PT2298815E - Moléculas de ligaçao especificas para cd37 e especificas para cd20 - Google Patents

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Sandy Alexander Simon
Jeffrey A Ledbetter
Martha Susan Hayden-Ledbetter
Laura Sue Grosmaire
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Description

DESCRIÇÃO REDUÇÃO DE CÉLULAS B COM O USO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇAO ESPECIFICAS PARA CD37 E ESPECIFICAS PARA CD20
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção geralmente proporciona composições para utilização em métodos métodos para a redução de células B num indivíduo usando moléculas de ligação específicas CD37. Em particular, a invenção proporciona composições para o uso em métodos para a redução de células B usando unicamente moléculas de ligação específicas CD37 ou uma combinação de moléculas de ligação específicas CD37 e moléculas de ligação específicas CD20, nalguns casos, uma combinação sinérgica. A invenção proporciona ainda composições para o uso em métodos para o tratamento de doenças envolvendo a atividade aberrante de células B.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
No seu papel normal, o Sistema imunológico humano protege o corpo de danos decorrentes de substâncias estranhas e patógenos. Uma forma pela qual o sistema imunológico protege o corpo é por produção de células especializadas denominadas linfócitos B ou células B. As células B produzem anticorpos que se ligam e, em alguns casos, medeiam a destruição de uma substância estranha ou patógeno.
No entanto, em alguns casos, há uma alteração do sistema imunológico humano, e especificamente dos linfócitos B do sistema imunológico humano, e surge uma doença. Há vários cancros que envolvem a proliferação descontrolada de células B. Também há várias doenças autoimunes que envolvem a produção por células B de anticorpos que, em vez de se ligarem às substâncias estranhas e aos patógenos, ligam-se a partes do corpo. Tais anticorpos são algumas vezes denominados auto-anticorpos. Além disso, há várias doenças autoimunes e inflamatórias que envolvem células B em sua patologia, por exemplo, através da apresentação inadequada de antigeno de célula B às células T, ou através de outras vias que envolvem células B. Por exemplo, camundongos com tendência autoimune deficientes em células B não desenvolvem doença renal autoimune, vasculite ou auto-anticorpos. Veja Shlomchik e cols., J. Exp. Med., 180: 1.295-306 (1994). Curiosamente, esses mesmos camundongos com tendência autoimune que possuem células B, mas são deficientes na produção de imunoglobulinas, desenvolvem doenças autoimunes quando induzidos experimentalmente, como descrito por Chan e cols., J. Exp. Med., 189: 1.639-48 ( 1999), o que indica que as células B têm uma participação integral no desenvolvimento de doença autoimune.
As células B podem ser identificadas por moléculas na sua superfície celular. CD20 foi a primeira molécula de superfície especifica para a linhagem de célula B humana identificada por um anticorpo monoclonal. Ela é uma fosfoproteina transmembrana de célula B não glicosilada hidrofóbica de 35 kDa que tem tanto a sua extremidade amino 3 0 quanto a extremidade carbóxi situadas dentro da célula. Veja Einfeld e cols., EMBO J., 7:711-17(1998). CD20 é expressa por todas as células B maduras normais, mas não é expressa por células B precursoras ou células plasmáticas. Não foram identificados ligantes naturais para CD20, e a função de CD20 na biologia das células B ainda não é completamente compreendida.
Outra molécula da superfície celular especifica para a linhagem de células B é CD37. CD37 é uma proteína altamente glicosilada de 40-52 kDa que pertence à família de tetraspanina transmembrana de antigenos da superfície celular. Ela atravessa a membrana celular quatro vezes, formando duas alças extracelulares e expondo suas extremidades amino e carbóxi ao citoplasma. CD37 é altamente expressa em (slg+) células B normais produtoras de anticorpo, mas não é expressa em pré-células B ou em células plasmáticas. A expressão de CD3 7 em células T em repouso e ativadas, monócitos e granulócitos, é baixa, e não há expressão detetável de CD3 7 em células NK (natural killer), plaquetas ou eritrócitos. Veja Belov e cols., Cancer Res., 61(11): 4.483-4.489 (2001); Schwartz-Albiez e cols., J.
Immunol., 140 (3) : 905-914 (1988); e Link e cols., J.
Immunol., 137(9): 3.013-3.018 (1988). Além das células B normais, quase todas as malignidades originadas de células B são positivas para expressão de CD37, incluindo leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL) e leucemia de células pilosas [Moore e cols., Journal of Pathology, 152: 13-21 (1987); Merson e Brochier, Immunology
Letters, 19: 269-272 (1988); e Faure e cols., American
Journal of Dermatopathology, 12 (3) : 122-133 (1990) ] . CD37 participa da regulação da função das células B, uma vez que foi constatado que camundongos desprovidos de CD37 possuem níveis baixos de IgGl sérica e têm deficiência da resposta humoral a antigenos virais e a antigenos modelares. Parece que ela atua como uma molécula co-estimuladora não clássica ou influencia diretamente a apresentação de antigeno por meio da formação de complexo com moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) da classe II. Veja Knobeloch e cols., Mol. Cell. Biol., 20 (15) : 5.363-5.369 (2000) . Parece que CD37 também participa da sinalização TCR. Veja Van Spriel e cols., J. Immunol., 172: 2.953-2.961 (2004).
Houve pesquisas e desenvolvimento de fármacos com base no conceito de que as próprias moléculas da superfície celular especificas para a linhaqem de células B, por exemplo, CD37 ou CD20, podem ser alvos para anticorpos que se ligariam e mediariam a destruição de células B cancerosas e causadoras de doença autoimune que possuem CD37 ou CD20 nas suas superficies. Na denominada "imunoterapia", anticorpos feitos (ou com base em anticorpos feitos) num animal não humano que se ligam a CD37 ou CD20 são administrados a um paciente para eliminar células B cancerosas ou causadoras de doença autoimune.
Um anticorpo para CD3 7 foi marcado com 131I e testado em testes clínicos para terapia de linfoma não Hodgkin (NHL). Veja Press e cols., J. Clin. Oncol., 7(3): 1.027-1.038 (1989); Bernstein e cols., Cancer Res. (Supl.), 50:1.017-1.021 (1990); Press e cols., Front. Radiat. Ther. Oncol., 24: 204-213 (1990); Press e cols., Adv. Exp. Med. Biol., 303: 91-96 ( 1991) e Brown e cols., Nucl. Med. Biol., 24: 657-663 (1997) . O anticorpo, MB-1, é um anticorpo monoclonal murideo IgGl desprovido de funções efetoras de Fc, por exemplo, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), e MB-1 não inibiu o crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto in vivo, a menos que tenha sido marcado com um isótopo (Buchsbaum e cols., Cancer Res., 52(83): 6.476-6.481 (1992)). A biodistribuição favorável de 131I-MB-1 foi observada em pacientes com linfoma que tinham cargas tumorais menores (<1 kg), e a terapia desses pacientes resultou em remissões completas do tumor que duram de 4 a 11 meses (Press e cols., 1989 e Bernstein e cols. 1990).
Além disso, um imunoconjugado composto pelo fármaco adriamicina ligado a G28-1, outro anticorpo anti-CD37, foi avaliado em camundongos e mostrou efeitos através de internalização e liberação intracelular do fármaco. Veja Braslawsky e cols., Cancer Immunol. Iwmunother., 33(6): 367- 374 (1991). Vários grupos investigaram o uso de anticorpos anti- CD20 para o tratamento de doenças relacionadas às células B. Um tratamento consiste em anticorpos anti-CD20 preparados na forma de radionuclideos para o tratamento de linfoma de células B (por exemplo, anticorpo anti-CD20 marcado com 131I), além de uma forma marcada com 89Sr para a atenuação de dor óssea causada por metástases de cancro de próstata e mama [Endo, Gan To Kagaku Ryoho, 26: 744-748 (1999)].
Outro grupo desenvolveu um anticorpo monoclonal quimérico especifico para CD20, que consiste em regiões variáveis de cadeia pesada e leve originárias de camundongos fundidas às regiões constantes da cadeia pesada de IgGl humana e da cadeia leve kappa humana. De acordo com o relatado, o anticorpo quimérico reteve a habilidade para se ligar a CD20 e a habilidade para mediar ADCC e para fixar complemento. Veja Liu e cols., J. Immunol. 139: 3.521-26 (1987). Ainda outro anticorpo quimérico anti-CD20 foi feito a partir de IDEC hibridoma C2B8, e foi denominado rituximab. Acredita-se que o mecanismo da atividade anti-tumoral de rituximab seja uma combinação de várias atividades, incluindo ADCC, fixação de complemento e desencadeamento de sinais que promovem apoptose em células B malignas, embora o grande tamanho do anticorpo quimérico impeça a difusão ótima da molécula em tecidos linfóides que contêm células B malignas limitando, dessa forma, suas atividades anti-tumorais. ADCC é uma reação mediada por células na qual células citotóxicas inespecificas que expressam recetores Fc (FcRs) (por exemplo, células Natural Killer (NK) , neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado em uma célula-alvo e, subsequentemente, causam a lise da célula-alvo. A fixação de complemento, ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), é a habilidade de uma molécula para efetuar a lise de um alvo na presença de complemento. A via de ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (Clq) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) em complexo com um antigeno cognato. 0 grande tamanho de rituximab impede a difusão ótima da molécula em tecidos linfóides que contêm células B malignas, limitando, dessa forma, essas atividades anti-tumorais.
Rituximab, administrado tipicamente em infusões 4 vezes por semana, é usado atualmente para tratar linfoma não Hodgkin de célula B de grau baixo ou folicular [McLaughlin e cols., Oncology, 12: 1.763-1.777 (1998); Leget e cols., Curr. Opin. Oncol.,10: 548-551 (1998)] e no linfoma folicular recidivado de estágio III/IV [White e cols., Pharm. Sei. Technol. Today, 2: 95-101 (1999)]. Outros distúrbios tratáveis com rituximab incluem linfoma de célula do centro folicular (FCC), linfoma de célula do manto (MCL), linfoma difuso de célula grande (DLCL) e linfoma linfocitico pequeno (SLL) [Nguyen e cols., Eur. J. Haematol., 62:76-82 (1999)]. Rituximab administrado em infusões semanais também é usado para tratar CLL [Lin e cols., Sem. Oncol., 30:483-92 (2003)].
Anticorpos anti-CD20 também foram usados para tratar pacientes que sofrem de doenças autoimunes associadas à produção de auto-anticorpos por células B. Por exemplo, rituximab demonstrou benefícios clínicos significativos na eliminação de células B CD20+ em pacientes com múltiplas doenças autoimunes/inflamatórias, incluindo Artrite reumatoide (AR) [Edwards, N. Engl. J. Med., 350: 2.546-2.548 (2004); Cambridge e cols., Arthritis Rheum., 48: 2.146-54 (2003)]. Os pacientes com AR receberam doses contínuas de metotrexato (MTX) e um esquema de 4 doses de infusão de rituximab (Edwards, supra). Esses pacientes apresentaram melhora das respostas da "American College of Rheumatology" (ACR) comparados com grupos de controlo.
Num ensaio para o tratamento de lúpus eritematoso sistémico (LES) [Leandro e cols., Arthritis Rheum., 46: 2.673-2.677 (2002)], os pacientes receberam a administração de duas infusões de rituximab em alta dose, e demonstraram redução de células B e melhora do estado da doença. Em um segundo estudo de redução de células B no LES [Looney e cols., Arthritis Rheum., 50: 2.580-2.589 (2004)], os pacientes receberam uma infusão única de 100 mg/m2 (dose baixa), uma infusão única de 375 mg/m2 (dose intermediária) ou como 4 infusões (com intervalo de 1 semana) de 375 mg/m2 (dose alta) de rituximab. Esses pacientes demonstraram redução de células B e melhora das pontuações da doença, mas o tratamento não alterou o nível de auto-anticorpos. Também foram realizados ensaios de rituximab na macroglobulinemia de Waldenstrom [Treon e cols., Immunother., 24: 272-279 (2000)],nos quais os pacientes apresentaram aumento do hematócrito (HCT) e das contagens de plaquetas (PLT) após 4 infusões de rituximab.
Relatos recentes de tratamento com rituximab em pacientes que sofrem de esclerose múltipla, uma doença autoimune que afeta o sistema nervoso central, indicam que um esquema de tratamento elimina células B periféricas, mas tem pouco efeito sobre células B em líquido cefalorraquidiano. Veja Monson e cols., Arch. Neurol., 62: 258-264 (2005).
Publicações adicionais em relação ao uso de rituximab incluem: Stashi e cols. "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98: 952-957 (2001); Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7, Abril de 2001) ; Leandro e cols. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann. Rheum. Dis. 61: 833-888 (2002); Leandro e cols. "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response". Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro e cols. "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis Rheum. 46: 2.673- 2.677 (2002); Edwards e cols., "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40: 205-211 (2001); Edwards e cols. "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 30(4): 824-828 (2002); Edwards e cols. "Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis". Arthritis Rheum. 46: S197 (2002);
Levine e cols., "IgM antibody-related pol ineuropathies: 13-cell depletion chemotherapy using rituximab" Neurology 52: 1.701-1.704 (1999); DeVita e cols. "Efficacy of selective 13-cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis Rheum. 46: 2.029-2.033 (2002); Hidashida et al. "Tratamento of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab", apresentado no "Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology"; 24-29 de outubro; Nova Orleans, La. 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab", apresentado no "Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology"; 24-29 de Outubro, New Orleans, La. 2002 .
Ainda persistem problemas associados à terapia com rituximab. Por exemplo, a maioria dos pacientes com cancro tratados com rituximab apresenta recidiva, geralmente em até cerca de 6-12 meses, e foram relatadas reações fatais à infusão em até 24 horas após a infusão de rituximab. Essas reações fatais ocorreram após uma reação à infusão complexa que incluía hipoxia, infiltrados pulmonares, síndrome do sofrimento respiratório agudo, infarto do miocárdio, fibrilação ventricular, ou choque cardiogênico. A insuficiência renal aguda com necessidade de diálise com casos de resultados fatais também foi relatada no quadro de síndrome de lise tumoral após o tratamento com rituximab, bem como reações mucocutâneas graves, algumas com resultados fatais. Adicionalmente, são necessárias doses altas de rituximab para a injeção intravenosa, pois a molécula é grande, de aproximadamente 150 kDa, e, como observado acima, a difusão nos tecidos linfoides, onde residem muitas células tumorais reside, é limitada.
Como as células B maduras normais também expressam CD37 e CD20, as células B normais são eliminadas pela terapia com anticorpo anti-CD37 (Press e cols., 1989) ou anti-CD20 [Reff e cols., Blood, 83: 435-445 (1994)]. Após o término do tratamento, no entanto, as células B normais podem ser regeneradas a partir de precursores de células B CD37- e CD2O-negativos; portanto, os pacientes tratados com terapia anti-CD37 ou anti-CD20 não apresentam imunossupressão significativa. A tecnologia de anticorpo monoclonal e métodos de engenharia genética levaram ao desenvolvimento de moléculas de imunoglobulina para diagnóstico e tratamento de doenças humanas. Foi feita a criação de proteínas por engenharia genética para aumentar a afinidade de um anticorpo por seu antígeno cognato, para reduzir os problemas relacionados à imunogenicidade, e para alterar as funções efetoras de um anticorpo. A estrutura do domínio de imunoglobulinas é passível de ser submetida à engenharia genética, uma vez que os domínios de ligação de antígeno e os domínios que conferem funções efetoras podem ser trocados entre classes e subclasses de imunoglobulinas. A estrutura e a função das imunoglobulinas são revisadas, por exemplo, em Harlow e cols., Eds., "Antibodies: A Laboratory Manual", Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988). Uma introdução extensa, além de informações detalhadas sobre todos os aspetos da tecnologia de anticorpo recombinante, podem ser encontradas no livro- texto "Recombinant Antibodies" (John Wiley & Sons, NY, 1999). Uma coleção abrangente de protocolos de laboratório detalhados sobre o projeto de anticorpos por engenharia genética pode ser encontrada em R. Kontermann e S. Dubel (eds. ) , "The Antibody Engineering Lab Manual" (Springer Verlag, Heidelberg/Nova York, 2000) .
Recentemente, foram construídas moléculas menores de imunoglobulina para superar problemas associados à terapia com imunoglobulina inteira. Fv de cadeia única (scFv) compreende um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo unido através de um peptídeo vinculador curto a um domínio variável da cadeia leve de anticorpo [Huston e COls., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 5.879-5.883 (1988)]. Além de regiões variáveis, cada uma das cadeias do anticorpo tem uma ou mais regiões constantes. Cadeias leves possuem um único domínio da região constante. Dessa forma, cadeias leves possuem uma região variável e uma região constante. Cadeias pesadas possuem vários domínios da região constante. As cadeias pesadas nos anticorpos IgG, IgA e IgD possuem três domínios da região constante, gue são designados CHI, CH2 e CH3, e as cadeias pesadas nos anticorpos IgM e IgE possuem guatro domínios da região constante, CHI, CH2, CH3 e CH4. Dessa forma, as cadeias pesadas possuem uma região variável e três ou guatro regiões constantes.
As cadeias pesadas de imunoglobulinas também podem ser divididas em três regiões funcionais: a região Fd (um fragmento que compreende V.sub.H e CHI, ou seja, os dois domínios do terminal N da cadeia pesada), a região de dobradiça, e a região Fc (a região do "fragmento cristalizável", derivada de regiões constantes e formada após digestão com pepsina). A região Fd em combinação com a cadeia leve forma um Fab (o "fragmento de ligação de antígeno"). Como um antígeno reagirá estereoquimicamente com a região de ligação de antígeno no terminal amino de cada Fab, a molécula de IgG é divalente, ou seja, ela pode se ligar a duas moléculas de antígeno. Fc contém os domínios que interagem com recetores de imunoglobulina nas células e com os elementos iniciais da cascata do complemento. Dessa forma, o fragmento Fc é geralmente considerado responsável pelas funções efetoras de uma imunoglobulina, por exemplo, fixação de complemento e ligação aos recetores Fc.
Por causa do pequeno tamanho das moléculas de scFv, elas exibem uma depuração muito rápida do plasma e dos tecidos, e uma penetração mais eficaz em tecidos do que a imunoglobulina inteira. Um scFv anti-tumoral mostrou penetração tumoral mais rápida e uma distribuição mais equilibrada pela massa tumoral do que o anticorpo quimérico correspondente [Yokota e cols., Cancer Res., 52, 3.402-3.408 ( 1992)]. A fusão de um scFv com outra molécula, por exemplo, uma toxina, se beneficia da atividade específica de ligação de antígeno e do pequeno tamanho de um scFv para liberar a toxina a um tecido-alvo. [Chaudary e cols., Nature, 339: 394 (1989); Batra e cols., Mol. Cell. Biol., 11: 2.200 (1991)].
Apesar das vantagens das moléculas de scFv, há várias desvantagens associadas ã sua utilização. Embora a depuração rápida de scFv possa reduzir seus efeitos tóxicos em células normais, essa depuração rápida pode impedir a liberação de uma dose eficaz mínima ao tecido-alvo. A fabricação de quantidades adequadas de scFv para administração a pacientes foi desafiadora, em função das dificuldades na expressão e isolamento de scFv que afetam de forma adversa o rendimento. Durante a expressão, as moléculas de scFv não possuem estabilidade e frequentemente se agregam por causa do
pareamento de regiões variáveis de moléculas diferentes. Além disso, os niveis de produção de moléculas de scFv em sistemas de expressão mamíferos são baixos, limitando o potencial para a fabricação eficiente de moléculas de scFv para terapia [Davis e cols., J. Biol. Chem., 265: 10.410-10.418 (1990); Traunecker e cols., EMBO J., 10: 3.655-3.659 (1991)]. Foram exploradas estratégias para aumento da produção, incluindo a adição de sítios de glicosilação nas regiões variáveis [Jost, C. R. Patente U.S. N° 5.888.773, Jost e cols., J. Biol. Chem., 69: 26.267-26.273 (1994)].
Outra desvantagem do uso de scFv para terapia é a ausência de função efetora. Um scFv sem as funções citoliticas, ADCC e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) associadas à região constante de uma imunoglobulina pode ser ineficaz para o tratamento de doença. Muito embora o desenvolvimento da tecnologia de scFv tenha começado há mais de 12 anos, atualmente não há produtos de scFv aprovados para terapia.
Alternativamente, foi proposto que a fusão de um scFv a outra molécula, por exemplo, uma toxina, poderia se beneficiar da atividade específica de ligação de antígeno e do pequeno tamanho de um scFv para liberar a toxina a um tecido-alvo. Chaudary e cols., Nature 339: 394 (1989); Batra e cols., Mol. Cell. Biol. 11: 2.200 (1991) . A conjugação ou fusão de toxinas a scFvs foi, desse modo, oferecida como uma estratégia alternativa para fornecer moléculas potentes, com especificidade de antígeno, mas a dosagem com tais conjugados ou quimeras pode ser limitada por toxicidade excessiva e/ou inespecífica em função da porção de toxina de tais preparações. Os efeitos tóxicos podem incluir elevação suprafisiológica das enzimas hepáticas e síndrome de vazamento vascular, e outros efeitos indesejados. Além disso, as próprias imunotoxinas são altamente imunogénicas quando administradas a um hospedeiro, e os anticorpos do hospedeiro, gerados contra a imunotoxina limitam a utilidade potencial para tratamentos terapêuticos repetidos de um indivíduo.
Outras proteínas de fusão projetadas, denominados pequenos produtos imuno-farmacêuticos modulares (SMIP™), são descritas nas Publicações de Patente U.S. de co- propriedade 2003/133939, 2003/0118592 e 200510136049, e nas Publicações de Patente Internacional de co-propriedade WO 02/056910, WO 2005/037989 e WO 2005/017148, que são todas aqui incorporadas por referência. Os produtos SMIP são proteínas de fusão de domínio de ligação-imunoglobulina inéditas que apresentam um domínio de ligação para uma estrutura cognata, por exemplo, um antígeno, um contra- recetor ou outros mais; um polipeptídeo da região de dobradiça de IgGl, IGA ou IgE ou um polipeptídeo da região de dobradiça de IgGl mutante que possui zero, um ou dois resíduos de cisteína; e domínios CH2 e CH3 de imunoglobulina. Os produtos SMIP são capazes de ADCC e/ou CDC.
Embora tenha sido realizada uma pesquisa intensa sobre terapias baseadas em anticorpos, ainda existe a necessidade na técnica de métodos aprimorados para o tratamento de doenças associadas à atividade aberrante de células B. As composições para uso nos métodos da presente invenção aqui descritos e reivindicados fornecem melhoramentos além de outras vantagens.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente divulgação providencia mátodos para reduzir células B usando ligação especifica de CD37. Nalguns métodos da divulgação, o uso de combinações de moléculas de ligação especifica - CD37 (um ou mais CD3 7 - moléculas de ligação especificas) e moléculas de ligação especificas de CD20 (uma ou mais moléculas de ligação especificas de CD20) resulta num aumento da redução das células-B. Nalguns desses métodos, as combinações são sinérgicas. Num aspeto relacionado, a divulgação proporciona um método de tratamento de um indivíduo gue tem, ou com suspeita de ter, uma doença associada com a atividade de células B aberrante. A presente inveção também fornece moléculas de ligação humanizadas específicas para CD37 (por exemplo, construções humanizadas de TRU-016) e seus usos nos métodos para a redução de células B com o uso dessas moléculas. Em algumas formas de realização dos métodos o uso de combinações de construções humanizadas de TRU-016 com uma ou mais moléculas de ligação específicas para CD20. Em outro aspeto, a divulgação fornece o uso de composições de acordo com a reivindicação 1 em métodos de tratamento de indivíduos gue possuem, ou com suspeita de terem, uma doença associada à atividade aberrante de células B. Aspetos relacionados da invenção dizem respeito ao uso de composições de acordo com a reivindicação 1 em métodos de prevenção de qualquer doença como essa e métodos de atenuação de um sintoma associado a uma doença como essa que compreende a administração de uma dose de uma molécula de ligação humanizada específica para CD37 eficaz para tratar ou evitar tal doença, ou para atenuar um sintoma de tal doença. "Atividade aberrante de células B" refere-se à atividade de células B que se devia da evolução normal, adequada ou esperada. Por exemplo, atividade aberrante de células B pode incluir a proliferação inadequada de células cujo ADN ou outros componentes celulares se tornaram danificados ou defeituosos. Atividade aberrante de células B pode incluir a proliferação celular cujas caracteristicas estão associadas a uma doença causada, mediada ou que resulta em níveis inadequadamente elevados de divisão celular, níveis inadequadamente baixos de apoptose, ou ambos. Tais doenças podem ser caracterizadas, por exemplo, por proliferações anormais locais únicas ou múltiplas de células, grupos de células ou tecido(s), sejam elas cancerosas ou não cancerosas, benignas ou malignas. A atividade aberrante de células B também pode incluir produção de anticorpo aberrante, por exemplo, a produção de auto-anticorpos ou a superprodução de anticorpos tipicamente desejável quando produzida em niveis normais. Contempla-se que a atividade aberrante de células B pode ocorrer em certas subpopulações de células B e não em outras subpopulações. A atividade aberrante de células B também pode incluir estimulação inadequada de células T, por exemplo, por apresentação inadequada de antigeno de célula B às células T ou por outras vias que envolvem células B. "Tratamento" ou "tratamento de" refere-se a um tratamento terapêutico ou a um tratamento profilático/preventivo. Um tratamento terapêutico pode melhorar pelo menos um sintoma de uma doença em um indivíduo que recebe o tratamento, ou pode retardar a piora de uma doença progressiva em um indivíduo, ou evitar o surgimento de doenças adicionais associadas.
Uma "dose terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz" de uma molécula de ligação especifica para CD20 refere-se àquela quantidade do composto suficiente para resultar na atenuação de um ou mais sintomas da doença tratada. Quando aplicada a um ingrediente ativo individual, administrado isoladamente, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àquele ingrediente isoladamente. Quando aplicada a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se às quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, sejam elas administradas serial ou simultaneamente. A invenção especificamente contempla que uma ou mais moléculas de ligação especificas podem ser administradas de acordo com métodos da invenção, cada uma em uma dose eficaz. "Um indivíduo que possui, ou com suspeita de ter, uma doença associada à atividade aberrante de células B" é um indivíduo no qual uma doença ou um sintoma de um distúrbio pode ser causado por atividade aberrante de células B, pode ser exacerbado por atividade aberrante de células B, ou pode ser aliviado por regulação da atividade de células B. Exemplos de tais doenças são um cancro de células B (por exemplo, linfoma de células B, uma leucemia de célula B ou um mieloma de célula B) , uma doença caracterizada por produção de auto-anticorpo ou uma doença caracterizada por estimulação inadequada de células T causada por apresentação inadequada de antígeno de célula B às células T ou causada por outras vias que envolvem células B.
Num aspeto exemplar, um indivíduo tratado pelos métodos da invenção demonstra uma resposta ao tratamento que é melhor do que, ou aumentada em relação à resposta ao tratamento com rituximab. Uma resposta que é superior em relação ao tratamento com rituximab refere-se a uma resposta clínica em que o tratamento por um método da invenção resulta em uma resposta clínica em um paciente que é melhor do que uma resposta clínica em um paciente submetido à terapia com rituximab, por exemplo, rituximab. Uma resposta superior é avaliada por comparação de critérios clínicos bem conhecidos na técnica e aqui descritos. Critérios exemplares incluem, sem limitação, duração da eliminação de células B, redução dos números qlobais de células B, redução dos números de células B em uma amostra biológica, redução do tamanho do tumor, redução do número de tumores, existentes e/ou que surgem após o tratamento, e melhora da resposta global, como avaliada pelos próprios pacientes e pelos médicos, por exemplo, com o uso do índice Prognóstico Internacional. A melhora pode ser em um ou mais de um dos critérios clínicos. Uma resposta superior com o método da invenção pode ser causada por uma resposta inadequada a tratamento prévio ou concomitante com rituximab, por exemplo, por causa da toxicidade e/ou eficácia inadequada do tratamento com rituximab.
