個のアミノ酸）及び一本の「重鎖」（約50〜70k D又は約446個のアミノ酸 ）より成る。各鎖のＣ末端は抗体のエフェクター機能（例えば補体固定、オプソ ニン作用等）を決定する定常領域（Ｃ）を規定し、一方、各鎖のＮ末端は抗原認 識を主に司る約100〜110又はそれより多くのアミノ酸の可変領域を規定する。可 変軽鎖（ＶL）及び可変重鎖（ＶH）なる語はこのような軽鎖及び重鎖のそれぞれ を意味する。 イムノグロブリン科の構成員は全て一連の逆平行β鎖をイムノグロブリン様フ ォールドへと安定化せしめる中央に位置したジスルフィド結合を特徴とするイム ノグロブリン様ドメインを共有する。科の構成員（例えばMHCクラスＩ、クラスI I分子、抗体及びＴ細胞レセプター）はイムノグロブリン可変又は定常ドメイン のいづれかとの相同性を共有しうる。 全長イムノグロブリン又は抗体「軽鎖」（一般に約２５キロダルトン（Kd）、 約214個のアミノ酸）はＮ末端（一般に約110個のアミノ酸）での可変領域遺伝子 及びCOOH末端での定常領域遺伝子によりコードされる。全長イムノグロブリン又 は抗体「重鎖」（一般に約50Kd、約446個のアミノ酸）は同様に可変領域遺伝子 （一般に約116個のアミノ酸をコードする）及びいづれかの定常領域遺伝子（一 般に約330個のアミノ酸をコードする）によりコードされる。一般に、「ＶL」は ＶL及びＪL（Ｊ又は連結領域）によりコードされる軽鎖部分を含み、そして「ＶH 」はＶH並びにＤH（Ｄ又は多様性領域）及びＪH遺伝子セグメントによりコード される重鎖の部分を含むであろう。一般には、Roittら、Immunology、第６章（ 第２版、1989）及びPaul，Fundamental Immunology；Raven Press（第２版、198 9）を参照のこと。Fv抗体フラグメントは可変重鎖及び可変軽鎖領域を含む。 イムノグロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、全て相補性決定領域 又はCDRと称され、４つの比較的保存されたフレームワーク領域又はFRの隣接し た３つの超可変領域を含んで成る。数多くのフレームワーク領域及びCDRが発表 されている（Kabatら、Sequences of Protein of Immunological Interest、米 国政府印刷局、NIH公開番号91-3242(1991)を参照のこと；本明細書では「Kabat and Wu」とも称する）。種々の軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は比較 的保存されている。CDR及びFRポリペプチドセグメントは現在の抗体のFv領域又 はそれをコードするDNAの配列分析に基づいて経験的に命名される。Kabat and W u等において公開されているものとの注目の抗体配列の整合より、フレームワー ク領域及びCDRは注目の抗体又はそのリガンド結合性成分について決定できうる 。構成軽鎖及び重鎖の組合せたフレームワーク領域はCDRを配置及び整列するの を担う。CDRは主に抗原のエピトープに対する結合を主に司り、そして一般にCDR １，CDR２及びCDR３と称され、その番号は可変領域鎖のＮ末端から順に始まる。 フレームワーク領域に同様に番号を付した。 Ｔ細胞レセプターの一般整列は抗体重鎖のそれに類似しており、Ｔ細胞レセプ ター(TCR)は可変ドメイン（Ｖ）及び定常（Ｃ）ドメインの双方を有する。Ｖド メインは抗原への結合のために機能する。抗体のフレームワークCDR領域に対し て相同性の領域がＶドメイン内にある。イムノグロブリンＶ領域に対する相同性 は整合により決定し得る。TCRのＶ領域は抗体のFvの高度なアミノ酸配列同一性 を有する。（Hedrickら、Nature（London）308：153-158（1984））。 本明細書において用いる語CDRは複数のアミノ酸配列であって、一緒になって 天然イムノグロブリン結合性部位の天然可変結合性領域（例えばFv）、Ｔ細胞レ セプター（例えばＶα及びＶβ）又はこ の機能を擬態する合成ポリペプチドの結合親和力及び特異性を規定するものをい う。本明細書において用いる語「フレームワーク領域」又は「FR」はCDR間に挿 入されたアミノ酸配列を意味する。 「結合性因子」とは、特定のリガンド又は抗原に特異的に結合する又はそれを 認識するように機能できる可変ドメインを有する分子をいう。特に注目の成分に は抗体及びＴ細胞レセプター、並びにFv，Fab，Ｆ(ab')2の如き合成又は組換結 合性フラグメントを含む。適当な可変領域にはＶH，ＶL，Ｖα及びＶβ等が含ま れる。 抗体はインタクトイムノグロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消 化により生成される数多くのよく特性決定されたフラグメントとして存在する。 即ち、例えば、ペプシンは抗体をヒンジ領域内のジスルフィド連結の下方で消化 してＦ(ab')2、即ちFabの二量体を生成する。Fab自体又はジスルフィド結合によ りＶH−ＣH１に連結された軽鎖である。Ｆ(ab')2は温和な条件下で還元されたヒ ンジ領域内のジスルフィド連結が切られ、これにより(Fab')2二量体はFab'単量 体へと変換する。Fab'単量体は本質的にはFabとヒンジ領域の一部とである。Fv 領域はFabの可変部ＶH−ＶL二量体である（その他の抗体フラグメントのより詳 細な説明については、Fundamental Immunology，W．E．Paul編、Raven Press，N ．Y．（1993）を参照のこと）。様々な抗体フラグメントはインタクト抗体の消 化の観点において定義されているが、当業者はかかるフラグメントが化学的又は 組換DNA方法論のいづれかを利用してde novo合成できうることを理解しているで あろう。即ち、本明細書において用いる抗体なる語は、まるごとの抗体の修飾に より、又は組換DNA方法論を利用してde novo合成することにより製造された抗体 フラグメントも含む。好適な抗体にはジスルフィド安定化抗体、より好ましくは ジスルフィド安定化Fv（dsfv）抗体であって可変重鎖及び 可変軽鎖が少なくとも一本のジスルフィド連結により結合し合ってインタクトFv フラグメントを形成しているものを含む。 本発明の実施は抗体のFv領域又はTCRのＶ領域を利用するのが好ましい。その 他の区域、例えば天然イムノグロブリンタンパク質構造のＣH及びＣLは存在して いる必要がなく、そして通常は本発明のポリペプチドから故意に排除されている 。しかしながら、本発明のポリペプチド生物活性領域を規定する更なるポリペプ チド領域、例えば毒素もしくは酵素を含んで成るか、又は下記のように毒素もし くは遠隔的に検出可能な物質を付加することのできる部位を含んで成りうる。Ｂ）Fvフラグメントの調製 Fv抗体フラグメント又は注目のその他のリガンド結合性因子についての情報が 所望のジスルフィド安定化フラグメント、例えばFvフラグメント（dsFv）を安定 化するようジスルフィド結合の適正な配置を供するために必要である。注目の可 変フラグメントのアミノ酸配列をKabat and Wu前掲による公知の公開物の中の類 似の配列との整合により対比し、所望のポリペプチドフラグメントのフレームワ ーク領域内にジスルフィド結合を供するよう各重鎖及び軽鎖可変領域の適正な位 置においてシステインがコードされるようにどの配列を突然変異させてよいかを 決定する。システイン残基は共有ジスルフィド結合を供するものが好ましい。例 えば、ジスルフィド結合はＶLのFR４とＶHのFR２を接続するのに、又はＶLのFR ２とＶHのFR４とを接続させるように配置させることができる。 配列を整合させた後、Kabat and Wuにより利用される番号付け方式における下 記の位置と整合する注目の配列内のアミノ酸の位置を同定する：重鎖可変領域の 位置43，44，45，46及び47（グループ１）並びに位置103，104，105及び106（グ ループ２）；並びに軽鎖可 変領域の位置42，43，44，45及び46（グループ３）並びに位置98，99，100及び1 01（グループ４）。あるケースにおいては、これらの位置の一部は欠失しており 、整合におけるギャップとなっている。 次に、このように同定された位置のうちの２箇所においてアミノ酸をコードす る核酸配列を変化させ、その２個のアミノ酸がシステイン残基へと突然変異する ようにする。選定するアミノ酸のペアーは、優先順に下記の通りである： ＶH44-ＶL105 ＶH44-ＶL99 ＶH44-ＶL100, ＶH105-ＶL43, ＶH105-ＶL42, ＶH44-ＶL101, ＶH106-ＶL43, ＶH104-ＶL43, ＶH45-ＶL98, ＶH46-ＶL98, ＶH103-ＶL43, ＶH103-ＶL44, ＶH103-ＶL45. より好ましくは、システインの置換は次の位置で行う： ＶH44−ＶL105(例えば、Ｂ１（dsfv）−PE33参照)； ＶH44−ＶL99（例えば、PE35/ｅ23（dsFv）KDEL参照）； ＶH44-ＶL100；又は ＶH105−ＶL43。 （例えば表示ＶH44−ＶL100は44位にシステインをもつＶH及び100位にシステ インをもつＶLを有するポリペプチドを意味する；その位置はKabat and Wuによ り表示されている番号付けに従う。） Kabat and Wuに従う位置の認定では、位置番号は規定の保存残基を意味し、そ して一定の抗体における実際のアミノ酸位置ではない。例えば、下記の実施例に 記載の通りにしてds（Fv）Ｂ３を作製するように用いるCysL100(Kabat and Wu) は実際にはＢ３（ＶL）の105位に対応する。 Ｔ細胞レセプターのＶα及びＶβの場合、Kabat and WuにおけるＴ細胞レセプ ターについての番号方式も参照してよい。システインの置換はＶαの位置41，42 ，43，44もしくは45において、及びＶβの位置106，107，108，109もしくは110 において；又はＶαの位置104，105，106，107，108もしくは109において、及び Ｖβの位置41，42，43，44もしくは45においてなされ、かかる位置はTCRについ てのKabat and Wuの番号方式に従う。かかる参照を行ったとき、最も好適なシス テイン置換はＶα42−Ｖβ110及びＶβ108−Ｖβ42である。Ｖβ位置106，107及 びＶα位置104，105はCDR位置ではあるが、それらはジスルフィド結合を安定的 に配置できる位置である。 Kabat and Wu番号方式の参照によるシステイン置換のためのアミノ酸位置の同 定の他に、注目の配列を、米国特許第5,242,813号、1991年９月30日出願の同時 係属出願USSN 07/767,331号、1993年４月22日出願の同時係属出願USSN 08/051,1 33号、全て1994年10月28日出願の同時係属出願USSN 08/331,391，08/331,397及 び08/331,396号、並びにBenharらClin．Cancer．Res.，１：1023-1029（1995） に記載の如きAmerican Type Culture Collection，Rockville，Marylandに全て 寄託されてあるモノクローナル抗体(MAb)Ｂ１，Ｂ３又はＢ５ハイブリドーマに ついての配列と整合させることができる。