Cancros de células B incluem linfomas de célula B [por exemplo, as várias formas de doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin (NHL) ou linfomas do sistema nervoso central], leucemias [por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de célula pilosa e leucemia mioblástica crónica] e mielomas (por exemplo, mieloma múltiplo). Cancros de células B adicionais incluem linfoma linfocítico pequeno, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, linfoma da zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma solitário dos ossos, plasmocitoma extra-ósseo, linfoma de células B da zona marginal extranodal de tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastinal (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de efusão primária, linfoma/leucemia de Burkitt, proliferações de células B de potencial maligno incerto, granulomatose linfomatóide e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante.
Distúrbios caracterizados por produção de auto- anticorpo são frequentemente considerados doenças autoimunes. Doenças autoimunes incluem, sem limitação: artrite, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, policondrite, artrite psoriática, psoríase, dermatite, polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpo de inclusão, miosite inflamatória, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia e esclerose sistémicas, síndrome de CREST, respostas associadas à doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome do sofrimento respiratório, síndrome do sofrimento respiratório do adulto (ARDS), meningite, encefalite, uveíte, colite, glomerulonefrite, condições alérgicas, eczema, asma, condições que envolvem a infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas, aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos, lúpus eritematoso sistémico (LES), lúpus eritematoso cutâneo subagudo, lúpus discoide, mielite do lúpus, cerebrite do lúpus, diabetes de surgimento juvenil, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, neuromielite ótica, febre reumática, coreia de Sydenham, respostas imunológicas associadas à hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose, incluindo granulomatose de Wegener e doença de Churg-Strauss, agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite/angeíte por hipersensibilidade, ANCA e vasculite reumatoide), anemia aplásica, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica imune, incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia pura de células vermelhas (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese leucocitária, distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central (SNC), síndrome de lesão de múltiplos órgãos, miastenia grave, doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana basal antiglomerular, síndrome do anticorpo anti-fosfolipídeo, neurite alérgica, doença de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténica de Lambert- Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjõrgen, síndrome de Stevens-Johnson, rejeição de transplante de órgão sólido, doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), penfigoide bolhoso, pênfigo, poliendocrinopatias autoimunes, espôndilo-artropatias soronegativas, doença de Reiter, síndrome da pessoa rígida (stiff-man), arterite de célula gigante, nefrite por complexo imune, nefropatia por IgA, polineuropatias por IgM ou neuropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura de Henoch-Schonlein, trombocitopenia autoimune, doença autoimune do testículo e do ovário, incluindo orquite e ooforite autoimunes, hipotireoidismo primário; doenças endócrinas autoimune, incluindo tireoidite autoimune, tireoidite crónica (tireoidite de Hashimoto), tireoidite subaguda, hipotireoidismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), diabetes do Tipo I, também denominado diabetes melito insulino-dependente (IDDM) e sindrome de Sheehan; hepatite autoimune, pneumonite intersticial linfóide (HIV), bronquiolite obliterante (não-transplante) vs NSIP, sindrome de Guillain-Barré, vasculite de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e arterite de célula gigante (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença de Kawasaki e poliartrite nodosa), poliartrite nodosa (PAN) espondilite anquilosante, doença de Berger (nefropatia por IgA), glomerulonefrite rapidamente progressiva, cirrose biliar primária, doença celíaca (enteropatia por glúten), crioglobulinemia, crioglobulinemia associada à hepatite, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença arterial coronariana, febre familiar do Mediterrâneo, poliangeíte microscópica, sindrome de Cogan, sindrome de Whiskott- Aldrich e tromboangeíte obliterante. A artrite reumatoide (AR) é uma doença crónica caracterizada por inflamação das articulações, causando edema, dor e perda da função. Pacientes que possuem AR por um período prolongado normalmente exibem destruição, deformidade, incapacidade articulares progressivas, e até mesmo morte prematura. A doença de Crohn e uma doença relacionada, a colite ulcerativa, são as duas dois categorias principais de doenças que pertencem a um grupo de patologias denominado doença inflamatória do intestino (IBD). A doença de Crohn é um distúrbio crónico que causa inflamação do trato digestivo ou gastrointestinal (GI). Embora possa envolver qualquer área do trato GI, da boca ao ânus, afeta mais comumente o intestino delgado e/ou cólon. Na colite ulcerativa, o envolvimento GI é limitado ao cólon. A doença de Crohn pode ser caracterizada por anticorpos contra antígenos de neutrófilos, ou seja, o "anticorpo perinuclear anti-neutrófilos" (pANCA), e Saccharomyces cervisiae, ou seja o "anticorpo anti- Saccharomyces cervisiae" (ASCA). Muitos pacientes com colite ulcerativa possuem o anticorpo pANCA no sangue, mas não o anticorpo ASCA, enguanto muitos pacientes com doença de Crohn exibem anticorpos ASCA, e não anticorpos pANCA. Um método de avaliação da doença de Crohn é a utilização do índice da Atividade da Doença de Crohn (CDAI), baseado em 18 pontuações variáveis indicadoras coletadas por médicos. Os valores CDAI de 150 ou menos estão associados à doença quiescente; valores acima daquele indicam doença ativa, e valores acima 450 são observados na doença extremamente grave [Best e cols., "Development of an Crohn's disease activity index", Gastroenterology 70: 439-444 (1976)]. No entanto, desde ο estudo original, alguns pesquisadores utilizam um "valor subjetivo" de 200 a 250 como uma pontuação saudável. O lúpus eritematoso sistémico (LES) é uma doença autoimune causada por lesões recorrentes dos vasos sanguíneos em vários órgãos, incluindo o rim, a pele e as articulações. Em pacientes com LES, uma interação defeituosa entre células T e células B causa a produção de auto-anticorpos que atacam o núcleo das células. Há uma concordância geral de que os auto-anticorpos são responsáveis pelo LES e, portanto, novas terapias que eliminam a linhagem de células B, permitindo que o sistema imunológico seja reinicializado à medida que são geradas novas células B a partir de precursores, dariam esperança de benefícios duradouros nos pacientes com LES. A esclerose múltipla (EM) também é uma doença autoimune. Caracteriza-se por inflamação do sistema nervoso central e destruição de mielina, que isola as fibras das células nervosas no cérebro, medula espinhal e no corpo. Embora a causa da EM seja desconhecida, acredita-se amplamente que células T autoimunes sejam os fatores primários para a patogénese da doença. No entanto, estão presentes níveis elevados de anticorpos no líquido cefalorraquidiano de pacientes com EM, e algumas teorias preveem que a resposta de células B que leva à produção de anticorpos é importante para o desenvolvimento da doença. A doença autoimune da tireoide resulta da produção de auto-anticorpos que tanto estimula a tireoide para causar hipertireoidismo (doença de Graves) quanto destrói a tireoide causando hipotireoidismo (tireoidite de Hashimoto). A estimulação da tireoide é causada por auto- anticorpos que se ligam e ativam o recetor do hormônio estimulante da tireoide (TSH). A destruição da tireoide é causada por auto-anticorpos que reagem com outros antígenos tireoidianos. A síndrome de Sjõgren é uma doença autoimune caracterizada por destruição das glândulas do corpo produtoras de umidade. A púrpura trombocitopénica imune (PTI) é causada por auto-anticorpos que se ligam às plaquetas sanguíneas e causam sua destruição. A Miastenia grave (MG) é um distúrbio neuromuscular autoimune crónico caracterizado por auto-anticorpos que se ligam a recetores de acetilcolina expressos nas junções neuromusculares causando fraqueza dos grupos musculares voluntários. A psoríase é caracterizada por inflamação autoimune na pele e também está associada à artrite em 30% dos casos, esclerodermia, doença inflamatória do intestino, incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa.
Também é contemplado o tratamento de miopatia inflamatória idiopática (MII), incluindo dermatomiosite (DM) e poliomiosite (PM). As miopatias inflamatórias foram caracterizadas com o uso de diversos esquemas de classificação. O esquema de classificação de Miller (Miller, Rheum. Dis. Clin. North Am. 20: 811-826, 1994) identifica 2 miopatias inflamatórias idiopáticas (Mil), poliomiosite (PM) e dermatomiosite (DM). A poliomiosite e a dermatomiosite são doenças inflamatórias crónicas, debilitantes, que envolvem os músculos e, no caso de DM, a pele. Esses distúrbios são raros, com uma incidência anual relatada de aproximadamente 5 a 10 casos por milhão de adultos, e de 0,6 a 3,2 casos por milhão de crianças por ano nos Estados Unidos (Targoff, Curr. Probl. Dermatol. 1991, 3: 131-180). A miopatia inflamatória idiopática está associada a uma morbidade e uma mortalidade significativas, com até metade dos adultos afetados apresentando um grau de invalidez importante (Gottdiener e cols., Am. J. Cardiol. 1978, 41: 1.141-49). Miller (Rheum. Dis. Clin. North Am. 1994, 20: 811-826 e "Arthritis and Allied Conditions", Capítulo 75, Eds. Koopman e Moreland, Lippincott Williams e Wilkins, 2005) definem cinco grupos de critérios usados para o diagnóstico de MII, ou seja, avaliação dos Critérios para Miopatia
Inflamatória Idiopática (IIMC), incluindo fraqueza muscular, evidências de degeneração na biópsia, elevação dos níveis séricos de enzimas associadas aos músculos, tríade eletromagnética de miopatia, evidências de erupções na dermatomiosite, e também incluem evidências de auto-anticorpos como critérios secundários.
Fatores associados à MII, incluindo enzimas associadas aos músculos e auto-anticorpos, incluem, sem limitação, creatina quinase (CK), lactato desidrogenase, aldolase, proteína C-reativa, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e auto-anticorpo antinuclear (ANA), anticorpos específicos para miosite (MSA), e anticorpo para antígenos nucleares passíveis de extração.
Uma "molécula de ligação" de acordo com a invenção pode ser, por exemplo, uma proteína (uma "proteína" pode ser um polipeptídeo ou um peptídeo), um ácido nucleico, um carboidrato, um lipídeo ou um composto de pequena molécula que se liga a um alvo. Um tipo de molécula de ligação proteinácea contemplada pela invenção é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que retém a atividade de ligação. Uma molécula de ligação pode ser modificada de acordo com métodos padronizados na técnica para melhorar sua afinidade de ligação, diminuir sua imunogenicidade, alterar suas funções efetoras e/ou aumentar sua disponibilidade no corpo de um indivíduo. Tais modificações podem incluir, por exemplo, modificações da sequência de aminoácidos ou expressão como uma proteína de fusão. Essas proteínas de fusão também são moléculas de ligação de acordo com a invenção. Uma molécula de ligação exemplar da invenção é um pequeno produto imuno-farmacêuticos modular (SMTP™).
Uma molécula de ligação que é "específica" para um alvo se liga àquele alvo com uma afinidade maior do que a qualquer outro alvo. Por exemplo, uma molécula de ligação específica para CD37 se liga a CD37 com uma afinidade maior do que a qualquer outro alvo e uma molécula de ligação específica para CD20 se liga a CD20 com uma afinidade maior do que a qualquer outro alvo. As moléculas de ligação da invenção podem ter afinidades por seus alvos de um Ka maior ou igual a cerca de 104 NP1, de preferência, maior ou igual a cerca de 105 NP1, mais preferivelmente, maior ou igual a cerca de 106 NP1 e, ainda mais preferivelmente, maior ou igual a cerca de 107 NP1. Afinidades ainda maiores do que cerca de 107 NP1 são ainda mais preferidas, por exemplo, afinidades iguais ou maiores do que cerca de 107 NP1, cerca de 108 NP1 e cerca de 109 NP1, e cerca de IO10 NP1. As afinidades das moléculas de ligação de acordo com a presente invenção podem ser facilmente determinadas com o uso de técnicas convencionais, por exemplo, aquelas descritas por Scatchard e cols., Ann. N.Y. Acad. Sei. 51: 660 (1949).
Certas moléculas de ligação específicas para CD37 contempladas pela invenção possuem afinidades por CD37 de cerca de 0,5 a cerca de 10 nM. Certas moléculas de ligação específicas para CD20 contempladas pela invenção possuem afinidades por CD20 de cerca de 1 a cerca de 30 nM.
Outra característica de certas moléculas de ligação a CD37 e moléculas de ligação a CD20 contempladas pela invenção é que elas exibem uma meia-vida na circulação de cerca de 7 a cerca de 30 dias.
Os anticorpos específicos para CD37 que caracterizaram o antígeno CD37 no "Terceiro Seminário de HLDA" foram HD28, G28-1, HH1, BI14, WR17 e F93G6 . Veja, Ling e MacLennan, pp. 302-335 em "Leucocyte Typing III. White Cell Differentiation Antigens", Oxford University Press (1987). Outros anticorpos específicos para CD37 que foram descritos incluem RFB-7, Y29/55, MB-1, M-B371, M-B372 e IPO-24. Veja Moldenhaurer, J. Biol., Regul. Homeost. Agents, 14: 281-283 (2000), que estabelece que todos esses anticorpos reconhecem apenas um epitopo de CD37. Schwartz-Albiez e cols., 14: 905-914 (1988) indicam que o epitopo está situado na porção de carboidrato do CD37. Outro anticorpo específico para CD3 7 é S-B3 (Biosys).
Patentes e publicações de patentes que descrevem anticorpos de CD20 incluem Patentes U.S. Nos 5.776.456, 5.736.137,
6.399.061 e 5.843.439, bem como os pedidos de patente U.S. Nos US 2002/0197255 AI e US 2003/0021781 AI (Anderson e cols.); Patente U.S. N° 6.455.043 BI e WO 00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez e White); WO 00/27433 (Grillo-Lopez e Leonard); WO 00/44788 (Braslawsky e cols.); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO 01/10461 (Rastetter e White); WO 01/10460 (White e Grillo- Lopez); Pedido U.S. N° US 2002/0006404 e WO 02/04021 (Hanna e Hariharan); pedido U.S. N° US 2002/0012665 AI e WO 01/74388 (Hanna, N.); pedido U.S. N° US 2002/0009444 Al, e WO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 01/97858 (White, C.); pedido U.S. N° US 2 0 0 2/012 848 8A1 e WO 02/34790 (Reff, M.); WO 02/060955 (Braslawsky e cols.); WO 02/096948 (Braslawsky et al. ) ; WO 02/079255 (Reff e Davies); Patentes U.S. NoS 6.171.586 BI e WO 98/56418 (Lam e cols.); W09 8/58964 (Raju, S.); WO 99/22764 (Raju, S.);WO 99/51642, Patente U.S. N° 6.194.551 Bl, Patente U.S. N° 6.242.195 Bl,
Patente U.S. N° 6.528.624 BI e Patente U.S. N° 6.538.124 (Idusogie e cols . ) ; WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd e cols.); WO 01/03734 (Grillo-Lopez e cols . ) ; pedido U.S. N° US 2002/0004587 AI e WO 01/77342 (Miller e Presta); pedido U.S. No US 2002/0197256 (Grewal, I.); Patentes U.S. Nos 6.090.365 Bl, 6.287.537 Bl, 6.015.542, 5.843.398 e 5.695.721, (Kaminski e cols.); Patentes U.S. Nos 5.500.362, 5.677.180, 5.721.108 e 6.120.767 (Robinson e cols.); Patente U.S. N° 6.410.391 Bl (Raubitschek e cols.); Patentes U.S. NoS 6.224.866 Bl e WO 00/20864 (Barbera- Guillem, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO 00/67795 (Goldenberg) ; WO 00/74718 (Goldenberg e Hansen); WO 00/76542 (Golay e cols.); WO 01/72333 (Wolin e Rosenblatt); Patente U.S. N° 6.368.596 Bl (Ghetie e cols.); Pedido U.S. N° US 2002/0041847 Al, (Goldenberg, D.); Pedido U.S. N° US 2003/0026801 Al (Weiner e Hartmann); WO 02/10231 (Engleman, E.), cada um deles é expressamente aqui incorporado por referência. Veja também, Patente U.S. N° 5.849.898 e Pedido E.P. N° 0,330.191 (Seed e cols.); Patente U.S. N° 4.861.579 e EP0332865 A2 (Meyer e Weiss); e WO 95/03770 (Bhat et al.).
Os números de pedido acima referem-se ao número de publicação dos pedidos de patentes relevantes.
Rituximab foi aprovado para uso clinico humano como Rituxan®. Rituxan® é considerado como sendo uma molécula de ligação especifica para CD20 da invenção.
Produtos imuno-farmacêuticos modulares pequenos (SMIPs) são considerados como sendo um tipo de molécula de ligação da invenção. Métodos para a fabricação de SMIPs foram descritos previamente no pedido U.S. de co-propriedade N° 10/627.556 e nas Publicações de Patente U.S. 20030133939, 20030118592 e 20050136049, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. SMIPs são proteínas de fusão de domínio de ligação-imunoglobulina inéditas que geralmente apresentam um domínio de ligação para uma estrutura cognata, por exemplo, um antígeno, um contra- recetor ou outros mais, um polipeptídeo da região de dobradiça de IgGl, IGA ou IgE ou um polipeptídeo da região de dobradiça de IgGl mutante que possui zero, um ou dois resíduos de cisteína, e domínios CH2 e CH3 de imunoglobulina. Em uma forma de realização, a molécula do domínio de ligação tem um ou dois resíduos de cisteína (Cys) na região de dobradiça. Em uma forma de realização relacionada, quando a molécula do domínio de ligação compreende dois resíduos Cys, o primeiro Cys, que está envolvido na ligação entre a cadeia pesada e a cadeia leve, não é eliminado ou substituído por um aminoácido.
As moléculas do domínio de ligação úteis nos métodos da invenção são contempladas como tendo uma ou mais regiões de ligação, tais como regiões de ligação variáveis da cadeia leve e regiões de ligação variáveis da cadeia pesada derivadas de um ou mais membros da superfamília das imunoglobulinas, por exemplo, uma imunoglobulina. Além disso, essas regiões estão tipicamente separadas por peptídeos vinculadores, que podem ser qualquer peptídeo vinculador conhecido na técnica para ser compatível com a junção do domínio ou região em uma molécula de ligação. Vinculadores exemplares são vinculadores que se baseiam no motivo vinculador Gly4Ser, por exemplo, (Gly4Ser)n, em que n = 1-5. As moléculas para uso nos métodos da invenção também contêm sequências de aminoácidos suficientes derivadas de uma região constante de uma imunoglobulina para fornecer uma função efetora, de preferência, ADCC e/ou CDC. Dessa forma, as moléculas terão uma sequência derivada de um domínio CH2 de uma imunoglobulina ou domínios CH2 e CH3 derivados de uma ou mais imunoglobulinas. SMIPs são capazes de ADCC e/ou CDC, mas têm sua habilidade para formar multímeros ligados por dissulfeto comprometida. A divulgação inclui polipeptídeos SMIP humanizados específicos para CD37 que exibem pelo menos 80 por cento de identidade para o polipeptídeo apresentado no ID. DE SEQ. N°: 2, em que o polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37 se liga a CD37. Em um aspeto, os polipeptídeos SMIP humanizados específicos para CD37 compreendem qualquer sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 80, 82, 84, 86, e 88.. Em outro aspeto, os polipeptídeos SMIP humanizados específicos para CD37 compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido em uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada do grupo que consiste em: CDR1 da cadeia leve, CDR1 da cadeia pesada, CDR2 da cadeia leve, CDR2 da cadeia pesada, CDR3 da cadeia leve e CDR3 da cadeia pesada.
Em uma forma de realização, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR1 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 61 (RASENVYSYLA). A invenção de acordo com a reivindicação 1 também inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR1 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 62 (RTSENVYSYLA). A divulgação ainda inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD3 7, em que a CDR1 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 63 (GYMNM).
Em outra forma de realização, a invenção de acordo com a reivindicação 1 inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a CDR2 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 64 (FAKTLAE). A invenção de acordo com a reivindicação 1 também inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a CDR2 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 65 (NIDPYYGGTTTYNRKFKG). A invenção de acordo com a reivindicação 1 inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a CDR3 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 66 (QHHSDNPWT). A invenção ainda inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 67 (SVGPFDY) . A invenção ainda inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 68 (SVGPFDS). A invenção também inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 69 (SVGPMDY).
Noutro aspeto, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37 que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três sequências das sequências de aminoácidos da CDR da cadeia leve selecionadas do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 61, 62, 64 e 66.
Ainda em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37 que compreende uma sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia leve dos IDS. DE SEQ. Nos: 61 ou 62, ou uma variante desta, na qual um ou dois aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 61 ou 62 foram alterados; uma sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 64, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 64 foram alterados; e uma sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 66, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 66 foram alterados.
Ainda noutro aspeto, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37 que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três sequências de aminoácidos da CDR da cadeia pesada selecionadas do qrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 63, 65 e 67-69. Em uma forma de realização adicional, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37 que compreende uma sequência de aminoácidos da CDR1, da cadeia pesada do ID. DE SEQ. N°: 63, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 63 foram alterados; uma sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. N° : 65, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 65 foram alterados; e uma sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 67-69, ou uma variante desta na qual um ou dois aminoácidos de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 67-69 foram alterados. A invenção também inclui polipeptideos SMIP humanizados específicos para CD37 que compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido em uma região estrutural (FR) selecionada do grupo que consiste em: FR1 da cadeia leve, FR1 da cadeia pesada, FR2 da cadeia leve, FR2 da cadeia pesada, FR3 da cadeia leve, FR3 da cadeia pesada, FR4 da cadeia leve e FR4 da cadeia pesada. Em uma forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a primeira região estrutural (FR1) da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 70 (EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC) . Em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a FR1 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 71 (EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT). Ainda em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a FR2 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 72 (WYQQKPGQAPRLLIY). Em uma forma de realização adicional, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD3 7, em que a FR2 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 73 (WVRQMPGKGLEWMG). Ainda em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a FR3 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 74 (GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC). Ainda noutra forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a FR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 75 (QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR). Ainda em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a FR4 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 76 (FGQGTKVEIK). Ainda em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a FR4 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 77 (WGQGTLVTVSS) . Ainda em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado especifico para CD37, em que a FR4 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 78 (WGRGTLVTVSS). A invenção ainda inclui polipeptideos SMIP humanizados específicos para CD3 7 que compreendem pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três sequências das sequências de aminoácidos da FR da cadeia leve selecionadas do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 70, 72, 74 e 76. Em uma forma de realização, a invenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado específico para CD37 que compreende uma sequência de aminoácidos da FR1 da cadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 70, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 70 foram alterados; uma sequência de aminoácidos da FR2 da cadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 72, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 72 foram alterados; uma sequência de aminoácidos da FR3 da cadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 74, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 74 foram alterados; e uma sequência de aminoácidos da FR4 da cadeia leve do ID. DE SEQ. N° : 76, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 76 foram alterados.
Além disso, a invenção inclui polipeptideos SMIP humanizados específicos para CD3 7 que compreendem pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três sequências das sequências de aminoácidos da FR da cadeia pesada selecionadas do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 71, 73, 75, 77 e 78. Em uma forma de realização, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado especifico para CD37 que compreende uma sequência de aminoácidos da FR1 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. N°: 71, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 71 foram alterados; uma sequência de aminoácidos da FR2 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. N° : 73, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 73 foram alterados; uma sequência de aminoácidos da FR3 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. N° : 75, ou uma variante desta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 75 foram alterados; e uma sequência de aminoácidos da FR4 da cadeia pesada dos IDS. DE SEQ. Nos: 77 ou 78, ou uma variante desta, na qual um ou dois aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 77 ou 78 foram alterados. A invenção também inclui uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37 que exibe pelo menos 80 por cento de identidade para o polipeptídeo apresentado no ID. DE SEQ. N° : 2, em que o polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37 se liga a CDC37. Uma molécula de ácido nucleico isolado como essa pode compreender uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 79, 81, 83, 85 e 87. Em uma forma de realização, a divulgação inclui vetores que compreendem essas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem os vetores. A invenção também inclui processos de produção dos polipeptideos aqui descritos, que compreendem o cultivo das células hospedeiras sob condições adequadas para expressar os polipeptideos e, opcionalmente, o isolamento dos polipeptideos da cultura.
Ainda em outro aspeto, a invenção inclui composições que compreendem os polipeptideos SMIP humanizados específicos para CD37 da invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável. A invenção ainda inclui o uso do SMIP especifico para CD37 ou das moléculas de ligação especificas para CD37 aqui descritos em qualquer um dos métodos da invenção. Tais métodos incluem o uso de qualquer SMIP especifico para CD3 7 ou molécula de ligação especifica para CD37 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 80, 82, 84, 86 e 88.
Ainda em outro aspeto, a invenção inclui kits para a redução de células B que compreendem as composições da invenção; e protocolos para a utilização dos kits para reduzir células B. Tais kits podem ainda compreender uma ou 30 mais moléculas de ligação especifica para CD20. A invenção contempla que uma molécula de ligação especifica para CD20 como essa é TRU-015. A invenção também inclui polipeptideos SMIP humanizados específicos para CD3 7 que compreendem uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3, que exibem pelo menos 80 por cento de identidade para o polipeptídeo apresentado no ID. DE SEQ. N°: 2.
Polipeptídeos SMIP específicos para CD37 como esses podem ainda compreender um domínio estrutural humano separando cada uma das CDR-1, CDR2 e CDR3.
Em outro aspeto, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37 que exibe pelo menos 8 0 por cento de identidade para o polipeptídeo apresentado no ID. DE SEQ. N° : 2, em que o polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37 se liqa a CD3 7 e compreende um polipeptídeo da região de dobradiça que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 110, 112, 114, 115, 116, 118, 120, 122, 124, 126 e 127. A divulgação também contempla um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD3 7 que exibe pelo menos 80 por cento de identidade para o polipeptídeo apresentado no ID. DE SEQ. N°: 2, em que o polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37 se liga a CD37 e compreende um vinculador que compreende (Gly4Ser)n/ em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
Ainda em um aspeto adicional, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR1 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 128 (RTSQNVYSYLA), 129 (RTSESVYSYLA), 130 (RASQSVYSYLA), 131 (RASQSVS SYLA) e 132 (RASQSVSYYLA) . Em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR1 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. NOS: 133 (SYMNM) e 134 (SYWIG). Em uma forma de realização adicional, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR2 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 135 (AASSLQS) , 136 (GASTRAT) e 137 (DASNRAT) . Ainda em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR2 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 13 8 (IIYPGDSDTRYSPSFQG) e 13 9 (RIDPSDSYTNYSPSFQG). A divulgação também inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR3 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 220 (QHHSDNPWT). Em outra forma de realização, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 211 (SVGPMDY), 212 (SVGPFDY), 213 (SVGPMDV), 214 (SVGPFDS), 215 (SVGPFDP), 216 (SVGPFQH), 217 (SVGPFDV), 218 (SVGPFDI) e 219 (SVGPFDL) .
Ainda um aspeto adicional, a invenção inclui polipeptídeos SMIP específicos para CD37 com regiões estruturais alternativas. Num aspeto, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a FR1 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 170-181. Em outro aspeto, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a FR1 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 140-146. Ainda em um aspeto adicional, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a FR2 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 182-193. Ainda em outro aspeto, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD3 7, em que a FR2 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 147-153. Em um aspeto adicional, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a FR3 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 194-205. Ainda em outro aspeto, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a FR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 154-160. Em um aspeto adicional, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a FR4 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 206-210. Ainda em outro aspeto, a invenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que a FR4 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 161-169. SMIPs específicos para CD37 exemplares úteis na invenção incluem, sem limitação: G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, que consiste em um G28-1 Fv de cadeia única no qual todos os três resíduos de cisteína nas regiões de conexão ou de dobradiça são mutados para resíduos de serina, e domínios CH2 e CH3 do tipo selvagem; G28-1 scFv IgAH WCH2 WCH3, que compreende uma dobradiça de IgA e domínios WT de IgGl; G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 CH3, em que todos os três resíduos de cisteína nas regiões de conexão ou de dobradiça são mutados para resíduos de serina, e a leucina na posição 11 da região variável da cadeia pesada é substituída por uma serina; G28-1 scFv VHL11S (CSS-S) H WCH2 CH3, em que os resíduos de cisteína foram substituídos na segunda e na terceira posições por serina; G28-1 scFv VHL11 S (CSC-S) H WCH2 CH3, em que os resíduos de cisteína foram substituídos na segunda posição por serina; G28-1 scFv VH11S (SSC-P) H WCH2 WCH3 (aqui denominado TRU-016), em que o primeiro e o segundo resíduo de cisteína nas regiões de conexão ou de dobradiça são mutados para resíduos de serina, e a leucina na posição 11 da região variável da cadeia pesada é substituída por uma serina; G28-1 scFv VH11S (SCS-S) H WCH2 WCH3, em que o primeiro e o terceiro resíduos de cisteína nas regiões de dobradiça são mutados para resíduos de serina; G28-1 scFv VHL11S (SSC-P) H WCH2 WCH3, em que o terceiro resíduo de cisteína na região de dobradiça é substituído por uma serina; G28-1 scFv VHL11 S (SCC-P) H WCH2 WCH3, em que a primeira cisteína é substituída por uma serina; G28-1 scFv VHL11S mlgE CH2 CH3 CH4, que compreende regiões CH 2-4 de IgE de camundongo nas quais a leucina na posição 11 da região variável da cadeia pesada é substituída por uma serina; G28-1 scFv VHL11S mlgA WIgACH2 T4CH3, que compreende uma dobradiça de IgA de camundongo com uma CH2 de IgA do tipo selvagem e um domínio CH3 de IgA truncado desprovido dos 4 aminoácidos carbóxi GTCY; G28-1 scFv VHL11 S hlgE CH2 CH3 CH4, que compreende regiões CH de IgE nas quais a leucina na posição 11 da região variável da cadeia pesada é substituída por uma serina; e G28-1 scFv VHL11 S hlgAH WIgACH2 TCH3, que compreende uma dobradiça de IgA, uma CH2 de IgA do tipo selvagem e uma CH2 de IgA truncada e um domínio CH3 de IgA truncado desprovido dos 4 aminoácidos carbóxi GTCY. SMIPs exemplares específicos para CD20 úteis na invenção incluem SMIPs derivados do anticorpo monoclonal *anti-CD20 2H7 descrito nas Publicações de Patente U.S. 2003133939 e 20030118592. Os SMIPs incluem 2H7scFv-Ig ou um derivado deste. Derivados incluem CytoxB-MHWTGlC, que tem um domínio Fc de IgGl humana, e um domínio de dobradiça de IgGl mutante; CytoxB-MHMGlC, que compreende um domínio Fc mutado; MG1H/MG1C, que compreende um recetor Fc com um resíduo de leucina mutado 234; CytoxB-IgAHWTHGlC, que compreende uma porção da dobradiça de IgA humana fundida ao domínio Fc humano do tipo selvagem; 2H7 scFv-lhama IgGl, que compreende a dobradiça de IgGl de llama e regiões CH2CH3, 2H7 scFv-llama IgG2, que compreende as regiões de dobradiça e CH2CH3 de IgG2 de lhama; 2H7 scFv-llama lgG3, que compreende as regiões de dobradiça e CH2CH3 de IgG3 de llama. 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3, em que todos os três resíduos de cisteína nas regiões de conexão ou de dobradiça são mutados para resíduos de serina, e domínios CH2 e CH3 do tipo selvagem; 2H7 scFv MTH (SSC), em que os dois primeiros resíduos de cisteína foram substituídos por resíduos de serina; 2H7 scFv MTH (SCS) , em que a primeira e a terceira cisteínas foram substituídas por resíduos de serina; 2H7 scFv MTH (CSS) WTCH2CH3, em que os resíduos de cisteína foram substituídos na segunda e na terceira posições por serina; 2H7 scFv VH 11 SER IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, em que a leucina na posição 11 na região variável da cadeia pesada é substituída por serina; 2H7 scFv IgA hinge-IgGl CH2-CH3, que compreende uma região de dobradiça de IgA e domínios WT de IgGl; 2H7 scFv IgA hinge-CH2-CH3, que compreende uma dobradiça de IgA, regiões CH2-3; 2H7 IgAWH IgACH2-T4CH3, que compreendem uma dobradiça de IgA, uma CH2 de IgA do tipo selvagem e um domínio CH3 de IgA truncado desprovido dos 4 aminoácidos carbóxi GTCY.
Derivados com mutações na região CH3 de IgG incluem 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, no qual o resíduo de fenilalanina na posição 4 05 (numeração de acordo com Rabat e cols. supra) foi substituído por tirosina; 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405, em que a fenilalanina na posição 405 foi substituída por uma alanina; scFv MTH WTCH2 MTCH3 A40 7, em que o resíduo de tirosina na posição 407 foi substituído por uma alanina; scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y4 05A4 0 7, que compreende as duas mutações; e scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407, que compreende duas mutações. 2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3 é uma construção com o terceiro resíduo de cisteína na região de dobradiça de IgGl substituído por um resíduo de serina. SMIP 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 compreende um domínio de dobradiça mutante (MT (SSS)) e um domínio CH2 mutante, em que a prolina no resíduo 238 (de acordo com Ward e cols.) foi substituída por uma serina.
Derivados 2H7scFv-Ig também incluem mutantes 2H7 scFv com mutações pontuais na região variável da cadeia pesada. Todas as construções a seguir compreendem mutações em que a leucina na posição 11 na região variável da cadeia pesada é substituída por serina; 2H7 scFv VH11SER IgG MTH (SSS-S) WTCH2CH3, 2H7scFv VHL11S (CSS-S) H WCH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada como apresentada acima; 2H7scFv VHL11S (CSC-S) H WCH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada como apresentada acima; 2H7 scFv VHL11S IgAH IgACH2 T4CH3, que compreende a dobradiça de IgA, WT IgA CH2 e CH3 truncada de IgA; 2H7 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4, que compreende as regiões CH 2-4 de IgE; 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) IgECH3CH4, que compreende uma região de dobradiça mutada e regiões CH3 e CH4 de IgE; 2H7 scFv VHL11S mlgE CH2 CH3 CH4, que compreende regiões de IgE de camundongo; 2H7 scFv VHL11S mlgAH WIGACH2 T4CH3, que compreende as mutações descritas acima e uma região constante de IgA de camundongo que consiste em uma região CH2 do tipo selvagem e uma região CH3 mutada; 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H K322S CH2 WCH3, que compreende uma mutação na região CH2 de IgGl humana no resíduo 322, em que lisina foi trocada por serina; 2H7 scFv VHL11S (CSS-S) H K322S CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada como descrito acima e uma região CH2 mutada como descrito previamente; 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H P331S CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada como descrito acima, e uma região CH2 mutada em que a prolina no resíduo 331 foi trocada por uma serina; 2H7 scFv VHL11S (CSS-S) H P331S CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada e uma mutação de prolina por serina no resíduo 331 na região CH2; 2H7 SCFv VHL11S (SSS-S) Η T256N CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada e uma mutação de treonina por asparagina no resíduo 256 na região CH2; 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H RTPE/QNAK (255-258) CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada e uma série de mutações nas quais os resíduos 255-258 foram mutados de arginina, treonina, prolina, ácido glutâmico para glutamina, asparaginas, alanina e lisina, respetivamente; 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3, que compreende regiões de dobradiça mutadas e uma troca de lisina por glutamina na posição 290 ; 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) Η A339P CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada e.uma troca de
alanina por prolina na posição 339; SMIP 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada e uma troca de prolina por serina na posição 238 em CH2, que é a mesma que 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3. 2H7 scFv IgAH IGAHCH2 T18CH3, que compreende uma região de dobradiça de IgA do tipo selvagem e uma região CH2 e uma região CH3 com uma truncagem de 18 aminoácidos na extremidade carbóxi.
Uma molécula de ligação da invenção pode compreender um domínio extracelular nativo ou projetado de outra proteína, o que aumenta a atividade da molécula de ligação. Em uma forma de realização, o domínio extracelular é selecionado do grupo que consiste em CD154 e CTLA4.
Uma "combinação sinérgica" de moléculas de ligação específicas para CD37 e de moléculas de ligação específicas para CD2 0 é uma combinação que tem um efeito que é maior do que a soma dos efeitos das moléculas de ligação quando administradas isoladamente.
Num aspeto da invenção, as moléculas de ligação são administradas em uma ou mais composições farmacêuticas. Para administrar as moléculas de ligação a um ser humano ou a animais de teste, é preferível formular as moléculas de ligação em uma composição que compreende um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. A frase "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" refere- se às entidades moleculares e composições que não produzem reações alérgicas ou outras reações adversas quando administradas com a utilização de vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. "Veículos farmaceuticamente aceitáveis" incluem qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardo da absorção clinicamente úteis, e semelhantes.
Além disso, os compostos podem formar solvatos com água ou solventes orgânicos comuns. Esses solvatos também são contemplados.
As composições de molécula de ligação podem ser administradas por via oral, tópica, transdérmica, parenteral, por pulverizador de inalação, vaginal, retal ou por injeção intracraniana. 0 termo parenteral, como aqui usado, inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intracisterna ou técnicas de infusão. A administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica em um local especifico também é contemplada. Geralmente, as composições são essencialmente livres de pirogênios, além de outras impurezas que podem ser prejudiciais ao paciente. Prefere-se a injeção, especialmente a injeção intravenosa.
As composições farmacêuticas da presente invenção que contêm moléculas de ligação usadas n um método da invenção podem conter veículos ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis, dependendo da via de administração. Exemplos desses veículos ou aditivos incluem água, um solvente orgânico farmacêutico aceitável, colagénio, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, um polímero de carboxivinil, carboximetilcelulose sódica, poliacrílico sódico, alginato de sódio, dextrana hidrossolúvel, carboximetil amido sódico, pectina, metil celulose, etil celulose, goma xantana, goma arábica, caseína, gelatina, ágar, diglicerina, glicerina, propileno glicol, polietileno glicol, vaselina, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactose, um tensioativo farmaceuticamente aceitável, e semelhantes. Os aditivos usados são escolhidos entre, sem limitação, os acima citados, ou combinações destes, como adequado, dependendo da forma de dosagem da presente invenção. A formulação da composição farmacêutica irá variar de acordo com a via de administração selecionada (por exemplo, solução, emulsão). Uma composição apropriada que compreende o anticorpo a ser administrado pode ser preparada em um veículo ou transportador fisiologicamente aceitável. Para soluções ou emulsões, veículos adequados incluem, por exemplo, soluções aquosas ou alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosos podem incluir vários aditivos, conservantes ou renovadores de líquidos, nutrientes ou eletrólitos.
Diversos veículos aquosos, por exemplo, água, água tamponada, soro fisiológico 0,4%, glicina 0,3% ou suspensões aquosas, podem conter o composto ativo misturado com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas. Tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes dispersantes ou hhumidificantes podem ser uma fosfatida de ocorrência natural, por exemplo, lecitina ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo, estearato de polioxietileno ou produtos de condensação de óxido de etileno com alcoóis alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetil- eneoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol, por exemplo, monooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo, monooleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo, etil, ou n-propil, p- hidroxibenzoato.
As composições de molécula de ligação podem ser liofilizadas para armazenamento, e reconstituídas em um veículo adequado, antes de serem utilizadas. Essa técnica demonstrou ser eficaz com imunoglobulinas convencionais. Qualquer técnica de liofilização e reconstituição adequada pode ser empregada. Será observado por aqueles habilitados na técnica que a liofilização e a reconstituição podem produzir graus variáveis de perda de atividade do anticorpo, e os níveis de uso podem ser ajustados para compensar. Pós e grânulos dispersíveis adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água fornecem o composto ativo misturado com um agente dispersante ou humidificante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou hhumidificantes e agentes de suspensão adequados são exemplificados por aqueles já mencionados anteriormente. A concentração de molécula de ligação nessas formulações pode variar amplamente, por exemplo, de menos de cerca de 0,5%, normalmente a ou pelo menos cerca de 1% alcançando até 15 ou 20% por peso, e será selecionada primariamente com base nos volumes de líquido, viscosidades etc., de acordo com o modo de administração em particular selecionado. Dessa forma, uma composição farmacêutica típica para injeção parenteral poderia ser constituída para conter 1 ml de água tamponada estéril e 50 mg de anticorpo. Uma composição típica para infusão intravenosa poderia ser constituída para conter 250 ml de solução de Ringer estéril e 150 mg de anticorpo. Métodos atuais para a preparação de composições administráveis por via parenteral são conhecidos ou ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica, e são descritos com mais detalhes, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980). Uma dosagem eficaz de anticorpo está dentro da faixa de 0,01 mg a 1.000 mg por kg de peso corporal por administração.
As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma suspensão aquosa estéril injetável, suspensão oleaginosa, dispersões ou pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida com o uso daqueles agentes dispersantes ou humidificantes e agentes de suspensão adequados que foram mencionados anteriormente. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente atóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. O veículo pode ser um meio solvente ou de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhantes), mistura adequadas destes, óleos vegetais, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um meio solvente ou de suspensão. Para essa finalidade, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, por exemplo, ácido oléico, podem ser usados na preparação de injetáveis.
Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida a ponto de permitir uma fácil introdução em seringas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, por exemplo, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário, no caso de dispersão, e pelo uso de tensioativos. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e estocagem, e deve ser preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser produzida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser produzida com o uso, nas composições, de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Composições úteis para administração podem ser formuladas com intensificadores da captação ou da absorção para aumentar sua eficácia. Esses intensificadores incluem, por exemplo, salicilato, glicocolato/linoleato, glicolato, aprotinina, bacitracina, SDS, caprato e semelhantes. Veja, por exemplo, Fix (J. Pharm. Sei., 85: 1.282-1.285, 1996) e Oliyai e Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 521- 544, 1993).
Além disso, as propriedades de hidrofilicidade e hidrofobicidade das composições contempladas para uso na invenção são bem equilibradas, aumentando, dessa forma, sua utilidade para usos tanto in vitro quanto, especialmente, in vivo, enquanto outras composições que não possuem esse equilíbrio têm uma utilidade substancialmente menor. Especificamente, as composições contempladas para uso na invenção possuem um grau apropriado de solubilidade em meios aquosos que permite a absorção e biodisponibilidade no corpo, ao mesmo tempo em que também possuem um grau de solubilidade em lipídeos que permite que os compostos atravessem a membrana celular até um suposto local de ação. Dessa forma, as composições de anticorpo contempladas são maximamente eficazes quando podem ser liberadas no local da atividade antigênica-alvo.
Num aspeto, os métodos da invenção incluem uma etapa de administração de uma composição de molécula de ligação.
Os métodos da invenção são realizados com o uso de qualquer meio medicamente aceito para a introdução de uma substância terapêutica direta ou indiretamente em um indivíduo mamífero, incluindo, sem limitação, injeções, ingestão oral, administração intranasal, tópica, transdérmica, parenteral, pulverizador de inalação, administração vaginal ou retal. 0 termo "parenteral", como aqui usado, inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares e intracisterna, além de cateter ou técnicas de infusão. A administração por injeção intradérmica, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica em um local especifico também é contemplada.
Em uma forma de realização, a administração é realizada no local de um cancro ou tecido afetado que necessita de tratamento por injeção direta no local ou por meio de liberação sustentada ou por um mecanismo de liberação sustentada, que pode liberar a formulação internamente. Por exemplo, microesferas ou cápsulas biodegradáveis ou outras configurações de polímero biodegradável capaz de liberação sustentada de uma composição (por exemplo, um polipeptídeo, anticorpo ou pequena molécula solúvel) podem ser incluídas nas formulações da invenção, implantadas próximo ao cancro.
Composições terapêuticas também podem ser liberadas ao paciente em múltiplos locais. As administrações múltiplas podem ser administradas simultaneamente, ou podem ser administradas ao longo de um período de tempo. Em certos casos, é benéfico fornecer um fluxo contínuo da composição terapêutica. A terapia adicional pode ser administrada em um intervalo determinado, por exemplo, de hora em hora, diariamente, semanalmente ou mensalmente.
As composições de molécula de ligação da invenção podem compreender uma, ou podem compreender mais de uma molécula de ligação. Também é contemplada pela presente invenção a administração de composições de molécula de ligação em conjunto com um segundo agente. Os segundos agentes contemplados pela invenção serão listados em parágrafos abaixo.
Um segundo agente pode ser uma molécula associada à célula B. Outras moléculas associadas à célula B contempladas pela invenção incluem moléculas de ligação que se ligam às moléculas de superfície das células B que não sejam CD3 7 ou CD20. Moléculas associadas às células B incluem, sem limitação, CD19 (antígeno de linfócito B CD19, também denominado antígeno de superfície de linfócito B B4, ou Leu-12), CD21, CD22 (recetor de célula B CD22, também denominado
Leu-14, molécula de adesão celular de linfócito B, ou BL-CAM) , CD23, CD40 (antígeno de superfície de célula B CD40, também denominado membro 5 da superfamília do recetor do Fator de Necrose Tumoral, recetor CD40L, ou Bp50), CD80 (antígeno de ativação de linfócito T CD80, também denominado antígeno de ativação B7-1, B7, B7-1, ou BB1), CD86 (antígeno de ativação de linfócito T CD86, também denominado antígeno de ativação B7-2, B70, FUN-1 ou BU63), CD13 7 (também denominado membro 9 da superfamília do recetor do Fator de Necrose Tumoral), CD152 (também denominado proteína 4 de linfócito T citotóxico ou CTLA-4), L6 (antígeno associado a tumores L6, também denominado membro 1 da superfamília Transmembrana 4, marcador do componente de superfície da membrana 1, ou M3S1), CD3 0 (antígeno de ativação de linfócitos CD30, também denominado membro 8 da superfamília do recetor do Fator de Necrose Tumoral, recetor CD30L, ou Ki-1), CD50 (também denominado molécula de adesão intercelular-3 (ICAM3) ou ICAM-R), CD54 (também denominado molécula de adesão intercelular-1 (ICAM1), ou recetor de rinovírus do grupo principal), B7- Hl (ligante para um recetor imunoinibidor expresso por células T ativadas, células B e células mielóides, também denominado PD-L1; veja Dong, e cols., "B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion", Na t.
Med., 5: 1.365-1.369 (1999)), CD134 (também denominado membro 4 da superfamília do recetor do Fator de Necrose Tumoral, 0X4 0, recetor 0X40L, antígeno ACT35, ou recetor 1 de glicoproteína ativada por transcrição por TAX), 41BB (recetor de ligante 4-1BB, antígeno de célula T 4-1BB, ou antígeno de célula T ILA), CD153 (também denominado membro 8 da superfamília do ligante do Fator de Necrose Tumoral, ligante CD3 0 ou CD3 0- L), CD154 (também denominado membro 5 da superfamília do ligante do Fator de Necrose Tumoral, proteína de ativação relacionada ao TNF, TRAP ou antígeno de célula T Gp39) e recetores Toll. A lista acima de alvos de construção e/ou antígenos-alvo é apenas exemplar e não é definitiva.
Citocinas e fatores de crescimento são segundos agentes contemplados pela invenção e incluem, sem limitação, um ou mais de TNF, IL-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL—11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietina, fator de célula-tronco, eeritropoietina. Composições farmacêuticas de acordo com a invenção também podem incluir outras angiopoietinas conhecidas, por exemplo, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y e/ou o polipeptídeo humano semelhante a angiopoietina e/ou fator de crescimento vascular endotelial (VEGF). Fatores de crescimento para uso em composições farmacêuticas da invenção incluem angiogenina, proteína óssea morfogênica-1, proteína óssea morfogênica-2, proteína óssea morfogênica-3, proteína óssea morfogênica-4, proteína óssea morfogênica-5, proteína óssea morfogênica-6, proteína óssea morfogênica-7, proteína óssea morfogênica-8, proteína óssea morfogênica-9, proteína óssea morfogênica-10, proteína óssea morfogênica-11, proteína óssea morfogênica-12, proteína óssea morfogênica-13, proteína óssea morfogênica-14, proteína óssea morfogênica-15, recetor IA de proteína óssea morfogénica, recetor IB da proteína óssea morfogénica, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator neurotrófico ciliar, recetor a do fator neurotrófico ciliar, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocina 1, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocina 2a, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocina 2β, fator de crescimento de células endoteliais β, endotelina 1, fator de crescimento epidérmico, atrativo de neutrófilos derivado de células epiteliais, fator de crescimento de fibroblastos 4, fator de crescimento de fibroblastos 5, fator de crescimento de fibroblastos 6, fator de crescimento de fibroblastos 7, fator de crescimento de fibroblastos 8, fator de crescimento de fibroblastos 8b, fator de crescimento de fibroblastos 8c, fator de crescimento de fibroblastos 9, fator de crescimento de fibroblastos 10, fator de crescimento de fibroblastos ácido, fator de crescimento de fibroblastos básico, recetor do fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais al, recetor do fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais a2, proteína relacionada ao crescimento, proteína relacionada ao crescimento α proteína relacionada ao crescimento β, proteína relacionada ao crescimento γ, fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina, fator de crescimento de hepatócitos, recetor do fator de crescimento de hepatócitos, fator de crescimento semelhante a insulina-I, recetor do fator de crescimento semelhante a insulina, fator de fator de crescimento semelhante a insulina II, proteína de ligação do fator de fator de crescimento semelhante a insulina, fator de crescimento de ceratinócitos, fator inibidor de leucemia, recetor do fator inibidor de leucemia a, fator de crescimento de nervos, recetor do fator de crescimento de nervos, neurotrofina-3, neurotrofina-4, fator de crescimento placentário, fator de crescimento placentário 2, fator de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas, fator de crescimento derivado de plaquetas, cadeia de fator de crescimento derivado de plaquetas A, fator de crescimento derivado de plaquetas AA, fator de crescimento derivado de plaquetas AB, cadeia de fator de crescimento derivado de plaquetas B, fator de crescimento derivado de plaquetas BB, recetor a de fator de crescimento derivado de plaquetas, recetor α de fator de crescimento derivado de plaquetas β, fator estimulante do crescimento de pré-células B, fator de célula-tronco, recetor do fator de célula-tronco, fator de transformação de crescimento a, fator de transformação de crescimento β, fator de transformação de crescimento βΐ, fator de transformação de crescimento β1,2, fator de transformação de crescimento β2, fator de transformação de crescimento β3, fator de transformação de crescimento β5, fator de transformação de crescimento latente βΐ, proteína de ligação I do fator de transformação de crescimento β, proteína de ligação II do fator de transformação de crescimento β, proteína de ligação III do fator de transformação de crescimento β, recetor do fator de necrose tumoral do tipo I, recetor do fator de necrose tumoral do tipo II, recetor do ativador de plasminogênio do tipo uroquinase, fator de crescimento vascular endotelial e proteínas quiméricas e fragmentos biológicos ou imunologicamente ativos destes.
Exemplos de agentes quimioterápicos contemplados como segundos agentes incluem, sem limitação, agentes alquilantes, tais como mostardas nitrogenadas (por exemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan e clorambucil); nitrosouréias (por exemplo, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (metil-CCNU)); etilenoiminas e metil-melaminas (por exemplo, trietilenomelamina (TEM), trietileno tiofosforamida (tiotepa) e hexametilmelamina (HMM, altretamina)); sulfonatos de alquila (por exemplo, bussulfan); e triazinas (por exemplo, dacabazina (DTIC)); antimetabólitos, tais como análogos de ácido fólico (por exemplo, metotrexato, trimetrexato, e pemetrexed (antifolato multidirecionado)); análogos de pirimidina (por exemplo, 5-fluoruracil (5-FU), fluordesoxiuridina, gemcitabina, citosina arabinosida (AraC, citarabina), 5-azacitidina, e 2,2'-difluordesoxicitidina); e análogos de purina (por exemplo, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA)); inibidores da topoisomerase do Tipo I, por exemplo camptotecina (CPT), topotecan e irinotecan; produtos naturais, tais como epipodofilotoxinas (porexemplo, etoposida e teniposida); e alcaloides da vinca (por exemplo, vinblastina, vincristina e vinorelbina), antibióticos anti-tumorais, tais como actinomicina D, doxorrubicina e bleomicina; radiossensibilizantes, tais como 5-bromodesoxiuridina, 5-iododesoxiuridina e bromodesoxicitidina; complexos de coordenação de platina, tais como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina; uréias substituídas, por exemplo, hidroxiuréia; e derivados de metilhidrazina como, por exemplo, N-metilhidrazina (MIH) e procarbazina.
Exemplos não limitantes de agentes quimioterápicos, agentes radioterápicos e outros agentes ativos e agentes secundários também são mostrados na Tabela 1. TABELA 1
Agentes alquilantes Produtos Naturais
Mostardas nitrogenadas Medicamentos antimicóticos mecloretamina ciclofosfamida ifosfamida Taxanos paclitaxel melfalan alcaloides da Vinca clorambucil vinblastina (VLB) vincristina
Nitrosouréias carmustina (BCNU) vinorelbina lomustina (CCNU) Taxotere® (docetaxei) semustina (metil-CCNU) estramustina fosfato de estramustina
Etileneimina/Meti 1-melamina trietilenomelamina (TEM) trietileno tiofosforamida Epipodofilotoxinas (tiotepa) Etoposida
Teniposida hexametilmelamina (HMM, altretamina)
Antibióticos actimomicina D
Sulfonatos de alquila daunomicina (rubido-micina)
Busulfan doxorrubicina (adria-micina) mitoxantroneidarrubicina Triazinas bleomicina dacarbazina (DTIC) esplicamicina (mitramicina) mitomicina
Antimetabólicos dactinomicina
Análogos de ácido fólico afidicolina metotrexato
Trimetrexato Enzimas
Pemetrexed (antifolato L-asparaginase multidirecionado) L-arginase
Analógos de pirimidina Radiosensibilizadores 5-fluorouracil metronidazol fluorodeoxiuridina misonidazole gemcitabina desmetilmisonidazole citosina-arabinósido (AraC, citarabina) pimonidazole etanidazole 5- azacitidina nimorazole 2,2'- difluorodeoxi-citidina RSU 1069 E0 9
Análogos de purina RB 6145 6- mercaptopurina SR4233 6-tioguanina nicotinamida azatioprina 5-bromodeozyuridine 2'-desoxicoformicina 5-iododesoxiuridina (pentostatina) bromodesoxicitidina
eritrohidroxinoni1-adenina (EHNA 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA) Agentes variados
Complexos de coordenação de platina cisplatina
Carboplatina
Inibidores da topoisomerase oxaliplatina
Tipo I camptotecina Antracenedione
Ureia substituída
Modificadores da resposta Hidroxiureia biológica
G-CSF GM-CSF Derivados de metilhidrazina N-metilhidrazina(MIH)
Agentes de diferenciação procarbazina
Supressores adrenocorticais
Derivados do ácido retinóico supressor adrenocortical
Hormónios e antagonistas mitotano (o, p'-DDD)
Adrenocorticóides/antagonistas aminoglutetimida prednisona e equivalentes dexametasona Citocinas aminoglutetimida interferon (α, β, γ) interleucina-2
Progestinas
Caproato de Hidroxiprogesterona Fotossensibilizantes
Acetato medroxiprogesterona Derivados de hematoporfirina acetato de megestrol Photofrin® derivados de benzoporfirina Estrógenos Npe6
Dietilestilbestrol estanho de etioporfirina(SnET2)
Etinil estradiol/equivalentes feoborida-a bacterioclorofila-a
Antiestrôqenios naftalocianinas
Tamoxifen ftalocianinas ftalocianinas de zinco
Androqênios propionato de testosterona Radiação
fluoximesterona/equivalentes Raios X
Luz ultravioleta
Antiandroqénios Radiação qama flutamida Luz visível libertadora de qonadotropina radiação infravermelha análoqos da hormona radiação de micro-ondas leuprolide
Antiandroqênicos não esteroides flutamida
Os segundos agentes contemplados pela invenção para o tratamento de doenças autoimunes são denominados agentes imunossupressores, que atuam para suprimir ou mascarar o sistema imunológico do indivíduo tratado. Agentes imunossupressores incluem, por exemplo, fármacos anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs), analgésicos, glucocorticoides, fármacos antirreumáticos modificadores de doença (DMARDs) para o tratamento de artrite ou modificadores da resposta biológica. Composições na descrição de DMARD também são úteis no tratamento de várias outras doenças autoimunes além de AR. NSAIDs exemplares são escolhidos do grupo que consiste em ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inibidores da Cox-2, tais como Vioxx e Celebrex e sialilatos. Analgésicos exemplares são escolhidos do grupo que consiste em acetaminofeno, oxicodona, tramadol de cloridrato de propoxifeno. Glicocorticóides exemplares são escolhidos do grupo que consiste em cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona ou prednisona. Modificadores da resposta biológica exemplares incluem, sem limitação, moléculas dirigidas contra marcadores da superfície celular (por exemplo, CD4, CD5 etc.), inibidores de citocina, tais como os antagonistas do TNF (por exemplo, etanercept (Enbrel), adalimumab (Humira) e infliximab (Remicade)), inibidores de quimiocina e inibidores de moléculas de adesão. Os modificadores da resposta biológica incluem anticorpos monoclonais, bem como formas recombinantes de moléculas. DMARDs exemplares incluem, sem limitação, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Ouro [oral (auranofin) e intramuscular] e minociclina.