グループ１について上記のKabat and WuのＶH位置に対応するＢ３のアミノ酸位置はそれぞれ43，44，45，46及び47で ある；グル ープ２はそれぞれ109，110，111及び112である。グループ３について上記のKaba t and WuのＶL位置に対応するＢ３のアミノ酸位置はそれぞれ47，48，49，50及 び51である；グループ４はそれぞれ103，104，105及び106である。 他方、システイン残基にする突然変異部位は以下に例示の通りにして実際の抗 体又はモデル抗体のいづれかを参照することにより同定できうる。抗体の如きタ ンパク質のモデルを作成するためのコンピュータープログラムは一般に入手可能 であり、そして当業界に公知である（Kabat and Wu；Loewら、Int．J．Quant．C hem.，Quant．Biol．Symp.，15：55-66（1988）；Bruccoleriら、Nature，335： 564-568（1988）；及びChothiaら、Science，233：755-758（1986）を参照のこ と）。市販のコンピュータープログラムを用い、これらのモデルをコンピュータ ーモニター上に表示する、原子間距離を計算する及び異なるアミノ酸の相互作用 の傾向を評価することができる（Ferrinら、J．Mol．Graphics，６：13-27(1988 )参照のこと）。例えば、コンピューターモデルは、アクセス可能であり、そし て結合に関連している帯電アミノ酸残基を推定でき、従ってコンホメーション的 に限定された有機分子を合成することができる。例えば、Saragoviら、Science ，253：792（1991）を参照のこと。その他の場合、抗体の実験的に決定された実 際の構造が有用である。 適切なアミノ酸残基のペアー（１）８Å以下、好ましくは6.5Å以下の２個の 残基間のＣα−Ｃα距離（Brookhaven Protein Data Bankの如きに由来する抗体 の結晶構造より決定）を有する、及び（２）可能な限りCDR領域から離れている 、べきである。一旦同定できたら、それらはシステインで置換してよい。上記に 挙げたものと相同性の位置でのモデル化Ｂ３における残基ペアー間のＣα−Ｃα 距離を下記の表１に記載する。 １ペアーのシステイン置換の導入がほとんどの用途にとって十分であろう。更 なる置換が一定のケースにおいて有用且つ所望されうる。 標的箇所においてシステインをコードする遺伝子の改変は公知の技術、例えば 部位特異的突然変異誘発（Gillman and Smith，Gene，８：81-97（1979）及びRo bertsらNature，328：731-734（1987））により、Kunkel，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 82：488-492(1985)記載の方法により、又は当業界公知の任意のその他 の手段により容易に成し遂げることができうる。 所望のＶH及びＶL配列（又はその他の相同性Ｖ配列）についての配列を有する 独立ベクターを突然変異されたプラスミドから作ることができうる。重鎖領域及 び軽鎖領域をコードする配列を作り、そして下記のガイドラインを除き、当業界 における任意の公知の又は発表された態様で独立の培養物の中で発現させる。別 の配列、例えば毒素についての配列を発現ポリペプチドの中に組込むとき、それ はＶHもしくはＶL配列にＮ−もしくはＣ−末端にて結合させるか、又はその他の タンパク質配列の中に適当な位置において挿入してよい。例えば、シュードモナ ス外毒素（PE）由来融合タンパク質については、ＶH又はＶLを毒素のＮ末端に連 結させるか、又はTheuerら、J．Urol.，149：1626-1632(1993)におけるTGFαの 如きのようにPEのドメインIIIに挿入するか、又はPEのドメインＩｂの代わりに 挿入するべきである。ジフテリア毒素由来免疫毒素については、ＶH又はＶLは好 ましくは毒素のＣ末端に連結させる。 ペプチドリンカー、例えば組換一本鎖抗体の発現において利用されているもの を、所望するなら２つの可変領域（ＶHとＶL，ＶαとＶβ）を連結するために利 用してよく、そして一定の分子の安定性を積極的に強めうる。本発明の二価又は 多価ジスルフィド安定化 ポリペプチドは下記の実施例に記載の通りにして２個以上の、好ましくは同一の ＶH領域をペプチドリンカーに接続し、そしてＶLを付加させることにより構築で きうる。リンカーによる２個以上のＶH領域の接続がリンカーによるＶL領域の接 続より好ましく、その理由はホモ二量体を形成する傾向がＶL領域よりも強いか らである。ペプチドリンカー及びその利用は当業界において公知である。例えば 、Hustonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，supra；Birdら、Science、前掲；Gl ockshuberら、前掲；米国特許第4,946,778号、同5,132,405号及び最近のStemmer ら、Biotechniques 14：256-265（1993）を参照のこと。Ｃ）様々なdsFvフラグメント分子 上記のdsFvペプチドの説明は全ての異なる種（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、 ヒト）の抗体の全てのクラス／グループ、キメラペプチド、ヒト化抗体等をカバ ーしうるものと理解されるべきである。「キメラ抗体」又は「キメラペプチド」 は抗体又は抗体ペプチドであって、ペプチドの一部が第一遺伝子起源由来の抗体 又はペプチドに由来するか又はそれに相同性のアミノ酸配列を有し、一方鎖の残 りのセグメントが別の遺伝子起源の対応の配列に相同性であるものをいう。例え ば、キメラ抗体はフレームワークと相補性決定領域とが異なる起源に由来してい る抗体を含みうる。例えば、非ヒトCDRをヒト定常領域に連結されたヒトフレー ムワーク領域の中に組込んで「ヒト抗体」を作ることができる。例えばPCT出願 公開番号WO87/02671、米国特許第4,816,567号、ヨーロッパ特許出願0173494号、 JonesらNature 321：522-525(1986)及びVerhoeyenら、Science，239：1534-1536 （1988）を参照のこと。同様に、ＶHの起源がＶLの起源を異なっていてもよい。 特に好適な結合性因子は癌細胞の特徴的なレセプター又はその他 の表層マーカーを特異的に認識する又はそれに結合する抗体に由来する。かかる マーカー及び対応の抗体は当業者に公知であり、そして限定することなく、癌胎 児性抗原(CEA)、トランスフェリンレセプター（HB21により標的化）、EGFレセプ ター(TGFαにより標的化)、Ｐ−糖タンパク質、ｃ−erbB２（ｅ２３により標的 化）、ルイスy炭水化物抗原（Ｂ１，Ｂ３，Ｂ５，BR96等により標的化）、IL− ２レセプター（抗−Tacにより標的化）、及びThird International Cmference o n Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer（San Diego，CA 1988） の要約書に記載の抗原が含まれる。Ｄ）抗体Fvドメインに対して相同性の分子−Ｔ細胞レセプター 本発明において利用されるこの結合性因子はＴ細胞レセプター(TCR)のリガン ドー特異的Ｖ−領域を含む抗体Fvドメインに対して高度な相同性を示す分子に由 来しうる。かかる用途の例を以下に概略する。TCR分子の抗原−特異性Ｖ領域の 配列2B4（Beckerら、Nature（London）317：430-434(1985)）を標準の配列整合 パッケージを用い、２つの抗体分子McPC603（下記参照）及びJ539（Protein Dat a Bank entry 2FBJ）のFvドメインに対して整合させた。2B4のＶα配列を２つの 抗体のＶH配列と整合させると、Ｂ３のＶH44に対応するＳ１部位残基がＶα43Ｓ （Kabat and Wuの番号方式ではTCR42）として同定でき、そしてＢ３のＶH111に 対応するＳ２部位残基がＶα104Q(Kabat and Wuの番号方式ではTCR 108)として 同定できた。このＶα配列を２つの抗体のＶL配列と整合させると、同一の残基 Ｖα43Ｓ及びＶα104Qが同定でき、同時にＢ３のＶL48及びＶL105のそれぞれに 対応する残基と整合する。同様に、2B4残基Ｖβ42Ｅ及びＶβ107P(Kabatらの番 号方式ではTCR 42及び110)はＢ３のＶH44及びＶH111に、そして同時にＢ３のＶL 48及びＶL105に対応する抗体残基と整合できうる。従って、このTCR内の最 も好適な鎖間ジスルフィド結合部位はＶα43−Ｖβ107及びＶα104−Ｖβ42であ る。このような残基ペアーのうちの１組における２個の残基のシステインへの突 然変異はこの分子のα及びβ鎖間にジスルフィド結合を導入するであろう。この ジスルフィド結合に由来する安定化はこのような分子を大量に単離精製すること を可能にする。III ．改変毒素 前記の通り、好適な免疫毒素は細胞障害活性のためにタンパク質分解式切断を 要しなくなるように改変（例えばトランケーション）されたシュードモナス外毒 素に連結されたジスルフィド安定化結合性因子を含んで成る。本明細書において 記載の通り、細胞障害活性は細胞を殺傷する能力又はその増殖もしくは増殖速度 を有意に抑制する能力を意味する。 本発明のPE分子は、標的細胞に特異的なジスルフィド安定化結合性因子とカッ プリングさせたときに標的細胞に対するその強められた細胞障害能及び強められ た抗腫瘍活性により固有に特徴付けられる。この強められた細胞障害能はジスル フィド安定化結合性因子に連結された天然融合タンパク質（タンパク質分解式切 断を要しないPEを含んで成る）の利用（例えば1993年６月14日出願の共譲渡U.S. S.N.08/077,252号参照）との対比又は一本鎖Fv（scFv）に融合したタンパク質分 解式切断を要しない改変PEを含んで成る融合タンパク質（例えば1995年３月15日 出願の共譲渡U.S.S.N.08/405,615号参照）との対比において認められる。 細胞障害能を決定するためのアッセイは課題のPE分子及びジスルフィド安定化 結合性因子を含んで成る融合タンパク質と、ジスルフィド安定化結合性因子に連 結した対照のPE分子、例えばPE40を含んで成る又はその逆の一本鎖Fv（scFv）に 連結された改変PE分子を含 んで成る融合タンパク質との対比を一般に含む。かくして、対応の融合タンパク 質を結合性因子に特異的な細胞に対する細胞障害アッセイで試験する。得られる IC50（以下に定義）は、リガンドレセプターからラベル化リガンドの50％を追い 出す毒素の濃度を、リガンドレセプターを抱える細胞に対する組換毒素のIC50を 徐して値を調整することにより、細胞障害指数を得るように調整し得る。各PE分 子についての細胞障害指数を対比する。 ドメインIIの欠失の認められないPE40又はその他のPE分子よりも約20倍以上、 好ましくは約60倍以上、そして最も好ましくは約300倍以上の補正済み細胞障害 指数を有するPE分子が所望される。