Contempla-se que a composição de molécula de ligação e do segundo agente pode ser dada simultaneamente na mesma formulação. Alternativamente, os agentes são administrados em uma formulação separada, mas concomitantemente, com concomitantemente referindo-se aos agentes dados com um intervalo de até 3 0 minutos entre eles.
Em outro aspeto, o segundo agente é administrado antes da administração da composição de molécula de ligação. Antes da administração refere-se à administração do segundo agente em um intervalo de até uma semana antes do tratamento com o anticorpo, até 3 0 minutos antes da administração do anticorpo. Contempla-se ainda que o segundo agente é administrado subsequente à administração da composição de molécula de ligação. Administração subsequente visa a descrever a administração de 30 minutos após o tratamento com anticorpo até uma semana após a administração do anticorpo.
Contempla-se ainda que, quando a molécula de ligação for administrada em combinação com um segundo agente, em que o segundo agente é uma citocina ou um fator de crescimento, ou um agente quimioterápico, a administração também poderá incluir o uso de um agente radioterápico ou radioterapia. A radioterapia administrada em combinação com um anticorpo composição é administrada da forma determinada pelo médico responsável, e nas doses tipicamente administradas a pacientes em tratamento de cancro.
As quantidades de molécula de ligação em certa dose irão variar de acordo com o tamanho do indivíduo que recebe a administração da terapia, bem como com as características do distúrbio tratado. Em tratamentos exemplares, pode ser necessário administrar cerca de 1 mg/dia, cerca de 5 mg/dia, cerca de 10 mg/dia, cerca de 20 mg/dia, cerca de 50 mg/dia, cerca de 75 mg/dia, cerca de 100 mg/dia, cerca de 150 mg/dia, cerca de 200 mg/dia, cerca de 250 mg/dia, cerca de 500 mg/dia ou cerca de 1.000 mg/dia. As doses também podem ser administradas com base no peso paciente, em uma dose de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg. Em uma forma de realização relacionada, a molécula de ligação pode ser administrada em uma faixa de dose de cerca de 0,015 a cerca de 3 0 mg/kg. Em uma forma de realização adicional, a molécula de ligação é administrada em uma dose de cerca de 0,015, cerca de 0,05, cerca de 0,15, cerca de 0,5, cerca de 1,5, cerca de 5, cerca de 15 ou cerca de 30 mg/kg.
Essas composições podem ser administradas em uma dose única ou em várias doses. Estudos padronizados de dose-resposta, inicialmente em modelos animais e depois em; testes clinicos, revelam dosagens ótimas para estados de doença e populações de pacientes específicos. A administração da composição de molécula de ligação diminui a população de células B em pelo menos 2 0% após a dose única de tratamento. Em uma forma de realização, a população de células B é diminuída em pelo menos cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90 ou cerca de 100%. A redução de células B é definida como uma diminuição na contagem absoluta de células B abaixo do limite inferior da faixa normal. A recuperação de células B é definida como o retorno da contagem absoluta de células B a um dos seguintes: 70% do valor basal ou faixa normal do indivíduo. A administração de moléculas de ligação específicas para CD20 também resulta em aumento da apoptose em subconjuntos específicos de células B. Apoptose refere-se á introdução da morte celular programada de uma célula, manifestada e avaliada por fragmentação de ADN, encolhimento da célula, fragmentação celular, formação de vesículas na membrana ou alteração da composição lipídica da membrana, avaliada por coloração com anexina V.
Além disso, a administração de composições de molécula de ligação da invenção resulta na produção de efeitos clínicos desejados na doença ou distúrbio tratado. Por exemplo, em pacientes que possuem artrite reumatoide, em um aspeto, a administração melhora a condição do paciente em uma quantidade clinicamente significativa [por exemplo, alcança a "American College of Rheumatology Preliminary Detection of Improvement" (ACR20)] e/ou em uma melhora de 2 0% da sensibilidade e do edemas articulares e uma melhora de 20% nos 3/5 das medidas ACR restantes (Felson e cols., Arthritis Rheum. 1995, 38: 727-35). Medidas biológicas para melhora em um paciente com AR após a administração de moléculas de ligação especificas para CD37 e especificas para CD20 incluem a medida das alterações dos niveis de citocina, medidos através dos niveis de proteína ou ARN. Citocinas de interesse incluem, sem limitação, TNF-α, IL- 1, interferons, Blys e APRIL. Alterações da citocina podem ser causadas por números reduzidos de células B ou diminuição de células T ativadas. Em pacientes com AR, marcadores relevantes para o turnover ósseo (reabsorção ou erosão ósseas) são medidos antes e depois da administração de moléculas de ligação específicas para CD20. Marcadores relevantes incluem, sem limitação, fosfatase alcalina, osteocalcina, fragmentos da degradação de colagénio, hidroxiprolina, fosfatase ácida resistente a tartarato e ligante de RANK (RANKL). Outros indicadores relevantes para a melhora da AR incluem a medida dos níveis de proteína C-reativa (CRP), velocidade de hemossedimentação (VHS), fator reumatoide, anticorpos CCP (peptídeo cíclico citrulinado) e avaliação dos níveis sistémicos de células B e contagem de linfócitos através de citometria de fluxo. Fatores específicos também podem ser medidos a partir da sinóvia de pacientes com AR, incluindo avaliação dos níveis de células B na sinóvia de biópsia sinovial, níveis de RANKL e outros fatores e citocinas ósseos apresentados acima.
Em um aspeto relacionado, os efeitos da administração da combinação sobre outras doenças são medidos de acordo com padrões conhecidos na técnica. Por exemplo, contempla-se que pacientes com doença de Crohn tratados de acordo com a invenção obtêm uma melhora no índice de Atividade da Doença de Crohn (CDAI) na faixa de cerca de 50 a cerca de 70 unidades, em que a remissão se situa em 150 unidades (Simonis e cols., Scand. J Gastroent. 1998, 33: 283-8). Uma pontuação de 150 ou 200 é considerada normal, enquanto uma pontuação de 450 é considerada uma pontuação da doença grave. Deseja-se ainda que a administração das moléculas de ligação específicas para CD37 e específicas para CD20 resulte em uma redução em anticorpo perinuclear anti- neutrófilos (pANCA) e anticorpo anti-Saccharomyces cervisiae (ASCA) em indivíduos que sofrem de doença inflamatória do intestino.
Contempla-se ainda que pacientes adultos e jovens com miosite tratados de acordo com a invenção obtêm uma melhora no conjunto central de avaliações, por exemplo, 3 de 6 dos indicadores do conjunto central medido melhoraram em aproximadamente 20%, com piora de no máximo 2 dessas medidas de indicadores centrais em aproximadamente 25% (veja Rider e cols., Arthritis Rheum. 2004, 50: 2.281-90) .
Contempla-se ainda que pacientes com LES tratados de acordo com a invenção obtêm uma melhora na pontuação pela Medida de Atividade do Lúpus Sistémico (SLAM) ou pelo índice de Atividade de Doença por LES (SLEDAI) de pelo menos 1 ponto (Gladman e cols., J. Rheumatol. 1994, 21: 1.468-71) (Tan e cols., Arthritis Rheum. 1982, 25: 1.271-7). Uma pontuação SLAM >5, ou pontuação SLEDAI >2, é considerada doença clinicamente ativa. Uma resposta ao tratamento pode ser definida como melhora ou estabilização pelas 2 medidas de atividade da doença (o indice de Atividade de Doença por LES [ SLEDAI] e a Medida de Atividade do Lúpus Sistémico) e 2 medidas da qualidade de vida (avaliação global do paciente e a Escala de Gravidade de Fadiga de Krupp) (Petri e cols., Arthritis Rheum. 2004, 50: 2.858-68). Contempla-se ainda que a administração da molécula de ligação a pacientes com LES resulte em uma redução em anticorpos anti-ADN de fita dupla. Alternativamente, a melhora pode ser estimada com a utilização dos Critérios do Grupo de Avaliação do Lúpus das Ilhas Britânicas (BILAG).
Contempla-se ainda que pacientes com esclerose múltipla tratados de acordo com a invenção obtêm uma melhora da pontuação clinica na escala do estado de Incapacidade Expandida de Kurtzke (EDSS) (Kurtzke, F., Neurology 1983, 33: 1.444-52) de pelo menos 0,5, ou um retardo na piora da doença clinica de pelo menos 1,0 na escala de Kurtzke (Rudick e cols., Neurology 1997, 49: 358- 63).
Contempla-se ainda que pacientes que sofrem de MII que recebem moléculas de ligação especificas para CD37 e especificas para CD20 obtêm uma redução em pelo menos um de cinco critérios apresentados na avaliação dos Critérios para Miopatia Inflamatória Idiopática (IIMC) (Miller, F., supra). Contempla-se ainda que a administração a pacientes com MII resulte em uma redução dos fatores associados à MII selecionados do grupo que consiste em creatina quinase (CK) , lactato desidrogenase, aldolase, proteína C-reativa, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), e auto-anticorpo antinuclear (ANA), anticorpos específicos para miosite (MSA), e anticorpo para antígenos nucleares passíveis de extração. Alternativamente, os pacientes atingem 3 de 6 dos critérios apresentados em Rider e cols., Arthritis Rheum., 5 0 (7):2.281-2.290 (2004), com piora em no máximo 2 critérios.
Em algumas modalidades, pacientes gue sofrem de um cancro de células B recebem tratamento de acordo com a invenção, e demonstram uma resposta benéfica global ao tratamento, com base em critérios clínicos bem conhecidos e comumente usados na técnica, e como descrito abaixo, por exemplo, uma diminuição do tamanho do tumor, diminuição do número de tumores e/ou uma melhora dos sintomas da doença.
Critérios clínicos exemplares são fornecidos pelo "U.S. National Cancer Institute" (NCI), gue dividiu algumas das classes de cancroes nas categorias clínicas de linfomas "indolentes" e "agressivos". Linfomas indolentes incluem linfomas de célula folicular, separados em "graus" citológicos, linfoma linfocítico difuso pequeno/leucemia linfocítica crónica (CLL), macroglobulinemia linfoplasmocitóide/de Waldenstrom, linfoma de zona marginal e leucemia de célula pilosa. Linfomas agressivos incluem linfoma difuso de células mistas e grandes, linfoma de Burkitt/linforna difuso de célula pequena não clivada, linfoma linfoblástico, linfoma de célula do manto e linfoma relacionado à AIDS. Em alguns casos, o índice Prognóstico Internacional (IPI) é usado nos casos de linfoma agressivo e folicular. Fatores que devem ser considerados no IPI incluem a idade (<60 anos de idade versus >6 0 anos de idade) , lactato desidrogenase sérica (níveis normais versus elevados), estado do desempenho (0 ou 1 versus 2-4) (veja definição abaixo), estágio da doença (I ou II versus III ou IV) e o envolvimento de local extranodal (0 ou 1 versus 2-4) . Pacientes com 2 ou mais fatores de risco possuem uma probabilidade menor do que 50% de Sobrevivência sem recidivas e global em 5 anos. O estado do desempenho no IPI agressivo é definido da seguinte forma: Descrição do Grau: 0 Totalmente ativo, capaz de realizar todo o desempenho pré-doença, restrições; IRestrito em atividades fisicamente extenuantes, mas ambulatório e capaz de realizar trabalho de natureza leve ou sedentária, por exemplo, trabalho doméstico leve, trabalho de escritório; 2 Ambulatório e capaz de realizar os cuidados pessoais, mas incapaz de realizar quaisquer atividades de trabalho, até e em torno de 50% das horas de vigília; 3 Capaz apenas de efetuar ou cuidados pessoais, confinado ao leito ou à cadeira em mais de 50% das horas de vigília; 4 Completamente incapaz, incapaz de realizar os cuidados pessoais, totalmente confinado ao leito ou à cadeira; 5e, Morto (veja, "The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project. A predictive model for aggressive Non-Hodgkin's Lymphoma". N. Engl. J. Med. 329: 987-94, 1993) .
Tipicamente, o grau de linfoma é avaliado clinicamente com o uso do critério de que linfoma de grau baixo normalmente se apresenta como uma doença nodal, e é frequentemente indolente ou de crescimento lento. A doença de grau intermediário e elevado normalmente se apresenta como uma doença bem mais agressiva, com grandes tumores volumosos extranodais. O sistema de classificação de Ann Arbor também é usado para medir a progressão de tumores, especialmente do linfoma não Hodgkins. Nesse sistema, os estágios I, II, III e IV do adulto NHL pode ser classificado nas categorias A e B, dependendo de se o paciente tem sintomas generalizados bem definidos (B) ou não (A) . A designação B é dada a pacientes com os seguintes sintomas: perda inexplicada de mais de 10% do peso corporal nos 6 meses antes do diagnóstico, febre inexplicada com temperaturas acima de 38°C e suores noturnos abundantes. As definições dos estágios são as seguintes: Estágio I-envolvimento da região de um único linfonodo, ou envolvimento localizado de um único órgão ou local extralinfático. Estágio II- envolvimento de duas ou mais regiões de linfonodo do mesmo lado do diafragma, ou envolvimento localizado de um único órgão ou local extralinfático associado e de seus linfonodos regionais, com ou sem outras regiões de linfonodos do mesmo lado do diafragma. Estágio III- envolvimento de regiões de linfonodos em ambos os lados do diafragma, possivelmente envolvimento localizado associado de um órgão ou local extralinfático, envolvimento do baço, ou ambos. Estágio IV envolvimento disseminado (multifocal) de um ou mais locais extralinfáticos, com ou sem envolvimento associado de linfonodos ou envolvimento isolado de órgão extralinfático, com envolvimento nodal distante (não regional). Para mais detalhes, veja "The International Non- Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project: A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma", New England J. Med. (1993) 329: 987-994 .
Em um aspeto, um efeito terapêutico dos métodos de acordo com a invenção é determinado pelo nível de resposta, por exemplo, uma resposta parcial é definida como redução tumoral a menos da metade de seu tamanho original. Uma resposta completa é definida como a eliminação total da doença, confirmada por avaliação clínica ou radiológica. Em uma forma de realização, o indivíduo que recebe o tratamento de acordo com a invenção demonstra pelo menos uma resposta parcial ao tratamento.
De acordo com os critérios de Cheson para avaliação de linfoma não Hodgkin desenvolvidos em colaboração com o "National Cancer Institute" (Cheson e cols., J. Clin. Oncol. 1999, 17: 1.244; Grillo-Lopez e cols., Ann. Oncol. 2000, 11: 399-408), uma resposta completa é obtida quando há um desaparecimento completo de todas as evidências clínicas e radiográficas detectáveis de doença e de sintomas relacionados à doença, todos linfonodos retornaram 7 ao tamanho normal, o baço regrediu de tamanho e a medula óssea não possui linfoma.
Uma resposta completa não confirmada é obtida quando um paciente exibe desaparecimento completo da doença e o baço regride de tamanho, mas os linfonodos regridem mais de 75% e a medula óssea é indeterminada. Uma resposta completa não confirmada preenche e excede os critérios para resposta parcial. Uma resposta global é definida como uma redução de pelo menos 50 por cento na carga tumoral global.
Critérios similares foram desenvolvidos para várias outras formas de cancros ou doenças hiperproliferativas, e são facilmente disponíveis por aqueles habilitados na técnica. Veja, por exemplo, Cheson e cols., Clin. Adv. Hematol. Oncol. 2006, 4:4-5, que descreve critérios para avaliação de CLL; Cheson e cols., J. Clin. Oncol. 2003, 21: 4.642-9, que descreve critérios para AML; Cheson e cols ., Blood 2000, 96: 3.671-4, que descreve critérios para síndromes mielodisplásicas .
Em outro aspeto, uma resposta terapêutica em pacientes que apresentam um cancro de células B manifesta- se como uma progressão mais lenta da doença, comparada com a de pacientes que não recebem a terapia. A medida da progressão mais lenta da doença ou de qualquer um dos fatores acima pode ser realizada com o uso de metodologias bem conhecidas na técnica, incluindo varredura óssea, varredura por TC, varredura com gálio, linfangiograma, MRI, varreduras PET, ultrassom, e semelhantes.
Também ficará evidente que a dosagem pode ser modificada caso sejam administradas substâncias terapêuticas tradicionais em combinação com as substâncias terapêuticas da invenção.
Como um aspeto adicional, a divulgação inclui kits que compreendem um ou mais compostos ou composições úteis nos métodos da invenção, embalados de uma forma que facilite seu uso para a prática dos métodos da invenção. Na modalidade mais simples, um kit como esse inclui um composto ou uma composição aqui descrita como útil para a prática de um método da invenção embalada em um recipiente, por exemplo, uma garrafa ou um vaso lacrado, com um rótulo afixado no recipiente ou incluído na embalagem que descreve o uso do composto ou da composição para a prática do método da invenção. De preferência, o composto ou a composição é embalado em uma forma de dosagem unitária. 0 kit pode ainda incluir um dispositivo adequado para a administração da composição de acordo com uma via de administração preferida, ou para a realização de um ensaio de rastreamento. 0 kit pode incluir um rótulo que descreve o uso da composição de molécula(s) de ligação em um método da invenção. A presente invenção também compreende produtos de fabrico.
Esses artigos compreendem moléculas de ligação especificas para CD37 ou moléculas de ligação especificas para CD37 e especificas para CD20, opcionalmente junto com um veiculo ou diluente farmacêutico, e pelo menos um rótulo que descreve um método de uso das moléculas de ligação de acordo com a invenção. Esses produtos manufaturados também podem opcionalmente compreender pelo menos um segundo agente para administração em conexão com as moléculas de ligação. A presente invenção também reivindica o uso de uma composição que compreende uma molécula de ligação especifica para CD37 ou moléculas de ligação especificas para CD37 e especificas para CD20 na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de uma doença que envolve atividade aberrante de células B.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura IA representa a estrutura da molécula de TRU-016; a Figura 1B mostra os resultados da análise SDS-PAGE, demonstrando que a proteína expressa migra em um Mr de aproximadamente 110 kDa sob condições não redutoras, e de aproximadamente 52 kDa quando submetida às condições redutoras; e a Figura 1C mostra que a molécula de TRU-016 demonstra ligação específica de nível elevado para linfócitos B do sangue periférico humano, e um nível de ligação bem menor para outras subpopulações de células na população diferente de linfócitos B (população CD19- negativa) quando analisada por citometria de fluxo. A Figura 2A-E mostra inibição da ligação por diferentes reagentes dirigidos a CD37. A Figura 3A demonstra a ligação de FITC Clq às formas moleculares de TRU-016 incubadas com células B Ramos no soro humano normal, com e sem fator de veneno de cobra (CVF); a Figura 3B mostra a atividade de CDC de formas moleculares de TRU-016 incubadas com células B Ramos no soro humano normal, com e sem CVF; e a Figura 3C mostra a atividade de CDC de formas moleculares de TRU-016 incubadas com células B Ramos e complemento humano ou de coelho. A Figura 4 mostra os traços de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) HPLC obtidos da purificação de GPC do TRU-016, colocando em um gráfico a absorbância versus o tempo de retenção para as diferentes frações coletadas. A Figura 5A mostra as propriedades de ligação de frações de SEC; a Figura 5B mostra a atividade de CDC de frações de SEC; e a Figura 5C mostra a atividade de ADCC de frações de SEC. A Figura 6 mostra a atividade de CDC de TRU-015, rituxan, TRU-016, ou uma combinação destes, em células B Ramos. A Figura 7 mostra o efeito de TRU-016 sobre a atividade de CDC de TRU-015 em células B DHL-4. A Figura 8 mostra o efeito de TRU-016 sobre a atividade de CDC de TRU-015 e rituxan. A Figura 9 mostra o efeito de TRU-016 em TRU-015 em um ensaio da CDC. A Figura 10 mostra o efeito de TRU-016 em rituxan em um ensaio da CDC. A Figura 11 mostra a interação de TRU-015 e TRU-016 em um ensaio da ADCC usando células BJAB. A Figura 12 mostra a interação de TRU-015 e TRU-016 em um ensaio da ADCC usando células Daudi. A Figura 13 mostra a interação de TRU-015 e TRU-016 em um ensaio da ADCC usando células Ramos. A Figura 14 mostra o efeito de rituxan, TRU-016, e uma combinação destes, sobre a morte especifica de células BJAB. A Figura 15 mostra o efeito de rituxan, TRU-016, e uma combinação destes, sobre a morte especifica de células BJAB. A Figura 16 mostra o efeito de TRU-015, TRU-016, e uma combinação destes, sobre a morte especifica de células BJAB. A Figura 17 mostra o efeito de TRU-015, TRU-016, e uma combinação destes, sobre a morte especifica de células BJAB. A Figura 18A-D mostra que formas diméricas de TRU-016 não medeiam CDC isoladamente, mas potencializam a atividade de CDC de Rituximab in vitro. A Figura 19A-B demonstra que TRU-016 purificado por proteína A induz apoptose de células Ramos e Daudi, enquanto as formas diméricas necessitam de reticulação. A Figura 20 mostra que TRU-016 preferencialmente elimina células B normais de culturas de PBMC. A Figura 21 demonstra a eficácia de TRU-016 comparado com hulgG, rituxan e o tratamento combinado de TRU-016 e rituxan sobre o volume tumoral em animais.
As Figuras 22A e B mostram que formas diméricas de TRU-016 exibem atividade anti-tumoral significativa, medida pelo efeito sobre o volume tumoral e percentual de Sobrevivência em um modelo de autoenxerto tumoral em camundongo. A Figura 23 demonstra que dímeros de TRU-016 não aumentam a atividade de CDC resultante do tratamento com reagentes específicos para MHCII, CD19, CD80/86 ou CD45. A Figura 24 mostra o percentual de Sobrevivência de camundongos com tumores Ramos (até 90 dias) após tratamento com TRU-016, rituximab ou uma combinação destes.
As Figuras 25 e 26 mostram o percentual de Sobrevivência de camundongos com tumores Daudi (até 90 dias) após tratamento com TRU-016 ou rituximab. A Figura 27 mostra que TRU-016 reduziu eficazmente a viabilidade celular relativa em células tratadas com fludarabina potencializando, dessa forma, o efeito citotóxico de fludarabina isoladamente. A Figura 28 mostra que TRU-016 induziu toxicidade celular maior do que herceptina ou rituximab em linhagens celulares resistentes a rituximab. A Figura 29 mostra que TRU-016 induziu fosforilação de tirosina em células B CD19+ primariamente CLL. A Figura 30A mostra a sequência de aminoácidos de consenso da construção humanizada de TRU-016 n° 019001 (ID. DE SEQ. N° : 6) e TRU-016 (ID. DE SEQ. N°: 2) com numeração de Rabat; a
Figura 3 0B mostra os alinhamentos de sequências de aminoácidos de três construções humanizadas de TRU-16 (019001, 019008 e 109009) . A Figura 31 mostra o ADN e alinhamentos de sequências de aminoácidos de três construções humanizadas de TRU-016 (019001, 019041 e 019044). A Figura 32 mostra os alinhamentos de sequências formatados por FASTA das mesmas três construções humanizadas de TRU-016 (019001, 019041 e 019044).
EXEMPLOS
Quaisquer exemplos que não caiam dentro do âmbito da reivindicação são providenciadas apenas para propósitos de comparação. Aspetos e detalhes adicionais da invenção ficarão evidentes a partir dos exemplos seguintes, os quais visam a ilustrá-la, e não limitá-la. 0 Exemplo 1 descreve a produção de uma molécula de ligação específica para CD37; 0 Exemplo 2 demonstra que TRU-016 e vários anticorpos específicos para CD37 reconhecem os mesmos epitopos ou epitopos superpostos; o Exemplo 3 mostra que TRU-016 é deficiente na ligação de Clq e na ativação da via clássica de ativação de complemento; o Exemplo 4 demonstra a atividade e a ligação de multímeros de TRU-016; o Exemplo 5 descreve a produção de uma molécula de ligação específica para CD20; o Exemplo 6 mostra que combinações de TRU-016 com TRU-015 ou rituxan aumentam sinergicamente a apoptose em células B; o Exemplo 7 mostra que combinações de TRU-016 com anticorpos específicos para CD20 ou SMIPs aumentam sinergicamente a CDC; o Exemplo 8 demonstra que TRU-016 aumenta a atividade de ADCC e CDC de anticorpos específicos para CD20 e SMIPS; o Exemplo 9 demonstra que TRU-016 induz apoptose em células B; o Exemplo 10 mostra que combinações de um SMIP específico para CD37 com um anticorpo específico para CD20 reduzem sinergicamente o volume tumoral em um modelo de xenoenxerto tumoral murídeo; o Exemplo 11 mostra que um SMIP específico para CD37 isoladamente também reduz o volume tumoral em um modelo de xenoenxerto tumoral murídeo; o Exemplo 12 demonstra que TRU-016 não afeta a atividade de CDC de outros recetores de superfície de células B; o Exemplo 13 demonstra que TRU-016 não aumenta a atividade de CDC de vários recetores-alvo, incluindo MHCII, CD19, CD80/86 e CD40; o Exemplo 14 fornece dados adicionais que mostram que TRU-016 aumenta a Sobrevivência in vivo em camundongos com tumores; o Exemplo 15 demonstra que TRU-016 potencializa a morte celular induzida por fludarabina em células CLL in vitro; o Exemplo 16 mostra que TRU-016 induz citotoxicidade direta em células resistentes ao rituximab; o Exemplo 17 mostra que TRU-016 induz fosforilação de tirosina em células B CD19+ primariamente CLL; e o Exemplo 18 fornece moléculas humanizadas de TRU-016.