ドメインＩａを欠くPE分子はドメインII，Ｉ ｂ及びIIIを発現するプラスミドpJH8により発現されうる。プラスミドpJH8は米 国特許第4,892,827号に記載されており、そしてAmerican Type Culture Collect ion，Rockville，MarylandよりATCC 67208として入手できる。 「IC50」は標的細胞におけるタンパク質合成を50％阻害する毒素の濃度を意味 し、それは一般に標準3Ｈ−ロイシン組込みアッセイにより測定される。追い出 しアッセイ又は競合結合性アッセイは当業界において公知且つ発表されている。 それらは一のペプチドが、別のペプチドと、標的抗原の結合について競合する能 力を測定する。 好適なPE分子はドメインＩａが欠失しており、そしてドメインIIのアミノ末端 より最初の27個のアミノ酸より多くが欠失していないものである。これは実質的 にアミノ酸１〜279の欠失を意味する。この欠失により供される細胞障害性の有 利さは下記の欠失があると著しく低下する：１−281；１−283；１−286；及び3 14〜380。ドメインIIのアミノ末端から、29，31，33又は36個ではなく、27個の アミノ酸の欠失が強められた毒素活性を供することは驚くべき ことであり、なぜならこのドメインは細胞質ゾルへの毒素の転位を司るからであ る。 更に、PE分子は、特定の所望の用途のために分子を改変するよう、部位特異的 突然変異誘発又はその他の当業界公知の技術を利用して更に改変できうる。ここ に記載のPE分子により供される機能的な利点に実質的な影響を及ぼさないように PE分子を改変する手段を利用してもよく、そしてこのようにして得られた分子は 本発明に包括されることを意図している。 好適なPE分子の最大細胞障害特性のため、分子に対するいく通りかの改変が推 奨される。分子を標的細胞の細胞質ゾルは転位するのには組換分子に適当なカル ボキシル末端配列を供するのが好ましい。有効であることのわかったアミノ酸配 列には、REDLK(天然PEの如く)、REDL又はKDEL、その反復体、又はその他の配列 であってここでは「小胞体配列」と呼んでいる小胞体の中にタンパク質を維持又 はリサイクルさせるものが含まれる。例えば、ChaudharyらProc. Natl．Acad．S ci．USA 87：308-312及びSectharamらJ．Biol．Chem．266：17376-17381(1991) 及び1990年１月２日出願の共譲渡USSN 07/459,635号を参照のこと。 ドメインＩｂのアミノ酸365-380の欠失は活性の損失抜きで行うことができる 。更に、アミノ酸位置280でのグリシンの代わりとなるメチオニンの置換はタン パク質合成の開始を可能にし、そして不適正なジスルフィド結合の形成を阻止す るアミノ酸位置287でのシステインの代わりとなるセリンの置換は有利である。 欠失の代わりに、ドメインＩｂを上記及び実施例１に記載の通りにしてジスル フィド安定化結合因子と置換してよい。III ．タンパク質発現及び精製 本発明の融合タンパク質は当業者公知のいくつかの手段に従って 作られうる。ジスルフィド安定化結合性因子及び／又は改変シュードモナス外毒 素が比較的短いとき（即ち、約50アミノ酸末満のとき）、これらは標準化学ペプ チド合成技術を利用して合成できうる。双方の分子が比較的短いとき、キメラ分 子は一本の連続ポリペプチドとして合成し得る。他方、ターゲッティング分子及 びエフェクター分子を別々に合成し、そして一の分子のアミノ末端を別の分子の カルボキシル末端と縮合させてペプチド結合を形成させることができる。他方、 このターゲッティング及びエフェクター分子をそれぞれペプチドスペーサー分子 の一端に縮合させ、これにより連続融合タンパク質を形成することができうる。 配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に付加され、その配列に残りのアミノ酸 の逐次付加がなされる固相合成が本発明のポリペプチドの化学合成のために好適 な方法である。固相合成のための技術は、引用することで本明細書に組入れるBa rany and Merrifield，Solid-Phase Peptide Synthesis；pp．3-284 The Peptid es：Analysis，Synthesis，Biology，Vol．２：Special Methods in Peptide Sy nthesis，Part A.，Merrifieldら、J．Am．Chem．Soc.，85：2149-2156(1963)及 びStewartら、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce Chem．Co.，Ro ckford，III.（1984）に記載されている。 好適な態様において、本発明のキメラ融合タンパク質は組換DNA方法論を利用 して合成する。一般に、これは融合タンパク質をコードするDNA配列を作り上げ 、そのDNAを発現カセットの中に特定のプロモーターのコントロール下で配置し 、そのタンパク質を宿主内で発現させ、発現タンパク質を単離し、そして必要な らばタンパク質を再生させることを含む。 本発明の融合タンパク質（例えばPE35/ｅ23（dsFv）KDEL，Ｂ１ （dsFv）−PE33等）をコードするDNAは任意の適当な方法、例えば適当な配列の クローニング及び制限、又は全て引用することで本明細書に組入れるNarangらMe th．Enzymol．68：90-99(1979)のホスホトリエステル法；BrownらMeth．Enzymol ．68：109-151（1979）のホスホジエステル法；BeaucageらTetra．Lett.，22：1 859-1862（1981）のジエチルホスホラミジット法；及び米国特許第4,458,006号 の固相支持法の如き方法による直接化学合成により調製し得る。 化学合成は一本鎖オリゴヌクレオチドを供する。これは相補性配列とのハイブ リダイゼーションにより、又はこの一本鎖を鋳型として用いてDNAポリメラーゼ による重合により二本鎖DNAへと変換できうる。当業者はDNAの化学合成が約100 塩基の配列に制約されることを認識しているであろうが、より長い配列が短い配 列のライゲーションにより得られうる。 他方、サブ配列をクローニングし、そして適当なサブ配列を適当な制限酵素を 用いて切断させる。そのフラグメントを次にライゲーションさせて所望のDNA配 列にすることができうる。 好適な態様において、本発明の融合タンパク質をコードするDNAはポリメラー ゼ連鎖反応(PCR)の如きDNA増幅法を利用してクローニングできうる。即ち、例え ば、好適な態様において、Ｂ１（ＶH）R44C DNAを、ＶHの５’末端にペプチドリ ンカー(GGGGS)をBamHIと一緒に作り上げ、且つ３’末端において別のペプチドリ ンカー(例えばKASGGPE)をHindIII制限部位と一緒に作り上げるプライマーを用い てPCR増幅させた。得られるDNAを次に部位特異的突然変異誘発によりPE37（pDF1 ）のドメインＩｂを置き換えるように用い、Ｂ１（ＶHR44C）PE33をコードするp CTK104を作る。 ２個の分子は好ましくは本質的に直接連結し合っているのが好ま しいが、当業者はその分子が１又は数個のアミノ酸より成るペプチドスペーサー により隔てられていてよいことを理解するであろう。一般に、このスペーサーは タンパク質同志を連結する又はその間の一定の最小距離もしくはその他の立体関 係を保つ以外の特定の生物活性はもたないであろう。しかしながら、スペーサー の構成アミノ酸は折りたたみ、正味の電荷又は疎水性の如き分子のいくつかの特 性に影響を及ぼすように選定し得る。 本発明のタンパク質はＥ．コリ（E．coli）及びその他の細菌宿主を含む様々 な細胞において発現されうる。組換タンパク質遺伝子は各宿主にとって適切な発 現コントロール配列に作用可能式に連結されている。Ｅ．コリに関し、これはプ ロモーター、例えばＴ７，trp，tac，lac又はラムダプロモーター、リボソーム 結合性部位、そして好ましくは転写終止シグナルを含む。真核細胞に関しては、 コントロール配列にはプロモーター、そして好ましくはイムノグロブリン遺伝子 、SV40、サイトメガロウィルス等に由来するエンハンサー、及びポリアデニル化 配列が含まれ、そしてスプライスドナー及びアクセプター配列が含まれうる。本 発明のプラスミドは公知の方法、例えばＥ．コリについての塩化カルシウム形質 転換、及び哺乳動物細胞についてのリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレー ションにより選定の宿主細胞に移入されうる。プラスミドにより形質転換された 細胞はプラスミド上に含まれる遺伝子、例えばamp，gpt，neo及びhyg遺伝子によ り授かる抗生物質耐性により選定できうる。 Ｅ．コリの如き細菌からのジスルフィド安定化結合因子及び免疫毒素を含むポ リペプチドを発現及び／又は適当な折りたたみ形態へのリフォルディングのため の方法は発表され、公知であり、そして本発明のポリペプチドに適用できる。Bu chnerら、Analytical Bio chemistry 205：263-270（1992）；Pluckthun，Biotechnology，９：545（1991 ）；Huseら、Science，246：1275(1989)及びWardらNature，341：544(1989)を参 照のこと。 往々にして、Ｅ．コリ又はその他の細菌由来の機能性タンパク質は封入体より 作られ、従って強力な変性剤を利用するタンパク質の可溶化及びその後のリフォ ルディングを要する。可溶化段階においては、還元剤がジスルフィド結合を溶解 させるのに存在していなければならず、それは当業界において公知である。還元 剤を有する典型的なバッファーは0.1Ｍのトリス、pH８，６Ｍのグアニジン、２m MのEDTA， 0.3ＭのDTE（ジチオスレイトール）である。タンパク質ジスルフィド 結合の再酸化は、Saxenaら、Biochemistry９：5015-5021（1970）に記載の通り 、そして特にBuchnerらAnal．Biochem．前掲（1992）に記載の通り、還元及び酸 化形態における低分子量チオール試薬の存在下で効率的に触媒されうる。 再生は一般に変性及び還元タンパク質のリフォルディングバッファーへの希釈 （例えば100倍）により成し遂げられる。典型的なバッファーは0.1Ｍのトリス、 pH8.0，0.5ＭのＬ−アルギニン、８mMの酸化グルタチオン（GSSG）及び２mMのED TAである。 一本鎖抗体プロトコールへの好適な改変において、ジスルフィド安定化結合因 子の重鎖及び軽鎖を別々に可溶化及び還元し、次いでリフォルディング溶液を組 合せる。好適な収率はこれら２種類のタンパク質を、一方のタンパク質の他方の ものに対するモル過剰量が５倍過剰以下であるモル比で混合したときに得られる 。 レドックス−シャフリングが完了した後にリフォルディング溶液に過剰の酸化 型グルタチオン又はその他の酸化性低分子量化合物を加えることが所望される。 他方、最終酸化を省略し、そしてリフォルディングをpH9.5で実施してよい。 一旦発現されたら、組換タンパク質は当業界に標準の手順、例えば硫酸アンモ ニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、等に従って精 製できうる（一般には、R．Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag， N．Y．(1982)及びDeutscher，M．P．Methods in Enzymology Vol．182：Guide t o Protein Purification，Academic Press，Inc．N．Y．(1990)を参照のこと） 。好適な態様において、折りたたまれたジスルフィド安定化及び免疫毒素は順列 イオン交換（Ｑ−Sepharose及びMono Ｑ）、それに次ぐTSK G 3000SW(Toso Haas )カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。約90〜95％の均 質性の実質的に純粋な組成が好ましく、そして薬理用途にとっては98〜99％又は それより高い均質性が最も好ましい。所望により部分的に、又は均質に至るまで 一旦精製できたら、薬理目的のためにはポリペプチドは外毒素を実質的に含まな いべきであり、それ故治療用に使用し得る。IV ．dsFvポリペプチドの結合親和力 本発明の免疫毒素は標的分子に特異的に結合できる。本発明に関し、リガンド に特異的に結合するポリペプチドは一般に標的細胞上のマーカー（抗原又はレセ プター）と反応する又はそうでなくても認識もしくは結合することができる分子 を一般に意味する。抗体又はその他のポリペプチドはリガンドに対して結合親和 性を有し、そしてもし抗体又はペプチドが、標準の抗体−抗原又はリガンド−レ セプターアッセイ、例えば競合アッセイ、飽和アッセイ、又は標準イムノアッセ イ、例えばELISA又はRIAによる測定又は決定に従いリガンドに結合又は結合可能 であるなら、リガンドに対して特異的である。この特異性の定義は一本鎖の重鎖 及び／又は軽鎖、CDR、重鎖及び／又は軽鎖の融合タンパク質又はフラグメント であって、それらが単独又は組合せにおいてリガンドに結合するならリガンド に対して特異的であるものに適用される。 競合アッセイにおいて、標的分子に結合する抗体又はペプチドフラグメントの 能力は、標的分子に対する結合について既知の化合物と競合するペプチドの能力 を検定することにより決定する。数多くのタイプの競合アッセイが知られ、そし てここで論述する。他方、インヒビターの非存在下で試験化合物の結合を測定す るアッセイも利用してよい。例えば、標的分子に結合する分子又はその他の化合 物の能力は注目の分子を直接ラベリングすることにより検出するか、又は分子を ラベルせず、そして様々なサンドイッチアッセイ方式を利用して間接的に検出す ることができる。多種多様なタイプのアッセイ、例えば競合結合性アッセイが知 られる（例えば、米国特許第3,376,110， 4,016,043号及びHarlowand Lane，An tibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Habor Publications，N．Y．（1 988）を参照のこと）。競合アッセイを用いるのではなく、一の成分のみに対す る試験化合物の結合力を測定するアッセイも有用である。例えば、イムノグロブ リンペプチドを利用して結合性リガンドの存在を同定することができる。モノク ローナル抗体アッセイのための標準の手順、例えばELISAを利用してよい（Harlo w and Lane前掲を参照のこと）。利用できうる様々なシグナル生成系については 、米国特許第4,391,904号を参照のこと。Ｖ．薬理組成物 本発明の組換融合タンパク質及び薬理組成物は非経腸投与、例えば静脈内投与 、又は体腔もしくは器官の腔への投与に極めて有用である。投与のための組成物 は一般に薬理学的に許容される担体、好ましくは水性担体の中に溶解されたPE分 子融合タンパク質の溶液を含んで成るであろう。様々な水性担体、例えば緩衝食 塩水等が使用できうる。これらの溶液は無菌であり、そして一般に不要物質を含 まない。これらの組成物は慣用の周知の滅菌技術により滅菌し得る。この組成物 は生理条件に近づけるのに必要な薬理学的に許容される補助物質、例えばpH調整 剤及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カリ ウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウム等を含みうる。このような製剤中の融合 タンパク質の濃度は幅広く変えることができ、そして主に流体容量、粘度、体重 等に基づき、選定の特定の投与方式及び患者の要望に従って選定されるであろう 。 そこで、静脈内投与のための典型的な薬理組成物は１日当り患者につき約0.1 〜10mgであろう。１日当り患者につき0.1〜約100mgの用量が、特に薬剤を血流で はなく隔離部位、例えば体腔又は器官の腔の中に投与するとき、利用されうる。 非経腸投与用組成物を調製するための実際の方法は当業者に公知又は自明であり 、そしてRemington's Pharmaceutical Science 第15版Mack Publishing Compan y，Easton，Pennsylvania（1980）に詳細に記載してある。 当該融合タンパク質又はそのカクテル（即ち、他のタンパク質との）を含む組 成物は治療的処置のために投与できうる。治療的用途において、疾患に苦しむ患 者に組成物を、疾患及びその合併症を治癒又は少なくとも軽減するのに十分な量 で投与する。これを成し遂げるのに適当な量を「治療的有効量」と定義する。こ の用途に有効な量は疾患の症度及び患者の健康の一般的な状態に依存するであろ う。 組成物の一回又は複数回の投与を、患者により必要且つ寛容される用量及び頻 度に応じて行う。いづれにせよ、この組成物は患者を効果的に処置するために十 分な量の本発明のタンパク質を投与すべきである。 本発明の組換融合タンパク質の様々な用途には、このタンパク質 の毒性作用により消失しうる特異的なヒト細胞を原因とする様々な疾患症状が含 まれる。一の好適な用途は、例えば腫瘍マーカーを特異的に標的として結合する ジスルフィド安定化結合性因子を含んで成る免疫毒素の利用による癌の処置であ る。かかる結合性因子は癌細胞上に見い出せる抗原（マーカー）に結合する抗体 を含む。かかる標的は当業者に公知であり、そして限定することなく癌胎児性抗 原(CEA)、トランスフェリンレセプター（TGFαにより標的化）、Ｄ−糖タンパク 質、ｃ−erbB２（ｅ23により標的化）、ルイスy炭水化物抗原（Ｂ１，Ｂ３，Ｂ ５，BR96等により標的化）、及びThird International Conference on Monoclon al Antibody Immunoconjugates for Cancer(San Diego，CA 1988)の要約書に記 載の抗原が含まれる。 自己免疫症状、例えばＴ及びＢ細胞により引き起こされる移植細胞対宿主病、 器官移植拒絶、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、全身性エリテマ トーデス、重症筋無力症等の処置がその他の用途に含まれる。融合タンパク質は in vitroで、例えば移植前に骨髄から有害な細胞を消失させるのにも利用されう る。融合タンパク質のリガンド結合性因子部分は意図する用途に従って選定され る。Ｔ細胞の膜上のタンパク質であって結合性因子にとっての標的を担いうるも のにはCD２（Ｔ11），CD３，CD４及びCD８が含まれる。標的を担いうるＢ細胞上 に主に見い出せるタンパク質にはCD10（CALLA抗原）、CD19及びCD20が含まれる 。CD45はリンパ細胞上に広く見い出せる可能な標的である。結合性因子にとって のこれら及びその他の可能な標的リンパ球抗原はLeucocyte Typing III，A．J． McMichael、編、Oxford University Press，1987に記載してある。 当業者はリガンド結合性因子であって、上記の細胞以外のタイプ の上に発現されるレセプター、例えは膜糖タンパク質、又は成長因子もしくはホ ルモンレセプター、例えば上皮成長因子レセプター等に結合するものを選定でき ることを理解するであろう。VI ．細胞質ゾルへの抗体の輸送 別の態様において、本発明は細胞の細胞質ゾルに抗体を輸送する組成物及び方 法を提供する。このようにして輸送する抗体は特定の細胞内成分（例えば、シグ ナル伝達系における特定のタンパク質、細胞骨格要素、特定の標的RNA等）に結 合するように選定し得る。結合した抗体は標的分子の正常活性を阻害でき、それ 故特定の細胞内機能を選択的に「ノックアウト」するのに利用できうる。抗体標 的に依存して、これは細胞障害能を判明させうるか、又は単に細胞の活性を改変 しうる。 即ち、例えば、一の態様において、抗体ＶH又はＶLは癌遺伝子のRNA転写生成 物に特異的に結合して阻害し、それ故標的細胞の形質転換を阻止しうる。他方、 この抗体は単にそれが結合する特定の細胞内成分の検出のためのラベルを担いう る。 抗体の細胞内導入のための組成物は好ましくは抗体フラグメント、より好まし くはＶH又はＶL抗体フラグメントにシュードモナス外毒素を連結することにより 形成された融合タンパク質である。シュードモナス外毒素は好ましくはトランケ ーションされているが、しかし機能性転位ドメイン（ドメインII）を含むもので ある。 好適な態様において、抗体はPEのドメインII又はIIIに配置されている。ADPリ ボシル化活性を有するドメインIIIは、抗体結合作用のみが発揮されるよう、不 活性化されていなければならない（例えばトランケーション、外来ペプチド配列 の挿入、又はドメインの完全消失を介して）。 特に好適な態様において、重鎖又は軽鎖のいづれかの抗体可変性 ドメインはタンパク質分解式活性化を要しないトランケーションPEのドメインII 又はIIIに配置されているべきである。即ち、例えば、Ｂ１（ＶH）PE33又はPE35 /ｅ23（ＶH）KDELにおいて、ＶHインサートはタンパク質分解により除去されず 、PEのドメインII及びIIIと一緒に転位される。実施例 以下の実施例は本発明を例示するために提供するが、本発明を限定するもので はない。実施例１ Ｂ１（dsFv）−PE33の調製及び試験 モノクローナル抗体(MAb)Ｂ１は数多くの癌腫の表層上に豊富なルイスy（Ley ）及び近縁の炭水化物抗原に対して特異的なマウス抗体である（Pastanら、Canc er Res．51，3781-3787(1991)）。MAb Ｂ１は一本鎖及びジスルフィド安定化Fv 免疫毒素の双方を作成するために利用されている（Pastanら、Cancer Res．51， 3781-3787(1991)，Benhar，et al.，Prot．Eng.，７：1509-1515(1995)、及びBe nharら、Clin．Cancer．Res.，１：1023-1029(1995)）。これらの因子はヌード マウスにおいて樹立された外植片の完全な退縮を引き起こすことができる。 