Exemplo 1
Produção de uma molécula de liqação especifica para CD37
SMIPs específicos para CD37 são descritos no Pedido U.S. de co-propriedade N° 10/627.556 e nas Publicações de Patente U.S. Nos 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049. Um SMIP exemplar, TRU-016, é produzido como descrito abaixo. TRU-016 [G28-1 ScFv VH11S (SSC-P) H WCH2 WCH3] é uma proteína recombinante de cadeia única que se liga ao antígeno CD37. O domínio de ligação era baseado na sequência do anticorpo G28-1 revelada previamente nas publicações de patentes listadas no parágrafo precedente, cuja revelação é aqui incorporada por referência. O domínio de ligação está conectado ao domínio efetor, os domínios CH2 e CH3 de IgGl humana, através de uma região de dobradiça modificada. TRU-016 existe como um dímero em solução, e o dímero tem um peso molecular teórico de aproximadamente 106.000 dáltons. O ARN total do hibridoma de G28-1 foi isolado com o uso de reagente de ARN Trizol (Gibco) de acordo com as instruções do fabricante. O cADN foi preparado com o uso de 5 pg ARN, iniciadores aleatórios e Transcriptase Reversa Superscript II (GIBCO BRL) . Os domínios variáveis foram clonados usando pools de iniciadores degenerados para diferentes famílias de gene de VK ou VH murídeo. Os domínios variáveis do hibridoma de G28-1 foram clonados em PCR 2.1 TOPO vetores de clonagem (Invitrogen), e o ADN dos transformantes com insertos de tamanho correto foi sequenciado. Regiões variáveis de cadeia pesada e leve de clones corretos foram então usadas como modelos para a realização de amplificação por PCR de um G28-1 scFv unido na orientação VL-VH com um vinculador 15 aa (gly4ser)3. 0 scFv anti-CD37 foi anexado a uma dobradiça de IgGl humana modificada, domínios de CH2 e CH3 (veja Figura IA) . A fim de assegurar a expressão adequada por células mamíferas, foram selecionadas modificações das regiões variáveis que permitissem aumentos significativos na expressão por células mamíferas. Especificamente, uma leucina foi trocada por uma serina na posição 11 do scFV. 0 peptídeo maduro previsto tem comprimento de 473 aminoácidos. A sequência de polinucleotídeos que codifica TRU-016 e a sequência de aminoácidos de TRU-016 são apresentadas, respetivamente, nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2. TRU-016 foi produzido por tecnologia de ADN recombinante em um sistema de expressão de células mamíferas de ovário de hamster chinês (CHO). As células CHO transfectadas que produzem o SMIP foram cultivadas em um biorreator com o uso de meios proprietários. SMIPs de TRU-016 foram purificados dos sobrenadantes da cultura de CHO por cromatografia de afinidade por Proteína A. Com o uso de dPBS, uma coluna de sefarose rProteína A FF de 50 ml (GE Healthcare rProtein A Sepharose FF, N° de Catálogo 17-0974-04) foi equilibrada a 5,0 mis/min (150 cm/h) para 1,5 volume de coluna (CV). O sobrenadante da cultura foi carregado à coluna rProteína A Sefarose FF em uma taxa de fluxo de 1,7 ml/min usando o AKTA Explorer 100 Air (GE healthcare AKTA Explorer 100 Air, N° de Catálogo 18-1403-00), que captura o TRU-016 recombinante. A coluna foi lavada com dPBS por 5 volumes de coluna (CV), e depois 1,0 M de NaCl, 20 mM de fosfato de sódio, pH 6,0, e depois com 25mM de NaCl, 25 mM de NaOAc, pH 5,0. Essas etapas de lavagem removeram as proteínas da célula CHO hospedeira ligadas inespecificamente da coluna de rProteína A que contribuem para a precipitação de produto após eluição. O TRU-016 recombinante foi eluído da coluna com 100 mM de glicina, pH 3,5. Frações de 10 ml do produto eluído foram recuperadas, e o produto eluído foi então levado até o pH 5,0 com 20% do volume eluído de 0,5 M de ácido 2-(N- morfolino)etanosulfónico (MES) pH 6,0. Esse produto eluído foi preparado para purificação de GPC por concentração da amostra até aproximadamente 25 mg/ml de TRU-016, e depois esterilizado por filtração na preparação para a purificação de GPC. A proteína purificada foi então submetida à, cromatografia por exclusão de tamanho GPC (SEC) para se obter uma purificação adicional da molécula de TRU-016 (dímero) de agregados de maior peso molecular. Com o uso de dPBS, uma coluna XK 50/100 (GE healthcare XK 50/100 cromatografia em coluna vazia, N° de Catálogo 18-8753-01) contendo 1 1 de
Superdex 200 FF sefarose foi equilibrada a 12,6 ml/min (38 cm/h) para 1,5 volume de coluna (CV). Um volume máximo de 54 ml (3% CV) de amostra foi aplicado à coluna. A coluna continuou a ser executada a 12,6 ml/min, e a proteína eluída foi fracionada em frações de 40 ml. Cada fração foi analisada quanto à qualidade do produto com o uso de uma HPLC analítica, e as frações eluídas foram reunidas em pool para TRU-016 com>95% POI (não agregado). Esse pool resultante foi esterilizado por filtração a 0,22 μΜ. O material foi então concentrado e formulado com 20 mM de fosfato de sódio e 24 0 mM de sacarose, com um pH resultante de 6,0. A composição é filtrada antes de ser preenchida em ampolas de vidro em uma concentração de 10 mg/ml. Cada ampola de vidro contém 5 mL de TRU-016 (50 mg/ampola). A proteína de TRU-016 também foi submetida à análise SDS-PAGE em géis Tris-glicina Novex 4-20% (Invitrogen, San Diego, CA). As amostras foram carregadas usando tampão de amostra Tris-glicina SDS Novex (2X) sob condições redutoras (adição de 1/10 volume de agente redutor de amostra NuPAGE) ou não redutoras após aguecimento a 95°C por 3 minutos, seguindo por eletroforese a 150 V por 90 minutos. A eletroforese foi realizada com o uso de tampão de execução Tris-glicina SDS Novex IX (Invitrogen). Os géis foram corados após eletroforese em coloração Coomassie SDS PAGE R-250 por 30 minutos com agitação, e descorados por pelo menos uma hora. O peso molecular previsto do peptídeo maduro é de 51,5 kDa. Sob condições redutoras, a proteína de fusão migra no peso molecular esperado. Sob condições não redutoras, a molécula migra em aproximadamente 150 kDa (Figura 1B).
Também foram realizados ensaios para determinar se a especificidade de ligação do anticorpo original ao recetor de superfície celular de CD37 está preservada em TRU-016. PBMCs humanas foram isoladas sobre gradientes de densidade LSM, e incubadas com TRU-016 não conjugado e CD19 anti-humano conjugado a PE. As células foram lavadas e incubadas com IgG GAH 1:100 FITC (específica para Fc) por 45 minutos no gelo.
As células foram lavadas e analisadas por citometria de fluxo bicolor em um instrumento FACsCalibur usando o programa de computador Cell Quest. As células foram agrupadas em linfócitos B ou não linfócitos B por coloração de CD19.
Com concentrações crescentes de TRU-016, o sinal de FITC nos linfócito B (agrupamento CD19-positivo) aumentou rapidamente de 0,01-1,0 pg/ml, até ter alcançado a saturação em aproximadamente 1 pg/ml ou uma intensidade média de fluorescência (MFI) de 1.000. Em contraste, a coloração da população de não linfócitos B é detetável, mas muito baixa, e aumenta lentamente com concentração crescente de scFvlg. Dessa forma, o padrão de coloração do anticorpo monoclonal G28-1 murídeo é preservado com TRU-016 (Figura 1C).
As moléculas de ligação a CD37 de acordo com a invenção descrevem estruturas (domínios de ligação derivados de anticorpos, variantes de dobradiça, regiões.CH2CH3 iguais ou diferentes, e vários isótopos).
Exemplo 2 TRU-016 e Vários Anticorpos Específicos para CD37 Ligam-se aos Mesmos Epitopos ou a Epitopos Superpostos em CD37
Foram realizados ensaios para identificar o epitopo de CD37 ligado por TRU-016 e por outros anticorpos descritos previamente específicos para CD37. MB371 não conjugado (n° 555457) e MB371 conjugado a FITC (n° 555456) foram obtidos de BD Pharmingen (San Jose, CA), BL14 conjugado a FITC (n° 0457) de Immunotech/Beckman Coulter (Fullerton, CA), NMN46 conjugado a FITC (n° RDI-CBL 136FT) e NMN46 não conjugado (n° RDI-CBL 136) de RDI (Flanders, NJ) , IP024 conjugado a FITC (n° 186-040) e IP024 não conjugado (n° 186-020) de Ancell Corporation (Bayport, MN), HHI conjugado a FITC (n° 3081) e HHI não conjugado (n° 3080) de Diatec.com (Oslo, Noruega) e WR17 conjugado a FITC (YSRTMCA483F) e WR17 não conjugado (YSRTMCA483S) de Accurate Chemical & Scientific (Westbury, NY) . A proteína de TRU-016 foi produzida como descrito no Exemplo 1. TRU-016 foi conjugado a FITC em Trubion com o uso de um Kit "Molecular Probes Fluororeporter FITC Labeling" (F6434) de acordo com as instruções do fabricante da seguinte forma: o pico de interesse da proteína de TRU-016 (POI) a 13,5 mg/ml foi ajustado até 5 mg/ml com PBS. Um mg (200 ui) foi adicionado aos tubos do kit com uma barra de agitação, e 1 M de NaHC03 (ajustado até o pH 8,5 com 6 N de NaOH) foi adicionado até uma concentração final de 0,1 M. Foram adicionados 50 ul de DMSO a 370 ug de FITC, e foram adicionados aos tubos em proporções molares de 15, 20, 30 e 40 de FITC: proteína com o uso da fórmula seguinte para determinar os ul de FITC a serem adicionados: [ul de solução de FITC a serem adicionados = 5 mg/ml de proteína x 0,2 ml x 389 x 100 x proporção molar/peso molecular desejado de TRU-016 (110.000)].
As reações eram protegidas da luz e agitadas continuamente por 75 minutos em temperatura ambiente. As reações foram adicionadas às colunas giratórias preparadas como descrito no kit, e giradas a 1.100 g por 5 minutos para troca de tampão em PBS com azida e remoção do FITC não conjugado. OD a 280 nM e 4 94 nM foi determinada com gotas de 2 ul no Nanodrop; o coeficiente de extinção para TRU-016 foi determinado experimentalmente para esse instrumento por leitura de diluições do SMIP não conjugado de partida, a concentração de cada um dos conjugados foi de 4,25 mg/ml, e foram determinadas as seguintes proporções FITC: proteína: 2,7 FITC/TRU-016 em uma proporção de 15; 3,7 FITC/TRU-016 em uma proporção de 20; 4,4 FITC/TRU-016 em uma proporção de 30; e 5,1 FITC/TRU-016 em uma proporção de 40.
Foi adicionado BSA até 3 mg/ml para ajudar a estabilizar a proteína. A ligação de cada fração foi avaliada em diluições que variam de 100-24.300 x em PBMC Ramos e 3.200-25.600 em PBMC humana. Todas se ligaram, mas a proporção MR3 0 foi escolhida para uso posterior, uma vez que gerou uma MFI elevada que foi mantida ao longo do intervalo de titulação usado, indicando que a avidez de ligação era menos afetada nessa reação.
Os conjugados de anticorpo marcado por FITC foram titulados de 10 ng/ml a 10 pg/ml em um estudo de ligação inicial para determinar as quantidades ótimas para serem usadas nos estudos de bloqueio. O nível escolhido era imediatamente abaixo das quantidades de saturação, e foi mantido constante nos ensaios subsequentes, enquanto os níveis de anticorpo de bloqueio foram aumentados em um intervalo de 10 vezes. Os dados foram colocados em um gráfico como percentual de ligação máxima versus concentração de anticorpo de bloqueio, de forma que niveis maiores indicam bloqueio menos eficiente, enquanto níveis menores indicam atividade de bloqueio mais eficiente. Todos os anticorpos testados mostraram atividade de bloqueio da ligação máxima observada sem reagentes não marcados (Figura 2).
As células BJAB, uma linhagem de célula B de linfoblastóide B (cortesia de Ed Clark, Universidade de Washington), foram então coradas com um painel de vários clones de MAbs anti-CD37, incluindo MB371, BL14, NMN 4 6, IP024, HH1, WR17 e o SMIP de TRU-016.
Para ensaios de ligação competitiva, 2,5 X 105 células BJAB foram incubadas em placas de 96 poços com fundo em "V" em meio de coloração (PBS com soros de camundongo 2%) com os MAbs anti-CD37 conjugados a FITC a 1,25 pg/ml na presença de MAb anti-CD37 não conjugado nas concentrações indicadas (2,5, 1,25, 0,6 ou 0,3 pg/ml) ou meio de coloração por 45 minutos no gelo no escuro. Anticorpos de blogueio e conjugados de anticorpo marcado por FITC foram adicionados às reações, antes da adição de células. As células foram então lavadas 2½ vezes com PBS, e fixadas com paraformaldeído 1% (n° 19943, USB, Cleveland, Ohio). As células foram analisadas por citometria de fluxo com o uso de um instrumento FACsCalibur e o programa de computador Cell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA).
Para o ensaio de bloqueio cruzado de FACs, 2,5 X 105 células BJAB foram incubadas em placas de 96 poços com fundo em "V" em meio de coloração (PBS com soros de camundongo 2%) na presença de MAb anti-CD3 7 não conjugado a 5 pg/ml de meio de coloração por 45 minutos em temperatura ambiente no escuro. MAbs anti-CD37 conjugados a FITC foram então adicionados até uma concentração final de 2 ug/ml, resultando em uma diluição dos reagentes não rotulados até 3,3 yg/ml. As reações foram então adicionalmente incubadas por 45 minutos em temperatura ambiente no escuro. As reações foram lavadas 2,5 vezes com PBS, e fixadas em paraformaldeído 1% em PBS (n° 19943, USB, Cleveland, Ohio). As células foram analisadas por citometria de fluxo em um instrumento FACsCalibur com o uso do programa de computador Cell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA).
Para ensaios de ligação celular, as células foram suspensas em PBS (n° 14040-133, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) contendo FBS 2% (n016140-071, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) (meio de coloração) em uma concentração de aproximadamente 4 x 106 células/ml. As células foram então plaqueadas, e amostras de teste, diluídas em meio de coloração, foram então adicionadas 1:1 até as concentrações finais designadas. As reações foram incubadas por 45 minutos no gelo. As amostras foram centrifugadas e lavadas 2 vezes com PBS. IgG anti-humana de cabra com FITC (n° H10501,CalTag, Burlingame CA) foi adicionada em uma diluição final de 1:50, e incubada 45 minutos no gelo. As amostras foram centrifugadas, lavadas em PBS, e depois fixadas em 200 μΐ paraformaldeído 1% em PBS (n° 19943, USB, Cleveland, Ohio). As células foram analisadas por citometria de fluxo em um instrumento FACs Calibur com o uso do programa de computador Cell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA).
Cada anticorpo mostrou inibição dose-dependente da ligação, indicando que todas as moléculas testadas se ligaram a um epitopo idêntico ou intimamente relacionado. Uma potência diferente para inibição da ligação foi observada para cada anticorpo. SMIP de TRU-016 teve o maior nível de atividade de bloqueio de todas as moléculas testadas, enquanto HH1 gerou um nível intermediário de atividade de bloqueio, e WR17 e IP024 bloquearam melhor do que MB371, mas mostraram bloqueio menos eficaz do que as outras duas moléculas não marcadas (Figura 2).
Além da análise da atividade de bloqueio, uma série similar de ensaios foi realizada, nos quais vários anticorpos dirigidos a CD37 foram testados quanto à sua habilidade para competir uns com os outros pela ligação ao recetor CD37. Os resultados desses ensaios, como os resultados obtidos nos estudos de bloqueio para todas as moléculas testadas, indicaram que os vários anticorpos dirigidos a CD37 e TRU-016 possuem os mesmos epitopos ou epitopos intimamente superpostos.
Exemplo 3 TRU-016 é Deficiente na Ligação de Clq e Ativação da Via Clássica de Ativação de Complemento
Foram realizados ensaios para explorar por que o pico de dimero de TRU-016 não medeia niveis significativos de morte dependente de complemento de células B-alvo. Uma possibilidade era que o dimero de TRU-016 mostra ligação reduzida aos componentes da cascata do complemento em relação ao anticorpo normal de IgGl humana. Dessa forma, foram feitos ensaios para determinar se TRU-016 ativa a via clássica de ativação de complemento verificando-se a ligação de TRU-016 a Clq. Clq é uma subunidade do complexo enzimático Cl que ativa o sistema de complemento sérico, e é o componente de reconhecimento da via clássica de ativação de complemento.
Os estudos de ligação de Clq foram realizados como descrito previamente (Cragg e cols., Blood 2004, 103: 2.738-2.743).
Resumidamente, células B Ramos em meio Iscoves (n° 12440-053, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) sem soro foram plaqueadas em placas de 96 poços com fundo em "V" a 5 X 105 células/poço em 100 μΐ. As células foram incubadas com reagentes por 15 minutos a 37 °C, e soro humano normal (NHS, n° A113, Quidel Corp., San Diego, CA) diluído em Iscoves foi então adicionado em um volume de 50 μΐ a cada poço para uma concentração final de 10, 5, 2,5, ou 1,25% de soro humano. Cinquenta μΐ de meio foram adicionados ao poço de controlo. Para ensaios com fator de veneno de cobra (CVF), CVF foi adicionado a amostras de complemento de soro humano a 2 0 Unidades CVF/ml de soro por 90 minutos a 37°C, antes da adição de soro aos ensaios de complemento, e a diluição de soro por CVF ocorria quando se faziam as diluições da amostra. A fonte de células mais complemento foi incubada por mais 5 minutos a 37°C, e lavada 2 vezes com PBS gelado (n° 14040-133, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) através de centrifugação, e ressuspensa em 100 μΐ de PBS. Cinquenta μΐ de cada poço foram transferidos para uma segunda placa para uma segunda coloração de controlo. Ambas as placas foram coradas por 15 minutos no escuro no gelo, com anti-Clq HU de carneiro com FITC (n° C7850-06A, US Biological, Swampscott, Mass) ou IgG de carneiro com FITC (n° 11904-56P, US Biological, Swampscott, Mass). As amostras foram lavadas, ressuspensas em PBS gelado, e lidas imediatamente em um citômetro de fluxo FACsCalibur e analisadas com o programa de computador Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA). FITC Clq não se liga bem a quaisquer subfrações de TRU-016 purificado por SEC, embora a fração agregada de maior peso molecular (HMW) ou A2 exiba mais ligação do que as outras formas (Figura 3A) . Em contraste, Rituxan mostrou um nível significativo de ligação de Clq, particularmente em níveis menores de NHS. A presença de CVF não bloqueou completamente essa ligação, embora os níveis de MFI estejam significativamente reduzidos comparados com meio isoladamente.
Foram então efetuados ensaios da CDC para comparar a habilidade das diferentes subtrações das formas purificadas de TRU-016 e Rituxan para mediar a morte celular na presença ou ausência de CVF e complemento de soro humano (Figura 3B) . Os ensaios da CDC foram realizados com o uso de coloração com iodeto de propídio para discriminar entre células vivas e mortas após incubações de células-alvo com anticorpo, proteínas de fusão, líquido ascítico, formas moleculares de TRU-016 ou meio, e uma fonte de complemento, por exemplo, soro humano. Resumidamente, 3 x 105 células B Ramos foram pré-incubadas com reagentes de teste por 3 0-45 minutos a 37 °C, antes da adição de complemento. As amostras pré-ligadas foram centrifugadas, lavadas e ressuspensas em Iscoves com soro humano (n° A113, Quidel, San Diego, CA) nas concentrações indicadas, e depois incubadas por 90 minutos a 37°C. As amostras foram lavadas e foi adicionado iodeto de propídio (n° P-16063, Molecular Probes, Eugene, OR) até uma concentração final de 0,5 pg/ml em PBS. As células foram incubadas com o iodeto de propídio por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro, e depois analisadas por citometria de fluxo em um instrumento FACsCalibur com o programa de computador Cell Quest (Becton Dickinson). A morte celular mediada tanto por fração A2 de TRU-016 quanto por Rituxan foi significativamente reduzida na presença de CVF, apesar de seu fracasso em bloquear completamente a ligação de Clq (Figura 3B).
Complemento humano e de coelho foram então comparados quanto à sua atividade de CDC na presença do TRU-016. A atividade de CDC de formas moleculares de TRU-016 incubadas com células B Ramos e complemento humano ou de coelho foi medida (Figura 3C). Células B Ramos foram adicionadas aos poços em meio sem soro. Rituxan ou o dímero, HMW A2, ou as frações pA de TRU-016, foram adicionados às células para gerar uma concentração final de 10 pg/ml, e incubados por 15 minutos a 37°C, antes da lavagem com meio sem soro 1,5X e adição de soro humano normal (NHS) ou complemento de coelho (Pelfreez) a 10, 5 ou 2,5%. A fonte de células mais complemento foi incubada por 90 minutos a 37°C. As células foram lavadas uma vez com PBS gelado, e foi adicionado iodeto de propídio (Molecular Probes n°P3566) até uma concentração final de 0,5 pg/ml em PBS gelado. As células com PI foram incubadas no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos, e analisadas por citometria de fluxo. A origem da fração do complemento afeta os resultados de CDC obtidos (Figura 3C) . O complemento de coelho mediou níveis de CDC maiores do que o complemento humano na presença de formas moleculares de TRU-016. Curiosamente, a forma dimérica do TRU-016 mediou boa CDC com o uso de complemento de coelho, mas atividade de CDC muito baixa na presença de complemento humano.
Exemplo 4
Atividade e ligação de multímeros de TRU-016
Foram realizados ensaios para examinar a atividade biológica de formas multiméricas de TRU-016 (multímeros de TRU-016) em solução. Inicialmente, para determinar o tamanho de proteína de fusão de TRU-016 em solução, o material purificado por proteína A foi analisado por SEC HPLC e revelou que TRU-016 existe em múltiplas formas em solução (Figura 4).
Foram obtidos traços de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) HPLC de purificação de GPC de TRU-016, formando-se um gráfico de absorbância versus tempo de retenção para as diferentes frações coletadas (Figura 4). TRU-016 foi purificado a partir de sobrenadantes de cultura de células inicialmente por cromatografia de afinidade com o uso de Sefarose Proteína A. A molécula recombinante foi eluída da coluna com 100 mM de glicina, pH 3,5. Frações de 10 ml do produto eluído foram recuperadas, e o produto eluído foi levado até o pH 5,0 com 20% do volume eluído de 0,5 M de ácido 2-(N-Morfolino)etanossulfônico (MES), pH 6,0. O eluído foi preparado para purificação de GPC por concentração da amostra até aproximadamente 25 mg/ml de TRU-016, e depois esterilizado por filtração na preparação para a purificação de GPC. A cromatografia por exclusão de tamanho foi realizada em um aparelho GE Healthcare AKTA Explorer 100 Air, usando uma coluna GE healthcare XK e Superdex 20 0 de grau preparatório (GE Healthcare).
Os poços de HMW ou A2 exibiram um tempo de retenção de aproximadamente 6,23 minutos, enquanto a forma mais proeminente exibiu um tempo de retenção de 8,38 minutos. 0 padrão de referência utilizado aqui (padrão pA ou std) é o material purificado por proteína A contendo tanto as formas diméricas quanto multiméricas HMW, como mostrado no primeiro painel da Figura 4. A forma mais proeminente, que migra em um tempo de retenção de 8,38 minutos, mais provavelmente corresponde à molécula dimérica observada em SDS-PAGE não reduzida, e várias formas menores mais provavelmente correspondem aos multimeros que se associam através de interações não covalentes, na medida em que são menos evidentes em SDS-PAGE não redutora. Para separar essas formas diferentes de TRU-016, o material obtido da cromatografia de afinidade com proteína A sefarose dos sobrenadantes da cultura foi adicionalmente purificado por GPC e fracionamento por HPLC para isolar a forma dimérica (identificada como "dímeros" ou "pico de dímeros") dos multimeros de peso molecular mais elevado (identificados como HMW ou fração A2 agg) . Cada uma dessas três subtrações foi então analisada separadamente quanto à atividade funcional in vitro com o uso de ensaios de ligação, da ADCC e da CDC.
Para explorar se as frações isoladas de SEC exibiam diferentes propriedades de ligação, cada fração de TRU-016 SEC foi testada quanto à ligação a células Ramos. Para determinar as propriedades de ligação de frações de SEC, as células foram suspensas em meio de coloração em uma concentração de aproximadamente 4 x 106 células/ml, e depois plaqueadas a 50 μΐ/poço (2 x 105 células/poço) em meio de coloração. Diluições seriais de frações de SEC foram então adicionadas aos poços sequenciais, incubadas por 45 minutos, lavadas, e a atividade de ligação foi detectada com a utilização de IgG anti-humana de cabra com FITC. As amostras foram fixadas em 200 μΐ 1% de paraf ormaldeído em PBS. As células foram analisadas por citometria de fluxo em um instrumento FACsCalibur com o uso do programa de computador Cell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA) (Figura 5A).
Para determinar a atividade de CDC de frações de SEC, as células foram suspensas a 5 x 105 células/poço em 75 μΐ de IMDM. As frações de SEC de TRU-016 (75 μΐ) foram adicionadas às células no dobro das concentrações indicadas. Foi permitido que as reações de ligação prosseguissem por 45 minutos, antes da centrifugação e lavagem em Iscoves sem soro. As células foram ressuspensas em Iscoves com soro humano (n° A113, Quidel, San Diego, CA) nas concentrações indicadas. As células foram incubadas por 60 minutos a 37°C, lavadas e ressuspensas em meio de coloração com 0,5 pg/ml de iodeto de propídio (PI, n° P-16063, Molecular Probes, Eugene OR). As amostras foram incubadas 15 minutos em temperatura ambiente no escuro, antes da análise por citometria de fluxo com o uso de um instrumento FACsCalibur e do programa de computador Cell Quest (Becton Dickinson) (Figura 5B).
Para determinar a atividade de ADCC de frações de SEC, células BJAB, Ramos e linfoblastóides B Daudi (107) foram marcadas com 500 pCi/ml de 51Cr cromato de sódio por 2 horas a 37°C em IMDM/FBS 10%. PBMCs foram isoladas de 20 sangue humano total heparinizado por fracionamento sobre Meio de Separação de Linfócitos (LSM, ICN Biomedical) gradientes. Foram adicionadas amostras de reagente ao meio RPMI com FBS 10%, e foram preparadas cinco diluições seriais para cada reagente. Para combinações, os reagentes foram pré-misturados e diluídos, antes da adição aos poços. As BJAB marcadas com 51Cr foram adicionadas a (2 x 104 células/poço). As PBMCs foram então adicionados a (5 x 105 células/poço) para uma proporção final de 25:1 de efetores (PBMC):alvos (BJAB). As reações foram preparadas em poços em quadruplicado de uma placa de 96 poços. As frações de SEC de TRU-016 foram adicionadas aos poços em uma concentração final que varia de 10 ng/ml a 20 pg/ml, como indicado nos gráficos. Cada série de dados mostra uma fração de SEC diferente nas faixas de titulação descritas. Foi permitido que as reações prosseguissem por 6 horas a 37°C em C02 5%, antes da coleta e contagem. A CPM liberada foi medida em um Packard TopCounNXT de 50 μΐ de sobrenadante de cultura seco. O percentual de morte especifica foi calculado subtraindo-se (cpm [média de amostras em quadruplicado] da amostra-cpm liberação espontânea)/(cpm liberação máxima-cpm liberação espontânea) x 100 (Figura 5C). A Figura 5A mostra as curvas de titulação da ligação de diferentes frações de SEC às células Ramos. Todas as moléculas fracionadas ligaram-se a CD37 com curvas de ligação similares, exceto nas maiores concentrações-testadas, em que o material HMW exibiu melhor ligação (maior intensidade de fluorescência) do que o padrão pA e as formas de pico de dimero.
Também foram realizados ensaios para determinar se as frações de SEC de TRU-016 exibiam níveis diferentes de atividade funcional, por exemplo, morte de célula-alvo mediada por CDC e ADCC. O gráfico mostrado na Figura 5B indica que apenas a fração purificada de multímero HMW mediou níveis significativos de atividade de CDC contra células B Ramos com o uso de complemento humano. O padrão pA exibiu alguma atividade de CDC em concentrações maiores, enquanto a forma de pico de dimero mostrou muito pouca ou nenhuma atividade de CDC em todas as concentrações testadas.
Foram realizados ensaios da ADCC em diluições seriais de frações de TRU-016 de vários tamanhos usando células B BJAB marcadas como alvos e PBMC humana como células efetoras. As frações de SEC de TRU-016 estavam presentes nos poços em uma concentração final que varia de 10 ng/ml a 20 pg/ml, como indicado no gráfico mostrado na Figura 5C. Cada série de dados mostrava uma fração de SEC diferente nas faixas de titulação descritas. Os dados foram colocados em um gráfico coma % de morte especifica versus concentração de proteína. Todas as subfrações de SEC, incluindo o padrão pA, fração HMW ou A2 e o pico de dímero, mediaram ADCC potente, dose-dependente, contra células BJAB-alvo. Resultados similares também foram obtidos com o uso de células Ramos como alvos marcados (dados não mostrados).
Exemplo 5
Produção de uma molécula de ligação específica para CD20 SMIPs específicos para CD20 são descritos nas Publicações de Patente U.S. de co-propriedade 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049. A produção de um SMIP específico para CD20 exemplar, TRU-015, é descrita abaixo. TRU-015 é uma proteína de cadeia única recombinante (muridea/humana) que se liga ao antígeno CD20. O domínio de ligação foi baseado em uma sequência de anticorpo CD20 humano disponível publicamente. O domínio de ligação está conectado ao domínio efetor, os domínios CH2 e CH3 de IgGl humana, através de uma região de dobradiça CSS modificada. TRU-015 existe como um dímero em solução, e o dímero tem um peso molecular teórico de aproximadamente 106.000 dáltons. A sequência de nucleotídeos que codifica TRU-015 e a sequência de aminoácidos de TRU-015 são apresentadas, respectivamente, nos IDS. DE SEQ. Nos: 3 e 4.
Em relação à sequência de aminoácidos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 4, TRU-015 compreende a sequência de clonagem do peptideo-líder 2el2 dos aminoácidos 1-23; a 2H7 região variável da cadeia leve de CD20 murídea anti-humana com uma substituição aminoácidos de lisina para serina (VHL11S) no resíduo 11 na região variável, que é refletida na posição 34; um vinculador asp-gly3-ser-(gly4ser)2 que começa no resíduo 129, com o vinculador tendo uma serina adicional na extremidade para incorporar o sítio de restrição Saci para embaralhamento do cassete; a região variável da cadeia pesada de CD20 murídea anti-humana 2H7, que não possui um resíduo de serina na extremidade da região da cadeia pesada, ou seja, alterada de VTVSS para VTVS; um domínio de Fc de IgGl humana, incluindo uma região de dobradiça modificada que compreende uma sequência (CSS), e domínios CH2 e CH3 do tipo selvagem.