小さく、安定で、且つタンパク質分解プロセシングを要しない組換免疫毒素を 開発する目標を達成するため、PE37（細胞質ゾルに至る転位を受ける毒素部分の みを含むPEのトランケーション形態〔残基280〜613〕）のドメインＩｂ(アミノ 酸365〜394)をジスルフィド結合でＶLドメインに連結されたMAb Ｂ１のＶHフラ グメントと置換した（図１）。本明細書に例示の通り、得られる分子Ｂ１（dsFv ）−PE33は免疫毒素を含む任意の従来のMAb Ｂ１よりも活性で ある。Ａ）Ｂ１（dsFv）−PE33の発現のためのプラスミドの構築 現世代の組換免疫毒素よりも小さく、且つ活性化のための細胞内タンパク質分 解式切断を要しない活性組換免疫毒素を構築するため、抗体フラグメントＢ１（ dsFv）をシュードモナス外毒素のドメインII及びIIIの間に挿入した。これは細 胞質ゾルに至る転位を受ける毒素部分のみを含むPEのトランケーション形態であ るPE37のドメインＩｂをＢ１（dsFv）で置換することにより成し遂げられる。詳 しくは、Ｂ１（ＶH）R44CをPEのアミノ酸364の後に挿入し、そしてそのインサー トに小型のフレキシブルなペプチドリンカーGGGGSを先行させた。ＶHドメインに 別のペプチドKASGGPE（Ｃ３コネクター）が続き（Brinkmannら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，89：3075-3079(1992)）、ＶHのカルボキシル末端をシュードモナ ス外毒素のアミノ酸395に接続させている。 図１に示すように、ＶHドメインはPE37のアミノ酸365〜394を置換しており、 そしてＶLドメインはフレームワーク領域に導入されたジスルフィド結合により ＶHドメインと接続しており、それらのシステインはＶHの44位とＶLの105位に導 入されている（Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90：7538-7542（19 93））。 得られる組換免疫毒素Ｂ１（dsFv）−PE33はＢ１（dsFv）PE38又はＢ１（Fv） −PE38よりも５kDa小さい（図１）。毒素部分において、システイン287はセリン へと変わっており、不適正なジスルフィド結合形成の機会が抑えられている（Th euerら、J．Urol．149：1626-1632（1993））。 PEアミノ酸281-613（タンパク質分解式活性化を要しないPEのトランケーショ ン形態）の後続するメチオニンにおいて開始するPE37を コードするプラスミドpDF1、及び一本鎖ドメインＢ１（ＶH）R44C−PE38免疫毒 素をコードするpB1VHR44C−PE38の構築が発表されている（Theuerら、J．Biol． Chem．267：16872-16877(1992)，Benharら、Clin．Cancer Res．１：1023-1029 （1995)）。鋳型としてウラシル含有pDF1を使用するスティッキー・フィート(st icky-feet)依存性突然変異誘発（Clacksonら、Nucl．Acids Res．17：10163-101 70(1989)）を、分子内挿入化dsFv-免疫毒素の成分であるＢ１（ＶH）R44C−PE33 をコードする発現プラスミドを構築するために利用した。Ｂ１（ＶH）R44C DNA を鋳型としてのプラスミドpB1VHR44C−PE38及び５’リン酸化CT120を有するオリ ゴプライマーCT119を用いてPCR増幅させた。フォワードPCRプライマーCT119： 5'-GGCAACGACGAGGC CGGCGCGGCCAACGGCGGTGGCGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGA3’（Seq．ID No：１ ）はPE残基356-364をコードするDNAと同一の配列及びＶHの５’末端に挿入され たペプチドリンカーGGGGSをコードする配列を有し、そしてBamHＩ部位が設けら れている（下線）。リバースPCRオリゴヌクレオチドプライマーCT120：5'-GTCGC CGAGGAACTCCGCGCCAGTGGGCTCGGGACCTCCGGAAGCT T TTGC-3’（Seq．ID No：２）はPE残基395-403をコードするDNAに相補性である 配列及びＶHの３’末端に挿入されたFv毒素接合（コネクター）を有し、そしてH indIII部位が設けられている（下線）。 PCR生成物を精製し、そしてM13K07ヘルパーファージ（Bio-Rad）によるpDF1フ ァージミドの釣り出しにより調製したウラシル含有一本鎖DNAにアニーリングさ せた。このDNAをMVTA-GENE突然変異誘発キット(Bio-Rad)に従って伸長及びライ ゲーションさせた。一本鎖鋳型に対するPCRフラグメントのアニーリング効率及 び突然変異誘発効率は低いため（〜10％）、突然変異誘発反応に使用したDNA プールをＢ１（ＶH）ではなくドメインＩｂ領域内の固有部位を切断する制限エ ンドヌクレアーゼにより消化した。追加の消化工程は突然変異効率を50％以上は 高めた。 適正なクローンをDNA制限分析により同定し、そしてDNA配列決定により確認し た。得られる免疫毒素クローンをpB１（ＶH）R44C−PE33又はpCTK104と命名し、 それはＶHドメインがPE37のドメインＩｂ領域(アミノ酸365-394)を置換している 一本鎖ドメインＢ１（ＶH）免疫毒素をコードする。プラスミドpB1VL105C STOP は既に発表されているdsFv−免疫毒素（Benharら、Clin．Cancer Res.，１：102 3-1029（1995））の成分であるＢ１（ＶL）A105Cをコードする。Ｂ）組換免疫毒素の製造 ジスルフィド安定化免疫毒素Ｂ１（ＶH）R44C−PE38，Ｂ１（ＶH）R44C-PE33 ，Ｂ１（ＶL）A105C又は一本鎖免疫毒素Ｂ１（Fv）−PE38の成分を、対応の発現 プラスミドを有する個別のＥ．コリBL21（λDE３）（Studierら、J．Mol．Biol. ，189：113-130（1986））培養物の中に発現させた。組換タンパク質は全て封入 体の中に蓄積した。ジスルフィド安定化免疫毒素は本質的に発表された通り（Re iterら、Cancer Res.，54：2714-2718(1994)）当量の可溶化及び還元化封入体を 混合することにより得られるが、ただし最終酸化工程は省略し、そしてリフォル ディングをpH9.5において実施した。適正に折りたたまれたジスルフィド安定化 及び一本鎖免疫毒素を順列イオン交換（Ｑ−Sepharose及びMono Ｑ）、それに次 ぐTSK G3000 SW(Toso Haas)カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより精 製した。 得られるタンパク質は95％以上均質であり、そしてSDS−PAGEで59kDaの予測の 分子量を有していた。還元剤β−メルカプトエタノ ールの存在下で、dsFv−免疫毒素Ｂ１（dsFv）−PE33を２分子へと還元した：一 方はＢ１（VL105C）、そして他方はＢ１（ＶH）−PE33である。これらの成分の 見かけ上の分子量はそれぞれ13kDa及び46kDaである。一本鎖ドメインＢ１（ＶH ）−PE33免疫毒素も作成し、そして精製した。Ｂ１（dsFv）−PE33又はＢ１（ＶH ）−PE33の収率はいづれも封入体の中に存在するタンパク質の８〜10％であっ た。Ｃ）Ｂ１−抗原発現性細胞系に対するＢ１（dsFv）−PE33の細胞障害活性 Ｂ１（dsFv）−PE33の細胞障害能は免疫毒素による処理を経た様々なヒト癌細 胞系による（3Ｈ）−ロイシンの組込みの低下を測定することにより決定した（K uanら、J．Biol．Chem.，269：7610-7616(1994)）。Ｂ１（dsFv）−PE38及びＢ １（ＶH）−PE33（軽鎖なし）を比較のために含ませた。表１は３種のタンパク 質全てがＢ１抗原発現性細胞(例えばA431，MCF7，CRL 1739及びLNCap)に対して 細胞障害性であるが、MAb Ｂ１に結合しない細胞（例えばL929及びHUT102）に対 しては細胞障害性でないことを示す。 1.細胞障害性データーはIC50値で示し、ここでIC50は免疫毒素との20時間の インキュベーションを経てタンパク質合成の50％を阻害する免疫毒素の濃度であ る。 2.L929を除く細胞系は全てヒト起源である。 3.抗原のレベルは、強、中及び検出不能表示のそれぞれについて＋＋＋，＋ 及び−で示す。 4.未測定。 このアッセイにおいて、Ｂ１（dsFv）−PE33はA431細胞に対して0.25ng／mlの IC50、そしてMCF7細胞に対しては0.35ng／mlのIC50を有した。Ｂ１（dsFv）−PE 33はこの研究において、タンパク質分解式プロセシングを要するＢ１（dsFv）− PE38よりも全ての抗原陽性細胞系に対して活性が強かった。Ｂ１（dsFv）−PE33 の細胞障害能が特異的であるかどうかを分析するため、過剰量のMAb Ｂ１で競合 実験を実施した。 得られるデーターはＢ１（dsFv）−PE33によるA431癌腫細胞の中毒がＢ１抗原 に対する特異的な結合に基づくことを示し、なぜならその細胞障害能が過剰量の MAb Ｂ１によりブロックされたからである。軽鎖と結合していないＢ１（ＶH） −PE33も試験し、そしてＢ１（dsFv）−PE33よりも10分の１の細胞障害能（A431 細胞に対して２ng／mlのIC50）であることが示された（表１）、重鎖が抗原結合 に重大な役割を司っていることを示唆する。しかしながら、活性化のためにタン パク質分解式プロセシングを要する近縁一本鎖免疫毒素（Ｂ３（ＶH）−PE38） はA431細胞に対し、40ng／mlではるかに弱い活性であった（Brinkmannら、J．Im munol．150，2774-2782（1993））。Ｄ）Ｂ１（dsFv）−PE33の抗原結合性 Ｂ１（dsFv）−PE33の向上した細胞障害能が向上した結合能又はその他の要因 に基づくかを調べるため、抗原陽性細胞（例えばA431細胞）に対するＢ１（dsFv ）−PE33の抗原結合親和能を競合アッセイにより決定した。そのアッセイにおい ては、各免疫毒素の濃度を上昇させ、４℃にてA431細胞に対して（125Ｉ）−Ｂ １−IgGと結合を競合させた。Ｂ１，IgG，Ｂ１（dsFv）−PE38，Ｂ１（dsFv）− PE33及びＢ１（ＶH）−PE33は（125Ｉ）−Ｂ１−IgGと、A431細胞に対する結合 について、それぞれ40nM，２mM，3.5mM及び25mMにて50％競合した。即ち、Ｂ１ （dsFv）−PE33の結合親和能はＢ１（dsFv）−PE38よりも若干弱く、向上した細 胞障害能が向上した結合能に基づくのではなく、向上した細胞障害能を司るタン パク質分解式活性化の要件の排除にあることを示唆する。一本鎖ドメイン免疫毒 素Ｂ１（VH）−PE33はdsFv−免疫毒素に対して10分の１の結合親和力を示し、そ の細胞障害能の低下と一致した（表１）。Ｅ）Ｂ１（dsFv）−PE33の安定性 免疫毒素の熱的安定性はそれを100μｇ／mlにおいてPBSの中で37℃で２又は８ 時間インキュベーションし、次いでTSK G3000 SW(Toso Haas)カラムで分析クロ マトグラフィーにかけて大型凝集物から単量体を分離させることにより決定した （Reiterら、Protein Eng.，７：697-704(1994)）。免疫毒素の相対結合親和力 は様々な濃度の競合因子を有するトレーサーとして125Ｉ−ラベル化Ｂ１−IgGを 105個のA431細胞に添加することにより決定した。結合アッセイは４℃で２ｈ， １％の牛血清アルブミン及び50mMのMES（Sigma）を含むRPMIの中で発表されてい る通りに実施した（Batraら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89：5867-5871(1992 )）。 Ｂ１（dsFv）−PE33及びＢ１（dsFv）−PE38は共にPBS中で37℃にてインキュ ベーションする前は単量体であり、そして２又は８時 間単量体であり続けた。一方、一本鎖免疫毒素Ｂ１（Fv）PE38は37℃で８hrのイ ンキュベーション後に＞60％の凝集物を形成した（表２、及びClin．Cancer Res .，１：1023-1029（1995）を参照のこと）。37℃で８hrのインキュベーション後 、Ｂ１（dsFv）−PE33及びＢ１（dsFv）−PE38はインキュベーション前とほぼ同 じ初期細胞障害活性を保持し、一方Ｂ１（Fv）−PE38はその細胞障害能の75％を 失っていた。即ち、Ｂ１（dsFv）−PE38及びＢ１（dsFv）−PE33は37℃では極め て安定であり、おそらくはscFv免疫毒素のように変性及び凝集する傾向がないか らである。Ｆ）ヌードマウスにおける毒性及び抗腫瘍活性 単独投与マウスLD50を雌BALB−ｃマウス（生後６〜８週、〜20ｇ）を用いて決 定し、それには200μｌのPBS−HSAに希釈した様々な用量のＢ１（dsFv）PE38又 はＢ１（dsFv）PE33の一回のi.v.注射を与えた。マウスを注射後２週間にわたり 追跡した。無胸腺（Nu−Nu）マウス、雌６〜８生後週、体重20ｇを０日目に、FB SのないRPMI培地の中に懸濁した３×106個のA431細胞と皮下注射した。５日目に 、腫瘍はサイズが約50〜70mm3となった。マウスを５，７及び９日目にPBS−HSA の中に希釈した様々な用量の免疫毒素のi.v.注射により処置した。腫瘍はノギス で測定し、そして腫瘍容積は次式を利用して計算した：容積＝（長さ）×（幅）2 ×（0.4）。 双方の免疫毒素のLD50は0.5mg／kgであることがわかった。毒性はＢ１（Fv） −PE38及びその他の抗−LeyFv-免疫毒素について決定したLD50値と同じであった （Reiterら、Cancer Res.，54：2714-27(1994)）。それらの結果は、免疫毒素が タンパク質分解式活性化を要しないために標的細胞に対してより強い活性である にもかかわらず、それがマウスに対して毒性がそれほどないことを示した。マウ スにおけるこの毒性は肝臓による非特異的な取り込みに基づく ものと推定される（Keritmanら、Blood，83：426-434(1994)）。Ｇ）Ｂ１（dsFv）−PE33の向上した抗腫瘍活性 in vitroでの向上した細胞障害能に抗腫瘍活性の上昇が伴かどうかを調べるた め、Ｂ１（dsFv）−PE33及びＢ１（dsFv）−PE38をヌードマウスにおいて樹立さ れたヒト癌腫外植片の退縮を引き起こす能力を評価することにより比較した。ヌ ードマウスに０日目に３×106個のA431細胞を皮下的に与えた。５日後、腫瘍が 平均して50〜70mm3の容積となったら、マウスを５，７及び９日目に様々な用量 の免疫毒素により３回i.v.注射で処置した。コントロールマウスはPBS−HSAのみ で処理した。 図４に示すように、双方の免疫毒素は有意な用量依存性抗腫瘍活性を示した。 Ｂ１（dsFv）−PE38は6.5μｇ／kg（100pmole／kg）の用量レベルにおいてA431 腫瘍の部分退縮のみを引き起こし、一方Ｂ１（dsFv）−PE33は同じ100pmole／kg （６μｇ／kg）用量において腫瘍の完全消失を引き起こした（図４）。更に、20 0pmole／kg（13μｇ／kg）のＢ１（dsFv）−PE38で処理した腫瘍は３回の注射後 に完全に退縮したが、数回以内に再増殖し、一方200pmole／kgのＢ１（dsFv）− PE33は５匹の動物のうちの５匹に１ヶ月以上持続する完全退縮を引き起こした。 これらの結果はＢ１（dsFv）−PE33がＢ１（dsFv）−PE38よりも有意に優れた抗 腫瘍活性を有することを示唆した。それ故、向上したin vitro細胞障害能は動物 における向上した抗腫瘍活性と相同した。 Ｂ１（dsFv）−PE33及びＢ１（dsFv）−PE38は共にマウスにおいて同じ毒性を 有するため、PE33バージョンはより大きな治療的用途を有する。ヌードマウスに おいて完全な退縮を引き起こす有効量は2.5％のマウスLD50であった。これはＢ １（dsFv）−PE33を抗癌剤としての臨床開発のための良好な候補のものとする。 Ｂ１（dsFv） −PE38に勝るＢ１（dsFv）−PE33の向上した抗腫瘍活性はin vitroでのより良好 な細胞障害能の結果であり、タンパク質分解式活性化についての要件の不要さ及 びより良好な腫瘍浸透のためのサイズの小ささに基づく。タンパク質分解式活性 化の効率は様々なタイプの細胞において異なるため、この新たなタイプの組換免 疫毒素はタンパク質分解式活性化を要する先代の分子よりも有用であることが実 証されるであろう。 上記の実験において、Ｂ１dsFvフラグメントをPEの転位ドメイン及びADP−リ ボシル化ドメインの間に挿入し、ドメインＩｂと置換させた。事実、活性を失う ことなくドメインIIの一部(アミノ酸343-364)を欠失させることも可能である。 更に、コンピューターグラフィックを利用するＢ１（dsFv）PE33の提案構造の分 析はドメインＩｂ領域がdsFvフラグメントの挿入のための良好な位置であること を示し、なぜならCDRは未だ抗原と相互作用するのに自由であろうからである。 上記の実験の結果はこの領域内のＢ１（dsFv）の存在がA431細胞に対する抗原結 合能にわずかにしか影響しないことを示唆する。実施例２ PE35/ ｅ23（dsFv）KDELの調製及び試験 現世代の組換免疫毒素よりも小さく、且つ活性化のために細胞内タンパク質分 解式切断を要しない活性組換免疫毒素を構築するため、ｅ23（dsFv）抗体フラグ メントを、細胞質ゾルに至る転位を受ける毒素部分のみを含むPEのトランケーシ ョン形態であるPE35KDELのカルボキシル末端付近に挿入した（図２）。Ａ）プラスミドの構築 図３に示すプラスミドは全てイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラ ノシド−誘導性Ｔ７プロモーター発現系（Studier & Moffatt J．Mol．Biol．189，113-130（1986））を利用する。プラスミドpCT12 はPEの280位においてMetで始まり、そしてアミノ酸281〜364及び381〜607のタン パク質PE35/TGFαKDELをコードする（ここでPEのアミノ酸607と604との間に挿入 されたTGFαをコードする遺伝子がある）。ここでアミノ酸KDELはPEのカルボキ シル末端REDLK配列を置換している（Theuerら、J．Urol.，149：1626-1632(1993 )）。ｅ23（ＶHCys44）−PE38KDELをコードするプラスミドpYR3aはdsFv−免疫毒 素ｅ23（dsFv）−PE38KDELのＶH毒素成分についての発現プラスミドである（Rei terら、J．Biol．Chem.，269：18327-18331(1994)）。PE35/ｅ23（ＶHCys44）KD EL及びPE35/ｅ23（ＶHCys44）をコードするプラスミドpCTK101及びpCTK103はdsF v−免疫毒素PE/ｅ23（dsFv）KDELの毒素ＶH成分についての発現プラスミドであ る。これらはStuＩ−EcoRＩ消化PCRフラグメントをpCT12のStuＩ−EcoRＩ制限部 位にクローニングすることにより構築した。PCR反応は鋳型としての10ngのpYR39 及び100pmoleのプライマー５'-AAACCGAGGCCTTCCGGAGGTGGTGGATCCGAAGTGCAGCTGCA GGAGTCAGGA-3'（Seq．ID No：３）及び5'-TTAGCAGCCGAATTCTTAGAGCTCGTCTTTCGGC GGTTTGCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTG-3’（Seq．ID No：４）をPE35/ｅ23（ＶH Cys44）KDELのために又は５'−AAACCGAGGCCTTCCGGAGGTGGTGGATCCGAAGTGCAGCTGCA GGAGTCAGGA-3'（Seq．ID No：５）及び5'-GATCGCTCGGAATTCTTAGGAGACGGTGACCGTG GTCCCTGC-3'（Seq．ID No：６）をPE35/ｅ23(ＶHCys44)のために用いて実施した 。pCTK101によりコードされるタンパク質は、ｅ23（ＶHCys44）が、ペプチドリ ンカーSGGGGSの後続するPEの残基607と残基604〜608及びKDELとの間に導入され た一本鎖ドメイン免疫毒素である。pCTK103によりコードされるタンパク質はpCT K101コードタンパク質と同じだが、アミノ酸604〜608及びKDELが除かれ ている。 プラスミドpYR40はdsFv−免疫毒素のＶL成分ｅ23（ＶHCys99）をコードし（Re iterら、J．Biol．Chem．269，18327-18331（1994））、一方pCTK102はPEアミノ 酸604-608及びカルボキシル末端配列KDELに融合したｅ23（ＶHCys99）をコード する。このプラスミドはNdeＩ−EcoRＩ消化したPCR生成物をpYR40に見い出せるN eＩ−EcoRＩ制限部位の中にサブクローニングすることにより構築し、それは鋳 型としてpYR40、そしてＴ７プロモータープライマー及びプライマーとしての5'- TTAGCAGCCGAATTCTTAGAGCTCGTCTTTCGGCGGTTTGCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTG-3' （Seq．ID No：７）を利用する。ｅ23（Fv）のフレームワーク領域におけるシス テインの置換位置はＶHではAsn44→Gys、そしてＶLではGly99→Cysである（Reit erら、J．Biol．Chem．269：18327-18331（1994））。プラスミドは全てDNA配列 決定により確認した。 ＶLではなくＶHをPE35KDELのカルボキシル末端に挿入し、なぜならPE35/ｅ23 （VH）KDEL（ＶLに未付加）は可溶性が低く、そしてＶHに付加されていないPE35 /ｅ23（ＶL）KDELよりも沈殿し易いからである（Brinkmannら、J．Immunol.，15 0：2774-2782（1993）；ReiterらBiochem.，33：5451-5459（1994））。