As células CHO que produzem TRU-015 foram cultivadas em um biorreator com o uso de meios proprietários. TRU-015 foi purificado com o uso de uma série de etapas de cromatografia e filtração, incluindo um filtro de redução de vírus. 0 material foi então concentrado e formulado com 2 0 mM de fosfato de sódio e 24 0 mM de sacarose, com um pH resultante de 6,0. A composição ê filtrada antes de ser preenchida em ampolas de vidro em uma concentração de 10 mg/ml. Cada ampola de vidro continha 5 ml de TRU-015 (50 mg/ampola).
Exemplo 6
Combinações de TRU-016 com TRU-015 ou Rituxan Aumentam sinergicamente a apoptose em células B
Foram efetuados ensaios que examinam o efeito de SMIPS dirigidos às células B sobre a apoptose da linhagem de células B. Cada SMIP foi testado individualmente, e depois em combinação. As amostras foram analisadas 24 e 48 horas após o inicio das reações de incubação. A análise de anexina/PI foi realizada da seguinte forma: células BJAB (cortesia de Ed Clark, Universidade de Washington), células Ramos (ATCC n° CRL-1596) e células Daudi foram incubadas 24 ou 48 horas a 37°C em 5% CO2 em meio Iscoves completo (Gibco) com FBS 10% a 3 X 105 células/ml e 20 pg/ml de proteína de SMIP. Além disso, 20 pg/ml IgG de cabra anti- humana foram adicionados às reações a fim de entrecruzar os reagentes na superfície celular. As células foram então coradas com anexina V-FITC e iodeto de propidio usando o "BD Pharmigen Apoptose Detection Kit I" (n° 556547), e processadas de acordo com as instruções do kit. Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, e ressuspensas em "tampão de ligação" a 1 X 106 células/ml. Cem microlitros das células em tampão de ligação foram então corados com 5 pL de Anexina V-FITC e 5 pL de iodeto de propidio. As células foram gentilmente turbilhonadas e incubadas no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos. Quatrocentos microlitros do tampão de ligação foram então adicionados a cada amostra. Elas foram então lidas e analisadas em um instrumento FACsCalibur (Becton Dickinson) com o uso do programa de computador Cell Quest (Becton Dickinson). A Tabela 2 abaixo mostra que, na presença de reticulação, o tratamento com TRU-016 teve um efeito mais significativo sobre a apoptose de linhagens celulares do que TRU-015 isoladamente, embora ambas as moléculas, quando usadas isoladamente, induzem alguma apoptose. 0 aumento varia, dependo da linhagem celular.
Exemplo 7
Combinações de TRU-016 com anticorpos ou SMIPs específicos para CD20 aumentam sinergicamente a CDC
Foram realizados ensaios para determinar a atividade de CDC de combinações de TRU-016 com anticorpos específicos para CD20 ou SMIPS contra células B. A quantidade de reagentes escolhida para os ensaios de combinação foi de 0,5 pg/ml de TRU-016, enquanto a de TRU- 015 também foi de 0,5 pg/ml. A concentração de rituxan foi normalmente de 0,04-0,06 pg/ml, por causa de sua maior atividade em ensaios de CDC de reagente único. Em alguns ensaios, a concentração de reagente CD20 foi mantida constante em uma concentração subótima, enquanto a concentração de TRU-016 era variada para explorar os níveis mínimos de reagente dirigido a CD37 necessários para observar o aumento dos efeitos sobre a CDC.
As células foram suspensas em Iscoves (n° 12440-053,
Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) a 5 x 10E5 células/poço em 75 μΐ. TRU-016 (75 μΐ), TRU-015, rituxan ou combinações desses reagentes foram adicionadas às células no dobro das concentrações indicadas. Foi permitido que as reações de ligação prosseguissem por 45 minutos, antes da centrifugação e lavagem em Iscoves sem soro. As células foram ressuspensas em Iscoves com soro humano (n° A113, Quidel, San Diego, CA) nas concentrações indicadas. As células foram incubadas por 60 minutos a 37°C. As células foram lavadas por centrifugação e ressuspensas em 125 μΐ de PBS com FBS 2% (n° 16140-071, Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY), meio de coloração. As células foram transferidas para tubos agrupados de FACS (n° 4410, CoStar, Corning, NY) e 125 μΐ de meio de coloração com 5 μΐ de iodeto de propídio (PI, n°P-16063, Molecular Probes, Eugene OR) foram adicionados. As amostras foram incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro, antes da análise por citometria de fluxo com o uso de um instrumento FACsCalibur e do programa de computador CellQuest (Becton Dickinson). A Figura 6 mostra gue, em concentrações subõtimas para a morte como agente único, TRU-015 e rituxan exibiram níveis maiores de atividade de CDC guando combinados com TRU-016. TRU-016 isoladamente não mediou CDC, a menos gue estejam presentes agregados. A eliminação de Clq das reações causa a eliminação de toda a atividade de CDC observada. A Figura 7 mostra um ensaio de combinação realizado em células B DHL-4. A adição de TRU-016 às reações de CDC produz uma mudança para baixo na curva de morte por TRU-015, demonstrando morte mais eficaz em cada concentração testada, embora TRU-016 exiba pouca ou nenhuma atividade isoladamente. A Figura 8 mostra outro ensaio de CDC no qual os reagentes da amostra foram misturados nas seguintes proporções: 0,5 μ/ml de TRU-015, 0,5 pg/ml de TRU-016 e 0,06 pg/ml de rituxan. Novamente, os agentes únicos são usados em concentrações subõtimas a fim de observar os feitos de aumento na presença de TRU-016. Tanto para TRU-015 quanto para rituxan, TRU-016 aumenta o nível de morte por CDC quando adicionado aos ensaios.
As Figuras 9 e 10 mostram representações gráficas dos dados para os ensaios da CDC nos quais a concentração de TRU-015 ou rituxan foi mantida constante, e a concentração de TRU-016 foi aumentada. Novamente, a atividade de CDC foi maior quando TRU-016 foi adicionado às reações, mas o aumento da concentração de TRU-016 até 2,5 pg/ml a partir de 0,5 pg/ml não aumenta significativamente a morte mediada por CDC nesses ensaios.
Exemplo 8 TRU-016 aumenta a atividade de ADCC e CDC de anticorpos e SMIPs específicos para CD20
Foram realizados ensaios para determinar se combinações de TRU-016 SMIP com anticorpos específicos para CD20 ou SMIPs poderiam aumentar a atividade de ADCC e de CDC contra células B-alvo. Células BJAB Ramos e células linfoblastóides B Daudi (10E7) foram marcadas com 500 pCi/ml de 51Cr cromato de sódio por 2 horas a 37°C em IMDM/FBS 10%. As células BJAB marcadas foram lavadas três vezes em RPMI/FBS 10% e ressuspensas a 4 x 10E5 células/ml em RPMI. Sangue humano total heparinizado foi obtido de doadores internados anónimos e as PBMCs isoladas por fracionamento sobre gradientes de Meio de Separação de Linfócitos (LSM, ICN Biomedical). As camadas de células brancas foram coletadas e lavadas duas vezes em RPMI/FBS 10%, antes da ressuspensão em RPMI/FBS 10% em uma concentração final de 3 x 10E6 células/ml. As células foram contadas por exclusão de azul tripano usando um hemocitómetro antes de serem utilizadas em ensaios subsequentes. Foram adicionadas amostras de reagente ao meio RPMI com FBS 10% a 4 vezes a concentração final, e foram preparadas cinco diluições seriais para cada reagente. Para as combinações, os reagentes foram pré- misturados e diluídos, antes da adição aos poços. Esses reagentes foram então adicionados a placas de 96 poços com fundo em U a 50 μΐ/poço para as concentrações finais indicadas. As células BJAB marcadas com 51Cr foram adicionadas às placas a 50 ul/poço (2 x 10E4 células/poço) . As PBMCs foram então adicionadas às placas a 100 μΐ/poço (3 x 10E5 células/poço) para uma proporção final de 15:1 de efetores (PBMC): alvo (BJAB).
Os efetores e os alvos foram adicionados ao meio isoladamente para medir a morte de fundo. As células BJAB marcadas com 51Cr foram adicionadas ao meio isoladamente para medir a liberação espontânea de 51Cr e ao meio com NP40 5% (n° 28324, Pierce, Rockford, IL) para medir a liberação máxima de 51Cr. As reações foram preparadas em poços em quadruplicado em uma placa de 96 poços. SMIPs foram adicionadas aos poços em uma concentração final que varia de 12 ng/ml a 10 pg/ml, como indicado nos gráficos. Para combinações de SMIP, os reagentes foram misturados antes da adição aos poços. Cada série de dados representa um único SMIP diferente ou a combinação nas faixas de titulação descritas. Foi permitido que as reações prosseguissem por 6 horas a 37°C em CCg 5%, antes da coleta e contagem. Cinquenta μΐ do sobrenadante de cada poço foram então transferidos para uma Placa Luma 96 (n° 6006633, Perkin Elmer, Boston, Mass) e secos de um dia para o outro em temperatura ambiente. A CPM liberada foi medida em um Packard TopCounNXT. O percentual de morte específica foi calculado subtraindo-se (cpm {média de amostras em quadruplicado) da amostra — cpm liberação espontânea) /(cpm liberação máxima-cpm liberação espontânea) x 100.
Os dados foram colocados em um gráfico coma % de morte específica versus concentração de SMIP. A proporção de efetor para alvo é indicada em cada figura, e a linhagem de célula-alvo também foi indicada. As Figuras 11, 12 e 13 mostram dados para ensaios em diferentes linhagens celulares (BJAB, Daudi e Ramos) nos quais foi utilizado o mesmo doador.
Nas Figuras 14 e 15 (rituxan + TRU-016) e nas Figuras 16 e 17 (TRU-015 + TRU-016), são apresentados os dados para ensaios nos quais a linhagem de célula-alvo usada foi BJAB. A morte específica observada para cada combinação foi maior do que com um reagente único isoladamente na mesma concentração, indicando que os SMIPs dirigidos a CD20 e CD37 aumentam a morte mediada pelo outro, embora o efeito de aumento não seja completamente aditivo.
Dessa forma, TRU-016 pode aumentar a morte por ADCC de células B mediada por SMIP específico para CD20 ou anticorpo específico para CD20.
Foram projetados ensaios iniciais para explorar os efeitos de combinações de TRU-016 com anticorpos dirigidos a CD20 para determinar as quantidades relativas de cada reagente a serem usadas de forma que a sinergia de CDC possa ser detetável. Células Ramos foram suspensas em IMDM, e TRU-016, Rituxan ou combinações desses reagentes foram adicionadas às células até as concentrações finais indicadas na Figura 18. Foi permitido que as reações de ligação prosseguissem por 45 minutos, antes da centrifugação e lavagem em Iscoves sem soro. As células foram ressuspensas em Iscoves com 10% NHS. As células foram incubadas por 60 minutos a 37°C. Nos ensaios mostrados na Figura 18A-C, as células foram lavadas por centrifugação, e ressuspensas em meio de coloração contendo 0,5 pg/ml de iodeto de propídio (PI, n°P-16063, Molecular Probes, Eugene OR) . As amostras foram incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro, antes da análise por citometria de fluxo com o uso de um instrumento FACsCalibur e do programa de computador Cell Quest (Becton Dickinson). O pico de dimero de TRU-016 mais altamente purificado é um mediador pobre da CDC quando usado isoladamente, como mostrado na Figura 18A pela curva de dose-resposta plana, até mesmo em concentrações elevadas. Como os reagentes dirigidos a CD20 foram indutores eficientes da atividade de CDC, eram desejáveis quantidades não saturantes dos reagentes dirigidos a CD20 em ensaios de combinação, de tal forma que a sinergia entre os reagentes pudesse ser detectada. A partir desses estudos iniciais, a quantidade normal de reagente escolhida para os ensaios de combinação foi de 0,5 pg/ml ou 2 pg/ml de TRU-016. A concentração de Rituxan foi normalmente de 0,04-0,06 yg/ml, por causa de sua atividade maior em ensaios de CDC de reagente único. Em alguns ensaios, a concentração de reagente CD20 foi mantida constante em uma concentração subótima, enquanto a concentração de TRU-016 foi variada para explorar os níveis mínimos de reagente dirigido a CD37 necessários para observar efeitos de aumento sobre a CDC. Dessa forma, TRU-016 isoladamente não medeia CDC, a menos que estejam presentes agregados. A Figura 18B mostra um gráfico da percentagem de células vivas (PI-negativas) observada ao longo da faixa de titulação indicada (0,06-0,5 yg/ml) quando Rituxan é usado isoladamente ou em combinação com TRU-016 a 2,5 pg/ml. Rituxan, quando usado em uma faixa de doses subótimas para morte como agente único, exibe níveis maiores de atividade de CDC EM cada concentração quando combinado com TRU-016 (Figura 18B) . A eliminação de Clq das reações causa a eliminação de toda a atividade de CDC observada (Figura 3B).
Na Figura 18C, as amostras também foram incubadas com FITC anti-Clq por 45 minutos no gelo, antes da análise por citometria de fluxo. A separação de linfócitos ocorreu em células comprometidas. A percentagem de células nessa separação aumentava com concentrações crescentes de Rituxan, e a MFI relativa para essa população de células foi colocada em um gráfico. A Figura 18C mostra os resultados de um ensaio de CDC em que os reagentes da amostra foram misturados nas seguintes proporções: 0,5 pg/ml para TRU-016, e concentrações de Rituxan que variam de 0,06 pg/ml a 0,5 pg/ml, e as células foram coradas com PI antes da citometria de fluxo. Os resultados mostram um aumento dose-dependente da MFI com doses crescentes de Rituxan. A adição de formas diméricas de TRU-016 resultou em um aumento adicional da MFI em cada concentração de Rituxan. Uma série similar de ensaios da CDC foi realizada, mantendo a concentração de Rituxan constante e aumentando a concentração de TRU-016. Novamente, a atividade de CDC foi maior quando TRU-016 foi adicionada às reações de Rituxan, mas o aumento da concentração de TRU-016 até 2,5 pg/ml a partir de 0,5 pg/ml não aumentou significativamente a morte mediada por CDC nesses ensaios (dados não mostrados).
Rituxan e as proteínas de TRU-016 usados isoladamente e em combinação entre eles foram comparados quanto à sua atividade de ADCC in vitro com o uso de uma faixa de concentração similar à usada para os ensaios da CDC. A Figura 18D mostra os resultados de um ensaio da ADCC com células Ramos marcadas como alvo e células PBMC humanas como efetoras em uma proporção efetor: alvo de 25:1, usando TRU-016 ou Rituxan, isoladamente e em combinação entre si ao longo das faixas de concentração indicadas. Foram obtidos dados similares em uma proporção efetor: alvo de 12,5:1. Tanto a forma dimérica de TRU-016 quanto Rituxan medeiam níveis significativos de ADCC contra células Ramos que expressam os antígenos-alvo CD20 e CD37; no entanto, a combinação dos dois reagentes não resulta em aumento significativo do nível de morte.
Exemplo 9
TRU-016 Induz Apoptose em Células B
Foram feitos ensaios que examinam o efeito de TRU-016 sobre a apoptose da linhagem de células B. Os ensaios iniciais dos efeitos sobre a apoptose de moléculas de TRU-016 dirigidas a diferentes recetores de célula B foram realizados com o uso de material purificado por proteína A que ainda continham agregados de ordem superior. Após tratamento de 24 horas com anticorpos CD37 ou moléculas projetadas de TRU-016, foram observados padrões similares de apoptose aumentada em vários ensaios com o uso de percentagens de células positivas para anexina V como uma medida da atividade aptotótica, e tanto células Ramos quanto células BJAB como alvos de ligação (dados não mostrados). A Figura 19A demonstra que a apoptose é significativamente aumentada após incubação de linhagens de células B com TRU-016 não fracionado. A Figura 19A mostra um dot plot de coloração com anexina V-PI de células Ramos após incubação for 24 horas com o TRU-016 (10 pg/ml). A % de células anexina V-PI duplamente positivas aumentou de 11,3% da população total para 32,8%, e a % de células anexina V positive-PI-negativas aumentou de 8,5% para 19,7%, indicando que a apoptose é induzida após exposição a TRU-016. Foram obtidos dados similares com o uso células de Ramos ou BJAB como alvos de ligação nesses ensaios.
Foram realizados ensaios adicionais que examinam o efeito de TRU-016 sobre a apoptose da linhagem de células B com o uso da forma dimérica mais altamente purificada de TRU-016 (Figura 19B). As amostras foram analisadas tanto em 24 e 48 horas após o início das reações de incubação. A análise de anexina/PI foi efetuada em vários tipos de células com a utilização de 20 pg/ml de proteína de TRU-016. Como a apoptose era reduzida com o uso da forma dimérica de TRU-016, 20 pg/ml de IgG anti-humana de cabra foram adicionados às reações a fim de entrecruzar os reagentes na superfície celular. As células foram então coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio. Os dados mostrados na Figura 19B demonstram que o pico de dímero de TRU-016 induz apoptose de células Daudi após 24-48 horas, mas que a presença de um agente de reticulação, por exemplo, IgG anti-humana, resulta num aumento significativo do nível de apoptose dirigida a CD3 7.
Também foram realizados ensaios para determinar o efeito de TRU-016 sobre células B humanas normais em cultura com o uso de PBMCs humanas. As Figuras 20A e 20B mostram resultados de um desses ensaios, com gráficos de coluna da percentagem de linfócitos CD19- ou CD40- positivos (células B) presente em culturas de PBMCs tratadas por 48-72 horas somente com meio, TRU-016 ou Rituxan.
As PBMCs humanas foram isoladas de sangue total por centrifugação de densidade LSM. As células foram incubadas por 48 ou 72 horas com 1 pg/ml de Rituxan ou TRU-016. Uma porção da reação de incubação foi coletada em 48 horas e novamente em 72 horas após inicio do ensaio. As PBMCs foram lavadas e incubadas com FITC anti-CD19, FITC anti- CD40 ou FITC anti-CD3 por 45 minutos no gelo. A percentagem total de linfócitos que coram com esses reagentes foi então tabulada e comparada com amostras de PBMCs incubadas sob condições similares, mas sem reagentes de teste, e coradas como as amostras tratadas. As Figuras 2 OA e B mostram gráficos de colunas da fração da população total de linfócitos (%) que gerou um sinal FACs positivo após 48 e 72 horas com os reagentes indicados. A Figura 20C mostra um gráfico composto de um ensaio similar, que mostra a redução percentual a partir do número original de linfócitos que expressam o antigeno CD indicado (ou seja, CD19, CD4 0 ou CD3-positivos) após incubação de PBMCs com TRU-016 (a 1 pg/ml) por 24 e 72 horas.
Na presença de reticulação, o tratamento com a forma dimérica de TRU-016 ou Rituxan resultou em uma redução na percentagem de linfócitos B em culturas de PBMCs medida PR coloração positiva para CD19 e CD40. Embora a percentagem de linfócitos B em cultura fosse baixa no inicio do ensaio, a co-cultura com Rituxan ou TRU-016 diminuiu o número de linfócitos CD19 e CD4 O-positivos na cultura de PBMCs em aproximadamente 1,5-2 vezes após 48 horas, e em mais de 3 vezes após 72 horas. Esse padrão geral de eliminação de células B após 48-72 horas era reprodutível em todas as culturas de PBMCs normais testadas, independentemente da percentagem de partida inicial de linfócitos B nessas culturas, que variou de aproximadamente 3% alcançando até 7% dos linfócitos totais, dependendo da amostra. A Figura 20C mostra um gráfico de colunas da percentagem de eliminação de linfócitos B, comparada com linfócitos T em culturas de PBMCs de curto prazo incubadas com TRU-016 por 24 a 72 horas. Esses dados indicam que o TRU-016 é capaz de eliminação específica de linfócitos B CD37-positivos de culturas do sangue periférico normal, e que o nível baixo de ligação por TRU-016 a não linfócitos B (Figura 1C) é insuficiente para mediar eliminação significativa desses linfócitos da população de células.
Exemplo 10
Combinações De Tru-016 E Rituximab Reduzem Significativamente 0 Volume Tumoral Em Um Modelo Murídeo De Xenoenxerto Tumorais
Foram realizados estudos de xenoenxerto tumoral em camundongo que exploram terapias de combinação com o uso de camundongos atímicos (nude) (Harlan) e linhagens tumorais humanas Ramos ou Daudi. Células tumorais Ramos ou Daudi cresceram em ampolas T150 em IMDM/FBS 10% até que alcançassem 80% de confluência. Foram usados cinco milhões (5 x 106) de células como inoculo tumoral por camundongo. As células foram injetadas subcutaneamente no flanco direito usando PBS em um volume total de 0,1 ml ou 5,0 x 107/ml. Foi permitido que os camundongos atímicos desenvolvessem os tumores, e eles foram divididos em grupos com base no tamanho/volume do tumor. Para cada grupo de tratamento, foram usados 12 camundongos com um volume tumoral médio de aproximadamente 222 mm3 (variação = 152- 296 mm3) . Alguns volumes tumorais médios que variam de 237- 251 mm3 também foram utilizados. Os animais foram injetados por via intravenosa (IV) nos dias 0, 2, 4, 6 e 8 com um dos seguintes reagentes: TRU-016 GPC POI (pico de interesse), 200 pg/camundongo; rituxan, 200 pg/camundongo ou IgG humana (controlo) a 200 ou 400 pg/camundongo como reagentes únicos, ou como as seguintes combinações de reagentes: Rituxan + TRU-016 a 100 pg de cada por camundongo; ou Rituxan + TRU-016 a 200 pg de cada por camundongo. O volume tumoral foi medido diariamente com compassos até o término do ensaio (sacrifício ou regressão). Foi feito um gráfico do volume tumoral em função do tempo de tratamento para cada animal, e também foram calculados os resultados médios dentro de cada grupo.
Também foram feitos estudos similares com a utilização de tumores menores, com os camundongos divididos em grupos com volume tumoral médio menor que varia entre 153-158 mm3, e com tumores maiores, mas com o uso de células Daudi ao invés de células Ramos. Esses estudos foram realizados nas instalações para animais aprovada pela AAALAC e o programa de uso dos animais de acordo com as diretrizes de um "Institutional Animal Care and Use Committee" (IACUC). A Figura 21 mostra gráficos da eficácia de TRU-016 comparado com hulgG, rituxan e as combinações a 100 pg e 200 pg de cada média em cada grupo de 12 animais. Foi feito um gráfico do volume tumoral em função do tempo após tratamento com a(s) injeção (injeções) IV. O volume tumoral médio após tratamento com TRU-016 foi menor do que aquele observado com o uso do controlo negativo (hulgG). Quando se colocou em um gráfico a % de Sobrevivência ou a % de animais sem tumor, a terapia de combinação de dose maior exibiu a maior atividade anti- tumoral nesse modelo de tumor in vivo. No entanto, na dose menor (100 pg de cada), a terapia de combinação não foi tão eficaz quanto cada reagente único em uma dose maior.
Esses dados indicam que a terapia com TRU-016, quando usada em combinação com rituxan nas doses apropriadas, terá maior eficácia no tratamento dos tumores do paciente do que a terapia de rituxan isoladamente.
Exemplo 11
Tru-016 Reduz O Volume Tumoral E Aumenta A Sobrevivência Em Um Modelo De Xenoenxerto Tumoral Murídeo
Foram realizados estudos de xenoenxerto tumoral de camundongo com o uso de camundongos atímicos (Harlan) e linhagens tumorais humanas Ramos ou Daudi. Foram feitos três estudos diferentes com base no tipo de tumor e tamanho do tumor no momento do tratamento com o TRU-016 ou com outro reagente de teste. Células tumorais Ramos ou Daudi cresceram até 5 x 106 células, e foram injetadas subcutaneamente no flanco direito para inocular cada camundongo tratado com o tumor. Foi permitido que os camundongos atímicos desenvolvessem os tumores, e eles foram divididos em grupos com base no tamanho/volume do tumor. No primeiro estudo, para cada grupo de tratamento, foram utilizados 12 camundongos com um volume tumoral médio de 155-237 mm3. Os animais foram injetados por via intravenosa (IV) nos dias 0, 2, 4, 6, e 8 com um dos seguintes reagentes: Rituximab, 200 pg/camundongo; pico de dímero de TRU-016 GPC, 200 pg/camundongo; ou IgG humana (controlo), 400 pg/camundongo. O volume tumoral foi medido diariamente com compassos até o término do ensaio (sacrifício ou regressão) . Foi feito um gráfico do volume tumoral em função do tempo de tratamento para cada animal, e também foram calculados os resultados médios dentro de cada grupo. As médias dos grupos são mostradas na Figura 22A, enguanto a Figura 22B mostra uma comparação dos dados de percentual de Sobrevivência para cada grupo de camundongos em função do tempo. A Figura 22A mostra a eficácia de TRU-016 comparado com hulgG e Rituxan no modelo tumoral Ramos, com média ao longo de cada grupo de 12 animais. Foi feito um gráfico do volume tumoral em função do tempo após tratamento com a(s) injeção (injeções) IV. 0 volume tumoral médio após tratamento com o TRU-016 foi menor do gue aguele observado com o uso do controlo negativo (hulgG). A Figura 22B mostra um gráfico das curvas de Sobrevivência para os diferentes grupos de tratamento, comparando hulgG, Rituxan e TRU-016. A administração de TRU-016, utilizando o modelo tumoral Ramos mais exigente com volume tumoral de base aumentado, resultou em uma inibição da taxa de crescimento tumoral em relação à IgG humana (dados não mostrados). A administração de TRU-016 aos camundongos com os tumores Ramos menores resultou tanto na inibição do crescimento tumoral guanto nos aumento dos tempos médios de sobrevivência.
Exemplo 12
TRU-016 não Afeta a Atividade e CDC de Outros Recetores de Superfície de Células B
Para determinar se a molécula de TRU-016 aumenta o nível de atividade de CDC gue resulta do tratamento com anticorpos para outros recetores de superfície de células B, além de CD20, por exemplo, MHCII, CD19, CD80/86 e CD40, foi feito um painel de ensaios similar àquele descrito para combinações dirigidas a CD20-CD37. Células Ramos foram adicionadas aos poços em meio Iscoves completo com FBS 10%. Os MAbs (reagente B: HD37- anti-CD19, reagente C: 9.4-anti-CD45), proteína de fusão (reagente D: CTLA-4 mulg-IgG2a, Ancell n° 501-820) e líquido ascítico (reagente A: HB10a-anti-MHCII), foram adicionadas nas diluições indicadas (veja Figura 23), e foram preparadas reações em duplicata com e sem a adição de Rituximab (a 0,05 yg/ml) ou TRU-016 (a 2 yg/ml). As reações foram incubadas por 30 minutos a 3 7°C. As células foram lavadas, e foi adicionado NHS até uma concentração final de 10% em meio sem soro. As células foram incubadas por 90 minutos a 37°C com a fonte de complemento. As células foram lavadas, foi adicionado iodeto de propídio até uma concentração final de 0,5 pg/ml em PBS; as células foram incubadas no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos; e depois as células foram testadas por citometria de fluxo. Cada gráfico nos painéis A-D da Figura 23 tabula a % de células PI-positivas ao longo das faixas de titulação indicadas.
Em geral, os dados indicam que não houve uma diferença significativa no nível de atividade de CDC quando anticorpos dirigidos a esses recetores foram usados isoladamente ou em combinação com o TRU-016 (Figura 23A- D) . Pode haver um ligeiro aumento nos níveis de CDC para os reagentes dirigidos a CD19 e CD45 quando usados com TRU-016 em concentrações subótimas. No entanto, as diferenças nos níveis de CDC não são tão significativas quanto aquelas observadas para a combinação CD20-CD37. Além do aumento da CDC quando reagentes dirigidos a CD20 e CD37 são usados em combinação, parece haver um aumento no nível de morte observado com o uso de combinações de anti-classe II (HBlOa), anti-CD19, anti-CD45 (9.4) ou CTLA41g com Rituxan na dose subótima.