ジスル フィド結合はＶHの44位及びＶLの99位に導入されたシステイン間で形成される（ Reiterら、J．Biol．Chem．269：18327-18331（1994））。この毒素部分におい て、システイン287はセリンへと変わり、不適正なジスルフィド結合形成の機会 が抑制される（Theuerら、J.Urol.，149：1626-1632（1993）；図２）。ｅ23（ ＶHCys44）挿入のために選定された位置はPEのアミノ酸607の後であり、そして それに小型ペプチドリンカーSGGGGSが先行する。ＶHドメインの後方にはアミノ 酸604-608及びKDELがある（図１）。この分子、PE35/ ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）の模式図を図２及び３に示す。Ｂ）組換タンパク質の製造 ジスルフィド安定化免疫毒素PE35/ｅ23（ＶHCys44）KDEL、PE35/ｅ23(ＶHCys4 4 )，ｅ23(ＶHCys44）−PE38KDEL，ｅ23（ＶLCys99）及びｅ23（ＶLCys99）KDEL 又は一本鎖免疫毒素の成分を対応の発現プラスミドを有する個別のＥ．コリBL21 （IDE3）（Studier & Moffatt，J．Mol．Biol.，189：113-130（1986））培養物 の中で生成した（図３参照）。組換タンパク質は全て封入体の中に蓄積した。適 正に折りたたまれたジスルフィド安定化免疫毒素は当量の可溶化及び還元化封入 体を本質的に発表の通りに混合（Reiterら、Cancer Res.，54：2714-2718(1994) ）することにより得られるが、ただし最終酸化工程は省き、そしてリフォルディ ングはpH9.5で実施した。 図３に示すように、PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）はPE35−ｅ23（ＶHCys44）K DELとｅ23（ＶLCys99）とを混合することにより生成し；PE35/ｅ23/(dsFv)KDEL （II）はPE35−ｅ23（ＶHCys44）とｅ23（ＶLCys99）KDELとを混合することによ り生成し；PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（III）はPE35−ｅ23（ＶHCys44）KDELとｅ23 （ＶLCys99）KDELとを混合することにより生成し；PE35/ｅ23（dsFv）（IV）はP E35−ｅ23(ＶHCys44)とｅ23(ＶLCys99)とを混合することにより生成した。免疫 毒素は封入体をレドックス−シャッフリングバッファー内でリフォルディングす ることにより精製した。適正に折りたたまれたジスルフィド−安定化及び一本鎖 免疫毒素は順列イオン交換（Ｑ−Sepharose及びMono Ｑ）、それに次ぐTSKG3000 SW(Toso Haas)カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。 得られるタンパク質は95％を超える均質性であり、そしてSDS− PAGEで予測の分子量を有していた(60kDa)。還元剤ｂ−メルカプトエタノールの 存在下で、dsFv−免疫毒素PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）を２分子へと還元した ；一方はｅ23(ＶHCys99)であり、そして他方は一本鎖ドメイン毒素PE35/ｅ23(ＶH Cys44)KDELであった。これらの成分の見かけ上の分子量は、予測通り、それぞ れ13kDa及び47kDaであった。Ｃ）ｅ23−抗原発現性細胞系に対するPE35/ｅ23（dsFv）KDELの比細胞障害活性 PE35/ｅ23（dsFv）KDELの細胞障害能は既に発表の通り（Kuanら、J．Biol．Ch em.，269：7610-7616(1994)）0.2％のHSAを含むPBSの中の免疫毒素の系列希釈品 による処置を経た様々なヒト癌細胞系による〔3Ｈ〕−ロイシンの組込みの低下 の測定により決定した。ｅ23（scFv）−PE38KDEL及びｅ23（dsFv）−PE38KDELを 比較のために含ませた。表２は、免疫毒素PE35−ｅ23（dsFv）−KDEL（Ｉ）並び にその他の２つの対照分子ｅ23（scFv）−PE38KDEL及びｅ23（dsFv）−PE38KDEL の活性の比較が、これらの３種のタンパク質全てがerbB２を発現する細胞（例え ばＮ87N及びA431）に対して細胞障害性であるが、MAb ｅ23に結合しない細胞(例 えばHUT-102)に対しては結合しないことを示唆する（表２）。このアッセイにお いて、PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）はＮ87細胞に対して0.8ng／mlのIC50を有し た。その活性は２種のその他の分子よりも弱いが（ｅ23（scFv）−PE38KDELにつ いては0.5ng／mlのIC50、そしてｅ23（dsFv）−PE38KDELについては0.1ng／ml） 、それでも非常に活性であった。 1.細胞障害性データーはIC50値で示し、ここでIC50は免疫毒素との20時間の インキュベーションを経てタンパク質合成の50％を阻害する免疫毒素の濃度であ る。 2.抗原のレベルは、強、中及び検出不能表示のそれぞれについて＋＋＋，＋ 及び−で示す。Ｄ）免疫毒素PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）の向上した安定性 免疫毒素の熱安定性を、それらを100μｇ／mlでPBSの中で37℃で２又は８時間 インキュベーションし、次いでTSK G3000 SW(TosoHaas)カラムでの分析クロマト グラフィーにかけて単量体を二量体及びより大きな凝集物から分離させることに より決定した。PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）はPBSの中で37℃でインキュベーシ ョンする前は単量体であり、そして２又は８時間単量体であり続けた。一方、一 本鎖免疫毒素ｅ23（Fv）PE38KDELは37℃での８時間のインキュベーション後に30 ％の凝集物及び25％の二量体を形成した。37℃で８ｈの処理後、PE35/ｅ23（dsF v）KDEL（Ｉ）は処理前とほぼ同じ細胞障害活性を保ったが、ｅ23（Fv）PE38KDE LはＮ−87細胞に対して3.1ng／mlのIC50を有し、後者は処理前の細胞障害活性の 16％にすぎない。この結果は精製PE35/ｅ23（dsFv）KDELがｅ23（dsFv）−PE38K DEL（Reiterら、Protein Eng.，７：697-704(1994)）と同様に非常に安定であり 、且つ低い凝集傾向を有することを示唆す る。Ｅ）PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）の抗原結合分析 PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）の低下した細胞障害能の理由を調べるため、抗 原陽性細胞（例えばＮ87細胞）に対する抗原結合親和力を競合アッセイにより分 析した。そのアッセイにおいては存在する各免疫毒素の濃度を上げながら４℃に Ｎ87細胞に対する結合を〔125Ｉ〕−ｅ23−IgGと競合させた。ｅ23 IgG，ｅ23（ dsFv）−PE38KDEL及びPE35/ｅ23（dsFv）KDELはＮ87細胞に対する結合について 、〔125Ｉ〕−ｅ23 IgGと、4 nM，140nM及び500nMのそれぞれで50％競合した。 従って、PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）の結合親和能はＮ87細胞に対し、ｅ23（d sFv）−PE38KDELの４分の１であった。それ故、PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）の 弱い細胞障害能は弱い結合親和力に関係する。先に報告の通り、二価のｅ23 IgG は一価であるｅ23（dsFv）PE38KDELよりも高い見かけ上の親和力を有していた（ Reiterら、J．Biol．Chem.，269：18327-18331(1994)）。Ｆ）細胞障害能のためのKDELの位置の重要性 PE35/ｅ23（dsFv）KDEL（Ｉ）において、KDELは毒素成分と同じポリペプチド 鎖の上にある。KDEL配列はERへの免疫毒素の毒素成分の輸送を媒介するものと考 えられ、ERでKDEL配列は転位できうる。毒素のＣ末端上にKDEL配列を有するのが 重要であるか、又はジスルフィド結合によりＶHPE35に付加されたＶLのＣ末端に それを付加させることができうるかを調べるため、ＶH毒素の代わりにKDELをＶL 上に有する、ＶH毒素及びＶLの双方の上にKDELを有する、並びにKDELを有さない 分子を構築した（図２）。これらをPE35/ｅ23（dsFv）KDELII〜IVと称す（表３ 及び図２）。表２は標的細胞に基づくタンパク質合成を阻害するのに、組換毒素 は毒素成分と同一のポリペプチド上にKDELを有することが重要であることを示す 。KDEL がないと、毒性は失われる。KDELがＶLドメイン上にあっても、細胞障害能は失 われる。ＶH毒素に加えてのＶL上のKDELの存在は細胞障害活性を変えない。即ち 、KDEL配列は毒素と同じポリペプチド鎖上になくてはならない。 1.細胞障害性及び結合性アッセイはＮ−87細胞系で測定した。 2.125Ｉ−ｅ23 IgGの結合能の50％阻害を及ぼす競合体の濃度。Ｉ−IVの組 成は図２に示す。Ｇ）比結合親和力 免疫毒素の比結合親和力は様々な濃度の競合体を有するトレーサーとして125 Ｉ−ラベル化ｅ23 IgGを105個のＮ87細胞に加えることにより決定した。結合ア ッセイは１％の牛血清アルブミン及び50mMのMES（Sigma）を含むRPMIの中で４℃ で２ｈ記載の通り（Batraら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89：58678-5871(19 92)）実施した。表３は４種の分子間で結合親和力において非常に小さな差しか ないことを示す。従って、細胞障害能の差は毒素分子上のKDEL配列の位置に原因 しうる。実施例３ Ｂ３免疫毒素の細胞障害能及び結合能 モノクローナル抗体Ｂ３は前述の通り、数多くの癌腫の表層上に豊富なルイスy 及び近縁炭水化物抗原に対して特異的なマウス抗体 である。ルイスy抗原のより完全な詳細については実施例１を参照のこと。 癌細胞に対する結合親和能及び細胞障害作用を評価するため、アミノ末端のア ミノ酸１〜279の欠失したPEをＢ３重鎖又は軽鎖の可変領域を挿入することによ り改変した。この挿入はＩａドメインの中又はドメインIIIのカルボキシル末端 において上述の通りに施した。Ｂ３免疫毒素の模式図については図５を参照のこ と。Ａ）Ｂ３抗原発現性細胞系に対するＢ３免疫毒素の細胞障害活性 Ｂ３免疫毒素の細胞障害能は免疫毒素による処理を経たA431細胞による（3Ｈ ）−ロイシンの組込みの低下を測定することにより決定した（Kuanら、J．Biol ．Chem.，269：7610-7616(1994)）。Ｂ１免疫毒素の比較（表１参照）は、Ｂ３ 免疫毒素がＢ１構築体よりも細胞障害能が弱いことを示す。表４に示す通り、細 胞障害能の低下は低下した結合親和能にある程度基づくようである。Ｂ）Ｂ３免疫毒素の結合親和能 比結合親和能を決定するため、各免疫毒素を濃度を高めながら、１％の牛血清 アルブミン及び50mMのMESを含むRPMIの中で４℃で２時間かけてA431細胞に対す る結合について（125Ｉ）−Ｂ３−IgG(又は比較のためのＢ１−IgG)と記載の通 り（Batraら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89：58678（1992））にして競合さ せた。 実施例４ ｅ23免疫毒素の細胞障害能及び結合能 モノクローナル抗体ｅ23はerbB２に対して特異的なマウス抗体である。erbB２ 抗原及びｅ23−免疫毒素の調製のより完全な詳細については実施例２を参照のこ と。 癌細胞に対する結合親和能及び細胞障害作用を評価するため、アミノ末端の最 初の279個のアミノ酸の欠失したPEをｅ23重鎖又は軽 鎖の可変領域を挿入することにより改変した。この挿入はＩａドメインの中又は ドメインIIIのカルボキシル末端において上述の通りに施した。Ａ）癌細胞系に対するｅ23免疫毒素の細胞障害活性 ｅ23免疫毒素の細胞障害能は0.2％のHSAを含むPBS中の免疫毒素系列希釈品に よる処理を経たMCF7及びＮ−87細胞系による（3Ｈ）−ロイシンの組込みの低下 を測定することにより決定した（Kuanら、J．Biol．Chem.，269：7610-7616(199 4)）。結果を表６に示す。Ｂ）ｅ23免疫毒素の結合親和能 比結合親和能を決定するため、各免疫毒素を濃度を高めながら、１％の牛血清 アルブミン及び50mMのMESを含むRPMIの中で４℃で２時間かけてMCF7及びＮ−87 細胞に対する結合について（125Ｉ）−ｅ23−IgGと記載の通り（Batraら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，89：58678（1992））にして競合させた。その結果を 表６に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．標的細胞に対して結合する免疫毒素であって、Fv抗体フラグメントの可変 重（ＶH）鎖フレームワーク領域に付加された細胞障害活性のためにタンパク質 分解式活性化を要しないシュードモナス外毒素（PE）を含んで成り、ここで前記 可変重鎖領域は少なくとも一本のジスルフィド結合を介して可変軽（ＶL）鎖フ レームワーク領域に結合しており、そして更にここで前記シュードモナス外毒素 は１〜279番目の残基を欠失しているものであり、そしてＶL鎖フレームワーク領 域に対するジスルフィド結合抜きでFv抗体フラグメントのＶH鎖フレームワーク 領域に付加されているPEを含んで成る免疫毒素よりも前記標的細胞に対して細胞 障害能が10倍以上強いものである、前記免疫毒素。 ２．前記可変重鎖領域が実質的に前記シュードモナス外毒素のドメインＩｂを 置換している、請求項１記載の免疫毒素。 ３．前記可変重鎖領域が前記シュードモナス外毒素のカルボキシル末端内に位 置している、請求項１記載の免疫毒素。 ４．前記重鎖領域のアミノ末端がペプチドリンカーを介して前記PEに付加され ている、請求項１記載の免疫毒素。 ５．前記ペプチドリンカーがSGGGGSである、請求項４記載の免疫毒素。 ６．前記重鎖領域のカルボキシル末端が前記PEにペプチドリンカーを介して付 加されている、請求項１記載の免疫毒素。 ７．前記ペプチドリンカーがKASGGPEである、請求項６記載の免疫毒素。 ８．前記Fv抗体フラグメントがＢ１及びｅ23より成る群から選ばれる抗体のフ ラグメントを含んで成る、請求項１記載の免疫毒素。 ９．カルボキシル末端配列KDELを有する、請求項１記載の免疫毒素。 10．前記免疫毒素がPE35/ｅ23（dsFv）KDELである、請求項１記載の免疫毒素 。 11．前記免疫毒素がＢ１（dsFv）PE33である、請求項１記載の免疫毒素。 12．前記免疫毒素が37℃で２時間のインキュベーションを経た後に単量体であ り続ける、請求項１記載の免疫毒素。 13．前記免疫毒素が37℃で８時間のインキュベーションを経た後に単量体であ り続ける、請求項１記載の免疫毒素。 14．前記免疫毒素が、同一の抗体フラグメントを含んで成り、且つ細胞障害性 となるのにタンパク質分解式活性化を要する免疫毒素と比べて腫瘍退縮において 実質的な向上を示す、請求項１記載の免疫毒素。 15．標的細胞に対して結合する免疫毒素であって、Fv抗体フラグメントの可変 軽（ＶL）鎖フレームワーク領域に付加された細胞障害活性のためにタンパク質 分解式活性化を要しないシュードモナス外毒素（PE）を含んで成り、ここで前記 可変軽鎖領域は少なくとも一本のジスルフィド結合を介して可変重（ＶH）鎖フ レームワーク領域に結合しており、そして更にここで前記シュードモナス外毒素 は１〜279番目の残基を欠失しているものであり、そしてＶH鎖フレームワーク領 域に対するジスルフィド結合抜きでFv抗体フラグメントのＶL鎖フレームワーク 領域に付加されているPEを含んで成る免疫毒素よりも前記標的細胞に対して細胞 障害能が10倍以上強いものである、前記免疫毒素。 16．前記可変軽鎖領域が実質的に前記シュードモナス外毒素のドメインＩｂを 置換している、請求項15記載の免疫毒素。 17．前記可変軽鎖領域が前記シュードモナス外毒素のカルボキシル末端内に位 置している、請求項15記載の免疫毒素。 18．前記軽鎖領域のアミノ末端がペプチドリンカーを介して前記PEに付加され ている、請求項15記載の免疫毒素。 19．前記ペプチドリンカーがSGGGGSである、請求項18記載の免疫毒素。 20．前記軽鎖領域のカルボキシル末端が前記PEにペプチドリンカーを介して付 加されている、請求項15記載の免疫毒素。 21．前記ペプチドリンカーがKASGGPEである、請求項20記載の免疫毒素。 22．前記Fv抗体フラグメントがＢ１及びｅ23より成る群から選ばれる抗体のフ ラグメントを含んで成る、請求項15記載の免疫毒素。 23．カルボキシル末端配列KDELを有する、請求項15記載の免疫毒素。 24．細胞障害活性のためにタンパク質分解式活性化を要しないシュードモナス 外毒素に付加されたFv抗体フラグメントの重鎖可変領域を含んで成る標的細胞に 対して結合する免疫毒素をコードする核酸であって、前記重鎖可変フレームワー ク領域はFvフラグメントの可変軽鎖フレームワーク領域とのジスルフィド連結を 形成する複数のシステイン残基を含み、ここで前記抗体フラグメントはＢ１及び ｅ23より成る群から選ばれる抗体の可変軽鎖又は可変重鎖を含んで成り、ここで 前記シュードモナス外毒素は１〜279番目の残基を欠いており、そしてここで前 記免疫毒素はＶL鎖フレームワーク領域に対するジスルフィド結合抜きでFv抗体 フラグメントのＶH鎖フレームワーク領域に付加されているPEを含んで成る免疫 毒素よりも前記標的細胞に対して細胞障害能が10倍以上強いものである、前記核 酸。 25．前記重鎖可変領域が前記シュードモナス外毒素のドメインＩｂを置換して いる、請求項24記載の核酸。 26．前記重鎖可変領域が前記シュードモナス外毒素の607番目の残基の後に位 置している、請求項24記載の核酸。 27．細胞障害活性のためにタンパク質分解式活性化を要しないシュードモナス 外毒素に付加されたFv抗体フラグメントの軽鎖可変領域を含んで成る標的細胞に 対して結合する免疫毒素をコードする核酸であって、前記軽鎖可変フレームワー ク領域はFvフラグメントの可変重鎖フレームワーク領域とのジスルフィド連結を 形成する複数のシステイン残基を含み、ここで前記抗体フラグメントはＢ１及び ｅ23より成る群から選ばれる抗体の可変軽鎖又は可変重鎖を含んで成り、ここで 前記シュードモナス外毒素は１〜279番目の残基を欠いており、そしてここで前 記免疫毒素はＶH鎖フレームワーク領域に対するジスルフィド結合抜きでFv抗体 フラグメントのＶL鎖フレームワーク領域に付加されているPEを含んで成る免疫 毒素よりも前記標的細胞に対して細胞障害能が10倍以上強いものである、前記核 酸。 28．前記軽鎖可変領域が前記シュードモナス外毒素のドメインＩｂを置換して いる、請求項27記載の核酸。 29．前記軽鎖可変領域が前記シュードモナス外毒素の607番目の残基の後に位 置している、請求項27記載の核酸。 30．一本鎖免疫毒素融合タンパク質であって、可変軽（ＶL）鎖又は可変重（ ＶH）鎖領域の双方ではなくいづれかに付加された細胞障害活性のためにタンパ ク質分解式活性化を要しないシュードモナス外毒素（PE）を含んで成り、そして ここで前記シュードモナス外毒素が１〜279番目の残基を欠いている、前記一本 鎖免疫毒素融合タンパク質。 31．前記可変重鎖又は可変軽鎖領域が実質的に前記シュードモナス外毒素のド メインＩｂを置換している、請求項30記載の免疫毒素。 32．前記可変重鎖又は可変軽鎖領域が前記シュードモナス外毒素のカルボキシ ル末端内に位置している、請求項30記載の免疫毒素。 33．前記可変重鎖又は可変軽鎖領域のアミノ末端がペプチドリンカーを介して 前記PEに付加されている、請求項30記載の免疫毒素。 34．前記ペプチドリンカーがSGGGGSである、請求項33記載の免疫毒素。 35．前記可変重鎖又は可変軽鎖領域のカルボキシル末端が前記PEにペプチドリ ンカーを介して付加されている、請求項30記載の免疫毒素。 36．前記ペプチドリンカーがKASGGPEである、請求項35記載の免疫毒素。 37．前記Fv抗体フラグメントがＢ１，Ｂ３，Ｂ５，ｅ23，BR96，抗−Tac，RFB ４及びHB21より成る群から選ばれる抗体のフラグメントを含んで成る、請求項30 記載の免疫毒素。 38．カルボキシル末端配列KDELを有する、請求項30記載の免疫毒素。 39．特徴的なマーカーを有する細胞を死に致らしめる方法であって、可変重鎖 領域が少なくとも一本のジスルフィド結合を介して可変軽鎖領域に、双方の抗体 フラグメントのフレームワーク領域において結合しているFv抗体フラグメントに 付加された細胞障害活性のためにタンパク質分解式活性化を要しないシュードモ ナス外毒素（PE）を含んで成る免疫毒素と前記細胞を接触させることを含んで成 る、前記方法。 40．薬理学的に許容される賦形剤中の有効量の免疫毒素を含んで 成る薬理組成物であって、前記免疫毒素が、可変重鎖領域が少なくとも一本のジ スルフィド結合を介して可変軽鎖領域に、双方の抗体フラグメントのフレームワ ーク領域において結合しているFv抗体フラグメントに付加された細胞障害活性の ためにタンパク質分解式活性化を要しないシュードモナス外毒素（PE）を含んで 成る、前記薬理組成物。 41．細胞の細胞質ゾルに抗体を輸送する方法であって、前記細胞の細胞質ゾル に至る転位のためにタンパク質分解式切断を要しないシュードモナス外毒素に付 加された前記抗体を含んで成るキメラ分子に前記細胞を接触させることを含んで 成る方法。
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