Exemplo 13 TRU-016 não aumenta a atividade de CDC de outros recetores-alvo, incluindo MHCII, CD19, CD80/86 e CD40
Para determinar se a molécula de TRU-016 aumenta o nível de atividade de CDC que resulta do tratamento com anticorpos para outros recetores de superfície de células B, além de CD20, foi feito um painel de ensaios similar àquele descrito para combinações dirigidas a CD20- CD37 (veja Exemplo 8). Os resultados desses ensaios são mostrados na Figura 23. Em geral, não houve uma diferença significativa no nível de atividade de CDC quando anticorpos dirigidos a esses recetores foram usados isoladamente ou em combinação com o TRU-016. Os níveis de CDC aumentaram ligeiramente em resposta aos reagentes dirigidos a CD19 e CD45 quando usados com TRU-016 em concentrações subótimas. No entanto, as diferenças nos níveis de CDC não foram tão significativas quanto aquelas observadas para a combinação CD20-CD37 (veja Exemplo 8). Além do aumento da CDC quando reagentes dirigidos a CD20 e CD37 são usados em combinação, parece haver um aumento no nível de morte observado com o uso de combinações de anti- MHCII (HBlOa), anti-CD19, anti-CD45 (9.4) ou CTLA4Ig com Rituxan na dose subótima.
Exemplo 14 TRU-016 aumenta a Sobrevivência em um modelo de xenoenxerto tumoral murideo
Foram realizados estudos de xenoenxerto tumoral de camundongo além daqueles descritos no Exemplo 11 para examinar a eficácia de TRU-016 no aumento da Sobrevivência de longo prazo com o uso de camundongos atimicos (Harlan) e linhagens de células tumorais humanas Ramos ou Daudi. Células tumorais Ramos e Daudi cresceram separadamente, e 5 x 106 células foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos para iniciar a formação de camundongo xenoenxertos tumorais. Após o desenvolvimento do tumor, os camundongos foram divididos em grupos com base no tamanho/volume do tumor (dia 0). Os animais foram injetados por via intravenosa (IV) nos dias 0, 2, 4, 6 e 8 com um dos seguintesreagentes: rituximab, 200 pg/camundongo; TRU-016, 200 pg/camundongo; rituximab + TRU-016 a 100 ou 200 pg/camundongo; ou IgG humana (controlo), 400 pg/camundongo. O volume tumoral foi medido às cegas três vezes por semana com compassos até o término do ensaio (sacrifício ou regressão). Foi feito um gráfico do volume tumoral em função do tempo de tratamento para cada animal, e também foram calculados os resultados médios dentro de cada grupo. A Figura 24 mostra o percentual de Sobrevivência de camundongos com tumores Ramos (até 90 dias) após tratamento com TRU-016, rituximab ou uma combinação destes. O tratamento combinado com TRU-016 + rituximab aumentou significativamente tempo médio de Sobrevivência versus tratamento com terapia com agente único isoladamente. As Figuras 25 e 26 mostram o percentual de Sobrevivência de camundongos com tumores Daudi (até 90 dias) após tratamento com TRU-016 ou rituximab. O tratamento com TRU-016 aumentou o tempo médio de Sobrevivência em tumores Daudi estabelecidos (Figura 25) . TRU-016 foi mais eficaz do que rituximab na manutenção da Sobrevivência em camundongos com tumores Daudi (Figura 26). A administração de TRU-016 como agente único em camundongos com tumores Ramos estabelecidos demonstrou uma inibição do crescimento tumoral e aumento dos tempos de Sobrevivência equivalentes ao rituximab administrado como agente único, e foi superior aos camundongos de controlo tratados com HulgG. Os dados reunidos de 3 ensaios demonstraram que a terapia de combinação com TRU-016 e rituximab resultou em uma melhora estatisticamente significativa do tempo de Sobrevivência comparado com monoterapias com TRU-016 (p = 0,028) ou rituximab (p = 0,045). As regressões tumorais completas também aumentaram para os grupos de combinação de TRU-016 e rituximab. Quarenta e dois por cento do grupo de combinação de TRU-016 + rituximab 2 00 pg foram capazes de obter regressão completa de longo prazo de seus tumores, comparados com uma taxa de regressão tumoral de 20% em camundongos tratados com TRU-016 ou rituximab isoladamente (veja a Tabela 3 e a Figura 24).
Foram constatados redução do crescimento tumoral e aumento do tempo de Sobrevivência após tratamento com TRU-016 no modelo de xenoenxerto tumoral Daudi (veja Tabela 4 e Figuras 25 e 26). A administração de TRU-016 aumentou significativamente o tempo de Sobrevivência comparado com o grupo de controlo. Também foi observado um aumento da percentagem de camundongos sem tumor com o tratamento com SMIP-016 nesse modelo, comparado tanto com os grupos de controlo quanto com os grupos de rituximab.
0 tratamento com um SMIP dirigido a CD37 (TRU-016) é tão eficaz quanto a monoterapia com rituximab na redução do volume tumoral e no aumento do tempo de Sobrevivência no modelo de xenoenxerto tumoral Ramos. A terapia de combinação de TRU-016 + rituximab demonstrou um benefício aumentado na redução do volume tumoral e no aumento significativo do tempo de Sobrevivência, comparado com monoterapia de rituximab ou TRU-016 no modelo de xenoenxerto tumoral Ramos. No modelo de xenoenxerto Daudi, camundongos tratados com TRU-016 demonstraram um aumento estatisticamente significativo no tempo médio de Sobrevivência, comparado com os controlos de HulgG. 0 tratamento com rituximab não prolongou os tempos de Sobrevivência, comparado com camundongos de controlo. Esses dados reforçam a eficácia de uma terapia dirigida a CD37 nesses modelos de xenoenxerto de linfoma não Hodgkin.
Exemplo 15 TRU-016 potencializa a morte celular induzida por fludarabina em células CLL in vitro A fludarabina é um fármaco quimioterápico usado no tratamento de malignidades hematológicas. Fludarabina é um análogo de purina que inibe a síntese de ADN por interferência na ribonucleotídeo redutase e ADN polimerase. Fludarabina é ativa tanto contra células em divisão quanto células em repouso. Ela é altamente eficaz no tratamento de leucemia linfocítica crónica (CLL), produzindo taxas de resposta mais elevadas do que os agentes alquilantes, por exemplo, clorambucil isoladamente (Rai e cols. N. Engl . J. Med. 343: 1.750-1.757, 2000). Fludarabina é usada em várias combinações com ciclofosfamida, mitoxantrona, dexametasona e rituximab no tratamento de linfoma e linfoma não Hodgkin indolentes. No entanto, também foi observada resistência à fludarabina no tratamento. A fludarabina induz apoptose dependente de caspase em células CLL, e a apoptose mediada por TRU-016 parece ser independente da ativação de caspase. 0 presente estudo examinou o efeito de TRU-016 com fludarabina em células CLL.
As células foram tratadas com TRU-016 em dosagens que variam de 0,1-100 pg/ml, e com fludarabina em dosagens que variam de 0-20 μΜ (veja Figura 27). TRU-016 foi fornecido por Trubion Pharmaceuticals (Seattle, WA) . Fludarabina (F-araA) foi adquirida de SIGMA (St. Louis, MO) . RPMI 1640 media foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Anexina V marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC e iodeto de propídio (PI) foram adquiridos de BD Pharmingen, San Diego, CA. Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5- difeniltetrazólio (MTT) foi adquirido de Sigma (St. Louis, MO) . As células B-CLL foram isoladas imediatamente após a doação usando centrifugação por gradiente de densidade de ficoll (Ficoll-Paque Plus, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . As células mononucleares isoladas foram incubadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado por aquecimento 10% (FBS, Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM de L-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) e penicilina (1.0OU/ml)/estreptomicina (100 pg/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis) a 37°C em uma atmosfera de CO2 5%. Células B-CLL recém isoladas foram usadas em todos os ensaios aqui descritos, exceto para a coloração de superfície. Para as amostras com menos de 90% de células B, foi aplicada seleção negativa para eliminar células não B com o uso do "B Cell Isolation Kit II" (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) ou pelo kit "Rosette-Sep" de Stem Cell Technologies (Vancouver, Columbia Britânica, Canadá) de acordo com ο protocolo sugerido pelo fabricante. A linhagem celular Raji (linhagem celular de linfoma de Burkitt humano) foi adquirida de ATCC, e mantida em meio RPMI 1640 contendo FBS 10%, suplementado com penicilina, estreptomicina e glutamina. As células foram divididas 1:3 quando a densidade celular alcançava 1 x 106/ml. O meio foi trocado na noite anterior de cada estudo para assegurar que estavam sendo usadas células frescas.
As células foram tratadas in vitro como aqui descrito. Foi preparada uma diluição serial 1:4 de fludarabina (44, 11, 2,8, 0,7, 0,17 e 0,04 μΜ) em uma placa de 6 poços por transferência de 2 ml de meio contendo fãrmaco para o poço seguinte contendo 6 ml de meio puro. Em uma placa de 6 poços separada, foi preparada uma diluição serial 1:4 de TRU-016 (44, 11, 2,8, 0,7, 0,17 e 0,04 pg/ml) em meio usando o mesmo método de diluição. De cada uma das placas, 0,45 ml de meio foi transferido para um poço designado em uma placa de 4 8 poços para formar uma solução mista de fãrmaco em meio (0,9 ml no total em cada poço) . As células CLL suspensas em meio em uma densidade de 1 x 107 células/ml (0,1 ml) foram então adicionadas ao 0,9 ml de meio em cada poço para formar uma densidade final de 1 x 106 células/ml. Para células Raji, a densidade celular final foi de 5 x 104 células/ml. Dessa forma, a suspensão de células usada foi de 5 x 105 células/ml. Para os ensaios de MTT, foram preparadas diluições seriais de fãrmaco em placa de 96 poços, e transferidas para outra placa de 96 poços para incubação com células. O volume total para incubação é de 200 μΐ (90 μΐ de solução de fludarabina, 90 μΐ de solução de TRU-016 e 20 μΐ suspensão de células). A viabilidade celular foi avaliada com o uso dos ensaios de MTT em 48 horas, e a apoptose foi medida com o uso de anexina V/PI em 24 horas.
Foram feitos ensaios de MTT para medir a viabilidade celular como aqui descrito. Resumidamente, 106 células CLL foram semeadas na placa de 96 poços. As células foram incubadas por 48 horas. Cinquenta 50μ1 de solução de trabalho de MTT (2 mg/ml, preparados a partir de 5 mg/ml de reagente MTT misturado com RPMI 1640 2:3 v/v), foram adicionados a cada poço, e as células foram incubadas por 8 horas. As placas foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido e dissolvido em 100 μΐ de solução de lise. As amostras foram medidas com uma leitora de placas em O.D. 540. A viabilidade celular foi expressa como a percentagem de viabilidade comparada com controlo de meio. A apoptose de células CLL após incubação com anticorpos foi medida com o uso de coloração de anexina V- FITC/iodeto de propidio (PI) com análise FACS. Foram coradas 5 x 105 células em 200 μΐ de tampão de ligação 1 x (BD Pharmingen) com 5 μΐ de anexina V (BD Pharmingen) e 5 μΐ de PI (BD Pharmingen) , e mantidas no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos, antes da suspensão com 3 00 μΐ de tampão 1 x, e analisadas por citometria de fluxo. Foram preparadas células sem coloração, células coradas apenas com anexina V e células coradas apenas com PI. Para todos os ensaios de citometria de fluxo, foi feita a análise FACS com o uso de um citômetro Beckman-Coulter EPICS XL (Beckman-Coulter, Miami, FL) . Os fluoróforos foram excitados a 488 nm. A fluorescência de FITC foi medida com FL1, enquanto a fluorescência de PI e PE foi medida com FL3. O pacote de programas de computador System II (Beckman-Coulter) foi aplicado para analisar os dados. O número de células contadas foi ajustado em 10.000 para cada amostra.
Um efeito sinérgico foi determinado pelo uso do método do isobolograma. Para identificar sinergia, o efeito de uma combinação de fármacos foi comparado com o efeito de cada fármaco isoladamente. Isso se baseia na equação: Ca/Ca,b + Cb/Cb,a = Cl, em que Ca e Cb são a concentração de fármaco A e fármaco B isoladamente, respectivamente, para produzir um efeito desejado (por exemplo, 50% de morte celular). Ca,b e Cb,a são as concentrações de fármaco A e de fármaco B em uma combinação, respectivamente, para produzir o mesmo efeito. Cl é o indice de combinação. As concentrações de fludarabina e TRU-016, que despertam 50% de morte (IC50), foram determinadas e são mostradas na Figura 27C [IC50 de Fludarabina (I) e IC50 de TRU-016 (II)] . A linha reta entre esses dois pontos nos eixos é a linha de efeito aditivo. Subsequentemente, combinações diferentes de fludarabina e TRU-016 que obtêm 50% de morte celular também foram determinadas a partir do estudo de viabilidade e tabuladas no mesmo gráfico. Quando os pontos caem abaixo da linha de aditividade, a sinergia é indicada. Quando surgem pontos acima da linha, o antagonismo é indicado. Quando os pontos estão sobre a linha, a aditividade é indicada. A Figura 27 mostra que TRU-016 reduziu eficazmente a viabilidade celular relativa em células tratadas com fludarabina potencializando, dessa forma, o efeito citotóxico de fludarabina isoladamente. Dessa forma, esse estudo fornece evidências de que TRU-016 pode ser co- administrado com fludarabina, resultando em aumento da eficácia (ou seja, redução sinérgica de células CLL) no tratamento de malignidades hematológicas.
Exemplo 16 TRU-016 induz Citotoxicidade Direta em Células Resistentes ao Rituximab
Como aqui revelado, rituximab é um anticorpo monoclonal usado no tratamento de linfoma não Hodgkin (NHL) , FCC, MCL, DLCL, SLL e CLL. 0 presente estudo foi realizado para determinar a eficácia de TRU-016 na indução de citotoxicidade direta em células resistentes ao rituximab. Células resistentes ao rituximab (1 X 106 células) (Raji 4RH e RL 4RH, fornecidas por Dr. Myron S. Czuczman, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY) foram tratadas com herceptina (10 pg/ml), rituximab (10 pg/ml) ou TRU-016 (5 pg/ml) na presença de um excesso de cinco vezes de IgG anti-humana de cabra por 24 horas. A citotoxicidade direta foi medida por coloração com anexina/PI, e a viabilidade celular (percentual) foi calculada em relação às células de controlo (células tratadas com herceptina). TRU-016 induziu maior toxicidade celular do que rituximab em linhagens celulares resistentes ao rituximab (veja Figura 28) . Dessa forma, TRU-016 é um agente eficaz para a indução de citotoxicidade em células resistentes ao rituximab, o que o torna útil como agente terapêutico em doenças caracterizadas ou que envolvem células resistentes ao rituximab, por exemplo, algumas células B.
Exemplo 17 TRU-016 induz fosforilação de tirosina em células B CLL primariamente CD19+
Para determinar como TRU-016 induz transdução de sinal em células B foram feitos ensaios para examinar o efeito de TRU-016 sobre a fosforilação de tirosina. Células CD19+ recém isoladas (-50-100 x 106) de pacientes com CLL foram suspensas em uma concentração de 5 X 106/ml de PBS. As células foram então incubadas por 10 minutos a 37°C, CO2 5%, com controlo, trastuzumab (herceptina) ou TRU-016 em uma concentração final de 5 ug/ml. As células foram então precipitadas por centrifugação, o sobrenadante foi removido, e as células foram ressuspensas em PBS fresco do volume inicial. Vinculador cruzado especifico para fragmento Fc anti-humano de cabra (25 ug/ml) foi adicionado, e as células foram incubadas por mais 5 minutos. As células foram novamente precipitadas por centrifugação, o sobrenadante foi removido, e as células foram lisadas em 1 ml de tampão de lise RIPA com inibidores de protease e fosfatase (10 mM de
Tris, ph 7,4, 150 mM de NaCl, Triton X-100 1%, ácido desoxicólico, SDS 0,1% e 5 mM de EDTA em todas as concentrações finais. Coguetel de inibidores de protease Sigma cat n° P-8340; coguetel de inibidores de fosfatase Sigma: coguetel de inibidores de serina/treonina fosfatase
Catn0 P-2850; e inibidor de tirosina fosfatase cat n° P-5726; PMSF (100 mM) foram usados. Os inibidores foram adicionados ao tampão de lise, imediatamente antes do uso, em uma diluição 1:100. A concentração de proteína nos lisados foi guantificada pelo método do ácido bicina conínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL). O controlo e as amostras tratadas de proteína (50 ug de proteína total) foram separados por eletroforese bidimensional em gel (faixa de pH: 3-10) (Ia
Dimensão) e SDS 10%SDS-PAGE (2a Dimensão). A proteína foi transferida para membranas de nitrocelulose de 0,2 Nm (Schleicher & Schuell, Keene, NH) e submetida à análise imunoblot usando clone de anticorpo anti-fosfotirosina 4G10 (Upstate Biotechnology), com a utilização do protocolo-padrão. IgG de cabra anti-coelho conjugada a peroxidase de raiz forte (HRP) foi usada como anticorpo secundário. A detecção da fosfoproteína foi feita com substrato quimioluminescente (SuperSignal, Pierce Inc. Rockford, IL). TRU-016 induziu fosforilação de tirosina em células B CD19+ primariamente CLL, como mostrado por análise de gel bidimensional (veja Figura 29) . Dessa forma, esses ensaios mostram que uma forma pela qual TRU-016 atua é através de uma via de fosforilação de tirosina.
Exemplo 18
Moléculas humanizadas de TRU-016
Como apresentado no Exemplo 1, SMIPs específicos para CD37 (por exemplo, TRU-016) são descritos no Pedido U.S. de co-propriedade N° 10/627.556 e nas Publicações de Pedido Patente U.S. Nos 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049.Aquelas descrições são aqui incorporadas por referência. Um SMIP exemplar específico para CD37, o polipeptídeo TRU-016 (ID. DE SEQ. N° : 2), foi nelas produzido e descrito. O presente exemplo fornece SMIPs humanizado de TRU-016.
Anticorpos humanizados são conhecidos na técnica e são discutidos na Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2006/0153837. O presente pedido usa as técnicas envolvidas na humanização de anticorpos (discutidas abaixo) para humanizar SMIPs e, particularmente, para humanizar TRU-016.
Espera-se que a "humanização" resulte em um anticorpo que seja menos imunogénico, com retenção completa das propriedades de ligação de antigeno da molécula original. A fim de reter todas as propriedades de ligação de antigeno do anticorpo original, a estrutura de seu sitio de ligação de antigeno deve ser reproduzida na versão "humanizada". Isso pode ser obtido enxertando-se apenas as CDRs não humanas em domínios variáveis estruturais e regiões constantes humanas, com ou sem retenção de resíduos estruturais críticos (Jones e cols., Nature 321: 522 (1986); Verhoeyen e cols., Science 239: 1.539 (1988)) ou por recombinação dos domínios variáveis não humanos inteiros (para preservar as propriedades de ligação de.ligante), mas "ocultando-os" com uma superfície humana-like através da substituição criteriosa de resíduos expostos (para reduzir a antigenicidade) (Padlan, Molec. Iirununol. 28: 489 (1991)).
Essencialmente, a humanização por enxerto de CDR envolve a recombinação apenas das CDRs de um anticorpo não humano em uma estrutura central de uma região variável humana e uma região constante humana. Teoricamente, isso deve reduzir substancialmente ou eliminar a imunogenicidade (exceto se existirem diferenças alotípicas ou idiotípicas). No entanto, foi relatado que alguns resíduos estruturais do anticorpo original também podem ter que ser preservados (Reichmann e cols., Nature, 332: 323 (1988); Queen e cols., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA, 86: 10, 029 (1989)).
Os resíduos estruturais que precisam ser preservados são passíveis de identificação através de modelagem por computador. Alternativamente, resíduos estruturais críticos podem potencialmente ser identificados comparando-se estruturas conhecidas de sitio de ligação de antigeno (Padlan, Molec. Immun., 31(3): 169-217 (1994)), agui incorporados por referência.
Os resíduos gue potencialmente afetam a ligação de antigeno se enguadram em vários grupos. 0 primeiro grupo compreende resíduos gue são contíguos com a superfície do sítio de antigeno, e que poderiam, portanto, fazer contato direto com antígenos. Esses resíduos incluem os resíduos do terminal amino e aqueles adjacentes às CDRs. 0 segundo grupo inclui resíduos que poderiam alterar a estrutura ou o alinhamento relativo das CDRs, tanto por contato das CDRs quanto por outra cadeia peptídica no anticorpo. 0 terceiro grupo compreende aminoácidos com cadeias laterais sepultadas que poderiam influenciar a integridade estrutural dos domínios variáveis. Os resíduos nesses grupos são normalmente encontrados nas mesmas posições (Padlan, 1994, supra), embora suas posições identificadas possam diferir, dependendo do sistema de numeração (veja Rabat e cols., "Sequences of proteins of imunological interest", 5a ed., Pub. No. 91-3.242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 19 91) .
Embora a presente invenção seja dirigida à humanização de SMIPs e não de anticorpos, o conhecimento de anticorpos humanizados na técnica é aplicável aos SMIPs de acordo com a invenção. Alguns exemplos de moléculas humanizadas de TRU-016 são apresentados na Tabela 5 abaixo.
Para a produção de construções humanizadas de TRU-016 da invenção, as regiões estruturais de TRU-016 de camundongo foram alinhadas aos resíduos estruturais VH1 e VH5 humanos para a cadeia pesada e VK1 e VK3 para a cadeia leve. As melhores combinações foram analisadas quanto à compatibilidade estrutural com as CDRs das regiões variáveis de camundongo. Embora houvesse várias combinações igualmente compatíveis para serem escolhidas, tivemos sucesso anteriormente com o uso da combinação VK3 (X01668), VH5-51(Z12373) e, portanto, os SMIPs humanizados anti-CD37 foram designados com o uso dessas estruturas centrais humanas unidas por um vinculador Gly4Ser ((g4s)3) scFv de 15 aa. A construção VK3 foi construída com JK1 como uma combinação FR4 preferida e a VH5 foi construída com JH2 codificando FR4, como as construções descritas previamente. Os SMIPs foram construídos de novo usando PCR por superposição de oligonucleotídeos. Produtos de comprimento total foram clonados no vetor de expressão SMIP alinhado com a dobradiça de IgGl humana, CH2 e CH3. Esses clones tiveram suas sequências verificadas, foram transfectados em células COS-7, e o meio condicionado de 3 dias foi testado quanto à ligação à linhagem de linfoma de células B, Ramos. A fim de aumentar a humanização, foram incorporadas alterações na CDR1 da cadeia leve nas posições L25, L27 e L28, e todas foram bem toleradas, mostrando igual atividade de ligação com a molécula humanizada original 019001. Foram feitas construções de ADN adicionais de modo similar para alterar a CDR3 da região VH por incorporação de aminoácidos da linhagem germinativa, H100-H102, codificados por várias regiões JH humanas. As construções foram examinadas quanto ao nível de expressão e ao grau de ligação a CD37 em células Ramos. TABELA 5. Construções humanizadas de TRU-016
A sequência de aminoácidos de consenso da construção humanizada de TRU-016 N° 019001 (ID. DE SEQ. N°: 6; H016-019001) e TRU-016 não humanizado (ID. DE SEQ. N° : 2; 016-G28-1) é mostrada com numeração de Rabat na Figura 3 0A. a
Figura 30 B mostra os alinhamentos de sequências de aminoácidos das construções humanizadas de TRU-016 Nos 019001 (ID. DE SEQ. N° : 6), 019008 (ID. DE SEQ. N° : 86) e 019009 (ID. DE SEQ. N°: 88). ADN e alinhamentos de sequências de aminoácidos de três construções humanizadas de TRU-016 (019001, 019041 e 019044), que demonstram ligação especifica para CD37 elevada às células B Ramos são mostrados na Figura 31. ADN formatado por FASTA e alinhamentos de sequências de aminoácidos das mesmas três construções humanizadas de TRU-016 (019001, 019041 e 019044) são mostrados na Figura 32.
Regiões de dobradiça adicionais (Tabela 6) e regiões estruturais (Tabela 7) que podem ser usadas nas moléculas humanizadas de TRU-016 da invenção são apresentadas abaixo.
São esperadas várias modificações e variações na invenção apresentada nos exemplos ilustrativos acima por aqueles habilitados na técnica. Consequentemente, somente as limitações apresentadas nas reivindicações em anexo devem ser consideradas na invenção.
A presente descrição é agora descrita com referência às seguintes cláusulas: 1. Um método para reduzir as células B que compreende a exposição de células B a uma combinação sinergistica de uma ou mais moléculas de ligação especificas de CD3 7 e uma ou mais moléculas de ligação especificas de CD20. 2. Um método para reduzir as células B que compreende a exposição de células B a uma combinação sinérgica de um ou mais medicamentos imunológicos, modulares pequenos específicos de CD37 (SMIPs) e um ou mais anticorpos específicos para CD20. 3. 0 método de cláusula 2, em que o referido SMIP específico do CD37 é TRU-016. 4. 0 método de ponto 2 em que o referido anticorpo específico para CD20 é Rituxan. 5. 0 método da cláusula 2 em que o referido SMIP específico do CD3 7 é TRU-016 e disse anticorpo específico para CD20 é Rituxan. 6. Um método para reduzir as células B que compreendem a exposição de células B a uma combinação sinérgica de SMIPs específicos de CD3 7 e SMIPs específicos de CD20. 7. 0 método da cláusula 6 em que a referida SMIP específico do CD37 é TRU-016. 8. 0 método da cláusula 6 em que o referido anticorpo específico para CD20 é TRU-015. 9. 0 método da cláusula 6 em que a referida SMIP específico do CD3 7 é TRU-016 e disse anticorpo específico para CD20 é TRU-015. 10. O método da cláusula 1, 2, ou 6, em que B por redução de citotoxicidade celular dependente do complemento é sinergicamente aumentada por tratamento com a combinação. 11. Um método de tratamento de um indivíduo que tem ou suspeito de ter uma doença associada com a actividade aberrante de células B, compreendendo a administração a um indivíduo de uma combinação sinergística de uma ou mais moléculas de ligação específica de CD37 e uma ou mais moléculas de ligação específica de CD20. 12. Um método de tratamento de um indivíduo que tem ou suspeito de ter uma doença associada com a actividade aberrante de células B, compreendendo a administração a um indivíduo de uma combinação sinérgica de um ou mais SMIPs específicos do CD37 e um ou mais anticorpos específicos para o CD20. 13. Um método de tratamento de um indivíduo que tem ou suspeito de ter uma doença associada com a actividade aberrante de células B, compreendendo a administração a um
indivíduo de uma combinação sinérgica de um ou mais SMIP específico do CD37 e um ou mais SMIPs específicos do CD20. 14. 0 método da cláusula 11, 12 ou 13, em que a doença é seleccionada a partir do grupo consistindo de um linfoma de células B, uma leucemia de células B, um mieloma de células B, uma doença caracterizada pela produção de auto-anticorpos e uma doença caracterizada pela inadequada estimulação de células T associada uma via de células-B. 15. 0 método da cláusula 14, em que a enfermidade caracterizada pela produção de auto-anticorpos é selecionada a partir do grupo que consiste de miopatia inflamatória idiopática, artrite reumatoide, miastenia gravis, doença de Grave, diabetes mellitus tipo I, esclerose múltipla, uma doença auto-imune, dermatomiosite, polimiosite e macroglobinemia de Waldenstrom. 16. 0 método da cláusula 14, em que a combinação é administrada em conjunto com um segundo agente. 17. 0 método da cláusula 16, em que o segundo agente é uma citoquina, uma quimioquina, um factor de crescimento, um agente quimioterapêutico ou um agente radioterapêutico. 18. 0 método da cláusula 16, em que o segundo agente é um agente imunossupressor. 19. 0 método da cláusula 12 ou 13, em que um SMIP é administrado numa gama de dosagem de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg. 20. O método da cláusula 19, em que um SMIP é administrado numa gama de dosagem de cerca de 0,015 a cerca de 30 mg/kg. 21. 0 método da cláusula 20, em que um SMIP é administrado numa dose de cerca de 0.015, cerca de 0,05, cerca de 0,15, cerca de 0,5, cerca de 15, cerca de 5, cerca de 15 ou cerca de 30 mg/kg. 22. O método da cláusula 11, 12 ou 13, em que as moléculas de ligação da combinação são administradas sequencialmente dentro de cerca de um periodo de 24 horas ou são administrados em simultâneo. 23. O método da cláusula 11, em que as moléculas de ligação têm afinidades de cerca de 0,5 a cerca de 10 nM. 24. O método da cláusula 11, em que as moléculas de ligação têm semi-vidas na circulação de cerca de 7 a cerca de 30 dias. 25. Um artigo de fabrico compreendendo uma molécula de ligação especifica-CD37 e uma molécula de ligação específica-CD20 e uma etiqueta que indica um método de acordo com a cláusula 11. 26. Um artigo de fabrico compreendendo um SMIP específicos de CD37 e um anticorpo específico para CD20 e uma etiqueta que indica um método de acordo com a cláusula 12. 27. Um artigo de fabrico compreendendo um SMIP específicos de CD37 e um SMIP específicos de CD20 e uma etiqueta que indica um método de acordo com a cláusula 13. 28. Um método para reduzir as células B que compreende a exposição de células B para uma ou mais moléculas de ligação especificas de CD37. 29. Um método para reduzir as células B que compreende a exposição de células B a uma combinação de uma ou mais medicamentos imunológicos, modulares pequenos específicos de CD37 (SMIPs) e um ou mais anticorpos específicos para CD37.
30. O método da cláusula 29, em que o referido SMIP específicos de CD37 é TRU-016. 31. O método da cláusula 29, em que o anticorpo específico para CD37 é seleccionado do grupo que consiste em: G28-1, MB371, BL.14, NMN46, IP024, HH1, e WR17. 32. O método da cláusula 28 ou 29, em que a redução de células B por citotoxicidade dependente do complemento é aumentada por tratamento com a combinação. 33. Um método de tratamento de um indivíduo que tem ou suspeito de ter uma doença associada com a actividade aberrante de células B, compreendendo a administração ao indivíduo de uma ou mais moléculas de ligação específicas de CD3 7. 34. Um método de tratamento de um indivíduo que tem ou suspeito de ter uma doença associada com a actividade aberrante de células B, compreendendo a administração ao indivíduo de uma ou mais SMIPs específicos do CD37. 35. Um método de tratamento de um indivíduo que tem ou suspeito de ter uma doença associada com a actividade aberrante de células B, compreendendo a administração ao indivíduo de uma combinação de um ou mais SMIP específico do CD37 e um ou mais anticorpos específicos para o CD37. 36. 0 método da cláusula 33, 34, ou 35, em que a doença é seleccionada a partir do grupo consistindo de um linfoma de células B, uma leucemia de células B, um mieloma de células B, uma doença caracterizada pela produção de auto-anticorpos, e uma doença caracterizado por inadequada estimulação de células T associado com uma via de células-B. 37. 0 método da cláusula 36, em que a doença que se caracteriza pela produção de auto-anticorpos é seleccionada a partir do grupo que consiste de miopatia inflamatória idiopática, artrite reumatoide, miastenia gravis, doença de Grave, diabetes mellitus tipo I, esclerose múltipla, uma doença auto-imune, dermatomiosite, polimiosite e macroglobinemia de Waldenstrom. 38. 0 método da cláusula 35, em que a combinação é administrada em conjunto com um segundo agente. 39. 0 método da cláusula 38, em que o segundo agente é uma citoquina, uma quimioquina, um factor de crescimento, um agente quimioterapêutico ou um agente radioterapêutico. 40. O método da cláusula 38, em que o segundo agente é um agente imunossupressor. 41. 0 método da cláusula 34 ou 35, em que o SMIP é administrado numa gama de dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. 42. O método da cláusula 41, em que o SMIP é administrado numa gama de dosagem de cerca de 0,015 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. 43. O método da cláusula 42, em que o SMIP é administrado numa dose de cerca de 0,015 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,15 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 15 mg/kg ou cerca de 30 mg/kg. 44. O método da cláusula 33, 34, ou 35, em que as moléculas de ligação da combinação são administradas sequencialmente dentro de cerca de um período de 24 horas ou são administrados em simultâneo. 45. O método da causa 33, em que as moléculas de ligação têm afinidades de cerca de 0,5 a cerca de 10 nM. 46. O método da cláusula 33, em que as moléculas de ligação têm semi-vidas na circulação de cerca de 7 a cerca de 30 dias. 47. Um artigo de fabrico compreendendo uma molécula de ligação específica-CD37 e uma etiqueta que indica um método de acordo com a cláusula 33. 48. Um artigo de fabrico compreendendo um SMIP específicos de CD3 7 e uma etiqueta que indica um método de acordo com a cláusula 34. 49. Um artigo de fabrico compreendendo um SMIP específicos de CD3 7 e um anticorpo específico para CD3 7 e uma etiqueta que indica um método de acordo com a reivindicação 35. 50. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado que exibe pelo menos 80 por cento de identidade com o polipéptido descrito em SEQ ID NO: 2, em que a polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado se liga a CD37. 51. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 80, 82, 84, 86 e 88. 52. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50 ou 51 que compreende pelo menos uma modificação de aminoácido de uma região determinante de complementaridade (CDR) seleccionado a partir do grupo que consiste em: cadeia leve CDR1, CDR1, CDR2 de cadeia leve e pesada cadeia CDR2, CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada CDR3. 53. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que CDR1 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (RASENVYSYLA). 54. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que CDR1 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 (RTSENVYSYLA). 55. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que CDR1 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 (GYMNM). 56. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR2 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (FAKTLAE). 57. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR2 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 (NIDPYYGGTTTYNRKFKG). 58. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR3 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 (QHHSDNPWT). 59. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 (SVGPFDY). 60. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 (SVGPFDS). 61. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 (SVGPMDY). 62. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, compreendendo, pelo menos, uma das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia leve seleccionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 61, 62, 64, e 66. 63. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50 que compreende pelo menos duas sequências das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia leve seleccionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 61, 62, 64, e 66 . 64. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50 que compreende pelo menos três sequências das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia leve seleccionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, 62, 64, e 66 . 65. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, que compreende: (a) uma sequência de aminoácidos de CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 61 ou 62, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 61 ou 62 ter sido alterada; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 64, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 64 foi alterada; e (c) uma sequência de CDR3 de cadeia leve de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 66 foi alterado. 66. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de causa 50 compreendendo, pelo menos, uma das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia pesada seleccionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 63, 65, e 67-69. 67. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50 que compreende pelo menos duas sequências das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia pesada seleccionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 63, 65, e 67-69. 68. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50 que compreende pelo menos três sequências das sequências de aminoácidos de CDR de cadeia pesada seleccionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 63, 65, e 6 7-69 . 69. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de causa 50 compreendendo: (a) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 63, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 63 foi alterada; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 65, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 65 foi alterada; e (c) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDR3 seleccionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 6 7-6 9, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 67-69 foi alterado. 70. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50 ou 51 que compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, em uma região de estrutura (FR) seleccionado a partir do grupo que consiste em: FR1 da cadeia leve, da cadeia pesada de FR1, FR2 da cadeia leve, da cadeia pesada FR2, cadeia leve FR3, cadeia pesada FR3, FR4 da cadeia leve e cadeia pesada FR4. 71. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a primeira região de estrutura (FR1) da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 (EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC). 72. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR1 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 (EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT). 73. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR2 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 (WYQQKPGQAPRLLIY). 74. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR2 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 (WVRQMPGKGLEWMG). 75. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a FR3 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 (GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC). 76. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a FR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 (QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR). 77. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR4 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 (FGQGTKVEIK). 78. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR4 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 (WGQGTLVTVSS). 79. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR4 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 (WGRGTLVTVSS). 80. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, compreendendo pelo menos uma sequência das sequências de aminoácidos da cadeia leve FR seleccionados a partir do qrupo que consiste nas SEQ ID NOS: 70, 72, 74, e 76 . 81. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula, 50 compreendendo, pelo menos, duas sequências das sequências de aminoácidos da cadeia leve FR seleccionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 70, 72, 74 e 76. 82. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50 que compreende pelo menos três sequências das sequências de ácido amino de cadeia leve FR seleccionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 70, 72, 74, e 76 . 83. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, que compreende: (a) uma sequência de cadeia leve FR1 de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 70 foram alterados; (b) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve FR2 de SEQ ID NO: 72, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 72 foram alterados; (b) uma sequência de cadeia leve FR3 de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 74 foram alterados; e (b) uma sequência de cadeia leve FR4 de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 76 foram alterados. 84. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, compreendendo pelo menos uma sequência das sequências de aminoácidos da cadeia pesada FR seleccionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 71, 73, 75, 77, e 78. 85. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50 que compreende pelo menos duas sequências das sequências de ácido amino FR de cadeia pesada seleccionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 71, 73, 75, 77, e 78. 86. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula, 50 compreendendo, pelo menos, três sequências das sequências de ácido amino FR de cadeia pesada seleccionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 71, 73, 75, 77, e 78. 87. Um polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, que compreende: (a) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FR1 de SEQ ID NO: 71, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 71 foi alterada; (b) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FR2 da SEQ ID NO: 73, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 73 foi alterada; (c) uma sequência de cadeia pesada FR3 de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 75 foi alterada; e (d) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FR4 de SEQ ID NO: 77 ou 78, ou uma sua variante em que um ou dois aminoácidos de SEQ ID NO: 77 ou 78 ter sido alterado. 88. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para um determinado polipeptídeo SMIP-CD37 humanizado que exibe pelo menos 80 por cento de identidade com o polipéptido descrito em SEQ ID NO: 2, em que a Polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado se liga a CD37. 89. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 79, 81, 83, 85 e 87. 90. Um vector que compreende a molécula de ácido nucleico da cláusula de 88 ou 89. 91. Uma célula hospedeira compreendendo o vector da cláusula 90 . 92. Um processo de produção de um polipéptido compreendendo a cultura da célula hospedeira de cláusula 91, sob condições adequadas para expressar o polipéptido, e, opcionalmente, o isolamento do polipéptido a partir da cultura. 93. Uma composição que compreende O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de qualquer uma das cláusulas 50-87 e um transportador farmaceuticamente aceitável. 94. O método de qualquer uma das cláusulas 2, 6, 10-29, e 34-49, em que o SMIP específicos de CD37 ou molécula de ligação específica é-CD37 humanizado e exibe pelo menos 80 por cento de identidade com o polipéptido descrito em SEQ ID NO: 2. 95. O método de qualquer uma das cláusulas 2, 6, 10-29, e 34- 49, em que o SMIP específico de CD37 ou molécula de ligação específica-CD37 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 80, 82, 84, 86 e 88. 96. Um kit para reduzir as células B compreendendo: (a) a composição da cláusula 93; e (b) um protocolo para a utilização do kit para reduzir as células B. 97. 0 kit da cláusula 96, que compreende ainda uma molécula de ligação especifica-CD20. 98. 0 kit da cláusula 96 ou 97 em que a molécula de ligação especifica à CD20 é TRU-015 humanizado ou um TRU-015. 99. Um polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3, que apresenta, pelo menos, 80 por cento de identidade com o polipéptido descrito em SEQ ID NO: 2. 100. O polipéptido da cláusula 99, compreendendo ainda um domínio estrutural humana que separa cada uma das CDR1, CDR2 e CDR3. 101. Um Polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado que apresenta, pelo menos, 8 0 por cento de identidade com o polipéptido descrito em SEQ ID NO: 2, em que o polipéptido SMIP humanizado específico se liga a CD37-CD37 e compreende uma sequência de polipéptido da região articulação seleccionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOS: 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 , 110, 112, 114, 115, 116, 118, 120, 122, 124, 126 e 127. 102. Um Polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado que apresenta, pelo menos, 8 0 por cento de identidade com o polipéptido descrito em SEQ ID NO: 2, em que o polipéptido SMIP humanizado específico se liga a CD37-CD37 e compreende um polipéptido da região de articulação que compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 90, 92, 94, 96, 98 , 100, 102, 104, 106, 108 110, 112, 114, 115, 116, 118, 120, 122, 124, 126 e 127 . 103. Um Polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado que apresenta, pelo menos, 8 0 por cento de identidade com o polipéptido descrito em SEQ ID NO: 2, em que o polipéptido SMIP humanizado específico se liga a CD37-CD37 e compreende um ligante que compreende (Gly4Ser)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. 104. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que CDR1 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 128 (RTSQNVYS YLA ), 129 (RTSESVYSYLA) , 130 (RASQSVYSYLA) , 131 (RASQSVSSYLA) e 132 (RASQSVSYYLA). 105. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula; 50, em que CDR1 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 133 (SYMNM) e 134 (SYWIG). 106. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR2 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 135 (AASSLQS) , 136 (GASTRAT) e 137 (DASNRAT). 107. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR2 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 138 (IIYPGDSDTRYSPSFQG) e 139 (RIDPSDSYTNYSPSFQG). 108. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR3 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220 (QHHSDNPWT). 109. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 211 (SVGPMDY) , 212 (SVGPFDY) , 213 (SVGPMDV), 214 (SVGPFDS), 215 (SVGPFDP), 216 (SVGPFQH), 217 (SVGPFDV), 218 (SVGPFDI) e 219 (SVGPFDL). 110. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR1 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 170-181. 111. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR1 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 140-146. 112. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR2 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 182-193. 113. O polipéptido SMIP específico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR2 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 147-153. 114. 0 polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a FR3 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 194-205. 115. O polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que a FR3 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 154-160. 116. O polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR4 da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 206-210. 117. O polipéptido SMIP especifico de CD37 humanizado de cláusula 50, em que o FR4 da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 161-169. LISTA DE SEQUÊNCIA <110> Grosmaire et al. <120> Redução de células B com o uso de moléculas de ligação específicas para CD-37 e específicas para CD20 <13 0> 30906/41324PCT <150> US 60/702, 499 <151> 25-07-2005 <150> US 60/800, 595 <151> 16-05-2006 <16 0> 220 <170> Patentln versão 3.3
<210> 1 <211> 1510 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> PoiinucleotídeoTRU-016 <40 0> 1 aagc'fcugcv'g tcaay£.¾¾¾¾ stctfec&gct tccSgctaaE: c&grgctt.cs 30
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<210> 3 <211> 1518 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-015 Polinucleotideo <400>3 a&gcfe&gccg ccatgga&feO fea&agtgeog afctfcfcc&gct &cct:gcta&t: cagtgcfcKea so grxataatgt' ceagaggasa s&ttgttcec Occc&gtctc csgca&tcct; gtstgcsccfc , 120 ccaggggsga aggfcsacaat: gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcaoxgg 180 tacsjageaga agesaggotx ctcccccaaa ccctggattt atgccccat-c caacatggat 2*0 acOggagtcc ctgcXc.gctO c&gtggeagt: gqgtatgcsga ccLcotaetc tctcacaatc 200 agxagagtgg aggcrgaago tgctgccact; totfc&cfcgcc agcogtggag ttXOa&aaos 260 cgcacgetcg gtgsfcgggac c&agcfcgg&g ctgaaagatg gcggtggctc: gggcggfcggt 420 ggaactggag g&ggtgggag ctctcaggct tatvct&cagc agtctggggc tgagtcggtg 480 aggccfcgggg cctsagtgaa g&tgtcctgc s&gg«tt,ctgr getacacatt taccagotae :548,: aauatgcacrt gggtaaagca gacacôtaga cagggftiscgg aatggafcfcgg asfgfcaçfctafc 58# ccaggaaatg gagatactix* KXaxxH:oag aagfcfccaagg gcaaggccac acagactgta t>6& gacaaatxct ceagcacaga aaacaitgcag ctcagcagc.c tgacatetga agactxXgog fso gtctactcet gtgsaagagfc ggtgtxctax agtaactctt &caggt:ac:tfc cgstgtctgg 780 ggeacagggs ccaxggtcac cgtctc&gat caggagccca aatcttgtga casas txc.se 840 aeaxerxcac cgtgeceagc acctgaactc ctgggtggae cgtcagoctt catattecec 800 eeaaaaecea agg&oaccct ciSfcgatctcc cggacccctg «gcjteacafcg egtggfcggtc; S&ú gacgtgsguc: acgaagacca tgaggtca&g ttcaactggt aegugg&egg cgtggagtjí:^ Xí530 c«tsatgcaa agacaaagaa gagggísggag «agt&c&aca «cacgtaccg fcgtggt: cage iCSô gfcguteaecg ;:ccf.gcacca ggactggcfcg aacggcaagg agtacasgtg caaggtctcc 1140 à&s&aagecí; Kécc&gcccc cat;«g«gs&& accatctcca aagcc&aagg ge&gíxesga 1200 gaascacagg tgtacaccat gcccceatee cggg&tgagc tgaccaagaa eeaggte&gc 12S0 ctg&CKítgcc fcggteaaagg cttctatcca agcgacascg cegtggagtg ggsgagcaafc 1220 gggcagccgg «gstaca&cfe* caaga<·'«&''-« cctreocgsfjc tg-gsctecga e^cKcctts 1380 ttccstefcaca gesagcccac cgtggscaag agesggÇggs; agcagggg&a cgcettctea- i440 tgefcessgfcg» tgc&tgaggc tctgcacaae caefcaeacgc a#asgag«et ctccctgtct 1300 c«g<J9t&«a& gstcfcaga ., 1528
<210> 4 <211> 499 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Polinucleotideo TRU-015 <400> 4
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<210> 5 <211> 1482 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 5 ac.gga«grcc cagcteegefc tcfccatcccc cfcgct&ctct ggctcecags tarsaccgqa 4a gsaat- rgfcgt tganae-agtu tactaqoaace cfegteitftgt «teaaggegii aag.ageeaee 134 etetnstgcc gaa^a-agsgs «asfcgfítae sgct'scttag eefggt.aocs ac.agaaacct 3 40 ggsyaggate «gaggeecefc catenass£t gcaa&aacet t»g»&gaagg aattxceagcc 34 4 aqgtteagtg geagtggacc cgggagagao rtracintce eaareagnag ectagugcct: 480 g&sgarpfctg Ksgfct&&Kfcs oSgfccascst catinargsta atetagrggís» a&t-B&g&esm 360 gggac«3ísgg tggaaatc;;íí aggtggcggt ggasrrgggcg gtggtggate tggaggaggt 438 gggaoeggtg aggtgaagct ggtgeagict ggagaagagg tgaaaaagcr eggagagtet 480
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Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Gly 115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu 130 135 140
Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 145 150 155 160
Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thx Ser Tyr Asn 165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 180 185 190
Asn lie Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 195 200 205
Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr Leu 210 215 220
Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 245 250 255
Val Ser Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser 260 265 270
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Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 340 345 350
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140
Gly Ala Ser Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 145 150 155 160
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Thr Ala Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Vai Gly Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly 245 250 255
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 260 265 270
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 275 280 285
Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 290 295 300
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 305 310 315 320
Glu Val .His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 325 330 335
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 340 345 350 Αδη Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 355 360 365
Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 370 375 380
Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 385 390 395 400
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala 405 410 415
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 420 425 430
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 435 440 445
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 465 470 475 430
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu 130 135 1*30
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Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn 165 170 175
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 370 375 380
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Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 . 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 '40 45
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1 S
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Gly
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Gly
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Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30
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Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20
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Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He Tyr 15 10 15 <210> 184 <211> 15
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Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie Tyr 1 5 10 15 <210> 189 <211> 15
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Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 190 <211> 15
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Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 1 5 10 15 <210> 191 <211> 15
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Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe lie Tyr 15 10 15 <210> 192 <211> 15
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Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 193 <211> 15
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Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 194 <211> 32
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Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
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Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 196 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado < 4 Ο Ο > 196
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GXy Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 197 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 197
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 198 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 198
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 199 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 199
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 15 10 15
Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 200 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 200
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 201 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 201
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 202 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 202
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 203 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 203
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15
Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 204 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 204
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 205 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 205
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 206 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 206
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 15 10 <210> 207 <211> 10
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<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 209
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 1 5 10
<210> 210 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 210
Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 1 5 10 <210> 211 <211> 7
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 211
Ser Val· Gly Pro Met Asp Tyr 1 5 <210> 212 <211> 7
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Ser Val Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5
<210> 213 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 213
Ser Val Gly Pro Met Asp Val 1 5 <210> 214 <211> 7
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 214
Ser Val Gly Pro Phe Asp Ser 1 5 <210> 215 <211> 7
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 215
Ser Val Gly Pro Phe Asp Pro 1 . 5
<210> 216 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 216
Ser Val Gly Pro Phe Gin His 1 5 <210> 217 <211> 7
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Ser Val Gly Pro Phe Asp Val 1 5
<210> 218 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 218
Ser Val Gly Pro Phe Asp He 1 5 <210> 219 <211> 7
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 219
Ser Val Gly Pro Phe Asp Leu 1 5
<210> 220 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 220
Gin His His Ser Asp Asn Pro Trp Thr 1 5

Claims (27)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína de ligação específica de CD37 humanizada compreendendo: (a) regiões de estrutura de cadeia leve humana, uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de amino ácido de SEQ ID NO: 64 e uma cadeia leve de CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; e (b) regiões de estrutura de cadeia pesada humana, um CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, uma cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 ou 68 em que proteína de ligação específica humanizada completa com o anticorpo monoclonal G28-1 para ligar com CD37 humano.
  2. 2. Proteína de ligação específica de CD37 humanizada de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 61, 64 e 66, respectivamente, e em que a cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 63, 65 e 67, respectivamente.
  3. 3. Proteína de ligação específica de CD37 humanizada de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 61, 64 e 66, respectivamente, e em que a cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 63, 65 e 68, respectivamente.
  4. 4. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes compreendendo: uma região de estrutura de cadeia leve humana selecionada a partir de SEQ ID NOS: 170-172, 175, 179,182, 184-188, 191, 194-198, 203 e 205-209, ou uma região de estrutura de cadeia pesada humana selecionada a partir das SEQ ID NOS: 140, 141, 143-147, 150, 151, 154-163, 168 e 169.
  5. 5. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de acordo com qulauqer um das reivindicações precedentes, compreendendo: uma primeira região de estrutura de cadeia leve humana (FR1) seleccionado a partir de SEQ ID NOS:170 - 172, 175 e 177-181; uma FR2 humana da região de estrutura de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOS: 182, 184-188 e 191, um humano FR3 da cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOS:194 - 198, 203 e 205, e um humano FR4 da cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOS: 206 - 209, ou uma primeira região de estrutura de cadeia pesada humana (FR1) seleccionado a partir de SEQ ID NOS: 140, 141 e 143-146; humano FR2 da cadeia pesada seleccionado a partir de SEQ ID NOS: 147, 150 e 151, um humano FR3 da cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOS :154 -160, e um humano FR4 da cadeia pesada seleccionado a partir de SEQ ID NOS: 161 - 163, 168 e 169.
  6. 6. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes em que a proteína de ligação é um polipéptido Fv (scFv) de cadeia simples, um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo, ou uma proteína de fusão de imunoglobulina que compreende, do amino até ao terminal carboxi, (i) um domínio de ligação tendo regiões de cadeia leve e e cadeia pesada variáveis de imunoglobulina, separadas por um péptido de ligação, (ii) um polipéptido de região de articulação de imunoglobulina ou um polipéptido de região de articulação mutante IgGl com zero, um ou dois resíduos de cisteína, e (iii) os domínios de imunoglobulina CH2 e CH3.
  7. 7. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de acordo com a reivindicação 6, em que o polipéptido de região de articulação de imunoglobulina pode ser um polipéptido de região de articulação IgGl, IgA ou IgE ou um mutante IgGl.
  8. 8. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de acordo com a reivindicação 6, em que: a proteína de ligação é uma proteína de fusão de imunoglobulina que compreende a região variável da cadeia leve que está ligada à região variável da cadeia pesada através de um péptido ligante que compreende (Gly4SER)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 conforme estabelecido em SEQ ID NOS: 221, 222, 223, 224, 225, ou 226; e as regiões variáveis de cadeia leve e pesada ligada eque são ligadas a um domínio efector IgGl por meio de uma articulação constituída por uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 90, 92 , 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 115, 116, 118, 120, 122, 124, 126, ou 127.
  9. 9. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 48 e 52.
  10. 10. Uma composição que compreende a proteína de ligação de qualquer uma das reivindicações anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  11. 11. Um polinucleótido isolado que codifica a proteína de ligação de qualquer uma das reivindicações anteriores.
  12. 12. Um vector que compreende o polinucleótido de acordo com a reivindicação 11.
  13. 13. Uma célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 12.
  14. 14. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a composição d a reivindicação 10, para utilização em terapia.
  15. 15. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a composição da reivindicação 10, para utilização num método de tratamento de um cancro de células B ou de uma doença auto-imune.
  16. 16. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1-8 ou composição da reivindicação 10 para utilização no tratamento de um cancro de células B, em que o cancro das células B é a doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, sistema nervoso central linfomas, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia mioblástica crónica, mieloma múltiplo, linfoma linfocítico de pequenas, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma da zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma solitário de osso, plasmocitoma extraosseous, extra-nodal zona marginal do linfoma de células B do tecido linfóide associado à mucosa, da zona marginal do linfoma de células B nodal, linfoma folicular, linfoma das células do manto, linfoma difuso de grandes células B, mediastinal (timo) do linfoma de células B grandes, intravascular linfoma de grandes células B, linfoma primário, Burkitt linfoma/leucemia, proliferações de células B de potencial maligno incerto, granulomatose linfomatóide, ou pós-transplante doença linfoproliferativa.
  17. 17. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1-8 ou composição da reivindicação 10 para utilização no tratamento de uma doença auto-imune, em que a doença auto-imune é artrite reumatóide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, doença de Crohn, síndroma de Sjogren, doença de Grave, diabetes mellitus tipo I, psoríase, púrpura trombocitopênica imunológica, pênfigo, miopatia inflamatória idiopática, miastenia grave, ou macroglobinemia de Waldenstorm.
  18. 18. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1-8 ou composição d a reivindicação 10 para utilização em qualquer uma das reivindicações 14-17, caracterizado pelo facto de a proteína de ligação específica-CD37 humanizada ser utilizada em combinação com um segundo agente.
  19. 19. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1-8 ou composição da reivindicação 10 para utilização na reivindicação 18, em que o segundo agente é um agente quimioterapêutico, um modificador de resposta biológica, um anticorpo específico para CD3 7 humano ou um um seu fragmento que se liga a CD37, uma citocina, uma quimiocina, um factor de crescimento, um agente radioterapêutico, um adrenocorticosteróides/ antagonista ou um agente imunossupressor.
  20. 20. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1-8 ou composição da reivindicação 10 para utilização na reivindicação 19, em que o segundo agente é o agente quimioterapêutico, e em que o agente quimioterapêutico é um agente alquilante, um análogo de pirimidina, ou um análogo de purina.
  21. 21. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1-8 ou composição da reivindicação 10 para utilização na reivindicação 19, em que o segundo agente é um agente quimioterapêutico, e em que o agente quimioterapêutico é de fludarabina ou clorambucil.
  22. 22. A proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1-8 ou composição da reivindicação 10 para utilização na reivindicação 19, em que o segundo agente é modificador da resposta biológica, caracterizado por o modificador de resposta biológica ser o G-CSF ou GM-CSF.
  23. 23. Um artigo de fabrico compreendendo uma proteína de ligação específica de CD37 humanizada de qualquer uma das reivindicações 1-8 e um segundo agente.
  24. 24. O artigo de fabrico da reivindicao 23, em que o segundo agente é uma proteína de ligação de imunoglobulina específica de CD20 humana, um agente quimioterapêutico, um modificador de resposta biológica, um anticorpo específico para CD37 humano ou um seu fragmento de ligação daí resultante, uma citocina, uma quimiocina, um factor de crescimento, um agente radioterapêutico, um adrenocorticosteróides / antagonista, ou um agente imunossupressor.
  25. 25. O artigo de fabrico da reivindicao 24, em que o segundo agente é um agente quimioterapêutico, e em que o agente quimioterapêutico é um agente alquilante, um análogo de piramidina, ou um análogo de purina.
  26. 26. 0 artigo de fabrico da reivindicao 24, em que o segundo agente é um agente quimioterapêutico, e o agente quimioterapêutico é fludarabina ou clorambucil.
  27. 27. 0 artigo de fabrico da reivindicao 24, em que o segundo agente é um modificador de resposta biológica, caracterizado por o modificador de resposta biológica ser o G-CSF ou GM-CSF .
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